JP2022540970A - ゲノム検査アッセイ用の高性能蛍光撮像モジュール - Google Patents

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Abstract

【解決手段】蛍光撮像システム設計は、より大きな視野、増加された空間解像度、改良された変調伝送および画質、より高い空間サンプリング周波数、一連の画像（例えば、異なる視野のもの）を捕捉するためにサンプル平面を再配置するときの画像捕捉の間のより速い遷移、および改良された撮像システムの負荷サイクルを提供し、従ってゲノムおよび他の撮像用途のより高いスループット画像取得および分析を可能にすることが記載されている。【選択図】図２Ａ

Description

相互参照
本出願は、２０２０年９月９日に出願された米国仮特許出願第６３／０７６，３６１号と、２０２０年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９６２，７２３号の利益を主張するものであり、これらは各々その全体における引用により本明細書に組み込まれる。
典型的な蛍光ベースのゲノム検査アッセイにおいて、例えば遺伝子型判定、または核酸配列決定（リアルタイム、サイクリックまたは段階的な反応スキームのどれかを使用する）、基板上でテザーされた核酸分子に付着する色素分子は、励起光源を使用して励起させられ、蛍光光子信号は基板上の１つ以上の空間的に局在する位置において生成され、蛍光は画像センサ上に光学システムを通してその後撮像される。それから、分析プロセスは、画像を分析し、基板上で標識分子（または分子のクローン増幅されたクラスタ）の位置を見つけ、波長および空間座標の点から蛍光光子信号を数量化し、それから、それは特定の化学反応、例えば、ハイブリダイゼーション現象または塩基添加現象が基板上で特定された場所に生じた程度に相関され得る。撮像に基づいた方法は大規模平行性および多重能力を提供し、このような技術のコストおよびアクセシビリティーを低減するのに役立つ。しかしながら、例えば、基板表面の小さな領域内の標識分子（または、分子のクローン増幅されたクラスタ）が過度に高密度に詰まっていることから生じる検出エラー、または画像における低いコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）により生じる検出エラーは、蛍光信号を正しい分子（分子のクローン増幅されたクラスタ）の起因とするときのエラーにつながり得る。
本明細書に開示されるのは、フローセルの第１の内部表面および第２の内部表面を撮像するように構成された撮像システムであり、前記撮像システムは、ａ）対物レンズと、ｂ）少なくとも１つの画像センサと、ｃ）対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間の光路に配置された少なくとも１つのチューブレンズとを含み、前記光学システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有し、および、少なくとも１つのチューブレンズは、フローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面の画像が実質的に同じ光学解像度を有するように、撮像性能を修正するように構成される。
いくつかの実施形態では、フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍの液体で満たされたギャップを有する。いくつかの実施形態では、第１の内部表面および第２の内部表面の画像は、光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく取得される。いくつかの実施形態では、撮像システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）を有する。いくつかの実施形態では、撮像システムは０．３より大きい開口数（ＮＡ）を有する。いくつかの実施形態では、撮像システムは１．５ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の内部表面および第２の内部表面の画像の光学解像度は全視野（ＦＯＶ）にわたって回折限界である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは、順番に、非対称な凸－凸レンズ、凸－平面レンズ、非対称な凹－凹レンズ、および非対称な凸－凹レンズを含む。いくつかの実施形態では、撮像システムは、２つ以上の蛍光波長で第１の内部表面および第２の内部表面のために最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む。いくつかの実施形態では、撮像システムは、第１の内部表面および第２の内部表面の画像を取得する間で、光学システムに再集光するように構成されたフォーカス機構をさらに含む。いくつかの実施形態では、撮像システムは第１の内部表面または第２の内部表面の少なくとも１つで、２つ以上の視野を撮像するように構成される。いくつかの実施形態では、フローセルの第１の内部表面および第２の内部表面は親水性コーティング層で被覆され、前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり１０，０００個よりも大きい核酸コロニーの表面密度で、そこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む。いