DE202021001858U1 - Hochleistungsfluoreszenzbildgebungsmodul für Assays zur genomischen Testung - Google Patents

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Abstract

Bildgebungssystem, umfassend:
a) zwei verschiedene, axial versetzte Oberflächen;
b) eine Objektivlinse; und
c) mindestens einen Bildsensor, wobei das Bildgebungssystem eine numerische Apertur (NA, numerical aperture) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV, field of vision) von mehr als 1,0 mm2 aufweist, und wobei das Bildgebungssystem Bilder der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen aufnehmen kann, die im Wesentlichen die gleiche optische Auflösung aufweisen, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor zu bewegen.

Description

  • QUERVERWEIS
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 63/076,361 , eingereicht am 9. September 2020, und der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/962,723 , eingereicht am 17. Januar 2020, die hierin jeweils in vollem Umfang durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • In typischen Assays auf Fluoreszenzbasis zur genomischen Testung, z. B. Genotypisierung oder Nukleinsäuresequenzierung (entweder unter Verwendung von Echtzeit-, zyklischen oder schrittweisen Reaktionsschemata), werden Farbstoffmoleküle, die an Nukleinsäuremoleküle angebunden sind, die auf ein Substrat gebunden sind, unter Verwendung einer Anregungslichtquelle angeregt, wird ein Fluoreszenzphotonensignal an einer oder mehreren räumlich lokalisierten Positionen auf dem Substrat erzeugt und wird die Fluoreszenz anschließend durch ein optisches System auf einem Bildsensor abgebildet. Ein Analyseprozess wird dann verwendet, um die Bilder zu analysieren, die Positionen von markierten Molekülen (oder klonal amplifizierten Molekülclustern) auf dem Substrat zu finden und das Fluoreszenzphotonensignal in Bezug auf Wellenlänge und räumliche Koordinaten zu quantifizieren, die dann mit dem Grad korreliert werden können, in dem eine spezifische chemische Reaktion, z. B. ein Hybridisierungsereignis oder ein Basenadditionsereignis, an den angegebenen Stellen auf dem Substrat auftrat. Bildgebungsbasierte Verfahren stellen umfangreiche Parallelitäts- und Multiplexfunktionen bereit, die dazu beitragen, die Kosten und die Zugänglichkeit solcher Technologien zu senken. Erkennungsfehler, die beispielsweise durch eine zu dichte Packung markierter Moleküle (oder klonal amplifizierter Molekülcluster) in einem kleinen Bereich der Substratoberfläche oder durch ein geringes Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) in dem Bild entstehen, können zu Fehlern bei der Zuordnung des Fluoreszenzsignals zu den richtigen Molekülen (oder zu klonal amplifizierten Molekülclustern) führen.
  • KURZDARSTELLUNG
  • Hierin offenbart sind Bildgebungssysteme, die konfiguriert sind, um eine erste Innenoberfläche und eine zweite Innenoberfläche einer Durchflusszelle abzubilden, wobei die Bildgebungssysteme umfassen: a) eine Objektivlinse; b) mindestens einen Bildsensor; und c) mindestens eine Tubuslinse, die in einem Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor angeordnet ist; wobei das optische System eine numerische Apertur (NA) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,0 mm2 aufweist; und wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um die Bildgebungsleistung so zu korrigieren, dass Bilder der ersten Innenoberfläche der Durchflusszelle und der zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle im Wesentlichen die gleiche optische Auflösung aufweisen.
  • In einigen Ausführungsformen weist die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 µm und einen mit Flüssigkeit gefüllten Spalt zwischen der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche von mindestens 50 µm auf. In einigen Ausführungsformen werden die Bilder der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche aufgenommen, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor zu bewegen. In einigen Ausführungsformen weist das Bildgebungssystem eine numerische Apertur (NA) von weniger als 0,6 auf. In einigen Ausführungsformen weist das Bildgebungssystem eine numerische Apertur (NA) von mehr als 0,3 auf. In einigen Ausführungsformen weist das Bildgebungssystem ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,5 mm2 auf. In einigen Ausführungsformen ist die optische Auflösung von Bildern der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche über das gesamte Sichtfeld (FOV) beugungsbegrenzt. In einigen Ausführungsformen umfasst die mindestens eine Tubuslinse in dieser Reihenfolge eine asymmetrische konvex-konvexe Linse, eine plankonvexe Linse, eine asymmetrische konkav-konkave Linse und eine asymmetrische konvex-konkave Linse. In einigen Ausführungsformen umfasst das Bildgebungssystem zwei oder mehr Tubuslinsen, die so ausgelegt sind, dass sie bei zwei oder mehr Fluoreszenzwellenlängen eine optimale Bildgebungsleistung für die erste Innenoberfläche und die zweite Innenoberfläche bereitstellen. In einigen Ausführungsformen umfasst das Bildgebungssystem ferner einen Fokussierungsmechanismus, der konfiguriert ist, um das optische System zwischen dem Aufnehmen von Bildern der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche neu zu fokussieren. In einigen Ausführungsformen ist das Bildgebungssystem konfiguriert, um zwei oder mehr Sichtfelder auf mindestens einer der ersten Innenoberfläche oder der zweiten Innenoberfläche abzubilden. In einigen Ausführungsformen sind die erste Innenoberfläche und die zweite Innenoberfläche der Durchflusszelle mit einer hydrophilen Überzugsschicht beschichtet, und wobei die hydrophile Überzugsschicht ferner markierte Nukleinsäurekolonien umfasst, die in einer Oberflächendichte von > 10.000 Nukleinsäurekolonien/mm2 darauf angeordnet sind. In einigen Ausführungsformen zeigt ein Bild der ersten Innenoberfläche oder der zweiten Innenoberfläche, das unter Verwendung des Bildgebungssystems aufgenommen wurde, ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 5, wenn die Nukleinsäurekolonien mit Cyaninfarbstoff 3 (Cy3) markiert sind, umfasst das Bildgebungssystem einen Satz aus dichroitischem Spiegel und Bandpassfilter, der für die Cy3-Emission optimiert ist, und wird das Bild unter nicht signalgesättigten Bedingungen aufgenommen, während die Oberfläche in 25 mM ACES, pH-Wert 7,4-Puffer, eingetaucht ist. In einigen Ausführungsformen umfasst das Bildgebungssystem 1, 2, 3 oder 4 Bildgebungskanäle, die zum Detektieren von Nukleinsäurekolonien konfiguriert sind, die auf mindestens einer der beiden verschiedenen Oberflächen angeordnet sind, die mit 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen detektierbaren Markierungen markiert wurden. In einigen Ausführungsformen wird das Bildgebungssystem verwendet, um eine Sequenzierung-durch-Avidität-, Sequenzierung-durch-Nukleotidbasenpaarung-, Sequenzierung-durch-Nukleotidbindung- oder Sequenzierung-durch-Nukleotideinbau-Reaktion auf der ersten Innenoberfläche und/oder der zweiten Innenoberfläche zu überwachen und eine gebundene oder eingebaute Nukleotidbase zu detektieren. In einigen Ausführungsformen wird das Bildgebungssystem verwendet, um eine Nukleinsäuresequenzierung durchzuführen. In einigen Ausführungsformen wird das Bildgebungssystem verwendet, um einen Genotyp einer Probe zu bestimmen, wobei das Bestimmen des Genotyps der Probe das Vorbereiten eines aus der Probe extrahierten Nukleinsäuremoleküls zur Sequenzierung und dann das Sequenzieren des Nukleinsäuremoleküls umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst der mindestens eine Bildsensor Pixel mit einer Pixelabmessung, die so gewählt ist, dass eine Abtastraumfrequenz für das Bildgebungssystem mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des Bildgebungssystems beträgt. In einigen Ausführungsformen ist eine Kombination aus der Objektivlinse und der mindestens einen Tubuslinse konfiguriert, um eine Modulationsübertragungsfunktion im Raumfrequenzbereich von 700 Zyklen pro mm bis 1100 Zyklen pro mm auf der Probenebene zu optimieren. In einigen Ausführungsformen ist die mindestens eine Tubuslinse so ausgelegt, dass sie die Modulationsübertragungsfunktion (MTF) bei einer oder mehreren spezifizierten Raumfrequenzen, Defokussierung, sphärische Aberration, chromatische Aberration, Koma, Astigmatismus, Feldkrümmung, Bildverzerrung, Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von Bildern oder eine beliebige Kombination davon für eine Kombination aus der Objektivlinse und der mindestens einen Tubuslinse korrigiert.
  • Hierin werden auch Verfahren zum Sequenzieren eines Nukleinsäuremoleküls offenbart, wobei die Verfahren umfassen: a) Abbilden einer ersten Oberfläche und einer axial versetzten zweiten Oberfläche unter Verwendung eines optischen Systems, das eine Objektivlinse und mindestens einen Bildsensor umfasst, wobei das optische System eine numerische Apertur (NA) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,0 mm2 aufweist, und wobei Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche mit im Wesentlichen der gleichen optischen Auflösung aufgenommen werden, ohne dass ein optischer Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor bewegt wird; und b) Detektieren einer fluoreszenzmarkierten Zusammensetzung, umfassend das Nukleinsäuremolekül oder ein Komplement davon, das auf der ersten Oberfläche oder der axial versetzten zweiten Oberfläche angeordnet ist, um eine Identität eines Nukleotids im Nukleinsäuremolekül zu bestimmen.
  • In einigen Ausführungsformen wird ein Fokussierungsmechanismus verwendet, um das optische System zwischen dem Aufnehmen von Bildern der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche neu zu fokussieren. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Abbilden von zwei oder mehr Sichtfeldern auf mindestens einer der ersten Oberfläche oder einer axial versetzten zweiten Oberfläche. In einigen Ausführungsformen umfassen die erste Oberfläche und die axial versetzte zweite Oberfläche zwei Oberflächen einer Durchflusszelle. In einigen Ausführungsformen sind die beiden Oberflächen der Durchflusszelle mit einer hydrophilen Überzugsschicht beschichtet. In einigen Ausführungsformen umfasst die hydrophile Überzugsschicht ferner markierte Nukleinsäurekolonien, die darauf in einer Oberflächendichte von > 10.000 Nukleinsäurekolonien/mm2 angeordnet sind. In einigen Ausführungsformen zeigt ein Bild einer Oberfläche der beiden Oberflächen, die unter Verwendung des optischen Systems aufgenommen wurden, ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 5, wenn die Nukleinsäurekolonien mit Cyaninfarbstoff 3 (Cy3) markiert sind, wobei das optische System einen Satz aus dichroitischem Spiegel und Bandpassfilter umfasst, der für die Cy3-Emission optimiert ist, und das Bild unter nicht signalsättigenden Bedingungen aufgenommen wird, während die Oberfläche in Puffer aus 25 mM ACES, pH-Wert 7,4, eingetaucht ist. In einigen Ausführungsformen umfasst das optische System 1, 2, 3 oder 4 Bildgebungskanäle, die konfiguriert sind, um Nukleinsäurekolonien zu detektieren, die auf mindestens einer der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche angeordnet sind, die mit 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen detektierbaren Markierungen markiert wurden. In einigen Ausführungsformen umfasst der mindestens eine Bildsensor Pixel mit einer Pixelabmessung, die so gewählt ist, dass eine Raumabtastfrequenz für das optische System mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des Bildgebungssystems beträgt. In einigen Ausführungsformen umfasst das optische System mindestens eine Tubuslinse, die zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor positioniert ist, und wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um eine Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden einer ersten Innenoberfläche einer Durchflusszelle und einer zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle zu korrigieren. In einigen Ausführungsformen weist die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 µm und einen Spalt zwischen der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche von mindestens 50 µm auf. In einigen Ausführungsformen umfasst die mindestens eine Tubuslinse in dieser Reihenfolge eine asymmetrische konvex-konvexe Linse, eine plankonvexe Linse, eine asymmetrische konkav-konkave Linse und eine asymmetrische konvex-konkave Linse. In einigen Ausführungsformen umfasst das optische System zwei oder mehr Tubuslinsen, die so ausgelegt sind, dass sie eine optimale Bildgebungsleistung bei zwei oder mehr Fluoreszenzwellenlängen bereitstellen. In einigen Ausführungsformen ist eine Kombination aus Objektivlinse und Tubuslinse konfiguriert, um eine Modulationsübertragungsfunktion im mittleren bis hohen Raumfrequenzbereich zu optimieren. In einigen Ausführungsformen umfasst die Bildgebungsleistungsmetrik eine Messung der Modulationsübertragungsfunktion (MTF) bei einer oder mehreren spezifizierten Raumfrequenzen, Defokussierung, sphärische Aberration, chromatische Aberration, Koma, Astigmatismus, Feldkrümmung, Bildverzerrung, Kontrast-Rauch-Verhältnis (CNR) von Bildern oder eine beliebige Kombination davon. In einigen Ausführungsformen ist die optische Auflösung von Bildern der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche über das gesamte Sichtfeld (FOV) beugungsbegrenzt. In einigen Ausführungsformen umfasst das Sequenzieren des Nukleinsäuremoleküls ferner das Durchführen einer Sequenzierung-durch-Avidität-, Sequenzierung-durch-Nukleotidbasenpaarung-, Sequenzierung-durch-Nukleotidbindung- oder Sequenzierung-durch-Nukleotideinbau-Reaktion auf mindestens einer der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche und das Detektieren einer gebundenen oder eingebauten Nukleotidbase. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Bestimmen eines Genotyps einer Probe, wobei das Bestimmen des Genotyps der Probe das Vorbereiten des Nukleinsäuremoleküls für die Sequenzierung und dann das Sequenzieren des Nukleinsäuremoleküls umfasst.
  • Hierin offenbart sind Bildgebungssysteme, die konfiguriert sind, um zwei verschiedene, axial versetzte Oberflächen abzubilden, wobei die Bildgebungssysteme eine Objektivlinse und mindestens einen Bildsensor umfassen, wobei das Bildgebungssystem eine numerische Apertur (NA) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,0 mm2 aufweist, wobei das Bildgebungssystem Bilder der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen aufnehmen kann, die im Wesentlichen die gleiche optische Auflösung aufweisen, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor zu bewegen.
  • In einigen Ausführungsformen weist das Bildgebungssystem eine numerische Apertur von mehr als 0,3 auf. In einigen Ausführungsformen umfasst das Bildgebungssystem ferner einen Fokussierungsmechanismus, der verwendet wird, um das optische System zwischen dem Aufnehmen von Bildern der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen neu zu fokussieren. In einigen Ausführungsformen ist das Bildgebungssystem konfiguriert, um zwei oder mehr Sichtfelder auf mindestens einer der beiden verschiedenen, axial versetzten Oberflächen abzubilden. In einigen Ausführungsformen umfassen die zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen zwei Oberflächen einer Durchflusszelle. In einigen Ausführungsformen sind die zwei verschiedenen Oberflächen der Durchflusszelle mit einer hydrophilen Überzugsschicht beschichtet, und wobei die hydrophile Überzugsschicht ferner markierte Nukleinsäurekolonien umfasst, die in einer Oberflächendichte von > 10.000 Nukleinsäurekolonien/mm2 darauf angeordnet sind. In einigen Ausführungsformen umfasst das Bildgebungssystem 1, 2, 3 oder 4 Bildgebungskanäle, die zum Detektieren von Nukleinsäurekolonien konfiguriert sind, die auf mindestens einer der beiden verschiedenen Oberflächen angeordnet sind, die mit 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen detektierbaren Markierungen markiert wurden. In einigen Ausführungsformen umfasst der mindestens eine Bildsensor Pixel mit einer Pixelabmessung, die so gewählt ist, dass eine Raumabtastfrequenz für das Bildgebungssystem mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des Bildgebungssystems beträgt. In einigen Ausführungsformen umfasst das Bildgebungssystem mindestens eine Tubuslinse, die zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor positioniert ist, und wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um eine Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden einer ersten Innenoberfläche einer Durchflusszelle und einer zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle zu korrigieren. In einigen Ausführungsformen weist die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 µm und einen Spalt zwischen der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche von mindestens 50 µm auf. In einigen Ausführungsformen umfasst das Bildgebungssystem zwei oder mehr Tubuslinsen, die so ausgelegt sind, dass sie eine optimale Bildgebungsleistung bei zwei oder mehr Fluoreszenzwellenlängen bereitstellen. In einigen Ausführungsformen ist die optische Auflösung von Bildern der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen über das gesamte Sichtfeld (FOV) beugungsbegrenzt.
  • Hierin offenbart sind Verfahren zum Sequenzieren eines Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren umfasst: a) Abbilden einer ersten Oberfläche und einer axial versetzten zweiten Oberfläche unter Verwendung eines kompensationsfreien optischen Systems, das eine Objektivlinse und mindestens einen Bildsensor umfasst, wobei das optische System eine numerische Apertur (NA) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,0 mm2 aufweist; b) Verarbeiten der Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche, um die optische Aberration so zu korrigieren, dass die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche im Wesentlichen die gleiche optische Auflösung aufweisen; und c) Detektieren einer fluoreszenzmarkierten Zusammensetzung, umfassend das Nukleinsäuremolekül oder ein Komplement davon, das auf der ersten Oberfläche oder der axial versetzten zweiten Oberfläche angeordnet ist, um eine Identität eines Nukleotids im Nukleinsäuremolekül zu bestimmen.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche aufgenommen, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor zu bewegen. In einigen Ausführungsformen werden die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche durch einfaches Neufokussieren des optischen Systems aufgenommen. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Abbilden von zwei oder mehr Sichtfeldern auf mindestens einer der ersten Oberfläche oder einer axial versetzten zweiten Oberfläche. In einigen Ausführungsformen umfassen die erste Oberfläche und die axial versetzte zweite Oberfläche zwei Oberflächen einer Durchflusszelle. In einigen Ausführungsformen sind die beiden Oberflächen der Durchflusszelle mit einer hydrophilen Überzugsschicht beschichtet. In einigen Ausführungsformen umfasst die hydrophile Überzugsschicht ferner markierte Nukleinsäurekolonien, die darauf in einer Oberflächendichte von > 10.000 Nukleinsäurekolonien/mm2 angeordnet sind. In einigen Ausführungsformen zeigt ein Bild einer Oberfläche der beiden Oberflächen, die unter Verwendung des optischen Systems aufgenommen wurden, ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 5, wenn die Nukleinsäurekolonien mit Cyaninfarbstoff 3 (Cy3) markiert sind, wobei das optische System einen Satz aus dichroitischem Spiegel und Bandpassfilter umfasst, der für die Cy3-Emission optimiert ist, und das Bild unter nicht signalsättigenden Bedingungen aufgenommen wird, während die Oberfläche in Puffer aus 25 mM ACES, pH-Wert 7,4, eingetaucht ist. In einigen Ausführungsformen umfasst das optische System 1, 2, 3 oder 4 Bildgebungskanäle, die konfiguriert sind, um Nukleinsäurekolonien zu detektieren, die auf mindestens einer der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche angeordnet sind, die mit 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen detektierbaren Markierungen markiert wurden. In einigen Ausführungsformen umfasst mindestens ein Bildsensor Pixel mit einer Pixelabmessung, die so gewählt ist eine Raumabtastfrequenz für das optische System mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des Bildgebungssystems beträgt. In einigen Ausführungsformen umfasst das optische System mindestens eine Tubuslinse, die zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor positioniert ist, und wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um eine Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden einer ersten Innenoberfläche einer Durchflusszelle und einer zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle zu korrigieren. In einigen Ausführungsformen weist die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 µm und einen Spalt zwischen der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche von mindestens 50 µm auf. In einigen Ausführungsformen umfasst die mindestens eine Tubuslinse in dieser Reihenfolge eine asymmetrische konvex-konvexe Linse, eine plankonvexe Linse, eine asymmetrische konkav-konkave Linse und eine asymmetrische konvex-konkave Linse. In einigen Ausführungsformen umfasst das optische System zwei oder mehr Tubuslinsen, die so ausgelegt sind, dass sie eine optimale Bildgebungsleistung bei zwei oder mehr Fluoreszenzwellenlängen bereitstellen. In einigen Ausführungsformen ist eine Kombination aus Objektivlinse und Tubuslinse konfiguriert, um eine Modulationsübertragungsfunktion im mittleren bis hohen Raumfrequenzbereich zu optimieren. In einigen Ausführungsformen umfasst die Bildgebungsleistungsmetrik eine Messung der Modulationsübertragungsfunktion (MTF) bei einer oder mehreren spezifizierten Raumfrequenzen, Defokussierung, sphärische Aberration, chromatische Aberration, Koma, Astigmatismus, Feldkrümmung, Bildverzerrung, Kontrast-Rauch-Verhältnis (CNR) von Bildern oder eine beliebige Kombination davon. In einigen Ausführungsformen ist die optische Auflösung von Bildern der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche über das gesamte Sichtfeld (FOV) beugungsbegrenzt. In einigen Ausführungsformen umfasst die Sequenzierung des Nukleinsäuremoleküls ferner das Durchführen einer Sequenzierung-durch-Avidität-, Sequenzierung-durch-Nukleotidbindung- oder Sequenzierung-durch-Nukleotideinbau-Reaktion auf mindestens einer der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche und das Detektieren einer gebundenen oder eingebauten Nukleotidbase. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Bestimmen eines Genotyps einer Probe, wobei das Bestimmen des Genotyps der Probe das Vorbereiten des Nukleinsäuremoleküls für die Sequenzierung und dann das Sequenzieren des Nukleinsäuremoleküls umfasst.
  • Hierin offenbart sind Systeme zum Sequenzieren eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend: a) ein optisches System, das eine Objektivlinse und mindestens einen Bildsensor umfasst, wobei das optische System eine numerische Apertur (NA) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,0 mm2 aufweist und konfiguriert ist, um Bilder einer ersten Oberfläche und einer axial versetzten zweiten Oberfläche aufzunehmen; und b) einen Prozessor, der programmiert ist, um: i) Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche zu verarbeiten, um die optische Aberration so zu korrigieren, dass die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche im Wesentlichen die gleiche optische Auflösung aufweisen; und ii) eine fluoreszenzmarkierte Zusammensetzung zu detektieren, die das Nukleinsäuremolekül oder ein Komplement davon umfasst, das auf der ersten Oberfläche oder der axial versetzten zweiten Oberfläche angeordnet ist, um eine Identität eines Nukleotids im Nukleinsäuremolekül zu bestimmen.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche aufgenommen, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor zu bewegen. In einigen Ausführungsformen werden die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche durch einfaches Neufokussieren des optischen Systems aufgenommen. In einigen Ausführungsformen weist das Bildgebungssystem eine numerische Apertur von mehr als 0,3 auf. In einigen Ausführungsformen umfassen die erste Oberfläche und die axial versetzte zweite Oberfläche zwei Oberflächen einer Durchflusszelle. In einigen Ausführungsformen sind die zwei Oberflächen der Durchflusszelle mit einer hydrophilen Überzugsschicht beschichtet, und wobei die hydrophile Überzugsschicht ferner markierte Nukleinsäurekolonien umfasst, die in einer Oberflächendichte von > 10.000 Nukleinsäurekolonien/mm2 darauf angeordnet sind. In einigen Ausführungsformen umfasst das optische System 1, 2, 3 oder 4 Bildgebungskanäle, die konfiguriert sind, um Nukleinsäurekolonien zu detektieren, die auf mindestens einer der ersten Oberfläche oder der axial versetzten zweiten Oberfläche angeordnet sind, die mit 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen detektierbaren Markierungen markiert wurden. In einigen Ausführungsformen umfasst der mindestens eine Bildsensor Pixel mit einer Pixelabmessung, die so gewählt ist, dass eine Raumabtastfrequenz für das optische System mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des Bildgebungssystems beträgt. In einigen Ausführungsformen umfasst das System mindestens eine Tubuslinse, die zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor positioniert ist, und wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um eine Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden einer ersten Innenoberfläche einer Durchflusszelle und einer zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle zu korrigieren. In einigen Ausführungsformen weist die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 µm und einen Spalt zwischen der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche von mindestens 50 µm auf. In einigen Ausführungsformen umfasst das optische System zwei oder mehr Tubuslinsen, die so ausgelegt sind, dass sie eine optimale Bildgebungsleistung bei zwei oder mehr Fluoreszenzwellenlängen bereitstellen.
  • Hierin offenbart sind Fluoreszenzbildgebungssysteme, umfassend: a) mindestens eine Lichtquelle, die konfiguriert ist, um Anregungslicht innerhalb eines oder mehrerer spezifizierter Wellenlängenbereiche bereitzustellen; b) eine Objektivlinse, die konfiguriert ist, um Fluoreszenz zu sammeln, die sich aus einem spezifizierten Sichtfeld einer Probenebene ergibt, wenn die Probenebene dem Anregungslicht ausgesetzt wird, wobei eine numerische Apertur der Objektivlinse mindestens 0,3 beträgt, wobei eine Arbeitsabstand der Objektivlinse mindestens 700 µm beträgt, und wobei das Sichtfeld eine Fläche von mindestens 2 mm2 aufweist; und c) mindestens einen Bildsensor, wobei die von der Objektivlinse gesammelte Fluoreszenz auf den Bildsensor abgebildet wird, und wobei eine Pixelabmessung für den Bildsensor so gewählt ist, dass eine Raumabtastfrequenz für das Fluoreszenzbildgebungssystem mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des Fluoreszenzbildgebungssystems beträgt.
  • In einigen Ausführungsformen beträgt die numerische Apertur mindestens 0,75. In einigen Ausführungsformen beträgt die numerische Apertur mindestens 1,0. In einigen Ausführungsformen beträgt der Arbeitsabstand mindestens 850 µm. In einigen Ausführungsformen beträgt der Arbeitsabstand mindestens 1000 µm. In einigen Ausführungsformen weist das Sichtfeld eine Fläche von mindestens 2,5 mm2 auf. In einigen Ausführungsformen weist das Sichtfeld eine Fläche von mindestens 3 mm2 auf. In einigen Ausführungsformen beträgt die Raumabtastfrequenz mindestens das 2,5-Fache der optischen Auflösung des Fluoreszenzbildgebungssystems. In einigen Ausführungsformen beträgt die Raumabtastfrequenz mindestens das 3-Fache der optischen Auflösung des Fluoreszenzbildgebungssystems. In einigen Ausführungsformen umfasst das System ferner eine X-Y-Z-Translationsstufe, so dass das System konfiguriert ist, um eine Reihe von zwei oder mehr Fluoreszenzbildern auf automatisierte Weise aufzunehmen, wobei jedes Bild der Reihe für ein anderes Sichtfeld aufgenommen wird. In einigen Ausführungsformen wird eine Position der Probenebene gleichzeitig in einer X-Richtung, einer Y-Richtung und einer Z-Richtung eingestellt, um der Position einer Brennebene der Objektivlinse zwischen der Aufnahme von Bildern für verschiedene Sichtfelder zu entsprechen. In einigen Ausführungsformen beträgt die Zeit, die für die gleichzeitigen Einstellungen in X-Richtung, Y-Richtung und Z-Richtung erforderlich ist, weniger als 0,4 Sekunden. In einigen Ausführungsformen umfasst das System ferner einen Autofokusmechanismus, der konfiguriert ist, um die Position der Brennebene vor dem Aufnehmen eines Bildes eines anderen Sichtfelds anzupassen, wenn ein Fehlersignal anzeigt, dass ein Unterschied, der in der Position der Brennebene und der Probenebene vorliegt, in der Z-Richtung größer als eine angegebene Fehlerschwelle ist. In einigen Ausführungsformen beträgt die spezifizierte Fehlerschwelle 100 nm. In einigen Ausführungsformen beträgt die spezifizierte Fehlerschwelle 50 nm. In einigen Ausführungsformen umfasst das System drei oder mehr Bildsensoren, und wobei das System konfiguriert ist, um die Fluoreszenz in jedem von drei oder mehr Wellenlängenbereichen auf einen anderen Bildsensor abzubilden. In einigen Ausführungsformen beträgt ein Unterschied in der Position einer Brennebene für jeden der drei oder mehr Bildsensoren und die Probenebene weniger als 100 nm. In einigen Ausführungsformen beträgt ein Unterschied in der Position einer Brennebene für jeden der drei oder mehr Bildsensoren und die Probenebene weniger als 50 nm. In einigen Ausführungsformen beträgt die Gesamtzeit, die erforderlich ist, um die Probenebene neu zu positionieren, den Fokus gegebenenfalls anzupassen und ein Bild aufzunehmen, weniger als 0,4 Sekunden pro Sichtfeld. In einigen Ausführungsformen beträgt die Gesamtzeit, die erforderlich ist, um die Probenebene neu zu positionieren, den Fokus gegebenenfalls anzupassen und ein Bild aufzunehmen, weniger als 0,3 Sekunden pro Sichtfeld.
  • Ebenfalls offenbart sind hierin Fluoreszenzbildgebungssysteme zur doppelseitigen Bildgebung einer Durchflusszelle, umfassend: a) eine Objektivlinse, die konfiguriert ist, um Fluoreszenz zu sammeln, die aus einem spezifizierten Sichtfeld einer Probenebene innerhalb der Durchflusszelle stammt; b) mindestens eine Tubuslinse, die zwischen der Objektivlinse und mindestens einem Bildsensor positioniert ist, wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um eine Bildgebungsleistungsmetrik für eine Kombination der Objektivlinse, der mindestens einen Tubuslinse und dem mindestens einen Bildsensor beim Abbilden einer Innenoberfläche der Durchflusszelle zu korrigieren, und wobei die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 µm und einen Spalt zwischen einer oberen Innenoberfläche und einer unteren Innenoberfläche von mindestens 50 µm aufweist; wobei die Bildgebungsleistungsmetrik für die Abbildung der oberen Innenoberfläche oder der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle im Wesentlichen dieselbe ist, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Durchflusszelle und dem mindestens einen Bildsensor hinein oder aus diesem heraus zu bewegen, ohne ein oder mehrere optische Elemente der Tubuslinse entlang des Strahlenganges zu bewegen und ohne ein oder mehrere optische Elemente der Tubuslinse in den Strahlengang hinein oder aus diesem heraus zu bewegen.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Objektivlinse ein im Handel erhältliches Mikroskopobjektiv. In einigen Ausführungsformen weist das im Handel erhältliche Mikroskopobjektiv eine numerische Apertur von mindestens 0,3 auf. In einigen Ausführungsformen weist die Objektivlinse einen Arbeitsabstand von mindestens 700 µm auf. In einigen Ausführungsformen wird die Objektivlinse korrigiert, um eine Deckglasdicke (oder Durchflusszellwanddicke) von 0,17 mm zu kompensieren. In einigen Ausführungsformen umfasst das Fluoreszenzbildgebungssystem ferner eine elektrooptische Phasenplatte, die neben der Objektivlinse und zwischen der Objektivlinse und der Tubuslinse positioniert ist, wobei die elektrooptische Phasenplatte eine Korrektur von optischen Aberrationen bereitstellt, die durch eine Flüssigkeit verursacht werden, die den Spalt zwischen der oberen Innenoberfläche und der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle füllt. In einigen Ausführungsformen ist die mindestens eine Tubuslinse eine zusammengesetzte Linse, die drei oder mehr optische Komponenten umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die mindestens eine Tubuslinse eine zusammengesetzte Linse, die vier optische Komponenten umfasst. In einigen Ausführungsformen umfassen die vier optischen Komponenten in dieser Reihenfolge eine erste asymmetrische konvex-konvexe Linse, eine zweite plankonvexe Linse, eine dritte asymmetrische konkav-konkave Linse und eine vierte asymmetrische konvex-konkave Linse. In einigen Ausführungsformen ist die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert, um eine Bildgebungsleistungsmetrik für eine Kombination aus der Objektivlinse, der mindestens einen Tubuslinse und dem mindestens einen Bildsensor zu korrigieren, wenn eine Innenoberfläche einer Durchflusszelle mit einer Wandstärke von mindestens 1 mm abgebildet wird. In einigen Ausführungsformen ist die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert, um eine Bildgebungsleistungsmetrik für eine Kombination aus der Objektivlinse, der mindestens einen Tubuslinse und dem mindestens einen Bildsensor zu korrigieren, wenn eine Innenoberfläche einer Durchflusszelle mit einem Spalt von mindestens 100 µm abgebildet wird. In einigen Ausführungsformen ist die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert, um eine Bildgebungsleistungsmetrik für eine Kombination aus der Objektivlinse, der mindestens einen Tubuslinse und dem mindestens einen Bildsensor zu korrigieren, wenn eine Innenoberfläche einer Durchflusszelle mit einem Spalt von mindestens 200 µm abgebildet wird. In einigen Ausführungsformen umfasst das System eine einzelne Objektivlinse, zwei Tubuslinsen und zwei Bildsensoren und ist jede der beiden Tubuslinsen so ausgelegt, dass sie eine optimale Bildgebungsleistung bei einer unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlänge bereitstellen. In einigen Ausführungsformen umfasst das System eine einzelne Objektivlinse, drei Tubuslinsen und drei Bildsensoren und ist jede der drei Tubuslinsen so ausgelegt, dass sie eine optimale Bildgebungsleistung bei einer unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlänge bereitstellt. In einigen Ausführungsformen umfasst das System eine einzelne Objektivlinse, vier Tubuslinsen und vier Bildsensoren und ist jede der vier Tubuslinsen so ausgelegt, dass sie eine optimale Bildgebungsleistung bei einer unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlänge bereitstellt. In einigen Ausführungsformen ist das Design der Objektivlinse oder der mindestens einen Tubuslinse konfiguriert, um die Modulationsübertragungsfunktion im mittleren bis hohen Raumfrequenzbereich zu optimieren. In einigen Ausführungsformen umfasst die Bildgebungsleistungsmetrik eine Messung der Modulationsübertragungsfunktion (MTF) bei einer oder mehreren spezifizierten Raumfrequenzen, Defokussierung, sphärische Aberration, chromatische Aberration, Koma, Astigmatismus, Feldkrümmung, Bildverzerrung, Kontrast-Rauch-Verhältnis (CNR) oder eine beliebige Kombination davon. In einigen Ausführungsformen beträgt der Unterschied in der Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden der oberen Innenoberfläche und der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle weniger als 10 %. In einigen Ausführungsformen beträgt der Unterschied in der Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden der oberen Innenoberfläche und der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle weniger als 5 %. In einigen Ausführungsformen stellt die Verwendung der mindestens einen Tubuslinse eine mindestens äquivalente oder stärkere Verbesserung der Bildgebungsleistungsmetrik für die doppelseitige Bildgebung im Vergleich zu jener für ein herkömmliches System bereit, das eine Objektivlinse, einen bewegungsbetätigten Kompensator und einen Bildsensor umfasst. In einigen Ausführungsformen stellt die Verwendung der mindestens einen Tubuslinse eine mindestens 10%igen Verbesserung der Bildgebungsleistungsmetrik für die doppelseitige Bildgebung im Vergleich zu jener für ein herkömmliches System bereit, das eine Objektivlinse, einen bewegungsbetätigten Kompensator und einen Bildsensor umfasst.
  • Hierin offenbart sind Beleuchtungssysteme zur Verwendung in bildgebungsbasierten Festphasen-Genotypisierungs- und -Sequenzierungsanwendungen, wobei das Beleuchtungssystem umfasst: a) eine Lichtquelle; und b) einen flüssigen Lichtleiter, der konfiguriert ist, um von der Lichtquelle emittiertes Licht zu sammeln und es an ein spezifiziertes Beleuchtungsfeld auf einer Trägeroberfläche zu liefern, die angebundene biologische Makromoleküle umfasst.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Beleuchtungssystem ferner eine Kondensorlinse. In einigen Ausführungsformen weist das spezifizierte Beleuchtungsfeld eine Fläche von mindestens 2 mm2 auf. In einigen Ausführungsformen ist das an das spezifizierte Beleuchtungsfeld gelieferte Licht über ein spezifiziertes Sichtfeld für ein Bildgebungssystem, das zum Aufnehmen von Bildern der Trägeroberfläche verwendet wird, von gleichmäßiger Intensität. In einigen Ausführungsformen weist das spezifizierte Sichtfeld eine Fläche von mindestens 2 mm2 auf. In einigen Ausführungsformen ist das an das spezifizierte Beleuchtungsfeld gelieferte Licht über das spezifizierte Sichtfeld von gleichmäßiger Intensität, wenn ein Variationskoeffizient (CV) für die Lichtintensität weniger als 10 % beträgt. In einigen Ausführungsformen ist das an das spezifizierte Beleuchtungsfeld gelieferte Licht über das spezifizierte Sichtfeld von gleichmäßiger Intensität, wenn ein Variationskoeffizient (CV) für die Lichtintensität weniger als 5 % beträgt. In einigen Ausführungsformen weist das an das spezifizierte Beleuchtungsfeld gelieferte Licht einen Speckle-Kontrastwert von weniger als 0,1 auf. In einigen Ausführungsformen weist das an das spezifizierte Beleuchtungsfeld gelieferte Licht einen Speckle-Kontrastwert von weniger als 0,05 auf.
  • AUFNAHME DURCH BEZUGNAHME
  • Alle in dieser Patentschrift erwähnten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden hierin mit in ihrer Gesamtheit in demselben Umfang durch Bezugnahme aufgenommen, als ob jede einzelne Veröffentlichung, jedes einzelne Patent oder jede einzelne Patentanmeldung spezifisch und individuell angegeben wäre, um durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen zu werden. Im Falle eines Konflikts zwischen einem Begriff hierin und einem Begriff in einem aufgenommenen Verweis gilt der Begriff hierin.
  • Figurenliste
  • Die neuartigen Merkmale der Erfindung sind in den beigefügten Patentansprüchen besonders dargelegt. Ein besseres Verständnis der Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung erhalten, die veranschaulichende Ausführungsformen darstellt, in denen die Prinzipien der Erfindung verwendet werden, und wobei in den beiliegenden Zeichnungen:
    • Die 1A bis 1B schematisch nicht einschränkende Beispiele für die Bildgebung von Doppeloberflächen-Trägerstrukturen zur Darbietung von Probenstellen zur Bildgebung durch die hier offenbarten Bildgebungssysteme darstellen. 1A: Darstellung der Bildgebung von vorderen und hinteren Innenflächen einer Durchflusszelle. 1B: Darstellung der Bildgebung von vorderen und hinteren Außenflächen eines Substrats.
    • Die 2A bis 2B ein nicht einschränkendes Beispiel für ein Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmodul darstellen, das einen dichroitischen Strahlteiler zum Senden eines Anregungslichtstrahls zu einer Probe und zum Empfangen und Umleiten der resultierenden Fluoreszenzemission zu vier zur Detektionskanälen, die zum Detektieren der Fluoreszenzemission bei vier verschiedenen jeweiligen Wellenlängen oder Wellenlängenbändern konfiguriert sind, durch Reflexion umfasst. 2A: Isometrische Draufsicht von oben. 2B: Isometrische Ansicht von unten.
    • Die 3A bis 3B die Strahlengänge innerhalb des Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmoduls der 2A und 2B darstellen, umfassend einen dichroitischen Strahlteiler zum Senden eines Anregungslichtstrahls zu einer Probe und zum Empfangen und Umleiten einer resultierenden Fluoreszenzemission zu vier Detektionskanälen zum Detektieren der Fluoreszenzemission bei vier verschiedenen jeweiligen Wellenlängen oder Wellenlängenbändern durch Reflexion. 3A: Draufsicht von oben. 3B: Seitenansicht.
    • 4 ein Schaubild ist, das eine Beziehung zwischen der Leistung des dichroitischen Filters und dem Einfallswinkel des Strahls darstellt.
    • 5 ein Schaubild ist, das eine Beziehung zwischen der Größe des Strahl-Footprints und dem Einfallswinkel des Strahls auf einem dichroitischen Filter darstellt.
    • Die 6A bis 6B schematisch eine beispielhafte Konfiguration für dichroitische Filter und Detektionskanäle eines Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmoduls darstellen, wobei die dichroitischen Filter eine reflektierende Oberfläche aufweisen, die so geneigt ist, dass der Winkel zwischen dem einfallenden Strahl (z. B. dem zentralen Winkel) und der reflektierenden Oberfläche des dichroitischen Filtern kleiner als 45 ist. 6A: Schematische Darstellung eines Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmoduls mit vier Detektionskanälen. 6B: Detailansicht, die den Einfallswinkel (AOI) eines Lichtstrahls auf einem dichroitischen Reflektor darstellt.
    • 7 ein Schaubild bereitstellt, das eine verbesserte Leistung des dichroitischen Filters darstellt, die der in den 6A und 6B dargestellten Bildgebungsmodulkonfiguration entspricht.
    • 8 ein Schaubild bereitstellt, das eine verbesserte Leistung des dichroitischen Filters darstellt, die der in den 6A und 6B dargestellten Bildgebungsmodulkonfiguration entspricht.
    • Die 9A bis 9B Schaubilder bereitstellen, die eine verringerte Oberflächenverformung darstellen, die sich aus der Bildgebungsmodulkonfiguration der 6A und 6B ergibt. 9A die Wirkung eines Faltwinkels auf die Verschlechterung der Bildqualität darstellt, die durch Hinzufügen von 1 Welle PV sphärische Kraft zum letzten Spiegel induziert wird. 9B die Wirkung eines Faltwinkels auf die Verschlechterung der Bildqualität darstellt, die durch Hinzufügen von 0,1 Welle PV sphärische Kraft zum letzten Spiegel induziert wird.
    • Die 10A bis 10B Schaubilder bereitstellen, die eine verbesserte Anregungsfilterleistung (z. B. schärfere Übergänge zwischen Passbändern und umgebenden Sperrbändern) darstellen, die aus der Verwendung einer s-Polarisation des Anregungsstrahls resultieren. 10A: Transmissionsspektren für ein beispielhaftes dichroitisches Bandpassfilter bei Einfallswinkeln von 40 Grad und 45 Grad, wobei der einfallende Strahl linear polarisiert und in Bezug auf die Ebene des dichroitischen Filters p-polarisiert ist. 10B: Eine Änderung der Ausrichtung der Lichtquelle in Bezug auf das dichroitische Filter, so dass der einfallende Strahl in Bezug auf die Ebene des dichroitischen Filters s-polarisiert ist, führt zu einer wesentlich schärferen Kante zwischen dem Passband und dem Sperrband.
    • Die 11A bis 11B die Modulationsübertragungsfunktion (MTF) eines hierin offenbarten beispielhaften Doppeloberflächen-Bildgebungssystems mit einer numerischen Apertur (NA) von 0,3 darstellen. 11A: Erste Oberfläche. 11B: Zweite Oberfläche.
    • Die 12A bis 12B die MTF eines hierin offenbarten beispielhaften Doppeloberflächen-Bildgebungssystems mit einer NA von 0,4 darstellen. 12A: Erste Oberfläche. 12B: Zweite Oberfläche.
    • Die 13A bis 13B die MTF eines hierin offenbarten beispielhaften Doppeloberflächen-Bildgebungssystems mit einer NA von 0,5 darstellen.13A: Erste Oberfläche. 13B: Zweite Oberfläche.
    • Die 14A bis 14B die MTF eines hierin offenbarten beispielhaften Doppeloberflächen-Bildgebungssystems mit einer NA von 0,6 darstellen. 14A: Erste Oberfläche. 14B: Zweite Oberfläche.
    • Die 15A bis 15B die MTF eines hierin offenbarten beispielhaften Doppeloberflächen-Bildgebungssystems mit einer NA von 0,7 darstellen. 15A: Erste Oberfläche. 15B: Zweite Oberfläche.
    • Die 16A bis 16B die MTF eines hierin offenbarten beispielhaften Doppeloberflächen-Bildgebungssystems mit einer NA von 0,8 darstellen. 16A: Erste Oberfläche. 16B: Zweite Oberfläche.
    • Die 17A bis 17B Graphiken zum berechneten Strehl-Verhältnis zum Abbilden einer zweiten Durchflusszellenoberfläche durch eine erste Durchflusszellenoberfläche bereitstellen.
    • 17A: Graphik zu den Strehl-Verhältnissen zum Abbilden einer zweiten Durchflusszellenoberfläche durch eine erste Durchflusszellenoberfläche als Funktion der Dicke der dazwischenliegenden Fluidschicht (Fluidkanalhöhe) für verschiedene numerische Öffnungen der Objektivlinse und/oder des optischen Systems. 17B: Graphik zum Strehl-Verhältnis als Funktion der numerischen Apertur zur Bildgebung einer zweiten Durchflusszellenoberfläche durch eine erste Durchflusszellenoberfläche und einer dazwischenliegenden Wasserschicht mit einer Dicke von 0,1 mm.
    • 18 eine schematische Darstellung eines Doppelwellenlängenanregungs-/Vierkanalemissions-Fluoreszenzbildgebungssystems der vorliegenden Offenbarung bereitstellt.
    • 19 ein Diagramm zur Verfolgung optischer Strahlen für ein Objektivlinsendesign bereitstellt, das zum Abbilden einer Oberfläche auf der gegenüberliegenden Seite eines 0,17 mm dicken Deckglases entworfen wurde.
    • 20 eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die in 19 dargestellte Objektivlinse als Funktion der Raumfrequenz bereitstellt, wenn zum Abbilden einer Oberfläche auf der gegenüberliegenden Seite eines 0,17 mm dicken Deckglases verwendet.
    • 21 eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die in 19 dargestellte Objektivlinse als Funktion der Raumfrequenz bereitstellt, wenn zum Abbilden einer Oberfläche auf der gegenüberliegenden Seite eines 0,3 mm dicken Deckglases verwendet.
    • 22 eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die in 19 dargestellte Objektivlinse als Funktion der Raumfrequenz bereitstellt, wenn eine Oberfläche abgebildet wird, die durch eine 0,1 mm dicke Schicht wässriger Flüssigkeit von jener auf der gegenüberliegenden Seite eines 0,3 mm dicken Deckglases getrennt ist.
    • 23 eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die in 19 dargestellte Objektivlinse als Funktion der Raumfrequenz bereitstellt, wenn zum Abbilden einer Oberfläche auf der gegenüberliegenden Seite eines 1,0 mm dicken Deckglases verwendet.
    • 24 eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die in 19 dargestellte Objektivlinse als Funktion der Raumfrequenz bereitstellt, wenn eine Oberfläche abgebildet wird, die durch eine 0,1 mm dicke Schicht wässriger Flüssigkeit von jener auf der gegenüberliegenden Seite eines 1,0 mm dicken Deckglases getrennt ist.
    • 25 ein Strahlverfolgungsdiagramm für ein Tubuslinsendesign bereitstellt, das, wenn es in Verbindung mit der in 19 dargestellten Objektivlinse verwendet wird, eine verbesserte doppelseitige Bildgebung durch ein 1 mm dickes Deckglas bereitstellt.
    • 26 eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die in 25 dargestellte Kombination aus Objektivlinse und Tubuslinse als Funktion der Raumfrequenz bereitstellt, wenn verwendet, um eine Oberfläche auf der gegenüberliegenden Seite eines 1,0 mm dicken Deckglases abzubilden.
    • 27 eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die in 25 dargestellte Kombination aus Objektivlinse und Tubuslinse als Funktion der Raumfrequenz bereitstellt, wenn eine Oberfläche abgebildet wird, die durch eine 0,1 mm dicke Schicht wässriger Flüssigkeit von jener auf der gegenüberliegenden Seite eines 1,0 mm dicken Deckglases getrennt ist.
    • 28 Strahlverfolgungsdiagramme für das Tubuslinsendesign (links) der vorliegenden Offenbarung bereitstellt, das optimiert wurde, um eine qualitativ hochwertige doppelseitige Bildgebungsleistung bereitzustellen. Da die Tubuslinse nicht mehr unendlich korrigiert ist, kann eine entsprechend gestaltete Nulllinse (rechts) in Kombination mit der Tubuslinse verwendet werden, um die nicht unendlich korrigierte Tubuslinse für Herstellungs- und Testzwecke zu kompensieren.
    • 29 ein nicht einschränkendes Beispiel für eine einzelne Kapillardurchflusszelle mit 2 Fluidadaptern darstellt.
    • 30 ein nicht einschränkendes Beispiel für eine Durchflusszellenpatrone darstellt, die ein Gehäuse, Fluidadapter und gegebenenfalls andere Komponenten umfasst, die zum Halten von zwei Kapillaren ausgelegt sind.
    • 31 ein nicht einschränkendes Beispiel für ein System darstellt, das eine einzelne Kapillardurchflusszelle umfasst, die mit verschiedenen Fluidströmungssteuerkomponenten verbunden ist, wobei die einzelne Kapillare mit der Montage auf einem Mikroskoptisch oder an einem anwenderspezifischen Bildgebungsinstrument zur Verwendung in verschiedenen Bildgebungsanwendungen kompatibel ist.
    • 32 ein nicht einschränkendes Beispiel für ein System darstellt, das eine Kapillardurchflusszellenpatrone mit integrierten Membranventilen umfasst, um das Totvolumen zu verringern oder minimieren und bestimmte Schlüsselreagenzien zu schonen.
    • 33 ein nicht einschränkendes Beispiel für ein System darstellt, das eine Kapillardurchflusszelle, einen Mikroskopaufbau und einen Temperatursteuermechanismus umfasst.
    • 34 ein nicht einschränkendes Beispiel für die Temperatursteuerung der Kapillardurchflusszellen unter Verwendung einer Metallplatte darstellt, die in Kontakt mit der Durchflusszellenpatrone gebracht wird.
    • 35 einen nicht einschränkenden Ansatz zur Temperatursteuerung der Kapillardurchflusszellen darstellt, der einen berührungslosen Wärmesteuermechanismus umfasst.
    • Die 36A bis 36C nicht einschränkende Beispiele für die Herstellung von Durchflusszellenvorrichtungen darstellen. 36A die Herstellung einer einteiligen Glasdurchflusszelle zeigt. 36B die Herstellung einer zweiteiligen Glasdurchflusszelle zeigt. 36C die Herstellung einer dreiteiligen Glasdurchflusszelle zeigt.
    • Die 37A bis 37C nicht einschränkende Beispiele für Glasdurchflusszellendesigns darstellen. 37A ein einteiliges Durchflusszellendesign aus Glas zeigt. 37B ein zweiteiliges Durchflusszellendesign aus Glas zeigt. 37C ein dreiteiliges Durchflusszellendesign aus Glas zeigt.
    • 38 eine Visualisierung der Clusterverstärkung in einem Kapillarlumen darstellt.
    • 39 ein nicht einschränkendes Beispiel für ein Blockdiagrams für ein Sequenzierungssystem bereitstellt, wie hierin offenbart.
    • 40 ein nicht einschränkendes Beispiel einen Ablaufplan für ein Sequenzierungsverfahren bereitstellt, wie hierin offenbart.
    • 41 ein nicht einschränkendes Beispiel für ein Schema für ein strukturiertes Beleuchtungssystem bereitstellt, wie hierin offenbart.
    • 42 ein nicht einschränkendes Beispiel für einen Ablaufplan zum Aufnehmen und Verarbeiten von strukturierten Beleuchtungsbildern einer Durchflusszellenoberfläche bereitstellt, wie hierin offenbart.
    • Die 43A bis 8 nicht einschränkende schematische Darstellungen eines gemultiplexten Lesekopfes bereitstellen, wie hierin offenbart. 43A: Seitenansicht eines gemultiplexten Lesekopfes, wobei einzelne Mikrofluorimeter konfiguriert sind, um eine gemeinsame Oberfläche abzubilden, z. B. die Innenoberfläche einer Durchflusszelle. 43B: Draufsicht auf einen gemultiplexten Lesekopf von oben, wobei die Bildgebungsgänge dargestellt sind, die von einzelnen Mikrofluorimetern des gemultiplexten Lesekopfs aufgenommen wurden.
    • Die 44A bis 8 nicht einschränkende schematische Darstellungen eines gemultiplexten Lesekopfes bereitstellen, wie hierin offenbart. 44A: Seitenansicht eines gemultiplexten Lesekopfes, wobei eine erste Teilmenge einer Mehrzahl einzelner Mikrofluorimeter konfiguriert ist, um eine erste Oberfläche abzubilden, z. B. eine erste Innenoberfläche einer Durchflusszelle, und eine zweite Teilmenge der Mehrzahl einzelner Mikrofluorimeter konfiguriert ist, um eine zweite Oberfläche abzubilden, z. B. eine zweite Innenoberfläche einer Durchflusszelle. 44B: Draufsicht auf den gemultiplexten Lesekopf von 44A von oben, wobei die Bildgebungsgänge dargestellt sind, die von einzelnen Mikrofluorimetern des gemultiplexten Lesekopfs aufgenommen wurden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Es besteht ein Bedarf an Fluoreszenzbildgebungsverfahren und -systemen, die eine erhöhte optische Auflösung und eine verbesserte Bildqualität für Genomanwendungen bereitstellen, die zu entsprechenden Verbesserungen der Genauigkeit von Genomtestungen führen. Hierin offenbart sind Designs optischer Systeme für Hochleistungs-Fluoreszenzbildgebungsverfahren und -systeme, die eine verbesserte optische Auflösung (einschließlich optischer Hochleistungsauflösung), eine verbesserte Bildqualität und/oder einen höheren Durchsatz für auf Fluoreszenzbildgebung basierende Genomanwendungen bereitstellen können. Die offenbarten Designs optischer Beleuchtungs- und Bildgebungssysteme können einen oder mehrere der folgenden Vorteile bereitstellen: verbesserte Leistung der dichroitischen Filter, erhöhte Gleichmäßigkeit des Frequenzgangs der dichroitischen Filter, verbesserte Anregungsstrahlfilterung, größere Sichtfelder, erhöhte räumliche Auflösung, verbesserte Modulationsübertragung, verbessertes Kontrast-Rausch-Verhältnis und verbesserte Bildqualität, höhere Raumabtastfrequenz, schnellere Übergänge zwischen der Bilderfassung beim Neupositionieren der Probenebene zur Erfassung einer Reihe von Bildern (z. B. mit unterschiedlichen Sichtfeldern), verbessertes Tastverhältnis des Bildgebungssystems und Bildaufnahme und -analyse mit höherem Durchsatz.
  • In einigen Fällen können Verbesserungen der Bildgebungsleistung, z. B. für zweiseitige (Durchflusszellen-)Bildgebungsanwendungen, die die Verwendung von dicken Durchflusszellenwänden (z. B. Wandstärke (oder Deckglasstärke) von > 700 µm) und Fluidkanälen (z. B. Fluidkanalhöhe oder -dicke von 50 bis 200 µm) umfassen, unter Verwendung neuartiger Objektivlinsendesigns erreicht werden, die die optische Aberration korrigieren, die durch Bildgebungsoberflächen auf der gegenüberliegenden Seite von dicken Deckgläsern und/oder Fluidkanälen vom Objektiv eingebracht wird.
  • In einigen Fällen können Verbesserungen der Bildgebungsleistung, z. B. für zweiseitige (Durchflusszellen-)Bildgebungsanwendungen, die die Verwendung von dicken Durchflusszellenwänden (z. B. Wandstärke (oder Deckglasstärke) von > 700 µm) und Fluidkanälen (z. B. Fluidkanalhöhe oder -dicke von 50 bis 200 µm) umfassen, selbst unter Verwendung von handelsüblichen Standardobjektiven erreicht werden, indem ein neuartiges Tubuslinsendesign verwendet wird, das im Gegensatz zur Tubuslinse in einem herkömmlichen Mikroskop einfach ein Bild auf der Zwischenbildebene erzeugt, die optischen Aberrationen korrigiert, die durch die dicken Durchflusszellwände und/oder die dazwischenliegende Fluidschicht in Kombination mit dem Objektiv induziert werden.
  • In einigen Fällen können Verbesserungen der Bildgebungsleistung, z. B. für Mehrkanal-Bildgebungsanwendungen (z. B. Zweifarben- oder Vierfarben-Bildgebungsanwendungen), erzielt werden, indem mehrere Tubuslinsen verwendet werden, eine für jeden Bildgebungskanal, wobei jedes Tubuslinsendesign für den spezifischen Wellenlängenbereich optimiert wurde, der in diesem Bildgebungskanal verwendet wird.
  • In einigen Fällen können Verbesserungen der Bildgebungsleistung, z. B. für zweiseitige (Durchflusszellen-)Bildgebungsanwendungen, erreicht werden, indem eine elektrooptische Phasenplatte in Kombination mit einer Objektivlinse verwendet wird, um die optischen Aberrationen zu kompensieren, die durch die Fluidschicht induziert werden, die die oberen (nahen) und unteren (fernen) Innenflächen einer Durchflusszelle trennt. In einigen Fällen kann dieser Designansatz auch Schwingungen kompensieren, die beispielsweise durch einen bewegungsbetätigten Kompensator eingebracht werden, der abhängig davon, welche Durchflusszellenoberfläche abgebildet wird, in den Strahlengang hinein oder aus diesem heraus bewegt wird.
  • Es werden verschiedene Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmoduldesigns offenbart, die Beleuchtungs- und Bildgebungsstrahlengänge beinhalten können, die gefaltete Strahlengänge umfassen (die z. B. einen oder mehrere Strahlteiler oder Strahlkombinierer umfassen, wie dichroitische Strahlteiler oder -kombinierer), die einen Anregungslichtstrahl auf eine Objektivlinse richten und Emissionslicht, das durch die Objektivlinse übertragen wird, auf mehrere Detektionskanäle richten. Einige besonders vorteilhafte Merkmale der hierin beschriebenen Fluoreszenzbildgebungsmodule sind unter anderem die Spezifikation von Einfallswinkeln dichroitischer Filter, die zu schärferen und/oder gleichmäßigeren Übergängen zwischen Passband- und Sperrbandwellenlängenbereichen der dichroitischen Filter führen. Solche Filter können in der gefalteten Optik beinhaltet sein und können dichroitische Strahlteiler oder -kombinierer umfassen. Weitere vorteilhafte Merkmale der offenbarten Bildgebungsoptikdesigns können die Position und Ausrichtung einer oder mehrerer Anregungslichtquellen und eines oder mehrerer Detektionsstrahlengänge in Bezug auf die Objektivlinse und ein dichroitisches Filter beinhalten, die bzw. das den Anregungsstrahl empfängt. Der Anregungsstrahl kann auch linear polarisiert sein und die Ausrichtung der linearen Polarisation kann so sein, dass s-polarisiertes Licht auf die dichroitische reflektierende Oberfläche des dichroitischen Filters fällt. Solche Merkmale können möglicherweise die Anregungsstrahlfilterung verbessern und/oder den Wellenfrontfehler verringern, der aufgrund der Oberflächenverformung von dichroitischen Filtern in den Emissionslichtstrahl eingebracht wird. Die hierin beschriebenen Fluoreszenzbildgebungsmodule können beliebige dieser Merkmale beinhalten oder auch nicht und können beliebiger dieser Vorteile beinhalten oder auch nicht.
  • Hierin werden auch Vorrichtungen und Systeme beschrieben, die konfiguriert sind, um eine große Anzahl verschiedener Nukleinsäuresequenzen durch Bildgebung zu analysieren, z. B. Anordnungen von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen oder amplifizierten Nukleinsäureclustern, die auf Durchflusszellenoberflächen gebildet sind. Die hierin beschriebenen Systeme und Vorrichtungen können z. B. auch bei der Durchführung einer Sequenzierung für die vergleichende Genomik, der Durchführung einer Verfolgung der Genexpression, der Durchführung einer Analyse von Mikro-RNA-Sequenzen, der Epigenomik sowie der Charakterisierung der Aptamer- und Phagendisplay-Bibliotheken und der Durchführung anderer Sequenzierungsanwendungen nützlich sein. Die hierin offenbarten Vorrichtungen und Systeme umfassen verschiedene Kombinationen aus optischen, mechanischen, fluidischen, thermischen, elektrischen und Computervorrichtungen/-aspekten. Die Vorteile, die durch die offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen, -patronen und -systeme erzielt werden, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein: (i) verringerte Komplexität und Kosten der Herstellung von Vorrichtungen und Systemen, (ii) signifikant niedrigere Kosten für Verbrauchsgüter (z. B. im Vergleich zu jenen für derzeit verfügbare Nukleinsäuresequenzierungssysteme), (iii) Kompatibilität mit typischen Oberflächenfunktionalisierungsverfahren für Durchflusszellen, (iv) flexible Durchflusskontrolle in Kombination mit mikrofluidischen Komponenten, z. B. Spritzenpumpen und Membranventilen usw., und (v) flexibler Durchsatz des Systems.
  • Hierin werden Kapillardurchflusszellenvorrichtungen und Kapillardurchflusszellenpatronen offenbart, die aus handelsüblichen Einwegkapillaren mit einem Lumen (z. B. einem einzelnen Fluiddurchflusskanal) oder mit mehreren Lumen hergestellt sind, die auch Fluidadapter, Patronengehäuse, eine oder mehrere integrierte Komponenten zur Fluiddurchflusssteuerung oder eine beliebige Kombination davon umfassen können. Hierin werden auch Systeme auf der Basis von Kapillardurchflusszellen offenbart, die eine oder mehrere Kapillardurchflusszellenvorrichtungen (oder mikrofluidische Chips), eine oder mehrere Kapillardurchflusszellenpatronen (oder mikrofluidische Patronen), Fluiddurchflusssteuerungsmodule, Temperatursteuermodule, Bildgebungsmodule oder eine beliebige Kombination davon umfassen können.
  • Die Designmerkmale einiger offenbarter Kapillardurchflusszellenvorrichtungen, - patronen und -systeme sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, (i) eine einheitliche Strömungskanalkonstruktion, (ii) geschlossenes, zuverlässiges und sich wiederholendes Wechseln zwischen Reagenzströmen, das mit einem einfachen Lade-/Entlademechanismus implementiert werden kann, so dass die Fluidschnittstellen zwischen dem System und den Kapillaren zuverlässig verschlossen werden, was den Austausch der Kapillaren und die Wiederverwendung des Systems erleichtert und eine präzise Steuerung der Reaktionsbedingungen wie Reagenskonzentration, pH-Wert und Temperatur ermöglicht, (iii) austauschbare einzelne Fluiddurchflusskanalvorrichtungen oder Kapillardurchflusszellenpatronen mit mehreren Strömungskanälen, die austauschbar verwendet werden können, um einen flexiblen Systemdurchsatz bereitzustellen, und (iv) Kompatibilität mit einer großen Vielzahl von Detektionsverfahren wie der Fluoreszenzbildgebung.
  • Obwohl die offenbarten Kapillardurchflusszellenvorrichtungen und -systeme, Kapillardurchflusszellenpatronen, auf Kapillardurchflusszellen basierten Systeme, mikrofluidische Vorrichtungen und Patronen, auf mikrofluidischem Chip basierten Systeme hauptsächlich im Zusammenhang mit ihrer Verwendung für Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen beschrieben werden, können verschiedene Aspekte der offenbarten Vorrichtungen und Systeme nicht nur auf die Nukleinsäuresequenzierung angewendet werden, sondern auch auf jede andere Art der chemischen Analyse, biochemischen Analyse, Nukleinsäureanalyse, Zellanalyse oder Gewebeanalyse. Es versteht sich, dass verschiedene Aspekte der offenbarten Verfahren, Vorrichtungen und Systeme einzeln, gemeinsam oder in Kombination miteinander verstanden werden können. Obwohl hierin hauptsächlich im Zusammenhang mit der Fluoreszenzbildgebung erörtert (einschließlich z. B. Fluoreszenzmikroskopiebildgebung, konfokaler Fluoreszenzbildgebung, Zwei-Photonen-Fluoreszenz und dergleichen), wird es dem Fachmann klar sein, dass viele der offenbarten Ansätze und Merkmale optischer Designs auf andere Bildgebungsmodi anwendbar sind, z. B. Hellfeldbildgebung, Dunkelfeldbildgebung, Phasenkontrastbildgebung und dergleichen.
  • Definitionen: Sofern nicht anders definiert, weisen alle hierin verwendeten Fachbegriffe dieselbe Bedeutung auf, wie sie von dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Offenbarung gehört, allgemein verstanden wird.
  • Wie in dieser Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen verwendet, beinhalten die Singularformen „ein“, „eine“ und „der/die/das“ den Plural, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Jeder Verweis auf „oder“ soll hierin „und/oder“ einschließen, sofern nicht anders angegeben.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „etwa“ eine Zahl auf diese Zahl plus oder minus 10 % dieser Zahl. Der Begriff „etwa“ bezieht sich im Zusammenhang mit einem Bereich auf diesen Bereich minus 10 % seines niedrigsten Werts und plus 10 % seines höchsten Wertes.
  • Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke „Bildgebungsmodul“, „Bildgebungseinheit“, „Bildgebungssystem“, „optisches Bildgebungsmodul“, „optische Bildgebungseinheit“ und „optisches Bildgebungssystem“ austauschbar verwendet und können Komponenten oder Untersysteme eines größeren Systems umfassen, die auch beispielsweise Fluidikmodule, Temperatursteuermodule, Translationsstufen, Roboterfluidabgabe und/oder - mikroplattenhandhabung, Prozessor oder Computer, Instrumentensteuersoftware, Datenanalyse und Anzeigesoftware usw. beinhalten können.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Detektionskanal“ auf einen Strahlengang (und/oder die darin enthaltenen optischen Komponenten) innerhalb eines optischen Systems, der konfiguriert ist, um ein optisches Signal, das von einer Probe stammt, an einen Detektor zu liefern. In einigen Fällen kann ein Detektionskanal zum Durchführen spektroskopischer Messungen konfiguriert sein, z. B. zum Überwachen eines Fluoreszenzsignals oder eines anderen optischen Signals unter Verwendung eines Detektors wie eines Photovervielfachers. In einigen Fällen kann ein „Detektionskanal“ ein „Bildgebungskanal“ sein, d. h. ein Strahlengang (und/oder die darin enthaltenen optischen Komponenten) innerhalb eines optischen Systems, der konfiguriert ist, um ein Bild zu erfassen und an einen Bildsensor zu liefern.
  • Wie hierin verwendet, kann sich eine „detektierbare Markierung“ auf eine Mehrzahl von detektierbaren Markierungen oder Tags beziehen, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Chromophore, Fluorophore, Quantenpunkte, hochkonvertierende Leuchtstoffe, lumineszierende oder chemilumineszierende Moleküle, Radioisotope, magnetische Nanopartikel, Masse-Tags und dergleichen. In einigen Fällen kann eine bevorzugte Markierung ein Fluorophor umfassen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Anregungswellenlänge“ auf die Wellenlänge des Lichts, das verwendet wird, um einen Fluoreszenzindikator (z. B. ein Fluorophor oder ein Farbstoffmolekül) anzuregen und Fluoreszenz zu erzeugen. Obwohl die Anregungswellenlänge typischerweise als eine einzelne Wellenlänge, z. B. 620 nm, spezifiziert ist, wird der Fachmann verstehen, dass sich diese Patentschrift auf einen Wellenlängenbereich oder einen Anregungsfilterbandpass bezieht, der auf der spezifizierten Wellenlänge zentriert ist. Beispielsweise umfasst in einigen Fällen Licht der spezifizierten Anregungswellenlänge Licht der spezifizierten Wellenlänge ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm oder mehr. In einigen Fällen kann die verwendete Anregungswellenlänge mit dem Absorptionspeakmaximum des Fluoreszenzindikators übereinstimmen oder auch nicht.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Emissionswellenlänge“ auf die Wellenlänge des Lichts, das von einem Fluoreszenzindikator (z. B. einem Fluorophor oder Farbstoffmolekül) bei Anregung durch Licht einer geeigneten Wellenlänge emittiert wird. Obwohl die Emissionswellenlänge typischerweise als eine einzelne Wellenlänge, z. B. 670 nm, spezifiziert ist, wird der Fachmann verstehen, dass sich diese Patentschrift auf einen Wellenlängenbereich oder einen Emissionsfilterbandpass bezieht, der auf der spezifizierten Wellenlänge zentriert ist. In einigen Fällen umfasst Licht der spezifizierten Emissionswellenlänge Licht der spezifizierten Wellenlänge ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm oder mehr. In einigen Fällen kann die verwendete Emissionswellenlänge mit dem Emissionspeakmaximum des Fluoreszenzindikators übereinstimmen oder auch nicht.
  • Wie hierin verwendet, ist die Fluoreszenz „spezifisch“, wenn sie von Fluorophoren herrührt, die an die Oberfläche anelliert oder auf andere Weise an diese gebunden sind, wie fluoreszierend markierte Nukleinsäuresequenzen mit einer Region einer umgekehrten Komplementarität zu einem entsprechenden Segment eines Oligonukleotidadapters auf der Oberfläche und an dieses entsprechende Segment anelliert. Diese Fluoreszenz wird mit Fluoreszenz kontrastiert, die von Fluorophoren herrührt, die nicht durch einen solchen Anellierungsprozess an die Oberfläche oder in einigen Fällen an die Hintergrundfluoreszenz der Oberfläche angebunden sind.
  • Wie hierin verwendet, ist eine „Nukleinsäure“ (auch als „Nukleinsäuremolekül“, „Polynukleotid“, „Oligonukleotid“, Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) bezeichnet) ein lineares Polymer aus zwei oder mehr Nukleotiden, die durch kovalente internukleosidische Verknüpfungen verbunden sind, oder Varianten oder funktionelle Fragmente davon. In natürlich vorkommenden Beispielen für Nukleinsäuren ist die Internukleosidverknüpfung typischerweise eine Phosphodiesterbindung. Andere Beispiele umfassen jedoch gegebenenfalls andere Internukleosidverknüpfungen, wie beispielsweise Phosphorthiolatverknüpfungen, und können eine Phosphatgruppe umfassen oder auch nicht. Nukleinsäuren beinhalten doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA, DNA/RNA-Hybride, Peptidnukleinsäuren (PNAs), Hybride zwischen PNAs und DNA oder RNA und können auch andere Arten von Nukleinsäuremodifikationen beinhalten.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „Nukleotid“ auf ein Nukleotid, ein Nukleosid oder ein Analogon davon. In einigen Fällen ist das Nukleotid ein N- oder C-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase (z. B. ein Desoxyribonukleosid, das 2-Desoxy-D-ribose enthält, oder ein Ribonukleosid, das D-Ribose enthält). Beispiele für andere Nukleotidanaloga sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale Methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide und dergleichen.
  • Fluoreszenzbildgebung als Informationspipeline betrachtet: Eine nützliche Abstraktion der Rolle, die Fluoreszenzbildgebungssysteme bei typischen genomischen Assaytechniken (einschließlich Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen) spielen, ist als Informationspipeline, bei der das Photonensignal an einem Ende der Pipeline eintritt, z. B. der Objektivlinse, die zur Bildgebung verwendet wird, und ortsspezifische Informationen bezüglich des Fluoreszenzsignals kommen am anderen Ende der Pipeline, z. B. an der Position des Bildsensors, heraus. Wenn mehr Informationen durch diese Pipeline gepumpt werden, gehen zwangsläufig einige Inhalte während dieses Übertragungsprozesses verloren und werden nie wiederhergestellt. Ein Beispiel für diesen Fall ist, wenn zu viele markierte Moleküle (oder klonal amplifizierte Molekülcluster) in einem kleinen Bereich einer Substratoberfläche vorhanden sind, um im Bild klar aufgelöst zu werden; an der Position des Bildsensors wird es schwierig, Photonensignale zu unterscheiden, die von benachbarten Molekülclustern stammen, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, das Signal dem falschen Cluster zuzuordnen, was zu Detektionsfehlern führt.
  • Design von optischen Bildgebungsmodulen: Ziel des Designs eines optischen Bildgebungsmoduls ist es daher, den Informationsfluss durch diese Detektionspipeline zu maximieren und Detektionsfehler zu minimieren. Im Designprozess müssen mehrere wichtige Designelemente berücksichtigt werden, darunter:
  • 1) Abgleichen der physikalischen Merkmalsdichte auf der abzubildenden Substratoberfläche mit der Gesamtbildqualität des optischen Bildgebungssystems und der Pixelabtastfrequenz des verwendeten Bildsensors. Eine Nichtübereinstimmung dieser Parameter kann zu einem Informationsverlust oder manchmal sogar zur Erzeugung falscher Informationen führen, z. B. kann ein räumliches Aliasing auftreten, wenn die Pixelabtastfrequenz niedriger als das Zweifache der Grenze der optischen Auflösung ist.
  • 2) Abgleichen der Größe des abzubildenden Bereichs mit der Gesamtbildqualität des optischen Bildgebungssystems und der Fokusqualität über das gesamte Sichtfeld.
  • 3) Abgleichen der Effizienz der optischen Sammlung, der Modulationsübertragungsfunktion und der Bildsensorleistungseigenschaften des Designs des optischen Systems mit dem Fluoreszenzphotonenfluss, der für den Eingangsanregungsphotonenfluss erwartet wird, der Farbstoffeffizienz (bezogen auf den Farbstoffextinktionskoeffizienten und die Fluoreszenzquantenausbeute) erwartet wird, unter Berücksichtigung von Hintergrundsignal- und Systemrauschencharakteristika.
  • 4) Maximierung der Trennung des Spektralinhalts, um das Übersprechen zwischen Fluoreszenzbildgebungskanälen zu verringern.
  • 5) Effektive Synchronisation der Bildaufnahmeschritte mit der Neupositionierung der Probe oder Optik zwischen der Bilderfassung verschiedener Sichtfelder, um die Ausfallzeit des Bildgebungssystems zu minimieren (oder dessen Tastverhältnis zu maximieren)und somit den Gesamtdurchsatz des Bilderfassungsprozesses zu maximieren.
  • Diese Offenbarung beschreibt einen systematischen Weg, um jedes der oben beschriebenen Designelemente zu berücksichtigen, und Spezifikationen auf Komponentenebene für das Bildgebungssystem zu erstellen.
  • Verbesserte optische Auflösung und Bildqualität zur Verbesserung oder Maximierung der Informationsübertragung und des Informationsdurchsatzes: Eine nicht einschränkende Designausübung kann darin bestehen, mit der optischen Auflösung zu beginnen, die erforderlich ist, um zwei benachbarte Merkmale zu unterscheiden, wie in Form einer Anzahl X von Linienpaaren pro mm (Ip/mm) spezifiziert, und diese in eine entsprechend notwendige numerische Apertur (NA) zu translatieren. Die notwendige numerische Apertur kann dann verwendet werden, um den resultierenden Einfluss auf die Modulationsübertragungsfunktion und den Bildkontrast zu bewerten.
  • Die Standard-Modulationsübertragungsfunktion (MTF) beschreibt den Raumfrequenzgang für den Bildkontrast (Modulation), der über ein optisches System übertragen wird; der Bildkontrast nimmt in Abhängigkeit von der Raumfrequenz ab und mit zunehmender NA zu. Diese Funktion begrenzt den Kontrast/die Modulation, die für eine gegebene NA erreicht werden kann. Darüber hinaus kann sich ein Wellenfrontfehler negativ auf die MTF auswirken, so dass es wünschenswert ist, das Design des optischen Systems unter Verwendung der echten System-MTF anstelle der durch beugungsbegrenzte Optik vorhergesagten zu verbessern oder zu optimieren. Es ist zu beachten, dass sich MTF, wie hierin verwendet, auf die MTF des Gesamtsystems bezieht (einschließlich des vollständigen Strahlenganges vom Deckglas zum Bildsensor), obwohl die Designausübung in erster Linie die MTF der Objektivlinse berücksichtigen kann.
  • In Anwendungen genomischer Testung, bei denen das abzubildende Ziel eine Anordnung von „Flecken“ mit hoher Dichte auf einer Oberfläche ist (entweder zufällig verteilt oder strukturiert), kann der minimale Modulationsübertragungswert bestimmt werden, der für die nachgeschaltete Analyse erforderlich ist, um zwei benachbarte Flecke aufzulösen und zwischen vier möglichen Zuständen (z. B. EIN-AUS, EIN-EIN, AUS-EIN und AUS-AUS) zu unterscheiden. Angenommen, die Flecke sind klein genug, um als Punktlichtquellen angenähert zu werden. Angenommen, dass die Detektionsaufgabe darin besteht, zu bestimmen, ob die zwei benachbarten Flecke, die durch einen Abstand d voneinander getrennt sind, EIN oder AUS sind (mit anderen Worten hell oder dunkel), und dass das Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) für die Fluoreszenzsignale aus den Flecken in der Probenebene (oder Objektebene) CProbe ist, dann kann das CNR des Auslesesignals für die beiden benachbarten Flecken in der Bildsensorebene CBild als CBild = CProbe × MTF(1 / d), wobei MTF(1 / d) der MTF-Wert bei einer Raumfrequenz = (1 / d) ist, eng angenähert werden.
  • In einem typischen Design muss der Wert von C möglicherweise mindestens 4 betragen, damit ein einfaches Schwellenwertverfahren verwendet werden kann, um eine Fehlklassifizierung von Fluoreszenzsignalen zu vermeiden. Unter der Annahme einer Gaußschen Verteilung der Fluoreszenzsignalintensitäten um einen Mittelwert bei einem CBild > 4 beträgt der erwartete Fehler bei der korrekten Klassifizierung von Fluoreszenzsignalen (z. B. als EIN oder AUS) < 0,035 %. Die Verwendung einer proprietären Sequenzierung mit hohem CNR und einer Oberflächenchemie, wie sie in der US-Patentanmeldung Nr. 16/363,842 beschrieben ist, ermöglicht es, CNR-Werte (CProbe-Werte) der Probenebene für Cluster von klonal amplifizierten, markierten Oligonukleotidmolekülen zu erhalten, die an eine Substratoberfläche von mehr als 12 (oder sogar viel höher) angebunden sind, wenn für ein spärliches Feld (d. h. bei einer geringen Oberflächendichte von Clustern oder Flecken) gemessen, bei dem die MTF einen Wert von nahezu 100 % aufweist. Unter der Annahme eines CNR-Werts der Probenebene von CProbe > 12 und einer Zielklassifizierungsfehlerrate von < 0,1 % (also CBild > 4) kann in einigen Implementierungen der Minimalwert für M(1 / d) als M(1 / d) = 4 / 12 ~ 33 % bestimmt werden. Somit kann ein Modulationsübertragungsfunktionsschwellenwert von mindestens 33 % verwendet werden, um den Informationsgehalt des übertragenen Bildes beizubehalten.
  • Die Designausübung kann den Mindesttrennabstand von zwei Merkmalen oder Flecken d mit der erforderlichen optischen Auflösung (wie oben in Bezug auf X (Ip/mm) spezifiziert) als d = (1 mm) / X in Beziehung setzen, d. h., d ist der Mindesttrennabstand zwischen zwei Merkmalen oder Flecken, der vom optischen System vollständig aufgelöst werden kann. In einigen hierin offenbarten Designs, bei denen das Ziel der Designanalyse darin besteht, die Übertragung von relevanten Informationen zu erhöhen oder zu maximieren, kann dieses Designkriterium auf d = (1 mm) / X / A gelockert werden, wobei 2 > A > 1 ist. Bei gleicher optischer Auflösung von X Ip/mm wird der Wert von d, der minimale auflösbare Fleckenabstand in der Probenebene, verringert, wodurch die Verwendung höherer Merkmalsdichten ermöglicht wird.
  • Die Designausübung bestimmt die minimale Raumabtastfrequenz in der Abtastebene unter Verwendung der Nyquist-Kriterien, wobei die Raumabtastfrequenz S ≥ 2 × X ist (und wobei X die optische Auflösung des Bildgebungssystems ist, die in X Ip/mm spezifiziert ist, wie oben angegeben). Wenn die Raumabtastfrequenz des Systems nahe an den Nyquist-Kriterien liegt, wie dies häufig der Fall ist, führt eine Auflösung des Bildgebungssystems von mehr als S zu einem Aliasing, da die vom optischen System aufgelösten Informationen mit höherer Frequenz vom Bildsensor nicht ausreichend abgetastet werden können.
  • Bei einigen der hierin offenbarten Designs kann ein Überabtastungsschema verwendet werden, das auf der Beziehung S = B x Y basiert (wobei B ≥ 2 und Y die wahre MTF-Grenze des optischen Systems ist), um die Informationsübertragungskapazität des Bildgebungssystems weiter zu verbessern. Wie oben angegeben, entspricht X (Ip/mm) einem praktischen minimalen Modulationsübertragungswert ungleich Null (> 33 %), während Y (Ip/mm) die Grenze der optischen Auflösung ist, so dass die Modulation bei Y (Ip/mm) 0 ist. Somit kann in den offenbarten Designs Y (Ip/mm) vorteilhafterweise signifikant größer als X sein. Für Werte von B ≥ 2 sind die offenbarten Designs eine Überabtastung für die Abtastobjektfrequenz X, d. h. S ≥ B × Y > 2 × X.
  • Die obige Beziehung kann verwendet werden, um die Systemvergrößerung zu bestimmen, und kann eine Obergrenze für die Pixelgröße des Bildsensors bereitstellen. Die Wahl der Pixelgröße des Bildsensors wird sowohl an die optische Qualität des Systems als auch an die Raumabtastfrequenz angepasst, die zur Reduzierung des Aliasing erforderlich ist. Die Untergrenze der Pixelgröße des Bildsensors kann basierend auf dem Photonendurchsatz bestimmt werden, da die relativen Rauschbeiträge mit kleineren Pixeln zunehmen.
  • Es sind jedoch auch andere Designansätze möglich. Zum Beispiel kann das Reduzieren der NA auf weniger als 0,6 (z. B. 0,5 oder weniger) eine erhöhte Schärfentiefe bereitstellen. Eine solche erhöhte Schärfentiefe kann eine doppelte Oberflächenabbildung ermöglichen, bei der zwei Oberflächen mit unterschiedlichen Tiefen gleichzeitig mit oder ohne Neufokussierung abgebildet werden können. Wie oben erörtert, kann das Reduzieren der NA die optische Auflösung verringern. In einigen Implementierungen kann die Verwendung einer höheren Anregungsstrahlleistung, z. B. 1 W oder höher, verwendet werden, um ein starkes Signal zu erzeugen. Eine Probe mit inhärent hohem Kontrast (d. h. mit einer Probenoberfläche, die ein starkes Vordergrundsignal und ein drastisch verringertes Hintergrundsignal aufweist, kann auch verwendet werden, um die Aufnahme von Bildern mit hohem Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR), z. B. mit CNR-Werten von > 20, die eine verbesserte Signalunterscheidung für das Base-Calling in Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen usw. bereitstellen, zu erleichtern. In einigen Designs optischer Systeme hierin wird offenbart, werden Probenträgerstrukturen, wie beispielsweise Durchflusszellen mit hydrophilen Oberflächen eingesetzt Hintergrundrauschen zu verringern.
  • In verschiedenen Implementierungen wird durch die offenbarten optischen Systeme ein großes Sichtfeld (FOV) bereitgestellt. Beispielsweise kann ein Sichtfeld von mehr als 2 oder 3 mm bei einigen optischen Bildgebungssystemen bereitgestellt werden, die beispielsweise eine Objektivlinse und eine Tubuslinse umfassen. In einigen Fällen stellt das optische Bildgebungssystem eine verringerte Vergrößerung bereit, beispielsweise eine Vergrößerung von weniger als 10-fach. Eine solche verringerte Vergrößerung kann in einigen Implementierungen große FOV-Designs erleichtern. Trotz einer verringerten Vergrößerung kann die optische Auflösung solcher Systeme immer noch ausreichend sein, da Detektoranordnungen mit kleiner Pixelgröße oder kleinem Pixelabstand verwendet werden können. In einigen Implementierungen können Bildsensoren verwendet werden, die eine Pixelgröße umfassen, die kleiner als das Zweifache der optischen Auflösung ist, die durch das optische Bildgebungssystem (z. B. Objektiv und Tubuslinse) bereitgestellt wird, um den Nyquist-Satz zu erfüllen.
  • Es sind auch noch andere Designs möglich. Bei einigen optischen Designs, die konfiguriert sind, um eine Doppeloberflächenbildgebung bereitzustellen, bei der zwei Oberflächen in unterschiedlichen Tiefen gleichzeitig abgebildet werden können, ist das optische Bildgebungssystem (z. B. die Objektivlinse und/oder die Tubuslinse) konfiguriert, um die optische Aberration für die Abbildung der beiden Oberflächen (z. B. zwei Ebenen) in diesen beiden jeweiligen Tiefen stärker als an anderen Stellen (z. B. anderen Ebenen) in anderen Tiefen zu verringern. Außerdem kann das optische Bildgebungssystem konfiguriert sein, um die Aberration für die Abbildung der beiden Oberflächen (z. B. zwei Ebenen) in diesen beiden jeweiligen Tiefen durch eine durchlässige Schicht auf der Probenträgerstruktur (wie eine Glasschicht (z. B. ein Deckglas) und durch eine Lösung (z. B. eine wässrige Lösung), die die Probe umfasst oder mit einer Probe auf mindestens einer der beiden Oberflächen in Kontakt steht, zu verringern.
  • Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmodule und -systeme: In einigen Fällen können die hierin offenbarten Bildgebungsmodule oder -systeme Fluoreszenzbildgebungsmodule oder - systeme umfassen. In einigen Fällen können die hierin offenbarten Fluoreszenzbildgebungssysteme eine einzelne Fluoreszenzanregungslichtquelle (zum Bereitstellen von Anregungslicht bei einer einzelnen Wellenlänge oder innerhalb eines einzelnen Anregungswellenlängenbereichs) und einen Strahlengang umfassen, der konfiguriert ist, um das Anregungslicht an eine Probe zu liefern (z. B. fluoreszierend getaggte Nukleinsäuremoleküle oder Cluster davon, die auf einer Substratoberfläche angeordnet sind). In einigen Fällen können die hierin offenbarten Fluoreszenzbildgebungssysteme einen einzelnen Fluoreszenzemissionsbildgebungs- und -detektionskanal umfassen, z. B. einen Strahlengang, der konfiguriert ist, um die von der Probe emittierte Fluoreszenz zu sammeln und ein Bild der Probe (z. B. ein Bild einer Substratoberfläche, auf der sich fluoreszierend getaggte Nukleinsäuremoleküle oder Cluster davon befinden) zu einem Bildsensor oder einer anderen Photodetektionsvorrichtung zu liefern. In einigen Fällen können die Fluoreszenzbildgebungssysteme zwei, drei, vier oder mehr als vier Fluoreszenzanregungslichtquellen und/oder Strahlengänge umfassen, die konfiguriert sind, um Anregungslicht bei zwei, drei, vier oder mehr als vier Anregungswellenlängen (oder innerhalb von zwei, drei, vier oder mehr als vier Anregungswellenlängenbereiche) zu liefern. In einigen Fällen können die hierin offenbarten Fluoreszenzbildgebungssysteme zwei, drei, vier oder mehr als vier Fluoreszenzemissionsbildgebungs- und -detektionskanäle umfassen, die konfiguriert sind, um die von der Probe emittierte Fluoreszenz bei zwei, drei, vier oder mehr als vier Emissionswellenlängen (oder innerhalb von zwei, drei, vier oder mehr als vier Emissionswellenlängenbereichen zu sammeln) und ein Bild der Probe (z. B. ein Bild einer Substratoberfläche, auf der sich fluoreszierend getaggte Nukleinsäuremoleküle oder Cluster davon befinden) an zwei, drei, vier oder mehr als vier Bildsensoren oder andere Photodetektionsvorrichtung zu liefern.
  • Doppeloberflächenbildgebung: In einigen Fällen können die hierin offenbarten Bildgebungssysteme, einschließlich Fluoreszenzbildgebungssystemen, konfiguriert sein, um hochauflösende Bilder einer einzelnen Probenträgerstruktur oder Substratoberfläche aufzunehmen. In einigen Fällen können die hierin offenbarten Bildgebungssysteme, einschließlich Fluoreszenzbildgebungssysteme, konfiguriert sein, um hochauflösende Bilder von zwei oder mehr Probenträgerstrukturen oder Substratoberflächen, z. B. zwei oder mehr Oberflächen einer Durchflusszelle, aufzunehmen. In einigen Fällen können die von den offenbarten Bildgebungssystemen bereitgestellten hochauflösenden Bilder verwendet werden, um Reaktionen zu überwachen, die auf den zwei oder mehr Oberflächen der Durchflusszelle auftreten (z. B. Nukleinsäurehybridisierungs-, Amplifikations- und/oder Sequenzierungsreaktionen), während verschiedene Reagenzien durch die Durchflusszelle oder um ein Durchflusszellsubstrat fließen. Die 1A und 1B stellen schematische Darstellungen solcher Doppeloberflächenträgerstrukturen bereit. 1A zeigt eine Doppeloberflächenträgerstruktur wie eine Durchflusszelle, die einen internen Strömungskanal beinhaltet, durch den ein Analyt oder Reagens fließen gelassen werden kann. Der Strömungskanal kann zwischen der ersten und zweiten, oberen und unteren und/oder vorderen und hinteren Schicht wie der ersten und zweiten, oberen und unteren und/oder vorderen und hinteren Platte wie gezeigt ausgebildet sein. Eine oder mehrere der Platten können eine Glasplatte wie ein Deckglas oder dergleichen beinhalten. In einigen Implementierungen umfasst die Schicht Borosilikatglas, Quarz oder Kunststoff. Innenflächen dieser oberen und unteren Schichten stellen Wände des Strömungskanals bereit, die dazu beitragen, den Fluss des Analyten oder Reagens durch den Strömungskanal der Durchflusszelle zu begrenzen. In einigen Designs sind diese Innenflächen eben. Gleichermaßen können die obere und die untere Schicht planar sein. Bei einigen Designs ist mindestens eine zusätzliche Schicht (nicht gezeigt) zwischen der oberen und der unteren Schicht angeordnet. Diese zusätzliche Schicht kann einen oder mehrere in diese geschnittene Pfade aufweisen, die beim Definieren eines oder mehrerer Strömungskanäle und beim Steuern des Flusses des Analyten oder Reagens innerhalb des Strömungskanals helfen. Probenträgerstrukturen, z. B. Durchflusszellen, sind nachstehend näher erörtert.
  • 1A zeigt schematisch mehrere fluoreszierende Probenstellen auf der ersten und zweiten, oberen und unteren und/oder vorderen und hinteren Innenoberfläche der Durchflusszelle. In einigen Implementierungen können an diesen an diesen Stellen Reaktionen auftreten, um die Probe derart zu binden, dass von diesen Stellen Fluoreszenz emittiert wird (es ist zu beachten, dass 1A schematisch und nicht maßstabsgetreu gezeichnet ist; zum Beispiel können die Größe und der Abstand der fluoreszierenden Probenstellen kleiner als gezeigt sein).
  • 1B zeigt eine andere Doppeloberflächenträgerstruktur mit zwei Oberflächen, die fluoreszierende Probenstellen enthalten, die abgebildet werden sollen. Die Probenträgerstruktur umfasst ein Substrat mit ersten und zweiten, oberen und unteren und/oder vorderen und hinteren Außenflächen. Bei einigen Designs sind diese Außenflächen eben. In verschiedenen Implementierungen wird der Analyt oder das Reagens über diese erste und zweite Außenfläche geleitet. 1B zeigt schematisch eine Mehrzahl von fluoreszierenden Probenstellen auf den ersten und zweiten, oberen und unteren und/oder vorderen und hinteren Außenflächen der Probenträgerstruktur. In einigen Implementierungen können an diesen an diesen Stellen Reaktionen auftreten, um die Probe derart zu binden, dass von diesen Stellen Fluoreszenz emittiert wird (es ist zu beachten, dass 1B schematisch und nicht maßstabsgetreu gezeichnet ist; zum Beispiel können die Größe und der Abstand der fluoreszierenden Probenstellen kleiner als gezeigt sein).
  • In einigen Fällen können die hierin beschriebenen Fluoreszenzbildgebungsmodule und - systeme konfiguriert sein, um solche fluoreszierenden Probenstellen auf der ersten und der zweiten Oberfläche in unterschiedlichen Abständen von der Objektivlinse abzubilden. Bei einigen Designs ist jeweils nur eine der ersten oder der zweiten Oberflächen im Fokus. Dementsprechend wird bei solchen Designs eine der Oberflächen zu einem ersten Zeitpunkt abgebildet und wird die andere Oberfläche zu einem zweiten Zeitpunkt abgebildet. Der Fokus des Fluoreszenzbildgebungsmoduls kann nach dem Abbilden einer der Oberflächen geändert werden, um die andere Oberfläche mit vergleichbarer optischer Auflösung abzubilden, da die Bilder der beiden Oberflächen nicht gleichzeitig im Fokus sind. Bei einigen Designs kann ein optisches Kompensationselement in den Strahlengang zwischen der Probenträgerstruktur und dem Bildsensor eingeführt werden, um eine der beiden Oberflächen abzubilden. Die Schärfentiefe in solchen Fluoreszenzbildgebungskonfigurationen ist möglicherweise nicht groß genug, um sowohl die erste als auch die zweite Oberfläche einzuschließen. In einigen Implementierungen der hierin beschriebenen Fluoreszenzbildgebungsmodule können sowohl die erste als auch die zweite Oberfläche gleichzeitig, d. h. zeitgleich, abgebildet werden. Beispielsweise kann das Fluoreszenzbildgebungsmodul eine Schärfentiefe aufweisen, die ausreichend groß ist, um beide Oberflächen einzuschließen. In einigen Fällen kann diese erhöhte Schärfentiefe bereitgestellt werden, indem beispielsweise die numerische Apertur der Objektivlinse (oder des Mikroskopobjektivs) verringert wird, wie nachstehend ausführlicher erörtert wird.
  • Wie in den 1A und 1B gezeigt, kann die Bildgebungsoptik (z. B. eine Objektivlinse) in einem geeigneten Abstand (z. B. einem Abstand, der dem Arbeitsabstand entspricht) von der ersten und der zweiten Oberfläche positioniert sein, um fokussierte Bilder der ersten und der zweiten Oberfläche auf einem Bildsensor eines Detektionskanals zu erzeugen. Wie in dem Beispiel der 1A und 1B gezeigt, kann sich die erste Oberfläche zwischen der Objektivlinse und der zweiten Oberfläche befinden. Beispielsweise ist, wie dargestellt, die Objektivlinse sowohl über der ersten als auch über der zweiten Oberfläche angeordnet und ist die erste Oberfläche über der zweiten Oberfläche angeordnet. Die erste und die zweite Oberfläche befinden sich beispielsweise in unterschiedlichen Tiefen. Die erste und die zweite Oberfläche befinden sich in unterschiedlichen Abständen von einem oder mehreren des Fluoreszenzbildgebungsmoduls, des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls, der Bildgebungsoptik oder der Objektivlinse. Die erste und die zweite Oberfläche sind voneinander getrennt, wobei die erste Oberfläche über der zweiten Oberfläche beabstandet ist. In dem gezeigten Beispiel sind die erste und die zweite Oberfläche ebene Flächen und sind entlang einer Richtung senkrecht zu der ersten und der zweiten ebenen Fläche voneinander getrennt. In dem gezeigten Beispiel weist die Objektivlinse auch eine optische Achse auf und sind die erste und die zweite Oberfläche entlang der Richtung der optischen Achse voneinander getrennt. Gleichermaßen kann der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Oberfläche dem Längsabstand entsprechen, beispielsweise entlang des Strahlenganges des Anregungsstrahls und/oder entlang einer optischen Achse durch das Fluoreszenzbildgebungsmodul und/oder die Objektivlinse. Dementsprechend können diese beiden Oberflächen in Längsrichtung (Z) durch einen Abstand voneinander getrennt sein, der entlang der Richtung der Mittelachse des Anregungsstrahls und/oder der optischen Achse der Objektivlinse und/oder des Fluoreszenzbildgebungsmoduls liegen kann. Diese Trennung kann beispielsweise in einigen Implementierungen einem Strömungskanal innerhalb einer Durchflusszelle entsprechen.
  • Bei verschiedenen Designs weist die Objektivlinse (möglicherweise in Kombination mit einer anderen optischen Komponente, z. B. einer Tubuslinse) eine Schärfentiefe und/oder Fokustiefe auf, die mindestens so groß wie der Längsabstand (in Z-Richtung) zwischen der ersten und der zweiten Oberfläche ist. Die Objektivlinse kann somit allein oder in Kombination mit der zusätzlichen optischen Komponente fokussierte Bilder sowohl der ersten als auch der zweiten Oberfläche gleichzeitig auf einem Bildsensor eines oder mehrerer Detektionskanäle erzeugen, wobei diese Bilder eine vergleichbare optische Auflösung aufweisen. In einigen Implementierungen muss das Bildgebungsmodul möglicherweise neu fokussiert werden oder auch nicht, um Bilder sowohl der ersten als auch der zweiten Oberfläche mit vergleichbarer optischer Auflösung zu erfassen. In einigen Implementierungen muss die Kompensationsoptik nicht in einen Strahlengang des Bildgebungsmoduls hinein oder aus diesem heraus bewegt werden, um fokussierte Bilder der ersten und der zweiten Oberfläche zu erzeugen. Gleichermaßen müssen in einigen Implementierungen ein oder mehrere optische Elemente (z. B. Linsenelemente) in dem Bildgebungsmodul (z. B. die Objektivlinse und/oder eine Tubuslinse) nicht bewegt werden, beispielsweise in Längsrichtung entlang des ersten und/oder des zweiten Strahlenganges (z. B. entlang der optischen Achse der Bildgebungsoptik), um fokussierte Bilder der ersten Oberfläche zu erzeugen, im Vergleich zum Ort des einen oder der mehreren optischen Elemente, wenn sie verwendet werden, um fokussierte Bilder der zweiten Oberfläche zu erzeugen. In einigen Implementierungen beinhaltet das Bildgebungsmodul jedoch ein Autofokussystem, das konfiguriert ist, um sowohl die erste als auch die zweite Oberfläche gleichzeitig fokussiert bereitzustellen. Bei verschiedenen Implementierungen ist die Probe im Fokus, um die Probenstellen, die in lateralen Richtungen (z. B. in X- und Y-Richtung) eng beieinander liegen, ausreichend aufzulösen. Dementsprechend tritt in verschiedenen Implementierungen kein optisches Element in einen Strahlengang zwischen der Probenträgerstruktur (z. B. zwischen einer Translationsstufe, die die Probenträgerstruktur trägt) und einem Bildsensor (oder einer Photodetektoranordnung) in dem mindestens einen Detektionskanal ein, um fokussierte Bilder von fluoreszierenden Probenstellen auf einer ersten Oberfläche der Probenträgerstruktur und auf einer zweiten Oberfläche der Probenträgerstruktur zu erzeugen. Gleichermaßen wird in verschiedenen Implementierungen keine optische Kompensation durchgeführt, um ein fokussiertes Bild von fluoreszierenden Probenstellen auf einer ersten Oberfläche der Probenträgerstruktur auf dem Bildsensor oder dem Photodetektoranordnung zu erzeugen, die nicht mit der optischen Kompensation identisch ist, die zur Erzeugung eines fokussierten Bildes von fluoreszierenden Probenstellen auf einer zweiten Oberfläche der Probenträgerstruktur auf dem Bildsensor oder dem Photodetektoranordnung verwendet wird. Außerdem wird in bestimmten Implementierungen kein optisches Element in einem Strahlengang zwischen der Probenträgerstruktur (z. B. zwischen einer Translationsstufe, die die Probenträgerstruktur trägt) und einem Bildsensor in dem mindestens einen Detektionskanal unterschiedlich eingestellt, um ein fokussiertes Bild von fluoreszierenden Probenstellen auf einer ersten Oberfläche der Probenträgerstruktur zu erzeugen, als um ein fokussiertes Bild von fluoreszierenden Probenstellen auf einer zweiten Oberfläche der Probenträgerstruktur zu erzeugen. Gleichermaßen wird in einigen verschiedenen Implementierungen kein optisches Element in einem Strahlengang zwischen der Probenträgerstruktur (z. B. zwischen einer Translationsstufe, die die Probenträgerstruktur trägt) und einem Bildsensor in dem mindestens einen Detektionskanal um einen anderen Betrag oder in eine andere Richtung bewegt, um ein fokussiertes Bild von fluoreszierenden Probenstellen auf der einer ersten Oberfläche der Probenträgerstruktur auf dem Bildsensor zu erzeugen, als um ein fokussiertes Bild von fluoreszierenden Probenstellen auf einer zweiten Oberfläche der Probenträgerstruktur auf dem Bildsensor zu erzeugen. Eine beliebige Kombination der Merkmale ist möglich. Beispielsweise können in einigen Implementierungen fokussierte Bilder der oberen Innenoberfläche und der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle erhalten werden, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Durchflusszelle und dem mindestens einen Bildsensor hinein oder aus diesem heraus zu bewegen und ohne ein oder mehrere optische Elemente des Bildgebungssystems (z. B. das Objektiv und/oder die Tubuslinse) entlang des Strahlenganges (z. B. der optischen Achse) dazwischen zu bewegen. Beispielsweise können fokussierte Bilder der oberen Innenoberfläche und der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle erhalten werden, ohne ein oder mehrere optische Elemente der Tubuslinse in den Strahlengang hinein oder aus diesem heraus zu bewegen oder ohne ein oder mehrere optische Elemente der Tubuslinse entlang des Strahlenganges (z. B. optische Achse) dazwischen zu bewegen.
  • Eines oder mehrere des Fluoreszenzbildgebungsmoduls, des Beleuchtungsstrahlenganges, des Bildgebungsstrahlenganges, der Objektivlinse oder der Tubuslinse können so ausgelegt sein, dass sie die optische Aberration an zwei Orten, wie beispielsweise zwei Ebenen, die zwei Oberflächen auf einer Durchflusszelle oder einer anderen Probenträgerstruktur entsprechen, beispielsweise dort, wo sich fluoreszierende Probenstellen befinden, verringern oder minimieren. Eines oder mehrere des Fluoreszenzbildgebungsmoduls, des Beleuchtungsstrahlenganges, des Bildgebungsstrahlenganges, der Objektivlinse oder der Tubuslinse können so ausgelegt sein, dass sie die optische Aberration an den ausgewählten Orten oder Ebenen relativ zu anderen Orten oder Ebenen wie der ersten und der zweiten Oberflächen, die fluoreszierende Probenstellen auf einer Durchflusszelle mit zwei Oberflächen enthalten, verringern oder minimieren. Beispielsweise können eines oder mehrere des Fluoreszenzbildgebungsmoduls, des Beleuchtungsstrahlenganges, des Bildgebungsstrahlenganges, der Objektivlinse oder der Tubuslinse so ausgelegt sein, dass sie die optische Aberration in zwei Tiefen oder Ebenen, die sich in unterschiedlichen Abständen von der Objektivlinse befinden, im Vergleich zu den Aberrationen, die mit anderen Tiefen oder Ebenen in anderen Abständen von der Objektivlinse verbunden sind, verringern oder minimieren. Beispielsweise kann die optische Aberration für die Bildgebung der ersten und der zweiten Oberfläche geringer als anderswo in einer Region im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 mm von der Objektivlinse sein. Außerdem können in einigen Fällen eines oder mehrere des Fluoreszenzbildgebungsmoduls, des Beleuchtungsstrahlenganges, des Bildgebungsstrahlenganges, der Objektivlinse oder der Tubuslinse konfiguriert sein, um die optische Aberration zu kompensieren, die durch die Übertragung von Emissionslicht durch ein oder mehrere Teile der Probenträgerstruktur induziert wird, wie eine Schicht, die eine der Oberflächen beinhaltet, auf der die Probe haftet, sowie möglicherweise eine Lösung, die mit der Probe in Kontakt steht. Diese Schicht (z. B. ein Deckglas oder die Wand einer Durchflusszelle) kann beispielsweise Glas, Quarz, Kunststoff oder ein anderes transparentes Material mit einem Brechungsindex umfassen, das eine optische Aberration einbringt.
  • Dementsprechend kann die Bildgebungsleistung im Wesentlichen gleich sein, wenn die erste Oberfläche und die zweite Oberfläche abgebildet werden. Beispielsweise können die optischen Übertragungsfunktionen (OTF) und/oder Modulationsübertragungsfunktionen (MTF) für die Abbildung der ersten und zweiten Oberfläche im Wesentlichen gleich sein. Eine oder beide dieser Übertragungsfunktionen können beispielsweise innerhalb von 20 %, innerhalb von 15 %, innerhalb von 10 %, innerhalb von 5 %, innerhalb von 2,5 % oder innerhalb von 1 % voneinander oder innerhalb eines beliebigen dieser Werte bei einer oder mehreren spezifizierten Raumfrequenzen oder bei Mittelung über einen Bereich von Raumfrequenzen liegen. Dementsprechend kann eine Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden der oberen Innenoberfläche oder der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Durchflusszelle und dem mindestens einen Bildsensor hinein oder aus diesem heraus zu bewegen und ohne ein oder mehrere optische Elemente des Bildgebungssystems (z. B. das Objektiv und/oder die Tubuslinse) entlang des Strahlenganges (z. B. der optischen Achse) dazwischen zu bewegen, im Wesentlichen dieselbe sein. Beispielsweise kann eine Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden der oberen Innenoberfläche oder der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle, ohne ein oder mehrere optische Elemente der Tubuslinse in den Strahlengang hinein oder aus diesem heraus zu bewegen oder ohne ein oder mehrere optische Elemente der Tubuslinse entlang des Strahlenganges (z. B. optische Achse) dazwischen zu bewegen, im Wesentlichen dieselbe sein. MTFs sind unten und in der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/962,723 , eingereicht am 17. Januar 2020, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit berücksichtigt ist, weiter erörtert.
  • Der Fachmann wird verstehen, dass die offenbarten Bildgebungsmodule oder -systeme in einigen Fällen eigenständige optische Systeme sein können, die zum Abbilden einer Proben-oder Substratoberfläche ausgelegt sind. In einigen Fällen können sie einen oder mehrere Prozessoren oder Computer umfassen. In einigen Fällen können sie ein oder mehrere Softwarepakete umfassen, die Instrumentensteuerfunktionen und/oder Bildverarbeitungsfunktionen bereitstellen. In einigen Fällen werden zusätzlich zu optischen Komponenten wie Lichtquellen (z. B. Festkörperlaser, Farbstofflaser, Diodenlaser, Bogenlampen, Wolframhalogenlampen usw.) Linsen, Prismen, Spiegel, dichroitische Reflektoren, Strahlteiler, optische Filter, optische Bandpassfilter, Lichtleiter, optische Fasern, Aperturen und Bildsensoren (z. B. CMOS-Bildsensoren und -Kameras (CMOS, Complementary Metal Oxide Semiconductor), CCD-Bildsensoren und Kameras (CCD, Charge Coupled Device) usw.) verwendet, sie können auch mechanische und/oder optomechanische Komponenten wie X-Y-Translationsstufen, X-Y-Z-Translationsstufen, piezoelektrische Fokussierungsmechanismen, elektrooptische Phasenplatten und dergleichen beinhalten. In einigen Fällen können sie als Module, Komponenten, Teilbaugruppen oder Teilsysteme größerer Systeme fungieren, die z. B. für Genomikanwendungen (z. B. genetische Testungen und/oder Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen) ausgelegt sind. In einigen Fällen können sie beispielsweise als Module, Komponenten, Unterbaugruppen oder Teilsysteme größerer Systeme fungieren, die ferner lichtdichte und/oder andere Umgebungssteuergehäuse, Temperatursteuermodule, Durchflusszellen und -patronen, Fluidiksteuermodule, Robotik für die Fluidabgabe, Robotik für die Handhabung von Patronen und/oder Mikroplatten (Pick-and-Place-Robotik), einen oder mehrere Prozessoren oder Computer, ein oder mehrere lokale und/oder cloudbasierte Softwarepakete (z. B. Instrumenten-/Systemsteuersoftwarepakete, Bildverarbeitungssoftwarepakete, Datenanalysesoftwarepakete), Datenspeichermodule, Datenkommunikationsmodule (z. B. Bluetooth, WiFi, Intranet oder Internetkommunikationshardware und zugehörige Software), Anzeigemodule usw. oder eine beliebige Kombination davon umfassen. Diese zusätzlichen Komponenten größerer Systeme, z. B. Systeme, die für Genomikanwendungen ausgelegt sind, werden nachstehend ausführlicher erörtert.
  • Die 2A und 2B stellen ein nicht einschränkendes Beispiel für ein Beleuchtungs- und Bildgebungsmodul 100 für die Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebung dar. Das Beleuchtungs- und Bildgebungsmodul 100 beinhaltet eine Objektivlinse 110, eine Beleuchtungsquelle 115, eine Mehrzahl von Detektionskanälen 120 und ein erstes dichroitisches Filter 130, das einen dichroitischen Reflektor oder Strahlteiler umfassen kann. Ein Autofokussystem, das beispielsweise einen Autofokuslaser 102 beinhalten kann, der einen Fleck projiziert, dessen Größe überwacht wird, um zu bestimmen, wann das Bildgebungssystem fokussiert ist, kann in einigen Designs beinhaltet sein. Einige oder alle Komponenten des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls 100 können mit einer Grundplatte 105 gekoppelt sein.
  • Die Beleuchtungs- oder Lichtquelle 115 kann jede geeignete Lichtquelle beinhalten, die konfiguriert ist, um Licht mit mindestens einer gewünschten Anregungswellenlänge zu erzeugen (nachstehend ausführlicher erörtert). Die Lichtquelle kann eine Breitbandquelle sein, die Licht innerhalb eines oder mehrerer Anregungswellenlängenbereiche (oder -bänder) emittiert. Die Lichtquelle kann eine Schmalbandquelle sein, die Licht innerhalb eines oder mehrerer engerer Wellenlängenbereiche emittiert. In einigen Fällen kann die Lichtquelle eine einzelne isolierte Wellenlänge (oder Linie) entsprechend der gewünschten Anregungswellenlänge oder mehrere isolierte Wellenlängen (oder Linien) erzeugen. In einigen Fällen können die Leitungen eine sehr schmale Bandbreite aufweisen. Beispielhafte Lichtquellen, die zur Verwendung in der Beleuchtungsquelle 115 geeignet sein können, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Glühlampe, eine Xenonbogenlampe, eine Quecksilberdampflampe, eine Leuchtdiode, eine Laserquelle wie eine Laserdiode oder ein Festkörperlaser oder andere Arten von Lichtquellen. Wie nachstehend erörtert, kann in einigen Designs die Lichtquelle eine polarisierte Lichtquelle wie eine linear polarisierte Lichtquelle umfassen. In einigen Implementierungen ist die Ausrichtung der Lichtquelle so, dass s-polarisiertes Licht auf eine oder mehrere Oberflächen einer oder mehrerer optischer Komponenten wie die dichroitische reflektierende Oberfläche eines oder mehrerer dichroitischer Filter einfällt.
  • Die Beleuchtungsquelle 115 kann ferner eine oder mehrere zusätzliche optische Komponenten wie Linsen, Filter, optische Fasern oder jede andere geeignete durchlässige oder reflektierende Optik beinhalten, um einen Anregungslichtstrahl mit geeigneten Eigenschaften in Richtung eines ersten dichroitischen Filters 130 auszugeben. Beispielsweise kann eine Strahlformungsoptik beinhaltet sein, um beispielsweise Licht von einem Lichtemitter in der Lichtquelle zu empfangen und einen Strahl zu erzeugen und/oder eine gewünschte Strahlcharakteristik bereitzustellen. Eine solche Optik kann beispielsweise eine Kollimatorlinse umfassen, die konfiguriert ist, um die Divergenz des Lichts zu verringern und/oder die Kollimation zu erhöhen und/oder das Licht zu kollimieren.
  • In einigen Implementierungen sind mehrere Lichtquellen in dem Beleuchtungs- und Bildgebungsmodul 100 beinhaltet. In einigen solchen Implementierungen können unterschiedliche Lichtquellen Licht mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften erzeugen, um beispielsweise unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe anzuregen. In einigen Implementierungen kann Licht, das von den verschiedenen Lichtquellen erzeugt wird, so gelenkt werden, dass es zusammenfällt und einen aggregierten Anregungslichtstrahl bildet. Dieser zusammengesetzte Anregungslichtstrahl kann aus Anregungslichtstrahlen von jeder der Lichtquellen zusammengesetzt sein. Der zusammengesetzte Anregungslichtstrahl weist mehr optische Leistung als die einzelnen Strahlen auf, die sich überlappen, um den zusammengesetzten Strahl zu bilden. Beispielsweise kann in einigen Implementierungen, die zwei Lichtquellen beinhalten, die zwei Anregungslichtstrahlen erzeugen, der zusammengesetzte Anregungslichtstrahl, der aus den beiden einzelnen Anregungslichtstrahlen gebildet wird, eine optische Leistung aufweisen, die die Summe der optischen Leistung der einzelnen Strahlen ist. Gleichermaßen können in einigen Implementierungen drei, vier, fünf oder mehr Lichtquellen beinhaltet sein, und diese Lichtquellen können jeweils Anregungslichtstrahlen ausgeben, die zusammen einen zusammengesetzten Strahl bilden, der eine optische Leistung aufweist, die die Summe der optischen Leistung der einzelnen Strahlen ist.
  • In einigen Implementierungen gibt die Lichtquelle 115 eine ausreichend große Lichtmenge aus, um eine ausreichend starke Fluoreszenzemission zu erzeugen. Eine stärkere Fluoreszenzemission kann das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und das Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von Bildern erhöhen, die vom Fluoreszenzbildgebungsmodul aufgenommen wurden. In einigen Implementierungen kann die Leistung der Lichtquelle und/oder eines davon abgeleiteten Anregungslichtstrahls (einschließlich eines zusammengesetzten Anregungslichtstrahls) eine Leistung im Bereich von etwa 0,5 W bis etwa 5,0 W oder mehr aufweisen (wie unten ausführlicher erörtert).
  • Unter erneuter Bezugnahme auf die 2A und 2B ist das erste dichroitische Filter 130 in Bezug auf die Lichtquelle angeordnet, um Licht von dieser zu empfangen. Das erste dichroitische Filter kann einen dichroitischen Spiegel, einen dichroitischen Reflektor, einen dichroitischen Strahlteiler oder einen dichroitischen Strahlkombinierer umfassen, der konfiguriert ist, um Licht in einem ersten Spektralbereich (oder Wellenlängenbereich) zu übertragen und Licht mit einem zweiten Spektralbereich (oder Wellenlängenbereich) zu reflektieren. Der erste Spektralbereich kann ein oder mehrere Spektralbänder beinhalten, z. B. ein oder mehrere Spektralbänder im ultravioletten und blauen Wellenlängenbereich. Gleichermaßen kann ein zweiter Spektralbereich ein oder mehrere Spektralbänder beinhalten, z. B. ein oder mehrere Spektralbänder, die sich von der grünen bis zur roten und infraroten Wellenlänge erstrecken. Andere Spektralbereiche oder Wellenlängenbereiche sind ebenfalls möglich.
  • In einigen Implementierungen kann das erste dichroitische Filter konfiguriert sein, um Licht von der Lichtquelle zu einer Probenträgerstruktur zu übertragen, beispielsweise zu einem Mikroskopobjektträger, einer Kapillare, einer Durchflusszelle, einem mikrofluidischen Chip oder einer anderen Substrat- oder Trägerstruktur. Die Probenträgerstruktur trägt und positioniert die Probe, z. B. eine Zusammensetzung, die ein fluoreszenzmarkiertes Nukleinsäuremolekül oder ein Komplement davon umfasst, in Bezug auf das Beleuchtungs- und Bildgebungsmodul 100. Dementsprechend erstreckt sich ein erster Strahlengang von der Lichtquelle zur Probe über das erste dichroitische Filter. In verschiedenen Implementierungen beinhaltet die Probenträgerstruktur mindestens eine Oberfläche, auf der die Probe angeordnet ist oder an die die Probe bindet. In einigen Fällen kann die Probe innerhalb verschiedener lokalisierter Regionen oder Stellen auf der mindestens einen Oberfläche der Probenträgerstruktur angeordnet oder an diese gebunden sein.
  • In einigen Fällen kann die Trägerstruktur zwei Oberflächen beinhalten, die sich in unterschiedlichen Abständen von der Objektivlinse 110 befinden (d. h. an unterschiedlichen Positionen oder Tiefen entlang der optischen Achse der Objektivlinse 110), auf denen die Probe angeordnet ist. Wie nachstehend erörtert, kann beispielsweise eine Durchflusszelle einen Fluidkanal umfassen, der mindestens teilweise durch erste und zweite (z. B. obere und untere) Innenflächen gebildet ist, und die Probe kann an lokalisierten Stellen auf der ersten Innenoberfläche, der zweite Innenoberfläche oder beiden Innenflächen angeordnet sein. Die erste und die zweite Oberfläche können durch die Region getrennt sein, die dem Fluidkanal entspricht, durch den eine Lösung fließt, und sich somit in unterschiedlichen Abständen oder Tiefen in Bezug auf die Objektivlinse 110 des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls 100 befinden.
  • Die Objektivlinse 110 kann in dem ersten Strahlengang zwischen dem ersten dichroitischen Filter und der Probe beinhaltet sein. Diese Objektivlinse kann beispielsweise konfiguriert sein, um eine Brennweite, einen Arbeitsabstand aufzuweisen und/oder so positioniert zu werden, dass Licht von der einen oder den mehreren Lichtquellen auf die Probe fokussiert wird, z. B. auf eine Oberfläche des Mikroskopobjektträgers, der Kapillare, der Durchflusszelle, des mikrofluidischen Chips oder der anderen Substrat- oder Trägerstruktur. Gleichermaßen kann die Objektivlinse 110 so konfiguriert sein, dass sie eine geeignete Brennweite und einen geeigneten Arbeitsabstand aufweist und/oder so positioniert ist, dass sie von der Probe reflektiertes, gestreutes oder emittiertes Licht (z. B. Fluoreszenzemission) sammelt und ein Bild der Probe erzeugt (z. B. ein Fluoreszenzbild).
  • In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse 110 ein Mikroskopobjektiv wie ein Standardobjektiv umfassen. In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse 110 ein anwenderspezifisches Objektiv umfassen. Ein Beispiel für eine anwenderspezifische Objektivlinse und/oder eine Kombination aus anwenderspezifischer Objektivlinse und anwenderspezifischer Tubuslinse ist nachstehend und in der am 17. Januar 2020 eingereichten vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/962,723 beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit berücksichtigt ist. Die Objektivlinse 110 kann so ausgelegt sein, dass sie die optische Aberration an zwei Orten, wie beispielsweise zwei Ebenen, die zwei Oberflächen einer Durchflusszelle oder einer anderen Probenträgerstruktur entsprechen, verringert oder minimiert. Die Objektivlinse 110 kann so ausgelegt sein, dass sie die optische Aberration an den ausgewählten Orten oder Ebenen, z. B. der ersten und der zweiten Oberfläche einer Durchflusszelle mit zwei Oberflächen, relativ zu anderen Orten oder Ebenen im Strahlengang verringert. Beispielsweise kann die Objektivlinse 110 so ausgelegt sein, dass sie die optische Aberration in zwei Tiefen oder Ebenen, die sich in unterschiedlichen Abständen von der Objektivlinse befinden, im Vergleich zu den optischen Aberrationen, die anderen Tiefen oder Ebenen in anderen Abständen vom Objektiv zugeordnet sind, verringert. Beispielsweise kann in einigen Fällen die optische Aberration zum Abbilden der ersten und zweiten Oberfläche einer Durchflusszelle geringer als diejenige andernorts in einer Region sein, die sich 1 bis 10 mm von der Vorderfläche der Objektivlinse erstreckt. Zusätzlich kann eine anwenderspezifische Objektivlinse 110 in einigen Fällen konfiguriert sein, um die optische Aberration zu kompensieren, die durch die Übertragung von Fluoreszenzemissionslicht durch einen oder mehrere Teile der Probenträgerstruktur induziert wird, wie beispielsweise eine Schicht, die eine oder mehrere der Durchflusszellenoberflächen beinhaltet, auf dem eine Probe angeordnet ist, oder eine Schicht, die eine Lösung umfasst, die den Fluidkanal einer Durchflusszelle füllt. Diese Schichten können beispielsweise Glas, Quarz, Kunststoff oder ein anderes transparentes Material mit einem Brechungsindex umfassen, das eine optische Aberration einbringen kann.
  • In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse 110 eine numerische Apertur (NA) von 0,6 oder mehr aufweisen (wie nachstehend ausführlicher erörtert wird). Eine solche numerische Apertur kann eine verringerte Fokustiefe und/oder Schärfentiefe, eine verbesserte Hintergrundunterscheidung und eine erhöhte Bildgebungsauflösung bereitstellen.
  • In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse 110 eine numerische Apertur (NA) von 0,6 oder weniger aufweisen (wie nachstehend ausführlicher erörtert wird). Eine solche numerische Apertur kann eine erhöhte Fokustiefe und/oder Schärfentiefe bereitstellen. Eine solche erhöhte Fokustiefe und/oder Schärfentiefe kann die Fähigkeit erhöhen, Ebenen abzubilden, die durch einen Abstand getrennt sind, wie beispielsweise jenen, der die erste und die zweite Oberfläche einer Durchflusszelle mit zwei Oberflächen trennt.
  • Wie oben erörtert, kann eine Durchflusszelle beispielsweise eine erste und eine zweite Schicht umfassen, die jeweils eine erste und eine zweite Innenoberfläche umfassen, die durch einen Fluidkanal getrennt sind, durch den ein Analyt oder ein Reagens fließen kann. In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse 110 und/oder das Beleuchtungs- und Bildgebungsmodul 100 konfiguriert sein, um eine Schärfentiefe und/oder Fokustiefe bereitzustellen, die groß genug ist, um sowohl die erste als auch die zweite Innenoberfläche der Durchflusszelle abzubilden, entweder nacheinander durch Neufokussieren des Bildgebungsmoduls zwischen dem Abbilden der ersten und der zweiten Oberfläche oder gleichzeitig durch Sicherstellen einer ausreichend großen Schärfentiefe und/oder Fokustiefe mit vergleichbarer optischer Auflösung. In einigen Fällen kann die Schärfentiefe und/oder die Fokustiefe mindestens so groß wie der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Oberfläche der abzubildenden Durchflusszelle, wie beispielsweise der ersten und der zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle, oder größer als dieser sein. In einigen Fällen können die erste und die zweite Oberfläche, z. B. die erste und die zweite Innenoberfläche einer Durchflusszelle mit zwei Oberflächen oder einer anderen Probenträgerstruktur, beispielsweise durch einen Abstand im Bereich von etwa 10 µm bis etwa 700 µm oder mehr getrennt sein (wie nachstehend ausführlicher erläutert wird). In einigen Fällen kann die Schärfentiefe und/oder Fokustiefe somit im Bereich von etwa 10 µm bis etwa 700 µm oder mehr liegen (wie nachstehend ausführlicher erörtert wird).
  • In einigen Designs kann eine Kompensationsoptik (z. B. ein „optischer Kompensator“ oder „Kompensator“) in einen Strahlengang in dem Bildgebungsmodul hinein oder aus diesem heraus bewegt werden, beispielsweise einen Strahlengang, durch den das von der Objektivlinse 110 gesammelte Licht an einen Bildsensor geliefert wird, damit das Bildgebungsmodul die erste und die zweite Durchflusszellenoberfläche mit zwei Oberflächen abbilden kann. Das Bildgebungsmodul kann beispielsweise konfiguriert sein, um die erste Oberfläche abzubilden, wenn die Kompensationsoptik in dem Strahlengang zwischen der Objektivlinse und einem Bildsensor oder einer Photodetektoranordnung beinhaltet ist, der bzw. die konfiguriert sind, um ein Bild der ersten Oberfläche zu erfassen. Bei einem solchen Design kann das Bildgebungsmodul konfiguriert sein, um die zweite Oberfläche abzubilden, wenn die Kompensationsoptik aus dem Strahlengang zwischen der Objektivlinse 110 und dem Bildsensor oder der Photodetektoranordnung, der bzw. die konfiguriert sind, um ein Bild der ersten Oberfläche zu erfassen, entfernt wird oder nicht in diesem beinhaltet ist. Die Notwendigkeit eines optischen Kompensators kann ausgeprägter sein, wenn eine Objektivlinse 110 mit einem hohen Wert der numerischen Apertur (NA) verwendet wird, z. B. Werten der numerischen Apertur von mindestens 0,6, mindestens 0,65, mindestens 0,7, mindestens 0,75, mindestens 0,8, mindestens 0,85, mindestens 0,9, mindestens 0,95, mindestens 1,0 oder höher. In einigen Implementierungen umfasst die optische Kompensationsoptik (z. B. ein optischer Kompensator oder Kompensator) ein brechendes optisches Element wie eine Linse, eine Platte aus optisch transparentem Material wie Glas, eine Platte aus optisch transparentem Material wie Glas oder im Fall von polarisierten Lichtstrahlen eine Viertelwellenplatte oder eine Halbwellenplatte usw. Andere Konfigurationen können verwendet werden, um zu ermöglichen, dass die erste und die zweite Oberfläche zu unterschiedlichen Zeiten abgebildet werden. Beispielsweise können eine oder mehrere Linsen oder optische Elemente konfiguriert sein, um in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse 110 und dem Bildsensor hinein und aus diesem heraus oder daran entlang verschoben zu werden.
  • Bei bestimmten Designs ist die Objektivlinse 110 jedoch konfiguriert, um eine ausreichend große Fokustiefe und/oder Schärfentiefe bereitzustellen, damit die erste und die zweite Oberfläche mit vergleichbarer optischer Auflösung abgebildet werden können, ohne dass eine solche Kompensationsoptik in einen Strahlengang im Bildgebungsmodul hinein und aus diesem heraus bewegt wird, wie beispielsweise einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem Bildsensor oder der Photodetektoranordnung. Gleichermaßen ist in verschiedenen Designs die Objektivlinse 110 konfiguriert, um eine ausreichend große Fokustiefe und/oder Schärfentiefe bereitzustellen, damit die erste und die zweite Oberfläche mit vergleichbarer optischer Auflösung abgebildet werden können, ohne dass die Optik bewegt wird, wie beispielsweise eine oder mehrere Linsen oder andere optische Komponenten, die entlang eines Strahlenganges in dem Bildgebungsmodul translatiert werden, wie beispielsweise eines Strahlenganges zwischen der Objektivlinse und dem Bildsensor oder der Photodetektoranordnung. Beispiele für solche Objektivlinsen sind nachstehend ausführlicher beschrieben.
  • In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse (oder das Mikroskopobjektiv) 110 so konfiguriert sein, dass sie eine verringerte Vergrößerung aufweist. Die Objektivlinse 110 kann beispielsweise so konfiguriert sein, dass das Fluoreszenzbildgebungsmodul eine Vergrößerung von weniger als 2-fach bis weniger als 10-fach aufweist (wie nachstehend ausführlicher erörtert wird). Eine solche verringerte Vergrößerung kann Designbeschränkungen ändern, so dass andere Designparameter erreicht werden können. Beispielsweise kann die Objektivlinse 110 auch so konfiguriert sein, dass das Fluoreszenzbildgebungsmodul ein großes Sichtfeld (FOV) aufweist, das beispielsweise von etwa 1,0 mm bis etwa 5,0 mm reicht (z. B. im Durchmesser, in der Breite, in der Länge oder in der längsten Abmessung), wie nachstehend ausführlicher erläutert wird.
  • In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse 110 konfiguriert sein, um das Fluoreszenzbildgebungsmodul mit einem Sichtfeld wie oben angegeben zu versehen, so dass das FOV eine beugungsbegrenzte Leistung aufweist, z. B. weniger als 0,15 Aberrationswellen über mindestens 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 95 % des Feldes, wie nachstehend ausführlicher erörtert wird.
  • In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse 110 konfiguriert sein, um das Fluoreszenzbildgebungsmodul mit einem Sichtfeld wie oben angegeben zu versehen, so dass das FOV eine beugungsbegrenzte Leistung aufweist, z. B. ein Strehl-Verhältnis von mehr als 0,8 über mindestens 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 95 % des Feldes, wie nachstehend ausführlicher erörtert wird.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf die 2A und 2B ist der erste dichroitische Strahlteiler oder Strahlkombinierer in dem ersten Strahlengang zwischen der Lichtquelle und der Probe angeordnet, um die Probe mit einem oder mehreren Anregungsstrahlen zu beleuchten. Dieser erste dichroitische Strahlteiler oder -kombinierer befindet sich auch in einem oder mehreren zweiten Strahlengängen von der Probe zu den verschiedenen optischen Kanälen, die zum Detektieren der Fluoreszenzemission verwendet werden. Dementsprechend koppelt das erste dichroitische Filter 130 den ersten Strahlengang des von der Beleuchtungsquelle 115 emittierten Anregungsstrahls und den zweiten Strahlengang des von einem Probenkörper emittierten Emissionslichts mit den verschiedenen optischen Kanälen, in denen das Licht auf die jeweiligen Bildsensoren oder Photodetektoranordnungen zum Erfassen von Bildern der Probe gelenkt wird.
  • In verschiedenen Implementierungen weist das erste dichroitische Filter 130, z. B. der erste dichroitische Reflektor oder Strahlteiler oder Strahlkombinierer, ein Passband auf, das ausgewählt ist, um Licht von der Beleuchtungsquelle 115 nur innerhalb eines spezifizierten Wellenlängenbandes oder möglicherweise einer Mehrzahl von Wellenlängenbändern zu übertragen, die die eine oder mehreren gewünschten Anregungswellenlänge oder Wellenlängen beinhalten. Beispielsweise beinhaltet der erste dichroitische Strahlteiler 130 eine reflektierende Oberfläche, die einen dichroitischen Reflektor umfasst, der eine spektrale Durchlässigkeitsantwort aufweist, beispielsweise konfiguriert, um Licht mit mindestens einigen der von der Lichtquelle ausgegebenen Wellenlängen, die einen Teil des Anregungsstrahls bilden, zu übertragen. Die spektrale Durchlässigkeitsantwort kann konfiguriert sein, um Licht einer oder mehrerer anderer Wellenlängen, beispielsweise einer oder mehrerer anderer Fluoreszenzemissionswellenlängen, nicht zu übertragen (z. B. stattdessen zu reflektieren). In einigen Implementierungen kann die spektrale Durchlässigkeitsantwort auch konfiguriert sein, um Licht einer oder mehrerer anderer Wellenlängen, die von der Lichtquelle ausgegeben werden, nicht zu übertragen (z. B. stattdessen zu reflektieren). Dementsprechend kann das erste dichroitische Filter 130 verwendet werden, um auszuwählen, welche Wellenlänge oder Wellenlängen des von der Lichtquelle abgegebenen Lichts die Probe erreichen. Umgekehrt weist der dichroitische Reflektor in dem ersten dichroitischen Strahlteiler 130 eine spektrale Reflektivitätsantwort auf, die Licht mit einer oder mehreren Wellenlängen entsprechend der gewünschten Fluoreszenzemission von der Probe reflektiert, und möglicherweise Licht mit einer oder mehreren Wellenlängen, die von der Lichtquelle ausgegeben werden, das die Probe nicht erreichen soll, reflektiert. Dementsprechend weist der dichroitische Reflektor in einigen Implementierungen eine spektrale Durchlässigkeit auf, die ein oder mehrere Passbänder beinhaltet, um das auf die Probe einfallende Licht zu übertragen, und ein oder mehrere Sperrbänder beinhaltet, die Licht außerhalb der Passbänder reflektieren, beispielsweise Licht mit einer oder mehreren Emissionswellenlängen und möglicherweise einer oder mehreren Wellenlängen, die von der Lichtquelle ausgegeben werden, die nicht dazu bestimmt sind, die Probe zu erreichen. Ebenso weist der dichroitische Reflektor in einigen Implementierungen eine spektrales Reflektivität auf, die einen oder mehrere Spektralbereiche beinhaltet, konfiguriert, um eine oder mehrere Emissionswellenlängen zu reflektieren und möglicherweise eine oder mehrere Wellenlängen, die von der Lichtquelle ausgegeben werden, die nicht dazu bestimmt sind, die Probe zu erreichen, zu reflektieren, und beinhaltet einen oder mehrere Bereiche, die Licht außerhalb dieser Reflexionsbereiche übertragen. Der dichroitische Reflektor, der in dem ersten dichroitischen Filter 130 beinhaltet ist, kann ein reflektierendes Filter wie ein Interferenzfilter (z. B. einen Viertelwellenstapel) umfassen, das konfiguriert ist, um die geeigneten spektralen Transmissions- und Reflexionsverteilungen bereitzustellen. Die 2A und 2B zeigen auch ein dichroitisches Filter 105, das beispielsweise einen dichroitischen Strahlteiler oder Strahlkombinierer umfassen kann, die verwendet werden können, um den Autofokuslaser 102 obwohl das Objektiv und zu der Probenträgerstruktur zu lenken.
  • Obwohl das in den 2A und 2B gezeigte und oben erörterte Bildgebungsmodul 100 so konfiguriert ist, dass der Anregungsstrahl durch das erste dichroitische Filter 130 zu der Objektivlinse 110 übertragen wird, kann die Beleuchtungsquelle 115 in einigen Designs in Bezug auf das erste dichroitische Filter 130 angeordnet sein und/oder ist das erste dichroitische Filter so konfiguriert (z. B. ausgerichtet), dass der Anregungsstrahl vom ersten dichroitischen Filter 130 zur Objektivlinse 110 reflektiert wird. Gleichermaßen ist in einigen solchen Designs das erste dichroitische Filter 130 konfiguriert, um Fluoreszenzemission von der Probe zu übertragen und möglicherweise Licht mit einer oder mehreren Wellenlängen zu übertragen, die von der Lichtquelle ausgegeben werden, das nicht dazu bestimmt ist, die Probe zu erreichen. Wie nachstehend erörtert wird, kann ein Design, bei dem die Fluoreszenzemission übertragen anstatt reflektiert wird, möglicherweise den Wellenfrontfehler in der detektierten Emission verringern und/oder möglicherweise andere Vorteile aufweisen. Jedenfalls ist in verschiedenen Implementierungen der erste dichroitische Reflektor 130 in dem zweiten Strahlengang angeordnet, um eine Fluoreszenzemission von der Probe zu empfangen, von der mindestens ein Teil zu den Detektionskanälen 120 weitergeht.
  • Die 3A und 3B stellen die Strahlengänge innerhalb des Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmoduls der 2A und 2B dar. In dem Beispiel zeigen die 2A und 3A, sind die Detektionskanäle 120 so angeordnet, dass sie eine Fluoreszenzemission von einem Probenkörper empfangen, die von der Objektivlinse 110 übertragen und von dem ersten dichroitischen Filter 130 reflektiert wird. Wie oben erwähnt und unten näher beschrieben, können in einigen Designs die Detektionskanäle 120 angeordnet sein, um den Teil des Emissionslichts zu empfangen, der von dem ersten dichroitischen Filter übertragen anstatt reflektiert wird. Jedenfalls können die Detektionskanäle 120 eine Optik zum Empfangen mindestens eines Teils des Emissionslichts beinhalten. Beispielsweise können die Detektionskanäle 120 eine oder mehrere Linsen wie Tubuslinsen beinhalten und können einen oder mehrere Bildsensoren oder Detektoren wie Photodetektoranordnungen (z. B. CCD- oder CMOS-Sensoranordnungen) zum Abbilden oder anderweitigen Erzeugen eines Signals auf Basis des empfangenen Lichts beinhalten. Die Tubuslinsen können beispielsweise ein oder mehrere Linsenelemente umfassen, die konfiguriert sind, um ein Bild der Probe auf dem Sensor oder der Photodetektoranordnung zu erzeugen, um ein Bild davon zu erfassen. Detektionskanäle sind unten und in der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/962,723 , eingereicht am 17. Januar 2020, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit berücksichtigt ist, weiter erörtert. In einigen Fällen kann eine verbesserte optische Auflösung unter Verwendung eines Bildsensors mit relativ hoher Empfindlichkeit, kleinen Pixeln und hoher Pixelanzahl in Verbindung mit einem geeigneten Abtastschema erreicht werden, das eine Überabtastung oder Unterabtastung beinhalten kann.
  • Die 3A und 3B sind Strahlverfolgungsdiagramme, die Strahlengänge des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls 100 der 2A und 2B darstellen. 3A entspricht einer Draufsicht auf das Beleuchtungs- und Bildgebungsmodul 100 von oben. 3B entspricht einer Seitenansicht des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls 100. Das in diesen Figuren dargestellte Beleuchtungs- und Bildgebungsmodul 100 beinhaltet vier Detektionskanäle 120. Es versteht sich jedoch, dass die offenbarten Beleuchtungs- und Bildgebungsmodule gleichermaßen in Systemen implementiert sein können, die mehr oder weniger als vier Detektionskanäle 120 beinhalten. Beispielsweise können die hierin offenbarten Mehrkanalsysteme mit lediglich einem Detektionskanal 120 oder bis zu zwei Detektionskanälen 120, drei Detektionskanälen 120, vier Detektionskanälen 120, fünf Detektionskanälen 120, sechs Detektionskanälen 120, sieben Detektionskanälen 120, acht Detektionskanälen 120 oder mehr als acht Detektionskanälen 120 implementiert sein, ohne vom Geist oder Umfang der vorliegenden Offenbarung abzuweichen.
  • Das nicht einschränkende Beispiel für das Bildgebungsmodul 100, das in den 3A und 3B dargestellt ist, beinhaltet vier Detektionskanäle 120, ein erstes dichroitisches Filter 130, das einen Strahl 150 von Emissionslichts reflektiert, ein zweites dichroitisches Filter (z. B. einen dichroitischen Strahlteiler) 135, das den Strahl 150 in einen übertragenen Teil und einen reflektierten Teil aufteilt, und zwei kanalspezifische dichroitische Filter (z. B. dichroitische Strahlteiler) 140, die die übertragenen und reflektierten Teile des Strahls 150 weiter auf einzelne Detektionskanäle 120 aufteilen. Die dichroitische reflektierende Oberfläche in den dichroitischen Strahlteilern 135 und 140 zum Aufteilen des Strahls 150 auf Detektionskanäle ist in einem Winkel von 45 Grad relativ zu einer Strahlmittelachse des Strahls 150 oder einer optischen Achse des Bildgebungsmoduls angeordnet. Wie nachstehend erörtert, kann jedoch ein Winkel von weniger als 45 Grad verwendet werden und Vorteile wie schärfere Übergänge von Passband zu Sperrband bieten.
  • Die verschiedenen Detektionskanäle 120 beinhalten Bildgebungsvorrichtungen 124, die einen Bildsensor oder eine Photodetektoranordnung (z. B. eine CCD- oder CMOS-Detektoranordnung) beinhalten können. Die verschiedenen Detektionskanäle 120 beinhalten ferner eine Optik 126 wie Linsen (z. B. eine oder mehrere Tubuslinsen, die jeweils ein oder mehrere Linsenelemente umfassen), die angeordnet sind, um den Teil des Emissionslichts, der in den Detektionskanal 120 eintritt, auf einer Brennebene zu fokussieren, die mit einer Ebene der Photodetektoranordnung 124 zusammenfällt. Die Optik 126 (z. B. eine Tubuslinse), die mit der Objektivlinse 110 kombiniert ist, ist konfiguriert, um ein Bild der Probe auf der Photodetektoranordnung 124 zu erzeugen, um ein Bild der Probe, beispielsweise ein Bild einer Oberfläche auf der Durchflusszelle oder einer anderen Probenträgerstruktur zu erfassen, nachdem die Probe an diese Oberfläche gebunden hat. Dementsprechend kann ein solches Bild der Probe eine Mehrzahl von fluoreszierenden emittierenden Flecken oder Regionen über eine räumliche Ausdehnung der Probenträgerstruktur umfassen, in der die Probe Fluoreszenzlicht emittiert. Die Objektivlinse 110 kann zusammen mit der Optik 126 (z. B. Tubuslinse) ein Sichtfeld (FOV) bereitstellen, das einen Teil der Probe oder die gesamte Probe beinhaltet. Gleichermaßen kann die Photodetektoranordnung 124 der verschiedenen Detektionskanäle 120 konfiguriert sein, um Bilder eines vollständigen Sichtfelds (FOV) zu erfassen, das von der Objektivlinse und der Tubuslinse oder einem Teil davon bereitgestellt wird. In einigen Implementierungen kann die Photodetektoranordnung 124 einiger oder aller Detektionskanäle 120 das Emissionslicht detektieren, das von einer auf der Probenträgerstruktur angeordneten Probe emittiert wird, z. B. einer Durchflusszellenoberfläche oder einem Teil davon, und elektronische Daten aufzeichnen, die ein Bild davon darstellen. In einigen Implementierungen kann die Photodetektoranordnung 124 einiger oder aller Detektionskanäle 120 Merkmale in dem von einer Probe emittierten Emissionslicht detektieren, ohne ein Bild der auf der Durchflusszellenoberfläche angeordneten Probe und/oder des gesamten Sichtfelds (FOV), das von der Objektivlinse und der Optik 126 und/oder 122 (z. B. Elementen einer Tubuslinse) bereitgestellt wird, zu erfassen und/oder zu speichern. In einigen Implementierungen kann das FOV der offenbarten Bildgebungsmodule (z. B. das durch die Kombination der Objektivlinse 110 und der Optik 126 und/oder 122 bereitgestellte) beispielsweise zwischen etwa 1 mm und 5 mm liegen (z. B. im Durchmesser, in der Breite, in der Länge oder in der längsten Abmessung), wie nachstehend erläutert wird. Das FOV kann beispielsweise ausgewählt werden, um ein Gleichgewicht zwischen Vergrößerung und Auflösung des Bildgebungsmoduls bereitzustellen und/oder basierend auf einer oder mehreren Eigenschaften der Bildsensoren und/oder Objektivlinsen. Beispielsweise kann ein relativ kleineres FOV in Verbindung mit einem kleineren und schnelleren Bildgebungssensor bereitgestellt werden, um einen hohen Durchsatz zu erzielen.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf die 3A und 3B kann in einigen Implementierungen die Optik 126 in dem Detektionskanal (z. B. der Tubuslinse) konfiguriert sein, um die optische Aberration in Bildern zu reduzieren, die unter Verwendung der Optik 126 in Kombination mit der Objektivlinse 110 aufgenommen werden. In einigen Implementierungen, die mehrere Detektionskanäle zum Abbilden bei unterschiedlichen Emissionswellenlängen umfassen, weist die Optik 126 (z. B. die Tubuslinse) für unterschiedliche Detektionskanäle unterschiedliche Designs auf, um die Aberration für die jeweiligen Emissionswellenlängen zu reduzieren, bei denen dieser bestimmte Kanal zum Abbilden konfiguriert ist. In einigen Implementierungen kann die Optik 126 (z. B. die Tubuslinse) so konfiguriert sein, dass Aberrationen verringert werden, wenn eine bestimmte Oberfläche (z. B. eine Ebene, Objektebene usw.) auf der Probenträgerstruktur abgebildet wird, auf der fluoreszierende Probenstellen sind, im Vergleich zu anderen Orten (z. B. anderen Ebenen im Objektraum). Gleichermaßen kann in einigen Implementierungen die Optik 126 (z. B. die Tubuslinse) konfiguriert sein, um Aberrationen zu verringern, wenn erste und zweite Oberflächen (z. B. erste und zweite Ebene, erste und zweite Objektebene usw.) auf einer Probenträgerstruktur mit zwei Oberflächen (z. B. einer Durchflusszelle mit zwei Oberflächen) mit darauf angeordneten fluoreszierenden Probenstellen abgebildet werden, im Vergleich zu anderen Orten (z. B. anderen Ebenen im Objektraum). Beispielsweise kann die Optik 126 in dem Detektionskanal (z. B. Tubuslinse) so ausgelegt sein, dass sie die Aberration in zwei Tiefen oder Ebenen, die sich in unterschiedlichen Abständen von der Objektivlinse befinden, im Vergleich zu den Aberrationen, die anderen Tiefen oder Ebenen in anderen Abständen vom Objektiv zugeordnet sind, verringert. Beispielsweise kann die optische Aberration für die Bildgebung der ersten und der zweiten Oberfläche geringer als anderswo in einer Region etwa 1 bis etwa 10 mm von der Objektivlinse sein. Zusätzlich kann eine anwenderspezifische Optik 126 in dem Detektionskanal (z. B. eine Tubuslinse) in einigen Ausführungsformen konfiguriert sein, um die Aberration zu kompensieren, die durch die Übertragung von Emissionslicht durch einen oder mehrere Teile der Probenträgerstruktur wie eine Schicht, beinhaltend eine der Oberflächen, auf denen die Probe angeordnet ist, sowie möglicherweise eine Lösung neben und in Kontakt mit der Oberfläche, auf der die Probe angeordnet ist, induziert wird. Die Schicht, die eine der Oberflächen umfasst, auf denen die Probe angeordnet ist, kann beispielsweise Glas, Quarz, Kunststoff oder ein anderes transparentes Material mit einem Brechungsindex und das eine optische Aberration einbringt, umfassen. Eine anwenderspezifische Optik 126 in dem Detektionskanal (z. B. der Tubuslinse) kann beispielsweise in einigen Implementierungen konfiguriert sein, um eine optische Aberration zu kompensieren, die durch eine Probenträgerstruktur, z. B. ein Deckglas oder eine Durchflusszellenwand oder andere Probenträgerstrukturkomponenten, induziert wird, sowie möglicherweise eine Lösung neben und in Kontakt mit der Oberfläche, auf der die Probe angeordnet ist.
  • In einigen Implementierungen ist die Optik 126 in dem Detektionskanal (z. B. eine Tubuslinse) so konfiguriert, dass sie eine verringerte Vergrößerung aufweist. Die Optik 126 in dem Detektionskanal (z. B. eine Tubuslinse) kann beispielsweise so konfiguriert sein, dass das Fluoreszenzbildgebungsmodul eine Vergrößerung von weniger als beispielsweise 10-fach aufweist, wie weiter unten erläutert wird. Eine solche verringerte Vergrößerung kann Designbeschränkungen ändern, so dass andere Designparameter erreicht werden können. Beispielsweise kann die Optik 126 (z. B. eine Tubuslinse) auch so konfiguriert sein, dass das Fluoreszenzbildgebungsmodul ein großes Sichtfeld (FOV) aufweist, beispielsweise von mindestens 1,0 mm oder mehr (z. B. im Durchmesser, in der Breite, in der Länge oder in der längsten Abmessung), wie weiter unten erläutert wird.
  • In einigen Implementierungen kann die Optik 126 (z. B. eine Tubuslinse) konfiguriert sein, um das Fluoreszenzbildgebungsmodul mit einem Sichtfeld zu versehen, wie oben angegeben, so dass das FOV weniger als 0,15 Aberrationswellen über mindestens 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 95 % des Feldes aufweiset, wie weiter unten erläutert wird.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf die 3A und 3B befindet sich in verschiedenen Implementierungen eine Probe an oder nahe einer Brennposition 112 der Objektivlinse 110. Wie oben unter Bezugnahme auf die 2A und 2B beschrieben, stellt eine Lichtquelle wie eine Laserquelle einen Anregungsstrahl an die Probe bereit, um die Fluoreszenz zu induzieren. Mindestens ein Teil der Fluoreszenzemission wird von der Objektivlinse 110 als Emissionslicht gesammelt. Die Objektivlinse 110 überträgt das Emissionslicht hin zum ersten dichroitischen Filter 130, das das gesamte Emissionslicht oder einen Teil davon als den auf das zweite dichroitische Filter 135 einfallenden Strahl 150 und zu den verschiedenen Detektionskanälen reflektiert, die jeweils eine Optik 126 umfassen, die ein Bild der Probe (z. B. eine Mehrzahl von fluoreszierenden Probenstellen auf einer Oberfläche einer Probenträgerstruktur) auf einer Photodetektoranordnung 124 erzeugt.
  • Wie oben erörtert, umfasst die Probenträgerstruktur in einigen Implementierungen eine Durchflusszelle, wie beispielsweise eine Durchflusszelle mit zwei Oberflächen, die zwei Oberflächen (z. B. zwei Innenflächen, eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche usw.) aufweist, die Probenstellen enthalten, die fluoreszierende Emission emittieren. Diese beiden Oberflächen können in Längsrichtung (Z) entlang der Richtung der Mittelachse des Anregungsstrahls und/oder der optischen Achse der Objektivlinse durch einen Abstand voneinander getrennt sein. Diese Trennung kann beispielsweise einem Strömungskanal innerhalb der Durchflusszelle entsprechen. Analyten oder Reagenzien können durch den Strömungskanal fließen und die erste und die zweite Innenoberfläche der Durchflusszelle berühren, wodurch sie mit einer Bindungszusammensetzung in Kontakt gebracht werden können, so dass die Fluoreszenzemission von einer Mehrzahl von Stellen auf der ersten und der zweiten Innenoberfläche abgestrahlt wird. Die Bildgebungsoptik (z. B. Objektivlinse 110) kann in einem geeigneten Abstand (z. B. einem Abstand, der dem Arbeitsabstand entspricht) von der Probe positioniert sein, um fokussierte Bilder der Probe auf einer oder mehreren Detektoranordnungen 124 zu erzeugen. Wie oben erörtert, kann in verschiedenen Designs die Objektivlinse 110 (möglicherweise in Kombination mit der Optik 126) eine Schärfentiefe und/oder Fokustiefe aufweisen, die mindestens so groß wie der Längsabstand zwischen der ersten und der zweiten Oberfläche ist. Die Objektivlinse 110 und die Optik 126 (jedes Detektionskanals) können somit gleichzeitig Bilder sowohl der ersten als auch der zweiten Durchflusszellenoberfläche auf der Photodetektoranordnung 124 erzeugen, und diese Bilder der ersten und der zweiten Oberfläche sind beide im Fokus und weisen eine vergleichbare optische Auflösung auf (oder können mit nur geringer Neufokussierung der Objekte in den Fokus gebracht werden, um Bilder der ersten und der zweiten Oberfläche mit vergleichbarer optischer Auflösung aufzunehmen). In verschiedenen Implementierungen muss die Kompensationsoptik nicht in einen Strahlengang des Bildgebungsmoduls hinein oder aus diesem heraus bewegt werden (z. B. in den ersten und/oder den zweiten Strahlengang hinein oder aus diesem heraus), um fokussierte Bilder der ersten und der zweiten Oberfläche zu erzeugen, die von vergleichbarer optischer Auflösung sind. Gleichermaßen müssen in diversen Implementierungen ein oder mehrere optische Elemente (z. B. Linsenelemente) in dem Bildgebungsmodul (z. B. die Objektivlinse 110 oder Optik 126) nicht bewegt werden, beispielsweise in Längsrichtung entlang des ersten und/oder des zweiten Strahlenganges, um fokussierte Bilder der ersten Oberfläche zu erzeugen, im Vergleich zum Ort des einen oder der mehreren optischen Elemente, wenn sie verwendet werden, um fokussierte Bilder der zweiten Oberfläche zu erzeugen. In einigen Implementierungen beinhaltet das Bildgebungsmodul ein Autofokussystem, das konfiguriert ist, um das Bildgebungsmodul schnell und nacheinander auf der ersten und/oder der zweiten Oberfläche neu zu fokussieren, so dass die Bilder eine vergleichbare optische Auflösung aufweisen. In einigen Implementierungen sind die Objektivlinse 110 und/oder die Optik 126 so konfiguriert, dass sowohl die erste als auch die zweite Durchflusszellenoberfläche gleichzeitig mit vergleichbarer optischer Auflösung fokussiert sind, ohne einen optischen Kompensator in den ersten und/oder den zweiten Strahlengang hinein oder aus diesem heraus zu bewegen und ohne ein oder mehrere Linsenelemente (z. B. Objektivlinse 110 und/oder Optik 126 (wie eine Tubuslinse) in Längsrichtung entlang des ersten und/oder zweiten Strahlenganges zu bewegen. In einigen Implementierungen können Bilder der ersten und/oder der zweiten Oberfläche, die entweder nacheinander (z. B. mit Neufokussierung zwischen Oberflächen) oder gleichzeitig (z. B. ohne Neufokussierung zwischen Oberflächen) unter Verwendung der hierin offenbarten neuartigen Objektivlinsen- und/oder Tubuslinsendesigns aufgenommen wurden, unter Verwendung eines geeigneten Bildverarbeitungsalgorithmus weiterverarbeitet werden, um die effektive optische Auflösung der Bilder derart zu verbessern, dass die Bilder der ersten und der zweiten Oberfläche eine vergleichbare optische Auflösung aufweisen. Bei verschiedenen Implementierungen ist die Probenebene ausreichend fokussiert, um Probenstellen auf der ersten und/oder zweiten Durchflusszellenoberfläche aufzulösen, wobei die Probenstellen in lateralen Richtungen (z. B. in X- und Y-Richtung) eng beabstandet sind.
  • Wie oben erörtert, können die dichroitischen Filter Interferenzfilter umfassen, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen basierend auf dem Prinzip der Dünnfilminterferenz unter Verwendung von Schichten optischer Beschichtungen mit unterschiedlichen Brechungsindizes und bestimmter Dicke selektiv übertragen und reflektieren. Dementsprechend kann die spektrale Antwort (z. B. Transmissions- und/oder Reflexionsspektren) der dichroitischen Filter, die in Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmodulen implementiert sind, mindestens teilweise von dem Einfallswinkel oder dem Einfallswinkelbereich abhängen, in dem das Licht der Anregungs- und/oder Emissionsstrahlen auf die dichroitischen Filter einfällt. Solche Effekte können in Bezug auf die dichroitischen Filter des Detektionsstrahlenganges (z. B. die dichroitischen Filter 135 und 140 der 3A und 3B) besonders signifikant sein.
  • 4 ist ein Schaubild, das eine Beziehung zwischen der Leistung des dichroitischen Filters und dem Einfallswinkel (AOI) des Strahls darstellt. Im Spezifischen zeigt das Schaubild von 4 die Auswirkung des Einfallswinkels auf die Übergangsbreite oder die Spektralspanne eines dichroitischen Filters, die dem Wellenlängenbereich entspricht, in dem die Spektralantwort (z. B. Transmissionsspektrum und/oder Reflexionsspektrum) zwischen dem Passband- und der Sperrbandbereich eines dichroitischen Filters übergeht. Somit entspricht eine Übertragungskante (oder Reflexionskante) mit einer relativ kleinen Spektralspanne (z. B. einem kleinen Delta-A-Wert in dem Schaubild von 4) einem schärferen Übergang zwischen Passband- und Sperrbandbereichen oder den Übertragungs- und Reflexionsbereichen (oder umgekehrt zwischen Reflexions- und Übertragungsbereichen), während eine Übertragungskante (oder Reflexionskante) mit einer relativ großen Spektralspanne (z. B. einem großen Delta_A-Wert in dem Schaubild von 4) einem weniger scharfen Übergang zwischen Passband- und Sperrbereichen entspricht. In verschiedenen Implementierungen sind schärfere Übergänge zwischen Passband- und Sperrbandbereichen im Allgemeinen wünschenswert. Darüber hinaus kann es auch wünschenswert sein, eine erhöhte Gleichmäßigkeit oder eine relativ gleichmäßige Übergangsbreite über das gesamte Sichtfeld und/oder den gesamten Strahlbereich oder den größten Teil davon aufzuweisen.
  • Fluoreszenzbildgebungsmodule, bei denen die dichroitischen Spiegel in einem Winkel von 45 Grad relativ zu einer Strahlmittelachse des Emissionslichts oder der optischen Achse der Strahlengänge (z. B. der Objektivlinse und/oder der Tubuslinse) angeordnet sind, können dementsprechend eine Übergangsbreite von circa 50 nm für ein beispielhaftes dichroitisches Filter, wie in 4 gezeigt, aufweisen. Da der Emissionslichtstrahl nicht kollimiert ist und einen gewissen Grad an Divergenz aufweist, können Fluoreszenzbildgebungsmodule einen Bereich von Einfallswinkeln von ungefähr 5 Grad zwischen gegenüberliegenden Seiten des Strahls aufweisen. Wie in 4 gezeigt, können unterschiedliche Teile des Emissionslichtstrahls somit in verschiedenen Einfallswinkeln zwischen 40 Grad und 50 Grad auf ein dichroitisches Kanalaufteilungsfilter einfallen. Dieser Bereich relativ großer Einfallswinkel entspricht einem Bereich von Übergangsbreiten zwischen etwa 40 nm und etwa 62 nm. Dieser Bereich relativ großer Einfallswinkel führt dadurch zu einer Vergrößerung der Übergangsbreite des dichroitischen Filters im Bildgebungsmodul. Die Leistung von Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmodulen kann somit verbessert werden, indem kleinere Einfallswinkel über den gesamten Strahl bereitgestellt werden, wodurch die Übertragungskante schärfer wird und eine bessere Unterscheidung zwischen verschiedenen Fluoreszenzemissionsbändern ermöglicht wird.
  • 5 ist ein Schaubild, das eine Beziehung zwischen der Größe des Strahl-Footprints (DBS) und dem Einfallswinkel des Strahls (DBS-Winkel) auf einem dichroitischen Filter darstellt. In einigen Fällen kann ein kleinerer Strahl-Footprint wünschenswert sein. Beispielsweise ermöglicht ein kleiner Strahl-Footprint die Verwendung kleinerer dichroitischer Filter, um einen Strahl in verschiedene Wellenlängenbereiche aufzuteilen. Die Verwendung kleinerer dichroitischer Filter reduziert wiederum die Herstellungskosten und erleichtert die Herstellung entsprechend flacher dichroitischer Filter. Wie in 5 gezeigt, führt jeder Einfallswinkel von mehr als 0 Grad (d. h. senkrecht zur Oberfläche des dichroitischen Filters) zu einem elliptischen Strahl-Footprint mit einer Fläche, die größer als die Querschnittsfläche des Strahls ist. Ein Einfallswinkel von 45 Grad führt zu einem großen Strahl-Footprint auf dem dichroitischen Reflektor, die größer als das 1,4-Fache der Querschnittsfläche des Strahls ist, wenn er bei null Grad einfällt.
  • Die 6A und 6B stellen schematisch eine nicht einschränkende beispielhafte Konfiguration von dichroitischen Filtern und Detektionskanälen in einem Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmodul dar, bei dem die dichroitischen Spiegel in einem Winkel von weniger als 45 Grad relativ zu einer Strahlmittelachse des Emissionslichts oder der optischen Achse der Strahlengänge (z. B. der Objektivlinse und/oder der Tubuslinse) angeordnet sind. 6A zeigt ein Bildgebungsmodul 500 mit einer Mehrzahl von Detektionskanälen 520a, 520b, 520c, 520d. 6B ist eine Detailansicht des Teils des Bildgebungsmoduls 500 innerhalb des Kreises 5B, wie in 6A gezeigt. Wie ausführlicher beschrieben wird, beinhaltet die in den 6A und 6B dargestellte Konfiguration eine Reihe von Aspekten, die zu signifikanten Verbesserungen gegenüber herkömmlichen Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmoduldesigns führen können. In einigen Fällen können Fluoreszenzbildgebungsmodule und -systeme der vorliegenden Offenbarung jedoch mit einem oder einer Teilmenge der in Bezug auf die 6A und 6B beschriebenen Merkmale implementiert werden, ohne vom Geist oder Umfang der vorliegenden Offenbarung abzuweichen.
  • Das in 6A dargestellte Bildgebungsmodul 500 beinhaltet eine Objektivlinse 510 und vier Detektionskanäle 520a, 520b, 520c und 520d, die angeordnet sind, um von der Objektivlinse 510 übertragenes Emissionslicht zu empfangen und/oder abzubilden. Ein erstes dichroitisches Filter 530 ist bereitgestellt, um die Anregungs- und Detektionsstrahlengänge zu koppeln. Im Gegensatz zu dem in den 2A und 2B sowie in den 3A und 3B gezeigten Design ist das erste dichroitische Filter 530 (z. B. ein dichroitischer Strahlteiler oder - kombinierer) konfiguriert, um Licht von der Lichtquelle zur Objektivlinse 510 und zur Probe zu reflektieren und Fluoreszenzemission von der Probe zu den Detektionskanälen 520a, 520b, 520c und 520d zu übertragen. Ein zweites dichroitisches Filter 535 teilt einen Emissionslichtstrahl auf mindestens zwei Detektionskanäle 520a, 520b auf, indem ein erster Teil 550a übertragen und ein zweiter Teil 550b reflektiert wird. Zusätzliche dichroitische Filter 540a, 540b sind bereitgestellt, um das Emissionslicht weiter aufzuteilen. Das dichroitische Filter 540a überträgt mindestens einen Teil des ersten Teils 550a des Emissionslichts und reflektiert einen Teil 550c zu einem dritten Detektionskanal 520c. Das dichroitische Filter 540b überträgt mindestens einen Teil des zweiten Teils 550b des Emissionslichts und reflektiert einen Teil 550d zu einem vierten Detektionskanal 520d. Obwohl das Bildgebungsmodul 500 mit vier Detektionskanälen gezeigt ist, kann das Bildgebungsmodul 500 in verschiedenen Ausführungsformen mehr oder weniger Detektionskanäle mit einer entsprechend größeren oder kleineren Anzahl von dichroitischen Filtern beinhalten, um einen Teil des Emissionslichts für jeden Detektionskanal bereitzustellen. Beispielsweise können in einigen Ausführungsformen die Merkmale des Bildgebungsmoduls 500 mit ähnlichen vorteilhaften Effekten in einem vereinfachten Bildgebungsmodul implementiert werden, das nur zwei Detektionskanäle 520a, 520b beinhaltet und bei dem auf zusätzliche dichroitische Filter 540a, 540b verzichtet wird. In einigen Implementierungen ist möglicherweise nur ein Detektionskanal beinhaltet. Alternativ können drei oder mehr Detektionskanäle verwendet werden.
  • Die Detektionskanäle 520a, 520b, 520c, 520d, die in 6A dargestellt sind, können einige oder alle der gleichen oder ähnlichen Komponenten wie die in den 2A bis 3B dargestellten Detektionskanäle 120 beinhalten. Beispielsweise können verschiedene Detektionskanäle 520a, 520b, 520c, 520d einen oder mehrere Bildsensoren oder Photodetektoranordnungen beinhalten und können durchlässige und/oder reflektierende Optik wie eine oder mehrere Linsen (z. B. Tubuslinsen) beinhalten, die das durch den Detektionskanal empfangene Licht auf ihren jeweiligen Bildsensor oder ihre jeweilige Photodetektoranordnung fokussieren.
  • Die Objektivlinse 510 ist so angeordnet, dass sie Emissionslicht empfängt, das durch Fluoreszenz von einem Probenkörper emittiert wird. Insbesondere ist das erste dichroitische Filter 530 angeordnet, um das von der Objektivlinse 510 gesammelte und übertragene Emissionslicht zu empfangen. Wie oben erörtert und in 6A gezeigt, ist in einigen Designs eine Beleuchtungsquelle (z. B. die Beleuchtungsquelle 115 der 2A und 2B) wie eine Laserquelle oder dergleichen angeordnet, um einen Anregungsstrahl bereitzustellen, der auf das erste dichroitische Filter 530 einfällt, so dass das erste dichroitische Filter 530 den Anregungsstrahl in dieselbe Objektivlinse 510 reflektiert, die das Emissionslicht überträgt, beispielsweise in einer Epifluoreszenzkonfiguration. Bei einigen anderen Designs kann die Beleuchtungsquelle durch andere optische Komponenten entlang eines anderen Strahlenganges, der nicht dieselbe Objektivlinse 510 beinhaltet, auf den Probenkörper gelenkt werden. In solchen Konfigurationen kann das erste dichroitische Filter 530 weggelassen werden.
  • Gleichermaßen können, wie oben erörtert und in 6A gezeigt, die Detektionsoptik (z. B. einschließlich der Detektionskanäle 520a, 520b, 520c, 520d und beliebiger optischer Komponenten wie dichroitischer Filter 535, 540a, 540b entlang des Strahlenganges zwischen der Objektivlinse 510 und den Detektionskanälen 520a, 520b, 520c, 520d) auf dem Übertragungsgang des ersten dichroitischen Filters 530 angeordnet sein und nicht auf dem reflektierten Gang des ersten dichroitischen Filters 530. In einer beispielhaften Implementierung sind die Objektivlinse 510 und die Detektionsoptik so angeordnet, dass die Objektivlinse 510 den Strahl 550 des Emissionslichts direkt hin zum zweiten dichroitischen Filter 535 überträgt. Die Wellenfronteigenschaft des Emissionslichts kann durch das Vorhandensein des ersten dichroitischen Filters 530 entlang des Ganges des Strahls 550 von Emissionslichts etwas verschlechtert werden (z. B. indem in den Strahl 550 ein gewisser Wellenfrontfehler eingebracht wird). Die Wellenfrontqualität, die durch einen Strahl eingebracht wird, der durch einen dichroitischen Reflektor eines dichroitischen Strahlteilers übertragen wird, ist jedoch im Allgemeinen signifikant kleiner als der Wellenfrontfehler eines Strahls, der von der dichroitischen Reflexionsfläche eines dichroitischen Strahlteilers reflektiert wird (z. B. eine Größenordnung kleiner). Somit können die Wellenfrontqualität und die nachfolgende Bildgebungsqualität des Emissionslichts in einem Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmodul wesentlich verbessert werden, indem die Detektionsoptik entlang des übertragenen Strahlenganges des ersten dichroitischen Filters 530 anstatt entlang des reflektierten Strahlenganges angeordnet wird.
  • Unter weiterer Bezugnahme auf 6A sind innerhalb der Detektionsoptik des Bildgebungsmoduls 500 dichroitische Filter 535, 540a und 540b bereitgestellt, um den Strahl 550 des Emissionslichts unter den Detektionskanälen 520a, 520b, 520c, 520d aufzuteilen. Beispielsweise teilen die dichroitischen Filter 535, 540a und 540b den Strahl 550 auf der Basis der Wellenlänge auf, so dass eine erste Wellenlänge oder ein erstes Wellenlängenband des Emissionslichts von dem ersten Detektionskanal 520a empfangen werden kann, eine zweite Wellenlänge oder ein zweites Wellenlängenband des Emissionslichts von dem zweiten Detektionskanal 520b empfangen werden kann, eine dritte Wellenlänge oder ein drittes Wellenlängenband des Emissionslichts von dem dritten Detektionskanal 520c empfangen werden kann und eine vierte Wellenlänge oder ein viertes Wellenlängenband des Emissionslichts von dem viertem Detektionskanal 520d empfangen werden kann. In einigen Implementierungen können mehrere getrennte Wellenlängen oder Wellenlängenbänder vom Detektionskanal empfangen werden.
  • Im Gegensatz zu dem in den 2A und 2B sowie 3A und 3B gezeigten Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmoduldesign weist das Bildgebungsmodul 500 dichroitische Filter 535, 540a und 540b auf, die in Einfallswinkeln von weniger als 45 Grad in Bezug auf die Strahlmittelachse der einfallenden Strahlen angeordnet sind. Wie in 6B gezeigt, weisen die verschiedenen Strahlen 550, 550a, 550b jeweilige Strahlmittelachsen 552, 552a, 552b auf. In verschiedenen Implementierungen befinden sich die Strahlmittelachsen 552, 552a, 552b in der Mitte eines Querschnitts des Strahls senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Strahls. Diese Strahlmittelachsen 552, 552a, 552b können der optischen Achse der Objektivlinse und/oder der Optik innerhalb der getrennten Kanäle entsprechen, beispielsweise den optischen Achsen der jeweiligen Tubuslinsen. Zusätzliche Strahlen 554, 554a, 554b jedes Strahls 550, 550a, 550b sind in 6B dargestellt, um den Durchmesser jedes Strahls 550, 550a, 550b anzuzeigen. Der Strahldurchmesser kann beispielsweise als eine volle Breite bei halbem Maximaldurchmesser, ein D4σ (d. h. 4 mal σ, wobei σ die Standardabweichung der horizontalen bzw. vertikalen Randverteilung des Strahls ist) oder eine Breite im zweiten Moment oder eine andere geeignete Definition des Strahldurchmessers definiert werden.
  • Die Strahlmittelachse 552 des Strahls 550 des Emissionslichts kann als Referenzpunkt zum Definieren des Einfallswinkels des Strahls 550 auf das zweite dichroitische Filter 535 dienen. Dementsprechend kann der „Einfallswinkel“ (AOI) eines Strahls 550 der Winkel zwischen der Strahlmittelachse 552 des einfallenden Strahls 550 und einer Linie N senkrecht zu der Oberfläche sein, auf die der Strahl einfällt, beispielsweise der dichroitischen reflektierenden Oberfläche. Wenn der Strahl 550 des Emissionslichts in einem Einfallswinkel AOI auf die dichroitische reflektierende Oberfläche des zweiten dichroitischen Filters 535 fällt, überträgt das zweite dichroitische Filter 535 einen ersten Teil 550a des Emissionslichts (z. B. den Teil mit Wellenlängen innerhalb des Passbereich des zweiten dichroitischen Filters 535) und reflektiert einen zweiten Teil 550b des Emissionslichts (z. B. den Teil mit Wellenlängen innerhalb des Sperrbereichs des zweiten dichroitischen Filters 535). Der erste Teil 550a und der zweite Teil 550b können jeweils auf ähnliche Weise in Bezug auf eine Strahlmittelachse 552a, 552b beschrieben werden. Wie oben erwähnt, kann die optische Achse alternativ oder zusätzlich verwendet werden.
  • In der Beispielkonfiguration von 6A und 6B ist das zweite dichroitische Filter 535 so angeordnet, dass die Strahlmittelachse 552 des Strahls 550 in einem Einfallswinkel von 30 Grad einfällt. Gleichermaßen sind die zusätzlichen dichroitischen Filter 540a, 540b so angeordnet, dass die Strahlmittelachsen 552a, 552b des ersten und des zweiten Teils 550a, 550b des Strahls 550 auch in Einfallswinkeln von 30 Grad einfallen. In verschiedenen Implementierungen können diese Einfallswinkel jedoch andere Winkel sein, die kleiner als 45 Grad sind. In einigen Fällen können beispielsweise die Einfallswinkel zwischen etwa 20 Grad und etwa 45 Grad liegen, wie weiter unten erläutert wird. Darüber hinaus müssen die Einfallswinkel auf jedem der dichroitischen Filter 535, 540a, 540b nicht unbedingt gleich sein. In einigen Ausführungsformen können einige oder alle der dichroitischen Filter 535, 540a, 540b so angeordnet sein, dass ihre einfallenden Strahlen 550, 550a, 550b unterschiedliche Einfallswinkel aufweisen. Wie oben beschrieben, kann sich der Einfallswinkel auf die optische Achse der Optik innerhalb des Bildgebungsmoduls, beispielsweise der Objektivlinse und/oder der Optik in den Detektionskanälen (z. B. die Tubuslinsen) und die dichroitische reflektierende Oberfläche im jeweiligen dichroitischen Strahlteiler beziehen. Die gleichen Bereiche und Werte für den Einfallswinkel gelten für den Fall, dass die optische Achse zur Spezifikation des AOI verwendet wird.
  • Die Strahlen 550, 550a, 550b des Emissionslichts in einem Fluoreszenzbildmodulsystem sind typischerweise divergierende Strahlen. Wie oben erwähnt, können die Strahlen des Emissionslichts eine Strahldivergenz aufweisen, die groß genug ist, dass Bereiche des Strahls innerhalb des Strahldurchmessers in Einfallswinkeln, die sich relativ zum Einfallswinkel der Strahlmittelachse und/oder der optischen Achse der Optik um bis zu 5 Grad oder mehr unterscheiden, auf die dichroitischen Filter einfallen. In einigen Designs kann die Objektivlinse 510 beispielsweise so konfiguriert sein, dass eine Blendenzahl oder eine numerische Apertur ausgewählt ist, um einen kleineren Strahldurchmesser für ein gegebenes Sichtfeld des Mikroskops zu erzeugen. In einem Beispiel kann die Blendenzahl oder die numerische Apertur der Objektivlinse 510 so gewählt werden, dass der volle Durchmesser der Strahlen 550, 550a, 550b beispielsweise in Einfallswinkeln innerhalb von beispielsweise 1 Grad, 1,5 Graden, 2 Graden, 2,5 Graden, 3 Graden, 3,5 Graden, 4 Graden, 4,5 Graden oder 5 Graden des Einfallswinkels der Strahlmittelachsen 552, 552a, 552b auf die dichroitischen Filter 535, 540a, 540b einfallen.
  • In einigen Implementierungen kann die Brennweite der Objektivlinse, die zur Erzeugung eines derart engen Strahldurchmessers geeignet ist, länger als diejenigen sein, die typischerweise in Fluoreszenzmikroskopen oder Bildgebungssystemen verwendet werden. Beispielsweise kann in einigen Implementierungen die Brennweite der Objektivlinse zwischen 20 mm und 40 mm liegen, wie weiter unten erläutert wird. In einem Beispiel kann eine Objektivlinse 510 mit einer Brennweite von 36 mm einen Strahl 550 erzeugen, der durch eine Divergenz gekennzeichnet ist, die klein genug ist, dass Licht über den gesamten Durchmesser des Strahls 550 in Winkeln innerhalb von 2,5 Graden des Einfallswinkels der Strahlmittelachse auf das zweite dichroitische Filter 535 fällt.
  • 7 und 8 stellen Schaubilder bereit, die eine verbesserte Leistung dichroitischer Filter aufgrund von Aspekten der Bildgebungsmodulkonfiguration von 6A und 6B (oder einer beliebigen der hierin offenbarten Bildgebungsmodulkonfigurationen) darstellen. Das Schaubild von 7 ist ähnlich dem von 4 und stellt die Wirkung des Einfallswinkels auf die Übergangsbreite (z. B. die Spektralspanne der Übertragungskante) eines dichroitischen Filters dar. 7 zeigt ein Beispiel, bei dem die Ausrichtung eines dichroitischen Filters (z. B. dichroitischer Filter 535, 540a und 540b) und die darin enthaltene dichroitische reflektierende Oberfläche derart ist, dass der einfallende Strahl davon einen Einfallswinkel von 30 Grad anstelle von 45 Grad aufweist. 7 zeigt, wie dieser verringerte Einfallswinkel die Schärfe und die Gleichmäßigkeit der Übergangsbreite über den gesamten Strahldurchmesser signifikant verbessert. Während beispielsweise ein Einfallswinkel von 45 Grad an der Strahlmittelachse zu einem Bereich von Übergangsbreiten zwischen etwa 40 nm und etwa 62 nm führt, führt ein Einfallswinkel von 30 Grad an der Strahlmittelachse zu einem Bereich von Übergangsbreiten zwischen etwa 16 nm und etwa 30 nm. In diesem Beispiel wird die durchschnittliche Übergangsbreite von etwa 51 nm auf etwa 23 nm verringert, was auf einen schärferen Übergang zwischen Passband und Sperrband hinweist. Darüber hinaus wird die Variation der Übergangsbreiten über den Strahldurchmesser um fast 40 % von einem Bereich von 22 nm auf einen Bereich von 14 nm verringert, was auf eine gleichmäßigere Schärfe des Übergangs über die Fläche des Strahls hinweist.
  • 8 zeigt zusätzliche Vorteile, die durch Auswahl der geeigneten Blendenzahl oder numerischen Apertur für die Objektivlinse erzielt werden können, um die Strahldivergenz in einer der hierin offenbarten Bildgebungsmodulkonfigurationen zu verringern. In einigen Implementierungen wird eine längere Brennweite verwendet. In dem Beispiel von 8 weist die Objektivlinse 510 eine Brennweite von 36 mm auf, was den Bereich der Einfallswinkel innerhalb des Strahls 550 mit der geeigneten numerischen Apertur (z. B. weniger als 5) von 30 Grad ± 5 Grad auf 30 Grad ± 2,5 Grad verringert. Mit diesem Design kann der Bereich der Übergangsbreiten auf zwischen etwa 19 nm und etwa 26 nm verringert werden. Im Vergleich zu dem verbesserten System von 7 wird, wenngleich die durchschnittliche Übergangsbreite im Wesentlichen die gleiche ist (beispielsweise eine Spektralspanne von etwa 23 nm), die Variation der Übergangsbreite über den Strahldurchmesser weiter auf einen 7-nm-Bereich reduziert, was eine Verringerung von fast 70 % gegenüber dem Bereich der Übergangsbreiten, der in 4 dargestellt ist, bedeutet.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf 5 ist die Verringerung des Einfallswinkels von 45 Grad auf 30 Grad an der Strahlmittelachse weiter vorteilhaft, da sie die Strahlfleckgröße auf dem dichroitischen Filter verringert. Wie in 5 gezeigt, führt ein Einfallswinkel von 45 Grad zu einem Strahl-Footprint auf dem dichroitischen Filter mit einer Fläche, die größer als das 1,4-Fache der Querschnittsfläche des Strahls ist. Ein Einfallswinkel von 30 Grad führt jedoch zu einem Strahl-Footprint auf dem dichroitischen Filter mit einer Fläche, die nur etwa das 1,15-Fache der Querschnittsfläche des Strahls beträgt. Das Verringern des Einfallswinkels an den dichroitischen Filtern 535, 540a, 540b von 45 Grad auf 30 Grad führt somit zu einer Verringerung der Strahl-Footprintfläche an den dichroitischen Filtern 535, 540a, 540b von etwa 18 %. Diese Verringerung der Strahl-Footprintfläche ermöglicht die Verwendung kleinerer dichroitischer Filter.
  • Unter Bezugnahme auf 9A und B kann die Verringerung des Einfallswinkels von 45 Grad auf 30 Grad auch eine verbesserte Leistung hinsichtlich der Oberflächenverformung bereitstellen, die durch die dichroitischen Filter in einer beliebigen der hierin offenbarten Bildgebungsmodulkonfigurationen verursacht wird, wie durch Verbesserungen der Modulationsübertragungsfunktion angezeigt. Im Allgemeinen nimmt das Ausmaß der Oberflächenverformung mit optischen Elementen mit größerer Fläche zu. Wenn eine größere Fläche auf dem dichroitischen Filter verwendet wird, tritt ein größeres Ausmaß an Oberflächenverformung auf, wodurch mehr Wellenfrontfehler in den Strahl eingebracht werden. 9A stellt die Wirkung eines Faltwinkels auf die Verschlechterung der Bildqualität dar, die durch Hinzufügen von 1 Welle Spitze zu Tal (PV) sphärische Kraft zum letzten Spiegel induziert wird. 9B stellt die Wirkung eines Faltwinkels auf die Verschlechterung der Bildqualität dar, die durch Hinzufügen von 0,1 Welle PV sphärische Kraft zum letzten Spiegel induziert wird. Wie in den 9A und 9B gezeigt, verringert die Verringerung des Einfallswinkels auf 30 Grad den Effekt der Oberflächenverformung signifikant, um eine nahezu beugungsbegrenzte Leistung der Detektionsoptik zu erreichen.
  • In einigen Implementierungen der offenbarten Bildgebungsmodule kann der Polarisationszustand des Anregungsstrahls verwendet werden, um die Leistung der hierin offenbarten Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmodule weiter zu verbessern. Unter erneuter Bezugnahme auf die 2A, 2B und 6A weisen beispielsweise einige Implementierungen der hierin offenbarten Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebungsmodule eine Epifluoreszenzkonfiguration auf, bei der ein erstes dichroitisches Filter 130 oder 530 die Strahlengänge des Anregungsstrahls und des Strahls des Emissionslichts zusammenführt, so dass sowohl das Anregungs- als auch das Emissionslicht durch die Objektivlinse 110, 510 übertragen werden. Wie oben erörtert, kann die Beleuchtungsquelle 115 eine Lichtquelle wie einen Laser oder eine andere Quelle beinhalten, die das Licht bereitstellt, das den Anregungsstrahl bildet. In einigen Designs umfasst die Lichtquelle eine linear polarisierte Lichtquelle und kann der Anregungsstrahl linear polarisiert sein. In einigen Designs ist eine Polarisationsoptik beinhaltet, um das Licht zu polarisieren und/oder die Polarisation des Lichts zu drehen. Beispielsweise kann ein Polarisator wie ein linearer Polarisator in einem Strahlengang des Anregungsstrahls beinhaltet sein, um den Anregungsstrahl zu polarisieren. Verzögerer wie Halbwellenverzögerer oder mehrere Viertelwellenverzögerern oder Verzögerer mit anderen Verzögerungsbeträgen können beinhaltet sein, um die lineare Polarisation in einigen Designs zu drehen.
  • Der linear polarisierte Anregungsstrahl kann, wenn er auf ein dichroitisches Filter oder eine andere planare Grenzfläche einfällt, p-polarisiert (z. B. mit einer elektrischen Feldkomponente parallel zur Einfallsebene), s-polarisiert (z. B. mit einer elektrischen Feldkomponente senkrecht zur Einfallsebene) werden oder kann eine Kombination von p-Polarisations- und s-Polarisationszuständen innerhalb des Strahls aufweisen. Der p- oder s-Polarisationszustand des Anregungsstrahls kann ausgewählt und/oder geändert werden, indem die Ausrichtung der Beleuchtungsquelle 115 und/oder einer oder mehrerer Komponenten davon in Bezug auf das erste dichroitische Filter 130, 530 und/oder in Bezug auf andere Oberflächen, mit denen der Anregungsstrahl in Wechselwirkung tritt, ausgewählt wird. In einigen Implementierungen, in denen die Lichtquelle linear polarisiertes Licht ausgibt, kann die Lichtquelle so konfiguriert werden, dass sie s-polarisiertes Licht bereitstellt. Beispielsweise kann die Lichtquelle einen Emitter wie einen Festkörperlaser oder eine Laserdiode umfassen, die um ihre optische Achse oder die Mittelachse des Strahls gedreht werden kann, um die Ausgabe von linear polarisiertem Licht daraus auszurichten. Alternativ oder zusätzlich können Verzögerer verwendet werden, um die lineare Polarisation um die optische Achse oder die Mittelachse des Strahls zu drehen. Wie oben erörtert, kann in einigen Implementierungen, beispielsweise wenn die Lichtquelle kein polarisiertes Licht ausgibt, ein Polarisator, der im Strahlengang des Anregungsstrahls angeordnet ist, den Anregungsstrahl polarisieren. Bei einigen Designs ist beispielsweise ein linearer Polarisator im Strahlengang des Anregungsstrahls angeordnet. Dieser Polarisator kann gedreht werden, um die richtige Ausrichtung der linearen Polarisation bereitzustellen, um s-polarisiertes Licht bereitzustellen.
  • Bei einigen Designs wird die lineare Polarisation um die optische Achse oder die Mittelachse des Strahls gedreht, so dass eine s-Polarisation auf den dichroitischen Reflektor des dichroitischen Strahlteilers einfällt. Wenn s-polarisiertes Licht auf den dichroitischen Reflektor des dichroitischen Strahlteilers einfällt, ist der Übergang zwischen dem Passband und dem Sperrband schärfer, als wenn p-polarisiertes Licht auf den dichroitischen Reflektor des dichroitischen Strahlteilers einfällt.
  • Wie in den 10A und 10B gezeigt, kann die Verwendung des p- oder s-Polarisationszustands des Anregungsstrahls die Schmalbandleistung von Anregungsfiltern wie dem ersten dichroitischen Filter 130, 530 erheblich beeinflussen. 10A stellt ein Transmissionsspektrum zwischen 610 nm und 670 nm für ein beispielhaftes dichroitisches Bandpassfilter bei Einfallswinkeln von 40 Grad und 45 Grad dar, wobei der einfallende Strahl linear polarisiert und in Bezug auf die Ebene des dichroitischen Filters p-polarisiert ist. Wie in 10B gezeigt, führt eine Änderung der Ausrichtung der Lichtquelle in Bezug auf das dichroitische Filter, so dass der einfallende Strahl in Bezug auf die Ebene des dichroitischen Filters s-polarisiert ist, zu einer wesentlich schärferen Kante zwischen dem Passband und dem Sperrband des dichroitischen Filters. Somit können die hierin offenbarten Beleuchtungs- und Bildgebungsmodule 100, 500 vorteilhafterweise eine Beleuchtungsquelle 115 aufweisen, die relativ zu dem ersten dichroitischen Filter 130, 530 ausgerichtet ist, so dass der Anregungsstrahl in Bezug auf die Ebene des ersten dichroitischen Filters 130, 530 s-polarisiert wird. Wie oben erörtert, kann in einigen Implementierungen ein Polarisator wie ein linearer Polarisator verwendet werden, um den Anregungsstrahl zu polarisieren. Dieser Polarisator kann gedreht werden, um eine Ausrichtung des linear polarisierten Lichts bereitzustellen, die dem s-polarisierten Licht entspricht. Wie oben erörtert, können in einigen Implementierungen auch andere Ansätze zum Drehen des linear polarisierten Lichts verwendet werden. Beispielsweise können optische Verzögerer wie Halbwellenverzögerer oder mehrere Viertelwellenverzögerer verwendet werden, um die Polarisationsrichtung zu drehen. Andere Anordnungen sind ebenfalls möglich.
  • Wie an anderer Stelle hierin erörtert, kann das Verringern der numerischen Apertur (NA) des Fluoreszenzbildgebungsmoduls und/oder der Objektivlinse die Schärfentiefe erhöhen, um die vergleichbare Bildgebung der beiden Oberflächen zu ermöglichen. Die 11A bis 16B zeigen, wie die MTF an der ersten und der zweiten Oberfläche, die durch 1 mm Glas getrennt sind, für niedrigere numerische Aperturen ähnlicher als für größere numerische Aperturen ist.
  • Die 11A und 11B zeigen die MTF an der ersten (11A) und der zweiten ( 11B) Oberfläche für eine NA von 0,3.
  • Die 12A und 12B zeigen die MTF an der ersten (12A) und der zweiten ( 12B) Oberfläche für eine NA von 0,4.
  • Die 13A und 13B zeigen die MTF an der ersten (13A) und der zweiten ( 13B) Oberfläche für eine NA von 0,5.
  • Die 14A und 14B zeigen die MTF an der ersten (14A) und der zweiten ( 14B) Oberfläche für eine NA von 0,6.
  • Die 15A und 15B zeigen die MTF an der ersten (15A) und der zweiten ( 15B) Oberfläche für eine NA von 0,7.
  • Die 16A und 16B zeigen die MTF an der ersten (16A) und der zweiten ( 16B) Oberfläche für eine NA von 0,8. Die erste und die zweite Oberfläche in jeder dieser Figuren entsprechen beispielsweise der oberen und der unteren Oberfläche einer Durchflusszelle.
  • Die 17A-B stellen Graphiken zum berechneten Strehl-Verhältnis (d. h. das Verhältnis der vom optischen System fokussierten oder gesammelten Peaklichtintensität zu jener von einem idealen optischen System und einer Punktlichtquelle fokussierten oder gesammelten Lichtintensität) zur Bildgebung einer zweiten Durchflusszellenoberfläche durch eine erste Durchflusszellenoberfläche bereit. 17A zeigt eine Graphik zu den Strehl-Verhältnissen zum Abbilden einer zweiten Durchflusszellenoberfläche durch eine erste Durchflusszellenoberfläche als Funktion der Dicke der dazwischenliegenden Fluidschicht (Fluidkanalhöhe) für verschiedene numerische Öffnungen der Objektivlinse und/oder des optischen Systems. Wie gezeigt, nimmt das Strehl-Verhältnis mit zunehmendem Abstand zwischen der ersten und der zweiten Oberfläche ab. Eine der Oberflächen hätte somit die Bildqualität mit zunehmendem Abstand zwischen den beiden Oberflächen verschlechtert. Die Abnahme der Bildgebungsleistung der zweiten Oberfläche mit zunehmendem Abstand zwischen den beiden Oberflächen ist bei Bildgebungssystemen mit kleineren numerischen Aperturen im Vergleich zu solchen mit größeren numerischen Aperturen verringert. 17B zeigt eine Graphik zum Strehl-Verhältnis als Funktion der numerischen Apertur zur Bildgebung einer zweiten Durchflusszellenoberfläche durch eine erste Durchflusszellenoberfläche und eine dazwischenliegende Wasserschicht mit einer Dicke von 0,1 mm. Der Verlust der Bildgebungsleistung bei höheren numerischen Aperturen kann der erhöhten optischen Aberration zugeschrieben werden, die durch das Fluid für die Bildgebung der zweiten Oberfläche induziert wird. Mit zunehmender NA verschlechtert die erhöhte optische Aberration, die von dem Fluid für die Bildgebung der zweiten Oberfläche eingebracht wird, die Bildqualität erheblich. Im Allgemeinen verringert jedoch das Verringern der numerischen Apertur des optischen Systems die erreichbare Auflösung. Dieser Verlust der Bildqualität kann mindestens teilweise ausgeglichen werden, indem ein erhöhtes Kontrast-Rausch-Verhältnis der Probenebene (oder Objektebene) bereitgestellt wird, beispielsweise indem Chemie für Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen verwendet wird, die die Fluoreszenzemission für markierte Nukleinsäurecluster verbessern und/oder die Hintergrundfluoreszenzemission reduziert. In einigen Fällen können beispielsweise Probenträgerstrukturen verwendet werden, die hydrophile Substratmaterialien und/oder hydrophile Beschichtungen umfassen. In einigen Fällen können solche hydrophilen Substrate und/oder hydrophilen Beschichtungen Hintergrundgeräusche reduzieren. Probenträgerstrukturen, hydrophile Oberflächen und Beschichtungen und Verfahren zum Verbessern des Kontrast-Rausch-Verhältnisses, z. B. für Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen, sind nachstehend näher erörtert.
  • In einigen Implementierungen sind eines oder mehrere des Fluoreszenzbildgebungssystems, des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls 100, der Bildgebungsoptik (z. B. Optik 126), der Objektivlinse und/oder der Tubuslinse so konfiguriert, dass sie eine verringerte Vergrößerung aufweisen, wie eine Vergrößerung von weniger als 10-fach, wie weiter unten erörtert wird. Eine solche verringerte Vergrößerung kann Designbeschränkungen so anpassen, dass andere Designparameter erreicht werden können. Beispielsweise können eines oder mehrere des Fluoreszenzmikroskops, des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls 100, der Bildgebungsoptik (z. B. Optik 126), der Objektivlinse und/oder der Tubuslinse auch so konfiguriert sein, dass das Fluoreszenzbildgebungsmodul ein großes Sichtfeld (FOV) aufweist, beispielsweise ein Sichtfeld von mindestens 3,0 mm oder mehr (z. B. im Durchmesser, in der Breite, in der Höhe oder in der längsten Abmessung), wie weiter unten erläutert wird. Eines oder mehrere des Fluoreszenzbildgebungssystems, des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls 100, der Bildgebungsoptik (z. B. Optik 126), der Objektivlinse und/oder der Tubuslinse können so konfiguriert sein, dass das Fluoreszenzmikroskop mit einem solchen Sichtfeld versehen wird, dass das FOV weniger als z. B. 0,1 Aberrationswellen über mindestens 80 % des Feldes aufweist. Gleichermaßen können eines oder mehrere des Fluoreszenzbildgebungssystems, des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls 100, der Bildgebungsoptik (z. B. Optik 126), der Objektivlinse und/oder der Tubuslinse so konfiguriert sein, dass das Fluoreszenzbildgebungsmodul ein solches FOV aufweist und beugungsbegrenzt ist oder über ein solches FOV beugungsbegrenzt ist.
  • Wie oben erörtert, wird in verschiedenen Implementierungen ein großes Sichtfeld (FOV) durch die offenbarten optischen Systeme bereitgestellt. In einigen Implementierungen wird das Erhalten eines erhöhten FOV teilweise durch die Verwendung größerer Bildsensoren oder Photodetektoranordnungen erleichtert. Die Photodetektoranordnung kann beispielsweise eine Aktivfläche mit einer Diagonale von mindestens 15 mm oder mehr aufweisen, wie weiter unten erläutert wird. Wie oben erörtert, stellen in einigen Implementierungen die offenbarten optischen Bildgebungssysteme eine reduzierte Vergrößerung bereit, beispielsweise von weniger als dem 10-Fachen, was Designs mit großem FOV erleichtern kann. Trotz der verringerten Vergrößerung kann die optische Auflösung des Bildgebungsmoduls immer noch ausreichend sein, da Detektoranordnungen mit kleiner Pixelgröße oder kleinem Abstand verwendet werden können. Die Pixelgröße und/oder der Abstand können beispielsweise etwa 5 µm oder weniger betragen, wie nachstehend ausführlicher erörtert wird. In einigen Implementierungen ist die Pixelgröße kleiner als das Zweifache der optischen Auflösung, die vom optischen Bildgebungssystem (z. B. Objektiv- und Tubuslinse) bereitgestellt wird, um den Nyquist-Satz zu erfüllen. Dementsprechend können die Pixelabmessung und/oder der Abstand für den einen oder die mehreren Bildsensor derart sein, dass eine Raumabtastfrequenz für das Bildgebungsmodul mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des Bildgebungsmoduls beträgt. Beispielsweise kann die Raumabtastfrequenz für die Photodetektoranordnung mindestens das 2-Fache, mindestens das 2,5-Fache, mindestens das 3-Fache, mindestens das 4-Fache oder mindestens das 5-Fache der optischen Auflösung des Fluoreszenzbildgebungsmoduls (z. B. des Beleuchtungs- und Bildgebungsmoduls, des Objektivs und der Tubuslinse, der Objektlinse und der Optik 126 in dem Detektionskanal, der Bildgebungsoptik zwischen der Probenträgerstruktur oder -stufe, die konfiguriert ist, um die Probenträgerstufe und die Photodetektoranordnung zu tragen) oder eine beliebige Raumabtastfrequenz in einem Bereich zwischen beliebigen dieser Werte betragen.
  • Obwohl hierin ein breiter Bereich von Merkmalen in Bezug auf Fluoreszenzbildgebungsmodule erörtert wird, kann jedes der hier beschriebenen Merkmale und Designs auf andere Arten von optischen Bildgebungssystemen angewendet werden, einschließlich ohne Einschränkung Hellfeld- und Dunkelfeldbildgebung, und kann auf Lumineszenz- oder Phosphoreszenzbildgebung angewendet werden.
  • Doppelwellenlängenanregungs-A/ierkanal-Bildgebungssystem: 18 stellt ein Doppelanregungswellenlängen-/Vierkanal-Bildgebungssystem für zweiseitige Bildgebungsanwendungen dar, das eine Kombination aus Objektiv und Tubuslinse beinhaltet, die in einer Richtung senkrecht zur optischen Achse abgetastet wird, um eine großflächige Bildgebung bereitzustellen, z. B. durch Kacheln mehrerer Bilder, um ein zusammengesetztes Bild mit einem Gesamtsichtfeld (FOV) zu erschaffen, das viel größer als jenes für jedes einzelne Bild ist. Das System umfasst zwei Anregungslichtquellen, z. B. Laser oder Laserdioden, die in unterschiedlichen Wellenlängen arbeiten, und einen Autofokuslaser. Die zwei Anregungslichtstrahlen und der Autofokuslaserstrahl werden unter Verwendung einer Reihe von Spiegeln und/oder dichroitischen Reflektoren kombiniert und durch das Objektiv an eine obere oder untere Innenoberfläche der Durchflusszelle abgegeben. Die Fluoreszenz, die von markierten Oligonukleotiden (oder anderen Biomolekülen) emittiert wird, die an eine der Durchflusszellenoberflächen angebunden sind, wird vom Objektiv gesammelt, durch die Tubuslinse übertragen und gemäß der Wellenlänge des emittierten Lichts von einem Reihe dichroitischer Zwischenreflektoren zu einem der vier Bildgebungssensoren gelenkt. Autofokuslaserlicht, das von der Durchflusszellenoberfläche reflektiert wurde, wird vom Objektiv gesammelt, durch die Tubuslinse übertragen und von einer Reihe dichroitischer Zwischenreflektoren zu einem Autofokussensor gelenkt. Das System ermöglicht die Aufrechterhaltung eines genauen Fokus (z. B. durch Einstellen des relativen Abstands zwischen der Durchflusszellenoberfläche und dem Objektiv unter Verwendung eines Präzisionslinearaktuators, einer Translationsstufe oder eines am Mikroskopturm montierten Fokuseinstellmechanismus, um die Größe des reflektierten Lichtflecks auf dem Autofokusbildsensor zu verringern oder zu minimieren), während die Objektiv/Tubuslinse-Kombination in einer Richtung senkrecht zur optischen Achse des Objektivs abgetastet wird. Die Doppelwellenlängenanregung, die in Kombination mit der Bildgebungsfähigkeit mit vier Kanälen (d. h. vier Wellenlängen) verwendet wird, stellt eine Hochdurchsatzbildgebung der oberen (nahen) und unteren (fernen) Innenflächen der Durchflusszelle bereit.
  • Gemultiplexte optische Leseköpfe:
  • In einigen Fällen können miniaturisierte Versionen beliebiger der hierin beschriebenen Bildgebungsmodule zusammengesetzt werden, um einen gemultiplexten Lesekopf zu erzeugen, der in einer oder mehreren Richtungen horizontal relativ zu einer Probenoberfläche, z. B. einer Innenoberfläche einer Durchflusszelle, translatiert werden kann, um mehrere Abschnitte der Oberfläche gleichzeitig abzubilden. Ein nicht einschränkendes Beispiel für einen gemultiplexten Lesekopf wurde kürzlich in der veröffentlichten US-Patentanmeldung Nr. 2020/0139375 A1 beschrieben.
  • In einigen Fällen kann beispielsweise ein miniaturisiertes Bildgebungsmodul ein „Mikrofluorometer“ umfassen, das eine Beleuchtungs- oder Anregungslichtquelle wie eine LED oder Laserdiode (oder die Spitze einer mit einer externen Lichtquelle verbundenen optischen Faser), eine oder mehrere Linsen zum Kollimieren oder Fokussieren des Beleuchtungs- oder Anregungslichts, einen oder mehrere dichroitische Reflektoren, ein oder mehrere optische Filter, einen oder mehrere Spiegel, Strahlteiler, Prismen, Aperturen usw., ein oder mehrere Objektive, eine oder mehrere anwenderspezifische Tubuslinsen zum Ermöglichen einer Doppeloberflächenbildgebung mit minimaler Fokuseinstellung, wie an anderer Stelle hierin beschrieben, einen oder mehrere Bildsensoren oder eine beliebige Kombination davon, wie an anderer Stelle hierin beschrieben, umfasst. In einigen Fällen kann ein miniaturisiertes Bildgebungsmodul (z. B. ein „Mikrofluorometer“) ferner einen Autofokusmechanismus, einen Mikroprozessor, Strom- und Datenübertragungsanschlüsse, ein lichtdichtes Gehäuse usw. umfassen. Das resultierende miniaturisierte Bildgebungsmodul kann somit ein integriertes Bildgebungspaket oder eine integrierte Bildgebungseinheit mit kleinem Formfaktor umfassen. In einigen Fällen kann die kürzeste Abmessung (z. B. Breite oder Durchmesser) des miniaturisierten Bildgebungsmoduls weniger als 5 cm, weniger als 4,5 cm, weniger als 4 cm, weniger als 3,5 cm, weniger als 3 cm, weniger als 2,5 cm, weniger als 2 cm, weniger als 1,8 cm, weniger als 1,6 cm, weniger als 1,4 cm, weniger als 1,2 cm, weniger als 1 cm, weniger als 0,8 cm oder weniger als 0,6 cm betragen. In einigen Fällen kann die längste Abmessung (z. B. Höhe oder Länge) des miniaturisierten Bildgebungsmoduls weniger als 16 cm, weniger als 14 cm, weniger als 12 cm, weniger als 10 cm, weniger als 9 cm, weniger als 8 cm, weniger als 7 cm, weniger als 5 cm, weniger als 5 cm, weniger als 4,5 cm, weniger als 4 cm, weniger als 3,5 cm, weniger als 3 cm, weniger als 2,5 cm, weniger als 2 cm, weniger als 1,8 cm, weniger als 1,6 cm, weniger als 1,4 cm, weniger als 1,2 cm oder weniger als 1 cm betragen. In einigen Fällen können ein oder mehrere einzelne miniaturisierte Bildgebungsmodule innerhalb des gemultiplexten Lesekopfs einen Autofokusmechanismus umfassen.
  • In einigen Fällen können gemultiplexte Leseköpfe, wie hierin beschrieben, eine Baugruppe von 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder mehr als 12 miniaturisierten Bildgebungsmodulen oder Mikrofluorometern umfassen, die in fester Position relativ zueinander gehalten werden. In einigen Fällen können die optischen Designspezifikationen und Leistungseigenschaften der einzelnen miniaturisierten Bildgebungsmodule oder Mikrofluorometer, z. B. für numerische Apertur, Sichtfeld, Schärfentiefe, Bildauflösung usw., dieselben wie an anderer Stelle hierin für andere Versionen der offenbarten Bildgebungsmodule beschrieben sein. In einigen Fällen kann die Mehrzahl einzelner miniaturisierter Bildgebungsmodule in einer linearen Anordnung angeordnet sein, die eine, zwei, drei, vier oder mehr als vier Zeilen und/oder Spalten umfasst. In einigen Fällen kann die Mehrzahl einzelner miniaturisierter Bildgebungsmodule z. B. in einer hexagonal eng gepackten Anordnung angeordnet sein. In einigen Fällen kann die Mehrzahl einzelner miniaturisierter Bildgebungsmodule in einer kreisförmigen oder spiralförmigen Anordnung, einer zufällig verteilten Anordnung oder in einer anderen dem Fachmann bekannten Anordnung angeordnet sein.
  • Die 43A-B stellen nicht einschränkende schematische Darstellungen eines gemultiplexten Lesekopfes bereit, wie hierin offenbart. 43A zeigt eine Seitenansicht eines gemultiplexten Lesekopfes, wobei zwei Reihen einzelner Mikrofluorometer (vom Ende aus gesehen) mit gemeinsamen optischen Designspezifikationen, z. B. numerischer Apertur, Sichtfeld, Arbeitsabstand usw., konfiguriert sind, um eine gemeinsame Oberfläche abzubilden, z. B. eine erste Innenoberfläche einer Durchflusszelle. 43B zeigt eine Draufsicht auf denselben gemultiplexten Lesekopf von oben, wobei die überlappenden Bildgebungsgänge dargestellt sind, die von einzelnen Mikrofluorometern des gemultiplexten Lesekopfs aufgenommen werden, während der Lesekopf relativ zur Durchflusszelle (oder umgekehrt) translatiert wird. In einigen Fällen können sich die einzelnen Sichtfelder für die einzelnen Mikrofluorometer überlappen, wie in 43B gezeigt. In einigen Fällen überlappen sie sich möglicherweise nicht. In einigen Fällen kann der gemultiplexte Lesekopf so ausgelegt sein, dass er mit vorbestimmten Merkmalen, z. B. einzelnen Fluidkanälen, innerhalb einer Durchflusszelle ausgerichtet ist und diese abbildet.
  • Die 44A-B stellen nicht einschränkende schematische Darstellungen eines gemultiplexten Lesekopfs bereit, wobei eine erste Teilmenge der Mehrzahl einzelner miniaturisierter Bildgebungsmodule konfiguriert ist, um eine erste Probenebene, z. B. eine erste Innenoberfläche einer Durchflusszelle, abzubilden, und eine zweite Teilmenge der Mehrzahl konfiguriert ist, um gleichzeitig eine zweite Probenebene abzubilden, z. B. eine zweite Innenoberfläche einer Durchflusszelle. 44A zeigt eine Seitenansicht des gemultiplexten Lesekopfs, wobei die erste Teilmenge einzelner Mikrofluorimeter konfiguriert ist, um z. B. die erste oder obere Innenoberfläche einer Durchflusszelle abzubilden, und die zweite Teilmenge konfiguriert ist, um eine zweite Oberfläche, z. B. die zweite oder untere Innenoberfläche einer Durchflusszelle, abzubilden. 44B zeigt eine Draufsicht auf den gemultiplexten Lesekopf von 44A von oben, wobei die Bildgebungsgänge dargestellt sind, die von einzelnen Mikrofluorimetern des gemultiplexten Lesekopfs aufgenommen wurden. Wiederum können sich in einigen Fällen die einzelnen Sichtfelder für die einzelnen Mikrofluorometer in einer gegebenen Teilmenge überlappen. In einigen Fällen überlappen sie sich möglicherweise nicht. In einigen Fällen kann der gemultiplexte Lesekopf so ausgelegt sein, dass sich die einzelnen miniaturisierten Bildgebungsmodule der ersten und der zweiten Teilmenge mit vorbestimmten Merkmalen, z. B. einzelnen Fluidkanälen, innerhalb einer Durchflusszelle ausrichten und diese abbilden.
  • Verbesserte oder optimierte Objektiv- und/oder Tubuslinsen zur Verwendung mit dickeren Deckgläsern: Die bestehende Designpraxis beinhaltet das Design von Objektivlinsen und/oder die Verwendung allgemein verfügbarer handelsüblicher Standardmikroskopobjektive zur Optimierung der Bildqualität, wenn Bilder durch dünne (z. B. < 200 µm dicke) Mikroskopdeckgläser aufgenommen werden. Bei Verwendung zur Bildgebung auf beiden Seiten eines Fluidkanals oder einer Durchflusszelle führt die zusätzliche Höhe des Spaltes zwischen den beiden Oberflächen (d. h. die Höhe des Fluidkanals; typischerweise etwa 50 µm bis 200 µm) zu einer optischen Aberration in aufgenommenen Bildern für die nicht optimale Seite des Fluidkanals, wodurch eine geringere optische Auflösung verursacht wird. Dies liegt hauptsächlich daran, dass die zusätzliche Spalthöhe im Vergleich zur optimalen Deckglasdicke erheblich ist (typische Fluidkanal- oder Spalthöhen von 50 bis 200 µm gegenüber Deckglasdicken von < 200 µm). Eine andere übliche Designpraxis besteht darin, eine zusätzliche „Kompensatorlinse“ im Strahlengang zu verwenden, wenn die Bildgebung auf der nicht optimalen Seite des Fluidkanals oder der Durchflusszelle durchgeführt werden soll. Diese „Kompensatorlinse“ und der Mechanismus, der erforderlich ist, um sie in den Strahlengang hinein oder aus diesem heraus zu bewegen, so dass jede Seite der Durchflusszelle abgebildet werden kann, erhöhen die Systemkomplexität und die Ausfallzeit des Bildgebungssystems weiter und verschlechtern möglicherweise die Bildqualität aufgrund von Vibrationen usw.
  • In der vorliegenden Offenbarung ist das Bildgebungssystem auf Kompatibilität mit Durchflusszellen-Verbrauchsmaterialien ausgelegt, die ein dickeres Deckglas oder eine dickere Durchflusszellenwand (Dicke ≥ 700 µm) umfassen. Das Objektivlinsendesign kann für ein Deckglas verbessert oder optimiert sein, das der tatsächlichen Deckglasdicke plus der Hälfte der effektiven Spaltdicke entspricht (z. B. 700 µm + ½ * Fluidkanalhöhe (Spalthöhe)). Dieses Design verringert die Auswirkung der Spalthöhe auf die Bildqualität für die beiden Oberflächen des Fluidkanals erheblich und gleicht die optische Qualität für Bilder der beiden Oberflächen aus, da die Spalthöhe im Verhältnis zur Gesamtdicke des Deckglases klein ist und damit ihre Auswirkung auf die optische Qualität verringert wird.
  • Weitere Vorteile der Verwendung eines dickeren Deckglases sind unter anderem eine verbesserte Kontrolle des Dickentoleranzfehlers während der Herstellung und die verringerte Wahrscheinlichkeit, dass das Deckglas aufgrund von thermischen und montagebedingten Spannungen eine Verformung erfährt. Dickenfehler und Verformung von Deckgläsern wirken sich nachteilig auf die Bildgebungsqualität aus, sowohl für die obere Oberfläche als auch für die untere Oberfläche einer Durchflusszelle.
  • Um die Qualität der Doppeloberflächenbildgebung für Sequenzierungsanwendungen weiter zu verbessern, legt unser Design optischer Systeme einen starken Schwerpunkt auf die Verbesserung oder Optimierung der MTF (z. B. durch Verbesserung oder Optimierung des Objektiv- und/oder Tubuslinsendesigns) im mittleren bis hohen Raumfrequenzbereich, der am besten zum Abbilden und Auflösen kleiner Flecken oder Cluster geeignet ist.
  • Verbessertes oder optimiertes Tubuslinsendesign zur Verwendung in Kombination mit handelsüblichen Standardobjektiven: Für ein kostengünstiges Sequenziererdesign kann die Verwendung einer handelsüblichen Standardobjektivlinse aufgrund ihres relativ geringen Preisniveaus bevorzugt werden. Wie oben erwähnt, sind kostengünstige Standardobjektive jedoch meistens für die Verwendung mit dünnen Deckgläsern mit einer Dicke von etwa 170 µm optimiert. In einigen Fällen kann bei den offenbarten optischen Systemen ein Tubuslinsendesign verwendet werden, das ein dickeres Deckglas der Durchflusszelle kompensiert und gleichzeitig eine hohe Bildqualität für beide Innenflächen einer Durchflusszelle in Doppeloberflächen-Bildgebungsanwendungen ermöglicht. In einigen Fällen ermöglichen die hierin offenbarten Tubuslinsendesigns eine qualitativ hochwertige Bildgebung für beide Innenflächen einer Durchflusszelle, ohne einen optischen Kompensator in den Strahlengang zwischen der Durchflusszelle und einem Bildsensor hinein oder aus diesem heraus zu bewegen, ohne ein oder mehrere optische Elemente oder Komponenten der Tubuslinse entlang des Strahlenganges zu bewegen und ohne ein oder mehrere optische Elemente oder Komponenten der Tubuslinse in den Strahlengang hinein oder aus diesem heraus zu bewegen.
  • 19 stellt ein Diagramm zur Verfolgung optischer Strahlen für ein Restlicht-Objektivlinsendesign bereit, das in Bezug auf die Bildgebung einer Oberfläche auf der gegenüberliegenden Seite eines 0,17 mm dicken Deckglases verbessert oder optimiert wurde. Die Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für dieses Objektiv, die in 20 gezeigt ist, zeigt eine nahezu beugungsbegrenzte Bildgebungsleistung an, wenn sie mit dem Design für 0,17 mm dickes Deckglas verwendet wird.
  • 21 stellt eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die in 19 dargestellte gleiche Objektivlinse als Funktion der Raumfrequenz bereit, wenn zum Abbilden einer Oberfläche auf der gegenüberliegenden Seite eines 0,3 mm dicken Deckglases verwendet. Die relativ geringen Abweichungen des MTF-Werts über den Raumfrequenzbereich von etwa 100 bis etwa 800 Linien/mm (oder Zyklen/mm) zeigen, dass die Bildqualität, die selbst bei Verwendung eines 0,3 mm dicken Deckglases erhalten wird, immer noch angemessen ist.
  • 22 stellt eine Graphik zur Modulationsübertragungsfunktion für die gleiche Objektivlinse, die in 19 dargestellt ist, als Funktion der Raumfrequenz bereit, wenn sie verwendet wird, um eine Oberfläche abzubilden, die von jener auf der gegenüberliegenden Seite eines 0,3 mm dicken Deckglases durch eine 0,1 mm dicke Schicht wässrigen Fluids getrennt ist (d. h. unter den Bedingungen, die für die doppelseitige Bildgebung einer Durchflusszelle beim Abbilden der entfernten Oberfläche vorliegen). Wie in der Graphik von 22 ersichtlich, wird die Bildgebungsleistung verschlechtert, wie durch die Abweichungen der MTF-Kurven von denen für einen idealen, beugungsbegrenzten Fall über den Raumfrequenzbereich von etwa 50 Ip/mm bis etwa 900 Ip/mm angezeigt.
  • Die 23 und 24 stellen Graphiken zur Modulationsübertragungsfunktion als Funktion der Raumfrequenz für die obere (oder nahe) Innenoberfläche (23) und die untere (oder ferne) Innenoberfläche (24) einer Durchflusszelle bereit, wenn sie unter Verwendung der Objektivlinse von 19 durch ein 1,0 mm dickes Deckglas abgebildet werden und wenn die obere und untere Innenoberfläche durch eine 0,1 mm dicke Schicht wässrigen Fluids getrennt sind. Wie zu sehen ist, ist die Bildgebungsleistung für beide Oberflächen erheblich verschlechtert.
  • 25 ein Strahlverfolgungsdiagramm für ein Tubuslinsendesign bereitstellt, das, wenn es in Verbindung mit der in 19 dargestellten Objektivlinse verwendet wird, eine verbesserte doppelseitige Bildgebung durch ein 1 mm dickes Deckglas bereitstellt. Das optische Design 700, das ein zusammengesetztes Objektiv (Linsenelemente 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709 und 710) und eine Tubuslinse (Linsenelemente 711, 712, 713 und 714) umfasst, ist in Bezug auf die Verwendung mit Durchflusszellen verbessert oder optimiert, die ein dickes Deckglas (oder eine dicke Wand), z. B. mit einer Dicke von mehr als 700 µm und einer Fluidkanaldicke von mindestens 50 µm, umfassen, und überträgt das Bild einer Innenoberfläche von der Durchflusszelle 701 mit drastisch verbesserter optischer Bildqualität und höherem CNR auf den Bildsensor 715.
  • In einigen Fällen kann die Tubuslinse (oder Tubuslinsenbaugruppe) mindestens zwei optische Linsenelemente, mindestens drei optische Linsenelemente, mindestens vier optische Linsenelemente, mindestens fünf optische Linsenelemente, mindestens sechs optische Linsenelemente, mindestens sieben optische Linsenelemente, mindestens acht optische Linsenelemente, mindestens neun optische Linsenelemente, mindestens zehn optische Linsenelemente oder mehr umfassen, wobei die Anzahl der optischen Linsenelemente, die Oberflächengeometrie jedes Elements und die Reihenfolge der Platzierung in der Baugruppe verbessert oder optimiert ist, um optische Aberrationen zu korrigieren, die durch die dicke Wand der Durchflusszelle induziert werden, und ermöglicht in einigen Fällen die Verwendung eines handelsüblichen Standardobjektivs, während sie dennoch ihre Fähigkeit zur qualitativ hochwertigen doppselseitigen Bildgebung beibehält.
  • In einigen Fällen, wie in 25 dargestellt, kann die Tubuslinsenbaugruppe in dieser Reihenfolge eine erste asymmetrische konvex-konvexe Linse 711, eine zweite plankonvexe Linse 712, eine dritte asymmetrische konkav-konkave Linse 713 und eine vierte asymmetrische konvex-konkave Linse 714 umfassen.
  • Die 26 und 27 stellen Graphiken zur Modulationsübertragungsfunktion als Funktion der Raumfrequenz für die obere (oder nahe) Innenoberfläche (26) und die untere (oder ferne) Innenoberfläche (27) einer Durchflusszelle bereit, wenn sie unter Verwendung der Kombination aus Objektivlinse (korrigiert für ein Deckglas von 0,17 mm) und Tubuslinse von 25 durch ein 1,0 mm dickes Deckglas abgebildet werden und wenn die obere und untere Innenoberfläche durch eine 0,1 mm dicke Schicht wässrigen Fluids getrennt sind. Wie zu sehen ist, ist die erzielte Bildgebungsleistung nahezu diejenige, die für ein beugungsbegrenztes optisches Design erwartet wird.
  • 28 stellt Strahlverfolgungsdiagramme für das Tubuslinsendesign (links) der vorliegenden Offenbarung bereit, das verbessert und optimiert wurde, um eine qualitativ hochwertige doppelseitige Bildgebungsleistung bereitzustellen. Da die Tubuslinse nicht mehr unendlich korrigiert ist, kann eine entsprechend gestaltete Nulllinse (rechts) in Kombination mit der Tubuslinse verwendet werden, um die nicht unendlich korrigierte Tubuslinse für Herstellungs- und Testzwecke zu kompensieren.
  • Bildgebungskanalspezifische Anpassung oder Optimierung der Tubuslinse: Beim Design von Bildgebungssystemen ist es möglich, sowohl die Objektivlinse als auch die Tubuslinse im gleichen Wellenlängenbereich für alle Bildgebungskanäle zu verbessern oder zu optimieren. Typischerweise wird dieselbe Objektivlinse von allen Bildgebungskanälen gemeinsam genutzt (siehe beispielsweise 18), und verwendet jeder Bildgebungskanal entweder dieselbe Tubuslinse oder weist eine Tubuslinse auf, die dasselbe Design aufweist.
  • In einigen Fällen können die hierin offenbarten Bildgebungssysteme ferner eine Tubuslinse für jeden Bildgebungskanal umfassen, wobei die Tubuslinse unabhängig für den spezifischen Bildgebungskanal verbessert oder optimiert wurde, um die Bildqualität zu verbessern, z. B. um Verzerrung und Feldkrümmung zu verringern oder zu minimieren und um die Tiefenschärfeleistung (DOF-Leistung) für jeden Kanal zu verbessern. Da der Wellenlängenbereich (oder Bandpass) für jeden spezifischen Bildgebungskanal viel enger als der kombinierte Wellenlängenbereich für alle Kanäle ist, führt die wellenlängen- oder kanalspezifische Anpassung oder Optimierung der in den offenbarten Systemen verwendeten Tubuslinse zu signifikanten Verbesserungen der Bildgebungsqualität und -leistung. Diese kanalspezifische Anpassung oder Optimierung führt bei Anwendungen der doppelseitigen Bildgebung zu einer verbesserten Bildqualität sowohl für die obere als auch die untere Oberfläche der Durchflusszelle.
  • Doppelseitige Bildgebung ohne in der Durchflusszelle vorhandenes Fluid: Für eine optimale Bildgebungsleistung sowohl der oberen als auch der unteren Innenoberfläche einer Durchflusszelle ist typischerweise ein bewegungsbetätigter Kompensator erforderlich, um optische Aberrationen zu korrigieren, die durch das Fluid in der Durchflusszelle induziert werden (typischerweise umfassend eine Fluidschichtdicke von etwa 50 bis 200 µm). In einigen Fällen der offenbarten Designs optischer Systeme kann die obere Innenoberfläche der Durchflusszelle mit in der Durchflusszelle vorhandenem Fluid abgebildet werden. Sobald der Sequenzierungschemiezyklus abgeschlossen ist, kann das Fluid aus der Durchflusszelle extrahiert werden, um die untere Innenoberfläche abzubilden. Somit bleibt in einigen Fällen auch ohne Verwendung eines Kompensators die Bildqualität für die untere Oberfläche erhalten.
  • Kompensation optischer Aberration und/oder Vibration unter Verwendung elektrooptischer Phasenplatten: In einigen Fällen kann die Bildqualität auf zwei Oberflächen verbessert werden, ohne dass das Fluid aus der Durchflusszelle entfernt werden muss, indem eine elektrooptische Phasenplatte (oder eine andere Korrekturlinse) in Kombination mit dem Objektiv verwendet wird, um die durch das Vorhandensein des Fluids induzierten optischen Aberrationen zu beseitigen. In einigen Fällen kann die Verwendung einer elektrooptischen Phasenplatte (oder Linse) eingesetzt werden, um die Auswirkungen von Vibrationen zu beseitigen, die sich aus der mechanischen Bewegung eines bewegungsbetätigten Kompensators ergeben, und kann schnellere Bildaufnahmezeiten und Sequenzierungszykluszeiten für Anwendungen der genomischen Sequenzierung bereitstellen.
  • Design mit verbessertem Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR), verbessertem Sichtfeld (FOV), verbesserter spektraler Trennung und verbessertem Timing zur Erhöhung oder Maximierung der Informationsübertragung und des Durchsatzes: Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung oder Maximierung der Informationsübertragung in Bildgebungssystemen, die für genomische Anwendungen entwickelt wurden, besteht darin, das Sichtfeld (FOV) zu vergrößern und die Zeit zu verringern, die zum Abbilden eines bestimmten FOV erforderlich ist. Bei typischen optischen Bildgebungssystemen mit großer NA kann es üblich sein, Bilder für Sichtfelder aufzunehmen, deren Fläche in der Größenordnung von 1 mm2 liegt, wobei in den gegenwärtig offenbarten Bildgebungssystemdesigns große FOV-Objektive mit langen Arbeitsabständen spezifiziert sind, um die Bildgebung von Flächen von 2 mm2 oder mehr zu ermöglichen.
  • In einigen Fällen sind die offenbarten Bildgebungssysteme zur Verwendung in Kombination mit proprietären gering bindenden Substratoberflächen und DNA-Amplifikationsprozessen ausgelegt, die den Fluoreszenzhintergrund verringern, der aus einer Vielzahl von Störsignalen resultiert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die unspezifische Adsorption von Fluoreszenzfarbstoffen an Substratoberflächen, unspezifische Nukleinsäureamplifikationsprodukte (z. B. Nukleinsäureamplifikationsprodukte, die auf der Substratoberfläche in Bereichen zwischen den Flecken oder Merkmalen entstehen, die klonal amplifizierten Clustern von Nukleinsäuremolekülen (d. h. spezifisch amplifizierten Kolonien) entsprechen, unspezifische Nukleinsäureamplifikationsprodukte, die innerhalb der amplifizierten Kolonien entstehen können, phasige und vorphasige Nukleinsäurestränge usw. Die Verwendung von gering bindenden Substratoberflächen und DNA-Amplifikationsprozessen, die den Fluoreszenzhintergrund verringern, in Kombination mit den offenbarten optischen Bildgebungssystemen kann die für das Abbilden jedes FOV erforderliche Zeit erheblich verringern.
  • Die gegenwärtig offenbarten Systemdesigns können die erforderliche Bildgebungszeit durch Verbesserung oder Optimierung der Bildgebungssequenz weiter verringern, wenn mehrere Kanäle von Fluoreszenzbildern gleichzeitig oder mit überlappendem Timing aufgenommen werden und wenn die spektrale Trennung der Fluoreszenzsignale so ausgelegt ist, dass Übersprechungen zwischen den Fluoreszenzdetektionskanälen und zwischen dem Anregungslicht und dem einen oder den mehreren Fluoreszenzsignalen reduziert werden.
  • Die gegenwärtig offenbarten Systemdesigns können ferner die erforderliche Bildgebungszeit durch Verbesserung oder Optimierung der Abtastbewegungssequenz verringern. Bei dem typischen Ansatz wird eine X-Y-Translationsstufe verwendet, um das Ziel-FOV in eine Position unterhalb des Objektivs zu bewegen, wird ein Autofokusschritt ausgeführt, bei dem die optimale Fokusposition bestimmt wird und das Objektiv in Z-Richtung zur bestimmten Fokusposition bewegt wird, und wird ein Bild aufgenommen. Eine Sequenz von Fluoreszenzbildern wird durch Durchlaufen einer Reihe von Ziel-FOV-Positionen aufgenommen. Aus Sicht des Informationsübertragungstastverhältnisses werden Informationen nur während des Fluoreszenzbildaufnahmeteils des Zyklus übertragen. In den gegenwärtig offenbarten Bildgebungssystemdesigns wird eine Einzelschrittbewegung ausgeführt, bei der alle Achsen (X-Y-Z) gleichzeitig neu positioniert werden, und der Autofokusschritt wird verwendet, um den Fokuspositionsfehler zu überprüfen. Die zusätzliche Z-Bewegung wird nur befohlen, wenn der Fokuspositionsfehler (d. h. die Differenz zwischen der Brennebenenposition und der Probenebenenposition) eine bestimmte Grenze überschreitet (z. B. eine spezifizierte Fehlerschwelle). In Verbindung mit einer X-Y-Bewegung mit hoher Geschwindigkeit erhöht dieser Ansatz das Tastverhältnis des Systems und damit den Bildgebungsdurchsatz pro Zeiteinheit.
  • Ferner kann die Zeit, die erforderlich ist, um Bilder mit hoher Qualität (Bilder mit hohem Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR)) aufzunehmen, durch Abgleichen der Effizienz der optischen Sammlung, der Modulationsübertragungsfunktion und der Bildsensorleistungseigenschaften des Designs mit dem Fluoreszenzphotonenfluss, der für den Eingangsanregungsphotonenfluss erwartet wird, der Farbstoffeffizienz (bezogen auf den Farbstoffextinktionskoeffizienten und die Fluoreszenzquantenausbeute) erwartet wird, unter Berücksichtigung von Hintergrundsignal- und Systemrauschencharakteristika reduziert oder minimiert werden.
  • Die Kombination aus effizienter Bildaufnahme und verbesserten oder optimierten Schritt- und Einschwingzeiten für die Translationsstufe führt zu schnellen Bildgebungszeiten (d. h. der pro Sichtfeld erforderlichen Gesamtzeit) und einer Leistung des Bildgebungssystems mit höherem Durchsatz.
  • Zusammen mit dem großen FOV und dem schnellen Tastverhältnis der Bildaufnahme können die offenbarten Designs auch das Spezifizieren der Ebenheit der Bildebene, der chromatischen Fokusleistung zwischen Fluoreszenzdetektionskanälen, der Ebenheit des Sensors, der Bildverzerrung und der Fokusqualitätsspezifikationen umfassen.
  • Die Leistung des chromatischen Fokus wird weiter verbessert, indem die Bildsensoren für verschiedene Fluoreszenzdetektionskanäle einzeln ausgerichtet werden, so dass sich die beste Brennebene für jeden Detektionskanal überlappt. Das Designziel besteht darin, sicherzustellen, dass Bilder über mehr als 90 Prozent des Sichtfelds innerhalb von ± 100 nm (oder weniger) relativ zur besten Brennebene für jeden Kanal aufgenommen werden, wodurch die Übertragung einzelner Fleckintensitätssignale erhöht oder maximiert wird. In einigen Fällen stellen die offenbarten Designs ferner sicher, dass Bilder über 99 Prozent des Sichtfelds innerhalb von ± 150 nm (oder weniger) relativ zur besten Brennebene für jeden Kanal aufgenommen werden, und dass auch Bilder über mehr das gesamte Sichtfeld innerhalb von ± 200 nm (oder weniger) relativ zur besten Brennebene für jeden Bildgebungskanal aufgenommen werden.
  • Design des Beleuchtungsstrahlenganges: Ein weiterer Faktor zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR), des Kontrast-Rausch-Verhältnisses (CNR) und/oder zur Erhöhung des Durchsatzes ist die Erhöhung der Beleuchtungsleistungsdichte für die Probe. In einigen Fällen können die offenbarten Bildgebungssysteme ein Beleuchtungsstrahlengangdesign umfassen, das einen Hochleistungslaser oder eine Hochleistungslaserdiode verwendet, der bzw. die mit einem flüssigen Lichtleiter gekoppelt ist. Der flüssige Lichtleiter entfernt optische Speckles, die kohärenten Lichtquellen wie Lasern und Laserdioden eigen sind. Darüber hinaus ist die Kopplungsoptik so ausgelegt, dass die Eintrittsapertur des flüssigen Lichtleiters unterfüllt ist. Die Unterfüllung der Eintrittsapertur des flüssigen Lichtleiters verringert die effektive numerische Apertur des in die Objektivlinse eintretenden Beleuchtungsstrahls und verbessert somit die Lichtabgabeeffizienz durch das Objektiv auf die Probenebene. Mit dieser Designinnovation können Beleuchtungsleistungsdichten erreicht werden, die bis zu dreimal so hoch wie bei herkömmlichen Designs über ein großes Sichtfeld (FOV) sind.
  • Durch Verwendung der winkelabhängigen Unterscheidung von s- und p-Polarisation kann in einigen Fällen die Beleuchtungsstrahlpolarisation ausgerichtet werden, um die Menge an zurückgestreutem und zurückreflektiertem Beleuchtungslicht zu verringern, die die Bildgebungssensoren erreicht.
  • Strukturierte Beleuchtungssysteme: In einigen Fällen können die offenbarten Bildgebungsmodule und -systeme ein strukturiertes optisches Beleuchtungsdesign umfassen, um die effektive räumliche Auflösung des Bildgebungssystems zu erhöhen und somit die Verwendung höherer Oberflächendichten von klonal amplifizierten Zielnukleinsäuresequenzen (Clustern) auf Durchflusszellenoberflächen für einen verbesserten Sequenzierungsdurchsatz zu ermöglichen. Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) verwendet räumlich strukturierte (d. h. periodische) Lichtmuster zur Beleuchtung der Probenebene und beruht auf der Erzeugung von Interferenzmustern, die als Moire-Streifen bekannt sind. Mehrere Bilder werden unter leicht unterschiedlichen Beleuchtungsbedingungen aufgenommen, z. B. durch Verschieben und/oder Drehen des Musters der strukturierten Beleuchtung, um die Moire-Streifen zu erzeugen. Die mathematische Entfaltung des resultierenden Interferenzsignals ermöglicht die Rekonstruktion eines hochauflösenden Bildes mit einer bis zu zweifachen Verbesserung der räumlichen Auflösung gegenüber der mit beugungsbegrenzter Bildgebungsoptik erzielten [Lutz (2011), „Biological Imaging by Superresolution Light Microscopy", Comprehensive Biotechnology (2. Aufl.), Bd. 1, S. 579-589, Elsevier; Feiner-Gracia, et al. (2018), „15 - Advanced Optical Microscopy Techniques for the Investigation of Cell-Nanoparticle Interactions", Smart Nanoparticles for Biomedicine: Micro and Nano Technologies, S. 219-236, Elsevier; Nylk, et al. (2019), „Light-Sheet Fluorescence Microscopy With Structured Light", Neurophotonics and Biomedical Spectroscopy, S. 477-501, Elsevier]. Ein Beispiel für strukturierte Beleuchtungsmikroskopiebildgebungssysteme wurde kürzlich in Hong, US-Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 2020/0218052 , beschrieben.
  • 41 stellt eine nicht einschränkende schematische Darstellung eines Bildgebungssystems 4100 bereit, das ein verzweigtes strukturiertes optisches Beleuchtungsdesign umfasst, wie es hierin offenbart ist. Die erste Verzweigung (oder der erste Arm) des Beleuchtungsstrahlenganges des Systems 4100 umfasst beispielsweise eine Lichtquelle (Lichtemitter) 4110A, einen optischen Kollimator 4120A zum Kollimieren von von der Lichtquelle 4110A emittiertem Licht, ein Beugungsgitter 4130A in einer ersten Ausrichtung in Bezug auf die optische Achse, ein rotierendes Fenster 4140A und eine Linse 4150A. Die zweite Verzweigung des Beleuchtungsstrahlenganges des Systems 4100 umfasst beispielsweise eine Lichtquelle 4110B, einen optischen Kollimator 4120B zum Kollimieren von von der Lichtquelle 4110B emittiertem Licht, ein Beugungsgitter 4130B in einer zweiten Ausrichtung in Bezug auf die optische Achse, ein rotierendes Fenster 4140B und eine Linse 4150B. Die Beugungsgitter 4130A und 4130B ermöglichen die Projektion von Mustern von Lichtstreifen auf die Probenebene.
  • In einigen Fällen können die Lichtquellen 4110A und 4110B inkohärente Lichtquellen (z. B. umfassend eine oder mehrere Leuchtdioden (LEDs)) oder kohärente Lichtquellen (z. B. umfassend einen oder mehrere Laser oder Laserdioden) sein. In einigen Fällen können die Lichtquellen 4110A und 4110B eine optische Faser umfassen, die z. B. mit einer LED, einem Laser oder einer Laserdiode gekoppelt ist, die bzw. der einen Lichtstrahl ausgibt, der dann von den jeweiligen Kollimatorlinsen 4120A und 4120B kollimiert wird. In einigen Fällen können die Lichtquellen 4110A und 4110B Licht derselben Wellenlänge ausgeben. In einigen Fällen können die Lichtquellen 4110A und 4110B Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen ausgeben. Jede der Lichtquellen 4110A und 4110B kann konfiguriert sein, um Licht mit einer beliebigen Wellenlänge und/oder einem Wellenlängenbereich auszugeben, die an anderer Stelle hierin beschrieben sind. Während der Bildgebung können die Lichtquellen 4110A und 4110B beispielsweise unter Verwendung eines im Strahlengang positionierten Hochgeschwindigkeitsverschlusses (nicht gezeigt) oder durch Pulsieren der Lichtquellen mit einer vorbestimmten Frequenz ein- oder ausgeschaltet werden.
  • In dem in 41 gezeigten Beispiel beinhaltet der erste Beleuchtungsarm des Systems 4100 ein festes vertikales Gitter 4130A, das verwendet wird, um ein Gittermuster (z. B. ein vertikales Lichtstreifenmuster) in einer ersten Ausrichtung auf die Probenebene zu projizieren, z. B. eine erste Innenoberfläche 4188 einer Durchflusszelle 4187, und der zweite Beleuchtungsarm beinhaltet ein festes horizontales Gitter 4130B, um ein Gittermuster (z. B. ein horizontales Lichtstreifenmuster) in einer zweiten Ausrichtung auf die Probenebene 4188 zu projizieren. Vorteilhafterweise müssen die Beugungsgitter des Bildgebungssystems 4100 während der Bildgebung in diesem nicht einschränkenden Beispiel nicht mechanisch gedreht oder translatiert werden, was eine verbesserte Bildgebungsgeschwindigkeit, Systemzuverlässigkeit und Systemwiederholbarkeit bereitstellen kann. In einigen Fällen können die Beugungsgitter 4130A und/oder 4130B um ihre jeweiligen optischen Achsen drehbar sein, so dass der Winkel zwischen den auf die Probenebene projizierten Lichtstreifenmustern einstellbar ist.
  • Wie in 41 gezeigt, können die Beugungsgitter 4130A und 4130B in einigen Fällen durchlässige Beugungsgitter sein, die mehrere Beugungselemente (z. B. parallele Schlitze oder Rillen) umfassen, die in einem Glassubstrat oder einer anderen geeigneten Oberfläche ausgebildet sind. In einigen Fällen können die Gitter als Phasengitter implementiert werden, die eine periodische Variation des Brechungsindex des Gittermaterials bereitstellen. In einigen Fällen kann der Rillen- oder Merkmalsabstand so gewählt werden, dass Licht in geeigneten Winkeln gebeugt wird und/oder auf die minimale auflösbare Merkmalsgröße der abgebildeten Proben für den Betrieb des Bildgebungssystems 4100 abgestimmt wird. In anderen Fällen können die Beugungsgitter reflektierende Beugungsgitter sein.
  • In dem in 41 gezeigten Beispiel sind die Ausrichtungen der vertikalen und horizontalen Lichtstreifenmuster um etwa 90 Grad versetzt. In anderen Fällen können andere Ausrichtungen der Beugungsgitter verwendet werden, um einen Versatz von etwa 90 Grad zu erzeugen. Beispielsweise können die Beugungsgitter so ausgerichtet sein, dass sie Lichtstreifenmuster projizieren, die um ± 45 Grad von der x- oder der y-Achse der Probenebene (z. B. der ersten Durchflusszelleninnenfläche) 4188 versetzt sind. Die Konfiguration des Bildgebungssystems 4100, die in 41 dargestellt ist, kann im Fall einer Probenträgerfläche (z. B. einer Innenoberfläche 4188 einer Durchflusszelle 4187) mit regelmäßig strukturierten Merkmalen, die auf einem rechteckigen Gitter angeordnet sind, besonders vorteilhaft sein, da eine Verbesserung der Bildauflösung unter Verwendung des strukturierten Beleuchtungsansatzes erreicht werden kann, wenn nur zwei senkrechte Gitterausrichtungen (z. B. die vertikale Gitterausrichtung und die horizontale Gitterausrichtung) verwendet werden.
  • Die Beugungsgitter 4130A und 4130B können im Beispiel des Systems 4100 konfiguriert sein, um die Eingangsbeleuchtungslichtstrahlen aufgrund konstruktiver Interferenz gemäß der Beziehung in eine Reihe von Intensitätsmaxima zu beugen: m = Ondungszahl=d sin  ( θ ) / λ
    Figure DE202021001858U1_0001
    wobei d der Abstand zwischen Schlitzen oder Rillen im Beugungsgitter ist, θ der Einfallswinkel des Beleuchtungslichts relativ zu einer Normalen zur Oberfläche des Beugungsgitters ist, λ die Wellenlänge des Beleuchtungslichts ist und m eine ganzzahliger Wert ist, der einem Intensitätsmaximum des gebeugten Lichts entspricht, z. B. m = 0, ± 1, ± 2 usw. In einigen Fällen kann eine bestimmte Ordnung des gebeugten Beleuchtungslichts, z. B. das Licht erster Ordnung (m = ± 1), auf die Probenebene projiziert werden, z. B. die Durchflusszelleninnenfläche 4188. In einigen Fällen kann beispielsweise das vertikale Gitter 4130A einen kollimierten Lichtstrahl in gebeugte Strahlen erster Ordnung (± 1 Ordnungen) beugen, die in einer ersten Ausrichtung auf die Probenebene fokussiert sind, und das horizontale Gitter 4130B kann einen kollimierten Lichtstrahl in gebeugte Strahlen erster Ordnung beugen, die in einer zweiten Ausrichtung auf die Probenebene fokussiert werden. In einigen Fällen können der Strahl nullter Ordnung und/oder alle anderen Strahlen höherer Ordnung (z. B. m = ± 2 oder höher) blockiert werden, d. h. aus dem auf die Probenebene 4188 projizierten Beleuchtungsmuster herausgefiltert werden, wobei beispielsweise ein Strahlblockierungselement (nicht gezeigt) verwendet wird, wie ein Ordnungsfilter, das in die Strahlengänge nach den Beugungsgittern eingefügt werden kann.
  • Jede Verzweigung des strukturierten Beleuchtungssystems in dem Beispiel von 4100 beinhaltet einen optischen Phasenmodulator oder Phasenschieber 4140A und 4140B, um das gebeugte Licht, das von jedem der Beugungsgitter 4130A und 4130B übertragen oder reflektiert wird, phasenzuverschieben. Während der strukturierten Bildgebung kann die optische Phase jedes gebeugten Strahls um einen Bruchteil (z. B. ½, ½, ¼ usw.) des Abstands (X) jedes Streifens des strukturierten Musters verschoben werden. In dem Beispiel von 41 können die Phasenmodulatoren 4140A und 4140B beispielsweise als rotierende optische Phasenplatten implementiert sein, die durch rotatorische Aktuatoren oder andere Aktuatormechanismen betätigt werden, um die Strahlenganglänge jedes gebeugten Strahls zu drehen und zu modulieren. Beispielsweise kann die optische Phasenplatte 4140A um die vertikale Achse gedreht werden, um das durch das vertikale Gitter 4130A auf der Probenebene 4188 projizierte Bild nach links oder rechts zu verschieben, und die optische Phasenplatte 4140B kann sich um die horizontale Achse drehen, um das durch das horizontale Gitter 4130B auf der Probenebene 4188 projizierte Bild in senkrechter Richtung zu verschieben.
  • In anderen Implementierungen können andere Arten von Phasenmodulatoren verwendet werden, die die Strahlenganglänge des gebeugten Lichts ändern (z. B. auf linearen Translationsstufen montierte optische Keile usw.). Obwohl die optischen Phasenmodulatoren 4140A und 4140B als nach den Beugungsgittern 4130A und 4130B angeordnet dargestellt sind, können sie in anderen Implementierungen auch an anderen Positionen im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sein. In einigen Fällen kann ein einzelner optischer Phasenmodulator in zwei verschiedenen Richtungen betrieben werden, um unterschiedliche Lichtstreifenmuster zu erzeugen, oder die Position eines einzelnen optischen Phasenmodulators kann unter Verwendung einer einzelnen Bewegung eingestellt werden, um gleichzeitig die Ganglängen beider Arme des Beleuchtungsstrahlenganges einzustellen.
  • In dem in 41 dargestellten Beispiel kann die optische Komponente 4160 verwendet werden, um Licht von den zwei Beleuchtungsstrahlengängen zu kombinieren. Die optische Komponente 4160 kann beispielsweise einen teilweise versilberten Spiegel, einen dichroitischen Spiegel (abhängig von den Wellenlängen des von den Lichtquellen 4110A und 4110B ausgegebenen Lichts), einen Spiegel, der ein Lochmuster oder eine strukturierte reflektierende Beschichtung umfasst, so dass Licht aus den beiden Armen des Beleuchtungssystems verlustfrei oder nahezu verlustfrei kombiniert wird (z. B. ohne signifikanten Verlust an optischer Leistung, abgesehen von einer geringen Absorption durch die reflektierende Beschichtung), einen polarisierenden Strahlteiler (für den Fall, dass Lichtquellen 4110A und 4110B konfiguriert sind, um polarisiertes Licht zu erzeugen) und dergleichen umfassen. Die optische Komponente 4160 kann so angeordnet sein, dass die gewünschten gebeugten Lichtordnungen, die von jedem der Beugungsgitter reflektiert oder übertragen werden, räumlich aufgelöst werden und die unerwünschten Lichtordnungen blockiert werden. In einigen Fällen kann die optische Komponente 4160 Licht erster Ordnung, das durch den ersten Beleuchtungslichtgang ausgegeben wird, durchlassen und Licht erster Ordnung, das durch den zweiten Beleuchtungslichtgang ausgegeben wird, reflektieren. In einigen Fällen kann das strukturierte Beleuchtungsmuster auf der Probenoberfläche 4188 von einer vertikalen Ausrichtung (z. B. unter Verwendung eines Beugungsgitters 4130A) durch Ein- oder Ausschalten jeder Lichtquelle oder durch Öffnen und Schließen eines optischen Verschlusses im Strahlengang für die Lichtquelle in eine horizontale Ausrichtung (z. B. unter Verwendung eines Beugungsgitters 4130B) geschaltet werden. In anderen Fällen kann das strukturierte Beleuchtungsmuster unter Verwendung eines optischen Schalters umgeschaltet werden, um den Beleuchtungsstrahlengang zu ändern, der zum Beleuchten der Probenebene verwendet wird.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf 41 können eine Linse 4170, ein halbreflektierender Spiegel oder ein dichroitischer Spiegel 4180 und ein Objektiv 4185 verwendet werden, um das strukturierte Beleuchtungslicht auf die Probenoberfläche 4188 (z. B. die erste Innenoberfläche einer Durchflusszelle 4187) zu fokussieren. Licht, das von der Probenoberfläche 4188 emittiert, reflektiert oder gestreut wird, wird dann vom Objektiv 4185 gesammelt, durch den Spiegel 4180 übertragen und von einem Bildsensor oder einer Kamera 4195 abgebildet. Wie erwähnt, kann der Spiegel 4180 ein dichroitischer Spiegel sein, um strukturiertes Beleuchtungslicht, das von jeder Verzweigung des Beleuchtungsstrahlenganges empfangen wird, zur Projektion auf die Probenebene 4188 in das Objektiv 4185 zu reflektieren und von der Probenebene 4188 emittiertes Licht (z. B. fluoreszierendes Licht, das bei anderen Wellenlängen als das Anregungslicht emittiert wird) zur Bildgebung auf den Bildsensor 4195 durchzulassen.
  • In einigen Fällen kann das System 4100 optional eine anwenderspezifische Tubuslinse 4190 umfassen, wie an anderer Stelle hierin beschrieben, so dass der Fokus des Bildgebungssystems von der ersten Innenoberfläche 4188 auf die zweite Innenoberfläche 4189 der Durchflusszelle 4187 verschoben werden kann, um eine Doppeloberflächenbildgebung mit minimaler Anpassung zu ermöglichen. In einigen Fällen kann die Linse 4170 eine anwenderspezifische Tubuslinse umfassen, wie sie an anderer Stelle hierin beschrieben ist, so dass der Fokus des Beleuchtungsstrahlenganges von der ersten Innenoberfläche 4188 auf die zweite Innenoberfläche 4189 der Durchflusszelle 4187 verschoben werden kann, um eine Doppeloberflächenabbildung mit minimaler Anpassung zu ermöglichen. In einigen Fällen kann die Linse 4170 implementiert werden, um entlang der optischen Achse gelenkig zu sein, um den Fokus des strukturierten Beleuchtungsmusters auf der Probenebene einzustellen. In einigen Fällen kann das System 4100 einen Autofokusmechanismus (nicht gezeigt) umfassen, um den Fokus des Beleuchtungslichts und/oder den Fokus des Bildes auf der Ebene des Bildsensors 4195 einzustellen. In einigen Fällen kann das in 41 dargestellte System 4100 eine hohe optische Effizienz bereitstellen, da im Strahlengang kein Polarisator vorhanden ist. Die Verwendung von unpolarisiertem Licht kann abhängig von der numerischen Apertur des Objektivs 4185 einen signifikanten Einfluss auf den Beleuchtungsmusterkontrast aufweisen oder auch nicht.
  • Der Einfachheit halber wurden einige optische Komponenten des Bildgebungssystems 4100 in 41 und der vorstehenden Erörterung möglicherweise weggelassen. Obwohl das System 4100 in diesem nicht einschränkenden Beispiel als ein Einkanal-Detektionssystem dargestellt ist, kann es in anderen Fällen als Mehrkanal-Detektionssystem implementiert werden (z. B. unter Verwendung von zwei verschiedenen Bildsensoren und geeigneter Optik sowie Lichtquellen, die in zwei verschiedenen Wellenlängen emittieren). Obwohl der Beleuchtungsstrahlengang des Systems 4100 in diesem nicht einschränkenden Beispiel als zwei Verzweigungen umfassend dargestellt ist, kann er in einigen Fällen so implementiert werden, dass er beispielsweise drei Verzweigungen, vier Verzweigungen oder mehr als vier Verzweigungen umfasst, von denen jede ein Beugungsgitter mit einer festen oder einstellbaren relativen Ausrichtung zueinander umfasst.
  • In einigen Fällen können alternative Beleuchtungsstrahlengangdesigns verwendet werden, um eine strukturierte Beleuchtung zu erzeugen. Beispielsweise kann in einigen Fällen ein einzelner großer, rotierender optischer Phasenmodulator nach der optischen Komponente 4160 positioniert und anstelle der optischen Phasenmodulatoren 4140A und 4140B verwendet werden, um die Phasen beider gebeugter Strahlen zu modulieren, die von den vertikalen und horizontalen Beugungsgittern 4130A und 4130B ausgegeben werden. In einigen Fällen verläuft die Drehachse für den einzelnen rotierenden optischen Kompensator nicht parallel zur optischen Achse eines der Beugungsgitter, sondern kann um 45 Grad (oder einen anderen Winkelversatz) von der optischen Achse von jedem der vertikalen und horizontalen Beugungsgitter versetzt sein, um eine Phasenverschiebung entlang beider Beleuchtungsrichtungen zu ermöglichen. In einigen Fällen kann der einzelne rotierende optische Phasenmodulator durch beispielsweise eine um die Nominalstrahlachse rotierende optische Keilkomponente ersetzt werden.
  • In einem anderen alternativen Beleuchtungsstrahlengangdesign können die Beugungsgitter 4130A und 4130B auf jeweiligen linearen Bewegungsstufen angebracht sein, so dass sie translatiert werden können, um die Strahlenganglänge (und damit die Phase) des von den Beugungsgittern 4130A und 4130B reflektierten oder übertragenen Lichts zu ändern. Die Bewegungsachse der linearen Bewegungsstufen kann senkrecht oder auf andere Weise von der Ausrichtung ihres jeweiligen Beugungsgitters versetzt sein, um eine Translation des Streifenmusters des Beugungsgitters entlang der Probenebene 4188 bereitzustellen. Geeignete Translationsstufen können beispielsweise gekreuzte Rollenlagerstufen, einen Linearmotor, einen hochgenauen Linearcodierer und/oder andere Linearaktuatortechnologien umfassen, um eine präzise lineare Translation der Beugungsgitter bereitzustellen.
  • 42 stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für einen Arbeitsablaufs zum Aufnehmen und Verarbeiten von Bildern unter Verwendung einer strukturierten Beleuchtung bereit, um die räumliche Auflösung des Bildgebungssystems zu verbessern. In einigen Fällen kann der in 42 dargestellte Arbeitsablauf durchgeführt werden, um eine gesamte Probenebene (z. B. eine Innenoberfläche einer Durchflusszelle mittels Bildkachelung) abzubilden oder um einen einzelnen Bereich einer größeren Probenebene abzubilden. Das vertikale Beugungsgitter 4130A und das horizontale Beugungsgitter 4130B des in 41 dargestellten Systems 4100 können verwendet werden, um Beleuchtungslichtstreifenmuster auf die Probenebene zu projizieren, die unterschiedliche bekannte Ausrichtungen und/oder unterschiedliche bekannte Phasenverschiebungen aufweisen. Beispielsweise kann das Bildgebungssystem 4100 ein vertikales Gitter 4130A und ein horizontales Gitter 4130B verwenden, um die horizontalen bzw. vertikalen Beleuchtungsmuster zu erzeugen, während die optischen Phasenmodulatoren 4140A und 4140B auf drei verschiedene Positionen eingestellt werden können, um die drei für jede Ausrichtung gezeigten Phasenverschiebungen zu erzeugen.
  • Während des Betriebs kann eine erste Beleuchtungsbedingung (z. B. eine spezifische Ausrichtung des Beugungsgitters und Phasenverschiebungseinstellung) verwendet werden, um ein Gitterlichtstreifenmuster auf die Probenebene zu projizieren, z. B. die Durchflusszellenoberfläche. Nach der Erfassung eines Bildes unter Verwendung der ersten Beleuchtungsbedingung werden ein oder mehrere zusätzliche Bilder, die unter Verwendung eines oder mehrerer phasenverschobener Beleuchtungsmuster aufgenommen werden (z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr als 6 zusätzliche Bilder, die unter Verwendung von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr als 6 phasenverschobenen Beleuchtungsmustern aufgenommen werden) aufgenommen. Wenn das Bildgebungssystem eine zweite Verzweigung des Beleuchtungsstrahlengangs umfasst, kann der Bildaufnahmevorgang unter Verwendung einer zweiten Beleuchtungsbedingung als Ausgangspunkt (z. B. einer zweiten spezifischen Ausrichtung des Beugungsgitters und Phasenverschiebungseinstellung) wiederholt werden und der Bildaufnahmeprozess kann wiederholt werden. In einigen Fällen können Bilder für mindestens drei verschiedene Ausrichtungen des Beugungsgitters (z. B. um 60 Grad relativ zueinander beabstandet) unter Verwendung von mindestens 5 verschiedenen phasenverschobenen Lichtstreifenmustern aufgenommen werden. Wenn keine Bilder mehr unter Verwendung unterschiedlicher Ausrichtungen des Beugungsgitters oder phasenverschobener Beleuchtungslichtstreifenmuster aufgenommen werden sollen, kann ein Bildrekonstruktionsalgorithmus verwendet werden, um die aufgenommenen Bilder zu verarbeiten und ein rekonstruiertes superauflösendes Bild zu erzeugen. In einigen Fällen können Bilder für mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr als 6 verschiedene Ausrichtungen des Beugungsgitters unter Verwendung von mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr als 6 verschiedene phasenverschobene Lichtstreifenmuster bei jeder Ausrichtung aufgenommen werden.
  • Ein möglicher Nachteil des Aufnehmens mehrerer Bilder zur Verwendung bei der Rekonstruktion einzelner superauflösender Bilder sind die Zeit, die erforderlich ist, um die Ausrichtung und/oder relative Phasenverschiebung der projizierten Lichtstreifenmuster anzupassen, und die Belichtungszeit, die für die Aufnahme jedes Bildes erforderlich ist, sowie die nachgeschaltete Bildverarbeitung. Daher sind optische Designs, die die Zeit minimieren, die erforderlich ist, um die Ausrichtung des Beugungsgitters und die relative Phase zu ändern, in Kombination mit hocheffizienten Bildrekonstruktionsalgorithmen zu bevorzugen. In einigen Fällen können weniger Bilder erforderlich sein, um superauflösende Bilder von z. B. Durchflusszellenoberflächen zu rekonstruieren, die separate, fluoreszenzmarkierte Cluster amplifizierter Zielnukleinsäuresequenzen umfassen, die an die hierin beschriebenen gering nichtspezifischen Bindungsoberflächen angebunden sind, als normalerweise zum Rekonstruieren von höherauflösenden Bildern herkömmlicher Proben, z. B. gefärbter Gewebeproben, erforderlich wären.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf 42 kann der vorgenannte Zyklus für verschiedene Bereiche einer gegebenen Durchflusszellenoberfläche wiederholt werden, z. B. in dem Fall, dass die Bilder gekachelt werden, um ein höherauflösendes Bild der gesamten Durchflusszellenoberfläche zu erzeugen. In einigen Fällen kann der vorgenannte Zyklus nach dem Einstellen des Fokus des Bildgebungssystems wiederholt werden, wenn beispielsweise eine zweite Durchflusszellenoberfläche abgebildet werden soll.
  • Andere superauflösende Bildgebungstechniken: In einigen Fällen können die offenbarten Bildgebungssysteme die Verwendung einer alternativen superauflösenden Bildgebungstechnik umfassen, z. B. Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (PALM), Fluoreszenzphotoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (FPALM) und/oder stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) [siehe beispielsweise Lutz et al. (2011), „Biological Imaging by Superresolution Light Microscopy", Comprehensive Biotechnology (2. Aufl.). Bd. 1, S. 579-589, Elsevier), die auf einer statistischen Kurvenanpassung der Intensitätsverteilung, die in Bildern der Punktspreizfunktion (PSF) eines einzelnen Moleküls beobachtet wurde, an eine Gaußsche Verteilungsfunktion basieren. Die Gaußsche Verteilungsfunktion wird dann verwendet, um die Position des Moleküls in der Probenebene mit viel höherer Genauigkeit zu definieren, als es die klassische Auflösungsgrenze zulässt. Der gleiche Ansatz kann verwendet werden, um beispielsweise kleine dispergierte Teilmengen fluoreszenzmarkierter Moleküle wie klonal amplifizierte Cluster von Zielnukleinsäuresequenzen abzubilden, die an eine gering unspezifisch bindende Oberfläche auf einem Probenträger oder die Innenoberfläche einer Durchflusszelle gebunden sind.
  • Die mit diesen Verfahren erzielte räumliche Genauigkeit oder Auflösung hängt von der Anzahl der Photonen, die aus dem Molekül vor dem Photobleichen gesammelt werden, und vom Hintergrundrauschpegel ab [Lutz et al. (2011), ebd.]. Für den Fall, dass das Hintergrundrauschen vernachlässigbar ist und eine Sammlung von mindestens 10.000 Photonen pro Molekül möglich ist, wurden Positionsgenauigkeiten von 1-2 nm gezeigt. In einigen Fällen, z. B. unter Verwendung des an anderer Stelle hierin beschriebenen Ansatzes der Sequenzierung durch Avidität können Polymer-Nukleotid-Konjugate, umfassend eine Mehrzahl von fluoreszierenden Markierungen (z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr als 10 Markierungen pro Konjugat), um eine hohe Photonenzahl sicherzustellen, die gegebenenfalls in Kombination mit den gering unspezifisch bindenden Oberflächen verwendet wird, die an anderer Stelle hierin offenbart sind, um sehr geringe Hintergrundsignale sicherzustellen, die Verwendung dieser superauflösenden Bildgebungstechniken für Anwendung genetischer Testungen und Sequenzierung erleichtern. Die räumliche Genauigkeit oder Auflösung nimmt mit abnehmender Anzahl gesammelter Photonen ab, selbst wenn nur eine moderate Anzahl von Photonen gesammelt wird, ist eine Positionsortsgenauigkeit oder Auflösung von 20 nm möglich. In einigen Fällen kann eine Verbesserung der lateralen räumlichen Auflösung um das 10-Fache oder besser erreicht werden. In einigen Fällen kann eine Bildauflösung von besser als 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm oder 10 nm erreicht werden.
  • Das zweite Prinzip, das für diese Klasse der Bildgebung von grundlegender Bedeutung ist, besteht darin, dass zu einem beliebigen bestimmten Zeitpunkt eine kleine Anzahl räumlich getrennter fluoreszierender Moleküle in der Probe abgebildet wird.
  • In einigen Fällen ist die Fähigkeit, die Fluoreszenzemission kleiner, dispergierter Teilmengen fluoreszierender Moleküle in der Probenebene zu steuern, der Schlüssel zur leichteren superauflösenden Bildgebung. Im Fall der Fluoreszenzphotoaktivierungslokalisationsmikroskopie (FPALM) und der Photoaktivierungslokalisationsmikroskopie (PALM) beispielsweise hat die Verwendung von photoaktivierbaren grün fluoreszierenden Proteinen (PA-GFP) als Markierung die kontrollierte Induktion fluoreszierender Teilmengen in einer Probe unter Verwendung von kurzen Impulsen von 405 nm Licht zur Photokonvertierung des PA-GFP von einem dunklen, nicht fluoreszierenden Zustand in einen anregbaren fluoreszierenden Zustand von 488 nm ermöglicht, wodurch räumlich getrennte Teilmengen fluoreszierender Moleküle entstehen, die abgebildet werden können [Lutz et al. (2011), ebd.]. Im Fall der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) können die Photo-Switching-Eigenschaften beispielsweise der Cyaninfarbstoffpaare Cy5-Cy3 auf ähnliche Weise verwendet werden, um die stochastische Induktion der Cy5-Fluoreszenz aus einer kleinen Teilmenge der Moleküle in der Probe zu einem beliebigen bestimmten Zeitpunkt zu ermöglichen, z. B. kleine Teilmengen von Molekülen, die räumlich durch mindestens mehrere Auflösungseinheiten getrennt sind. In einigen Fällen, z. B. in Kombination mit dem an anderer Stelle hierin beschriebenen Ansatz der Sequenzierung durch Avidität, können Polymer-Nukleotid-Konjugate ein photoaktivierbares grün fluoreszierendes Protein (PA-GFP) oder eine Subdomäne oder einen Teil davon umfassen. In einigen Fällen können die Polymer-Nukleotid-Konjugate eine Mischung von Konjugaten umfassen, in denen ein erster Teil mit z. B. Cy3-Markierungen und ein zweiter Teil mit z. B. Cy5-Markierungen markiert ist. In einigen Fällen können die Polymer-Nukleotid-Konjugate eine Mischung von z. B. Cy3- und Cy5-Markierungen innerhalb desselben Konjugats umfassen.
  • Das superauflösende Bild wird aus der Summe der Gaußschen Anpassungen aller Moleküle oder Merkmale (z. B. markierter Nukleinsäurecluster) rekonstruiert, die in einem Zeitstapel aufgenommener Bilder abgebildet werden [Lutz et al. (2011), ebd.], wobei die Intensität der Positionsunsicherheit des Ortes jedes Moleküls oder jeder Teilmenge von Molekülen entspricht. Einzigartig für diese Art von Datensatz ist die Fähigkeit, das Bild mit unterschiedlichen Lokalisierungsgenauigkeiten oder -auflösungen wiederzugeben. In einigen Fällen kann ein Bildgebungsmodul, das ein optisches Bildgebungsdesign mit interner Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF) umfasst, bei der Implementierung der Verwendung dieser superauflösenden Bildgebungstechniken vorteilhaft sein, da die zur Anregung der Fluoreszenz verwendete evaneszente Welle in der axialen Abmessung auf weniger als 200 nm von der Probenträger- oder Durchflusszellenoberfläche entfernt beschränkt ist und somit das Hintergrundfluoreszenzsignal unterdrückt. In einigen Fällen kann das Bildgebungssystem ein Objektiv mit höherer numerischer Apertur umfassen, als es in anderen hierin offenbarten Bildgebungsmoduldesigns verwendet wird. Die Verwendung von Objektiven mit höherer numerischer Apertur kann die Implementierung einer Anregung durch evaneszente Wellen und eine hocheffiziente Erfassung von Photonen von den fluoreszierenden Sonden erleichtern. In einigen Fällen kann die Weitfeldbildgebung unter Verwendung von einzelphotonensensitiven EM-CCD-Kameras oder anderen Arten von Bildsensoren die gleichzeitige Bildgebung vieler Moleküle oder Teilmengen von Molekülen (z. B. Nukleinsäuresequenzclustern) pro Frame ermöglichen, wodurch der Durchsatz der Bildaufnahme verbessert wird.
  • In einigen Fällen kann die Datenerfassungszeit, die erforderlich ist, um genügend Bilder für eine angemessene Merkmalsdefinition und -auflösung aufzunehmen, durch Verbesserungen der Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Bildgebungssystems durch die Verwendung der Reagenzien zur Sequenzierung durch Avidität und durch gering unspezifisch bindende Oberflächen, wie hierin offenbart, um das Signal zu erhöhen, während der Hintergrund verringert oder beseitigt wird, und die Verwendung verbesserter Bildrekonstruktionsalgorithmen verkürzt werden.
  • Beurteilung der Bildqualität: Für jede der hierin offenbarten Ausführungsformen der optischen Bildgebungsdesigns kann die Bildgebungsleistung oder Bildgebungsqualität unter Verwendung beliebiger von diversen Leistungsmetriken bewertet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Messungen der Modulationsübertragungsfunktion (MTF) bei einer oder mehreren spezifizierten Raumfrequenzen, Defokussierung, sphärische Aberration, chromatische Aberration, Koma, Astigmatismus, Feldkrümmung, Bildverzerrung, Kontrast-Rauch-Verhältnis (CNR) oder eine beliebige Kombination davon.
  • In einigen Fällen können die offenbarten optischen Designs für die doppelseitige Bildgebung (z. B. die offenbarten Objektivlinsendesigns, Tubuslinsendesigns, die Verwendung einer elektrooptischen Phasenplatte in Kombination mit einem Objektiv usw. allein oder in Kombination) signifikante Verbesserungen für die Bildqualität sowohl für die obere (nahe) als auch die untere (ferne) Innenoberfläche einer Durchflusszelle erzielen, so dass der Unterschied in einer Bildgebungsleistungsmetrik für die Bildgebung der oberen Innenoberfläche und der unteren Innenoberfläche der Durchflusszelle für beliebige der oben aufgeführten Bildgebungsleistungsmetriken weniger als 20 %, weniger als 15 %, weniger als 10 %, weniger als 5 %, weniger als 4 %, weniger als 3 %, weniger als 2 % oder weniger als 1 %, entweder einzeln oder in Kombination, beträgt.
  • In einigen Fällen können die offenbarten optischen Designs für die doppelseitige Bildgebung (z. B. umfassend die offenbarten Tubuslinsendesigns, die Verwendung einer elektrooptischen Phasenplatte in Kombination mit einem Objektiv usw.) signifikante Verbesserungen der Bildqualität erzielen, so dass eine Bildqualitätsleistungsmetrik für die doppelseitige Bildgebung eine mindestens 1 %ige, mindestens 2%ige, mindestens 3%ige, mindestens 4%ige, mindestens 5%ige, mindestens 10%ige, mindestens 15%ige, mindestens 20%ige, mindestens 25%ige oder mindestens 30%ige Verbesserung der Bildgebungsleistungsmetrik für die doppelseitige Bildgebung im Vergleich zu einem herkömmlichen System bereitstellt, umfassend z. B. eine Objektivlinse, einen bewegungsbetätigten Kompensator (der aus dem Strahlengang heraus oder in diesen hinein bewegt wird, wenn die nahen oder fernen Innenflächen einer Durchflusszelle abgebildet werden) und einen Bildsensor, für beliebige der oben aufgeführten Bildgebungsleistungsmetriken, entweder einzeln oder in Kombination. In einigen Fällen stellen Fluoreszenzbildgebungssysteme, die eines oder mehrere der offenbarten Tubuslinsendesigns umfassen, eine mindestens äquivalente oder stärkere Verbesserung einer Bildgebungsleistungsmetrik für die doppelseitige Bildgebung im Vergleich zu einem herkömmlichem System bereit, das eine Objektivlinse, einen bewegungsbetätigten Kompensator und einen Bildsensor umfasst. In einigen Fällen stellen Fluoreszenzbildgebungssysteme, die eines oder mehrere der offenbarten Tubuslinsendesigns umfassen, eine mindestens 5%ige, 10%ige, 15%ige, 20%ige, 25%ige, 30%ige, 35%ige, 40%ige, 45%ige oder 50%ige Verbesserung einer Bildgebungsleistungsmetrik für die doppelseitige Bildgebung im Vergleich zu einem herkömmlichem System bereit, das eine Objektivlinse, einen bewegungsbetätigten Kompensator und einen Bildsensor umfasst.
  • Technische Daten des Bildgebungsmoduls:
  • Anregungslichtwellenlänge/n: In jedem der offenbarten optischen Bildgebungsmoduldesigns können die eine oder mehreren Lichtquelle der offenbarten Bildgebungsmodule sichtbares Licht wie grünes Licht und/oder rotes Licht erzeugen. In einigen Fällen können die eine oder mehreren Lichtquellen allein oder in Kombination mit einer oder mehreren optischen Komponenten, z. B. optischen Anregungsfiltern und/oder dichroitischen Strahlteilern, Anregungslicht mit etwa 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 475 nm, 500 nm, 525 nm, 550 m, 575 nm, 600 nm, 625 nm, 650 nm, 675 nm, 700 nm, 725 nm, 750 nm, 775 nm, 800 nm, 825 nm, 850 nm, 875 nm oder 900 nm erzeugen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anregungswellenlänge einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 620 nm.
  • Anregungslichtbandbreiten: In jedem der offenbarten optischen
  • Bildgebungsmoduldesigns können die eine oder mehreren Lichtquellen allein oder in Kombination mit einer oder mehreren optischen Komponenten, z. B. optischen Anregungsfiltern und/oder dichroitischen Strahlteilern, Licht bei der spezifizierten Anregungswellenlänge innerhalb einer Bandbreite von ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm oder mehr erzeugen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anregungsbandbreiten einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen können, z. B. etwa ± 18 nm.
  • Ausgabe der Lichtquellenleistung: In jedem der offenbarten optischen Bildgebungsmoduldesigns kann die Ausgabe der einen oder mehreren Lichtquellen und/oder eines davon abgeleiteten Anregungslichtstrahls (einschließlich eines zusammengesetzten Anregungslichtstrahls) eine Leistung im Bereich von etwa 0,5 W bis etwa 5,0 W oder mehr aufweisen (wie weiter unten ausführlicher besprochen wird). In einigen Fällen kann die Ausgabe der Lichtquelle und/oder die Leistung eines davon abgeleiteten Anregungslichtstrahls mindestens 0,5 W, mindestens 0,6 W, mindestens 0,7 W, mindestens 0,8 W, mindestens 1 W, mindestens 1,1 W, mindestens 1,2 W, mindestens 1,3 W, mindestens 1,4 W, mindestens 1,5 W, mindestens 1,6 W, mindestens 1,8 W, mindestens 2,0 W, mindestens 2,2 W, mindestens 2,4 W, mindestens 2,6 W, mindestens 2,8 W, mindestens 3,0 W, mindestens 3,5 W, mindestens 4,0 W, mindestens 4,5 W oder mindestens 5,0 W betragen. In einigen Implementierungen darf die Ausgabe der Lichtquelle und/oder die Leistung eines davon abgeleiteten Anregungslichtstrahls (einschließlich eines zusammengesetzten Anregungslichtstrahls) höchstens 5,0 W, höchstens 4,5 W, höchstens 4,0 W, höchstens 3,5 W, höchstens 3,0 W, höchstens 2,8 W, höchstens 2,6 W, höchstens 2,4 W, höchstens 2,2 W, höchstens 2,0 W, höchstens 1,8 W, höchstens 1,6 W, höchstens 1,5 W, höchstens 1,4 W, höchstens 1,3 W, höchstens 1,2 W, höchstens 1,1 W, höchstens 1 W, höchstens 0,8 W, höchstens 0,7 W, höchstens 0,6 W oder höchstens 0,5 W betragen. Die in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Ausgabe der Lichtquelle und/oder die Leistung eines davon abgeleiteten Anregungslichtstrahls (einschließlich eines zusammengesetzten Anregungslichtstrahls) im Bereich von etwa 0,8 W bis etwa 2,4 W liegen. Fachleute erkennen, dass die Ausgabe der Lichtquelle und/oder die Leistung eines davon abgeleiteten Anregungslichtstrahls (einschließlich eines zusammengesetzten Anregungslichtstrahls) einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs, z. B. etwa 1,28 W, aufweisen kann.
  • Lichtquellenausgabeleistung und CNR: In einigen Implementierungen der offenbarten optischen Bildgebungsmoduldesigns sind die Ausgabeleistung der einen oder mehreren Lichtquellen und/oder die Leistung eines oder mehrerer davon abgeleiteter Anregungslichtstrahlen (einschließlich eines zusammengesetzten Anregungslichtstrahls) in Kombination mit einer geeigneten Probe ausreichend, um ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) in Bildern, die durch das Beleuchtungs- und Bildgebungsmodul aufgenommen werden, von mindestens 5, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 21, mindestens 22, mindestens 23, mindestens 24, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40 oder mindestens 50 oder mehr oder ein beliebiges CNR innerhalb eines Bereichs, der durch beliebige dieser Werte gebildet wird, bereitzustellen.
  • Fluoreszenzemissionsbänder: In einigen Fällen können die offenbarten optischen Fluoreszenzbildgebungsmodule konfiguriert sein, um die Fluoreszenzemission zu detektieren, die von beliebigen diverser Fluorophore erzeugt wird, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele für geeignete Fluoreszenzfarbstoffe zur Verwendung in z. B. Genotypisierungs- und Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen (z. B. durch Konjugation an Nukleotide, Oligonukleotide oder Proteine) sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluorescein, Rhodamin, Cumarin, Cyanin und Derivate davon, einschließlich der Cyaninderivate Cyaninfarbstoff-3 (Cy3), Cyaninfarbstoff-5 (Cy5), Cyaninfarbstoff-7 (Cy7) usw.
  • Fluoreszenzemissionswellenlängen: In jedem der offenbarten optischen Bildgebungsmoduldesigns kann der Detektionskanal oder Bildgebungskanal der offenbarten optischen Systeme eine oder mehrere optische Komponenten beinhalten, z. B. optische Emissionsfilter und/oder dichroitische Strahlteiler, die zum Sammeln von Emissionslicht mit etwa 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 475 nm, 500 nm, 525 nm, 550 m, 575 nm, 600 nm, 625 nm, 650 nm, 675 nm, 700 nm, 725 nm, 750 nm, 775 nm, 800 nm, 825 nm, 850 nm, 875 nm oder 900 nm konfiguriert sind. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anregungswellenlänge einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 825 nm.
  • Fluoreszenzemissionslichtbandbreiten: In jedem der offenbarten optischen Bildgebungsmoduldesigns kann der Detektionskanal oder Bildgebungskanal eine oder mehrere optische Komponenten umfassen, z. B. optische Emissionsfilter und/oder dichroitische Strahlteiler, die konfiguriert sind, um Licht bei der spezifizierten Emissionswellenlänge innerhalb einer Bandbreite von ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm oder mehr zu sammeln. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anregungsbandbreiten einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen können, z. B. etwa ± 18 nm.
  • Numerische Apertur: In einigen Fällen kann die numerische Apertur der Objektivlinse und/oder des optischen Bildgebungsmoduls (z. B. umfassend eine Objektivlinse und/oder eine Tubuslinse) in beliebigen der offenbarten Designs optischer Systeme im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1,4 liegen. In einigen Ausführungsformen kann die numerische Apertur mindestens 0,1, mindestens 0,2, mindestens 0,3, mindestens 0,4, mindestens 0,5, mindestens 0,6, mindestens 0,7, mindestens 0,8, mindestens 0,9, mindestens 1,0, mindestens 1,1, mindestens 1,2, mindestens 1,3 oder mindestens 1,4 betragen. In einigen Ausführungsformen kann die numerische Apertur höchstens 1,4, höchstens 1,3, höchstens 1,2, höchstens 1,1, höchstens 1,0, höchstens 0,9, höchstens 0,8, höchstens 0,7, höchstens 0,6, höchstens 0,5, höchstens 0,4, höchstens 0,3, höchstens 0,2 oder höchstens 0,1 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die numerische Apertur in einigen Fällen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,6 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die numerische Apertur einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 0,55 nm.
  • Optische Auflösung: In einigen Fällen kann der minimale auflösbare Trennabstand zwischen Flecken (oder Merkmalen) in der Probenebene, der durch ein beliebiges der offenbarten Designs optischer Systeme erreicht wird, in Abhängigkeit von der numerischen Apertur der Objektivlinse und/oder des optischen Systems (z. B. umfassend eine Objektivlinse und/oder eine Tubuslinse) im Bereich von etwa 0,5 µm bis etwa 2 µm liegen. In einigen Fällen kann der minimale auflösbare Fleckentrennabstand in der Probenebene mindestens 0,5 µm, mindestens 0,6 µm,mindestens 0,7 µm,mindestens 0,8 µm, mindestens 0,9 µm,mindestens 1,0 µm,mindestens 1,2 µm, mindestens 1,4 µm, mindestens 1,6 µm,mindestens 1,8 µm oder mindestens 1,0 µm betragen. In einigen Fällen kann der minimale auflösbare Fleckentrennabstand höchstens 2,0 µm,höchstens 1,8 µm,höchstens 1,6 µm,höchstens 1,4 µm,höchstens 1,2 µm, höchstens 1,0 µm,höchstens 0,9 µm,höchstens 0,8 µm,höchstens 0,7 µm,höchstens 0,6 µm oder höchstens 0,5 µm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen der minimale auflösbare Fleckentrennabstand im Bereich von etwa 0,8 bis etwa 1,6 µm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die der minimale auflösbare Fleckentrennabstand einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 0,95 µm.
  • Optische Auflösung der ersten und der zweiten Oberfläche in unterschiedlichen Tiefen: In einigen Fällen kann die Verwendung der hierin offenbarten neuartigen Objektivlinsen- und/oder Tubuslinsendesigns in einem der hierin offenbarten optischen Module oder Systeme eine vergleichbare optische Auflösung für die erste und die zweite Oberfläche (z. B. die obere und die untere Innenoberfläche einer Durchflusszelle) bereitstellen, wobei eine Neufokussierung zwischen der Aufnahme der Bilder der ersten und zweiten Oberfläche erforderlich ist oder auch nicht. In einigen Fällen kann die optische Auflösung der so erhaltenen Bilder der ersten und der weiten Oberfläche 20 %, 18 %, 16 %, 14 %, 12 %, 10 %, 8 %, 6 %, 4 %, 2 % oder 1 % voneinander betragen oder innerhalb eines beliebigen Wertes innerhalb dieses Bereichs liegen.
  • Vergrößerung: In einigen Fällen kann die Vergrößerung der Objektivlinse und/oder der Tubuslinse und/oder des optischen Systems (z. B. umfassend eine Objektivlinse und/oder eine Tubuslinse) in beliebigen der offenbarten optischen Konfigurationen im Bereich von etwa 2-fach bis etwa 20-fach liegen. In einigen Fällen kann die Vergrößerung des optischen Systems mindestens 2-fach, mindestens 3-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 6-fach, mindestens 7-fach, mindestens 8-fach, mindestens 9-fach, mindestens 10-fach, mindestens 15-fach oder mindestens 20-fach sein. In einigen Fällen kann die Vergrößerung des optischen Systems höchstens 20-fach, höchstens 15-fach, höchstens 10-fach, höchstens 9-fach, höchstens 8-fach, höchstens 7-fach, höchstens 6-fach, höchstens 5-fach, höchstens 4-fach, höchstens 3-fach oder höchstens 2-fach sein. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Vergrößerung des optischen Systems in einigen Fällen im Bereich von etwa 3-fach bis etwa 10-fach liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Vergrößerung des optischen Systems einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 7,5-fach.
  • Brennweite der Objektivlinse: In einigen Implementierungen der offenbarten optischen Designs kann die Brennweite der Objektivlinse im Bereich zwischen 20 mm und 40 mm liegen. In einigen Fällen kann die Brennweite der Objektivlinse mindestens 20 mm, mindestens 25 mm, mindestens 30 mm, mindestens 35 mm oder mindestens 40 mm betragen. In einigen Fällen kann die Brennweite der Objektivlinse höchstens 40 mm, höchstens 35 mm, höchstens 30 mm, höchstens 25 mm oder höchstens 20 mm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Brennweite der Objektivlinse im Bereich von 25 mm bis 35 mm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Brennweite der Objektivlinse einen beliebigen Wert innerhalb des oben spezifizierten Wertebereichs aufweisen kann, z. B. etwa 37 mm.
  • Arbeitsabstand der Objektivlinse: In einigen Implementierungen der offenbarten optischen Designs kann der Arbeitsabstand der Objektivlinse im Bereich zwischen etwa 100 µm und 30 mm liegen. In einigen Fällen kann der Arbeitsabstand mindestens 100 µm , mindestens 200 µm , mindestens 300 µm, mindestens 400 µm, mindestens 500 µm, mindestens 600 µm, mindestens 700 µm , mindestens 800 µm, mindestens 900 µm, mindestens 1 mm, mindestens 2 mm, mindestens 4 mm, mindestens 6 mm, mindestens 8 mm, mindestens 10 mm, mindestens 15 mm, mindestens 20 mm, mindestens 25 mm oder mindestens 30 mm betragen. In einigen Fällen kann der Arbeitsabstand höchstens 30 mm, höchstens 25 mm, höchstens 20 mm, höchstens 15 mm, höchstens 10 mm, höchstens 8 mm, höchstens 6 mm, höchstens 4 mm, höchstens 2 mm, höchstens 1 mm, höchstens 900 µm, höchstens 800 µm, höchstens 700 µm, höchstens 600 µm, höchstens 500 µm, höchstens 400 µm, höchstens 300 µm, höchstens 200 µm, höchstens 100 µm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen der Arbeitsabstand der Objektivlinse im Bereich von 500 µm bis 2 mm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass der Arbeitsabstand der Objektivlinse einen beliebigen Wert innerhalb des oben spezifizierten Wertebereichs aufweisen kann, z. B. etwa 1,25 mm.
  • Für die Bildgebung durch dicke Deckgläser optimierte Objektive: In einigen Fällen der offenbarten optischen Designs kann das Design der Objektivlinse für ein anderes Deckglasdicke von Durchflusszellen verbessert oder optimiert sein. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Objektivlinse für eine optimale optische Leistung für ein Deckglas mit einer Dicke von etwa 200 µm bis etwa 1000 µm ausgelegt sein. In einigen Fällen kann die Objektivlinse für eine optimale Leistung mit einem Deckglas ausgelegt sein, das mindestens 200 µm, mindestens 300 µm, mindestens 400 µm, mindestens 500 µm, mindestens 600 µm, mindestens 700 µm, mindestens 800 µm, mindestens 900 µm oder mindestens 1000 µm dick ist. In einigen Fällen kann die Objektivlinse für eine optimale Leistung mit einem Deckglas ausgelegt sein, das höchstens 1000 µm, höchstens 900 µm, höchstens 800 µm, höchstens 700 µm, höchstens 600 µm, höchstens 500 µm, höchstens 400 µm, höchstens 300 µm oder höchstens 200 µm dick ist. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Objektivlinse in einigen Fällen für eine optimale optische Leistung für ein Deckglas im Bereich von etwa 300 µm bis etwa 900 µm ausgelegt sein. Der Fachmann wird erkennen, dass die Objektivlinse für eine optimale optische Leistung für ein Deckglas ausgelegt sein kann, das einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 725 µm.
  • Schärfentiefe und Fokustiefe: In einigen Fällen können die Schärfentiefe und/oder Fokustiefe für jedes der offenbarten Bildgebungsmoduldesigns (z. B. umfassend eine Objektivlinse und/oder eine Tubuslinse) im Bereich von etwa 10 µm bis etwa 800 µm oder mehr liegen. In einigen Fällen können die Schärfentiefe und/oder Fokustiefe mindestens 10 µm, mindestens 20 µm, mindestens 30 µm, mindestens 40 µm, mindestens 50 µm, mindestens 75 µm, mindestens 100 µm, mindestens 125 µm, mindestens 150 µm, mindestens 175 µm, mindestens 200 µm, mindestens 250 µm , mindestens 300 µm, mindestens 300 µm, mindestens 400 µm, mindestens 500 µm, mindestens 600 µm,mindestens 700 µm oder mindestens 800 µm oder mehr betragen. In einigen Fällen betragen die Schärfentiefe und/oder Fokustiefe höchstens 800 µm, höchstens 700 µm,höchstens 600 µm , höchstens 500 µm,höchstens 400 µm, höchstens 300 µm,höchstens 250 um. höchstens 200 µm,höchstens 175 µm , höchstens 150 µm,höchstens 125 µm,höchstens 100 µm, höchstens 75 µm,höchstens 50 µm,höchstens 40 µm, höchstens 30 µm, höchstens 20 µm,höchstens 10 µm oder weniger. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise können die Schärfentiefe und/oder die Fokustiefe in einigen Fällen im Bereich von etwa 100 µm bis etwa 175 µm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Schärfentiefe und/oder die Fokustiefe einen beliebigen Wert innerhalb des oben spezifizierten Wertebereichs aufweisen können, z. B. etwa 132 µm.
  • Sichtfeld (FOV): In einigen Implementierungen kann das FOV beliebiger der offenbarten Bildgebungsmoduldesigns (z. B. das, das durch eine Kombination aus Objektivlinsen- und Detektionskanaloptik (wie einer Tubuslinse) bereitgestellt wird) beispielsweise im Bereich zwischen etwa 1 mm und 5 mm (z. B. im Durchmesser, in der Breite, in der Länge oder in der längsten Abmessung) liegen. In einigen Fällen kann das FOV mindestens 1,0 mm, mindestens 1,5 mm, mindestens 2,0 mm, mindestens 2,5 mm, mindestens 3,0 mm, mindestens 3,5 mm, mindestens 4,0 mm, mindestens 4,5 mm oder mindestens 5,0 mm (z. B. im Durchmesser, in der Breite, in der Länge oder in der längsten Abmessung) betragen. In einigen Fällen kann das FOV höchstens 5,0 mm, höchstens 4,5 mm, höchstens 4,0 mm, höchstens 3,5 mm, höchstens 3,0 mm, höchstens 2,5 mm, höchstens 2,0 mm, höchstens 1,5 mm oder höchstens 1,0 mm (z. B. im Durchmesser, in der Breite, in der Länge oder in der längsten Abmessung) betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann das FOV in einigen Fällen im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 3,5 mm (im Durchmesser, in der Breite, in der Länge oder in der längsten Abmessung) liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass das FOV einen beliebigen Wert innerhalb des oben spezifizierten Wertebereichs aufweisen kann, z. B. etwa 3,2 mm (z. B. im Durchmesser, in der Breite, in der Länge oder in der längsten Abmessung).
  • Fläche des Sichtfelds (FOV): In einigen Fällen der offenbarten Designs optischer Systeme kann die Fläche des Sichtfelds im Bereich von etwa 2 mm2 bis etwa 5 mm2 liegen. In einigen Fällen kann das Sichtfeld eine Fläche von mindestens 2 mm2, mindestens 3 mm2, mindestens 4 mm2 oder mindestens 5 mm2 haben. In einigen Fällen kann das Sichtfeld eine Fläche von höchstens 5 mm2, höchstens 4 mm2, höchstens 3 mm2 oder höchstens 2 mm2 haben. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann das Sichtfeld in einigen Fällen eine Fläche im Bereich von etwa 3 mm2 bis etwa 4 mm2 haben. Der Fachmann wird erkennen, dass die Fläche des Sichtfelds einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. 2,75 mm2.
  • Optimierung der MTF von Objektivlinsen und/oder Tubuslinsen: In einigen Fällen ist das Design der Objektivlinse und/oder mindestens einer Tubuslinse in den offenbarten Bildgebungsmodulen und -systemen konfiguriert, um die Modulationsübertragungsfunktion im mittleren bis hohen Raumfrequenzbereich zu optimieren. Beispielsweise ist in einigen Fällen das Design der Objektivlinse und/oder mindestens einer Tubuslinse in den offenbarten Bildgebungsmodulen und -systemen konfiguriert, um die Modulationsübertragungsfunktion im Raumfrequenzbereich von 500 Zyklen pro mm bis 900 Zyklen pro mm, von 700 Zyklen pro mm bis 1100 Zyklen pro mm, von 800 Zyklen pro mm bis 1200 Zyklen pro mm oder von 600 Zyklen pro mm bis 1000 Zyklen pro mm in der Probenebene zu optimieren.
  • Optische Aberration und beugungsbegrenzte Bildgebungsleistung: In einigen Implementierungen eines der hierin offenbarten optischen Bildgebungsmoduldesigns kann die Objektivlinse und/oder Tubuslinse konfiguriert sein, um dem Bildgebungsmodul ein Sichtfeld bereitzustellen, wie oben angegeben, so dass das FOV weniger als 0,15 Aberrationswellen über mindestens 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 95 % des Feldes aufweist. In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse und/oder Tubuslinse konfiguriert sein, um dem Bildgebungsmodul ein Sichtfeld bereitzustellen, wie oben angegeben, so dass das FOV weniger als 0,1 Aberrationswellen über mindestens 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 95 % des Feldes aufweist. In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse und/oder Tubuslinse konfiguriert sein, um dem Bildgebungsmodul ein Sichtfeld bereitzustellen, wie oben angegeben, so dass das FOV weniger als 0,075 Aberrationswellen über mindestens 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 95 % des Feldes aufweist. In einigen Implementierungen kann die Objektivlinse und/oder Tubuslinse konfiguriert sein, um dem Bildgebungsmodul ein Sichtfeld bereitzustellen, wie oben angegeben, so dass das FOV über mindestens 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 95 % des Feldes beugungsbegrenzt ist.
  • Einfallswinkel von Lichtstrahlen auf dichroitische Reflektoren, Strahlteiler und Strahlkombinierer: In einigen Fällen der offenbarten optischen Designs können die Einfallswinkel für einen auf einen dichroitischen Reflektor, Strahlteiler oder Strahlkombinierer einfallenden Lichtstrahl im Bereich zwischen etwa 20 Grad und etwa 45 Grad liegen. In einigen Fällen können die Einfallswinkel mindestens 20 Grad, mindestens 25 Grad, mindestens 30 Grad, mindestens 35 Grad, mindestens 40 Grad oder mindestens 45 Grad betragen. In einigen Fällen können die Einfallswinkel höchstens 45 Grad, höchstens 40 Grad, höchstens 35 Grad, höchstens 30 Grad, höchstens 25 Grad oder höchstens 20 Grad betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise können die Einfallswinkel in einigen Fällen im Bereich von etwa 25 Grad bis etwa 40 Grad liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Einfallswinkel einen beliebigen Wert innerhalb des oben spezifizierten Wertebereichs aufweisen können, z. B. etwa 43 Grad.
  • Größe des Bildsensors (der Photodetektoranordnung): In einigen Fällen können die offenbarten optischen Systeme einen oder mehrere Bildsensoren mit einer Aktivfläche mit einer Diagonale im Bereich von etwa 10 mm bis etwa 30 mm oder mehr aufweisen. In einigen Fällen können die Bildsensoren eine Aktivfläche mit einer Diagonale von mindestens 10 mm, mindestens 12 mm, mindestens 14 mm, mindestens 16 mm, mindestens 18 mm, mindestens 20 mm, mindestens 22 mm, mindestens 24 mm, mindestens 26 mm, mindestens 28 mm oder mindestens 30 mm aufweisen. In einigen Fällen können die Bildsensoren eine Aktivfläche mit einer Diagonale von höchstens 30 mm, höchstens 28 mm, höchstens 26 mm, höchstens 24 mm, höchstens 22 mm, höchstens 20 mm, höchstens 18 mm, höchstens 16 mm, höchstens 14 mm, höchstens 12 mm oder höchstens 10 mm aufweisen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise können in einigen Fällen die Bildsensoren eine Aktivfläche mit einer Diagonale im Bereich von etwa 12 mm bis etwa 24 mm aufweisen. Der Fachmann wird erkennen, dass der eine oder die mehreren Bildsensoren eine Aktivfläche mit einer Diagonale aufweisen können, die einen beliebigen Wert innerhalb des oben spezifizierten Wertebereichs liegt, z. B. etwa 28,5 mm.
  • Pixelgröße und -abstand des Bildsensors: In einigen Fällen können die Pixelgröße und/oder der Pixelabstand, die für die in den offenbarten optischen Systemdesigns verwendeten Bildsensoren ausgewählt wurden, in mindestens einer Abmessung im Bereich von etwa 1 µm bis etwa 10 µm liegen. In einigen Fällen können die Pixelgröße und/oder der Abstand mindestens 1 µm , mindestens 2 µm , mindestens 3 µm , mindestens 4 µm , mindestens 5 µm, mindestens 6 µm , mindestens 7 µm , mindestens 8 µm , mindestens 9 µm oder mindestens 10 µm betragen. In einigen Fällen können die Pixelgröße und/oder der Abstand höchstens 10 µm, höchstens 9 µm, höchstens 8 µm, höchstens 7 µm, höchstens 6 µm , höchstens 5 µm , höchstens 4 µm, höchstens 3 µm, höchstens 2 µm oder höchstens 1 µm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise können die Pixelgröße und/oder der Pixelabstand in einigen Fällen im Bereich von etwa 3 µm bis etwa 9 µm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Pixelgröße und/oder der Pixelabstand einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen können, beispielsweise etwa 1,4 µm .
  • Überabtastung: In einigen Fällen der offenbarten optischen Designs wird ein räumliches Überabtastungsschema verwendet, bei dem die Raumabtastfrequenz mindestens das 2-Fache, 2,5-Fache, 3-Fache, 3,5-Fache, 4-Fache, 4,5-Fache, 5-Fache, 6-Fache, 7-Fache, 8-Fache, 9-Fache oder 10-Fache der optischen Auflösung X (Ip/mm) beträgt.
  • Maximale Geschwindigkeit der Translationsstufe: In einigen Fällen der offenbarten optischen Bildgebungsmodule kann die maximale Geschwindigkeit der Translationsstufe auf einer beliebigen Achse im Bereich von etwa 1 mm/s bis etwa 5 mm/s liegen. In einigen Fällen kann die maximale Geschwindigkeit der Translationsstufe mindestens 1 mm/s, mindestens 2 mm/s, mindestens 3 mm/s, mindestens 4 mm/s oder mindestens 5 mm/s betragen. In einigen Fällen kann die maximale Geschwindigkeit der Translationsstufe höchstens 5 mm/s, höchstens 4 mm/s, höchstens 3 mm/s, höchstens 2 mm/s oder höchstens 1 mm/s betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die maximale Geschwindigkeit der Translationsstufe im Bereich von etwa 2 mm/s bis etwa 4 mm/s liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die maximale Geschwindigkeit der Translationsstufe einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 2,6 mm/s.
  • Maximale Beschleunigung der Translationsstufe: In einigen Fällen der offenbarten optischen Bildgebungsmodule kann die maximale Beschleunigung auf einer beliebigen Bewegungsachse im Bereich von etwa 2 mm/s2 bis etwa 10 mm/s2 liegen. In einigen Fällen kann die maximale Beschleunigung mindestens 2 mm/s2, mindestens 3 mm/s2, mindestens 4 mm/s2, mindestens 5 mm/s2, mindestens 6 mm/s2, mindestens 7 mm/s2, mindestens 8 mm/s2, mindestens 9 mm/s2 oder mindestens 10 mm/s2 betragen. In einigen Fällen kann die maximale Beschleunigung höchstens 10 mm/s2, höchstens 9 mm/s2, höchstens 8 mm/s2, höchstens 7 mm/s2, höchstens 6 mm/s2, höchstens 5 mm/s2, höchstens 4 mm/s2, höchstens 3 mm/s2 oder höchstens 2 mm/s2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die maximale Beschleunigung in einigen Fällen im Bereich von etwa 2 mm/s2 bis etwa 8 mm/s2 aufweisen. Der Fachmann wird erkennen, dass die maximale Beschleunigung einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, beispielsweise etwa 3,7 mm/s2.
  • Wiederholbarkeit der Positionierung der Translationsstufe: In einigen Fällen der offenbarten optischen Bildgebungsmodule kann die Wiederholbarkeit der Positionierung für eine beliebige Achse im Bereich von etwa 0,1 µm bis etwa 2 µm liegen. In einigen Fällen kann die Wiederholbarkeit der Positionierung mindestens 0,1 µm, mindestens 0,2 µm , mindestens 0,3 µm, mindestens 0,4 µm, mindestens 0,5 µm, mindestens 0,6 µm, mindestens 0,7 µm, mindestens 0,8 µm, mindestens 0,9 µm, mindestens 1,0 µm, mindestens 1,2 µm , mindestens 1,4 µm , mindestens 1,6 µm, mindestens 1,8 µm oder mindestens 2,0 µm betragen. In einigen Fällen kann die Wiederholbarkeit der Positionierung höchstens 2,0 µm, höchstens 1,8 µm , höchstens 1,6 µm, höchstens 1,4 µm, höchstens 1,2 µm, höchstens 1,0 µm, höchstens 0,9 µm, höchstens 0,8 µm, höchstens 0,7 µm, höchstens 0,6 µm, höchstens 0,5 µm , höchstens 0,4 µm , höchstens 0,3 µm , höchstens 0,2 µm oder höchstens 0,1 µm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Wiederholbarkeit der Positionierung im Bereich von etwa 0,3 bis etwa 1,2 µm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Wiederholbarkeit der Positionierung einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, beispielsweise etwa 0,47 µm.
  • FOV-Neupositionierungszeit: In einigen Fällen der offenbarten optischen Bildgebungsmodule kann die maximale Zeit, die erforderlich ist, um die Probenebene (das Sichtfeld) relativ zur Optik oder umgekehrt neu zu positionieren, im Bereich von etwa 0,1 s bis etwa 0,5 s liegen. In einigen Fällen kann die maximale Neupositionierungszeit (d. h. der Abtaststufenschritt und die Einschwingzeit) mindestens 0,1 s, mindestens 0,2 s, mindestens 0,3 s, mindestens 0,4 s oder mindestens 0,5 s betragen. In einigen Fällen kann die maximale Neupositionierungszeit höchstens 0,5 s, höchstens 0,4 s, höchstens 0,3 s, höchstens 0,2 s oder höchstens 0,1 s betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die maximale Neupositionierungszeit im Bereich von etwa 0,2 s bis etwa 0,4 s liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die maximale Neupositionierungszeit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 0,45 s.
  • Fehlerschwelle für die Autofokuskorrektur: In einigen Fällen der offenbarten optischen Bildgebungsmodule kann die spezifizierte Fehlerschwelle zum Auslösen einer Autofokuskorrektur im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 200 nm liegen. In einigen Fällen kann die Fehlerschwelle mindestens 50 nm, mindestens 75 nm, mindestens 100 nm, mindestens 125 nm, mindestens 150 nm, mindestens 175 nm oder mindestens 200 nm betragen. In einigen Fällen kann die Fehlerschwelle höchstens 200 nm, höchstens 175 nm, höchstens 150 nm, höchstens 125 nm, höchstens 100 nm, höchstens 75 nm oder höchstens 50 nm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Fehlerschwelle in einigen Fällen im Bereich von etwa 75 nm bis etwa 150 nm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Fehlerschwelle einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 105 nm.
  • Bildaufnahmezeit: In einigen Fällen der offenbarten optischen Bildgebungsmodule kann die Bildaufnahmezeit im Bereich von etwa 0,001 s bis etwa 1 s liegen. In einigen Fällen kann die Bildaufnahmezeit mindestens 0,001 s, mindestens 0,01 s, mindestens 0,1 s oder mindestens 1 s betragen. In einigen Fällen kann die Bildaufnahmezeit höchstens 1 s, höchstens 0,1 s, höchstens 0,01 s oder höchstens 0,001 s betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Bildaufnahmezeit im Bereich von etwa 0,01 s bis etwa 0,1 s liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Bildaufnahmezeit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 0,250 s.
  • Bildgebungszeit pro Sichtfeld: In einigen Fällen können die Bildgebungszeiten zwischen etwa 0,5 Sekunden und etwa 3 Sekunden pro Sichtfeld liegen. In einigen Fällen kann die Bildgebungszeit mindestens 0,5 Sekunden, mindestens 1 Sekunde, mindestens 1,5 Sekunden, mindestens 2 Sekunden, mindestens 2,5 Sekunden oder mindestens 3 Sekunden pro Sichtfeld betragen. In einigen Fällen kann die Bildgebungszeit höchstens 3 Sekunden, höchstens 2,5 Sekunden, höchstens 2 Sekunden, höchstens 1,5 Sekunden, höchstens 1 Sekunde oder höchstens 0,5 Sekunden pro Sichtfeld betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Bildgebungszeit in einigen Fällen im Bereich von etwa 1 Sekunde bis etwa 2,5 Sekunden liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Bildgebungszeit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, beispielsweise etwa 1,85 Sekunden.
  • Ebenheit des Feldes: In einigen Fällen werden Bilder über 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % oder 100 % des Sichtfelds innerhalb von ± 200 nm, ± 175 nm, ± 150 nm, ± 125 nm, ± 100 nm, ± 75 nm oder ± 50 nm relativ zur besten Brennebene für jeden Fluoreszenzdetektionskanal (oder anderen Bildgebungsmodusdetektionskanal) aufgenommen.
  • Systeme und Systemkomponenten für Genomik- und andere Anwendungen: Wie oben erwähnt, können in einigen Implementierungen die offenbarten optischen Bildgebungsmodule als Module, Komponenten, Teilbaugruppen oder Teilsysteme größerer Systeme fungieren, die für die Durchführung von z. B. Genomikanwendungen (z. B. Anwendungen für genetische Testung und/oder Nukleinsäuresequenzierung) oder andere chemische Analyse-, biochemische Analyse-, Nukleinsäureanalyse-, Zellanalyse- oder Gewebeanalysenanwendungen konfiguriert sind. 39 stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für ein Blockdiagram für z. B. ein Sequenzierungssystem bereit, wie hierin offenbart. Zusätzlich zu einem, zwei, drei, vier oder mehr als vier Bildgebungsmodulen, wie hierin offenbart (von denen jedes einen oder mehrere Beleuchtungsstrahlengänge und/oder einen oder mehrere optische Detektionsstrahlengänge umfassen kann (z. B. einen oder mehrere Detektionskanäle, die zur Bildgebung der Fluoreszenzemission innerhalb eines spezifizierten Wellenlängenbereichs auf einen Bildsensor konfiguriert sind)) können solche Systeme eine oder mehrere X-Y-Translationsstufen, eine oder mehrere X-Y-Z-Translationsstufen, Durchflusszellen oder -patronen, Fluidiksysteme und Fluiddurchflusssteuermodule, Reagenzienpatronen, Temperatursteuermodule, Robotik für die Fluidabgabe, Robotik für die Patronen- und/oder Mikroplattenhandhabung (Pick-and-Place-Robotik), lichtdichte Gehäuse und/oder Umgebungskontrollkammern, einen oder mehrere Prozessoren oder Computer, Datenspeichermodule, Datenkommunikationsmodule (z. B. Bluetooth-, WiFi-, Intranet- oder Internetkommunikationshardware und zugehörige Software), Anzeigemodule, ein oder mehrere lokale und/oder cloudbasierte Softwarepakete (z. B. Instrumenten-/Systemsteuersoftwarepakete, Bildverarbeitungssoftwarepakete, Datenanalysesoftwarepakete usw. oder eine beliebige Kombination davon umfassen.
  • Translationsstufen: In einigen Implementierungen der hierin offenbarten Bildgebungs- und Analysesysteme (z. B. Nukleinsäuresequenzierungssysteme) kann das System eine oder mehrere (z. B. eine, zwei, drei, vier oder mehr als vier) hochpräzise X-Y-Translationsstufen (oder in einigen Fällen X-Y-Z) zum Neupositionieren einer oder mehrerer Probenträgerstrukturen (z. B. Durchflusszellen) in Bezug auf das eine oder die mehreren Bildgebungsmodule umfassen, z. B. um ein oder mehrere Bilder zu kacheln, die jeweils einem Sichtfeld des Bildgebungsmoduls entsprechen, um ein oder mehrere zusammengesetzte Bilder einer gesamten Durchflusszellenoberfläche zu rekonstruieren. In einigen Implementierungen der hierin offenbarten Bildgebungssysteme und Genominikanalysesysteme (z. B. Nukleinsäuresequenzierungssysteme) kann das System eine oder mehrere (z. B. eine, zwei, drei, vier oder mehr als vier) hochpräzise X-Y-Translationsstufen (oder in einigen Fällen X-Y-Z) zum Neupositionieren des einen oder der mehreren Bildgebungsmodule in Bezug auf eine oder mehrere Probenträgerstrukturen (z. B. Durchflusszellen) umfassen, z. B. um ein oder mehrere Bilder zu kacheln, die jeweils einem Sichtfeld des Bildgebungsmoduls entsprechen, um ein oder mehrere zusammengesetzte Bilder einer gesamten Durchflusszellenoberfläche zu rekonstruieren.
  • Geeignete Translationsstufen sind bei einer Mehrzahl von Anbietern im Handel erhältlich, beispielsweise bei Parker Hannifin. Präzisionstranslationsstufensysteme umfassen typischerweise eine Kombination mehrerer Komponenten, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Linearaktuatoren, optische Codierer, Servo- und/oder Schrittmotoren und Motorsteuerungen oder Antriebseinheiten. Für die hierin offenbarten Systeme und Verfahren ist eine hohe Präzision und Wiederholbarkeit der Stufenbewegung erforderlich, um eine genaue und reproduzierbare Positionierung und Bildgebung von beispielsweise Fluoreszenzsignalen zu gewährleisten, wenn wiederholte Schritte der Reagenzienabgabe und der optischen Detektion dazwischen ausgeführt werden.
  • Folglich können die hierin offenbarten Systeme das Spezifizieren der Präzision umfassen, mit der die Translationsstufe konfiguriert wird, um eine Probenträgerstruktur in Bezug auf die Beleuchtungs- und/oder Bildgebungsoptik zu positionieren (oder umgekehrt). In einem Aspekt der vorliegenden Offenbarung liegt die Präzision der einen oder mehreren Translationsstufen zwischen etwa 0,1 µm und etwa 10 µm. In anderen Aspekten beträgt die Präzision der Translationsstufe etwa 10 µm oder weniger, etwa 9 µm oder weniger, etwa 8 µm oder weniger, etwa 7 µm oder weniger, etwa 6 µm oder weniger, etwa 5 µm oder weniger, etwa 4 µm oder weniger, etwa 3 µm oder weniger, etwa 2 µm oder weniger, etwa 1 µm oder weniger, etwa 0,9 µm oder weniger, etwa 0,8 µm oder weniger, etwa 0,7 µm oder weniger, etwa 0,6 µm oder weniger, etwa 0,5 µm oder weniger, etwa 0,4 µm oder weniger, etwa 0,3 µm oder weniger, etwa 0,2 µm oder weniger oder etwa 0,1 µm oder weniger. Der Fachmann wird erkennen, dass in einigen Fällen die Positionierungspräzision der Translationsstufe in einen Bereich fallen kann, der durch beliebige zwei dieser Werte begrenzt ist (z. B. von etwa 0,5 µm bis etwa 1,5 µm). In einigen Fällen kann die Positionierungspräzision der Übersetzungsstufe einen beliebigen Wert innerhalb des in diesem Absatz beinhalteten Wertebereichs aufweisen, z. B. etwa 0,12 µm.
  • Durchflusszellen, mikrofluidische Vorrichtungen und Patronen: Die hierin offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und Durchflusszellenpatronen können als Komponenten von Systemen verwendet werden, die für eine Vielzahl von chemischen Analyse-, biochemischen Analyse-, Nukleinsäureanalyse-, Zellanalyse- oder Gewebeanalyseanwendungen ausgelegt sind. Im Allgemeinen können solche Systeme eine oder mehrere der offenbarten Einzelkapillardurchflusszellenvorrichtungen, Mehrfachkapillardurchflusszellenvorrichtungen, Kapillardurchflusszellenpatronen und/oder mikrofluidische Vorrichtungen und Patronen umfassen, die hierin beschrieben sind. Die offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und - patronen sind in der PCT-Patentanmeldungsveröffentlichung WO 2020/118255 , die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit berücksichtigt ist, näher beschrieben.
  • Die hierin offenbarten Systeme können 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr als 10 Einzelkapillardurchflusszellenvorrichtungen, Mehrfachkapillardurchflusszellenvorrichtungen, Kapillardurchflusszellenpatronen und/oder mikrofluidische Vorrichtungen und Patronen umfassen. In einigen Fällen können die Einzelkapillardurchflusszellenvorrichtungen, die Mehrfachkapillardurchflusszellenvorrichtungen und/oder die mikrofluidischen Vorrichtungen und Patronen feste Komponenten der offenbarten Systeme sein. In einigen Fällen können die Einzelkapillardurchflusszellenvorrichtungen, die Mehrfachkapillardurchflusszellenvorrichtungen und/oder die mikrofluidischen Vorrichtungen und Patronen entfernbare, austauschbare Komponenten der offenbarten Systeme sein. In einigen Fällen können die Einzelkapillardurchflusszellenvorrichtungen, die Mehrfachkapillardurchflusszellenvorrichtungen und/oder die mikrofluidischen Vorrichtungen und Patronen Einweg- oder Verbrauchskomponenten der offenbarten Systeme sein.
  • In einigen Implementierungen umfassen die offenbarten Einzelkapillardurchflusszellenvorrichtungen (oder Einzelkapillardurchflusszellenpatronen) eine einzelne Kapillare, z. B. eine Glas- oder Quarzglaskapillare, deren Lumen einen Fluidströmungsgang bildet, durch den Reagenzien oder Lösungen fließen können, und deren Innenoberfläche eine Probenträgerstruktur bilden kann, an die jeweilige Proben gebunden oder angebunden sind. In einigen Implementierungen können die hierin offenbarten Mehrkapillar-Kapillardurchflusszellenvorrichtungen (oder Mehrkapillardurchflusszellenpatronen) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr als 20 Kapillaren umfassen, die zur Durchführung einer Analysetechnik konfiguriert sind, die ferner die Bildgebung als Detektionsverfahren umfasst.
  • In einigen Fällen können eine oder mehrere Kapillaren in einem Gehäuse verpackt sein, um eine Patrone zu bilden, die die einfache Handhabung erleichtert, Adapter oder Verbinder zum Herstellen externer Fluidverbindungen enthält und gegebenenfalls zusätzliche integrierte Funktionen wie Reagenzienbehälter, Abfallbehälter, Ventile (z. B. Mikroventile), Pumpen (z. B. Mikropumpen) usw. oder eine beliebige Kombination davon beinhaltet.
  • 29 stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für eine Einzelglaskapillardurchflusszellenvorrichtung dar, die zwei Fluidadapter umfasst - wobei jeweils einer an jedem Ende des Glaskapillarstücks angebracht ist -, die zur Verbindung mit einer Standard-OD-Fluidverrohrung ausgelegt sind, um praktische, auswechselbare Fluidverbindungen mit einem externen Fluiddurchflusssteuersystem bereitzustellen. Die Fluidadapter können an der Kapillare unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken angebracht werden, die dem Fachmann bekannt sind, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Presspassung, Klebeverbinden, Lösungsmittelbinden, Laserschweißen usw. oder eine beliebige Kombination davon.
  • Im Allgemeinen weisen die in den offenbarten Kapillardurchflusszellenvorrichtungen und Kapillardurchfluszellenpartronen verwendeten Kapillaren mindestens einen internen, axial ausgerichteten Fluiddurchflusskanal (oder „Lumen“) auf, der über die gesamte Länge der Kapillare verläuft. In einigen Aspekten kann die Kapillare zwei, drei, vier, fünf oder mehr als fünf interne, axial ausgerichtete Fluiddurchflusskanäle (oder „Lumen“) aufweisen.
  • Eine Anzahl spezifizierter Querschnittsgeometrien für geeignete Kapillaren (oder das Lumen davon) stimmt mit der Offenbarung hierin überein, unter anderem, aber nicht beschränkt auf kreisförmige, elliptische, quadratische, rechteckige, dreieckige, abgerundete quadratische, abgerundete rechteckige oder abgerundete dreieckige Querschnittsgeometrien. In einigen Fällen kann die Kapillare (oder ein Lumen davon) eine spezifizierte Querschnittsabmessung oder einen Satz von Abmessungen aufweisen. Beispielsweise kann in einigen Fällen die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens (z. B. der Durchmesser, wenn das Lumen kreisförmig ist, oder die Diagonale, wenn das Lumen quadratisch oder rechteckig ist) im Bereich von etwa 10 µm bis etwa 10 mm liegen. In einigen Aspekten kann die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens mindestens 10 µm, mindestens 25 µm, mindestens 50 µm, mindestens 75 µm, mindestens 100 µm, mindestens 200 µm, mindestens 300 µm, mindestens 400 µm, mindestens 500 µm, mindestens 600 µm , mindestens 700 µm, mindestens 800 µm, mindestens 900 µm, mindestens 1 mm, mindestens 2 mm, mindestens 3 mm, mindestens 4 mm mindestens 5 mm, mindestens 6 mm, mindestens 7 mm, mindestens 8 mm, mindestens 9 mm oder mindestens 10 mm betragen. In einigen Aspekten kann die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens höchstens 10 mm, höchstens 9 mm, höchstens 8 mm, höchstens 7 mm, höchstens 6 mm, höchstens 5 mm, höchstens 4 mm, höchstens 3 mm, höchstens 2 mm, höchstens 1 mm, höchstens 900 µm, höchstens 800 µm, höchstens 700 µm, höchstens 600 µm, höchstens 500 µm, höchstens 400 µm, höchstens 300 µm, höchstens 200 µm, höchstens 100 µm, höchstens 75 µm, höchstens 50 µm, höchstens 25 µm oder höchstens 10 µm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens im Bereich von etwa 100 µm bis etwa 500 µm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 124 µm.
  • In einigen Fällen, z. B. wobei das Lumen der einen oder mehreren Kapillaren in einer Durchflusszellenvorrichtung oder -patrone einen quadratischen oder rechteckigen Querschnitt aufweist, kann der Abstand zwischen einer ersten Innenoberfläche (z. B. einer obersten oder oberen Oberfläche) und einer zweiten Innenoberfläche (z. B. einer untersten oder unteren Oberfläche), die die Spalthöhe oder -dicke eines Fluiddurchflusskanals definiert, im Bereich von etwa 10 µm bis etwa 500 µm liegen. In einigen Fällen kann die Spalthöhe mindestens 10 µm, mindestens 20 µm, mindestens 30 µm, mindestens 40 µm, mindestens 50 µm, mindestens 60 µm, mindestens 70 µm, mindestens 80 µm, mindestens 90 µm, mindestens 100 µm, mindestens 125 µm, mindestens 150 µm, mindestens 175 µm, mindestens 200 µm, mindestens 225 µm, mindestens 250 µm, mindestens 275 µm, mindestens 300 µm, mindestens 325 µm, mindestens 350 µm, mindestens 375 µm, mindestens 400 µm, mindestens 425 µm, mindestens 450 µm, mindestens 475 µm oder mindestens 500 µm betragen. In einigen Fällen kann die Spalthöhe höchstens 500 µm, höchstens 475 µm, höchstens 450 µm, höchstens 425 µm, höchstens 400 µm, höchstens 375 µm, höchstens 350 µm, höchstens 325 µm , höchstens 300 µm, höchstens 275 µm, höchstens 250 µm, höchstens 225 µm, höchstens 200 µm, höchstens 175 µm, höchstens 150 µm, höchstens 125 µm, höchstens 100 µm, höchstens 90 µm, höchstens 80 µm, höchstens 70 µm, höchstens 60 µm, höchstens 50 µm, höchstens 40 µm, höchstens 30 µm , höchstens 20 µm oder höchstens 10 µm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Spalthöhe in einigen Fällen im Bereich von etwa 40 µm bis etwa 125 µm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Spalthöhe einen beliebigen Wert innerhalb des Wertebereichs in diesem Absatz aufweisen kann, z. B. etwa 122 µm.
  • Die Länge der einen oder mehreren Kapillaren, die zur Herstellung der offenbarten Kapillardurchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen verwendet werden, kann in einigen Fällen im Bereich von etwa 5 mm bis etwa 5 cm oder mehr liegen. In einigen Fällen kann die Länge der einen oder mehreren Kapillaren weniger als 5 mm, mindestens 5 mm, mindestens 1 cm, mindestens 1,5 cm, mindestens 2 cm, mindestens 2,5 cm, mindestens 3 cm, mindestens 3,5 cm, mindestens 4 cm, mindestens 4,5 cm oder mindestens 5 cm betragen. In einigen Fällen kann die Länge der einen oder mehreren Kapillaren höchstens 5 cm, höchstens 4,5 cm, höchstens 4 cm, höchstens 3,5 cm, höchstens 3 cm, höchstens 2,5 cm, höchstens 2 cm, höchstens 1,5 cm, höchstens 1 cm oder höchstens 5 mm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Länge der einen oder mehreren Kapillaren im Bereich von etwa 1,5 cm bis etwa 2,5 cm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Länge der einen oder mehreren Kapillaren einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 1,85 cm. In manchen Fällen können die Vorrichtungen oder Patronen eine Mehrzahl von zwei oder mehr Kapillaren mit gleicher Länge umfassen. In einigen Fällen können Vorrichtungen oder Patronen eine Mehrzahl von zwei oder mehr Kapillaren unterschiedlicher Länge umfassen.
  • Die Kapillaren, die zum Aufbau der offenbarten Kapillarflusszellenvorrichtungen oder Kapillardurchflusszellenpatronen verwendet werden, können beliebigen diverser Materialien hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Glas (z. B. Borosilikatglas, Kalknatronglas usw.), Quarzglas (Quarz), Polymer (z. B. Polystyrol (PS), makroporöses Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen mit hoher Dichte (HDPE), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COC), Polyethylenterephthalat (PET), Polydimethylsiloxan (PDMS) usw.), Polyetherimid (PEI) und Perfluorelastomer (FFKM) als chemisch inertere Alternativen oder eine beliebige Kombination davon. PEI liegt in Bezug auf Kosten und chemische Kompatibilität zwischen Polycarbonat und PEEK. FFKM ist auch als Kalrez bekannt.
  • Das eine oder die mehreren Materialien, die zur Herstellung der Kapillaren verwendet werden, sind häufig optisch transparent, um die Verwendung mit spektroskopischen oder bildgebenden Detektionstechniken zu erleichtern. In einigen Fällen ist die gesamte Kapillare optisch transparent. Alternativ ist in einigen Fällen nur ein Teil der Kapillare (z. B. ein optisch transparentes „Fenster“) optisch transparent.
  • Die Kapillaren, die zum Aufbau der offenbarten Kapillarflusszellenvorrichtungen und Kapillardurchflusszellenpatronen verwendet werden, können unter Verwendung beliebiger diverser Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wobei die Wahl der Herstellungstechnik häufig von der Wahl des verwendeten Materials abhängt und umgekehrt. Beispiele für geeignete Kapillarherstellungstechniken sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Extrusion, Ziehen, Präzisions-CNC-Bearbeitung und -Bohrung, Laser-Photoablation und dergleichen.
  • In einigen Implementierungen können die in den offenbarten Kapillardurchflusszellenvorrichtungen und -patronen verwendeten Kapillaren handelsübliche Produkte sein. Beispiele für kommerzielle Anbieter, die Präzisionskapillarverrohrung bereitstellen, sind unter anderem Accu-Glass (St. Louis, MO; Präzisionsglaskapillarverrohrung), Polymicro Technologies (Phoenix, AZ; Präzisionsglas- und Quarzglaskapillarverrohrung), Friedrich & Dimmock, Inc. (Millville, NJ; anwenderspezifische Präzisionsglaskapillarverrohrung) und Drummond Scientific (Broomall, PA; OEM-Kapillarverrohrung aus Glas und Kunststoff).
  • Die Fluidadapter, die an den Kapillaren der hierin offenbarten Kapillardurchflusszellenvorrichtungen und -patronen angeschlossen werden, und andere Komponenten der Kapillardurchflusszellenvorrichtungen und -patronen können unter Verwendung beliebiger diverser geeigneter Techniken (z. B. Extrusionsformen, Spritzgießen, Formpressen, Präzisions-CNC-Bearbeitung usw.) und Materialien (z. B. Glas, Quarzglas, Keramik, Metall, Polydimethylsiloxan, Polystyrol (PS), makroporösem Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen mit hoher Dichte (HDPE), cyclischen Olefinpolymeren (COP), cyclischen Olefincopolymeren (COC), Polyethylenterephthalat (PET) usw.) hergestellt werden, wobei die Wahl der Herstellungstechnik wiederum häufig von der Wahl des verwendeten Materials abhängt und umgekehrt.
  • 30 stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für eine Kapillardurchflusszellenpatrone bereit, die zwei Glaskapillaren, Fluidadapter (in diesem Beispiel zwei pro Kapillare) und ein Patronengehäuse umfasst, das mit den Kapillaren und/oder Fluidadaptern zusammenpasst, so dass die Kapillaren in einer festen Ausrichtung relativ zur Patrone gehalten werden. In einigen Fällen können die Fluidadapter in das Patronengehäuse integriert sein. In einigen Fällen kann die Patrone zusätzliche Adapter umfassen, die mit den Kapillaren und/oder Kapillarfluidadaptern zusammenpassen. Wie an anderer Stelle hierin erwähnt, kann die Patrone in einigen Fällen zusätzliche Funktionskomponenten umfassen. In einigen Fällen sind die Kapillaren unlösbar in der Patrone montiert. In einigen Fällen ist das Patronengehäuse so ausgelegt, dass eine oder mehrere Kapillaren der Durchflusszellenpatrone austauschbar entfernt und ersetzt werden können. In einigen Fällen kann das Patronengehäuse beispielsweise eine schwenkbare „Clamshell“-Konfiguration aufweisen, die es ermöglicht, es zu öffnen, so dass eine oder mehrere Kapillaren entfernt und ersetzt werden können. In einigen Fällen ist das Patronengehäuse so konfiguriert, dass es beispielsweise auf dem Tisch eines Mikroskopsystems oder in einem Patronenhalter eines Fluoreszenzbildgebungsmoduls oder Instrumentensystems der vorliegenden Offenbarung montiert werden kann.
  • In einigen Fällen können die offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen mikrofluidische Vorrichtungen (oder „mikrofluidische Chips“) und Patronen umfassen, wobei die mikrofluidischen Vorrichtungen durch Bilden von Fluidkanälen in einer oder mehreren Schichten eines geeigneten Materials hergestellt werden und einen oder mehrere Fluidkanäle (z. B. „Analysekanäle“) umfassen, die zum Durchführen einer Analysetechnik konfiguriert sind, die ferner die Bildgebung als Detektionsverfahren umfasst. In einigen Implementierungen können die hierin offenbarten mikrofluidischen Vorrichtungen oder Patronen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr als 20 Fluidkanäle (z. B. „Analysefluidkanäle“) umfassen, die zum Durchführen einer Analysetechnik konfiguriert sind, die ferner die Bildgebung als Detektionsverfahren umfasst. In einigen Fällen können die offenbarten mikrofluidischen Vorrichtungen ferner zusätzliche Fluidkanäle (z. B. zum Verdünnen oder Mischen von Reagenzien), Reagenzienbehälter, Abfallbehälter, Adapter zum Herstellen externer Fluidverbindungen und dergleichen umfassen, um eine integrierte „Lab-on-a-Chip“-Funktionalität innerhalb der Vorrichtung bereitzustellen.
  • Ein nicht einschränkendes Beispiel für eine mikrofluidische Durchflusszellenpatrone umfasst einen Chip mit zwei oder mehr parallelen Glaskanälen, die auf dem Chip ausgebildet sind, Fluidadaptern, die mit dem Chip gekoppelt sind, und ein Patronengehäuse, das mit dem Chip und/oder Fluidadaptern zusammenpasst, so dass der Chip in einer festen Ausrichtung relativ zur Patrone positioniert ist. In einigen Fällen können die Fluidadapter in das Patronengehäuse integriert sein. In einigen Fällen kann die Patrone zusätzliche Adapter umfassen, die mit dem Chip und/oder den Fluidadaptern zusammenpassen. In einigen Fällen ist der Chip unlösbar in der Patrone montiert. In einigen Fällen ist das Patronengehäuse so ausgelegt, dass ein oder mehrere Chips der Durchflusszellenpatrone austauschbar entfernt und ersetzt werden können. In einigen Fällen kann das Patronengehäuse beispielsweise eine schwenkbare „Clamshell“-Konfiguration aufweisen, die es ermöglicht, es zu öffnen, so dass eine oder mehrere Chips entfernt und ersetzt werden können. In einigen Fällen ist das Patronengehäuse so konfiguriert, dass es beispielsweise auf dem Tisch eines Mikroskopsystems oder in einem Patronenhalter eines Bildgebungssystems montiert werden kann. Selbst wenn in dem nicht einschränkenden Beispiel nur ein Chip beschrieben ist, versteht es sich, dass mehr als ein Chip in der mikrofluidischen Durchflusszellenpatrone verwendet werden kann. Die Durchflusszellenpatronen der vorliegenden Offenbarung können einen einzelnen mikrofluidischen Chip oder mehrere mikrofluidische Chips umfassen. In einigen Fällen können die Durchflusszellenpatronen der vorliegenden Offenbarung 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr als 20 mikrofluidische Chips umfassen. Das Verpacken einer oder mehrerer mikrofluidischen Vorrichtungen in einer Patrone kann die Handhabung und korrekte Positionierung der Vorrichtung innerhalb des optischen Bildgebungssystems erleichtern.
  • Die Fluidkanäle innerhalb der offenbarten mikrofluidischen Vorrichtungen und Patronen können diverse Querschnittsgeometrien aufweisen, unter anderem, aber nicht beschränkt auf kreisförmige, elliptische, quadratische, rechteckige, dreieckige, abgerundete quadratische, abgerundete rechteckige oder abgerundete dreieckige Querschnittsgeometrien. In einigen Fällen können die Fluidkanäle eine beliebige spezifizierte Querschnittsabmessung oder einen Satz von Abmessungen aufweisen. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Höhe (z. B. die Spalthöhe), die Breite oder die größte Querschnittsabmessung der Fluidkanäle (z. B. der Diagonale, wenn der Fluidkanal einen quadratischen, abgerundeten quadratischen, rechteckigen oder abgerundeten rechteckigen Querschnitt aufweist) im Bereich von etwa 10 µm bis etwa 10 mm liegen. In einigen Aspekten kann die Höhe (z. B. die Spalthöhe), die Breite oder die größte Querschnittsabmessung der Fluidkanäle mindestens 10 µm, mindestens 25 µm , mindestens 50 µm, mindestens 75 µm, mindestens 100 µm, mindestens 200 µm, mindestens 300 µm, mindestens 400 µm, mindestens 500 µm, mindestens 600 µm, mindestens 700 µm, mindestens 800 µm, mindestens 900 µm, mindestens 1 mm, mindestens 2 mm, mindestens 3 mm, mindestens 4 mm mindestens 5 mm, mindestens 6 mm, mindestens 7 mm, mindestens 8 mm, mindestens 9 mm oder mindestens 10 mm betragen. In einigen Aspekten kann die Höhe (z. B. die Spalthöhe), die Breite oder die größte Querschnittsabmessung der Fluidkanäle höchstens 10 mm, höchstens 9 mm, höchstens 8 mm, höchstens 7 mm, höchstens 6 mm, höchstens 5 mm, höchstens 4 mm, höchstens 3 mm, höchstens 2 mm, höchstens 1 mm, höchstens 900 µm, höchstens 800 µm, höchstens 700 µm, höchstens 600 µm, höchstens 500 µm, höchstens 400 µm, höchstens 300 µm, höchstens 200 µm , höchstens 100 µm, höchstens 75 µm, höchstens 50 µm, höchstens 25 µm oder höchstens 10 µm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Höhe (z. B. die Spalthöhe), die Breite oder die größte Querschnittsabmessung der Fluidkanäle im Bereich von etwa 20 µm bis etwa 200 µm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Höhe (z. B. die Spalthöhe), die Breite oder die größte Querschnittsabmessung der Fluidkanäle einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 122 µm.
  • In einigen Fällen kann die Länge der Fluidkanäle in den offenbarten mikrofluidischen Vorrichtungen und Patronen im Bereich von etwa 5 mm bis etwa 10 cm oder mehr liegen. In einigen Fällen kann die Länge der Fluidkanäle weniger als 5 mm, mindestens 5 mm, mindestens 1 cm, mindestens 1,5 cm, mindestens 2 cm, mindestens 2,5 cm, mindestens 3 cm, mindestens 3,5 cm, mindestens 4 cm, mindestens 4,5 cm, mindestens 5 cm, mindestens 6 cm, mindestens 7 cm, mindestens 8 cm, mindestens 9 cm oder mindestens 10 cm betragen. In einigen Fällen kann die Länge der Fluidkanäle höchstens 10 cm, höchstens 9 cm, höchstens 8 cm, höchstens 7 cm, höchstens 6 cm, höchstens 5 cm, höchstens 4,5 cm, höchstens 4 cm, höchstens 3,5 cm, höchstens 3 cm, höchstens 2,5 cm, höchstens 2 cm, höchstens 1,5 cm, höchstens 1 cm oder höchstens 5 mm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Länge der Fluidkanäle im Bereich von etwa 1,5 cm bis etwa 2,5 cm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Länge der Fluidkanäle einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 1,35 cm. In einigen Fällen können die mikrofluidischen Vorrichtungen oder Patronen eine Mehrzahl von Fluidkanälen mit der gleichen Länge umfassen. In einigen Fällen können die mikrofluidischen Vorrichtungen oder -patronen eine Mehrzahl von Fluidkanälen mit unterschiedlichen Längen umfassen.
  • Die offenbarten mikrofluidischen Vorrichtungen umfassen mindestens eine Materialschicht mit einem oder mehreren darin gebildeten Fluidkanälen. In einigen Fällen kann der mikrofluidische Chip zwei Schichten beinhalten, die miteinander verbunden sind, um einen oder mehrere Fluidkanäle zu bilden. In einigen Fällen kann der mikrofluidische Chip drei oder mehr Schichten beinhalten, die miteinander verbunden sind, um einen oder mehrere Fluidkanäle zu bilden. In einigen Fällen können die mikrofluidischen Fluidkanäle eine offene Oberseite aufweisen. In einigen Fällen können die mikrofluidischen Fluidkanäle innerhalb einer Schicht, z. B. der oberen Oberfläche einer unteren Schicht, hergestellt und durch Verbinden der oberen Oberfläche der unteren Schicht mit der unteren Oberfläche einer oberen Materialschicht versiegelt werden. In einigen Fällen können die mikrofluidischen Kanäle innerhalb einer Schicht hergestellt werden, z. B. als strukturierte Kanäle, deren Tiefe sich über die gesamte Dicke der Schicht erstreckt, die dann zwischen zwei nicht strukturierten Schichten angeordnet und mit diesen verbunden wird, um die Fluidkanäle zu versiegeln. In einigen Fällen werden die mikrofluidischen Kanäle durch Entfernen einer Opferschicht auf der Oberfläche eines Substrats hergestellt. Bei diesem Verfahren muss das Bulk-Substrat (z. B. ein Glas- oder Siliciumwafer) nicht weggeätzt werden. Stattdessen befinden sich die Fluidkanäle auf der Oberfläche des Substrats. In einigen Fällen können die mikrofluidischen Kanäle in oder auf der Oberfläche eines Substrats hergestellt und dann durch Abscheidung eines konformen Films oder einer konformen Schicht auf der Oberfläche des Substrats versiegelt werden, um unterirdische oder verborgene Fluidkanäle im Chip zu erzeugen.
  • Die mikrofluidischen Chips können unter Verwendung einer Kombination von Mikrofabrikationsprozessen hergestellt werden. Da die Vorrichtungen mikrofabriziert sind, werden Substratmaterialien typischerweise auf Basis ihrer Kompatibilität mit bekannten Mikrofabrikationstechniken ausgewählt, z. B. Photolithographie, nasschemischem Ätzen, Laserablation, Laserbestrahlung, Luftabriebtechniken, Spritzgießen, Prägen und anderen Techniken. Die Substratmaterialien werden im Allgemeinen auch aufgrund ihrer Kompatibilität mit dem gesamten Bereich von Bedingungen ausgewählt, denen die mikrofluidischen Vorrichtungen ausgesetzt sein können, einschließlich extremer pH-Werte, Temperaturen, Salzkonzentrationen und Anlegen elektromagnetischen (z. B. Licht) oder elektrischen Feldern.
  • Die offenbarten mikrofluidischen Chips können aus beliebigen diversen Materialien hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glas (z. B. Borosilikatglas, Kalknatronglas usw.), Kieselglas (Quarz), Silicium, Polymer (z. B. Polystyrol (PS), makroporöses Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen hoher Dichte (HDPE), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COC), Polyethylenterephthalat (PET), Polydimethylsiloxan (PDMS) usw.), Polyetherimid (PEI) und Perfluorelastomer (FFKM) (als chemisch inertere Alternativen) oder eine beliebige Kombination davon. Dementsprechend können das eine oder die mehreren Substratmaterialien in einigen bevorzugten Fällen Substrate auf Siliciumdioxidbasis, wie Borosilikatglas und Quarz, sowie andere Substratmaterialien beinhalten.
  • Die offenbarten mikrofluidischen Vorrichtungen können unter Verwendung beliebiger diverser Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wobei die Wahl der Herstellungstechnik häufig von der Wahl des verwendeten Materials abhängt und umgekehrt. Die mikrofluidischen Kanäle auf dem Chip können unter Verwendung von Techniken konstruiert werden, die zur Bildung von Mikrostrukturen oder Mikromustern auf der Oberfläche eines Substrats geeignet sind. In einigen Fällen werden die Fluidkanäle durch Laserbestrahlung gebildet. In einigen Fällen werden die mikrofluidischen Kanäle durch fokussierte Femtosekundenlaserstrahlung gebildet. In einigen Fällen werden die mikrofluidischen Kanäle durch Photolithographie und Ätzen gebildet, unter anderem, aber nicht beschränkt auf chemisches Ätzen, Plasmaätzen oder tiefes reaktives lonenätzen. In einigen Fällen werden die mikrofluidischen Kanäle durch Laserätzen gebildet. In einigen Fällen werden die mikrofluidischen Kanäle unter Verwendung einer direktschreibenden Lithographietechnik gebildet. Beispiele für die direktschreibende Lithographie sind unter anderem direktschreibende Elektronenstrahl- und fokussiertes lonenstrahlfräsen.
  • In zusätzlichen bevorzugten Fällen können das eine oder die mehreren Substratmaterialien Polymermaterialien, z. B. Kunststoffe wie Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat, Polytetrafluorethylen (TEFLON™), Polyvinylchlorid (PVC), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polysulfon und dergleichen umfassen. Solche polymeren Substrate können unter Verwendung verfügbarer Mikrofabrikationstechniken, wie den oben beschriebenen, einfach strukturiert oder mikrobearbeitet werden. In einigen Fällen können mikrofluidische Chips aus Polymermaterialien hergestellt werden, z. B. aus mikrofabrizierten Mastern, unter Verwendung bekannter Formtechniken wie Spritzgießen, Prägen, Stanzen oder durch Polymerisieren des polymeren Vorläufermaterials innerhalb einer Form (siehe z. B. US-Pat. Nr. 5,512,131 ). Solche polymeren Substratmaterialien werden in einigen Fällen wegen ihrer einfachen Herstellung, geringen Kosten und Verfügbarkeit sowie ihrer allgemeinen Inertheit gegenüber den meisten extremen Reaktionsbedingungen bevorzugt. Wie bei Durchflusszellenvorrichtungen, die aus anderen Materialien hergestellt sind, z. B. Glas, können Durchflusszellenvorrichtungen, die aus diesen Polymermaterialien hergestellt sind, behandelte Oberflächen, z. B. derivatisierte oder beschichtete Oberflächen, beinhalten, um ihre Nützlichkeit im mikrofluidischen System zu verbessern, wie unten ausführlicher erörtert wird.
  • Die Fluidkanäle und/oder Fluidkammern der mikrofluidischen Vorrichtungen werden typischerweise in der oberen Oberfläche eines ersten Substrats als mikroskalige Kanäle (z. B. Rillen, Vertiefungen usw.) unter Verwendung der oben beschriebenen Mikrofabrikationstechniken hergestellt. Das erste Substrat umfasst eine Oberseite mit einer ersten planaren Oberfläche und eine Unterseite. In den mikrofluidischen Vorrichtungen, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, ist die Mehrzahl von Fluidkanälen (z. B. Rillen und/oder Vertiefungen) auf der ersten planaren Oberfläche gebildet. In einigen Fällen weisen die in der ersten planaren Oberfläche (vor dem Verbinden mit einem zweiten Substrat) gebildeten Fluidkanäle (z. B. Rillen und/oder Vertiefungen) Boden- und Seitenwände auf, wobei sie oben offen bleiben. In einigen Fällen weisen die in der ersten planaren Oberfläche (vor dem Verbinden mit einem zweiten Substrat) gebildeten Fluidkanäle (z. B. Rillen und/oder Vertiefungen) Boden- und Seitenwände auf, wobei sie oben geschlossen bleiben. In einigen Fällen weisen die in den ersten ebenen Oberflächen (vor dem Verbinden mit einem zweiten Substrat) gebildeten Fluidkanäle (z. B. Rillen und/oder Vertiefungen) nur Seitenwände und keine obere oder untere Oberfläche auf (d. h., die Fluidkanäle überspannen die gesamte Dicke des ersten Substrats.
  • Fluidkanäle und -kammern können versiegelt werden, indem die erste ebene Oberfläche des ersten Substrats mit der ebenen Oberfläche eines zweiten Substrats in Kontakt gebracht und mit dieser verbunden wird, um die Kanäle und/oder Kammern (z. B. den inneren Teil) der Vorrichtung an der Grenzfläche dieser beiden Komponenten zu bilden. Nachdem das erste Substrat mit einem zweiten Substrat verbunden wurde, kann die Struktur in einigen Fällen weiter mit einem dritten Substrat in Kontakt gebracht und mit diesem verbunden werden. Das dritte Substrat kann in einigen Fällen mit der Seite des ersten Substrats in Kontakt gebracht werden, die nicht mit dem zweiten Substrat in Kontakt steht. In einigen Fällen ist das erste Substrat zwischen dem zweiten Substrat und dem dritten Substrat angeordnet. In einigen Fällen können das zweite Substrat und das dritte Substrat die Rillen, Vertiefungen oder Öffnungen auf dem ersten Substrat bedecken und/oder versiegeln, um die Kanäle und/oder Kammern (z. B. den inneren Teil) der Vorrichtung an der Grenzfläche dieser Komponenten zu bilden.
  • Die Vorrichtung kann Öffnungen aufweisen, die so ausgerichtet sind, dass sie mit mindestens einem der Fluidkanäle und/oder Fluidkammern in Fluidverbindung stehen, die im inneren Teil der Vorrichtung gebildet sind, wodurch Fluideinlässe und/oder Fluidauslässe gebildet werden. In einigen Fällen sind die Öffnungen auf dem ersten Substrat ausgebildet. In einigen Fällen sind die Öffnungen auf dem ersten und dem zweiten Substrat ausgebildet. In einigen Fällen sind die Öffnungen auf dem ersten, dem zweiten und dem dritten Substrat ausgebildet. In einigen Fällen sind die Öffnungen an der Oberseite der Vorrichtung positioniert. In einigen Fällen sind die Öffnungen an der Unterseite der Vorrichtung positioniert. In einigen Fällen sind die Öffnungen am ersten und/oder am zweiten Ende der Vorrichtung positioniert und verlaufen die Kanäle entlang der Richtung vom ersten Ende zum zweiten Ende.
  • Die Bedingungen, unter denen Substrate miteinander verbunden werden können, sind dem Fachmann allgemein hinlänglich bekannt, und eine solche Bindung von Substraten wird im Allgemeinen durch beliebige diverser Verfahren durchgeführt, deren Wahl in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Substratmaterialien variieren kann. Beispielsweise kann eine thermische Verbindung von Substraten auf eine Reihe von Substratmaterialien angewendet werden, einschließlich z. B. Substraten auf Glas- oder Siliciumdioxidbasis sowie einigen Substraten auf Polymerbasis. Solchen Techniken zum thermischen Verbinden umfassen typischerweise das Zusammenfügen der zu verbindenden Substratoberflächen unter Bedingungen erhöhter Temperatur und in einigen Fällen unter Anwendung von äußerem Druck. Die genauen verwendeten Temperaturen und Drücke variieren im Allgemeinen in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Substratmaterialien.
  • Beispielsweise wird für Substratmaterialien auf Siliciumdioxidbasis, d. h. Glas (Borosilikatglas, Pyrex™, Kalknatronglas usw.), Kieselglas (Quarz) und dergleichen, das thermische Verbinden von Substraten typischerweise bei Temperaturen im Bereich von etwa 500 °C bis etwa 1400 °C und vorzugsweise von etwa 500 °C bis etwa 1200 °C durchgeführt. Beispielsweise wird Kalknatronglas typischerweise bei Temperaturen von etwa 550 °C gebunden, während Borosilikatglas typischerweise bei oder nahe 800 °C thermisch gebunden wird. Quarzsubstrate hingegen werden typischerweise bei Temperaturen bei oder nahe 1200 °C thermisch gebunden. Diese Verbindungstemperaturen werden typischerweise erreicht, indem die zu verbindenden Substrate in Hochtemperaturglühöfen platziert werden.
  • Bei Polymersubstraten, die thermisch gebunden sind, werden hingegen typischerweise niedrigere Temperaturen und/oder Drücke als Substrate auf Siliciumdioxidbasis verwendet, um ein übermäßiges Schmelzen der Substrate und/oder eine Verformung zu verhindern, z. B. ein Abflachen des inneren Teils der Vorrichtung (d. h. der Fluidkanäle oder -kammern). Im Allgemeinen variieren solche erhöhten Temperaturen zum Binden von Polymersubstraten in Abhängigkeit von dem verwendeten Polymermaterial von etwa 80 °C bis etwa 200 °C und liegen vorzugsweise zwischen etwa 90 °C und etwa 150 °C. Aufgrund der deutlich verringerten Temperaturen, die zum Verbinden von polymeren Substraten erforderlich sind, kann ein solches Verbinden typischerweise ohne die Notwendigkeit von Hochtemperaturöfen durchgeführt werden, wie sie beim Verbinden von Substraten auf Siliciumdioxidbasis verwendet werden. Dies ermöglicht den Einbau einer Wärmequelle in ein einzelnes integriertes Verbindungssystem, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
  • Klebstoffe können auch verwendet werden, um Substrate nach hinlänglich bekannten Verfahren miteinander zu verbinden, die typischerweise das Aufbringen einer Klebstoffschicht zwischen den zu verbindenden Substraten und das Zusammenpressen dieser Substrate bis zum Aushärten des Klebstoffs umfassen. Eine Vielzahl von Klebstoffen kann gemäß diesen Verfahren verwendet werden, einschließlich z. B. UV-härtbarer Klebstoffe, die im Handel erhältlich sind. Alternative Verfahren können auch verwendet werden, um Substrate gemäß der vorliegenden Erfindung miteinander zu verbinden, einschließlich z. B. akustischen oder Ultraschallschweißens und/oder Lösungsmittelschweißens von Polymerteilen.
  • Typischerweise wird eine Reihe der beschriebenen mikrofluidischen Chips oder Vorrichtungen gleichzeitig hergestellt, z. B. unter Verwendung von „Wafer-Scale“-Fabrikation. Beispielsweise können polymere Substrate in großen trennbaren Folien gestanzt oder geformt werden, die dann zusammengefügt und miteinander verbunden werden können. Einzelne Vorrichtungen oder gebundene Substrate können dann durch Schneiden oder Würfeln (Dicing) von der größeren Folie getrennt werden. Gleichermaßen können für Substrate auf Siliciumdioxidbasis einzelne Vorrichtungen aus größeren Substratwafern oder -platten hergestellt werden, was einen höheren Durchsatz des Herstellungsprozesses ermöglicht. Insbesondere kann eine Mehrzahl von Fluidkanalstrukturen auf einem ersten Substratwafer oder einer ersten Substratplatte hergestellt werden, die dann mit einem zweiten Substratwafer oder einer zweiten Substratplatte überlagert und daran gebunden wird und gegebenenfalls weiter mit einem dritten Substratwafer oder einer dritten Substratplatte überlagert und daran gebunden wird. Die einzelnen Vorrichtungen werden dann unter Verwendung bekannter Verfahren wie Sägen, Ritzen und Brechen und dergleichen von den größeren Substraten segmentiert.
  • Wie oben erwähnt, wird das obere oder zweite Substrat auf das untere oder erste Substrat gelegt, um die verschiedenen Kanäle und Kammern zu versiegeln. Bei der Durchführung des Verbindungsprozesses gemäß den Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann das Verbinden des ersten und des zweiten Substrats unter Verwendung von Vakuum und/oder Druck durchgeführt werden, um die zwei Substratoberflächen in optimalem Kontakt zu halten. Insbesondere kann das untere Substrat in optimalem Kontakt mit dem oberen Substrat gehalten werden, z. B. indem die planare Oberfläche des unteren Substrats mit der planaren Oberfläche des oberen Substrats verbunden wird und ein Vakuum durch die Löcher angelegt wird, die durch das obere Substrat angeordnet sind. Typischerweise wird das Anlegen eines Vakuums an Löcher im oberen Substrat durchgeführt, indem das obere Substrat auf ein Vakuumfutter gelegt wird, das typischerweise einen Montagetisch oder eine Montagefläche mit einer integrierten Vakuumquelle umfasst. Im Fall von Substraten auf Siliciumdioxidbasis werden die gebundenen Substrate erhöhten Temperaturen ausgesetzt, um eine anfängliche Bindung herzustellen, so dass die gebundenen Substrate dann in den Glühofen überführt werden können, ohne sich relativ zueinander zu verschieben.
  • Alternative Bindungssysteme zum Einbau in die hierin beschriebene Vorrichtung sind unter anderem z. B. Klebstoffabgabesysteme zum Aufbringen von Klebstoffschichten zwischen den beiden planaren Oberflächen der Substrate. Dies kann erreicht werden, indem die Klebstoffschicht vor dem Zusammenfügen der Substrate aufgetragen wird oder indem eine Menge des Klebstoffs an einer Kante der angrenzenden Substrate platziert wird und die Dochtwirkung der beiden zusammengefügten Substrate den Klebstoff über den Raum zwischen den zwei Substraten ziehen lässt.
  • In bestimmten Fällen kann das gesamte Verbindungssystem automatisierbare Systeme beinhalten, um das obere und das untere Substrat auf der Montagefläche zu platzieren und sie für das nachfolgende Verbinden auszurichten. Typischerweise beinhalten solche Systeme Translationssysteme zum Bewegen entweder der Montagefläche oder eines oder mehrerer des oberen und des unteren Substrats relativ zueinander. Beispielsweise können Robotersysteme verwendet werden, um wiederum jedes des oberen und des unteren Substrats nacheinander auf den Montagetisch und innerhalb der Ausrichtungsstrukturen anzuheben, zu verschieben bzw. zu platzieren. Nach dem Verbindungsprozess können solche Systeme auch das fertige Produkt von der Montagefläche entfernen und diese zusammengefügten Substrate zu einem nachfolgenden Vorgang übertragen, z. B. einen Trenn- oder Würfelungsvorgang, einen Glühofen für Substrate auf Siliciumdioxidbasis usw., bevor zusätzliche Substrate darauf zum Verbinden platziert werden.
  • In einigen Fällen beinhaltet das Herstellen des mikrofluidischen Chips das Schichten oder Laminieren von zwei oder mehr Schichten von Substrat, z. B. strukturierten und nicht strukturierten Polymerfolien, um den Chip herzustellen. Beispielsweise werden in mikrofluidischen Vorrichtungen die mikrofluidischen Merkmale der Vorrichtung typischerweise durch Laserbestrahlung, Ätzen oder anderweitiges Einarbeiten von Merkmalen in die Oberfläche einer ersten Schicht hergestellt. Eine zweite Schicht wird dann auf die Oberfläche des ersten laminiert oder damit verbunden, um diese Merkmale zu versiegeln und die fluidischen Elemente der Vorrichtung bereitzustellen, z. B. die Fluidkanäle.
  • Wie oben erwähnt, können in einigen Fällen eine oder mehrere Kapillardurchflusszellenvorrichtungen oder mikrofluidischen Chips in einem Patronengehäuse montiert sein, um eine Kapillardurchflusszellenpatrone oder eine mikrofluidische Patrone zu bilden. In einigen Fällen kann die Kapillardurchflusszellenpatrone oder die mikrofluidische Patrone ferner zusätzliche Komponenten umfassen, die in die Patrone integriert sind, um eine verbesserte Leistung für bestimmte Anwendungen bereitzustellen. Beispiele für zusätzliche Komponenten, die in die Patrone integriert werden können, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Adapter oder Verbinder für Fluidverbindungen mit anderen Komponenten des Systems, Fluiddurchflusssteuerkomponenten (z. B. Miniaturventile, Miniaturpumpen, Mischverteiler usw.), Temperatursteuerkomponenten (z. B. Widerstandsheizelemente, Metallplatten, die als Wärmequellen oder -senken dienen, piezoelektrische (Peltier) Vorrichtungen zum Heizen oder Kühlen, Temperatursensoren) oder optische Komponenten (z. B. optische Linsen, Fenster, Filter, Spiegel, Prismen, Glasfasern und/oder Leuchtdioden (LEDs) oder andere Miniaturlichtquellen, die gemeinsam verwendet werden können, um spektroskopische Messungen und/oder die Bildgebung eines oder mehrerer Kapillar- oder Fluiddurchflusskanäle zu erleichtern.
  • Die Fluidadapter, das Patronengehäuse und andere Patronenkomponenten können unter Verwendung einer beliebiger diverser Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, an den Kapillaren, der einen oder den mehreren Kapillardurchflusszellenvorrichtungen, dem einen oder den mehreren mikrofluidischen Chips (oder Fluidkanälen innerhalb des Chips) angebracht werden, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Presspassung, Klebeverbinden, Lösungsmittelbinden, Laserschweißen usw. oder eine beliebige Kombination davon. In einigen Fällen sind der eine oder die mehreren Einlässe und/oder Auslässe der mikrofluidischen Kanäle auf dem mikrofluidischen Chip Öffnungen auf der oberen Oberfläche des Chips und können die Fluidadapter an dem einen oder den mehreren Einlässen und/oder Auslässen der mikrofluidischen Kanäle innerhalb des Chips angebracht oder daran gekoppelt werden. In einigen Fällen kann die Patrone zusätzliche Adapter (d. h. zusätzlich zu den Fluidadaptern) umfassen, die mit dem Chip und/oder den Fluidadaptern zusammenpassen und dabei helfen, den Chip innerhalb der Patrone zu positionieren. Diese Adapter können unter Verwendung der gleichen Herstellungstechniken und Materialien wie die oben für die Fluidadapter beschriebenen hergestellt werden.
  • Das Patronengehäuse (oder „Gehäuse“) kann aus Metall- und/oder Polymermaterialien wie Aluminium, eloxiertem Aluminium, Polycarbonat (PC), Acryl (PMMA) oder Ultem (PEI) hergestellt sein, während andere Materialien ebenfalls mit der vorliegenden Offenbarung übereinstimmen. Ein Gehäuse kann unter Verwendung von CNC-Bearbeitungs- und/oder Formtechniken hergestellt werden und so ausgelegt sein, dass eine, zwei oder mehr als zwei Kapillaren oder mikrofluidische Chips durch das Gehäuse in einer festen Ausrichtung begrenzt werden, um einen oder mehrere unabhängige Durchflusskanäle zu erzeugen. Die Kapillaren oder Chips können in dem Gehäuse montiert werden, indem beispielsweise eine Kompressionsanpassung verwendet wird oder indem komprimierbare Adapter aus Silikon oder einem Fluorelastomer zusammengefügt werden. In einigen Fällen werden zwei oder mehr Komponenten des Patronengehäuses (z. B. eine obere und eine untere Hälfte) unter Verwendung von z. B. Schrauben, Clips, Klemmen oder anderen Befestigungselementen zusammengebaut, so dass die beiden Hälften trennbar sind. In einigen Fällen werden zwei oder mehr Komponenten des Patronengehäuses unter Verwendung von beispielsweise Klebstoffen, Lösungsmittelbinden oder Laserschweißen zusammengebaut, so dass die zwei oder mehr Komponenten dauerhaft angebracht sind.
  • Durchflusszellenoberflächenbeschichtungen: In einigen Fällen können eine oder mehrere Innenflächen der Kapillarlumen oder mikrofluidischen Kanäle in den offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen unter Verwendung beliebiger diverser Oberflächenmodifikationstechniken oder Polymerbeschichtungen beschichtet werden, die dem Fachmann bekannt sind. In einigen Fällen können die Beschichtungen so formuliert werden, dass sie die Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen (z. B. angebundene Oligonukleotidadapter-/-primersequenzen) auf der einen oder den mehreren Innenflächen erhöhen oder maximieren, um ein Vordergrundsignal zu erhöhen oder zu maximieren, z. B. ein Fluoreszenzsignal aus markierten Nukleinsäuremolekülen, die mit angebundenen Oligonukleotidadapter-/-primersequenzen hybridisiert sind. In einigen Fällen können die Beschichtungen so formuliert sein, dass sie die unspezifische Bindung von Fluorophoren und anderen kleinen Molekülen oder markierten oder unmarkierten Nukleotiden, Proteinen, Enzymen, Antikörpern, Oligonukleotiden oder Nukleinsäuremolekülen (z. B. DNA, RNA usw.) verringern oder minimieren, um ein Hintergrundsignal zu verringern oder zu minimieren, z. B. Hintergrundfluoreszenz, die aus der unspezifischen Bindung markierter Biomoleküle oder aus der Autofluoreszenz einer Probenträgerstruktur resultiert. Die Kombination eines erhöhten Vordergrundsignals und eines verringerten Hintergrundsignals, die in einigen Fällen durch die Verwendung der offenbarten Beschichtungen erreicht werden kann, kann somit ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) bei spektroskopischen Messungen oder ein verbessertes Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) bei Bildgebungsverfahren bereitstellen.
  • Wie nachstehend ausführlicher erörtert, führen die offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen, die gegebenenfalls in Kombination mit den verbesserten Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsprotokollen verwendet werden, zu Festphasen-Bioassayreaktionen, die aufweisen: (i) vernachlässigbare unspezifische Bindung von Protein und anderen Reaktionskomponenten (wodurch der Substrathintergrund verringert oder minimiert wird); (ii) vernachlässigbares unspezifisches Nukleinsäureamplifikationsprodukt und (iii) einstellbare Nukleinsäureamplifikationsreaktionen bereitstellen. Obwohl hierin hauptsächlich im Zusammenhang mit Nukleinsäurehybridisierungs-, Amplifikations- und Sequenzierungsassays beschrieben, versteht es der Fachmann, dass die offenbarten Träger mit geringer Bindung in beliebigen einer Vielzahl anderer Bioassayformate verwendet werden können, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Sandwich-Immunoassays, enzymgebundene Immunosorbens-Assays (ELISAs) usw.
  • In einem bevorzugten Aspekt können eine oder mehrere Schichten eines Beschichtungsmaterials auf die Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen aufgebracht werden, wobei die Anzahl der Schichten und/oder die Materialzusammensetzung jeder Schicht ausgewählt wird, um eine oder mehrere Oberflächeneigenschaften der Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen einzustellen, wie in der US-Patentanmeldung Nr. 16/363.842 angegeben. Beispiele für Oberflächeneigenschaften, die eingestellt werden können, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Oberflächenhydrophilie/- hydrophobie, Gesamtbeschichtungsdicke, Oberflächendichte chemisch reaktiver funktioneller Gruppen, Oberflächendichte gepfropfter Linkermoleküle oder Oligonukleotidadapter/-primer usw. In einigen bevorzugten Anwendungen werden eine oder mehrere Oberflächeneigenschaften des Kapillar- oder Kanallumens eingestellt, um beispielsweise (i) eine sehr geringe unspezifische Bindung von Proteinen, Oligonukleotiden, Fluorophoren und anderen molekularen Komponenten chemischer oder biologischer Analyseanwendungen bereitzustellen, einschließlich Festphasennukleinsäureamplifikations- und/oder Sequenzierungsanwendungen, (ii) für eine verbesserte Festphasennukleinsäurehybridisierungsspezifität und -effizienz bereitzustellen und (iii) für eine verbesserte Festphasennukleinsäureamplifikationsrate, -spezifität und -effizienz bereitzustellen.
  • Beliebige diverser Molekülen, die dem Fachmann bekannt sind, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Silane, Aminosäuren, Peptide, Nukleotide, Oligonukleotide, andere Monomere oder Polymere oder Kombinationen davon, können zur Herstellung des einen oder der mehreren chemisch modifizierten Schichten auf den Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen verwendet werden, wobei die Auswahl der verwendeten Komponenten variiert werden kann, um eine oder mehrere Eigenschaften der Trägeroberfläche zu verändern, z. B. die Oberflächendichte von funktionellen Gruppen und/oder gebundenen Oligonukleotidprimern, die Hydrophilie/Hydrophobizität der Trägeroberfläche, oder die dreidimensionale Beschaffenheit (d. h. „Dicke“) der Trägeroberfläche.
  • Die Anbindungschemie, die zum Pfropfen einer ersten chemisch modifizierten Schicht auf eine Innenoberfläche der Durchflusszelle (Kapillare oder Kanal) verwendet wird, hängt im Allgemeinen sowohl vom Material, aus dem die Durchflusszellenvorrichtung hergestellt wird, als auch von der chemischen Beschaffenheit der Schicht ab. In einigen Fällen kann die erste Schicht kovalent an die Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen angebunden sein. In einigen Fällen kann die erste Schicht nicht kovalent gebunden sein, z. B. durch nichtkovalente Wechselwirkungen wie elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken oder Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche und den molekularen Komponenten der ersten Schicht an der Oberfläche adsorbiert sein. In jedem Fall kann die Substratoberfläche vor dem Anbringen oder Abscheiden der ersten Schicht behandelt werden. Zum Reinigen oder Behandeln der Trägeroberfläche können beliebige diverser Oberflächenvorbehandlungstechniken verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise können Glas- oder Siliciumoberflächen unter Verwendung einer Piranha-Lösung (einer Mischung aus Schwefelsäure (H2SO4) und Wasserstoffperoxid (H2O2)) mit Säure gewaschen und/oder unter Verwendung eines Sauerstoffplasmabehandlungsverfahrens gereinigt werden.
  • Die Silanchemie stellt einen nicht einschränkenden Ansatz zur kovalenten Modifizierung der Silanolgruppen auf Glas- oder Siliciumoberflächen dar, um reaktivere funktionelle Gruppen (z. B. Amine oder Carboxylgruppen), die dann zur Kopplung von Linkermolekülen (z. B. linearen Kohlenwasserstoffmolekülen von verschiedenen Längen, wie C6-, C12-, C18-Kohlenwasserstoffen, oder linearen Polyethylenglykolmolekühlen (PEG-Molekülen) oder Schichtmolekülen (z. B. verzweigten PEG-Molekülen oder anderen Polymeren) verwendet werden können, an die Oberfläche anzubinden. Beispiele für geeignete Silane, die zur Herstellung beliebiger der offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung verwendet werden können, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS), (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES), beliebige einer Vielzahl von PEG-Silanen (z. B. umfassend Molekulargewichte von 1 K, 2 K, 5 K, 10 K, 20 K usw.), Amino-PEG-Silan (d. h. umfassend eine freie aminofunktionelle Gruppe), Maleimid-PEG-Silan, Biotin-PEG-Silan und dergleichen.
  • Beispiele für bevorzugte Polymere, die verwendet werden können, um eine oder mehrere Schichten aus wenig unspezifischem Bindungsmaterial in einer der offenbarten Trägeroberflächen zu erzeugen, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyethylenglykol (PEG) mit verschiedenen Molekulargewichten und Verzweigungsstrukturen, Streptavidin-, Polyacrylamid-, Polyester-, Dextran-, Polylysin- und Polylysin-Copolymere oder eine beliebige Kombination davon. Beispiele für Konjugationschemien, die verwendet werden können, um eine oder mehrere Materialschichten (z. B. Polymerschichten) auf die Trägeroberfläche zu pfropfen und/oder die Schichten miteinander zu vernetzen, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen (oder Variationen davon), His-Tag-Ni/NTA-Konjugationschemie, Methoxyetherkonjugationschemie, Carboxylatkonjugationschemie, Aminkonjugationschemie, NHS-Ester, Maleimide, Thiol, Epoxid, Azid, Hydrazid, Alkin, Isocyanat und Silan.
  • Die Anzahl der Schichten aus Polymer oder anderer chemischer Schichten auf der Durchflusszellenvorrichtungsinnenfläche kann in einigen Fällen im Bereich von 1 bis etwa 10 oder mehr als 10 liegen. In einigen Fällen beträgt die Anzahl der Schichten mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder mindestens 10. In einigen Fällen kann die Anzahl der Schichten höchstens 10, höchstens 9, höchstens 8, höchstens 7, höchstens 6, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder höchstens 1 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der Schichten im Bereich von etwa 2 bis etwa 4 liegen. In einigen Fällen können die eine oder mehreren Schichten alle das gleiche Material umfassen. In einigen Fällen kann jede Schicht ein anderes Material umfassen. In einigen Fällen kann die Mehrzahl von Schichten eine Mehrzahl von Materialien umfassen.
  • Eine oder mehrere Schichten einer mehrschichtigen Oberfläche können ein verzweigtes Polymer umfassen oder können linear sein. Beispiele für geeignete verzweigte Polymere sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, verzweigtes PEG, verzweigter Poly(vinylalkohol) (verzweigter PVA), verzweigtes Poly(vinylpyridin), verzweigtes Poly(vinylpyrrolidon) (verzweigtes PVP), verzweigtes Poly(acrylsäure) (verzweigte PAA), verzweigtes Polyacrylamid, verzweigtes Poly(N-isopropylacrylamid) (verzweigtes PNIPAM), verzweigtes Poly(methylmethacrylat) (verzweigtes PMA), verzweigtes Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (verzweigtes PHEMA), verzweigtes Poly(oligo(ethylenglykol)methylethermethacrylat) (verzweigtes POEGMA), verzweigte Polyglutaminsäure (verzweigte PGA), verzweigtes Polylysin, verzweigtes Polyglucosid und Dextran.
  • In einigen Fällen können die verzweigten Polymere, die zum Erzeugen einer oder mehrerer Schichten einer der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, mindestens 4 Verzweigungen, mindestens 5 Verzweigungen, mindestens 6 Verzweigungen, mindestens 7 Verzweigungen, mindestens 8 Verzweigungen, mindestens 9 Verzweigungen, mindestens 10 Verzweigungen, mindestens 12 Verzweigungen, mindestens 14 Verzweigungen, mindestens 16 Verzweigungen, mindestens 18 Verzweigungen, mindestens 20 Verzweigungen, mindestens 22 Verzweigungen, mindestens 24 Verzweigungen, mindestens 26 Verzweigungen, mindestens 28 Verzweigungen, mindestens 30 Verzweigungen, mindestens 32 Verzweigungen, mindestens 34 Verzweigungen, mindestens 36 Verzweigungen, mindestens 38 Verzweigungen oder mindestens 40 Verzweigungen umfassen. Moleküle weisen häufig eine Zweierpotenz von Verzweigungen auf, wie 2, 4, 8, 16, 32, 64 oder 128 Verzweigungen.
  • In einigen Fällen können die resultierenden funktionellen Endgruppen, die nach der Abscheidung einer oder mehrerer Schichten, z. B. Polymerschichten, von der Oberfläche distal gelegen sind, Biotin, Methoxyether, Carboxylat, Amin, NHS-Ester, Maleimid und Bissilan sein, ohne darauf beschränkt zu sein.
  • Lineare, verzweigte oder mehrfach verzweigte Polymere, die verwendet werden, um eine oder mehrere Schichten einer der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen zu erzeugen, können ein Molekulargewicht von mindestens 500 Dalton, mindestens 1.000 Dalton, mindestens 1.500 Dalton, mindestens 2.000 Dalton, mindestens 2.500 Dalton, mindestens 3.000 Dalton, mindestens 3.500 Dalton, mindestens 4.000 Dalton, mindestens 4.500 Dalton, mindestens 5.000 Dalton, mindestens 7.500 Dalton, mindestens 10.000 Dalton, mindestens 12.500 Dalton, mindestens 15.000 Dalton, mindestens 17.500 Dalton, mindestens 20.000 Dalton, mindestens 25.000 Dalton, mindestens 30.000 Dalton, mindestens 35.000 Dalton, mindestens 40.000 Dalton, mindestens 45.000 Dalton oder mindestens 50.000 Dalton aufweisen. In einigen Fällen können die linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymere, die zur Erzeugung einer oder mehrerer Schichten einer der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, ein Molekulargewicht von höchstens 50.000 Dalton, höchstens 45.000 Dalton, höchstens 40.000 Dalton, höchstens 35.000 Dalton, höchstens 30.000 Dalton, höchstens 25.000 Dalton, höchstens 20.000 Dalton, höchstens 17.500 Dalton, höchstens 15.000 Dalton, höchstens 12.500 Dalton, höchstens 10.000 Dalton, höchstens 7.500 Dalton, höchstens 5.000 Dalton, höchstens 4.500 Dalton, höchstens 4.000 Dalton, höchstens 3.500 höchstens 3.000 Dalton, höchstens 2.500 Dalton, höchstens 2.000 Dalton, höchstens 1.500 Dalton, höchstens 1.000 Dalton oder höchstens 500 Dalton aufweisen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen das Molekulargewicht von linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymeren, die zur Erzeugung einer oder mehrerer Schichten beliebiger der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, im Bereich von etwa 1.500 Dalton bis etwa 20.000 Dalton liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass das Molekulargewicht von linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymeren, die zur Erzeugung einer oder mehrerer Schichten einer der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. 1.260 Dalton.
  • In einigen Fällen können zwei oder mehr Schichten kovalent miteinander gekoppelt oder intern vernetzt sein, um die Stabilität der resultierenden Oberfläche zu verbessern. In einigen Fällen, z. B. wobei mindestens eine Schicht einer mehrschichtigen Oberfläche ein verzweigtes Polymer umfasst, kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der abgeschiedenen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht im Bereich von etwa einer kovalenten Verknüpfung pro Molekül und etwa 32 kovalenten Verknüpfungen pro Molekül liegen. In einigen Fällen kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 22, mindestens 24, mindestens 26, mindestens 28, mindestens 30 oder mindestens 32 oder mehr als 32 kovalente Verknüpfungen pro Molekül betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht höchstens 32, höchstens 30, höchstens 28, höchstens 26, höchstens 24, höchstens 22, höchstens 20, höchstens 18, höchstens 16, höchstens 14, höchstens 12, höchstens 10, höchstens 9, höchstens 8, höchstens 7, höchstens 6, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder höchstens 1 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht im Bereich von etwa 4 bis etwa 16 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. in einigen Fällen etwa 11 oder in anderen Fällen eine durchschnittliche Anzahl von etwa 4,6.
  • Alle reaktiven funktionellen Gruppen, die nach der Kopplung einer Materialschicht an die Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen verbleiben, können gegebenenfalls durch Kopplung eines kleinen, inerten Moleküls unter Verwendung einer Kopplungschemie mit hoher Ausbeute blockiert werden. Beispielsweise können in dem Fall, dass die Aminkopplungschemie verwendet wird, um eine neue Materialschicht an die vorherige zu anzubinden, alle verbleibenden Amingruppen anschließend durch Kopplung mit einer kleinen Aminosäure wie Glycin acetyliert oder deaktiviert werden.
  • Um die Oberflächendichte von Bindungsstellen, z. B. der Oberflächendichte der Oligonukleotidadapter/-primer, zu skalieren und hydrophilen oder amphoteren Oberflächen zusätzliche Dimensionalität zu verleihen, wurden Substrate entwickelt, die mehrschichtige Beschichtungen aus PEG und anderen hydrophilen Polymeren umfassen. Durch Verwendung von hydrophilen und amphoteren Oberflächenschichtungsansätzen, die die nachstehend beschriebenen Polymer/Copolymer-Materialien beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind, ist es möglich, die Adapter-/Primerbeladungsdichte auf der Oberfläche signifikant zu erhöhen. Bei traditionellen PEG-Beschichtungsansätzen wird die Monoschichtprimerabscheidung verwendet, die für Einzelmolekülsequenzierungsanwendungen getestet und berichtet wurde, jedoch für Nukleinsäureamplifikationsanwendungen keine hohen Kopienzahlen ergibt. Wie hierin beschrieben, kann „Schichtung“ unter Verwendung herkömmlicher Vernetzungsansätze mit beliebigen kompatiblen Polymer- oder Monomeruntereinheiten erreicht werden, so dass eine Oberfläche, die zwei oder mehr stark vernetzte Schichten umfasst, nacheinander aufgebaut werden kann. Beispiele für geeignete Polymere sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Streptavidin, Polyacrylamid, Polyester, Dextran, Polylysin und Copolymere von Polylysin und PEG. In einigen Fällen können die verschiedenen Schichten durch beliebige diverser Konjugationsreaktionen vernetzt werden, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Biotin-Streptavidin-Bindung, Azid-Alkin-Klick-Reaktion, Amin-NHS-Ester-Reaktion, Thiol-Maleimid-Reaktion und ionischer Wechselwirkungen zwischen positiv geladenem Polymer und negativ geladenem Polymer. In einigen Fällen können Materialien mit hoher Adapter-/Primerdichte in Lösung konstruiert und anschließend in mehreren Schritten auf die Oberfläche geschichtet werden.
  • Beispielhafte PEG-Mehrfachschichten sind unter anderem PEG (8-armig, 16-armig, 8-armig) auf PEG-Amin-APTES. Ähnliche Konzentrationen wurden bei mehrarmigem 3-Schicht-PEG (8-armig, 16-armig, 8-armig) und (8-armig, 64-armig, 8-armig) auf PEG-Amin-APTES, die 8 µM Primer ausgesetzt waren, und mehrarmigem 3-Schicht-PEG (8-armig, 8-armig, 8-armig) mit sternförmigem PEG-Amin als Ersatz für 16 und 64 Arme beobachtet. PEG-Mehrfachschichten mit vergleichbaren ersten, zweiten und dritten PEG-Schichten werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • In einigen Fällen kann die resultierende Oberflächendichte von Bindungsstellen auf den Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen, z. B. die Oberflächendichten von Olligonukleotidadaptern/-primern, im Bereich von etwa 100 Primermolekülen pro µm2 bis etwa 1.000.000 Primermolekülen pro µm2 liegen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Bindungstellen mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400, mindestens 500, mindestens 600, mindestens 700, mindestens 800, mindestens 900, mindestens 1.000, mindestens 1.500, mindestens 2.000, mindestens 2.500, mindestens 3.000, mindestens 3.500, mindestens 4.000, mindestens 4.500, mindestens 5.000, mindestens 5.500, mindestens 6.000, mindestens 6.500, mindestens 7.000, mindestens 7.500, mindestens 8.000, mindestens 8.500, mindestens 9.000, mindestens 9.500, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000 oder mindestens 1.000.000 Moleküle pro µm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Bindungsstellen höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.500, höchstens 9.000, höchstens 8.500, höchstens 8.000, höchstens 7.500, höchstens 7.000, höchstens 6.500, höchstens 6.000, höchstens 5.500, höchstens 5.000, höchstens 4.500, höchstens 4.000, höchstens 3.500, höchstens 3.000, höchstens 2.500, höchstens 2.000, höchstens 1.500, höchstens 1.000, höchstens 900, höchstens 800, höchstens 700, höchstens 600, höchstens 500, höchstens 400, höchstens 300, höchstens 200 oder höchstens 100 Moleküle pro µm2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von Bindungsstellen im Bereich von etwa 10.000 Molekülen pro µm2 bis etwa 100.000 Molekülen pro µm2 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Oberflächendichte von Bindungsstellen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. in einigen Fällen etwa 3.800 Moleküle pro µm2 oder in anderen Fällen etwa 455.000 Moleküle pro µm2. In einigen Fällen kann, wie weiter unten für Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen erörtert wird, die Oberflächendichte von Template-Bibliothek-Nukleinsäuresequenzen (z. B. Proben-DNA-Moleküle), die anfänglich mit Adapter- oder Primersequenzen hybridisiert sind, die an die Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen angebunden sind, kleiner als die für die Oberflächendichte von Bindungsstellen angegebene oder gleich dieser sein. In einigen Fällen kann, wie auch weiter unten erörtert wird, die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Template-Bibliothek-Nukleinsäuresequenzen, die an Adapter- oder Primersequenzen auf den Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen hybridisiert sind, den gleichen Bereich oder einen anderen Bereich als den für die Oberflächendichte von gebundenen Oligonukleotidadaptern oder -primern angegebenen überspanne.
  • Lokale Oberflächendichten von Bindungsstellen auf Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen wie oben aufgeführt, schließen eine Variation der Dichte über eine Oberfläche nicht aus, so dass eine Oberfläche eine Region mit einer Bindungsstellendichte von beispielsweise 500.000/µm2 umfassen kann, während sie gleichzeitig mindestens eine zweite Region mit einer wesentlich anderen lokalen Oberflächendichte umfasst.
  • In einigen Fällen können Fängersonden, z. B. Oligonukleotidprimer mit unterschiedlichen Basensequenzen und Basenmodifikationen (oder andere Biomoleküle, z. B. Enzyme oder Antikörper), in verschiedenen Oberflächendichten an die eine oder mehreren Schichten der resultierende Oberfläche angebunden sein. In einigen Fällen können beispielsweise sowohl die Oberflächendichte von funktionellen Gruppen als auch die zur Kopplung verwendete Konzentration der Fängersonden variiert werden, um auf einen bestimmten Bereich der Oberflächendichte der Fängersonden abzuzielen. Zusätzlich kann die Oberflächendichte der Fängersonden durch Verdünnen der Fängersonden mit anderen „inerten“ Molekülen gesteuert werden, die dieselbe reaktive funktionelle Gruppe zur Kopplung an die Oberfläche tragen. Beispielsweise können aminmarkiertes Oligonukleotidsonden mit aminmarkiertem Polyethylenglykol in einer Reaktion mit einer mit NHS-Ester beschichteten Oberfläche verdünnt werden, um die endgültige Primerdichte zu verringern. Im Fall von Oligonukleotidadaptern/-primern können auch Sondensequenzen mit unterschiedlichen Linkerlängen zwischen der Hybridisierungsregion und der funktionellen Gruppe der Oberflächenanhaftung angewendet werden, um die Oberflächendichte zu variieren. Beispiele für geeignete Linker sind unter anderem Poly-T- und Poly-A-Stränge am 5'-Ende des Primers (z. B. 0 bis 20 Basen), PEG-Linker (z. B. 3 bis 20 Monomereinheiten) und Kohlenstoffketten (z. B. C6), C12, C18 usw.). Um die Oberflächendichte der Fängersonden zu messen oder abzuschätzen, können fluoreszenzmarkierte Fängersonden an die Oberfläche angebunden werden und kann ein Fluoreszenzwert mit jenem für eine Kalibrierungslösung verglichen werden, die eine bekannte Konzentration des Fluorophors umfasst.
  • In einigen Fällen kann der Grad der Hydrophilie (oder „Benetzbarkeit“ mit wässrigen Lösungen) der offenbarten Trägeroberflächen, z. B. Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen, beispielsweise durch Messung von Wasserkontaktwinkeln bewertet werden, bei der ein kleiner Wassertropfen auf die Oberfläche aufgebracht wird und dessen Kontaktwinkel mit der Oberfläche gemessen wird, beispielsweise mit einem optischen Tensiometer. In einigen Fällen kann ein statischer Kontaktwinkel bestimmt werden. In einigen Fällen kann ein fortschreitender oder zurückgehender Kontaktwinkel bestimmt werden. In einigen Fällen kann der hierin offenbarte Wasserkontaktwinkel für den hierin offenbarten hydrophilen Träger mit geringer Bindung im Bereich von etwa 0 Grad bis etwa 50 Grad liegen. In einigen Fällen darf der hierin offenbarte Wasserkontaktwinkel für den hierin offenbarten hydrophilen Träger mit geringer Bindung nicht mehr als 50 Grad, 45 Grad, 40 Grad, 35 Grad, 30 Grad, 25 Grad, 20 Grad, 18 Grad, 16 Grad, 14 Grad, 12 Grad, 10 Grad, 8 Grad, 6 Grad, 4 Grad, 2 Grad oder 1 Grad betragen. In vielen Fällen beträgt der Kontaktwinkel nicht mehr als einen Wert innerhalb dieses Bereichs, z. B. nicht mehr als 40 Grad. Der Fachmann wird erkennen, dass eine gegebene hydrophile Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung einen Wasserkontaktwinkel mit einem beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 27 Grad. In einigen Fällen weisen die offenbarten gering unspezifisch bindenden Oberflächen einen Wasserkontaktwinkel von weniger als 45 Grad auf. In einigen Fällen weisen die offenbarten gering unspezifisch bindenden Oberflächen einen Wasserkontaktwinkel von weniger als 35 Grad auf.
  • Wie erwähnt, zeigen die hydrophile beschichteten Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen der vorliegenden Offenbarung eine verringerte unspezifische Bindung von Proteinen, Nukleinsäuren, Fluorophoren und anderen Komponenten von biologischen und biochemischen Assayverfahren. Der Grad der unspezifischen Bindung, der von einer gegebenen Trägeroberfläche, z. B. einer Durchflusszellenvorrichtungsinnenfläche, gezeigt wird, kann entweder qualitativ oder quantitativ bewertet werden. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Exposition der Oberfläche gegenüber fluoreszierenden Farbstoffen (z. B. Cyaninfarbstoff 3 (Cy3), Cyaninfarbstoff 5 (Cy5) usw.), fluoreszenzmarkierten Nukleotiden, fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden und/oder fluoreszenzmarkierten Proteinen (z. B. Polymerasen) unter einem standardisierten Satz von Bedingungen, gefolgt von einem spezifizierten Spülprotokoll und Fluoreszenzbildgebung, als qualitatives Werkzeug zum Vergleich der unspezifischen Bindung auf Trägern verwendet werden, die verschiedene Oberflächenformulierungen umfassen. In einigen Fällen kann die Exposition der Oberfläche gegenüber fluoreszierenden Farbstoffen, fluoreszenzmarkierten Nukleotiden, fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden und/oder fluoreszenzmarkierten Proteinen (z. B. Polymerasen) unter einem standardisierten Satz von Bedingungen, gefolgt von einem spezifizierten Spülprotokoll und Fluoreszenzbildgebung als quantitatives Instrument zum Vergleich der unspezifischen Bindung auf Trägern mit verschiedenen Oberflächenformulierungen verwendet werden - vorausgesetzt, es wurde darauf geachtet, dass die Fluoreszenzbildgebung unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen das Fluoreszenzsignal linear (oder auf vorhersagbare Weise) zu der Anzahl der Fluorophore auf der Trägeroberfläche (z. B. unter Bedingungen, bei denen die Signalsättigung und/oder Selbstlöschung des Fluorophors kein Problem darstellt) in Beziehung steht und geeignete Kalibrierungsstandards verwendet werden. In einigen Fällen können andere dem Fachmann bekannte Techniken, beispielsweise Radioisotopenmarkierungs- und Zählverfahren, zur quantitativen Beurteilung des Grades verwendet werden, in dem die verschiedenen Trägeroberflächenformulierungen der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Bindung aufweisen.
  • In einigen Fällen kann der Grad der unspezifischen Bindung, den die offenbarten Trägeroberflächen mit gering unspezifischer Bindung aufweist, unter Verwendung eines standardisierten Protokolls zum Inkontaktbringen der Oberfläche mit einem markierten Protein (z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Streptavidin, einer DNA-Polymerase, einer reversen Transkriptase, einer Helikase, einem einzelsträngigen Bindungsprotein (SSB) usw. oder einer beliebigen Kombination davon), einem markierten Nukleotid, einem markierten Oligonukleotid usw. unter einem standardisierten Satz von Inkubations- und Spülbedingungen, gefolgt von der Erfassung der Menge der auf der Oberfläche verbleibenden Markierung und dem Vergleich des daraus resultierenden Signals mit einem geeigneten Kalibrierungsstandard, bewertet werden. In einigen Fällen kann die Markierung eine fluoreszierende Markierung umfassen. In einigen Fällen kann die Markierung ein Radioisotop umfassen. In einigen Fällen kann die Markierung jede andere detektierbare Markierung umfassen, die dem Fachmann bekannt ist. In einigen Fällen kann der Grad der unspezifischen Bindung, den eine gegebene Trägeroberflächenformulierung aufweist, somit als Anzahl nicht spezifisch gebundener Proteinmoleküle (oder anderer Moleküle) pro Flächeneinheit bewertet werden. In einigen Fällen können die Träger mit gering unspezifischer Bindung der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Proteinbindung (oder unspezifische Bindung anderer spezifizierter Moleküle, z. B. Cyaninfarbstoff 3 (Cy3) von weniger als 0,001 Molekülen pro µm2, weniger als 0,01 Molekülen pro µm2, weniger als 0,1 Molekülen pro µm2, weniger als 0,25 Molekülen pro µm2, weniger als 0,5 Molekülen pro µm2, weniger als 1 Molekül pro µm2, weniger als 10 Molekülen pro µm2, weniger als 100 Molekülen pro µm2 oder weniger als 1000 Molekülen pro µm2 zeigen. Der Fachmann wird erkennen, dass eine gegebene Trägeroberfläche der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Bindung aufweisen kann, die in diesen Bereich fällt, beispielsweise von weniger als 86 Molekülen pro µm2. Beispielsweise zeigen einige hierin offenbarte modifizierte Oberflächen nach 15-minütigem Kontakt mit einer 1-µM-Lösung von Cy3-markiertem Streptavidin (GE Amersham) in phosphatgepuffertem Salzpuffer (PBS), gefolgt von 3 Spülungen mit entionisiertem Wasser, eine unspezifische Proteinbindung von weniger als 0,5 Molekülen/µm2. Einige hierin offenbarte modifizierte Oberflächen zeigen eine unspezifische Bindung von Cy3-Farbstoffmolekülen von weniger als 0,25 Molekülen pro µm2. In unabhängigen unspezifischen Bindungsassays wurden 1 µM markierter Cy3 SA (ThermoFisher), 1 µM Cy5 SA-Farbstoff (ThermoFisher), 10 µM Aminoallyl-dUTP-ATTO-647N (Jena Biosciences), 10 µM Aminoallyl-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 µM Aminoallyl-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 µM 7-Propargylamino-7-deaza-dGTP-Cy5 (Jena Biosciences) und 10 µM 7-Propargylamino-7-deaza-dGTP - Cy3 (Jena Biosciences) auf den gering unspezifisch bindenden Substraten 15 Minuten bei 37°C in einem 384-Well-Plattenformat inkubiert. Jedes Well wurde 2 bis 3 Mal mit 50 µl entionisiertem RNase/DNasefreiem Wasser und 2 bis 3 Mal mit 25 mM ACES-Puffer, pH-Wert 7,4, gespült. Die 384-WellPlatten wurden auf einem GE Typhoon-Instrument (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA) unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Cy3-, AF555- oder Cy5-Filtersätze (gemäß durchgeführtem Farbstofftest) bei einer PMT-Verstärkungseinstellung von 800 und Auflösung von 50-100 µm abgebildet. Für eine Bildgebung mit höherer Auflösung wurden Bilder auf einem Olympus IX83-Mikroskop (Olympus Corp., Center Valley, PA) mit einem Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Objektiv (20-fach, 0,75 NA oder 100-fach, 1,5 NA, Olympus) aufgenommen, eine sCMOS Andor-Kamera, (Zyla 4.2). Dichroitische Spiegel wurden von Semrock (IDEX Health & Science, LLC, Rochester, New York) gekauft, z. B. dichroitische Reflektoren/Strahlteiler mit 405, 488, 532 oder 633 nm, und Bandpassfilter wurden als 532 LP oder 645 LP in Übereinstimmung mit der entsprechenden Anregungswellenlänge ausgewählt. Einige hierin offenbarte modifizierte Oberflächen zeigen eine unspezifische Bindung von Farbstoffmolekülen von weniger als 0,25 Molekülen pro µm2.
  • In einigen Fällen können die hierin offenbarten beschichteten Durchflusszellenvorrichtungsoberflächen ein Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Bindung eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder mehr als 100 oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird.
  • In einigen Fällen können eine oder mehrere Oberflächenmodifikations- und/oder Polymerschichten unter Verwendung einer Technik wie chemischer Gasphasenabscheidung (CVD) auf die Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen aufgebracht werden. Eine oder mehrere Oberflächenmodifizierungs- und/oder Polymerschichten können in einigen Fällen auf die Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen aufgebracht werden, indem ein oder mehrere geeignete chemische Kopplungs- oder Beschichtungsreagenzien durch die Kapillaren oder die Fluidkanäle geleitet werden, bevor sie für ihre beabsichtigte Anwendung verwendet werden. Ein oder mehrere Beschichtungsreagenzien können in einigen Fällen zu einem verwendeten Puffer gegeben werden, z. B. eine Nukleinsäurehybridisierung, Amplifikationsreaktion und/oder Sequenzierungsreaktion, um eine dynamische Beschichtung der Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen bereitzustellen.
  • Die chemischen Modifizierungsschichten können in einigen Fällen gleichmäßig über die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur aufgebracht werden. Alternativ kann die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur ungleichmäßig verteilt oder strukturiert sein, so dass die chemischen Modifikationsschichten auf einen oder mehrere separate Bereiche des Substrats beschränkt sind. Beispielsweise kann die Substratoberfläche unter Verwendung photolithographischer Techniken strukturiert werden, um eine geordnete Anordnung oder ein zufälliges Muster chemisch modifizierter Regionen auf der Oberfläche zu erzeugen. Alternativ oder in Kombination kann die Substratoberfläche unter Verwendung von beispielsweise Kontaktdruck- und/oder Tintenstrahldrucktechniken strukturiert werden. In einigen Fällen kann eine geordnetes Anordnung oder zufälliges Muster chemisch modifizierter separater Regionen mindestens 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 oder 10.000 oder mehr separate Regionen oder jede Zwischenzahl separater Regionen, die durch den hierin angegebenen Bereich umfasst wird, umfassen.
  • In einigen Fällen zeigen Fluoreszenzbilder der offenbarten gering unspezifisch bindenden Oberflächen, wenn sie beispielsweise bei Nukleinsäurehybridisierungs- oder Amplifikationsanwendungen verwendet werden, um Cluster von hybridisierten oder klonal amplifizierten Nukleinsäuremolekülen (z. B. „separate Regionen“, die direkt oder indirekt mit einem Fluorophor markiert wurden) zu erzeugen, Kontrast-Rausch-Verhältnisse (CNRs) von mindestens 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 210, 220, 230, 240, 250 oder mehr als 250, wenn die Nukleinsäuremoleküle mit Cy3 markiert sind und die Bilder unter Verwendung eines inversen Fluoreszenzmikroskops Olympus IX83 aufgenommen werden, ausgestattet mit einem 20-fach-Objektiv mit 0,75 NA, einer 532-nm-Lichtquelle, einem Bandpass und einem Satz dichroitischer Spiegelfilter, angepasst oder optimiert für 532-nm-Langpassanregung und Cy3-Fluoreszenzemissionsfilter, einem dichroitischen Semrock-532-nm-Reflektor und einer Kamera (Andor sCMOS, Zyla 4.2), wobei die Intensität des Anregungslichts eingestellt ist, um eine Signalsättigung zu vermeiden, und die Oberfläche in einen Puffer (z. B. Puffer 25 mM ACES, pH-Wert 7,4) getaucht wird, während das Bild aufgenommen wird. Wie hierin verwendet, wird das Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) wie folgt berechnet: CNR = ( S-B ) / Rauschen
    Figure DE202021001858U1_0002
    wobei S = Vordergrundsignal (z. B. das in dem Bild gemessene Fluoreszenzsignal, das von einer markierten Nukleinsäurekolonie oder einem markierten Cluster auf einer Probenträgeroberfläche stammt), B = Hintergrundsignal (wobei B = Binter + Bintra), Binter = Hintergrundsignal, gemessen an einer Stelle auf der Probenträgeroberfläche, die sich zwischen markierten Nukleinsäurekolonien oder -clustern befindet, Bintra = Hintergrundsignal, gemessen an der Stelle einer Nukleinsäurekolonie oder eines Nukleinsäureclusters (bestimmt z. B. durch Inkontaktbringen der Probenträgeroberfläche mit einem markierten, nicht komplementären Oligonukleotid und Messung der resultierenden Fluoreszenz), und Rauschen = Signalrauschen. Das Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von Bildern von Sequenzierungsoberflächen stellt beispielsweise eine Schlüsselmetrik für die Beurteilung der Nukleinsäureamplifikationsspezifität und der unspezifischen Bindung auf dem Träger bereit. Während das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) häufig als Benchmark für die Gesamtsignalqualität angesehen wird, kann gezeigt werden, dass ein verbessertes CNR einen signifikanten Vorteil gegenüber SNR als Benchmark für die Signalqualität in Bildgebungsanwendungen bereitstellen kann, die eine schnelle Bilderfassung erfordern (z. B. Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen, für die Zykluszeiten minimiert werden müssen).
  • In einigen Fällen können polymerbeschichtete Probenträgerstrukturen, z. B. Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen, die die offenbarten hydrophilen Polymerbeschichtungen umfassen, eine verbesserte Stabilität gegenüber wiederholter Exposition gegenüber Lösungsmitteln, Temperaturänderungen, Änderungen des pH-Werts oder Langzeitlagerung aufweisen.
  • Fluidische Systeme und Fluiddurchflusssteuermodul: In einigen Implementierungen können die offenbarten Bildgebungs- und/oder Analysesysteme eine Fluiddurchflusssteuerfunktion zum Abgeben von Proben oder Reagenzien an die eine oder mehreren Durchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen (z. B. Einzelkapillarflusszellenvorrichtung oder mikrofluidische Kanaldurchflusszellenvorrichtung), die mit dem System verbunden sind, bereitstellen. Reagenzien und Puffer können in Flaschen, Reagenzien- und Pufferpatronen oder anderen geeigneten Behältern aufbewahrt werden, die über Verrohrungen und Ventilverteiler mit den Einlässen der Durchflusszellen verbunden sind. Die offenbarten Systeme können auch verarbeitete Proben- und Abfallbehälter in Form von Flaschen, Patronen oder anderen geeigneten Behältern zum Sammeln von Fluiden stromabwärts der Kapillardurchflusszellenvorrichtungen oder Kapillardurchflusszellenpatronen beinhalten. In einigen Ausführungsformen kann das Fluiddurchflusssteuermodul (oder „Fluidiksteuermodul“ ein programmierbares Umschalten des Flusses zwischen verschiedenen Quellen, z. B. Proben- oder Reagenzienbehältern oder Flaschen, die sich im Instrument befinden, und dem einen oder den mehreren Einlässen zu einem zentralen Bereich (z. B. eine Kapillardurchflusszelle oder eine mikrofluidische Vorrichtung oder eine große Fluidkammer wie eine große Fluidkammer innerhalb einer mikrofluidischen Vorrichtung) bereitstellen. In einigen Fällen kann das Fluiddurchflusssteuermodul ein programmierbares Umschalten des Flusses zwischen dem einen oder den mehreren Auslässen vom zentralen Bereich (z. B. einer Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung) und verschiedenen Sammelstellen bereitstellen, z. B. Behältern für verarbeitete Probenbehälter, Abfallbehältern usw., die mit dem System verbunden sind. In einigen Fällen können Proben, Reagenzien und/oder Puffer in Behältern aufbewahrt werden, die in die Durchflusszellenpatrone oder mikrofluidische Patrone selbst integriert sind. In einigen Fällen können verarbeitete Proben, verbrauchte Reagenzien und/oder gebrauchte Puffer in Behältern gelagert werden, die in die Durchflusszellenpatrone oder mikrofluidische Patrone selbst integriert sind.
  • In einigen Implementierungen können ein oder mehrere Fluiddurchflusssteuermodule konfiguriert sein, um die Abgabe von Fluiden an eine oder mehrere Kapillardurchflusszellen, Kapillardurchflusszellenpatronen, mikrofluidische Vorrichtungen, mikrofluidische Patronen oder eine beliebige Kombination davon zu steuern. In einigen Fällen können die eine oder mehreren Fluidiksteuerungen konfiguriert sein, um Volumendurchflussraten für eine oder mehrere Fluide oder Reagenzien, lineare Durchflussgeschwindigkeiten für eine oder mehrere Fluide oder Reagenzien, Mischungsverhältnisse für eine oder mehrere Fluide oder Reagenzien oder eine beliebige Kombination davon zu steuern. Die Steuerung des Fluiddurchflusses durch die offenbarten Systeme wird typischerweise unter Verwendung von Pumpen (oder anderen Fluidbetätigungsmechanismen) und Ventilen (z. B. programmierbaren Pumpen und Ventilen) durchgeführt. Beispiele für geeignete Pumpen sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Spritzenpumpen, programmierbare Spritzenpumpen, Schlauchpumpen, Membranpumpen und dergleichen. Beispiele für geeignete Ventile sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Rückschlagventile, elektromechanische Zweiwege- oder Dreiwegeventile, pneumatische Zweiwege- und Dreiwegeventile und dergleichen. In einigen Fällen kann der Fluiddurchfluss durch das System durch Anlegen eines positiven pneumatischen Drucks an einen oder mehrere Einlässe des Reagenz- und Pufferbehälters oder an Einlässe gesteuert werden, die in eine oder mehrere Durchflusszellenpatronen eingebaut sind (z. B. Kapillardurchflusszellen- oder mikrofluidische Patronen). In einigen Ausführungsformen kann der Fluiddurchfluss durch das System durch Ziehen eines Vakuums an einem oder mehreren Auslässen von Abfallbehältern oder an einem oder mehreren Auslässen, die in Durchflusszellenpatronen (z. B. Kapillardurchflusszellen- oder mikrofluidische Patronen) eingebaut sind, gesteuert werden.
  • In einigen Fällen werden verschiedene Modi der Fluiddurchflusssteuerung an verschiedenen Punkten in einem Assay- oder Analyseverfahren verwendet, z. B. Vorwärtsfluss (relativ zum Einlass und Auslass für eine bestimmte Kapillardurchflusszellenvorrichtung), Rückfluss, oszillierender oder pulsierender Fluss oder Kombinationen davon. In einigen Anwendungen kann ein oszillierender oder pulsierender Fluss angewendet werden, beispielsweise während der Wasch-/Spülschritte des Assays, um einen vollständigen und effizienten Austausch von Fluiden innerhalb der einen oder mehreren Durchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen (z. B. Kapillarflusszellenvorrichtungen oder -patronen und mikrofluidische Vorrichtungen oder Patronen) zu ermöglichen.
  • Gleichermaßen können in einigen Fällen unterschiedliche Fluiddurchflussraten an unterschiedlichen Orten innerhalb einer Durchflusszellenvorrichtung oder an unterschiedlichen Punkten im Assay- oder Analyseprozessarbeitsablauf verwendet werden, beispielsweise kann in einigen Fällen die Volumendurchflussrate von -100 ml/s bis +100 ml/s variieren. In einigen Ausführungsformen kann der Absolutwert der Volumendurchflussrate mindestens 0,001 ml/s, mindestens 0,01 ml/s, mindestens 0,1 ml/s, mindestens 1 ml/s, mindestens 10 ml/s oder mindestens 100 ml/s betragen. In einigen Ausführungsformen kann der Absolutwert der Volumendurchflussrate höchstens 100 ml/s, höchstens 10 ml/s, höchstens 1 ml/s, höchstens 0,1 ml/s, höchstens 0,01 ml/s oder höchstens 0,001 ml/s betragen. Die Volumendurchflussrate zu einem bestimmten Zeitpunkt kann einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen, z. B. eine Vorwärtsdurchflussrate von 2,5 ml/s, eine Rückwärtsdurchflussrate von - 0,05 ml/s oder einen Wert von 0 ml/s (d. h. gestoppter Durchfluss).
  • In einigen Implementierungen kann das Fluidiksystem so ausgelegt sein, dass der Verbrauch von Schlüsselreagenzien (z. B. teuren Reagenzien), die für die Durchführung von z. B. Genomanalyseanwendungen erforderlich sind, minimiert wird. Beispielsweise können in einigen Implementierungen die offenbarten Fluidiksysteme einen ersten Behälter, in dem ein erstes Reagens oder eine erste Lösung aufgenommen ist, einen zweiten Behälter, in dem ein zweites Reagens oder eine zweite Lösung aufgenommen ist, und eine zentrale Region, z. B. eine zentrale Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidische Vorrichtung umfassen, wobei ein Auslass aus dem ersten Behälter und ein Auslass aus dem zweiten Behälter durch mindestens ein Ventil mit einem Einlass der zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung fluidverbunden sind, so dass das Volumen des ersten Reagens oder der ersten Lösung, das pro Zeiteinheit aus dem Auslass des ersten Behälters zum Einlass der zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung fließt kleiner als das Volumen des zweiten Reagens oder der zweiten Lösung ist, das pro Zeiteinheit aus Auslass des zweiten Behälters zum Einlass der zentralen Region fließt. In einigen Implementierungen können der erste Behälter und der zweite Behälter in eine Kapillardurchflusszellenpatrone oder mikrofluidische Patrone integriert sein. In einigen Fällen kann das mindestens eine Ventil auch in die Kapillardurchflusszellenpatrone oder die mikrofluidische Patrone integriert sein.
  • In einigen Fällen ist der erste Behälter über ein erstes Ventil mit der zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung fluidverbunden und ist der zweite Behälter über ein zweites Ventil mit der zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung fluidverbunden. In einigen Fällen können das erste und/oder das zweite Ventil beispielsweise ein Membranventil, ein Quetschventil, ein Absperrschieber oder ein anderes geeignetes Ventil sein. In einigen Fällen ist der erste Behälter in unmittelbarer Nähe zu dem Einlass der zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung positioniert, um das Totvolumen für die Abgabe der ersten Reagenslösungen zu verringern. In einigen Fällen befindet sich der erste Behälter näher am Einlass der zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung als der zweite Behälter. In einigen Fällen ist der erste Behälter in unmittelbarer Nähe zu dem zweiten Ventil positioniert, um das Totvolumen für die Abgabe des ersten Reagens im Vergleich zu jenem für die Abgabe mehrerer „zweiter“ Reagenzien (z. B. zwei, drei, vier, fünf oder sechs oder mehr „zweite“ Reagenzien) aus mehreren „zweiten“ Behältern (z. B. zwei, drei, vier, fünf oder sechs oder mehr „zweite“ Behälter) zu verringern.
  • Der oben beschriebene erste und zweite Behälter können verwendet werden, um die gleichen oder unterschiedliche Reagenzien oder Lösungen aufzunehmen. In einigen Fällen unterscheidet sich das erste Reagens, das in dem ersten Behälter aufgenommen ist, von dem zweiten Reagens, das in dem zweiten Behälter aufgenommen ist, und umfasst das zweite Reagens mindestens ein Reagens, das von einer mehreren Reaktionen, die in der zentralen einer zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung auftreten, verwendet wird. In einigen Fällen, z. B. in Fluidiksystemen, die zur Durchführung einer Nukleinsäuresequenzierungschemie innerhalb der zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung konfiguriert sind, umfasst das erste Reagens mindestens ein Reagens, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Polymerase, einem Nukleotid und einem Nukleotidanalogon besteht. In einigen Fällen umfasst das zweite Reagens ein kostengünstiges Reagens, z. B. ein Lösungsmittel.
  • In einigen Fällen kann das Innenvolumen der zentralen Region, z. B. einer zentralen Kapillardurchflusszellenpatrone oder mikrofluidischen Vorrichtung, die einen oder mehrere Fluidkanäle oder eine oder mehrere Fluidkammern umfasst, basierend auf der spezifischen durchzuführenden Anwendung, z. B. Nukleinsäuresequenzierung, eingestellt werden. In einigen Ausführungsformen umfasst die zentrale Region ein Innenvolumen, das zur Sequenzierung eines eukaryotischen Genoms geeignet ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die zentrale Region ein Innenvolumen, das zur Sequenzierung eines prokaryotischen Genoms geeignet ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die zentrale Region ein Innenvolumen, das zur Sequenzierung eines viralen Genoms geeignet ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die zentrale Region ein Innenvolumen, das zur Sequenzierung eines Transkriptoms geeignet ist. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen das Innenvolumen der zentralen Region ein Volumen von weniger als 0,05 µl, zwischen 0,05 µl und 0,1 µl, zwischen 0,05 µl und 0,2 µl, zwischen 0,05 µl und 0,5 µl, zwischen 0,05 µl und 0,8 µl, zwischen 0,05 µl und 1 µl, zwischen 0,05 µl und 1,2 µl, zwischen 0,05 µl und 1,5 µl, zwischen 0,1 µl und 1,5 µl, zwischen 0,2 µl und 1,5 µl, zwischen 0,5 µl und 1,5 µl, zwischen 0,8 µl und 1,5 µl zwischen 1 µl und 1,5 µl, zwischen 1,2 µl und 1,5 µl oder mehr als 1,5 µl oder einem Bereich, der durch beliebige zwei des Vorstehenden definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen der zentralen Region ein Volumen von weniger als 0,5 µl, zwischen 0,5 µl und 1 µl, zwischen 0,5 µl und 2 µl, zwischen 0,5 µl und 5 µl, zwischen 0,5 µl und 8 µl, zwischen 0,5 µl und 10 µl, zwischen 0,5 µl und 12 µl, zwischen 0,5 µl und 15 µl, zwischen 1 µl und 15 µl, zwischen 2 µl und 15 µl, zwischen 5 µl und 15 µl, zwischen 8 µl und 15 µl, zwischen 10 µl und 15 µl, zwischen 12 µl und 15 µl oder mehr als 15 µl oder einem Bereich, der durch beliebige zwei des Vorstehenden definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen der zentralen Region ein Volumen von weniger als 5 µl, zwischen 5 µl und 10 µl, zwischen 5 µl und 20 µl, zwischen 5 µl und 500 µl, zwischen 5 µl und 80 µl, zwischen 5 µl und 100 µl, zwischen 5 µl und 120 µl, zwischen 5 µl und 150 µl, zwischen 10 µl und 150 µl, zwischen 20 µl und 150 µl, zwischen 50 µl und 150 µl, zwischen 80 µl und 150 µl, zwischen 100 µl und 150 µl, zwischen 120 µl und 150 µl oder mehr als 150 µl oder einem Bereich, der durch beliebige zwei des Vorstehenden definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen der zentralen Region ein Volumen von weniger als 50 µl, zwischen 50 µl und 100 µl, zwischen 50 µl und 200 µl, zwischen 50 µl und 500 µl, zwischen 50 µl und 800 µl zwischen 50 µl und 1000 µl, zwischen 50 µl und 1200 µl, zwischen 50 µl und 1500 µl, zwischen 100 µl und 1500 µl, zwischen 200 µl und 1500 µl, zwischen 500 µl und 1500 µl, zwischen 800 µl und 1500 µl, zwischen 1000 µl und 1500 µl, zwischen 1200 µl und 1500 µl oder mehr als 1500 µl oder einem Bereich, der durch beliebige zwei des Vorstehenden definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen der zentralen Region ein Volumen von weniger als 500 µl, zwischen 500 µl und 1000 µl, zwischen 500 µl und 2000 µl, zwischen 500 µl und 5 ml, zwischen 500 µl und 8 ml, zwischen 500 µl und 10 ml, zwischen 500 µl und 12 ml, zwischen 500 µl und 15 ml, zwischen 1 ml und 15 ml, zwischen 2 ml und 15 ml, zwischen 5 ml und 15 ml, zwischen 8 ml und 15 ml, zwischen 10 ml und 15 ml, zwischen 12 ml und 15 ml oder mehr als 15 ml oder einem Bereich, der durch beliebige zwei des Vorstehenden definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen der zentralen Region ein Volumen von weniger als 5 ml, zwischen 5 ml und 10 ml, zwischen 5 ml und 20 ml, zwischen 5 ml und 50 ml, zwischen 5 ml und 80 ml, zwischen 5 ml und 100 ml, zwischen 5 ml und 120 ml, zwischen 5 ml und 150 ml, zwischen 10 ml und 150 ml, zwischen 20 ml und 150 ml, zwischen 50 ml und 150 ml, zwischen 80 ml und 150 ml, zwischen 100 ml und 150 ml, zwischen 120 ml und 150 ml oder mehr als 150 ml oder einem Bereich, der durch beliebige zwei des Vorstehenden definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen umfassen die hierin beschriebenen Systeme, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Anordnung oder Sammlung von Durchflusszellenvorrichtungen oder - systemen, die mehrere separate Kapillaren, mikrofluidische Kanäle, Fluidkanäle, Kammern oder Lumenregionen umfassen, wobei das kombinierte Innenvolumen einen oder mehrere der innerhalb eines hierin offenbarten Bereichs liegenden Werte darstellt, umfasst oder beinhaltet.
  • In einigen Fällen kann das Verhältnis der Volumendurchflussrate für die Abgabe des ersten Reagens an die zentrale Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidische Vorrichtung zu dem für die Abgabe des zweiten Reagens an die zentrale Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidische Vorrichtung weniger als 1:20, weniger als 1:16, mindestens 1:12, weniger als 1:10, weniger als 1:8, weniger als 1:6 oder weniger als 1:2 betragen. In einigen Fällen kann das Verhältnis der Volumendurchflussrate für die Abgabe des ersten Reagens an die zentrale Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidische Vorrichtung zu dem für die Abgabe des zweiten Reagens an die zentrale Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidische Vorrichtung einen beliebigen Wert innerhalb des von diesen Werten umfassten Bereichs darstellen, z. B. weniger als 1:15.
  • Wie erwähnt, können die hierin offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und/oder Fluidiksysteme konfiguriert sein, um eine Verwendung der Reagenzien zu erzielen, die effizienter als jene ist, die z. B. durch andere Sequenzierungsvorrichtungen und -systeme erzielt wird, insbesondere für die kostspieligen Reagenzien, die in zahlreichen Sequenzierungschemieschritten verwendet werden. In einigen Fällen umfasst das erste Reagens ein Reagens, das teurer als das zweite Reagens ist. In einigen Fällen umfasst das erste Reagens ein reaktionsspezifisches Reagens und umfasst das zweite Reagens ein unspezifisches Reagenz, das allen Reaktionen gemeinsam ist, die in der Region der zentralen Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung durchgeführt werden, und wobei das reaktionsspezifische Reagens teurer als das unspezifische Reagens ist.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der hierin offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und/oder fluidischen Systeme Vorteile hinsichtlich eines verringerten Verbrauchs kostspieliger Reagenzien mit sich bringen. In einigen Fällen kann beispielsweise die Verwendung der hierin offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und/oder fluidischen Systeme im Vergleich zu dem Reagenzienverbrauch, der beim Betrieb von z. B. derzeit im Handel erhältlichen Nukleinsäuresequenzierungssystemen auftritt, zu einer Verringerung des Reagenzienverbrauchs von mindestens 5 %, mindestens 7,5 %, mindestens 10 %, mindestens 12,5 %, mindestens 15 %, mindestens 17,5 %, mindestens 20 %, mindestens 22,5 %, mindestens 25 %, mindestens 30 %, mindestens 35 %, mindestens 40 %, mindestens 45 % oder mindestens 50 % führen.
  • 31 stellt eine Ausführungsform eines nicht einschränkenden Beispiels für ein einfaches Fluidiksystem dar, das eine Einzelkapillardurchflusszelle umfasst, die mit verschiedenen Fluiddurchflusssteuerkomponenten verbunden ist, wobei die Einzelkapillare optisch zugänglich und mit der Montage auf einem Mikroskoptisch oder in einem anwenderspezifischen Bildgebungsinstrument zur Verwendung in verschiedenen Bildgebungsanwendungen kompatibel ist. Mehrere Reagenzbehälter sind mit dem Einlassende der Einzelkapillarflusszellenvorrichtung fluidverbunden, wobei das zu einem bestimmten Zeitpunkt durch die Kapillare fließende Reagens mittels eines programmierbaren Drehventils gesteuert wird, mit dem der Benutzer Zeitpunkt und Dauer des Reagenzflusses steuern kann. In diesem nicht einschränkenden Beispiel wird der Fluiddurchfluss mittels einer programmierbaren Spritzenpumpe gesteuert, die eine präzise Steuerung und ein präzises Timing des Fluidvolumendurchflusses und der Fluiddurchflussgeschwindigkeit bereitstellt.
  • 32 stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für ein Fluidiksystem dar, das eine Kapillardurchflusszellenpatrone mit integrierten Membranventilen umfasst, um das Totvolumen zu verringern oder minimieren und bestimmte Schlüsselreagenzien zu schonen. Durch die Integration von Miniatur-Membranventilen in die Patrone kann das Ventil in unmittelbarer Nähe zum Einlass der Kapillare positioniert werden, wodurch das Totvolumen innerhalb der Vorrichtung verringert oder minimiert und der Verbrauch kostspieliger Reagenzien verringert wird. Die Integration von Ventilen und anderen Fluidsteuerkomponenten in die Kapillardurchflusszellenpatrone ermöglicht auch die Integration einer größeren Fluiddurchflusssteuerfunktionalität in das Patronendesign.
  • 33 stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für ein auf Kapillardurchflusszellenpatronen basierendes Fluidiksystems dar, das in Kombination mit einem Mikroskopaufbau verwendet wird, wobei die Patrone eine Temperatursteuerkomponente wie eine Metallplatte enthält oder mit dieser zusammenpasst, die mit den Kapillaren in der Patrone in Kontakt kommt und als Wärmequelle/-senke dient. Der Mikroskopaufbau besteht aus einem Beleuchtungssystem (z. B. einem Laser, einer LED oder einer Halogenlampe usw. als Lichtquelle), einer Objektivlinse, einem Bildgebungssystem (z. B. einer CMOS- oder CCD-Kamera) und einer Translationsstufe, um die Patrone relativ zum optischen System zu bewegen, wodurch beispielsweise Fluoreszenz- und/oder Hellfeldbilder für verschiedene Bereiche der Kapillardurchflusszellen aufgenommen werden können, wenn die Stufe bewegt wird.
  • Temperatursteuermodule: In einigen Implementierungen beinhalten die offenbarten Systeme in einigen Fällen eine Temperatursteurtfunktionalität, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Assay- oder Analyseergebnissen zu erleichtern. Beispiele für Temperatursteuerkomponenten, die in das Design des Instrumentensystems (oder der Kapillardurchflusszellenpatrone) eingebaut werden können, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Widerstandsheizelemente, Infrarotlichtquellen, Peltier-Heiz- oder - Kühlvorrichtungen, Wärmesenken, Thermistoren, Thermoelemente und dergleichen. In einigen Fällen kann das Temperatursteuermodul (oder die „Temperatursteuerung“) eine programmierbare Temperaturänderung zu einer festgelegten, einstellbaren Zeit vor der Durchführung bestimmter Assay- oder Analyseschritte bereitstellen. In einigen Fällen kann die Temperatursteuerung programmierbare Temperaturänderungen über bestimmte Zeitintervalle bereitstellen. In einigen Ausführungsformen kann die Temperatursteuerung ferner das Zyklieren von Temperatur zwischen zwei oder mehr eingestellten Temperaturen mit spezifizierten Frequenz- und Rampenraten bereitstellen, so dass ein Wärmezyklus für Amplifikationsreaktionen durchgeführt werden kann.
  • 34 stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für die Temperatursteuerung der Durchflusszellen (z. B. Kapillardurchflusszellen oder auf mikrofluidischer Vorrichtung basierte Durchflusszellen) unter Verwendung einer Metallplatte dar, die mit der Durchflusszellenpatrone in Kontakt gebracht wird. In einigen Fällen kann die Metallplatte in das Patronengehäuse integriert sein. In einigen Fällen kann die Metallplatte unter Verwendung einer Peltier- oder einer Widerstandsheizung temperaturgesteuert werden.
  • 35 stellt einen nicht einschränkenden Ansatz zur Temperatursteuerung der Durchflusszellen (z. B. Kapillar- oder mikrofluidische Kanaldurchflusszellen) dar, der einen berührungslosen Wärmesteuermechanismus umfasst. Bei diesem Ansatz wird ein Strom temperaturgesteuerter Luft unter Verwendung eines Lufttemperatursteuersystems durch die Durchflusszellenpatrone (z. B. zu einer Einzelkapillarflusszellenvorrichtung oder einer mikrofluidischen Kanalddurchflusszellenvorrichtung) gelenkt. Das Lufttemperatursteuersystem umfasst einen Wärmetauscher, z. B. eine Widerstandsheizspule, an einer Peltier-Vorrichtung angebrachte Lamellen usw., der die Luft erwärmen und/oder kühlen und auf einer konstanten, benutzerdefinierten Temperatur halten kann. Das Lufttemperatursteuersystem umfasst auch eine Luftzufuhrvorrichtung, wie beispielsweise einen Ventilator, der den Strom erwärmter oder gekühlter Luft zur Kapillardurchflusszellenpatrone leitet. In einigen Fällen kann das Lufttemperatursteuersystem auf eine konstante Temperatur T1 eingestellt werden, so dass der Luftstrom und folglich die Durchflusszelle oder -patrone (z. B. Kapillardurchflusszelle oder mikrofluidische Kanalflusszelle) auf einer konstanten Temperatur T2 gehalten werden, die in einigen Fällen von der Solltemperatur T1 in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur, Luftdurchflussgeschwindigkeit usw. abweichen kann. In einigen Fällen können zwei oder mehr solche Lufttemperatursteuersysteme um die Kapillardurchflusszellenvorrichtung oder Durchflusszellenpatrone eingebaut werden, so dass die Kapillare oder Patrone schnell zwischen mehreren verschiedenen Temperaturen gewechselt werden kann, indem gesteuert wird, welches der Lufttemperatursteuersysteme zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv ist. Bei einem anderen Ansatz kann die Temperatureinstellung des Lufttemperatursteuersystems variiert werden, so dass die Temperatur der Kapillardurchflusszelle oder -patrone entsprechend geändert werden kann.
  • Fluidabgaberobotik: In einigen Implementierungen können die offenbarten Systeme ein automatisiertes, programmierbares Fluidabgabesystem (oder Flüssigkeitsabgabesystem) zur Verwendung beim Abgeben von Reagenzien oder anderen Lösungen in z. B. Mikroplatten, Kapillardurchflusszellenvorrichtungen und -patronen, mikrofluidische Vorrichtungen und Patronen usw. umfassen. Geeignete automatisierte, programmierbare Fluidabgabesysteme sind im Handel von einer Reihe von Anbietern erhältlich, z. B. Beckman Coulter, Perkin Elmer, Tecan, Velocity 11 und vielen anderen. In einem bevorzugten Aspekt der offenbarten Systeme umfasst das Fluidabgabesystem ferner einen Mehrkanal-Abgabekopf, z. B. einen 4-Kanal-, 8-Kanal-, 16-Kanal-, 96-Kanal- oder 384-Kanal-Abgabekopf zur gleichzeitigen Abgabe programmierbarer Flüssigkeitsvolumina (z. B. im Bereich von etwa 1 Mikroliter bis zu mehreren Millilitern) an mehrere Wells oder Stellen auf einer Durchflusszellenpatrone oder mikrofluidischen Patrone.
  • Robotik zur Handhabung von Patronen und/oder Mikroplatten (Pick-and-Place-Robotik): In einigen Implementierungen kann das offenbarte System ein Robotiksystem zur Handhabung von Patronen und/oder Mikroplatten zum automatisierten Ersetzen und Positionieren von Mikroplatten, Kapillardurchflusszellenpatronen oder mikrofluidischen Vorrichtungspatronen in Bezug auf das optische Bildgebungssystem oder zum optionalen Bewegen von Mikroplatten, Kapillardurchflusszellenpatronen oder mikrofluidischen Vorrichtungspatronen zwischen dem optischen Bildgebungssystem und einem Fluidabgabesystem umfassen. Geeignete automatisierte, programmierbare Robotiksysteme zur Handhabung von Mikroplatten sind im Handel von einer Reihe von Anbietern erhältlich, darunter Beckman Coulter, Perkin Elemer, Tecan, Velocity 11 und vielen anderen. In einem bevorzugten Aspekt der offenbarten Systeme ist ein automatisiertes Robotiksystem zur Handhabung von Mikroplatten konfiguriert, um Sammlungen von Mikrowellplatten, die Proben und/oder Reagenzien umfassen, zu und von beispielsweise gekühlten Lagereinheiten zu bewegen.
  • Spektroskopie- oder Bildgebungsmodule: Wie oben angegeben, beinhalten die offenbarten Analysesysteme in einigen Implementierungen optische Bildgebungsfunktionen und können auch andere spektroskopische Messfunktionen beinhalten. Beispielsweise können die offenbarten Bildgebungsmodule konfiguriert sein, um in beliebigen diverser Bildgebungsmodi zu arbeiten, die dem Fachmann bekannt sind, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Hellfeld-, Dunkelfeld-, Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder Phosphoreszenzbildgebung. In einigen Fällen umfassen die eine oder mehreren Kapillardurchflusszellen oder mikrofluidischen Vorrichtungen eines Fluidikteilsystems ein Fenster, das es ermöglicht, mindestens einen Abschnitt einer oder mehrerer Kapillaren oder eines oder mehrerer Fluidkanäle in jeder Durchflusszelle oder mikrofluidischen Vorrichtung zu beleuchten und abzubilden.
  • In einigen Ausführungsformen kann eine Einzelwellenlängenanregungs- und Emissionsfluoreszenzbildgebung durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Fluoreszenzbildgebung mit Anregung und Emission mit zwei Wellenlängen (oder Anregung oder Emission mit mehreren Wellenlängen) durchgeführt werden. In einigen Fällen ist das Bildgebungsmodul konfiguriert, um Videobilder aufzunehmen. Die Wahl des Bildgebungsmodus kann sich auf das Design der Durchflusszellenvorrichtungen oder -patronen auswirken, da alle oder ein Teil der Kapillaren oder Patronen notwendigerweise über den jeweiligen Spektralbereich optisch transparent sein müssen. In einigen Fällen kann eine Mehrzahl von Kapillaren innerhalb einer Kapillardurchflusszellenpatrone in ihrer Gesamtheit innerhalb eines einzelnen Bildes abgebildet werden. In einigen Fällen kann nur eine einzelne Kapillare oder eine Teilmenge von Kapillaren innerhalb einer Kapillardurchflusszellenpatrone oder Teilen davon innerhalb eines einzelnen Bildes abgebildet werden. In einigen Fällen kann eine Reihe von Bildern „gekachelt“ werden, um ein einzelnes hochauflösendes Bild von einer, zwei, mehreren oder den gesamten Mehrzahl von Kapillaren innerhalb einer Patrone zu erzeugen. In einigen Fällen kann eine Mehrzahl von Fluidkanälen innerhalb eines mikrofluidischen Chips in ihrer Gesamtheit innerhalb eines einzelnen Bildes abgebildet werden. In einigen Fällen kann nur ein einzelner Kanal oder eine Teilmenge von Fluidkanälen innerhalb eines mikrofluidischen Chips oder Teilen davon innerhalb eines einzelnen Bildes abgebildet werden. In einigen Fällen kann eine Reihe von Bildern „gekachelt“ werden, um ein einzelnes hochauflösendes Bild von einer, zwei, mehreren oder den gesamten Mehrzahl von Fluidkanälen innerhalb einer Patrone zu erzeugen.
  • Ein Spektroskopie- oder Bildgebungsmodul kann beispielsweise ein Mikroskop umfassen, das mit einem CMOS einer CCD-Kamera ausgestattet ist. In einigen Fällen kann das Spektroskopie- oder Bildgebungsmodul beispielsweise ein anwenderspezifisches Instrument umfassen, z. B. eines der hierin beschriebenen Bildgebungsmodule, das konfiguriert ist, eine spezifische Spektroskopie- oder Bildgebungstechnik von Interesse durchzuführen. Im Allgemeinen kann die dem Spektroskopie- oder Bildgebungsmodul zugeordnete Hardware Lichtquellen, Detektoren und andere optische Komponenten sowie Prozessoren oder Computer beinhalten.
  • Lichtquellen: Zur Bereitstellung des Bildgebungs- oder Anregungslichts können beliebige diverser Lichtquellen verwendet werden, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Wolframlampen, Wolframhalogenlampen, Bogenlampen, Laser, Leuchtdioden (LEDs) oder Laserdioden. In einigen Fällen kann eine Kombination aus einer oder mehreren Lichtquellen und zusätzlichen optischen Komponenten, z. B. Linsen, Filtern, Aperturen, Blenden, Spiegeln und dergleichen, als Beleuchtungssystem (oder Teilsystem) konfiguriert sein.
  • Detektoren: Für Bildgebungszwecke kann eine Mehrzahl von Bildsensoren verwendet werden, unter anderem, aber nicht beschränkt auf Photodiodenarrays, CCD-Kameras (Charge Coupled Device) oder CMOS-Bildsensoren (Complementary Metal Oxide Semiconductor). Wie hierin verwendet, können „Bildsensoren“ eindimensionale (lineare) oder zweidimensionale Anordnungssensoren sein. In vielen Fällen kann eine Kombination aus einem oder mehreren Bildsensoren und zusätzlichen optischen Komponenten, z. B. Linsen, Filtern, Aperturen, Membranen, Spiegeln und dergleichen, als Bildgebungssystem (oder Teilsystem) konfiguriert werden. In einigen Fällen können, z. B. wenn spektroskopische Messungen vom System anstelle der Bildgebung durchgeführt werden, geeignete Detektoren Photodioden, Lawinenphotodioden und Photovervielfacher beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Andere optische Komponenten: Die Hardwarekomponenten des spektroskopischen Mess- oder Bildgebungsmoduls können auch diverse optische Komponenten zum Lenken, Formen, Filtern oder Fokussieren von Lichtstrahlen durch das System beinhalten. Beispiele für geeignete optische Komponenten sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Linsen, Spiegel, Prismen, Aperturen, Beugungsgitter, farbige Glasfilter, Langpassfilter, Kurzpassfilter, Bandpassfilter, Schmalbandinterferenzfilter, Breitbandinterferenzfilter, dichroitische Reflektoren, optische Fasern, optische Wellenleiter und dergleichen. In einigen Fällen kann, wie oben erwähnt, das spektroskopische Mess- oder Bildgebungsmodul ferner eine oder mehrere Translationsstufen oder andere Bewegungssteuermechanismen umfassen, um Kapillardurchflusszellenvorrichtungen und -patronen relativ zu der Beleuchtung und/oder zu Detektions-/Bildgebungsuntersystemen oder umgekehrt zu bewegen.
  • Interne Totalreflexion: In einigen Fällen kann das optische Modul oder Teilsystem so ausgelegt sein, dass es die gesamte optisch transparente Wand der Kapillaren oder mikrofluidischen Kanäle in Durchflusszellenvorrichtungen und -patronen oder einen Teil davon als Wellenleiter zur Abgabe von Anregungslicht an das eine oder die mehreren Kapillar- oder Kanallumen über interne Totalreflexion verwendet. Wenn einfallendes Anregungslicht in einem Winkel zu einer Normalen zur Oberfläche auf die Oberfläche des Kapillar- oder Kanallumens trifft, der größer als der kritische Winkel ist (bestimmt durch die relativen Brechungsindizes des Kapillar- oder Kanalwandmaterials und des in der Kapillare oder dem Kanal enthaltenen wässrigen Puffers), tritt die interne Totalreflexion an der Oberfläche auf und breitet sich das Licht durch die Kapillar- oder Kanalwand entlang der Länge der Kapillare oder des Kanals aus. Die interne Totalreflexion erzeugt eine evaneszente Welle an der Lumenoberfläche, die über extrem kurze Strecken in das Lumeninnere eindringt und zur selektiven Anregung von Fluorophoren an der Oberfläche verwendet werden kann, z. B. markierten Nukleotiden, die von einer Polymerase über eine Festphasen-Primerverlängerungsreaktion in ein wachsendes Oligonukleotid eingebaut wurden.
  • Lichtdichte Gehäuse und Umgebungskontrollkammern: In einigen Implementierungen können die offenbarten Systeme ein lichtdichtes Gehäuse umfassen, um zu verhindern, dass Umgebungsstreulicht Blendung erzeugt und beispielsweise relativ schwache Fluoreszenzsignale verdeckt. In einigen Implementierungen können die offenbarten Systeme eine Umgebungssteuerkammer umfassen, die es dem System ermöglicht, unter einer streng gesteuerten Temperatur, einem streng gesteuerten Feuchtigkeitsniveau usw. zu arbeiten.
  • Prozessoren und Computer: In einigen Fällen können die offenbarten Systeme einen oder mehrere Prozessoren oder Computer umfassen. Der Prozessor kann ein Hardwareprozessor sein, wie beispielsweise eine zentrale Verarbeitungseinheit (CPU), eine Grafikverarbeitungseinheit (GPU), eine Allzweckverarbeitungseinheit oder eine Computerplattform. Der Prozessor kann aus einer Mehrzahl geeigneter integrierter Schaltungen, Mikroprozessoren, Logikvorrichtungen, feldprogrammierbaren Gate-Arrays (FPGAs) und dergleichen bestehen. In einigen Fällen kann der Prozessor ein Einzelkern- oder Mehrkernprozessor sein, oder es können mehrere Prozessoren für die Parallelverarbeitung konfiguriert sein. Obwohl die Offenbarung unter Bezugnahme auf einen Prozessor beschrieben ist, sind auch andere Arten von integrierten Schaltungen und Logikvorrichtungen anwendbar. Der Prozessor kann jede geeignete Datenoperationsfähigkeit aufweisen. Beispielsweise kann der Prozessor 512-Bit-, 256-Bit-, 128-Bit-, 64-Bit-, 32-Bit- oder 16-Bit-Datenoperationen ausführen.
  • Der Prozessor oder die CPU kann eine Folge von maschinenlesbaren Anweisungen ausführen, die in einem Programm oder einer Software enthalten sein können. Die Anweisungen können an einem Arbeitsspeicherort gespeichert werden. Die Anweisungen können an die CPU geleitet werden, die anschließend die CPU programmieren oder auf andere Weise konfigurieren können, um beispielsweise die Systemsteuerverfahren der vorliegenden Offenbarung zu implementieren. Beispiele für Operationen, die von der CPU ausgeführt werden, können das Abrufen, Dekodieren, Ausführen und Zurückschreiben beinhalten.
  • Einige Prozessoren können eine Verarbeitungseinheit eines Computersystems umfassen. Das Computersystem kann eine cloudbasierte Datenspeicherung und/oder cloudbasiertes Rechnen ermöglichen. In einigen Fällen kann das Computersystem mit Hilfe einer Kommunikationsschnittstelle betriebsmäßig mit einem Computernetzwerk („Netzwerk“) gekoppelt sein. Das Netzwerk kann das Internet, ein Intranet und/oder Extranet, ein Intranet und/oder Extranet, das mit dem Internet kommuniziert, oder ein lokales Netzwerk (LAN) sein. Das Netzwerk ist in einigen Fällen ein Telekommunikations- und/oder Datennetzwerk. Das Netzwerk kann einen oder mehrere Computerserver beinhalten, die verteiltes Rechnen ermöglichen können, wie beispielsweise cloudbasiertes Rechnen.
  • Das Computersystem kann auch Computerarbeitsspeicher oder Speicherorte (z. B. Direktzugriffsspeicher, Nur-Lese-Speicher, Flash-Speicher), elektronische Speichereinheiten (z. B. Festplatte), Kommunikationsschnittstellen (z. B. Netzwerkadapter) zur Kommunikation mit einem oder mehreren anderen Systemen sowie Peripheriegeräte wie Zwischenspeicher, andere Speichereinheiten, Datenspeichereinheiten und/oder elektronische Anzeigeadapter beinhalten. In einigen Fällen kann die Kommunikationsschnittstelle ermöglichen, dass der Computer mit einem oder mehreren zusätzlichen Vorrichtungen kommuniziert. Der Computer kann möglicherweise Eingabedaten von den gekoppelten Vorrichtungen zur Analyse empfangen. Arbeitsspeichereinheiten, Speichereinheiten, Kommunikationsschnittstellen und Peripheriegeräte können über einen Kommunikationsbus (durchgezogene Linien) mit dem Prozessor oder der CPU in Verbindung stehen, wie sie in ein Motherboard integriert sein können. Eine Arbeitsspeicher- oder Speichereinheit kann eine Datenspeichereinheit (oder ein Datenrepository) zum Speichern von Daten sein. Die Arbeitsspeicher- oder Speichereinheiten können Dateien wie Treiber, Bibliotheken und gespeicherte Programme speichern. Die Arbeitsspeicher- oder Speichereinheiten können Benutzerdaten speichern, z. B. Benutzereinstellungen und Benutzerprogramme.
  • Die hierin beschriebenen Systemsteuer-, Bildverarbeitungs- und/oder Datenanalyseverfahren können durch maschinenausführbaren Code implementiert werden, der in einem elektronischen Speicherort des Computersystems gespeichert ist, wie beispielsweise im Arbeitsspeicher oder der elektronischen Speichereinheit. Der maschinenausführbare oder maschinenlesbare Code kann in Form von Software bereitgestellt werden. Während der Verwendung kann der Code vom Prozessor ausgeführt werden. In einigen Fällen kann der Code von der Speichereinheit abgerufen und im Arbeitsspeicher gespeichert werden, damit der Prozessor darauf zugreifen kann. In einigen Situationen kann die elektronische Speichereinheit ausgeschlossen werden, und maschinenausführbare Anweisungen werden im Arbeitsspeicher gespeichert.
  • In einigen Fällen kann der Code vorkompiliert und für die Verwendung mit einer Maschine konfiguriert sein, deren Prozessor zur Ausführung des Codes angepasst ist. In einigen Fällen kann der Code während der Laufzeit kompiliert werden. Der Code kann in einer Programmiersprache bereitgestellt werden, die ausgewählt werden kann, damit der Code vorkompiliert oder wie kompiliert ausgeführt werden kann.
  • Einige Aspekte der hierin bereitgestellten Systeme und Verfahren können in Software enthalten sein. Verschiedene Aspekte der Technologie können als „Produkte“ oder „Herstellungserzeugnisse“ betrachtet werden, typischerweise in Form von maschinenausführbarem (oder prozessorausführbarem) Code und/oder zugehörigen Daten, die auf einer Art von maschinenlesbarem Medium weitergegeben werden oder in diesem vorhanden sind. Ein maschinenausführbarer Code kann auf einer elektronischen Speichereinheit wie einem Arbeitsspeicher (z. B. Nur-Lese-Speicher, Direktzugriffsspeicher, Flash-Speicher) oder einer Festplatte gespeichert werden. Medien vom Typ „Speicher“ können eine beliebiges oder alle des materiellen Speichers der Computer, Prozessoren oder dergleichen oder zugehörigen Module davon beinhalten, wie verschiedene Halbleiterspeicher, Bandlaufwerke, Plattenlaufwerke und dergleichen, die jederzeit einen nichtflüchtigen Speicher für die Softwareprogrammierung bereitstellen können. Die gesamte Software oder Teile davon können manchmal über das Internet oder verschiedene andere Telekommunikationsnetzwerke kommuniziert werden. Eine solche Kommunikation kann beispielsweise das Laden der Software von einem Computer oder Prozessor auf einen anderen ermöglichen, beispielsweise von einem Verwaltungsserver oder Hostcomputer auf die Computerplattform eines Anwendungsservers. Somit beinhaltet ein anderer Medientyp, der die Softwareelemente tragen kann, optische, elektrische und elektromagnetische Wellen, wie sie über physikalische Schnittstellen zwischen lokalen Vorrichtungen, über drahtgebundene und optische Festnetznetzwerke und über verschiedene Luftverbindungen verwendet werden. Die physischen Elemente, die solche Wellen tragen, wie drahtgebundene oder drahtlose Verbindungen, optische Verbindungen oder dergleichen, können auch als Medien betrachtet werden, die die Software tragen. Wie hierin verwendet, beziehen sich Begriffe wie „lesbares Medium“ für Computer oder Maschinen, sofern sie nicht auf nichtflüchtige, materielle „Speichermedien“ beschränkt sind, auf jedes Medium, das an der Bereitstellung von Anweisungen für einen Prozessor zur Ausführung beteiligt ist.
  • In einigen Fällen können die Systemsteuer-, Bildverarbeitungs- und/oder Datenanalyseverfahren der vorliegenden Offenbarung mittels eines oder mehrerer Algorithmen implementiert werden. Ein Algorithmus kann mittels Software bei Ausführung durch die zentrale Verarbeitungseinheit implementiert werden.
  • Systemsteuersoftware: In einigen Fällen kann das System einen Computer (oder Prozessor) und ein computerlesbares Medium umfassen, der bzw. das Code zum Bereitstellen einer Benutzeroberfläche sowie einer manuellen, halbautomatischen oder vollautomatischen Steuerung aller Systemfunktionen, z. B. Steuerung des einen oder der mehreren Fluiddurchflussmodule, des einen oder der mehreren Temperatursteuermodule und/oder des einen oder der mehreren Spektroskopie- oder Bildgebungsmoduls sowie anderer Datenanalyse- und Anzeigeoptionen beinhaltet. Der Systemcomputer oder -prozessor kann eine integrierte Komponente des Systems sein (z. B. ein in das Instrument eingebetteter Mikroprozessor oder ein darin eingebettetes Motherboard) oder kann ein eigenständiges Modul sein, beispielsweise ein Großrechner, ein Personal Computer oder ein Laptoprechner. Beispiele für Fluiddurchflusssteuerfunktionen, die von der Systemsteuersoftware bereitgestellt werden, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluidvolumendurchflussraten, Fluiddurchflussgeschwindigkeiten, der Zeitpunkt und die Dauer für die Proben- und Reagenzzugabe, die Pufferzugabe und die Spülschritte. Beispiele für Temperatursteuerfunktionen, die von der Systemsteuersoftware bereitgestellt werden, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, das Festlegen von Temperatursollwerten und die Steuerung des Zeitpunkts, der Dauer und der Rampenraten für Temperaturänderungen. Beispiele für spektroskopische Mess- oder Bildsteuerfunktionen, die von der Systemsteuersoftware bereitgestellt werden, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Autofokusfähigkeit, Steuerung der Belichtungszeiten und -intensitäten von Beleuchtungs- oder Anregungslicht, Steuerung der Bildaufnahmerate, Belichtungszeit und Datenspeicheroptionen .
  • Bildverarbeitungssoftware: In einigen Fällen kann das System ferner einen Computer (oder Prozessor) und ein computerlesbares Medium umfassen, der bzw. das Code zum Bereitstellen von Bildverarbeitungs- und Analysefunktionen beinhaltet. Beispiele für Bildverarbeitungs- und Analysefunktionen, die von der Software bereitgestellt werden können, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, eine manuelle, halbautomatische oder vollautomatische Anpassung der Bildbelichtung (z. B. Weißabgleich, Kontrastanpassung, Signalmittelung und andere Rauschunterdrückungsfunktionen usw.), automatisierte Kantenerkennung und Objektidentifikation (z. B. zur Identifizierung von klonal amplifizierten Clustern fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide auf der Lumenoberfläche von Kapillardurchflusszellenvorrichtungen), automatisierte statistische Analyse (z. B. zur Bestimmung der Anzahl klonal amplifizierte Cluster von Oligonukleotiden, die pro Flächeneinheit der Kapillarlumenoberfläche identifiziert wurden, oder für automatisierte Nukleotidbasendetektion in Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen) und manuelle Messfunktionen (z. B. zum Messen von Abständen zwischen Clustern oder anderen Objekten usw.). Optional können Instrumentensteuer- und Bildverarbeitungs-/Bildanalysesoftware als separate Softwaremodule geschrieben werden. In einigen Ausführungsformen können Instrumentensteuer- und Bildverarbeitungs-/Bildanalysesoftware in ein integriertes Paket eingebaut sein.
  • Beliebige diverser Bildverarbeitungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können zur Bildverarbeitung/Bildvorverarbeitung verwendet werden. Beispiele sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Canny-Kantenerkennungsverfahren, Canny-Deriche-Kantenerkennungsverfahren, Gradientenkantenerkennungsverfahren erster Ordnung (z. B. der Sobel-Operator), Differentialkantenerkennungsverfahren zweiter Ordnung, Phasenkongruenzkantenerkennungsverfahren (Phasenkohärenzkantenerkennungsverfahren), andere Bildsegmentierungsalgorithmen (z. B. Intensitätsschwellenwertbildung, Intensitätsclusteringverfahren, auf Intensitätshistogrammen basierende Verfahren usw.), Merkmals- und Mustererkennungsalgorithmen (z. B. die verallgemeinerte Hough-Transformation zum Erkennen beliebiger Formen, die kreisförmige Hough-Transformation usw.) und mathematische Analysealgorithmen (z. B. Fourier-Transformation, schnelle Fourier-Transformation, Wavelet-Analyse, Autokorrelation usw.) oder eine beliebige Kombination davon.
  • Nukleinsäuresequenzierungsysteme und -anwendungen: Die Nukleinsäuresequenzierung stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für eine Anwendung für die offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen (z. B. Kapillardurchflusszellen- oder -patronen und mikrofluidische Vorrichtungen und -patronen) und Bildgebungssysteme bereit. Bei vielen Sequenzierungstechnologien der „zweiten“ und der „dritten Generation“ wird ein massiv paralleler, zyklischer Anordnungsansatz für die Sequenzierung durch Nukleotideinbau durchgeführt, bei dem sich eine genaue Decodierung einer an einen festen Träger gebundenen einzelsträngigen Template-Oligonukleotidsequenz auf das erfolgreiche Klassifizieren von Signalen, die sich aus der schrittweisen Addition von A-, G-, C- und T-Nukleotiden durch eine Polymerase an einen komplementären Oligonukleotidstrang ergeben, stützt. Diese Verfahren erfordern typischerweise, dass das Oligonukleotid-Template mit einer bekannten Adaptersequenz fester Länge modifiziert wird, die an einem festen Träger (z. B. der einen oder den mehreren Lumenoberflächen der offenbarten Kapillardurchflusszellenvorrichtungen oder mikrofluidischen Chips) in zufälliger oder strukturierter Anordnung durch Hybridisierung an oberflächenangebundene Fängersonden (hierin auch als an die Durchflusszelleninnenflächen angebundene „Adapter“ oder „Primer“ bezeichnet) bekannter Sequenz angebracht ist, die zu jener der Adaptersequenz komplementär sind und anschließend durch eine zyklische Reihe von Primerverlängerungsreaktionen mit einzelner Basenaddition, wobei z. B. fluoreszenzmarkierte Nukleotide verwendet werden, um die Sequenz von Basen in den Template-Oligonukleotiden zu identifizieren, untersucht wird. Diese Prozesse erfordern daher die Verwendung miniaturisierter Fluidiksysteme, die eine präzise, reproduzierbare Steuerung des Zeitpunkts der Reagenzieneinführung in die Durchflusszelle, in der die Sequenzierungsreaktionen durchgeführt werden, und kleine Volumina bieten, um den Verbrauch kostspieliger Reagenzien zu verringern oder minimieren.
  • Bestehende im Handel erhältliche NGS-Durchflusszellen bestehen aus Glasschichten, die mit anderen Verfahren geätzt, geläppt und/oder verarbeitet wurden, um die engen Maßtoleranzen zu erfüllen, die für die Bildgebung, Kühlung und/oder andere Anforderungen erforderlich sind. Wenn Durchflusszellen als Verbrauchsmaterialien verwendet werden, führen die für ihre Herstellung erforderlichen kostspieligen Herstellungsprozesse zu Kosten pro Sequenzierungslauf, die zu hoch sind, um die Sequenzierung Wissenschaftlern und Medizinern in Forschungs- und klinischen Bereichen routinemäßig zugänglich zu machen.
  • Diese Offenbarung stellt ein Beispiel für kostengünstige Durchflusszellenarchitektur bereit, die kostengünstige Glas- oder Polymerkapillaren oder mikrofluidische Kanäle, Fluidadapter und Patronengehäuse beinhaltet. Die Verwendung von Glas- oder Polymerkapillaren, die in ihrer endgültigen Querschnittsgeometrie extrudiert werden, können mehrere hochpräzise und kostspielige Glasherstellungsprozesse überflüssig machen. Das robuste Einschränken der Ausrichtung der Kapillaren oder mikrofluidischen Kanäle und das Bereitstellen bequemer Fluidverbindungen unter Verwendung von geformten Kunststoff- und/oder Elastomerkomponenten verringert die Kosten weiter. Das Laserbonding der Komponenten des Polymerpatronengehäuses stellt ein schnelles und effizientes Mittel zum Versiegeln der Kapillare oder der mikrofluidischen Kanäle und zum strukturellen Stabilisieren der Kapillaren oder Kanäle und der Durchflusszellenpatrone bereit, ohne dass Befestigungselemente oder Klebstoffe erforderlich sind.
  • Die offenbarten Vorrichtungen und Systeme können konfiguriert sein, um eine Nukleinsäuresequenzierung unter Verwendung beliebiger diverser Sequenzierungsbiochemien durch „Sequenzierung durch Nukleotideinbau“, „Sequenzierung durch Nukleotidbindung“, „Sequenzierung durch Nukleotidbasenpaarung“ und „Sequenzierung durch Avidität“ durchzuführen. Die hierin offenbarten Verbesserungen im Design der Durchflusszellenvorrichtung, z. B. umfassend hydrophil beschichtete Oberflächen, die Vordergrundsignale für z. B. fluoreszenzmarkierte Nukleinsäurecluster maximieren, die darauf angeordnet sind, während sie gleichzeitig Hintergrundsignale minimieren, können zu Verbesserungen des CNR für Bilder führen, die für Base-Calling-Zwecke verwendet werden, in Kombination mit Verbesserungen im Design des optischen Bildgebungssystems für eine schnelle Bildgebung mit zwei Oberflächendurchflusszellen (umfassend gleichzeitige oder nahezu gleichzeitige Bildgebung der Durchflusszelleninnenflächen), die durch verbesserte Objektivlinsen- und/oder Tubuslinsendesigns erzielt werden, die größere Schärfentiefe und größere Sichtfelder sowie einen verringerten Reagenzienverbrauch (erreicht durch ein verbessertes Design der Durchflusszellen) bereitstellen, können zu drastischen Verbesserungen der Genauigkeit Base-Calling, verkürzten Bildgebungszykluszeiten, verkürzten Gesamtsequenzierungsreaktionszykluszeiten und Nukleinsäuresequenzierung mit höheren Durchsatz zu verringerten Kosten pro Base führen.
  • Die hierin offenbarten Systeme können so konfiguriert sein, dass sie beliebige diverser verschiedener Sequenzierungsmethodiken unter Verwendung diverser unterschiedlicher Sequenzierungschemien implementieren. Beispielsweise stellt 40 ein nicht einschränkendes Beispiel für einen Ablaufplan zum Implementieren eines Verfahrens zur Sequenzierung nach Avidität bereit. Ein Polymer-Nukleotid-Konjugat kann verwendet werden, um einen multivalenten Bindungskomplex mit einer Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen zu bilden, die an eine Trägeroberfläche angebunden sind, z. B. eine oder mehrere Innenflächen einer Durchflusszelle, so dass der multivalente Bindungskomplex eine signifikant längere Lebensdauer aufweist, als durch die Bindungswechselwirkungen zwischen einzelnen Nukleotiden und einzelnen geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen erzielt wird. Im Allgemeinen umfasst ein solcher Ansatz der Sequenzierung durch Avidität einen oder mehrere der folgenden Schritte: Hybridisieren von Zielnukleinsäuresequenzen mit Adapter-/Primersequenzen, die an die Trägeroberfläche angebunden sind; klonales Amplifizieren zur Erzeugung von Clustern amplifizierter Zielsequenzen auf der Trägeroberfläche; Inkontaktbringen der Trägeroberfläche mit einem Polymer-Nukleotid-Konjugat, umfassend eine Mehrzahl von Nukleotideinheiten, die an einen Polymerkern konjugiert sind, wobei das Polymer-Nukleotid-Konjugat ferner eine oder mehrere detektierbare Markierungen, z. B. Fluorophore, umfassen kann, um einen stabilen, multivalenten Bindungskomplex zu erzeugen; Auswaschen von überschüssigem, ungebundenem Polymer-Nukleotid-Konjugat; Detektieren multivalenter Bindungskomplexe, z. B. durch Fluoreszenzbildgebung der Trägeroberfläche; Identifizieren eines Nukleotids in der Zielnukleinsäuresequenz (Base-Calling); Destabilisieren des multivalenten Bindungskomplexes, z. B. durch Ändern der lonenstärke, der lonenzusammensetzung und/oder des pH-Werts des Puffers; Spülen der Durchflusszelle; und Durchführen einer Primerverlängerungsreaktion, um ein Nukleotid zu addieren, das die komplementäre Base für das identifizierte Nukleotid umfasst. Der Zyklus kann wiederholt werden, um zusätzliche Nukleotidbasen in der Sequenz zu identifizieren, gefolgt von der Verarbeitung und Zusammenstellung der Sequenzdaten. In einigen Fällen kann die Datenverarbeitung das Berechnen von Sequenzierungsleistungsmetriken, wie beispielsweise eines Q-Scores, in Echtzeit während der Durchführung des Sequenzierungsdurchgangs oder als Teil eines Datenverarbeitungsschritts nach dem Durchgang umfassen.
  • In einigen Fällen können die offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen, die in Kombination mit den hierin offenbarten optischen Bildgebungssystemen verwendet werden, jedem Nukleinsäuresequenzierungssystem einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Vorteile bieten: (i) verringerte fluidische Waschzeiten für Fluid (aufgrund einer verringerten unspezifischen Bindung und damit schnellere Sequenzierungszykluszeiten), (ii) verringerte Bildgebungszeiten (und damit schnellere Durchlaufzeiten für Assay-Messungs- und Sequenzierungszyklen), (iii) verringerte Anforderungen an die Gesamtarbeitsablaufzeit (aufgrund verringerter Zykluszeiten), (iv) verringerte Detektionsinstrumentierungskosten (aufgrund der Verbesserungen des CNR), (v) verbesserte Messgenauigkeit (Base-Calling) (aufgrund von Verbesserungen des CNR), (vi) verbesserte Reagenzstabilität und verringerte Anforderungen an den Reagenzienverbrauch (und damit reduzierte Reagenzienkosten) und (vii) weniger Laufzeitfehler aufgrund von Fehlern bei der Nukleinsäureamplifikation.
  • Die hierin offenbarten Verfahren, Vorrichtungen und Systeme zum Durchführen einer Nukleinsäuresequenzierung sind für diverse Sequenzierungsanwendungen und zum Sequenzieren von Nukleinsäuremolekülen geeignet, die aus beliebigen diverser Proben und Quellen stammen. In einigen Fällen können Nukleinsäuren aus beliebigen einer Vielzahl biologischer Proben extrahiert werden, z. B. Blutproben, Speichelproben, Urinproben, Zellproben, Gewebeproben und dergleichen. Beispielsweise können die offenbarten Vorrichtungen und System zur Analyse von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, die von beliebigen einer Vielzahl verschiedener Zell-, Gewebe- oder Probentypen stammen, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise können Nukleinsäuren aus Zellen oder Gewebeproben extrahiert werden, die einen oder mehrere Zelltypen umfassen, die von Eukaryoten (wie Tieren, Pflanzen, Pilzen, Protisten), Archaebakterien oder Eubakterien stammen. In einigen Fällen können Nukleinsäuren aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen wie anhaftenden oder nicht anhaftenden eukaryotischen Zellen extrahiert werden. Nukleinsäuren werden auf verschiedene Weise beispielsweise aus primären oder immortalisierten Zelllinien von Nagetieren, Schweinen, Katzen, Hunden, Rindern, Pferden, Primaten oder Menschen extrahiert. Nukleinsäuren können aus beliebigen diverser verschiedener Zell-, Organ- oder Gewebetypen extrahiert werden (z. B. weißen Blutkörperchen, roten Blutkörperchen, Blutplättchen, Epithelzellen, Endothelzellen, Neuronen, Gliazellen, Astrozyten, Fibroblasten, Skelettmuskelzellen, glatten Muskelzellen, Gameten oder Zellen aus Herz, Lunge, Gehirn, Leber, Niere, Milz, Bauchspeicheldrüse, Thymus, Blase, Magen, Kolon oder Dünndarm). Nukleinsäuren können aus normalen oder gesunden Zellen extrahiert werden. Alternativ oder in Kombination werden Säuren aus erkrankten Zellen wie Krebszellen oder aus pathogenen Zellen, die einen Wirt infizieren, extrahiert. Einige Nukleinsäuren können aus einer eigenen Untergruppe von Zelltypen extrahiert werden, z. B. Immunzellen (wie T-Zellen, zytotoxischen (Killer-)T-Zellen, Helfer-T-Zellen, Alpha-Beta-T-Zellen, Gamma-Delta-T-Zellen, T-Zell-Vorläufern, B-Zellen, B-Zell-Vorläufern, lymphoiden Stammzellen, myeloischen Vorläuferzellen, Lymphozyten, Granulozyten, natürlichen Killerzellen, Plasmazellen, Gedächtniszellen, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen, Mastzellen, Monozyten, dendritischen Zellen und/oder Makrophagen oder einer beliebigen Kombination davon), undifferenzierten menschlichen Stammzellen, menschlichen Stammzellen, die zur Differenzierung induziert wurden, seltenen Zellen (z. B. zirkulierenden Tumorzellen (CTCs), zirkulierenden Epithelzellen, zirkulierenden Endothelzellen, zirkulierenden Endometriumzellen, Knochenmarkszellen, Vorläuferzellen, Schaumzellen, Mesenchymzellen oder Trophoblasten). Andere Zellen werden in Betracht gezogen und stimmen mit der Offenbarung hierin überein.
  • Nukleinsäuren können gegebenenfalls an eine oder mehrere Nicht-Nukleotideinheiten wie Markierungen und andere kleine Moleküle, große Moleküle (wie Proteine, Lipide, Zucker usw.) und feste oder halbfeste Träger angebunden sein, beispielsweise durch kovalente oder nichtkovalente Bindungen entweder mit dem 5'- oder 3'-Ende der Nukleinsäure. Markierungen beinhalten jede Einheit, die unter Verwendung beliebiger diverser dem Fachmann bekannter Detektionsverfahren detektierbar ist, und machen somit das angebundene Oligonukleotid oder die angebundene Nukleinsäure ähnlich detektierbar. Einige Markierungen, z. B. Fluorophore, senden elektromagnetische Strahlung aus, die optisch detektierbar oder sichtbar ist. Alternativ oder in Kombination umfassen einige Markierungen ein Massen-Tag, das das markierte Oligonukleotid oder die markierte Nukleinsäure in Massenspektraldaten sichtbar macht, oder ein Redox-Tag, das das markierte Oligonukleotid oder die markierte Nukleinsäure durch Amperometrie oder Voltametrie detektierbar macht. Einige Markierungen umfassen einen magnetischen Tag, der die Trennung und/oder Reinigung des markierten Oligonukleotids oder der markierten Nukleinsäure erleichtert. Das Nukleotid oder Polynukleotid ist oft nicht an eine Markierung gebunden, und das Vorhandensein des Oligonukleotids oder der Nukleinsäure wird direkt detektiert.
  • Durchflusszellenvorrichtungen, die zum Sequenzieren konfiguriert sind: In einigen Fällen können eine oder mehrere Durchflusszellenvorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung für Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen konfiguriert sein, z. B. wobei zwei oder mehr Durchflusszellenvorrichtungsinnenflächen hydrophile Polymerbeschichtungen umfassen, die ferner eine oder mehrere Fängeroligonukleotide, z. B. Adapter/Primer-Oligonukleotide, oder andere Oligonukleotide, wie hierin offenbart, umfassen. In einigen Fällen können die hydrophilen, polymerbeschichteten Oberflächen der offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen eine Mehrzahl von daran angebundenen Oligonukleotiden umfassen, die zur Verwendung bei der Sequenzierung eines eukaryotischen Genoms ausgewählt wurden. In einigen Fällen können die hydrophilen, polymerbeschichteten Oberflächen der offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen eine Mehrzahl von daran angebundenen Oligonukleotiden umfassen, die zur Verwendung bei der Sequenzierung eines prokaryotischen Genoms oder Abschnitts davon ausgewählt wurden. In einigen Fällen können die hydrophilen, polymerbeschichteten Oberflächen der offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen eine Mehrzahl von daran angebundenen Oligonukleotiden umfassen, die zur Verwendung bei der Sequenzierung eines viralen Genoms oder Abschnitts davon ausgewählt wurden. In einigen Fällen können die hydrophilen, polymerbeschichteten Oberflächen der offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen eine Mehrzahl von daran angebundenen Oligonukleotiden umfassen, die zur Verwendung bei der Sequenzierung eines Transkriptoms ausgewählt wurden.
  • In einigen Fällen kann eine Durchflusszellenvorrichtung der vorliegenden Offenbarung eine erste Oberfläche in einer Ausrichtung umfassen, die im Allgemeinen dem Inneren des Durchflusskanals zugewandt ist, eine zweite Oberfläche in einer Ausrichtung, die im Allgemeinen dem Inneren des Durchflusskanals zugewandt ist und ferner im Allgemeinen der ersten Oberflache zugewandt ist oder parallel zu dieser verläuft, eine dritte Oberfläche, die im Allgemeinen dem Inneren eines zweiten Durchflusskanals zugewandt ist, und eine vierte Oberfläche, die im Allgemeinen dem Inneren des zweiten Durchflusskanals zugewandt ist und im Allgemeinen der dritten Oberfläche gegenüberliegt oder parallel dazu ist; wobei die zweite und die dritte Oberfläche auf einander gegenüberliegenden Seiten eines allgemein planaren Substrats angeordnet oder an diesen angebracht sein können, das ein reflektierendes, transparentes oder durchscheinendes Substrat sein kann. In einigen Fällen können sich eine oder mehrere Bildgebungsflächen innerhalb einer Durchflusszelle innerhalb der Mitte einer Durchflusszelle oder innerhalb oder als Teil einer Unterteilung zwischen zwei Untereinheiten oder Unterteilungen einer Durchflusszelle befinden, wobei die Durchflusszelle eine obere Oberfläche und eine untere Oberfläche umfassen kann, von der eine oder beide für einen solchen Detektionsmodus, wie er verwendet werden kann, transparent sein können; und wobei eine Oberfläche, die Oligonukleotidadapter/-primer umfasst, die an eine oder mehrere Polymerbeschichtungen angebunden sind, innerhalb des Lumens der Durchflusszelle platziert oder angeordnet sein kann. In einigen Fällen beinhalten die oberen und/oder unteren Oberflächen keine angebundenen Oligonukleotidadapter/-primer. In einigen Fällen umfassen die oberen und/oder unteren Oberflächen durchaus angebundene Oligonukleotidadapter/- primer. In einigen Fällen kann entweder die obere oder die untere Oberfläche angebundene Oligonukleotidadapter/-primer umfassen. Eine oder mehrere Oberflächen, die innerhalb des Lumens einer Durchflusszelle positioniert oder angeordnet sind, können auf einer Seite, einer gegenüberliegenden Seite oder beiden Seiten eines allgemein planaren Substrats platziert oder angebunden sein, das ein reflektierendes, transparentes oder durchscheinendes Substrat sein kann.
  • Im Allgemeinen kann mindestens eine Schicht der einen oder mehreren Schichten aus gering unspezifisch bindender Beschichtung auf den Durchflusszellenvorrichtungsoberflächen funktionelle Gruppen für die kovalente oder nichtkovalente Bindung von Oligonukleotidmolekülen umfassen, z. B. Adapter- oder Primersequenzen, oder die mindestens eine Schicht kann zum Zeitpunkt der Abscheidung auf der Trägeroberfläche bereits kovalent oder nicht kovalent angebundene Oligonukleotidadapter- oder -primersequenzen umfassen. In einigen Fällen können die Oligonukleotide, die an die Polymermoleküle von mindestens einer dritten Schicht angebunden sind, in mehreren Tiefen über die gesamte Schicht verteilt sein.
  • In einigen Fällen werden der Oligonukleotidadapter oder die Primermoleküle kovalent an das Polymer in Lösung gekoppelt, d. h. vor dem Koppeln oder Abscheiden des Polymers auf der Oberfläche. In einigen Fällen werden der Oligonukleotidadapter oder die Primermoleküle kovalent an das Polymer gekoppelt, nachdem es an die Oberfläche gekoppelt oder auf dieser abgeschieden wurde. In einigen Fällen umfasst mindestens eine hydrophile Polymerschicht mehrere kovalent gebundene Oligonukleotidadapter- oder Primermoleküle. In einigen Fällen umfassen mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier oder mindestens fünf Schichten eines hydrophilen Polymers mehrere kovalent gebundene Adapter- oder Primermoleküle.
  • In einigen Fällen können die Oligonukleotidadapter- oder Primermoleküle unter Verwendung einer Mehrzahl geeigneter Konjugationschemien, die dem Fachmann bekannt sind, an die eine oder mehreren Schichten eines hydrophilen Polymers gekoppelt werden. Beispielsweise können die Oligonukleotidadapter- oder Primersequenzen Einheiten umfassen, die mit Amingruppen, Carboxylgruppen, Thiolgruppen und dergleichen reaktiv sind. Beispiele für geeignete aminreaktive Konjugationschemien, die verwendet werden können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Reaktionen, an denen Isothiocyanat-, Isocyanat-, Acylazid-, NHS-Ester-, Sulfonylchlorid-, Aldehyd-, Glyoxal-, Epoxid-, Oxiran-, Carbonat-, Arylhalogenid-, Imidoester-, Carbodiimid-, Anhydrid- und Fluorphenylestergruppen beteiligt sind. Beispiele für geeignete carboxylreaktive Konjugationschemien beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Reaktionen, an denen Carbodiimidverbindungen beteiligt sind, z. B. wasserlösliches EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid·HCL). Beispiele für geeignete sulfydrylreaktive Konjugationschemien beinhalten Maleimide, Halogenacetyle und Pyridyldisulfide.
  • Eine oder mehrere Arten von Oligonukleotidmolekülen können an die Trägeroberfläche angelagert oder angebunden sein. In einigen Fällen können der eine oder die mehreren Arten von Oligonukleotidadaptern oder -primern Spacersequenzen, Adaptersequenzen zur Hybridisierung an Nukleinsäuresequenzen der adapterligierten Template-Bibliothek, Vorwärtsamplifikationsprimer, Rückwärtsamplifikationsprimer, Sequenzierungsprimer und/oder molekulare Barcodierungssequenzen oder eine beliebige Kombination davon umfassen. In einigen Fällen kann 1 Primer- oder Adaptersequenz an mindestens eine Schicht der Oberfläche gebunden sein. In einigen Fällen können mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr als 10 verschiedene Primer- oder Adaptersequenzen an mindestens eine Schicht der Oberfläche angebunden sein.
  • In einigen Fällen können die angebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder - primersequenzen eine Länge von etwa 10 Nukleotiden bis etwa 100 Nukleotiden aufweisen. In einigen Fällen können die angebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder -primersequenzen mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90 oder mindestens 100 Nukleotide lang sein. In einigen Fällen dürfen die angebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder -primersequenzen höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20 oder höchstens 10 Nukleotide lang sein. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Länge der angebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder - primersequenzen im Bereich von etwa 20 Nukleotiden bis etwa 80 Nukleotiden liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Länge der angebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder - primersequenzen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 24 Nukleotide.
  • Die Anzahl der Beschichtungsschichten und/oder die Materialzusammensetzung jeder Schicht wird in einigen Fällen so gewählt, dass die resultierende Oberflächendichte von Oligonukleotidadaptern/-primern (oder anderen angebundenen Molekülen) auf den beschichteten Durchflusszelleninnenflächen eingestellt wird. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidadaptern/-primern im Bereich von etwa 1000 Primermolekülen pro µm2 bis etwa 1.000.000 Primermolekülen pro µm2 liegen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern mindestens 1.000, mindestens 10.000, mindestens 100.000 oder mindestens 1.000.000 Moleküle pro µm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern höchstens 1.000.000, höchstens 100.000, höchstens 10.000 oder höchstens 1.000 Moleküle pro µm2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von Primern im Bereich von etwa 10.000 Molekülen pro µm2 bis etwa 100.000 Molekülen pro µm2 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Oberflächendichte von Primermolekülen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 455.000 Moleküle pro µm2. In einigen Fällen können die Oberflächeneigenschaften der Kapillar- oder Kanallumenbeschichtung, einschließlich der Oberflächendichte von angebundenen Oligonukleotidprimern, eingestellt werden, um beispielsweise die Spezifität und Effizienz der Festphasennukleinsäurehybridisierung und/oder die Festphasennukleinsäureamplifikationsrate, Spezifität und Effizienz zu verbessern oder optimieren.
  • In einigen Fällen können die angebundenen Adapter- oder Primersequenzen Modifikationen umfassen, die entworfen wurden, um die Spezifität und Effizienz der Nukleinsäureamplifikation, wie sie auf den Trägern mit geringer Bindung durchgeführt wird, zu erleichtern. Beispielsweise kann der Primer in einigen Fällen Polymerasestopppunkte umfassen, so dass die Strecke der Primersequenz zwischen dem Oberflächenkonjugationspunkt und der Modifikationsstelle immer in Einzelstrangform vorliegt und bei einigen helikaseabhängigen isothermen Amplifikationsverfahren als Beladungsstelle für 5'- bis 3'-Helikasen fungiert. Andere Beispiele für Primermodifikationen, die verwendet werden können, um Polymerasestopppunkte zu erzeugen, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Insertion einer PEG-Kette in das Grundgerüst des Primers zwischen zwei Nukleotiden in Richtung des 5'-Endes, die Insertion eines abasischen Nukleotids (d. h. eines Nukleotids, das weder eine Purin- noch eine Pyrimidinbase aufweist) oder einer Läsionsstelle, die von der Helikase umgangen werden kann.
  • Nukleinsäurehybridisierung: In einigen Fällen können die hierin offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungsoberflächen Vorteile bereitstellen, wenn sie allein oder in Kombination mit verbesserten Pufferformulierungen zur Durchführung von Festphasennukleinsäurehybridisierungs- und/oder Festphasennukleinsäureamplifikationsreaktionen als Teil von Genotypisierungs- oder Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen verwendet werden. In einigen Fällen können die hierin offenbaren polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen Vorteile in Bezug auf verbesserte Nukleinsäurehybridisierungs- und verbesserte Nukleinsäureamplifikationsraten und -spezifität bereitstellen, die durch einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Aspekte der vorliegenden Offenbarung erreicht werden können: (i) Primerdesign (z. B. Sequenz und/oder Modifikationen), (ii) Steuerung der Dichte des angebundenen Primers auf dem festen Träger, (iii) die Oberflächenzusammensetzung des festen Trägers, (iv) die Oberflächenpolymerdichte des festen Trägers, (v) die Verwendung verbesserter Hybridisierungsbedingungen vor und während der Amplifikation und/oder (vi) die Verwendung verbesserter Amplifikationsformulierungen, die die unspezifische Primeramplifikation verringern oder die Effizienz der Template-Amplifikation erhöhen.
  • In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Oberflächendichte von angebundenen Oligonukleotidadaptern oder -primern auf den beschichteten Durchflusszellenoberflächen und/oder den Abstand der angebundenen Adapters oder Primer von der beschichteten Durchflusszellenoberfläche zu variieren (z. B. durch Variieren der Länge eines Linkermoleküls, das verwendet wird, um den Adapter oder die Primer an die Oberfläche anzubinden), um den Träger für eine optimale Leistung bei Verwendung z. B. eines bestimmten Amplifikationsverfahrens „feinabzustimmen“, In einigen Fällen kann das Einstellen der Oberflächendichte von gebundenen Oligonukleotidadaptern oder -primern den Grad der spezifischen und/oder unspezifischen Amplifikation, die auf der Oberfläche beobachtet wird, auf eine Weise beeinflussen, die gemäß dem ausgewählten Amplifikationsverfahren variiert. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von angebundenen Oligonukleotidadaptern oder - primern durch Einstellen des Verhältnisses der zur Erzeugung der Trägeroberfläche verwendeten molekularen Komponenten variiert werden. Beispielsweise kann in dem Fall, dass ein Oligonukleotidprimer-PEG-Konjugat verwendet wird, um die letzte Schicht eines Trägers mit geringer Bindung zu erzeugen, das Verhältnis des Oligonukleotidprimer-PEG-Konjugats zu einem nicht konjugierten PEG-Molekül variiert werden. Die resultierende Oberflächendichte von gebundenen Primermolekülen kann dann unter Verwendung einer Mehrzahl von Techniken geschätzt oder gemessen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, die Verwendung von Radioisotopenmarkierungs- und -zählverfahren, die kovalente Kopplung eines spaltbaren Moleküls, das eine optisch detektierbare Markierung (z. B. eine fluoreszierende Markierung) umfasst, die von einer Trägeroberfläche eines definierten Bereichs abgespalten, in einem festen Volumen eines geeigneten Lösungsmittels gesammelt und dann durch Vergleich von Fluoreszenzsignalen mit denen für eine Kalibrierungslösung mit bekannter optischer Markierungskonzentration oder unter Verwendung von Fluoreszenzbildgebungstechniken quantifiziert werden kann, vorausgesetzt, dass die Markierungsreaktionsbedingungen und Bildaufnahmeeinstellungen sorgfältig berücksichtigt wurden, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzsignale linear mit der Anzahl der Fluorophore auf der Oberfläche korrelieren (z. B. dass es kein signifikantes Selbstquenching der Fluorophore auf der Oberfläche gibt).
  • Die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen entweder allein oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen kann in einigen Fällen relative Hybridisierungsraten ergeben, die etwa 2-fach bis etwa 20-fach schneller als jene für ein herkömmliches Hybridisierungsprotokoll sind. In einigen Fällen kann die relative Hybridisierungsrate mindestens 2-fach, mindestens 3-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 6-fach, mindestens 7-fach, mindestens 8-fach, mindestens 9-fach, mindestens 10-fach, mindestens 12-fach, mindestens 14-fach, mindestens 16-fach, mindestens 18-fach, mindestens 20-fach, mindestens 25-fach, mindestens 30-fach oder mindestens 40-fach so viel wie bei einem herkömmlichen Hybridisierungsprotokoll betragen.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Pufferformulierungen Gesamthybridisierungsreaktionszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % Abschluss der Hybridisierungsreaktion zu erreichen) von weniger als 60 Minuten, 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten, 15 Minuten, 10 Minuten oder 5 Minuten für beliebige dieser Abschlussmetriken ergeben.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Pufferformulierungen eine verbesserte Hybridisierungsspezifität im Vergleich zu der für ein herkömmliches Hybridisierungsprotokoll ergeben. In einigen Fällen ist die Hybridisierungsspezifität, die erreicht werden kann, besser als 1 Basenfehlpaarung bei 10 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 20 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 30 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 40 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 50 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 75 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 100 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 200 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 300 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 400 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 500 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 600 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 700 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 800 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 900 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 1.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 2.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 3.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 4.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 5.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 6.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 7.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 8.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 9.000 Hybridisierungsereignissen oder 1 Basenfehlpaarung bei 10.000 Hybridisierungsereignissen.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Pufferformulierungen eine verbesserte Hybridisierungseffizienz (z. B. die Fraktion verfügbarer Oligonukleotidprimer auf der Trägeroberfläche, die erfolgreich an Zieloligonukleotidsequenzen hybridisiert wurden) im Vergleich zu jener für ein herkömmliches Hybridisierungsprotokoll ergeben. In einigen Fällen ist die Hybridisierungseffizienz, die erreicht werden kann, besser als 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % für beliebige der unten spezifizierten Eingangskonzentrationen von Zieloligonukleotiden und in beliebigen der oben spezifizierten Hybridisierungsreaktionszeiten. In einigen Fällen, wenn z. B. die Hybridisierungseffizienz weniger als 100 % beträgt, kann die resultierende Oberflächendichte von Zielnukleinsäuresequenzen, die mit der Trägeroberfläche hybridisiert sind, geringer als die Oberflächendichte von Oligonukleotidadapter- oder -primersequenzen auf der Oberfläche sein.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen für Nukleinsäurehybridisierungsanwendungen (oder Nukleinsäureamplifikationsanwendungen) unter Verwendung herkömmlicher Hybridisierungsprotokolle (oder Amplifikationsprotokolle) oder verbesserter oder optimierter Hybridisierungsprotokolle (oder Amplifikationsprotokolle) zu einer verringerten Anforderung an die Eingangskonzentration der Zielnukleinsäuremoleküle (oder Probennukleinsäuremoleküle), die mit der Trägeroberfläche in Kontakt stehen, führen. Beispielsweise können in einigen Fällen die Zielnukleinsäuremoleküle (oder Probennukleinsäuremoleküle) mit der Trägeroberfläche in einer Konzentration im Bereich von etwa 10 pM bis etwa 1 µM (d. h. vor dem Anellieren oder Amplifizieren) in Kontakt gebracht werden. In einigen Fällen können die Zielnukleinsäuremoleküle (oder Probennukleinsäuremoleküle) in einer Konzentration von mindestens 10 pM, mindestens 20 pM, mindestens 30 pM, mindestens 40 pM, mindestens 50 pM, mindestens 100 pM, mindestens 200 pM, mindestens 300 pM, mindestens 400 pM, mindestens 500 pM, mindestens 600 pM, mindestens 700 pM, mindestens 800 pM, mindestens 900 pM, mindestens 1 nM, mindestens 10 nM, mindestens 20 nM, mindestens 30 nM, mindestens 40 nM, mindestens 50 nM, mindestens 60 nM, mindestens 70 nM, mindestens 80 nM, mindestens 90 nM, mindestens 100 nM, mindestens 200 nM, mindestens 300 nM, mindestens 400 nM, mindestens 500 nM, mindestens 600 nM, mindestens 700 nM, mindestens 800 nM, mindestens 900 nM oder mindestens 1 µM verabreicht werden. In einigen Fällen können die Zielnukleinsäuremoleküle (oder Probennukleinsäuremoleküle) in einer Konzentration von höchstens 1 µM, höchstens 900 nM, höchstens 800 nm, höchstens 700 nM, höchstens 600 nM, höchstens 500 nM, höchstens 400 nM, höchstens 300 nM, höchstens 200 nM, höchstens 100 nM, höchstens 90 nM, höchstens 80 nM, höchstens 70 nM, höchstens 60 nM, höchstens 50 nM, höchstens 40 nM, höchstens 30 nM, höchstens 20 nM, höchstens 10 nM, höchstens 1 nM, höchstens 900 pM, höchstens 800 pM, höchstens 700 pM, höchstens 600 pM, höchstens 500 pM, höchstens 400 pM, höchstens 300 pM, höchstens 200 pM, höchstens 100 pM, höchstens 90 pM, höchstens 80 pM, höchstens 70 pM, höchstens 60 pM, höchstens 50 pM, höchstens 40 pM, höchstens 30 pM, höchstens 20 pM oder höchstens 10 pM verabreicht werden. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise können in einigen Fällen die Zielnukleinsäuremoleküle (oder Probennukleinsäuremoleküle) im Bereich von etwa 90 pM bis etwa 200 nM liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Zielnukleinsäuremoleküle (oder Probennukleinsäuremoleküle) in einer Konzentration mit einem beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs verabreicht werden können, z. B. etwa 855 nM.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Hybridisierungspufferformulierungen zu einer Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen (oder Probenoligonukleotidmolekülen) (d. h. vor dem Durchführen einer nachfolgenden Festphasen- oder klonalen Amplifikationsreaktion) im Bereich von etwa 0,0001 Zieloligonukleotidmolekülen pro µm2 bis etwa 1.000.000 Zieloligonukleotidmolekülen pro µm2 führen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen mindestens 0,0001, mindestens 0,0005, mindestens 0,001, mindestens 0,005, mindestens 0,01, mindestens 0,05, mindestens 0,1, mindestens 0,5, mindestens 1, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400, mindestens 500, mindestens 600, mindestens 700, mindestens 800, mindestens 900, mindestens 1.000, mindestens 1.500, mindestens 2.000, mindestens 2.500, mindestens 3.000, mindestens 3.500, mindestens 4.000, mindestens 4.500, mindestens 5.000, mindestens 5.500, mindestens 6.000, mindestens 6.500, mindestens 7.000, mindestens 7.500, mindestens 8.000, mindestens 8.500, mindestens 9.000, mindestens 9.500, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000 mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000 oder mindestens 1.000.000 Moleküle pro µm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.500, höchstens 9.000, höchstens 8.500, höchstens 8.000, höchstens 7.500, höchstens 7.000, höchstens 6.500, höchstens 6.000, höchstens 5.500, höchstens 5.000, höchstens 4.500, höchstens 4.000, höchstens 3.500, höchstens 3.000, höchstens 2.500, höchstens 2.000, höchstens 1.500, höchstens 1.000, höchstens 900, höchstens 800 höchstens 700, höchstens 600, höchstens 500, höchstens 400, höchstens 300, höchstens 200, höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 1, höchstens 0,5, höchstens 0,1, höchstens 0,05, höchstens 0,01, höchstens 0,005, höchstens 0,001, höchstens 0,0005 oder höchstens 0,0001 Moleküle pro (µm2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen im Bereich von etwa 3.000 Molekülen pro µm2 bis etwa 20.000 Molekülen pro µm2 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 2.700 Moleküle pro µm2.
  • Anders ausgedrückt kann in einigen Fällen die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit verbesserten optimierten Hybridisierungspufferformulierungen zu einer Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen (oder Probenoligonukleotidmolekülen) (d. h. vor dem Durchführen einer nachfolgenden Festphasen- oder klonalen Amplifikationsreaktion) im Bereich von etwa 100 hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen pro mm2 bis etwa 1 × 1012 hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen pro mm2 führen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 4.000, mindestens 5.000, mindestens 6.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Moleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Moleküle pro mm2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen im Bereich von etwa 5.000 Molekülen pro mm2 bis etwa 50.000 Molekülen pro mm2 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 50.700 Moleküle pro mm2.
  • In einigen Fällen können die Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder Nukleinsäuremoleküle), die mit den Oligonukleotidadapter- oder die -primermolekülen hybridisiert sind, die an die Trägeroberfläche mit geringer Bindung angebunden sind, eine Länge von etwa 0,02 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb oder von etwa 0,1 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb aufweisen. In einigen Fällen können die Zieloligonukleotidmoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 0,6 kb lang, mindestens 0,7 kb lang, mindestens 0,8 kb lang, mindestens 0,9 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang, mindestens 20 kb lang, mindestens 30 kb lang oder mindestens 40 kb lang sein oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der mit dem hierin beschriebenen Bereich umfasst wird, z. B. mindestens 0,85 kb Länge.
  • In einigen Fällen können die Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle (z. B. Conkatamere) umfassen, die ferner Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen können die einzelsträngigen oder doppelsträngigen multimeren Nukleinsäuremoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang, mindestens 20 kb lang, mindestens 30 kb lang oder mindestens 40 kb lang sein oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der mit dem hierin beschriebenen Bereich umfasst wird, z. B. etwa 2,45 kb Länge.
  • In einigen Fällen können die Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle (z. B. Conkatamere) umfassen, die etwa 2 bis etwa 100 Kopien einer sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50, mindestens 55, mindestens 60, mindestens 65, mindestens 70, mindestens 75, mindestens 80, mindestens 85, mindestens 90, mindestens 95 und mindestens 100 betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit höchstens 100, höchstens 95, höchstens 90, höchstens 85, höchstens 80, höchstens 75, höchstens 70, höchstens 65, höchstens 60, höchstens 55, höchstens 50, höchstens 45, höchstens 40, höchstens 35, höchstens 30, höchstens 25, höchstens 20, höchstens 15, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3 oder höchstens 2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit im Bereich von etwa 4 bis etwa 60 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 17. Somit kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von hybridisierten Zielsequenzen in Bezug auf die Anzahl von Kopien einer Zielsequenz pro Flächeneinheit der Trägeroberfläche die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern überschreiten, selbst wenn die Hybridisierungseffizienz weniger als 100 % beträgt.
  • Nukleinsäureoberflächenamplifikation (NASA): Wie hierin verwendet, wird der Ausdruck „Nukleinsäureoberflächenamplifikation“ (NASA) austauschbar mit dem Ausdruck „Festphasennukleinsäureamplifikation“ (oder einfach „Festphasenamplifikation“) verwendet. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Nukleinsäureamplifikationsformulierungen beschrieben, die in Kombination mit den offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen verbesserte Amplifikationsraten, Amplifikationsspezifität und Amplifikationseffizienz bereitstellen. Wie hierin verwendet, bezieht sich die spezifische Amplifikation auf die Amplifikation von Oligonukleotidsträngen der Template-Bibliothek, die entweder kovalent oder nichtkovalent an den festen Träger angebunden wurden. Wie hierin verwendet, bezieht sich unspezifische Amplifikation auf die Amplifikation von Primerdimeren oder anderen Nicht-Template-Nukleinsäuren. Wie hierin verwendet, ist die Amplifikationseffizienz ein Maß für den Prozentsatz an angebundenen Oligonukleotiden auf der Trägeroberfläche, die während eines gegebenen Amplifikationszyklus oder einer gegebenen Amplifikationsreaktion erfolgreich amplifiziert werden. Eine Nukleinsäureamplifikation, die an hierin offenbarten Oberflächen durchgeführt wird, kann Amplifikationseffizienzen von mindestens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder mehr als 95 % erhalten, wie 98 % oder 99 %.
  • Mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung können beliebige diverser thermischer Zyklen oder isothermer Nukleinsäureamplifikationsschemata verwendet werden. Beispiele für Nukleinsäureamplifikationsverfahren, die mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung verwendet werden können, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Polymerasekettenreaktion (PCR), Mehrfachverdrängungsamplifikation (MDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation (NASBA), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), Echtzeit-SDA, Brückenamplifikation, isotherme Brückenamplifikation, Rolling-Circle-Amplifikation, Kreis-zu-Kreis-Amplifikation, helikaseabhängige Amplifikation, rekombinaseabhängige Amplifikation oder proteinabhängige Einzelstrangbindungsamplifikation.
  • In einigen Fällen können Verbesserungen der Amplifikationsrate, der Amplifikationsspezifität und der Amplifikationseffizienz erreicht werden, wenn die offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit Formulierungen der Amplifikationsreaktionskomponenten verwendet werden. Zusätzlich zum Einschluss von Nukleotiden, einer oder mehreren Polymerasen, Helikasen, einzelsträngigen Bindungsproteinen usw. (oder einer beliebigen Kombination davon) kann das Amplifikationsreaktionsgemisch auf verschiedene Arten eingestellt werden, um eine verbesserte Leistung zu erzielen, unter anderem, aber nicht beschränkt auf die Wahl des Puffertyps, des Puffer-pH-Werts, der organischen Lösungsmittelgemische, der Pufferviskosität, der Detergenzien und zwitterionischen Komponenten, der lonenstärke (einschließlich der Einstellung sowohl einwertiger als auch zweiwertiger lonenkonzentrationen), Antioxidationsmittel und Reduktionsmittel, Kohlenhydrate, BSA, Polyethylenglykol, Dextransulfat, Betain, anderer Additive und dergleichen.
  • Die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen kann zu erhöhten Amplifikationsraten im Vergleich zu jenen führen, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhalten werden. In einigen Fällen können die relativen Amplifikationsraten, die erreicht werden können, mindestens 2-fach, mindestens 3-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 6-fach, mindestens 7-fach, mindestens 8-fach, mindestens 9-fach, mindestens 1-0x, mindestens 12-fach, mindestens 14-fach, mindestens 16-fach, mindestens 18-fach oder mindestens 20-fach so hoch wie für die Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle für eines der oben beschriebenen Amplifikationsverfahren sein.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Pufferformulierungen Gesamtamplifikationsreaktionszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % Abschluss der Amplifikationsreaktion zu erreichen) von weniger als 180 Minuten, 120 Minuten, 90 Minuten, 60 Minuten, 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten, 15 Minuten, 10 Minuten, 5 Minuten, 3 Minuten, 1 Minute, 50 s, 40 s, 30 s, 20s oder 10 s für beliebige dieser Abschlussmetriken ergeben.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Pufferformulierungen schnellere Amplifikationsreaktionszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % Abschluss der Amplifikationsreaktion zu erreichen) von nicht mehr als 60 Minuten, 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten oder 10 Minuten ermöglichen. Gleichermaßen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Pufferformulierungen ermöglichen, dass Amplifikationsreaktionen in einigen Fällen in nicht mehr als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 oder nicht mehr als 30 Zyklen abgeschlossen werden.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen zu einer erhöhten spezifischen Amplifikation und/oder einer verringerten unspezifischen Amplifikation im Vergleich zu der unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhaltenen führen. In einigen Fällen beträgt das resultierende Verhältnis von spezifischer Amplifikation zu unspezifischer Amplifikation, das erreicht werden kann, mindestens 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1 oder 1,000:1.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen zu einer erhöhten Amplifikationseffizienz im Vergleich zu der unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhaltenen führen. In einigen Fällen ist die Hybridisierungseffizienz, die erreicht werden kann, besser als 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % für beliebige der oben spezifizierten Amplifikationsreaktionszeiten.
  • In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder Nukleinsäuremoleküle), die mit den Oligonukleotidadapter- oder die -primermolekülen hybridisiert sind, die an die Oberflächen der hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtung angebunden sind, eine Länge von etwa 0,02 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb oder von etwa 0,1 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb aufweisen. In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang oder mindestens 20 kb lang sein oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der von dem hierin beschriebenen Bereich umfasst wird, z. B. mindestens 0,85 kb lang.
  • In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle (z. B. Conkatamere) umfassen, die ferner Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen können die klonal amplifizierten einzelsträngigen oder doppelsträngigen multimeren Nukleinsäuremoleküle mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang oder mindestens 20 kb lang sein oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der von dem hierin beschriebenen Bereich umfasst wird, z. B. etwa 2,45 kb lang.
  • In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle (z. B. Conkatamere) umfassen, die etwa 2 bis etwa 100 Kopien einer sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50, mindestens 55, mindestens 60, mindestens 65, mindestens 70, mindestens 75, mindestens 80, mindestens 85, mindestens 90, mindestens 95 und mindestens 100 betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit höchstens 100, höchstens 95, höchstens 90, höchstens 85, höchstens 80, höchstens 75, höchstens 70, höchstens 65, höchstens 60, höchstens 55, höchstens 50, höchstens 45, höchstens 40, höchstens 35, höchstens 30, höchstens 25, höchstens 20, höchstens 15, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3 oder höchstens 2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit im Bereich von etwa 4 bis etwa 60 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 12. Somit kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Zielsequenzen in Bezug auf die Anzahl von Kopien einer Zielsequenz pro Flächeneinheit der Trägeroberfläche die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern überschreiten, selbst wenn die Hybridisierungs- und/oder Amplifikationseffizienz weniger als 100 % beträgt.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen zu einer erhöhten klonalen Kopienzahl im Vergleich zu der unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhaltenen führen. In einigen Fällen, in denen beispielsweise die klonal amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) verkettete, multimere Wiederholungen einer monomeren Zielsequenz umfassen, kann die klonale Kopienzahl wesentlich kleiner als diejenige sein, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhalten wird. Somit kann in einigen Fällen die klonale Kopienzahl im Bereich von etwa 1 Molekül bis etwa 100.000 Molekülen (z. B. Zielsequenzmolekülen) pro amplifizierter Kolonie liegen. In einigen Fällen kann die klonale Kopienzahl mindestens 1, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 50, mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 2.000, mindestens 3.000, mindestens 4.000, mindestens 5.000, mindestens 6.000, mindestens 7.000, mindestens 8.000, mindestens 9.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000 oder mindestens 100.000 Moleküle pro amplifizierter Kolonie betragen. In einigen Fällen kann die klonale Kopienzahl höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.000, höchstens 8.000, höchstens 7.000, höchstens 6.000, höchstens 5.000, höchstens 4.000, höchstens 3.000, höchstens 2.000, höchstens 1.000, höchstens 500, höchstens 100, höchstens 50, höchstens 10, höchstens 5 oder höchstens 1 Molekül pro amplifizierter Kolonie betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die klonale Kopienzahl im Bereich von etwa 2.000 Molekülen bis etwa 9.000 Molekülen liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die klonale Kopienzahl einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. in einigen Fällen etwa 2.220 Moleküle oder in anderen etwa 2 Moleküle.
  • Wie oben erwähnt, können in einigen Fällen die amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder Nukleinsäuremoleküle) verkettete, multimere Wiederholungen einer monomeren Zielsequenz umfassen. In einigen Fällen können die amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder Nukleinsäuremoleküle) mehrere Moleküle umfassen, von denen jedes eine einzelne monomere Zielsequenz umfasst. Somit kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen zu einer Oberflächendichte von Zielsequenzkopien führen, die im Bereich von etwa 100 Zielsequenzkopien pro mm2 bis etwa 1 × 1012 Zielsequenzkopien pro mm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Zielsequenzkopien mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 klonierte amplifizierte Zielsequenzmoleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Zielsequenzkopien höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000 höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Zielsequenzkopien pro mm2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von Zielsequenzkopien im Bereich von etwa 1.000 Zielsequenzkopien pro mm2 bis etwa 65.000 Zielsequenzkopien pro mm2 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Oberflächendichte von hybridisierten Zielsequenzkopien einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 49.600 Zielsequenzkopien pro mm2.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Amplifikationspufferformulierungen zu einer Oberflächendichte von klonal amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle (oder Probenoligonukleotidmoleküle) (oder -clustern) führen, die im Bereich von etwa 100 Molekülen pro mm2 bis etwa 1 × 1012 Kolonien pro mm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Moleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000 höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Moleküle pro mm2 betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen im Bereich von etwa 5.000 Molekülen pro mm2 bis etwa 50.000 Molekülen pro mm2 liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Kolonien einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 48.800 Moleküle pro mm2.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen ein Signal von den amplifizierten und markierten Nukleinsäurepopulationen (z. B. ein Fluoreszenzsignal) ergeben, das einen Varianzkoeffizienten von nicht mehr als 50 % aufweist, wie 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % oder weniger als 5 %.
  • Gleichermaßen kann in einigen Fällen die Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen allein oder in Kombination mit verbesserten oder optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen ein Signal von den amplifizierten und nicht markierten Nukleinsäurepopulationen ergeben, das einen Varianzkoeffizienten von nicht mehr als 50 % aufweist, wie 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % oder weniger als 5 %.
  • Fluoreszenzbildgebung von Oberflächen von hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen: Die offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen, die z. B. klonale Cluster von markierten Zielnukleinsäuremolekülen umfassen, die darauf angeordnet sind, können in beliebigen einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyseanwendungen verwendet werden, z. B. Nukleinsäurebasenunterscheidung, Nukleinsäurebasenklassifizierung, Nukleinsäure-Base-Calling, Nukleinsäuredetektionsanwendungen, Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen und auf Nukleinsäuren basierende (genetische und genomische) diagnostische Anwendungen. In vielen dieser Anwendungen können Fluoreszenzbildgebungstechniken verwendet werden, um Hybridisierungs-, Amplifikations- und/oder Sequenzierungsreaktionen zu überwachen, die an den Trägern mit geringer Bindung durchgeführt werden. Die Fluoreszenzbildgebung kann unter Verwendung beliebiger der hierin offenbaren optischen Bildgebungsmodule sowie von diversen Fluorophoren, Fluoreszenzbildgebungstechniken und anderen Fluoreszenzbildgebungsinstrumenten durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • In einigen Fällen kann die Leistung von Nukleinsäurehybridisierungs- und/oder - amplifikationsreaktionen unter Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen und Reaktionspufferformulierungen unter Verwendung von Fluoreszenzbildgebungstechniken bewertet werden, wobei das Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) der Bilder eine wichtige Metrik bei der Beurteilung der Amplifikationsspezifität und der unspezifischen Bindung an den Träger bereitstellt. CNR wird üblicherweise definiert als: CNR = (Signal - Hintergrund) / Rauschen. Der Hintergrundterm wird üblicherweise als das Signal angesehen, das für die interstitiellen Bereiche gemessen wird, die ein bestimmtes Merkmal (beugungsbegrenzter Fleck, DLS) in einem spezifizierten Bereich von Interesse (ROI) umgeben. Während das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), wie oben angegeben, häufig als Benchmark für die Gesamtsignalqualität angesehen wird, kann gezeigt werden, dass ein verbessertes CNR einen signifikanten Vorteil gegenüber SNR als Benchmark für die Signalqualität in Anwendungen bereitstellen kann, die eine schnelle Bilderfassung erfordern (z. B. Sequenzierungsanwendungen, für die Zykluszeiten reduziert oder minimiert werden sollten). Bei einem hohen CNR kann die Bildgebungszeit, die erforderlich ist, um eine genaue Signalunterscheidung zu erreichen (und somit ein genaues Detektieren von Basen bei Sequenzierungsanwendungen), selbst bei moderaten Verbesserungen des CNR drastisch reduziert werden.
  • Bei den meisten ensemblebasierten Sequenzierungsansätzen wird der Hintergrundterm typischerweise als das Signal gemessen, das mit „interstitiellen“ Regionen assoziiert ist. Zusätzlich zum „interstitiellen“ Hintergrund (Binter) existiert ein „intrastitieller“ Hintergrund (Bintra) innerhalb der separaten Regionen, die von amplifizierten DNA-Kolonien besetzt sind. Die Kombination dieser beiden Hintergrundsignalterme bestimmt das erreichbare CNR im Bild und wirkt sich anschließend direkt auf die Anforderungen an optische Instrumente, die Architekturkosten, die Reagenzienkosten, Laufzeiten, Kosten/Genom und letztendlich die Genauigkeit und Datenqualität für zyklische arraybasierte Sequenzierungsanwendungen aus. Das Binter-Hintergrundsignal stammt aus diversen Quellen; einige Beispiele sind unter anderem Autofluoreszenz von verbrauchbaren Durchflusszellen, unspezifische Adsorption von Detektionsmolekülen, die falsche Fluoreszenzsignale liefern, die das Vordergrundsignal in Bezug auf den ROI verdecken können, und das Vorhandensein unspezifischer DNA-Amplifikationsprodukte (z. B. solche, die aus Primerdimeren stammen). In typischen Next-Generation-Sequencing-Anwendungen (NGS-Anwendungen) wird dieses Hintergrundsignal im aktuellen Sichtfeld (FOV) über die Zeit gemittelt und subtrahiert. Das Signal, das von einzelnen DNA-Kolonien stammt (d. h. (S) - Binter im FOV), ergibt ein erkennbares Merkmal, das klassifiziert werden kann. In einigen Fällen kann der intrastitielle Hintergrund (Bintra) ein verfälschendes Fluoreszenzsignal liefern, das für das Ziel von Interesse nicht spezifisch ist, aber in demselben ROI vorhanden ist, wodurch Mittelung und Subtraktion weitaus schwieriger werden.
  • Die Implementierung der Nukleinsäureamplifikation auf hydrophilen, polymerbeschichteten Substratoberflächen der vorliegenden Offenbarung das Binter-Hintergrundsignal durch Reduzieren der unspezifischen Bindung verringern, zu Verbesserungen bei der spezifischen Nukleinsäureamplifikation führen und kann zu einer Abnahme der unspezifischen Amplifikation führen, die sich auf das Hintergrundsignal auswirken kann, das sowohl aus dem interstitiellen als auch aus dem intrastitiellen Bereich stammt. In einigen Fällen können die offenbarten Trägeroberflächen mit gering unspezifischer Bindung, die gegebenenfalls in Kombination mit verbesserten Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsreaktionspufferformulierungen verwendet werden, zu einer Verbesserung des CNR um den Faktor 2, 5, 10, 100, 200, 500 oder 1000 gegenüber denjenigen führen, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Hybridisierungs-, Amplifikations- und/oder Sequenzierungsprotokolle erreicht wurden. Obwohl hierin im Zusammenhang mit der Verwendung der Fluoreszenzbildgebung als Mess- oder Detektionsmodus beschrieben, gelten die gleichen Prinzipien für die Verwendung der offenbarten Träger mit gering unspezifischer Bindung und Nukleinsäurehybridisierungs- und -amplifikationsformulierungen auch für andere Detektionsmodi, einschließlich sowohl optischer und nicht optischer Detektionsmodi.
  • Alternative Sequenzierungsbiochemien: Zusätzlich zu dem oben beschriebenen Ansatz der Sequenzierung durch Nukleotideinbau sind die offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und optischen Bildgebungssysteme auch mit anderen aufkommenden Nukleinsäuresequenzierungsbiochemien kompatibel. Beispiele sind unter anderem der im US-Patent Nr. 10,655,176 B2 beschriebenen Ansatz der „Sequenzierung durch Nukleotidbindung“ und der im US-Patent Nr. 10,768,173 B2 beschriebenen Ansatz der „Sequenzierung durch Avidität“.
  • Der Ansatz der „Sequenzierung durch Nukleotidbindung“, wie er derzeit von Omniome, Inc. (San Diego, CA) entwickelt wird, basiert auf der Durchführung sich wiederholender Zyklen des Detektierens eines stabilisierten Komplexes, der sich an jeder Position entlang des Templates bildet (z. B. eines ternären Komplexes, der das geprimete Template (an eine Probenträgerstruktur angebunden), eine Polymerase und ein verwandtes Nukleotid für die Position beinhaltet) unter Bedingungen, die den kovalenten Einbau des verwandten Nukleotids in den Primer verhindern, und des anschließenden Verlängerns des Primers, um die Detektion der nächsten Position entlang des Templates zu ermöglichen. In dem Ansatz der Sequenzierung durch Bindung erfolgt die Detektion des Nukleotids an jeder Position des Templates vor der Verlängerung des Primers auf die nächste Position. Im Allgemeinen wird die Methodik verwendet, um die vier verschiedenen Nukleotidtypen, die an Positionen entlang eines Nukleinsäure-Templates vorhanden sein können, zu unterscheiden, indem jeder Typ eines ternären Komplexes (d. h. verschiedene Arten von ternären Komplexen, die sich in der Art des darin enthaltenen Nukleotids unterscheiden) eindeutig markiert wird oder die Reagenzien, die zur Bildung jeder Art von ternärem Komplex benötigt werden, separat abgegeben werden. In einigen Fällen kann die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung von beispielsweise dem verwandten Nukleotid oder der Polymerase umfassen, die am ternären Komplex beteiligt sind. Der Ansatz ist somit mit den offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und Bildgebungssystemen kompatibel.
  • Der Ansatz der „Sequenzierung durch Avidität“, wie er derzeit von Element Biosciences, Inc. (San Diego, CA) entwickelt wird, basiert auf der erhöhten Avidität (oder „funktionellen Affinität“), die sich aus der Bildung eines Komplexes ergibt, der mehrere einzelne nichtkovalente Bindungswechselwirkungen umfasst. Der Ansatz von Element basiert auf der Detektion eines multivalenten Bindungskomplexes, der zwischen einem fluoreszenzmarkierten Polymer-Nukleotid-Konjugat, einer Polymerase und einer Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuremolekülen gebildet wird, die an eine Probenträgerstruktur angebunden sind, wodurch der Detektions-/Base-Calling-Schritt vom Nukleotideinbauschritt getrennt werden kann. Die Fluoreszenzbildgebung wird verwendet, um den gebundenen Komplex zu detektieren und dadurch die Identität des N-+-1-Nukleotids in der Zielnukleinsäuresequenz zu bestimmen (wobei der Primerverlängerungsstrang N Nukleotide lang ist). Nach dem Bildgebungsschritt wird der multivalente Bindungskomplex aufgebrochen und weggewaschen, das korrekte blockierte Nukleotid wird in den Primerverlängerungsstrang eingebaut und der Zyklus wird wiederholt.
  • In einigen Fällen kann ein Polymer-Nukleotid-Konjugat der vorliegenden Offenbarung eine Mehrzahl von Nukleotideinheiten oder Nukleotidanalogoneinheiten umfassen, die an einen Polymerkern konjugiert sind, z. B. über das 5'-Ende des Nukleotids, entweder direkt oder über einen Linker. Als nicht einschränkendes Beispiel können die Nukleotideinheiten Ribonukleotideinheiten, Ribonukleotidanalogoneinheiten, Desoxyribonukleotideinheiten, Desoxyribonukleotidanalogonreste oder eine beliebige Kombination davon beinhalten. In einigen Fällen können die Nukleotide oder Nukleotidanaloga Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Thymidin, Desoxyuridin, Desoxycytidin, Adenosin, Guanosin, 5-Methyluridin und/oder Cytidin umfassen. In einigen Fällen können die Nukleotid- oder Nukleotidanalogoneinheiten ein Nukleotid umfassen, das modifiziert wurde, um die Verlängerung während einer Polymerasereaktion oder einer Sequenzierungsreaktion zu hemmen, wie beispielsweise wobei das mindestens eine Nukleotid oder Nukleotidanalogon ein Nukleotid, dem eine 3'-Hydroxylgruppe fehlt; ein Nukleotid, das modifiziert wurde, um eine Blockierungsgruppe an der 3'-Position zu enthalten; und/oder ein Nukleotid, das mit einer 3'-0-Azidogruppe, einer 3'-0-Azidomethylgruppe, einer 3'-0-Alkylhydroxylaminogruppe, einer 3'-Phosphorothioatgruppe, einer 3'-0-Malonylgruppe oder einer 3'-0-Benzylgruppe modifiziert wurde, ist.
  • In einigen Fällen kann der Polymerkern ein lineares oder verzweigtes Polymer umfassen, z. B. lineares oder verzweigtes Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol, Polyvinylalkohol, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polyglycin, Polyvinylacetat, ein Dextran, ein Protein oder andere solche Polymere oder Copolymere, die beliebige zwei oder mehr der vorgenannten enthalten, oder andere Polymere, die in dem Stand der Technik bekannt sind. In einigen Fällen ist das Polymer ein PEG. In einigen Fällen ist das Polymer ein verzweigtes PEG. In einigen Fällen kann ein verzweigtes Polymer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder mehr Verzweigungen oder Arme oder 2, 4, 8, 16, 32, 64 oder mehr Verzweigungen oder Arme umfassen. In einigen Fällen können die Verzweigungen oder Arme von einer zentralen Einheit ausstrahlen.
  • In einigen Fällen kann das Polymer-Nukleotid-Konjugat ferner eine oder mehrere detektierbare Markierungen umfassen, z. B. eine, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, fünfzehn, zwanzig oder mehr als zwanzig detektierbare Markierungen. In einigen Fällen können die eine oder mehreren detektierbaren Markierungen ein oder mehrere Fluorophore (z. B. Cyaninfarbstoff 3 (Cy3), Cyaninfarbstoff 5 (Cy5) usw.), einen oder mehrere Quantenpunkte, einen Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Donor (FRET-Donor) und/oder einen FRET-Akzeptor umfassen.
  • In einigen Fällen kann das Polymer-Nukleotid-Konjugat ferner eine Bindungseinheit umfassen, die an jede Verzweigung des Polymerkerns oder an eine Untergruppe von Verzweigungen angebunden ist. Beispiele für geeignete Bindungseinheiten sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Biotin, Avidin, Streptavidin oder dergleichen, Polyhistidindomänen, komplementäre gepaarte Nukleinsäuredomänen, G-Quartett bildende Nukleinsäuredomänen, Calmodulin, maltosebindendes Protein, Cellulase, Maltose, Saccharose, Glutathion-S-transferase, Glutathion, 0-6-Methylguanin-DNA-methyltransferase, Benzylguanin und Derivate davon, Benzylcystein und Derivate davon, ein Antikörper, ein Epitop, ein Protein A oder ein Protein G. Die Bindungseinheit kann jedes interaktive Molekül oder Fragment davon sein, von dem in dem Stand der Technik bekannt ist, dass es an Wechselwirkungen zwischen Proteinen, zwischen Proteinen und Liganden, zwischen Proteinen und Nukleinsäuren, zwischen Nukleinsäuren oder zwischen kleinmolekularen Wechselwirkungsdomänen oder -einheiten bindet oder diese erleichtert.
  • Wie oben erwähnt, wird bei dem Ansatz der Sequenzierung durch Avidität ein multivalenter Bindungskomplex zwischen z. B. einem fluoreszenzmarkierten Polymer-Nukleotid-Konjugat, einer Polymerase und einer Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuremolekülen gebildet, die an eine Probenträgerstruktur angebunden sind (z. B. eine Durchflusszellenoberfläche), wenn die Nukleotideinheiten des Polymer-Nukleotid-Konjugats zu einem Nukleotidrest der Zielsequenz komplementär sind. Die Stabilität des so gebildeten multivalenten Bindungskomplexes ermöglicht es, den Detektions-/Base-Calling-Schritt in einem Sequenzierungsreaktionszyklus vom Nukleotideinbauschritt zu trennen.
  • Die Stabilität des multivalenten Bindungskomplexes - ein ternärer Komplex, der zwischen zwei oder mehr Nukleotideinheiten des Polymer-Nukleotid-Konjugats, zwei oder mehr Polymerasemolekülen und zwei oder mehr geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen gebildet wird - wird durch die verlängerten Persistenzzeiten der Komplex belegt. Beispielsweise können in einigen Fällen die multivalenten Bindungskomplexe (ternäre Komplexe) eine Persistenzzeit von weniger als 0,5 Sekunden, weniger als 1 Sekunde, mehr als 1 Sekunde, mehr als 2 Sekunden, mehr als 3 Sekunden, mehr als 4 Sekunden, mehr als 5 Sekunden, mehr als 10 Sekunden, mehr als 15 Sekunden, mehr als 20 Sekunden, mehr als 30 Sekunden, mehr als 60 Sekunden, mehr als 120 Sekunden, mehr als 360 Sekunden, mehr als 720 Sekunden, mehr als 1.440 Sekunden, mehr als 3.600 Sekunden oder länger oder für eine Zeit innerhalb eines Bereichs, der durch beliebige zwei oder mehr dieser Werte definiert ist, aufweisen.
  • Die Verwendung von Polymer-Nukleotid-Konjugaten zur Bildung eines multivalenten Bindungskomplexes mit der Polymerase und der geprimeten Zielnukleinsäure führt zu einer effektiven lokalen Konzentration des Nukleotids, die gegenüber der durchschnittlichen Nukleotidkonzentration, die unter Verwendung einzelner nicht konjugierter oder nicht angebundener Nukleotide erreicht werden würde, um ein Vielfaches erhöht ist, wodurch wiederum sowohl die Stabilität des Komplexes verbessert als auch die Signalintensität nach Waschschritten erhöht wird. Die hohe Signalintensität bleibt während der gesamten Bindungs-, Wasch- und Bildgebungsschritte bestehen und trägt zu kürzeren Bildaufnahmezeiten bei. Nach dem Bildgebungsschritt kann der multivalente Bindungskomplex destabilisiert werden, z. B. durch Ändern der lonenzusammensetzung, der lonenstärke und/oder des pH-Werts des Puffers, und weggewaschen werden. Eine Primerverlängerungsreaktion kann dann durchgeführt werden, um den komplementären Strang um eine Base zu verlängern.
  • Leistung des Nukleinsäuresequenzierungssystems: In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme die eine oder mehrere der offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen umfassen, die in Kombination mit einem oder mehreren der offenbarten optischen Bildgebungssysteme verwendet werden, und bei denen gegebenenfalls eine der aufkommenden Sequenzierungsbiochemien verwendet wird, wie der oben beschriebene Ansatz der „Sequenzierung durch Einfangen“ (oder „Sequenzierung durch Avidität“), kann eine verbesserte Nukleinsäuresequenzierungsleistung bereitstellen, z. B. hinsichtlich verringerte Anforderungen an die Probeneingabe, verringerter Bildaufnahmezykluszeit, verringerter Sequenzierungsreaktionszykluszeit, verringerter Sequenzierungslaufzeit, verbesserter Genauigkeit des Base-Calling, verringerter Reagenzienverbrauch und -kosten, höheren Sequenzierungsdurchsatzes und verringerter Seq uenzieru ngskosten.
  • Nukleinsäureprobeneingabe (pM): In einigen Fällen können die Anforderungen an die Probeneingabe für das offenbarte System aufgrund der verbesserten Hybridisierungs- und Amplifikationseffizienz, die erreicht werden kann, und der Bilder mit hohem CNR, die für das Base-Calling aufgenommen werden können, unter Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen und Bildgebungssysteme erheblich verringert werden. In einigen Fällen kann die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe für die offenbarten Systeme im Bereich von etwa 1 pM bis etwa 10.000 pM liegen. In einigen Fällen kann die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe mindestens 1 pM, mindestens 2 pM, mindestens 5 pM, mindestens 10 pM, mindestens 20 pM, mindestens 50 pM, mindestens 100 pM, mindestens 200 pM, mindestens 500 pM, mindestens 1.000 pM, mindestens 2.000 pM, mindestens 5.000 pM, mindestens 10.000 pM betragen. In einigen Fällen kann die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe für die offenbarten Systeme höchstens 10.000 pM, höchstens 5.000 pM, höchstens 2.000 pM, höchstens 1.000 pM, höchstens 500 pM, höchstens 200 pM, höchstens 100 pM, höchstens 50 pM, höchstens 20 pM, höchstens 10 pM, höchstens 5 pM, höchstens 2 pM oder höchstens 1 pM betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe für die offenbarten Systeme in einigen Fällen im Bereich von etwa 5 pM bis etwa 500 pM liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 132 pM. In einem beispielhaften Fall reicht eine Nukleinsäureprobeneingabe von etwa 100 pM aus, um Signale für ein zuverlässiges Base-Calling zu erzeugen.
  • Nukleinsäureprobeneingabe (Nanogramm): In einigen Fällen kann die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe für die offenbarten Systeme im Bereich von etwa 0,05 Nanogramm bis etwa 1.000 Nanogramm liegen. In einigen Fällen kann die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe bei mindestens 0,05 Nanogramm, mindestens 0,1 Nanogramm, mindestens 0,2 Nanogramm, mindestens 0,4 Nanogramm, mindestens 0,6 Nanogramm, mindestens 0,8 Nanogramm, mindestens 1,0 Nanogramm, mindestens 2 Nanogramm, mindestens 4 Nanogramm, mindestens 6 Nanogramm, mindestens 8 Nanogramm, mindestens 10 Nanogramm, mindestens 20 Nanogramm, mindestens 40 Nanogramm, mindestens 60 Nanogramm, mindestens 80 Nanogramm, mindestens 100 Nanogramm, mindestens 200 Nanogramm, mindestens 400 Nanogramm, mindestens 600 Nanogramm, mindestens 800 Nanogramm oder mindestens 1.000 Nanogramm liegen. In einigen Fällen kann die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe höchstens 1.000 Nanogramm, höchstens 800 Nanogramm, höchstens 600 Nanogramm, höchstens 400 Nanogramm, höchstens 200 Nanogramm, höchstens 100 Nanogramm, höchstens 80 Nanogramm, höchstens 60 Nanogramm, höchstens 40 Nanogramm, höchstens 20 Nanogramm, höchstens 10 Nanogramm, höchstens 8 Nanogramm, höchstens 6 Nanogramm, höchstens 4 Nanogramm, höchstens 2 Nanogramm, höchstens 1 Nanogramm, höchstens 0,8 Nanogramm, höchstens 0,6 Nanogramm, höchstens 0,4 Nanogramm, höchstens 0,2 Nanogramm, höchstens 0,1 Nanogramm oder höchstens 0,05 Nanogramm betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe für die offenbarten Systeme in einigen Fällen im Bereich von etwa 0,6 Nanogramm bis etwa 400 Nanogramm liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Anforderung an die Nukleinsäureprobeneingabe einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 2,65 Nanogramm.
  • # FOV-Bilder, die zum Kacheln der Durchflusszelle erforderlich sind: In einigen Fällen ist das Sichtfeld (FOV) des offenbarten optischen Bildgebungsmoduls ausreichend groß, dass eine Mehrkanal-Durchflusszelle (oder Mehrbahnen-Durchflusszelle) (d. h. die Fluidkanalteile davon) der vorliegenden Offenbarung durch Kacheln von etwa 10 FOV-Bildern (oder „Frames“) bis etwa 1.000 FOV-Bildern (oder „Frames“) abgebildet werden kann. In einigen Fällen kann ein Bild der gesamten Mehrkanal-Durchflusszelle das Kacheln von mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 150, mindestens 200, mindestens 250, mindestens 300, mindestens 350, mindestens 400, mindestens 450, mindestens 500, mindestens 550, mindestens 600, mindestens 650, mindestens 700, mindestens 750, mindestens 800, mindestens 850, mindestens 900, mindestens 950 oder mindestens 1.000 FOV-Bildern (oder „Frames“) erfordern. In einigen Fällen kann ein Bild der gesamten Mehrkanal-Durchflusszelle das Kacheln von höchstens 1.000, höchstens 950, höchstens 900, höchstens 850, höchstens 800, höchstens 750, höchstens 700, höchstens 650, höchstens 600, höchstens 550, höchstens 500, höchstens 450, höchstens 400, höchstens 350, höchstens 300, höchstens 250, höchstens 200, höchstens 150, höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80 höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20 oder höchstens 10 FOV-Bildern (oder „Frames“) erfordern. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen ein Bild der gesamten Mehrkanal-Durchflusszelle das Kacheln von etwa 30 bis etwa 100 FOV-Bildern erfordern. Der Fachmann wird erkennen, dass in einigen Fällen die Anzahl der erforderlichen FOV-Bilder einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 54 FOV-Bilder.
  • Bildgebungszykluszeit: In einigen Fällen ermöglicht die Kombination aus großem SOV, Bildsensorreaktionsempfindlichkeit und/oder schnellen FOV-Translationszeiten verkürzte Bildgebungszykluszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um eine ausreichende Anzahl von FOV-Bildern zu detektieren, um die gesamte Mehrkanal-Durchflusszelle (oder deren Fluidkanalteile) zu kacheln. In einigen Fällen kann die Bildgebungszykluszeit im Bereich von etwa 10 Sekunden bis etwa 10 Minuten liegen. In einigen Fällen kann die Bildgebungszykluszeit mindestens 10 Sekunden, mindestens 20 Sekunden, mindestens 30 Sekunden, mindestens 40 Sekunden, mindestens 50 Sekunden, mindestens 1 Minute, mindestens 2 Minuten, mindestens 3 Minuten, mindestens 4 Minuten, mindestens 5 Minuten, mindestens 6 Minuten, mindestens 7 Minuten, mindestens 8 Minuten, mindestens 9 Minuten oder mindestens 10 Minuten betragen. In einigen Fällen kann die Bildgebungszykluszeit höchstens 10 Minuten, höchstens 9 Minuten, höchstens 8 Minuten, höchstens 7 Minuten, höchstens 6 Minuten, höchstens 5 Minuten, höchstens 4 Minuten, höchstens 3 Minuten, höchstens 2 Minuten, höchstens 1 Minute, höchstens 50 Sekunden, höchstens 40 Sekunden, höchstens 30 Sekunden, höchstens 20 Sekunden oder höchstens 10 Sekunden betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Bildgebungszykluszeit in einigen Fällen im Bereich von etwa 20 Sekunden bis etwa 1 Minute liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass in einigen Fällen die Bildgebungszykluszeit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 57 Sekunden.
  • Sequenzierungszykluszeit: In einigen Fällen können verkürzte Sequenzierungsreaktionsschritte, z. B. aufgrund reduzierter Waschzeitanforderungen für die offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellen, zu verkürzten Gesamtsequenzierungszykluszeiten führen. In einigen Fällen können die Sequenzierungszykluszeiten für die offenbarten Systeme im Bereich von etwa 1 Minute bis etwa 60 Minuten liegen. In einigen Fällen kann die Sequenzierungszykluszeit mindestens 1 Minute, mindestens 2 Minuten, mindestens 3 Minuten, mindestens 4 Minuten, mindestens 5 Minuten, mindestens 6 Minuten, mindestens 7 Minuten, mindestens 8 Minuten, mindestens 9 Minuten, mindestens 10 Minuten, mindestens 15 Minuten, mindestens 20 Minuten, mindestens 25 Minuten, mindestens 30 Minuten, mindestens 35 Minuten, mindestens 40 Minuten, mindestens 45 Minuten, mindestens 50 Minuten, mindestens 55 Minuten oder mindestens 60 Minuten betragen. In einigen Fällen kann die Sequenzierungsreaktionszykluszeit höchstens 60 Minuten, höchstens 55 Minuten, höchstens 50 Minuten, höchstens 45 Minuten, höchstens 40 Minuten, höchstens 35 Minuten, höchstens 30 Minuten, höchstens 25 Minuten, höchstens 20 Minuten, höchstens 15 Minuten, höchstens 10 Minuten, höchstens 9 Minuten, höchstens 8 Minuten, höchstens 7 Minuten, höchstens 6 Minuten, höchstens 5 Minuten, höchstens 4 Minuten, höchstens 3 Minuten höchstens 2 Minuten oder höchstens 1 Minute betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Sequenzierungszykluszeit in einigen Fällen im Bereich von etwa 2 Minuten bis etwa 15 Minuten liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass in einigen Fällen die Sequenzierungszykluszeit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 1 Minute, 12 Sekunden.
  • Sequenzierungsleseweiten: In einigen Fällen können die verbesserten CNR-Bilder, die unter Verwendung der offenbarten hydrophilen, polymerbeschichteten Durchflusszellenvorrichtungen in Kombination mit den offenbarten Bildgebungssystemen erzielt werden können, und in einigen Fällen die Verwendung milderer Sequenzierungsbiochemien längere Sequenzierungsleseweiten für die offenbarten Systeme ermöglichen. In einigen Fällen kann die maximale Leseweite (Einzellesung) im Bereich von etwa 50 bp bis etwa 500 bp liegen. In einigen Fällen kann die maximale Leseweite (Einzellesung) mindestens 50 bp, mindestens 100 bp, mindestens 150 bp, mindestens 200 bp, mindestens 250 bp, mindestens, 300 bp, mindestens 350 bp, mindestens 400 bp, mindestens 450 bp oder mindestens 500 bp betragen. In einigen Fällen beträgt die maximale Leseweite (Einzellesung) höchstens 500 bp, höchstens 450 bp, höchstens 400 bp, höchstens 350 bp, höchstens 300 bp, höchstens 250 bp, höchstens 200 bp, höchstens 150 bp, höchstens 100 bp oder höchstens 50 bp. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die maximale Leseweite (Einzellesung) im Bereich von etwa 100 bis etwa 450 bp liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass in einigen Fällen die maximale Leselänge (Einzellesung) einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 380 bp.
  • Sequenzierungslaufzeit: In einigen Fällen kann die Sequenzierungslaufzeit für die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme im Bereich von etwa 8 Stunden bis etwa 20 Stunden liegen. In einigen Fällen beträgt die Sequenzierungslaufzeit mindestens 8 Stunden, mindestens 9 Stunden, mindestens 10 Stunden, mindestens 12 Stunden, mindestens 14 Stunden, mindestens 16 Stunden, mindestens 18 Stunden oder mindestens 20 Stunden. In einigen Fällen beträgt die Sequenzierungslaufzeit höchstens 20 Stunden, höchstens 18 Stunden, höchstens 16 Stunden, höchstens 14 Stunden, höchstens 12 Stunden, höchstens 10 Stunden, höchstens 9 Stunden oder höchstens 8 Stunden. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann die Sequenzierungslaufzeit in einigen Fällen im Bereich von etwa 10 Stunden bis etwa 16 Stunden liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass in einigen Fällen die Sequenzierungslaufzeit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 7 Stunden, 35 Minuten.
  • Durchschnittliche Genauigkeit beim Base-Calling: In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme eine durchschnittliche Genauigkeit beim Base-Calling von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 94 %, mindestens 96 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,5 %, mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % Korrektheit im Verlauf eines Sequenzierungslaufs bereitstellen. In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme eine durchschnittliche Genauigkeit beim Base-Calling von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 94 %, mindestens 96 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,5 %, mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % Korrektheit pro jeweils gecallter 1.000 Basen, 10.0000 Basen, 25.000 Basen, 50.000 Basen, 75.000 Basen oder 100.000 Basen bereitstellen.
  • Durchschnittlicher Q-Score: In einigen Fällen kann die Qualität oder Genauigkeit eines Sequenzierungslaufs durch Berechnung eines Phred-Qualitätsfaktors (auch als Qualitätsfaktor oder „Q-Score“ bezeichnet) bewertet werden, der die Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Base vom Sequenzierungssystem nicht korrekt gecallt werden, anzeigt. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Genauigkeit des Base-Calling für eine bestimmte Sequenzierungschemie und/oder ein bestimmtes Sequenzierungssystem für einen großen empirischen Datensatz bewertet werden, der aus der Durchführung von Sequenzierungsläufen an einer Bibliothek bekannter Nukleinsäuresequenzen abgeleitet wurde. Der Q-Score kann dann gemäß der folgenden Gleichung berechnet werden: Q = − 10 L o g 10 P
    Figure DE202021001858U1_0003
    wobei P die Base-Calling-Fehlerwahrscheinlichkeit ist. Ein Q-Score von 30 gibt beispielsweise die Wahrscheinlichkeit an, dass ein Base-Calling-Fehler von 1 pro 1000 gecallter Basen auftritt (oder eine Base-Calling-Genauigkeit von 99,9 %).
  • In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme eine genauere Basenauslesung bereitstellen. In einigen Fällen können beispielsweise die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme einen Q-Score für die Base-Calling-Genauigkeit über einen Sequenzierungslauf bereitstellen, der im Bereich von etwa 20 bis etwa 50 liegt. In einigen Fällen kann der durchschnittliche Q-Score für den Lauf mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45 oder mindestens 50 betragen. Der Fachmann wird erkennen, dass der durchschnittliche Q-Score einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 32.
  • Q-Score vs. % identifizierte Nukleotide: In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme einen Q-Score von mehr als 20 für mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % der identifizierten terminalen (oder N + 1) Nukleotide bereitstellen. In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme einen Q-Score von mehr als 25 für mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % der identifizierten terminalen (oder N + 1) Nukleotide bereitstellen. In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme einen Q-Score von mehr als 30 für mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % der identifizierten terminalen (oder N + 1) Nukleotide bereitstellen. In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme einen Q-Score von mehr als 35 für mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % der identifizierten terminalen (oder N + 1) Nukleotide bereitstellen. In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme einen Q-Score von mehr als 40 für mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % der identifizierten terminalen (oder N + 1) Nukleotide bereitstellen. In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme einen Q-Score von mehr als 45 für mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % der identifizierten terminalen (oder N + 1) Nukleotide bereitstellen. In einigen Fällen können die offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung einen Q-Score von mehr als 50 für mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % der identifizierten terminalen (oder N + 1) Nukleotide bereitstellen.
  • Reagenzienverbrauch: In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme niedrigere Reagenzienverbrauchsraten und Kosten aufweisen, beispielsweise durch die Verwendung der offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und fluidischen Systeme, die Fluidkanalvolumina und Totvolumina minimieren. In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme daher durchschnittlich mindestens 5 % weniger, mindestens 10 % weniger, mindestens 15 % weniger, mindestens 20 % weniger, mindestens 25 % weniger, mindestens 30 % weniger, mindestens 35 % weniger, mindestens 40 % weniger, mindestens 45 % weniger oder mindestens 50 % weniger Reagens pro Volumen pro sequenzierter Gbase erfordern, als ein Illumina MiSeq-Sequenzer verbraucht.
  • Sequenzierungsdurchsatz: In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme einen Sequenzierungsdurchsatz im Bereich von etwa 50 Gbase/Lauf bis etwa 200 Gbase/Lauf bereitstellen. In einigen Fällen kann der Sequenzierungsdurchsatz mindestens 50 Gbase/Lauf, mindestens 75 Gbase/Lauf, mindestens 100 Gbase/Lauf, mindestens 125 Gbase/Lauf, mindestens 150 Gbase/Lauf, mindestens 175 Gbase/Lauf oder mindestens 200 Gbase/Lauf betragen. In einigen Fällen kann der Sequenzierungsdurchsatz höchstens 200 Gbase/Lauf, höchstens 175 Gbase/Lauf, höchstens 150 Gbase/Lauf, höchstens 125 Gbase/Lauf, höchstens 100 Gbase/Lauf, höchstens 75 Gbase/Lauf oder höchstens 50 Gbase/Lauf betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise kann der Sequenzierungsdurchsatz im Bereich von etwa 75 Gbase/Lauf bis etwa 150 Gbase/Lauf liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass in einigen Fällen der Sequenzierungsdurchsatz einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 119 Gbase/Lauf.
  • Sequenzierungskosten: In einigen Fällen können die offenbarten Nukleinsäuresequenzierungssysteme eine Nukleinsäuresequenzierung zu Kosten im Bereich von etwa 5 USD pro Gbase bis etwa 30 USD pro Gbase bereitstellen. In einigen Fällen können die Sequenzierungskosten mindestens 5 USD pro Gbase, mindestens 10 USD pro Gbase, mindestens 15 USD pro Gbase, mindestens 20 USD pro Gbase, mindestens 25 USD pro Gbase oder mindestens 30 USD pro Gbase betragen. In einigen Fällen können die Sequenzierungskosten höchstens 30 USD pro Gbase, höchstens 25 USD pro Gbase, höchstens 20 USD pro Gbase, höchstens 15 USD pro Gbase, höchstens 10 USD pro Gbase oder höchstens 30 USD pro Gbase betragen. Beliebige der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte können kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist, beispielsweise können die Sequenzierungskosten in einigen Fällen im Beriech von etwa 10 USD pro Gbase bis etwa 15 USD pro Gbase liegen. Der Fachmann wird erkennen, dass in einigen Fällen die Sequenzierungskosten einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen können, z. B. etwa 7,25 USD pro Gbase.
  • BEISPIELE
  • Diese Beispiele werden nur zur Veranschaulichung bereitgestellt und sollen den Umfang der hierin bereitgestellten Patentansprüche nicht einschränken.
  • Beispiel 1 - Designspezifikationen für ein Fluoreszenzbildgebungsmodul für Genomikanwendungen
  • Ein nicht einschränkendes Beispiel für Designspezifikationen für ein Fluoreszenzbildgebungsmodul der vorliegenden Offenbarung wird in Tabelle 1 bereitgestellt. Tabelle 1. Beispiele für Designspezifikationen für ein Fluoreszenzbildgebungsmodul für Genomikanwendungen.
    Designparameter Spezifikation
    Numerische Apertur ≥ 0,3
    Bildqualität Beugungsbegrenzt
    Sichtfeld (FOV) > 2,0 mm2
    Bildebenenkrümmung Beste Brennebene innerhalb von 100 nm für > 90 % des SOV, innerhalb von 150 nm für 99 % des SOV und innerhalb von 200 nm für das gesamte SOV
    Bildverzerrung < 0,5 % über das SOV
    Vergrößerung 2-fach bis 20-fach
    Pixelgröße der Kamera in der Probenebene ≥ 2-Fache der MTF-Grenze (MTF, Modulationsübertragungsfunktion) des optischen Systems
    Deckglasdicke > 700 µm
    Anzahl der Fluoreszenzbi ldgebungskanäle ≥ 3
    Chromatischer Brennebenendifferenz bei der Kamera zwischen allen Bildkanälen ≤ 100 nm äquivalent in der Probenebene
    Anzahl der AF-Kanäle 1
    Bildgebungszeit ≤ 2 Sekunden pro SOV
    Autofokus Einzelschritt-Autofokus mit Fehlerkorrektur
    Autofokusgenauigkeit < 100 nm
    Abtaststufenschritt und Einschwingzeit < 0,4 Sekunden
    Kanalspezifische optimierte Tubuslinse 1 pro Bildgebungskanal
    Beleuchtungsstrahlengang Flüssiger Lichtleiter mit unterfüllter Eintrittsapertur
  • Beispiel 2 - Herstellung von mikrofluidischen Durchflusszellenvorrichtungen aus Glas
  • Die Wafer-Scale-Herstellung von mikrofluidischen Vorrichtungen zur Verwendung als Durchflusszellen kann beispielsweise aus einer, zwei oder drei Glasschichten, z. B. Borosilikatglas, Kieselglas oder Quarz, unter Verwendung einer der in 36A-36C dargestellten Verfahren konstruiert werden und einer Verarbeitungstechnik wie fokussierter Femtosekundenlaserphotoablation und/oder Laserglasbindung erfolgen.
  • In 36A wird ein erster Wafer mit einem Laser (z. B. der Femtosekundenlaserstrahlung erzeugt) verarbeitet, um das Wafermaterial abzutragen und eine strukturierte Oberfläche bereitzustellen. Die strukturierte Waferoberfläche kann eine Mehrzahl von mikrofluidischen Vorrichtungen umfassen (z. B. 12 Vorrichtungen pro Wafer mit 210 mm Durchmesser), von denen jede eine Mehrzahl von Fluidkanälen umfassen kann. Der verarbeitete Wafer kann dann gewürfelt werden, um einzelne mikrofluidische Chips zu erzeugen, die offene Fluidkanäle umfassen, die gegebenenfalls anschließend versiegelt werden können, z. B. durch Versiegeln mit einem Film oder durch Festklemmen der Vorrichtung an einer anderen Trägeroberfläche.
  • In 36B wird ein erster Wafer verarbeitet, um eine strukturierte Oberfläche zu erzeugen, die dann in Kontakt mit einem zweiten Wafer gebracht und mit diesem verbunden werden kann, um die Fluidkanäle abzudichten. Abhängig von den verwendeten Materialien, z. B. Glaswafern, Siliciumwafern usw., kann das Verbinden unter Verwendung beispielsweise eines Wärmeverbindungsprozesses, eines anodischen Bindungsprozesses, eines Laserglasbindungsprozesses usw. durchgeführt werden. Der zweite Wafer bedeckt und/oder versiegelt die Rillen, Vertiefungen und/oder Öffnungen auf dem Wafer mit der strukturierten Oberfläche, um Fluidkanäle und/oder Fluidkammern (z. B. den inneren Teil) der Vorrichtung an der Grenzfläche der beiden Waferkomponenten zu bilden. Die gebundene Struktur kann dann in einzelne mikrofluidische Chips gewürfelt werden, z. B. 12 mikrofluidische Chips pro Wafer mit 210 mm Durchmesser.
  • In 36C wird der erste Wafer verarbeitet, um ein Muster von Fluidkanälen zu erzeugen, die durch die volle Dicke des Wafers geschnitten oder geätzt werden (d. h. auf jeder Oberfläche des Wafers offen sind). Der erste Wafer ist dann sandwichartig zwischen einem zweiten Wafer auf der einen Seite und einem dritten Wafer auf der anderen Seite angeordnet und mit diesen verbunden. Abhängig von den verwendeten Materialien, z. B. Glaswafern, Siliciumwafern usw., kann das Verbinden unter Verwendung beispielsweise eines Wärmeverbindungsprozesses, eines anodischen Bindungsprozesses, eines Laserglasbindungsprozesses usw. durchgeführt werden. Der zweite und der dritte Wafer decken und/oder versiegeln die Rillen, Vertiefungen und/oder Öffnungen in dem ersten Wafer, um Fluidkanäle und/oder Fluidkammern (z. B. die inneren Teile) der Vorrichtung zu bilden. Die gebundene Struktur kann dann in einzelne mikrofluidische Chips gewürfelt werden, z. B. 12 mikrofluidische Chips pro Wafer mit 210 mm Durchmesser.
  • Beispiel 3 - Beschichten von Durchflusszellenoberflächen mit einer hydrophilen Polymerbeschichtung
  • Durchflusszellenvorrichtungen aus Glas wurden durch Waschen vorbereiteter Glaskanäle mit KOH und anschließendes Spülen mit Ethanol und danach 30-minütiges Silanisieren bei 65 °C beschichtet. Fluidkanaloberflächen wurden 30 min mit EDC-NHS aktiviert, gefolgt von Pfropfen von Oligonukleotidprimern durch Inkubation der aktivieren Oberfläche mit 5 µm Primer über 20 min und anschließender Passivierung mit 30 µm aminoterminiertem Polyethylenglykol (PEG-NH2).
  • Mehrschichtoberflächen werden nach dem oben beschriebenen Ansatz hergestellt, wobei nach dem PEG-NH2-Passivierungsschritt ein mehrarmiges PEG-NHS durch die Fluidkanäle fließen gelassen wird, gefolgt von einer weiteren Zugabe des PEG-NH2, gegebenenfalls gefolgt von einer weiteren Inkubation mit PEG-NHS und gegebenenfalls gefolgt von einer weiteren Inkubation mit mehrarmigem PEG-NH2. Für diese Oberflächen kann der Primer in jedem Schritt und insbesondere nach der letzten Zugabe von mehrarmigem PEG-NH2 gepfropft werden.
  • Beispiel 4 - Durchflusszellenvorrichtungen zur Nukleinsäuresequenzierung
  • 37A stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für ein einstückiges mikrofluidisches Chip/Durchflusszellendesigns aus Glas dar. Bei diesem Design können Fluidkanäle und Einlass-/Auslasslöcher unter Verwendung von beispielsweise fokussierter Femtosekundenlaserstrahlung hergestellt werden. Es gibt zwei Fluidkanäle („Bahnen“) in der Durchflusszellenvorrichtung, und jeder Fluidkanal umfasst z. B. 2 Reihen mit jeweils 26 Frames (d. h., wobei ein „Frame“ der Bildbereich ist, der dem Sichtfeld für ein entsprechendes Bildgebungsmodul entspricht), so dass das Kacheln von 2 x 26 = 52 Bildern ausreicht, um einen gesamten Fluidkanal abzubilden. Der Fluidkanal kann eine Tiefe von z. B. etwa 100 µm aufweisen. Fluidkanal 1 weist ein Einlassloch A1 und ein Auslassloch A2 auf, und Fluidkanal 2 weist ein Einlassloch B1 und ein Auslassloch B2 auf. Die Durchflusszellenvorrichtung kann auch einen linearen, für Menschen lesbaren und/oder maschinenlesbaren 1 D-Barcode und gegebenenfalls einen 2D-Matrix-Barcode umfassen.
  • 37B stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für ein zweistückiges mikrofluidisches Chip/Durchflusszellendesigns aus Glas dar. Bei diesem Design können Fluidkanäle und Einlass-/Auslasslöcher unter Verwendung von beispielsweise fokussierter Femtosekundenlaserphotoablation oder Photolithographie und chemischen Ätzprozessen hergestellt werden. Die 2 Stücke können unter Verwendung beliebiger diverser Techniken, wie oben beschrieben, miteinander verbunden werden. Die Einlass- und Auslasslöcher können auf der obersten Schicht der Struktur positioniert und so ausgerichtet sein, dass sie mit mindestens einem der Fluidkanäle und/oder Fluidkammern, die im inneren Teil der Vorrichtung ausgebildet sind, in Fluidverbindung stehen. Es gibt zwei Fluidkanäle in der Durchflusszellenvorrichtung und wie bei der in 37A dargestellten Vorrichtung umfasst jeder Fluidkanal beispielsweise 2 Reihen mit 26 Frames in jeder Reihe. Die Fluidkanäle können eine Tiefe von z. B. etwa 100 µm aufweisen. Fluidkanal 1 weist ein Einlassloch A1 und ein Auslassloch A2 auf, und Fluidkanal 2 weist ein Einlassloch B1 und ein Auslassloch B2 auf. Die Durchflusszellenvorrichtung kann auch einen linearen, für Menschen lesbaren und/oder maschinenlesbaren 1 D-Barcode und gegebenenfalls einen 2D-Matrix-Barcode umfassen.
  • 37C stellt ein nicht einschränkendes Beispiel für ein dreistückiges mikrofluidisches Chip/Durchflusszellendesigns aus Glas dar. Bei diesem Design können Fluidkanäle und Einlass-/Auslasslöcher unter Verwendung von beispielsweise fokussierter Femtosekundenlaserphotoablation oder Photolithographie und chemischen Ätzprozessen hergestellt werden. Die 3 Stücke können unter Verwendung beliebiger einer Vielzahl von Techniken, wie oben beschrieben, miteinander verbunden werden. Der erste Wafer (umfassend ein Durchgangsmuster von Fluidkanälen oder Fluidkammern) ist dann sandwichartig zwischen einem zweiten Wafer auf der einen Seite und einem dritten Wafer auf der anderen Seite angeordnet und mit diesen verbunden. Die Einlass- und Auslasslöcher können auf der obersten Schicht der Struktur positioniert und so ausgerichtet sein, dass sie mit mindestens einem der Fluidkanäle und/oder Fluidkammern, die im inneren Teil der Vorrichtung ausgebildet sind, in Fluidverbindung stehen. Es gibt zwei Fluidkanäle in der Durchflusszellenvorrichtung und wie bei der in den 37A und 37B dargestellten Vorrichtungen weist jeder Fluidkanal 2 Reihen mit 26 Frames in jeder Reihe auf. Der Fluidkanal kann eine Tiefe von z. B. etwa 100 µm aufweisen. Fluidkanal 1 weist ein Einlassloch A1 und ein Auslassloch A2 auf, und Fluidkanal 2 weist ein Einlassloch B1 und ein Auslassloch B2 auf. Die Durchflusszellenvorrichtung kann auch einen linearen, für Menschen lesbaren und/oder maschinenlesbaren 1 D-Barcode und gegebenenfalls einen 2D-Matrix-Barcode umfassen.
  • Beispiel 5 - Bildgebung von Nukleinsäureclustern in einer Kapillardurchflusszelle
  • Nukleinsäurecluster wurden innerhalb einer Kapillare erzeugt und einer Fluoreszenzbildgebung unterzogen. Für den Test wurde eine Durchflussvorrichtung mit einem Kapillarröhrchen verwendet. Ein Beispiel für die resultierenden Clusterbilder sind in 38 gezeigt. Die Figur zeigte, dass Nukleinsäurecluster, die durch Amplifikation innerhalb des Lumens einer Kapillardurchflusszellenvorrichtung, wie hierin offenbart, gebildet werden, zuverlässig gebildet und sichtbar gemacht werden können.
  • Beispiel 6 - Probenträgerstrukturen aus Kunststoff
  • In einigen Fällen können die offenbarten Probenträgerstrukturen aus einem Polymer hergestellt werden. Beispiele für Materialien, aus denen die Probenträgerstruktur, z. B. eine Kapillardurchflusszellenvorrichtung, hergestellt werden kann, sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Polystyrol (PS), makroporöses Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen mit hoher Dichte (HDPE), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COC), Polyethylenterephthalat (PET)) oder eine beliebige Kombination davon. Es werden auch verschiedene Zusammensetzungen in Betracht gezogen, die sowohl Glas- als auch Kunststoffsubstrate umfassen.
  • Das Modifizieren einer Polymeroberfläche für die hierin offenbarten Oberflächenbeschichtungszwecke beinhaltet das Reaktivmachen von Oberflächen mit anderen chemischen Gruppen (-R), einschließlich Aminen. Bei Herstellung auf einem geeigneten Substrat können diese reaktiven Oberflächen bei Raumtemperatur langfristig gelagert werden, beispielsweise mindestens 3 Monate oder in einigen Fällen länger. Solche Oberflächen können weiter mit R-PEG- und R-Primer-Oligomer zur Oberflächenamplifikation von Nukleinsäuren gepfropft werden, wie an anderer Stelle hierin beschrieben. Kunststoffoberflächen, wie z. B. cyclisches Olefinpolymer (COP), können unter Verwendung einer beliebigen einer Vielzahl, in dem Stand der Technik bekannter Verfahren modifiziert werden. Beispielsweise können sie mit Ti:Saphir-Laserablation, UV-vermittelter Ethylenglykolmethacrylat-Photopfropfung, Plasmabehandlung oder mechanischer Agitation (z. B. Sandstrahlen oder -polieren usw.) behandelt werden, um hydrophile Oberflächen zu erzeugen, die monatelang gegen viele chemische Gruppen wie Amine reaktiv bleiben können. Diese Gruppen können dann die Konjugation von Passivierungspolymeren wie PEG oder Biomolekülen wie DNA oder Proteinen ohne Verlust der biochemischen Aktivität ermöglichen. Beispielsweise ermöglicht die Anbindung von DNA-Primer-Oligomeren die DNA-Amplifikation auf einer passivierten Kunststoffoberfläche, während die unspezifische Adsorption von Proteinen, Fluorophormolekülen oder anderen hydrophoben Molekülen verringert oder minimiert wird.
  • Zusätzlich kann die Oberflächenmodifikation in einigen Fällen mit beispielsweise Laserdruck oder UV-Maskierung kombiniert werden, um strukturierte Oberflächen zu erzeugen. Dies ermöglicht die strukturierte Anbindung von DNA-Oligomeren, Proteinen oder anderen Einheiten, wodurch eine oberflächenbasierte enzymatische Aktivität, Bindung, Detektion oder Verarbeitung ermöglicht wird. Beispielsweise können DNA-Oligomere verwendet werden, um DNA nur innerhalb strukturierter Merkmale zu amplifizieren oder amplifizierte lange DNA-Conkatemere strukturiert einzufangen. In einigen Ausführungsformen können Enzyminseln in den strukturierten Bereichen erzeugt werden, die mit lösungsbasierten Substraten reagieren können. Da Kunststoffoberflächen für diese Verarbeitungsmodi besonders zugänglich sind, können in einigen Ausführungsformen, wie sie hierin in Betracht gezogen werden, Probenträgeroberflächen oder Durchflusszellenvorrichtungen aus Kunststoff besonders vorteilhaft sein.
  • Darüber hinaus kann Kunststoff viel einfacher als Glassubstrate spritzgegossen, geprägt, gestanzt oder in 3D gedruckt werden, um eine beliebige Form zu bilden, einschließlich mikrofluidischer Vorrichtungen, und kann daher verwendet werden, um Oberflächen für die Bindung und Analyse von biologischen Proben in mehreren Konfigurationen zu erzeugen, z. B. mikrofluidischen Chips von Probe bis zum Ergebnis für die Detektion von Biomarkern oder die DNA-Sequenzierung.
  • Eine spezifische und lokalisierte DNA-Amplifikation auf modifizierten Kunststoffoberflächen kann durchgeführt werden, um Nukleinsäureflecken mit einem extrem hohen Kontrast-Rausch-Verhältnis und einen sehr niedrigen Hintergrund herzustellen, wenn sie mit fluoreszierenden Markierungen untersucht werden.
  • Es kann eine hydrophile und aminreaktive cyclische Olefinpolymeroberfläche mit Aminprimer und Amin-PEG hergestellt werden, und es wurde gezeigt, dass sie die Rolling-Circle-Amplifikation unterstützt. Bei Untersuchung mit fluorophormarkierten Primern oder bei Addition von markierten dNTPs zu den hybridisierten Primern durch eine Polymerase wurden helle Flecken von DNA-Amplikons beobachtet, die ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 100 mit extrem geringen Hintergründen zeigten, was auf eine hochspezifische Amplifikation und extrem geringe Niveaus von unspezifischer Protein- und hydrophober Fluorophorbindung hinweist, die Kennzeichen der hochgenauen Detektionssystem sind, die für Systeme wie fluoreszenzbasierte DNA-Sequenzierer erforderlich sind.
  • Beispiel 7 - Prophetisches Beispiel für die Verwendung eines strukturierten Beleuchtungsbildgebungssystem zur Sequenzierung
  • Ein strukturiertes Beleuchtungsbildgebungssystem 4100, wie das in 41 dargestellte nicht einschränkende Beispiel, kann in Kombination mit einer Durchflusszelle 4187 verwendet werden, die eine gering unspezifisch bindende Oberfläche umfasst, um eine Nukleinsäuresequenzierung durchzuführen. Zielnukleinsäuresequenzen werden mit Adapter-/Primersequenzen hybridisiert, die an die gering unspezifisch bindende Oberfläche 4188 angebunden sind, im Inneren der Durchflusszelle 4187 in hoher Oberflächendichte, und unter Verwendung von Hybridisierungs- und Amplifikationspuffern, die speziell für die Oberfläche formuliert sind, klonal amplifiziert, um die spezifischen Hybridisierungs- und Amplifikationsraten zu verbessern.
  • Die Durchflusszelle 4187 wird in dem strukturierten Beleuchtungsbildgebungssystem 4100 montiert, und ein Sequenzierungsreaktionszyklus, der die Verwendung beispielsweise der oben beschriebenen Polymer-Nukleotid-Konjugatchemie und des in 40 dargestellten Arbeitsablaufs umfasst, wird eingeleitet. Das fluoreszenzmarkierte Polymer-Nukleotid-Konjugat wird in die Durchflusszelle 4187 eingebracht und mit der Oberfläche 4188 in Kontakt gebracht, um multivalente Bindungskomplexe zu bilden, wenn die Nukleotideinheit des Polymer-Nukleotid-Konjugats zu einem Nukleotid der Zielsequenz komplementär ist. Überschüssiges, ungebundenes Polymer-Nukleotid-Konjugat wird dann abgespült.
  • Für jeden Detektionsschritt wird eine Reihe von Bildern der Oberfläche 4188 unter Verwendung unterschiedlicher Ausrichtungen eines Beugungsgitters, z. B. 4130A, in mindestens einer Verzweigung eines Beleuchtungsstrahlenganges und an mehreren unterschiedlichen Positionen eines optischen Phasenmodulators, z. B. 4140A, erfasst, um Beleuchtungslichtstreifenmuster auf die Oberfläche 4188 zu projizieren. Nach der Bildaufnahme werden die Bildreihen unter Verwendung eines Bildrekonstruktionsalgorithmus verarbeitet, um ein höherauflösendes Bild zu erzeugen, als dies allein mit einer beugungsbegrenzten Optik möglich ist. Der Prozess kann für mehrere Positionen auf der Oberfläche 4188 wiederholt werden, um ein gekacheltes Bild der Durchflusszelleninnenfläche zu erzeugen. Gegebenenfalls kann die Brennebene eingestellt werden, und der Prozess kann wiederholt werden, um höherauflösende Bilder einer zweiten Durchflusszelleninnenfläche 4189 zu erzeugen.
  • Die Kombination von Bildern mit hohem Kontrast-Rausch-Verhältnis (erzielt unter Verwendung der offenbarten Oberflächen mit geringer Bindung mit mehrfach markierter Polymer-Nukleotid-Konjugat-Sequenzierungschemie) und effizienter Verarbeitung einer relativ kleinen Anzahl von Bildern, die unter Verwendung eines strukturierten Beleuchtungsbildgebungssystems aufgenommen wurden, um eine Durchflusszellenoberfläche mit Superauflösung abzubilden (wodurch die Verwendung höherer Oberflächendichten von Zielsequenzclustern ermöglicht wird), kann zu einem höheren Gesamtsequenzierungsdurchsatz beitragen.
  • Beispiel 8 - Prophetisches Beispiel für die Verwendung eines gemultiplexten Lesekopfs für die Doppeloberflächenbildgebung
  • Ein gemultiplexter Lesekopf, wie er schematisch in den 44A und 44B dargestellt ist, ist für die Durchführung einer Doppeloberflächenbildgebung ausgelegt. Der Lesekopf umfasst eine Mehrzahl von Mikrofluorometern, die so zusammengesetzt sind, dass sie in festen Positionen relativ zueinander gehalten werden und in einer Richtung horizontal zu einem Paar gegenüberliegender Durchflusszelleninnenflächen abgetastet werden können, um Bilder von einem breiten Streifen jeder Oberfläche aufzunehmen. Wie in 44A dargestellt, ist eine erste Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert, um Bilder einer ersten Durchflusszelleninnenfläche zu detektieren, und ist eine zweite Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometer konfiguriert, um Bilder einer zweiten Durchflusszelleninnenfläche zu detektieren, die der ersten Innenoberfläche zugewandt ist und durch die Dicke eines dazwischenliegenden Fluidkanals von dieser getrennt ist.
  • Eine Durchflusszelle mit einer gering unspezifisch bindenden Oberflächenbeschichtung wird verwendet, um eine Nukleinsäuresequenzierung durchzuführen. Zielnukleinsäuresequenzen werden mit Adapter-/Primersequenzen hybridisiert, die an die gering unspezifisch bindenden Oberflächen angebunden sind, im Inneren der Durchflusszelle, und unter Verwendung von Hybridisierungs- und Amplifikationspuffern, die speziell für die Oberflächen formuliert sind, klonal amplifiziert, um die spezifischen Hybridisierungs- und Amplifikationsraten zu verbessern.
  • Die Durchflusszelle wird in einem Bildgebungssystem montiert, das den gemultiplexte Lesekopf umfasst, und ein Sequenzierungsreaktionszyklus, der die Verwendung von beispielsweise der oben beschriebenen Polymer-Nukleotid-Konjugatchemie und des in 40 dargestellten Arbeitsablaufs umfasst, wird eingeleitet. Das fluoreszenzmarkierte Polymer-Nukleotid-Konjugat wird in die Durchflusszelle eingebracht und mit den Innenflächen in Kontakt gebracht, um multivalente Bindungskomplexe zu bilden, wenn die Nukleotideinheit des Polymer-Nukleotid-Konjugats zu einem Nukleotid der Zielsequenz komplementär ist. Überschüssiges, ungebundenes Polymer-Nukleotid-Konjugat wird dann abgespült.
  • Für jeden Detektionsschritt wird der gemultiplexte Lesekopf in mindestens einer Richtung parallel zu den Innenflächen der Durchflusszelle abgetastet (oder die Durchflusszelle kann relativ zu dem gemultiplexten Lesekopf abgetastet werden) und Bilder sowohl der ersten als auch der zweiten Durchflusszelleninnenflächen werden gleichzeitig aufgenommen, wie in 44B dargestellt, während ein Autofokusmechanismus den richtigen Arbeitsabstand zwischen den Objektiven des gemultiplexten Lesekopfs und mindestens einer der Durchflusszelleninnenflächen beibehält.
  • Die Fähigkeit, beide Durchflusszellenoberflächen gleichzeitig mit einer Single-Pass-Abtastung der Durchflusszelle abzubilden (abhängig vom Design des Lesekopfs), kann erhebliche Verbesserungen des Sequenzierungsdurchsatzes bereitstellen.
  • Weitere nummerierte Ausführungsformen
    1. 1. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen, umfassend:
      1. a) eine Durchflusszelle mit einer Innenoberfläche, die eine Mehrzahl von daran gekoppelten geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen umfasst, wobei eine Polymerase an eine geprimete Zielnukleinsäuresequenz aus der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen gebunden ist;
      2. b) eine Fluidflusssteuerung, die konfiguriert ist, um eine sequentielle und iterative Abgabe eines Reagens an die Innenoberfläche der Durchflusszelle zu steuern;
      3. c) ein Bildgebungsmodul, umfassend:
        • i) ein strukturiertes Beleuchtungssystem; und
        • ii) ein Bildaufnahmesystem, das konfiguriert ist, um Bilder von der Innenoberfläche der Durchflusszelle aufzunehmen; und
      4. d) einen Prozessor, wobei der Prozessor so programmiert ist, dass er das System anweist, ein iteratives Verfahren durchzuführen, umfassend:
        • i) Inkontaktbringen der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen, die an die Innenoberfläche der Durchflusszelle gekoppelt sind, mit einer Nukleotidzusammensetzung, um einen transienten Bindungskomplex zwischen der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen und einer Mehrzahl von Nukleotideinheiten zu bilden, wenn eine Nukleotideinheit der Nukleotidzusammensetzung zu einem Nukleotid der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz komplementär ist; und
        • ii) Abbilden der Innenoberfläche der Durchflusszelle, um den transienten Bindungskomplex zu detektieren und dadurch eine Identität des Nukleotids der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz zu bestimmen.
    2. 2. System nach Anspruch 1, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem ein optisches System umfasst, das dazu ausgelegt ist, periodische Lichtmuster auf die Innenoberfläche der Durchflusszelle zu projizieren, und wobei eine relative Orientierung oder Phasenverschiebung einer Mehrzahl der periodischen Lichtmuster auf bekannte Weise verändert werden kann.
    3. 3. System nach Anspruch 1, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem einen ersten optischen Arm umfasst, der einen ersten Lichtemitter umfasst, um Licht zu emittieren, und einen ersten Strahlteiler umfasst, um Licht zu teilen, das von dem ersten Lichtemitter emittiert wird, um eine erste Mehrzahl von Streifen auf die Innenoberfläche der Durchflusszelle zu projizieren.
    4. 4. System nach Anspruch 3, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem ferner einen zweiten optischen Arm umfasst, der einen zweiten Lichtemitter umfasst, um Licht zu emittieren, und einen zweiten Strahlteiler umfasst, um Licht zu teilen, das von dem zweiten Lichtemitter emittiert wird, um eine zweite Mehrzahl von Streifen auf die Innenoberfläche der Durchflusszelle zu projizieren.
    5. 5. System nach Anspruch 4, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem ferner ein optisches Element umfasst, um einen Strahlengang des ersten Arms und des zweiten Arms zu kombinieren.
    6. 6. System nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der erste Strahlteiler ein erstes durchlässiges Beugungsgitter umfasst und der zweite Strahlteiler ein zweites durchlässiges Beugungsgitter umfasst.
    7. 7. System nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der erste und der zweite Lichtemitter unpolarisiertes Licht emittieren und wobei das erste und das zweite durchlässige Beugungsgitter unpolarisiertes Licht beugen sollen, das von einem jeweiligen des ersten und des zweiten Lichtemitters emittiert wird.
    8. 8. System nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei das optische Element zum Kombinieren eines Strahlenganges der ersten Mehrzahl von Streifen und der zweiten Mehrzahl von Streifen einen Spiegel mit Löchern umfasst, wobei der Spiegel so angeordnet ist, dass er Licht reflektiert, das durch das erste durchlässige Beugungsgitter gebeugt wird, und wobei die Löcher so angeordnet sind, dass sie mindestens erste Ordnungen von Licht passieren lassen, das durch das zweite durchlässige Beugungsgitter gebeugt wird.
    9. 9. System nach Anspruch 8, ferner umfassend: ein oder mehrere optische Elemente zur Phasenverschiebung der ersten Mehrzahl von Streifen und der zweiten Mehrzahl von Streifen.
    10. 10. System nach Anspruch 9, wobei das eine oder die mehreren optischen Elemente zur Phasenverschiebung der ersten Mehrzahl von Streifen und der zweiten Mehrzahl von Streifen ein erstes rotierendes optisches Fenster zur Phasenverschiebung der ersten Mehrzahl von Streifen und ein zweites rotierendes optisches Fenster zur Phasenverschiebung der zweiten Mehrzahl von optischen Streifen umfassen.
    11. 11. System nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei das eine oder die mehreren optischen Elemente zur Phasenverschiebung der ersten Mehrzahl von Streifen und der zweiten Mehrzahl von Streifen eine erste lineare Bewegungsstufe zum Verschieben des ersten Beugungsgitters und eine zweite lineare Bewegungsstufe zum Translatieren des zweiten Beugungsgitters umfassen.
    12. 12. System nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das eine oder die mehreren optischen Elemente zur Phasenverschiebung der ersten Mehrzahl von Streifen und der zweiten Mehrzahl von Streifen ein einzelnes rotierendes optisches Fenster umfassen, wobei das einzelne rotierende optische Fenster nach dem Spiegel mit Löchern in einem Strahlengang zur Probe positioniert ist.
    13. 13. System nach Anspruch 12, wobei eine Drehachse des einzelnen rotierenden optischen Fensters um etwa 45 Grad von einer optischen Achse jedes der Gitter versetzt ist.
    14. 14. System nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die erste Mehrzahl von Streifen gegenüber der zweiten Mehrzahl von Streifen in der Probenebene um etwa 90 Grad winkelversetzt ist.
    15. 15. System nach Anspruch 14, wobei die Probe eine Mehrzahl von Merkmalen umfasst, die in einer rechteckigen Anordnung oder einer hexagonalen Anordnung regelmäßig strukturiert sind.
    16. 16. System nach einem der Ansprüche 9 bis 15, ferner umfassend: eine Objektivlinse zum Projizieren von jedem der ersten Mehrzahl von Streifen und der zweiten Mehrzahl von Streifen auf die Probe.
    17. 17. System nach einem der Ansprüche 9 bis 16, ferner umfassend: einen oder mehrere optische Strahlblocker zum Blockieren von nullten Ordnungen von Licht, das von jedem der ersten und zweiten Beugungsgitter emittiert werden.
    18. 18. System nach Anspruch 17, wobei der eine oder die mehreren optischen Strahlblocker ein Bragg-Gitter umfassen.
    19. 19. System nach einem der Ansprüche 6 bis 18, wobei das optische Element zum Kombinieren eines Strahlenganges des ersten Arms und des zweiten Arms einen Polarisationsstrahlteiler umfasst, wobei das erste Beugungsgitter vertikal polarisiertes Licht beugt und wobei das zweite Beugungsgitter horizontal polarisiertes Licht beugt.
    20. 20. System nach einem der Ansprüche 4 bis 19, wobei der erste und der zweite Strahlteiler jeweils einen Strahlteilerwürfel oder eine Strahlteilerplatte umfassen.
    21. 21. System nach einem der Ansprüche 3 bis 20, wobei der erste Strahlteiler ein erstes reflektierendes Beugungsgitter umfasst und der zweite Strahlteiler ein zweites reflektierendes Beugungsgitter umfasst.
    22. 22. System nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem einen Mehrfachstrahlteilerschlitten umfasst, der eine Mehrzahl von Strahlteilern umfasst, die auf einem linearen Verschiebetisch montiert sind, so dass die Mehrzahl von Strahlteilern feste Ausrichtungen in Bezug auf die optische Achse des Systems aufweist.
    23. 23. System nach Anspruch 22, wobei die Mehrzahl von Strahlteilern eine Mehrzahl von Beugungsgittern umfasst.
    24. 24. System nach Anspruch 23, wobei die Mehrzahl von Beugungsgittern zwei Beugungsgitter umfasst.
    25. 25. System nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem ein festes zweidimensionales Beugungsgitter umfasst, das in Kombination mit einem Raumfilterrad verwendet wird, um eindimensionale Beugungsmuster auf die Innenoberfläche der Durchflusszelle zu projizieren.
    26. 26. System nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei das Bildaufnahmesystem eine individuell angepasste Tubuslinse umfasst, die in Kombination mit einem Objektiv die Abbildung einer ersten Durchflusszelleninnenfläche und einer zweiten Durchflusszelleninnenfläche mit im Wesentlichen derselben Bildauflösung ermöglicht.
    27. 27. System nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Nukleotidzusammensetzung eine konjugierte Polymer-Nukleotid-Zusammensetzung umfasst.
    28. 28. System nach Anspruch 27, wobei die konjugierte Polymer-Nukleotid-Zusammensetzung eine Mehrzahl von an einen Polymerkern konjugierten Nukleotideinheiten umfasst.
    29. 29. System nach Anspruch 28, wobei die Mehrzahl von Nukleotideinheiten Nukleotide, Nukleotidanaloga oder eine beliebige Kombination davon umfasst.
    30. 30. System nach Anspruch 28 oder Anspruch 29, wobei die Mehrzahl von Nukleotideinheiten eine Mehrzahl von identischen Nukleotideinheiten umfasst.
    31. 31. System nach einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei der Nukleotidzusammensetzung vor dem Bilden des transienten Bindungskomplexes eine Polymerase fehlt.
    32. 32. Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuremolekülen, umfassend:
      1. a) Bereitstellen einer Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen, die an eine Oberfläche angebunden sind, wobei eine Polymerase an eine geprimete Zielnukleinsäuresequenz der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen gebunden ist;
      2. b) Inkontaktbringen der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen mit einer Nukleotidzusammensetzung, um einen transienten Bindungskomplex zwischen der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen und einer Mehrzahl von Nukleotideinheiten zu bilden, wenn eine Nukleotideinheit der Nukleotidzusammensetzung zu einem Nukleotid der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz komplementär ist; und
      3. c) Detektieren des transienten Bindungskomplexes zur Bestimmung der Identität des Nukleotids der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz, wobei das Detektieren umfasst:
        • i) Beleuchten der Oberfläche mit Licht, das von einem strukturierten Beleuchtungssystem bereitgestellt wird, unter einem ersten Satz von Beleuchtungsbedingungen, um eine erste Mehrzahl von Streifen, die in einer bestimmten Richtung ausgerichtet sind, auf die Oberfläche zu projizieren;
        • ii) Erfassen einer ersten Mehrzahl von Phasenbildern der Oberfläche, wobei während des Erfassens der ersten Mehrzahl von Bildern die Positionen der ersten Mehrzahl von Streifen auf der Oberfläche verschoben sind;
        • iii) Beleuchten der Oberfläche mit Licht, das von dem strukturierten Beleuchtungssystem bereitgestellt wird, unter einem zweiten Satz von Beleuchtungsbedingungen, um eine zweite Mehrzahl von Streifen auf die Oberfläche zu projizieren, wobei die zweite Mehrzahl von Streifen gegenüber der ersten Mehrzahl von Streifen auf der Oberfläche winkelversetzt ist; und
        • iv) Erfassen einer zweiten Mehrzahl von Phasenbildern der Oberfläche, die mit der zweiten Mehrzahl von Streifen beleuchtet ist, wobei während des Erfassens der zweiten Mehrzahl von Streifen die Positionen der zweiten Mehrzahl von Streifen auf der Oberfläche verschoben sind.
    33. 33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem einen ersten optischen Arm umfasst, umfassend einen ersten Lichtemitter, um Licht zu emittieren, und ein erstes Beugungsgitter, um das vom ersten Lichtemitter emittierte Licht zu beugen, um die erste Mehrzahl von Streifen, die in einer bestimmten Richtung ausgerichtet sind, auf die Oberfläche zu projizieren.
    34. 34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem einen zweiten optischen Arm umfasst, umfassend einen zweiten Lichtemitter, um Licht zu emittieren, und ein zweites Beugungsgitter, um das vom zweiten Lichtemitter emittierte Licht zu beugen, um die zweite Mehrzahl von Streifen, die von der ersten Mehrzahl von Streifen winkelversetzt ist, auf die Oberfläche zu projizieren.
    35. 35. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem einen Mehrfachstrahlteilerschlitten umfasst, der eine Mehrzahl von Strahlteilern umfasst, die auf einem linearen Verschiebetisch montiert sind, so dass die Mehrzahl von Strahlteilern feste Ausrichtungen in Bezug auf die optische Achse des Systems aufweist, und wobei der erste Satz von Beleuchtungsbedingungen einer ersten Position der linearen Translationsstufe entspricht und der zweite Satz von Beleuchtungsbedingungen einer zweiten Position der linearen Translationsstufe entspricht.
    36. 36. Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Mehrzahl von Strahlteilern eine Mehrzahl von Beugungsgittern umfasst.
    37. 37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Mehrzahl von Beugungsgittern zwei Beugungsgitter umfasst.
    38. 38. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 37, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem ein festes zweidimensionales Beugungsgitter umfasst, das in Kombination mit einem Raumfilterrad verwendet wird, um eindimensionale Beugungsmuster auf die Oberfläche zu projizieren, und wobei der erste Satz von Beleuchtungsbedingungen einer ersten Position des Raumfilterrads entspricht und der zweite Satz von Beleuchtungsbedingungen einer zweiten Position des Raumfilterrads entspricht.
    39. 39. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 38, wobei das erste Beugungsgitter und das zweite Beugungsgitter durchlässige Beugungsgitter sind, wobei das strukturierte Beleuchtungssystem einen Spiegel mit Löchern umfasst, um durch das erste Beugungsgitter gebeugtes Licht zu reflektieren und mindestens erste Ordnungen von durch das erste Beugungsgitter gebeugtem Licht durchzulassen.
    40. 40. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 39, ferner umfassend: Verwenden mindestens der ersten Mehrzahl von erfassten Phasenbildern und der zweiten Mehrzahl von erfassten Phasenbildern, um ein oder mehrere Bilder mit einer höheren Auflösung als jedes der ersten und der zweiten Mehrheit von erfassten phasierten Bildern rechnerisch zu rekonstruieren.
    41. 41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die erste Mehrzahl von Streifen gegenüber der zweiten Mehrzahl von Streifen auf der Oberfläche um etwa 90 Grad winkelversetzt ist.
    42. 42. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 41, wobei die Oberfläche eine Mehrzahl von Merkmalen umfasst, die in einer rechteckigen Anordnung oder einer hexagonalen Anordnung regelmäßig strukturiert sind.
    43. 43. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 42, wobei die erste Mehrzahl von Streifen und die zweite Mehrzahl von Streifen durch Drehen eines einzelnen optischen Fensters, das in einem Strahlengang zwischen der Oberfläche und jedem des ersten und des zweiten Beugungsgitters positioniert ist, phasenverschoben werden, wobei eine Drehachse des einzelnen rotierenden optischen Fensters von einer optischen Achse jedes der Beugungsgitter versetzt ist.
    44. 44. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 43, wobei der erste optische Arm ausgeschaltet und der zweite optische Arm des strukturierten Beleuchtungssystems nach dem Erfassen der ersten Mehrzahl von Phasenbildern eingeschaltet wird.
    45. 45. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 44, wobei das erste Beugungsgitter und das zweite Beugungsgitter während der Bilderfassung mechanisch fixiert sind.
    46. 46. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 45, wobei die Nukleotidzusammensetzung eine konjugierte Polymer-Nukleotid-Zusammensetzung umfasst.
    47. 47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die konjugierte Polymer-Nukleotid-Zusammensetzung eine Mehrzahl von an einen Polymerkern konjugierten Nukleotideinheiten umfasst.
    48. 48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei die Mehrzahl von Nukleotideinheiten Nukleotide, Nukleotidanaloga oder eine beliebige Kombination davon umfasst.
    49. 49. Verfahren nach Anspruch 47 oder Anspruch 48, wobei die Mehrzahl von Nukleotideinheiten eine Mehrzahl von identischen Nukleotideinheiten umfasst.
    50. 50. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 49, wobei das Verfahren verwendet wird, um die Identität eines „N + 1“- oder terminalen Nukleotids eines Primerstrangs der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz zu bestimmen.
    51. 51. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 50, wobei der Nukleotidzusammensetzung vor dem Bilden des transienten Bindungskomplexes eine Polymerase fehlt.
    52. 52. Detektionsvorrichtung, umfassend
      1. a) eine Lesekopfbaugruppe, die eine Mehrzahl von Mikrofluorometern umfasst,
        • wobei die Mehrzahl von Mikrofluorometern in festen Positionen relativ zueinander gehalten werden, um einen gemultiplexten Lesekopf zu bilden,
        • wobei mindestens eines aus einer ersten Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um ein Weitfeldbild eines anderen Bereichs einer ersten Probenebene zu erfassen, und
        • wobei mindestens eines aus einer zweiten Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder eines anderen Bereichs einer zweiten Probenebene aufzunehmen.
    53. 53. Detektionsvorrichtung nach Anspruch 52, ferner umfassend eine Translationsstufe, die konfiguriert ist, um die Lesekopfbaugruppe in mindestens einer Richtung parallel zu der ersten und der zweiten Probenebene zu bewegen.
    54. 54. Detektionsvorrichtung nach Anspruch 52 oder Anspruch 53, ferner umfassend einen Probentisch, der konfiguriert ist, um eine Durchflusszelle zu halten, die eine erste und eine zweite Innenoberfläche umfasst, so dass die erste Innenoberfläche in der ersten Probenebene gehalten wird und die zweite Innenoberfläche in der zweiten Probenebene gehalten wird.
    55. 55. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 52 bis 54, wobei mindestens ein Mikrofluorimeter der Mehrzahl von Mikrofluorimetern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder mit einem Sichtfeld von mindestens 1 mm aufzunehmen.
    56. 56. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 52 bis 55, wobei mindestens ein Mikrofluorimeter der Mehrzahl von Mikrofluorimetern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder mit einem Sichtfeld von mindestens 1,5 mm aufzunehmen.
    57. 57. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 52 bis 56, wobei mindestens eines der Mikrofluorometer ferner einen dedizierten Autofokusmechanismus umfasst.
    58. 58. Detektionsvorrichtung nach Anspruch 57, wobei der Autofokusmechanismus für ein erstes Mikrofluorometer konfiguriert ist, um Daten von einem Autofokusmechanismus für ein zweites Mikrofluorometer zu integrieren, wobei die Autofokusmechanismen für das erste Mikrofluorometer einen Fokus des ersten Mikrofluorometers basierend auf einer Fokusposition des ersten Mikrofluorometers und einer Fokusposition des zweiten Mikrofluorometers ändern.
    59. 59. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 52 bis 58, wobei ein einzelnes Mikrofluorometer ferner ein Objektiv, einen Strahlteiler und einen Detektor umfasst, wobei der Strahlteiler positioniert ist, um Anregungsstrahlung von einer Anregungsstrahlungsquelle auf das Objektiv zu lenken und Emissionsstrahlung vom Objektiv auf den Detektor zu lenken.
    60. 60. Detektionsvorrichtung nach Anspruch 59, wobei mindestens ein einzelnes Mikrofluorometer ferner eine einzelne Anregungsstrahlungsquelle umfasst.
    61. 61. Detektionsvorrichtung nach Anspruch 59 oder Anspruch 60, wobei die Anregungsstrahlungsquelle die Anregungsstrahlung auf die Objektive von zwei oder mehr einzelnen Mikrofluorometern der Mehrzahl lenkt, so dass sich die zwei oder mehr einzelnen Mikrofluorometer die Anregungsstrahlungsquelle teilen.
    62. 62. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 59 bis 61, wobei zwei oder mehr einzelne Mikrofluorometer der Mehrzahl ferner mindestens zwei Anregungsstrahlungsquellen umfassen oder sich diese teilen.
    63. 63. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 59 bis 62, wobei die Objektive der einzelnen Mikrofluorometer der Mehrzahl eine numerische Apertur zwischen 0,2 und 0,5 aufweisen.
    64. 64. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 52 bis 63, wobei die Mikrofluorometer der Mehrzahl konfiguriert sind, um Bilder mit einer Auflösung aufzunehmen, die ausreicht, um Merkmale zu unterscheiden, die weniger als 50 Mikrometer voneinander entfernt sind.
    65. 65. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 52 bis 64, wobei die Mikrofluorometer der Mehrzahl konfiguriert sind, um eine Schärfentiefe aufzuweisen, die geringer als der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle ist.
    66. 66. Detektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 52 bis 65, wobei die erste Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder bei einer ersten Fluoreszenzemissionswellenlänge aufzunehmen, und die zweite Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder bei einer zweiten Fluoreszenzemissionswellenlänge aufzunehmen.
    67. 67. Verfahren zum Bestimmen einer Identität eines Nukleotids in einer Zielnukleinsäuresequenz, umfassend:
      1. a) Bereitstellen einer Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen, wobei eine Polymerase an eine geprimete Zielnukleinsäuresequenz der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen gebunden ist;
      2. b) Inkontaktbringen der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen mit einer Nukleotidzusammensetzung, um einen transienten Bindungskomplex zwischen der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen und einer Mehrzahl von Nukleotideinheiten zu bilden, wenn eine Nukleotideinheit der Nukleotidzusammensetzung zu einem Nukleotid der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz komplementär ist; und
      3. c) Detektieren des transienten Bindungskomplexes zur Bestimmung der Identität des Nukleotids der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz, wobei das Detektieren umfasst:
        • Translatieren eines gemultiplexten Lesekopfes in mindestens eine Richtung parallel zu einer Oberfläche, an die die Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen angebunden ist,
        • wobei der gemultiplexte Lesekopf eine Mehrzahl von Mikrofluorometern umfasst,
        • die in festen Positionen relativ zueinander gehalten werden, und
        • wobei mindestens ein Mikrofluorimeter der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um ein Weitfeldbild eines anderen Bereichs der Oberfläche als andere Mikrofluorimeter der Mehrzahl aufzunehmen.
    68. 68. Verfahren nach Anspruch 67, wobei die Nukleotidzusammensetzung eine konjugierte Polymer-Nukleotid-Zusammensetzung umfasst.
    69. 69. Verfahren nach Anspruch 68, wobei die konjugierte Polymer-Nukleotid-Zusammensetzung eine Mehrzahl von an einen Polymerkern konjugierten Nukleotideinheiten umfasst.
    70. 70. Verfahren nach Anspruch 69, wobei die Mehrzahl von Nukleotideinheiten Nukleotide, Nukleotidanaloga oder eine beliebige Kombination davon umfasst.
    71. 71. Verfahren nach Anspruch 69 oder Anspruch 70, wobei die Mehrzahl von Nukleotideinheiten eine Mehrzahl von identischen Nukleotideinheiten umfasst.
    72. 72. Verfahren nach einem der Ansprüche 67 bis 71, wobei das Verfahren verwendet wird, um die Identität eines „N + 1“- oder terminalen Nukleotids eines Primerstrangs der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz zu bestimmen.
    73. 73. Verfahren nach einem der Ansprüche 67 bis 72, wobei der Nukleotidzusammensetzung vor dem Bilden des transienten Bindungskomplexes eine Polymerase fehlt.
    74. 74. Verfahren nach einem der Ansprüche 67 bis 73, wobei die Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen an eine erste Innenoberfläche und eine zweite Innenoberfläche einer Durchflusszelle angebunden ist, und wobei eine erste Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder verschiedener Bereiche der ersten Innenoberfläche der Durchflusszelle aufzunehmen, und eine zweite Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder verschiedener Bereiche der zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle aufzunehmen.
    75. 75. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen, umfassend:
      1. a) eine Durchflusszelle mit mindestens einer Innenoberfläche, die eine Mehrzahl von daran gekoppelten geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen umfasst, wobei eine Polymerase an eine geprimete Zielnukleinsäuresequenz aus der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen gebunden ist;
      2. b) eine Fluidflusssteuerung, die konfiguriert ist, um eine sequentielle und iterative Abgabe eines Reagens an die mindestens eine Innenoberfläche der Durchflusszelle zu steuern;
      3. c) ein Bildgebungsmodul, das konfiguriert ist, um die mindestens eine Innenoberfläche der Durchflusszelle abzubilden, wobei das Bildgebungsmodul umfasst:
        • eine gemultiplexte Lesekopfbaugruppe, die eine Mehrzahl von Mikrofluorometern umfasst, die in festen Positionen relativ zueinander gehalten werden,
        • wobei mindestens ein Mikrofluorimeter der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um ein Weitfeldbild eines anderen Bereichs der mindestens einen Oberfläche als andere Mikrofluorimeter der Mehrzahl aufzunehmen; und
      4. d) einen Prozessor, wobei der Prozessor so programmiert ist, dass er das System anweist, ein iteratives Verfahren durchzuführen, umfassend:
        • i) Inkontaktbringen der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen, die an die mindestens eine Innenoberfläche der Durchflusszelle gekoppelt sind, mit einer Nukleotidzusammensetzung, um einen transienten Bindungskomplex zwischen der Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen und einer Mehrzahl von Nukleotideinheiten zu bilden, wenn eine Nukleotideinheit der Nukleotidzusammensetzung zu einem Nukleotid der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz komplementär ist; und
        • ii) Abbilden der mindestens einen Innenoberfläche der Durchflusszelle unter Verwendung des gemultiplexten Lesekopfs, um den transienten Bindungskomplex zu detektieren und dadurch die Identität des Nukleotids der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz zu bestimmen.
    76. 76. System nach Anspruch 75, wobei die Nukleotidzusammensetzung eine konjugierte Polymer-Nukleotid-Zusammensetzung umfasst.
    77. 77. System nach Anspruch 76, wobei die konjugierte Polymer-Nukleotid-Zusammensetzung eine Mehrzahl von an einen Polymerkern konjugierten Nukleotideinheiten umfasst.
    78. 78. System nach Anspruch 77, wobei die Mehrzahl von Nukleotideinheiten Nukleotide, Nukleotidanaloga oder eine beliebige Kombination davon umfasst.
    79. 79. System nach Anspruch 77 oder Anspruch 78, wobei die Mehrzahl von Nukleotideinheiten eine Mehrzahl von identischen Nukleotideinheiten umfasst.
    80. 80. System nach einem der Ansprüche 75 bis 79, wobei das Verfahren verwendet wird, um die Identität eines „N + 1“- oder terminalen Nukleotids eines Primerstrangs der geprimeten Zielnukleinsäuresequenz zu bestimmen.
    81. 81. System nach einem der Ansprüche 75 bis 80, wobei der Nukleotidzusammensetzung vor dem Bilden des transienten Bindungskomplexes eine Polymerase fehlt.
    82. 82. Verfahren nach einem der Ansprüche 75 bis 81, wobei die Mehrzahl von geprimeten Zielnukleinsäuresequenzen an eine erste Innenoberfläche und eine zweite Innenoberfläche der Durchflusszelle angebunden ist, und wobei eine erste Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder verschiedener Bereiche der ersten Innenoberfläche der Durchflusszelle aufzunehmen, und eine zweite Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder verschiedener Bereiche der zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle aufzunehmen.
    83. 83. System nach einem der Ansprüche 75 bis 82, ferner umfassend eine Translationsstufe, die konfiguriert ist, um die gemultiplexte Lesekopfbaugruppe in mindestens einer Richtung parallel zu der ersten und der zweiten Abtastebene zu bewegen.
    84. 84. System nach einem der Ansprüche 75 bis 83, wobei mindestens ein Mikrofluorimeter der Mehrzahl von Mikrofluorimetern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder mit einem Sichtfeld von mindestens 1 mm aufzunehmen.
    85. 85. System nach einem der Ansprüche 75 bis 84, wobei mindestens ein Mikrofluorimeter der Mehrzahl von Mikrofluorimetern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder mit einem Sichtfeld von mindestens 1,5 mm aufzunehmen.
    86. 86. System nach einem der Ansprüche 74 bis 85, wobei mindestens eines der Mikrofluorometer ferner einen dedizierten Autofokusmechanismus umfasst.
    87. 87. System nach Anspruch 86, wobei der Autofokusmechanismus für ein erstes Mikrofluorometer konfiguriert ist, um Daten von einem Autofokusmechanismus für ein zweites Mikrofluorometer zu integrieren, wobei die Autofokusmechanismen für das erste Mikrofluorometer einen Fokus des ersten Mikrofluorometers basierend auf einer Fokusposition des ersten Mikrofluorometers und einer Fokusposition des zweiten Mikrofluorometers ändern.
    88. 88. System nach einem der Ansprüche 75 bis 87, wobei ein einzelnes Mikrofluorometer der Mehrzahl ferner ein Objektiv, einen Strahlteiler und einen Detektor umfasst, wobei der Strahlteiler positioniert ist, um Anregungsstrahlung von einer Anregungsstrahlungsquelle auf das Objektiv zu lenken und Emissionsstrahlung vom Objektiv auf den Detektor zu lenken.
    89. 89. System nach Anspruch 88, wobei mindestens ein einzelnes Mikrofluorometer ferner eine einzelne Anregungsstrahlungsquelle umfasst.
    90. 90. System nach Anspruch 89, wobei die Anregungsstrahlungsquelle die Anregungsstrahlung auf die Objektive von zwei oder mehr einzelnen Mikrofluorometern der Mehrzahl lenkt, so dass sich die zwei oder mehr einzelnen Mikrofluorometer die Anregungsstrahlungsquelle teilen.
    91. 91. System nach einem der Ansprüche 88 bis 90, wobei zwei oder mehr einzelne Mikrofluorometer der Mehrzahl ferner mindestens zwei Anregungsstrahlungsquellen umfassen oder sich diese teilen.
    92. 92. System nach einem der Ansprüche 88 bis 91, wobei die Objektive der einzelnen Mikrofluorometer der Mehrzahl eine numerische Apertur zwischen 0,2 und 0,5 aufweisen.
    93. 93. System nach einem der Ansprüche 75 bis 92, wobei die Mikrofluorometer der Mehrzahl konfiguriert sind, um Bilder mit einer Auflösung aufzunehmen, die ausreicht, um Merkmale zu unterscheiden, die weniger als 50 Mikrometer voneinander entfernt sind.
    94. 94. System nach einem der Ansprüche 82 bis 93, wobei die Mikrofluorometer der Mehrzahl konfiguriert sind, um eine Schärfentiefe aufweisen, die geringer als der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Innenoberfläche der Durchflusszelle ist.
    95. 95. System nach einem der Ansprüche 82 bis 94, wobei die erste Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder bei einer ersten Fluoreszenzemissionswellenlänge aufzunehmen, und die zweite Teilmenge der Mehrzahl von Mikrofluorometern konfiguriert ist, um Weitfeldbilder bei einer zweiten Fluoreszenzemissionswellenlänge aufzunehmen.
    96. 96. Verfahren zum Sequenzieren eines Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren umfasst:
      1. a) Bereitstellen einer Oberfläche; wobei die Oberfläche umfasst:
        • i) ein Substrat;
        • ii) mindestens eine Schicht mit hydrophiler Polymerüberzugsschicht;
        • iii) eine Mehrzahl von Oligonukleotidmolekülen, die an mindestens einer hydrophilen Polymerüberzugsschicht angebunden sind; und iv) mindestens eine separate Region der Oberfläche, der eine Mehrzahl von klonal amplifizierten Probennukleinsäuremolekülen umfasst, die an der Mehrzahl von angebundenen Oligonukleotidmolekülen immobilisiert sind, wobei die Mehrzahl von immobilisierten klonal amplifizierten Probennukleinsäuremolekülen in einem Abstand von weniger als λ/(2 x NA) vorhanden ist, wobei λ die Mittenwellenlänge einer Anregungsenergiequelle ist und NA die numerische Apertur eines Bildgebungssystems ist.
      2. b) Anwenden einer Chemie des stochastischen Photo-Switching auf die Mehrzahl von klonal amplifizierten Probennukleinsäuremolekülen gleichzeitig, um zu bewirken, dass die Mehrzahl von klonal amplifizierten Probennukleinsäuremolekülen durch stochastisches Photo-Switching in Ein- und Ausschaltereignissen in bis zu vier verschiedenen Farben fluoreszieren; und
      3. c) Detektieren der Ein- und Ausschaltereignisse in einem Farbkanal für jede Farbe in Echtzeit, wenn die Ein- und Ausschaltereignisse für die Mehrzahl von klonal amplifizierten Probennukleinsäuremolekülen auftreten, um eine Identität eines Nukleotids des klonal amplifizierten Probennukleinsäuremoleküls zu bestimmen.
    97. 97. Verfahren nach Anspruch 96, wobei Konzentrationen von Reagenzien für das stochastische Photo-Switching ausreichend sind, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein Einschaltereignis für ein gegebenes Nukleotid für ein gegebenes klonal amplifiziertes Probennukleinsäuremolekül der Mehrzahl von klonal amplifizierten Probennukleinsäuremolekülen gleichzeitig wie ein Einschaltereignis für ein gegebenes Nukleotid eines klonal amplifizierten Probennukleinsäuremoleküls neben dem gegebenen klonal amplifizierten Probennukleinsäuremolekül auftritt, weniger als etwa 0,5 % beträgt.
    98. 98. Verfahren nach Anspruch 96, ferner umfassend das Steuern einer Rate, mit der die Ein- und Ausschaltereignisse auftreten, um eine Wahrscheinlichkeit, dass ein Einschaltereignis für ein gegebenes Nukleotid für ein gegebenes klonal amplifiziertes Probennukleinsäuremolekül gleichzeitig wie ein Einschaltereignis für ein Nukleotid eines klonal amplifizierten Probennukleinsäuremoleküls neben dem gegebenen klonal amplifizierten Probennukleinsäuremolekül auftritt, zu steuern.
    99. 99. Verfahren nach Anspruch 98, wobei das Steuern der Rate, mit der die Ein- und Ausschaltereignisse auftreten, das Einstellen der Konzentrationen von Nukleotiden und Enzymen in der Chemie des stochastischen Photo-Switching umfasst.
    100. 100. Verfahren nach Anspruch 96, ferner umfassend das Bestimmen, ob eine Beleuchtungsintensität eines Detektionsereignisses in einem Farbkanal größer als eine vorbestimmte Schwelle ist.
    101. 101. Verfahren nach Anspruch 96, ferner umfassend das Bestimmen, ob eine Fleckgröße eines Detektionsereignisses in einem Farbkanal größer als eine vorbestimmte Schwelle ist.
    102. 102. Verfahren nach Anspruch 96, wobei die mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht PEG umfasst.
    103. 103. Verfahren nach Anspruch 96, wobei das Detektieren das Aufnehmen eines Bildes der Oberfläche umfasst, wobei das Bild ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 40 aufweist.
    104. 104. Verfahren nach Anspruch 96, wobei das Detektieren das Aufnehmen eines Bildes der Oberfläche umfasst, wobei das Bild ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 60 aufweist.
    105. 105. Verfahren nach Anspruch 96, wobei das Substrat Glas umfasst.
    106. 106. Verfahren nach Anspruch 96, wobei das Substrat Kunststoff umfasst.
    107. 107. Verfahren nach Anspruch 96, wobei die Oberfläche im Inneren eines Strömungskanals positioniert ist.
    108. 108. Verfahren nach Anspruch 96, wobei die mindestens eine hydrophile Polymerschicht ein verzweigtes hydrophiles Polymer mit mindestens 8 Verzweigungen umfasst.
    109. 109. Verfahren nach Anspruch 96, wobei eine Hintergrundfluoreszenzintensität, die in einer Region der Oberfläche gemessen wird, die seitlich von der mindestens einen separaten Region verschoben ist, nicht mehr als das Zweifache der Intensität beträgt, die in der mindestens einen separaten Region vor der klonalen Amplifikation gemessen wurde.
    110. 110. Verfahren nach Anspruch 96, wobei die Probennukleinsäuremoleküle einzelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, die Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit umfassen.
    111. 111. Verfahren nach Anspruch 110, wobei die einzelsträngigen multimeren Nukleinsäuremoleküle mindestens 10 kb lang sind.
    112. 112. Verfahren nach Anspruch 110, ferner umfassend doppelsträngige monomere Kopien der regelmäßig auftretenden Monomereinheit.
    113. 113. Verfahren nach Anspruch 96, wobei die Oberfläche eine erste Schicht, die eine Monoschicht aus Polymermolekülen umfasst, die an eine Oberfläche des Substrats angebunden sind; eine zweite Schicht, die Polymermoleküle umfasst, die an die Polymermoleküle der ersten Schicht angebunden sind; und eine dritte Schicht umfasst, die Polymermoleküle umfasst, die an die Polymermoleküle der zweiten Schicht angebunden sind, wobei mindestens eine Schicht verzweigte Polymermoleküle umfasst.
    114. 114. Verfahren nach Anspruch 113, wobei die dritte Schicht ferner Oligonukleotide umfasst, die an die Polymermoleküle der dritten Schicht angebunden sind.
    115. 115. Verfahren nach Anspruch 114, wobei die an die Polymermoleküle der dritten Schicht angebundenen Oligonukleotide in mehreren Tiefen über die gesamte dritte Schicht verteilt sind.
    116. 116. Verfahren nach Anspruch 113, ferner umfassend eine vierte Schicht, die verzweigte Polymermoleküle umfasst, die an die Polymermoleküle der dritten Schicht angebunden sind, und eine fünfte Schicht, die Polymermoleküle umfasst, die an die verzweigten Polymermoleküle der vierten Schicht angebunden sind.
    117. 117. Verfahren nach Anspruch 116, wobei die Polymermoleküle der fünften Schicht ferner Oligonukleotide umfassen, die an die Polymermoleküle der fünften Schicht gebunden sind.
    118. 118. Verfahren nach Anspruch 117, wobei die an die Polymermoleküle der fünften Schicht angebundenen Oligonukleotide in mehreren Tiefen über die gesamte fünfte Schicht verteilt sind.
    119. 119. Verfahren nach Anspruch 96, wobei die mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht ein Molekül umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyethylenglykol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(acrylsäure) (PAA), Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(methylmethacrylat) (PMA), Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglykol)methylethermethacrylat) (POEGMA), Polyglutaminsäure (PGA), Polylysin, Polyglucosid, Streptavidin und Dextran besteht.
  • Während bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hierin gezeigt und beschrieben wurden, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass solche Ausführungsformen nur beispielhaft bereitgestellt werden. Der Fachmann erkennt zahlreiche mögliche Variationen, Änderungen und Substitutionen, ohne aus der Erfindung zu treten. Es versteht sich, dass verschiedene Alternativen zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung in beliebiger Kombination bei der Durchführung der Erfindung eingesetzt werden können. Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Patentansprüche den Umfang der Erfindung definieren und dass Verfahren und Strukturen im Umfang dieser Patentansprüche und deren Äquivalente dadurch abgedeckt werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 63/076361 [0001]
    • US 62/962723 [0001, 0069]
    • US 16363842 [0053, 0273]
    • US 62962723 [0080, 0092]
    • US 2020/0139375 A1 [0136]
    • US 2020/0218052 [0169]
    • WO 2020/118255 [0232]
    • US 5512131 [0255]
    • US 10655176 B2 [0385]
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  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Lutz (2011), „Biological Imaging by Superresolution Light Microscopy“, Comprehensive Biotechnology (2. Aufl.), Bd. 1, S. 579-589, Elsevier [0169]
    • Feiner-Gracia, et al. (2018), „15 - Advanced Optical Microscopy Techniques for the Investigation of Cell-Nanoparticle Interactions“, Smart Nanoparticles for Biomedicine: Micro and Nano Technologies, S. 219-236, Elsevier [0169]
    • Nylk, et al. (2019), „Light-Sheet Fluorescence Microscopy With Structured Light“, Neurophotonics and Biomedical Spectroscopy, S. 477-501, Elsevier [0169]
    • Lutz et al. (2011), „Biological Imaging by Superresolution Light Microscopy“, Comprehensive Biotechnology (2. Aufl.). Bd. 1, S. 579-589, Elsevier [0188]

Claims (79)

  1. Bildgebungssystem, umfassend: a) zwei verschiedene, axial versetzte Oberflächen; b) eine Objektivlinse; und c) mindestens einen Bildsensor, wobei das Bildgebungssystem eine numerische Apertur (NA, numerical aperture) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV, field of vision) von mehr als 1,0 mm2 aufweist, und wobei das Bildgebungssystem Bilder der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen aufnehmen kann, die im Wesentlichen die gleiche optische Auflösung aufweisen, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor zu bewegen.
  2. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, wobei das Bildgebungssystem eine numerische Apertur von mehr als 0,3 aufweist.
  3. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, ferner umfassend einen Autofokussierungsmechanismus, der einen Autofokussierungslaser und einen Autofokussierungssensor umfasst, wobei der Autofokussierungsmechanismus verwendet wird, um das optische System zwischen dem Aufnehmen von Bildern der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen neu zu fokussieren.
  4. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, wobei die Objektivlinse eine Vergrößerungskraft aufweist, die ausreicht, um zwei oder mehr Sichtfelder auf mindestens einer der beiden verschiedenen, axial versetzten Oberflächen abzubilden.
  5. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, wobei die zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen zwei Oberflächen einer Durchflusszelle umfassen.
  6. Bildgebungssystem nach Anspruch 5, wobei die zwei Oberflächen der Durchflusszelle mit einer hydrophilen Überzugsschicht beschichtet sind, und wobei die hydrophile Überzugsschicht ferner markierte Nukleinsäurekolonien umfasst, die in einer Oberflächendichte von mehr als 10.000 Nukleinsäurekolonien pro Quadratmillimeter (mm2) darauf angeordnet sind.
  7. Bildgebungssystem nach Anspruch 5, wobei das Bildgebungssystem 1, 2, 3 oder 4 Bildgebungskanäle umfasst, die eine Tubuslinse mit einer Schärfentiefe umfassen, die ausreicht, um Nukleinsäurekolonien zu detektieren, die auf mindestens einer der beiden Oberflächen der Durchflusszelle angeordnet sind und die mit 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen detektierbaren Markierungen markiert wurden.
  8. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Bildsensor Pixel mit einer Pixelabmessung umfasst, die so gewählt ist, dass eine Raumabtastfrequenz für das Bildgebungssystem mindestens das Zweifache der optischen Auflösung des Bildgebungssystems beträgt.
  9. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Bildsensor einen aktiven Bereich mit einer Diagonale von größer oder gleich etwa 15 Millimetern (mm) umfasst.
  10. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, ferner umfassend mindestens eine Tubuslinse, die zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor positioniert ist, und wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um eine Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen einer Durchflusszelle zu korrigieren.
  11. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, ferner umfassend mindestens eine Tubuslinse, die eine nicht unendlich korrigierte Tubuslinse ist.
  12. Bildgebungssystem nach Anspruch 10, wobei die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 Mikrometern (µm) und einen Spalt zwischen einer ersten Innenoberfläche und einer zweiten Innenoberfläche der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen der Durchflusszelle von mindestens 50 µm aufweist.
  13. Bildgebungssystem nach Anspruch 10, wobei das Bildgebungssystem zwei oder mehr Tubuslinsen umfasst, die so ausgelegt sind, dass sie eine optimale Bildgebungsleistung bei zwei oder mehr Fluoreszenzwellenlängen bereitstellen.
  14. Bildgebungssystem nach Anspruch 1, wobei die optische Auflösung der Bilder der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen über das gesamte Sichtfeld (FOV) beugungsbegrenzt ist.
  15. Bildgebungssystem, umfassend: a) zwei verschiedene, axial versetzte Oberflächen einer Durchflusszelle; b) eine Objektivlinse; c) mindestens einen Bildsensor; und d) mindestens eine Tubuslinse, die in einem Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor angeordnet ist, wobei das Bildgebungssystem eine numerische Apertur (NA) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,0 Quadratmillimeter (mm2) aufweist, und wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um die Bildgebungsleistung derart zu korrigieren, dass Bilder einer ersten Innenoberfläche und einer zweiten Innenoberfläche der zwei verschiedenen, axial versetzten Oberflächen der Durchflusszelle im Wesentlichen die gleiche optische Auflösung aufweisen.
  16. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 Mikrometern (µm) und einen fluidgefüllten Spalt zwischen der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche von mindestens 50 µm aufweist.
  17. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, ferner umfassend einen optischen Kompensator, der unbeweglich ist und eine feste Position in Bezug auf einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor aufweist.
  18. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei das Bildgebungssystem eine numerische Apertur (NA) von mehr als 0,3 aufweist.
  19. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei das Bildgebungssystem ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,5 mm2 aufweist.
  20. Bildgebungssystem nach Anspruch 19, wobei die optische Auflösung der Bilder der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche über das gesamte Sichtfeld (FOV) beugungsbegrenzt ist.
  21. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei die mindestens eine Tubuslinse, in dieser Reihenfolge, eine asymmetrische konvex-konvexe Linse, eine plankonvexe Linse, eine asymmetrische konkav-konkave Linse und eine asymmetrische konvex-konkave Linse umfasst.
  22. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei die mindestens eine Tubuslinse eine nicht unendlich korrigierte Tubuslinse ist.
  23. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei das Bildgebungssystem zwei oder mehr Tubuslinsen umfasst, die so ausgelegt sind, dass sie bei zwei oder mehr Fluoreszenzwellenlängen eine optimale Bildgebungsleistung für die erste Innenoberfläche und die zweite Innenoberfläche bereitstellen.
  24. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, ferner umfassend einen Autofokussierungsmechanismus, der einen Autofokussierungslaser und einen Autofokussierungssensor umfasst, wobei der Autofokussierungsmechanismus verwendet wird, um das Bildgebungssystem zwischen dem Erfassen der Bilder der ersten Innenoberfläche und der zweiten Innenoberfläche neu zu fokussieren.
  25. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei die Objektivlinse eine Vergrößerungskraft aufweist, die ausreicht, um zwei oder mehr Sichtfelder auf mindestens einer der ersten Innenoberfläche oder der zweiten Innenoberfläche abzubilden.
  26. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei die erste Innenoberfläche und die zweite Innenoberfläche der Durchflusszelle mit einer hydrophilen Überzugsschicht beschichtet sind, und wobei die hydrophile Überzugsschicht ferner markierte Nukleinsäurekolonien umfasst, die in einer Oberflächendichte von mehr als 10.000 Nukleinsäurekolonien pro Quadratmillimeter (mm2) darauf angeordnet sind.
  27. Bildgebungssystem nach Anspruch 26, wobei ein Bild der ersten Innenoberfläche oder der zweiten Innenoberfläche, das unter Verwendung des Bildgebungssystems aufgenommen wurde, ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR, contrast-to-noise-ratio) von mindestens 5 zeigt, wenn die Nukleinsäurekolonien mit Cyaninfarbstoff 3 (Cy3) markiert sind, das Bildgebungssystem einen Satz aus dichroitischem Spiegel und Bandpassfilter umfasst, der für die Cy3-Emission optimiert ist, und das Bild unter nicht signalgesättigten Bedingungen aufgenommen wird, während die erste Innenoberfläche oder die zweite Innenoberfläche in 25 mM ACES, pH-Wert 7,4-Puffer eingetaucht ist.
  28. Bildgebungssystem nach Anspruch 26, wobei das Bildgebungssystem 1, 2, 3 oder 4 Bildgebungskanäle umfasst, die eine Tubuslinse mit einer Schärfentiefe umfassen, die ausreicht, um Nukleinsäurekolonien zu detektieren, die auf mindestens einer der beiden verschiedenen, axial versetzten Oberflächen angeordnet sind, die mit 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen detektierbaren Markierungen markiert wurden.
  29. Bildgebungssystem nach Anspruch 26, wobei das Bildgebungssystem verwendet wird, um eine Sequenzierung-durch-Avidität-, Sequenzierung-durch-Nukleotidbasenpaarung-, Sequenzierung-durch-Nukleotidbindung- oder Sequenzierung-durch-Nukleotideinbau-Reaktion auf der ersten Innenoberfläche und/oder der zweiten Innenoberfläche zu überwachen und eine gebundene oder eingebaute Nukleotidbase zu detektieren.
  30. Bildgebungssystem, nach Anspruch 26, wobei das Bildgebungssystem verwendet wird, um eine Nukleinsäuresequenzierung durchzuführen.
  31. Bildgebungssystem nach Anspruch 26, wobei das Bildgebungssystem verwendet wird, um einen Genotyp einer Probe zu bestimmen, wobei das Bestimmen des Genotyps der Probe das Vorbereiten eines aus der Probe extrahierten Nukleinsäuremoleküls zur Sequenzierung und dann das Sequenzieren des Nukleinsäuremoleküls umfasst.
  32. Bildgebungssystem nach Anspruch 26, wobei der mindestens eine Bildsensor Pixel mit einer Pixelabmessung umfasst, die so gewählt ist, dass eine Raumabtastfrequenz für das Bildgebungssystem mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des Bildgebungssystems beträgt.
  33. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei eine Kombination aus der Objektivlinse und der mindestens einen Tubuslinse konfiguriert ist, um eine Modulationsübertragungsfunktion (MTF, modulation transfer function) in einem Raumfrequenzbereich von 700 Zyklen pro Millimeter (mm) bis 1100 Zyklen pro mm auf einer Probenebene zu optimieren.
  34. Bildgebungssystem nach Anspruch 15, wobei die mindestens eine Tubuslinse so ausgelegt ist, dass sie die MTF bei einer oder mehreren spezifizierten Raumfrequenzen, Defokussierung, sphärischer Aberration, chromatischer Aberration, Koma, Astigmatismus, Feldkrümmung, Bildverzerrung, CNR von Bildern oder einer beliebigen Kombination davon für eine Kombination aus der Objektivlinse und der mindestens einen Tubuslinse korrigiert.
  35. System zum Sequenzieren eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend: a) ein optisches System, umfassend: (i) eine erste Oberfläche und eine axial versetzte zweite Oberfläche; (ii) eine Objektivlinse; und (iii) mindestens einen Bildsensor, wobei das optische System eine numerische Apertur (NA) von weniger als 0,6 und ein Sichtfeld (FOV) von mehr als 1,0 Quadratmillimeter (mm2) aufweist und konfiguriert ist, um Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche zu erfassen; und b) einen Prozessor, der funktionsfähig mit dem optischen System gekoppelt ist, wobei der Prozessor ein Softwareprogramm umfasst, das die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche verarbeitet, um die optische Aberration zu korrigieren, so dass die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche im Wesentlichen die gleiche optische Auflösung aufweisen, und eine fluoreszenzmarkierte Zusammensetzung detektiert, umfassend das Nukleinsäuremolekül oder ein Komplement davon, das auf der ersten Oberfläche oder der axial versetzten zweiten Oberfläche angeordnet ist, um eine Identität eines Nukleotids im Nukleinsäuremolekül zu bestimmen.
  36. System nach Anspruch 35, wobei die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche aufgenommen werden, ohne einen optischen Kompensator in einen Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor zu bewegen.
  37. System nach Anspruch 35, wobei die Bilder der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche durch Neufokussieren des optischen Systems aufgenommen werden.
  38. System nach Anspruch 35, wobei das optische System eine numerische Apertur von mehr als 0,3 aufweist.
  39. System nach Anspruch 35, wobei die erste Oberfläche und die axial versetzte zweite Oberfläche zwei Oberflächen einer Durchflusszelle umfassen.
  40. System nach Anspruch 39, wobei die beiden Oberflächen der Durchflusszelle mit einer hydrophilen Überzugsschicht beschichtet sind, und wobei die hydrophile Überzugsschicht ferner markierte Nukleinsäurekolonien umfasst, die in einer Oberflächendichte von mehr als 10.000 Nukleinsäurekolonien pro Quadratmillimeter (mm2) darauf angeordnet sind.
  41. System nach Anspruch 35, wobei das optische System 1, 2, 3 oder 4 Bildgebungskanäle umfasst, die eine Tubuslinse mit einer Schärfentiefe umfassen, die ausreicht, um Nukleinsäurekolonien zu detektieren, die auf mindestens einer der ersten Oberfläche oder der axial versetzten zweiten Oberfläche angeordnet sind und mit 1, 2, 3 oder 4 unterschiedlichen detektierbaren Markierungen markiert wurden.
  42. System nach Anspruch 35, wobei der mindestens eine Bildsensor Pixel mit einer Pixelabmessung umfasst, die so gewählt ist, dass eine Raumabtastfrequenz für das optische System mindestens das Zweifache einer optischen Auflösung des optischen Systems beträgt.
  43. System nach Anspruch 35, wobei das optische System ferner mindestens eine Tubuslinse umfasst, die zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor positioniert ist, und wobei die mindestens eine Tubuslinse konfiguriert ist, um eine Bildgebungsleistungsmetrik zum Abbilden der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche zu korrigieren, wobei die erste Oberfläche und die axial versetzte zweite Oberfläche zwei Innenoberflächen einer Durchflusszelle sind.
  44. System nach Anspruch 35, wobei das optische System ferner mindestens eine Tubuslinse umfasst, die eine nicht unendlich korrigierte Tubuslinse ist.
  45. System nach Anspruch 43, wobei die Durchflusszelle eine Wandstärke von mindestens 700 Mikrometern (µm) und einen Spalt zwischen der ersten Oberfläche und der axial versetzten zweiten Oberfläche von mindestens 50 µm aufweist.
  46. System nach Anspruch 43, wobei das optische System zwei oder mehr Tubuslinsen umfasst, die so ausgelegt sind, dass sie bei zwei oder mehr Fluoreszenzwellenlängen eine optimale Bildgebungsleistung bereitstellen.
  47. Bildgebungssystem, umfassend: a) einen Probenbehälter, der eine Oberfläche umfasst, die eine Vielzahl von Bindungselementen umfasst, wobei jedes der Bindungselemente an ein einzelnes Oligonukleotidmolekül einer Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen gebunden ist, und wobei ferner ein durchschnittlicher Abstand zwischen benachbarten Bindungselementen der Vielzahl von Bindungselementen kleiner als die Abbe'sche Grenze ist; und b) einen Bildgeber, der positioniert ist, um an der Vielzahl von Bindungselementen auftretendes Photo-Switching abzubilden, indem er Ein- und Ausschaltereignisse in einer Vielzahl von Farbkanälen im Wesentlichen zur gleichen Zeit erfasst, zu der die Ein- und Ausschaltereignisse für die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen auftreten, wenn eine stochastische Photo-Switching-Chemie auf die Vielzahl der Oligonukleotidmoleküle angewendet wird, wodurch die Vielzahl der Oligonukleotidmoleküle in den Ein- und Ausschaltereignissen fluoresziert.
  48. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei der Probenbehälter eine Durchflusszelle umfasst, die die Vielzahl von Bindungselementen an einer Vielzahl von Probenstellen umfasst.
  49. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei sich jedes der Vielzahl von Bindungselementen auf dem Probenbehälter innerhalb eines Sichtfelds des Bildgebers befindet, der verwendet wird, um das Photo-Switching abzubilden, so dass das Erfassen der Ein- und Ausschaltereignisse zur gleichen Zeit für die gebundenen Oligonukleotidmoleküle bei der Vielzahl von Bindungselementen auftritt.
  50. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei die stochastische Photo-Switching-Chemie, die zur gleichen Zeit auf alle gebundenen Oligonukleotidmoleküle angewendet wird, eine stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie, eine DNA-Punktakkumulation für die Bildgebung in der Nanoskalentopographie oder eine direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit stochastischer Photo-Switching-Chemie umfasst.
  51. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei die Konzentration der Reagenzien für das stochastische Photo-Switching derart ausreichend ist, dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein Einschaltereignis für eine gegebene Base für ein gegebenes Molekül zur gleichen Zeit auftritt wie das Einschaltereignis für eine gleiche Base bei einem Molekül neben dem gegebenen Molekül, weniger als 0,5 % beträgt.
  52. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei eine Rate, mit der die Ein- und Ausschaltereignisse auftreten, eine Wahrscheinlichkeit ergibt, dass ein Einschaltereignis für eine gegebene Base für ein gegebenes Molekül zur gleichen Zeit wie das Einschaltereignis für eine gleiche Base bei einem Molekül neben dem gegebenen Molekül auftritt, niedriger ist als eine bestimmte Fehlerrate in einer Sequenzierungsanwendung, in der das Verfahren angewendet wird.
  53. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, ferner umfassend das Bestimmen, ob eine Beleuchtungsintensität oder eine Punktgröße eines detektierten Einschaltereignisses in einem Farbkanal größer als eine vorbestimmte Schwelle ist.
  54. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei der durchschnittliche Abstand zwischen benachbarten Elementen weniger als etwa 20 nm beträgt.
  55. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei die Oberfläche mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht umfasst.
  56. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei die Vielzahl der Bindungselemente ein verzweigtes hydrophiles Polymer mit mindestens 8 Verzweigungen umfasst.
  57. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei der Bildgeber, der positioniert ist, um das Photo-Switching der Oberfläche abzubilden, ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 40 aufweist.
  58. Bildgebungssystem nach Anspruch 47, wobei der Bildgeber, der positioniert ist, um das Photo-Switching der Oberfläche abzubilden, ein Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 60 aufweist.
  59. Superauflösendes Bildgebungssystem, umfassend: (a) eine Anregungslichtquelle; (b) eine Verarmungslichtquelle; (c) eine Objektivlinse; (d) einen Strahlengang, der optische Komponenten umfasst, die eine Anordnung von Regionen erzeugen, wobei jede der Regionen eine Aktivierungsregion umfasst, die Licht von der von einer Verarmungsregion umgebenen Anregungslichtquelle umfasst, die Licht von der Verarmungslichtquelle umfasst; (e) mindestens einen Bildsensor, der Signale von den Regionen über die Zeit empfängt und integriert und ein integriertes Signal für einzelne Punkte erzeugt, die von den Regionen beleuchtet werden; und (f) einen Prozessor, der derart programmiert ist, dass er die Fluoreszenz der einzelnen Punkte aus dem von dem mindestens einen Bildsensor in (e) integrierten Signal bestimmt.
  60. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 59, ferner umfassend mindestens eine Tubuslinse, die in einem Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor angeordnet ist.
  61. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei die mindestens eine Tubuslinse, in dieser Reihenfolge, eine asymmetrische konvex-konvexe Linse, eine plankonvexe Linse, eine asymmetrische konkav-konkave Linse und eine asymmetrische konvex-konkave Linse umfasst.
  62. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei die einzelnen Punkte fluoreszierenden Nukleinsäuremolekülen auf einem festen Träger entsprechen.
  63. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei einzelne Regionen kreisförmige Ringregionen sind.
  64. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei die Anregungslichtquelle einen Anregungslaser für jede Region in der Anordnung umfasst und die Verarmungslichtquelle einen Verarmungslaser für jede Region in der Anordnung umfasst, und wobei für jede Region in der Anordnung von Regionen der Strahlengang Licht von dem entsprechenden Anregungslaser und dem Verarmungslaser zu den erzeugten Regionen leitet.
  65. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 64, wobei der mindestens eine Bildsensor einen Bildsensor für jede entsprechende Region in der Anordnung von Regionen umfasst.
  66. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei der Strahlengang einen Deflektor enthält, um das Licht von der Anregungslichtquelle zu lenken und das Licht von der Verarmungslichtquelle auf zeitabhängige Weise zu lenken, um die Anordnung von Regionen zu erzeugen.
  67. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei der Strahlengang eine Phasenmaske enthält, um das Licht von der Anregungslichtquelle in eine Vielzahl von Anregungslichtstrahlen aufzuteilen und das Licht von der Verarmungslichtquelle in eine Vielzahl von Verarmungslichtstrahlen aufzuteilen, um die Anordnung von Regionen zu erzeugen.
  68. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei der Strahlengang einen Wellenleiter enthält, um eine stehende Welle mit dem Licht von der Verarmungslichtquelle innerhalb des Wellenleiters zu erzeugen.
  69. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei der mindestens eine Bildsensor einen einzelnen Bildsensor umfasst, um Licht von der Probe zu detektieren.
  70. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 69, wobei der einzelne Bildsensor einen Mehrkanal-Photonensensor umfasst.
  71. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 70, wobei der Mehrkanal-Photonensensor einen CCD-Bildsensor umfasst.
  72. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, wobei die Regionen in der Anordnung von Regionen in einem Gitter verteilt sind, das eine Vielzahl von Zeilen und eine Vielzahl von Spalten umfasst.
  73. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 60, ferner umfassend ein Abtastsystem, das konfiguriert ist, um die Probe zu bewegen, so dass sich die Anordnung von Regionen relativ zu der Probe bewegt.
  74. Superauflösendes Bildgebungssystem, umfassend: (a) eine Anregungslichtquelle; (b) eine Verarmungslichtquelle; (c) eine Objektivlinse; (d) einen Strahlengang, der optische Komponenten umfasst, die mehrere Musterregionen erzeugen, wobei jede Musterregion Anregungslicht von der Anregungsquelle und Verarmungslicht von der Verarmungslichtquelle umfasst; und (e) mindestens einen Bildsensor, der konfiguriert ist, um Signale von Fluorophoren zu empfangen und zu integrieren, die durch die Musterregion beleuchtet werden, und um eine Fluoreszenz der Fluorophore basierend auf den integrierten Signalen zu erzeugen.
  75. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 74, ferner umfassend mindestens eine Tubuslinse, die in einem Strahlengang zwischen der Objektivlinse und dem mindestens einen Bildsensor angeordnet ist.
  76. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 74, wobei die Fluorophore einen dunklen Zustand mit einer Lebensdauer aufweisen, die größer oder gleich etwa 100 Millisekunden (ms) ist.
  77. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 74, wobei die Fluorophore Farbstoffe mit Aus-Zuständen umfassen, die für mindestens 10 Sekunden stabil sind.
  78. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 77, wobei die Farbstoffe Rhodamin-, Oxazin- oder Carbocyaninfarbstoffe umfassen.
  79. Superauflösendes Bildgebungssystem nach Anspruch 74, wobei die gemusterte Regionen eine erste Region des Anregungslichts umfassen, die von einer zweiten Region des Verarmungslichts umgeben ist.
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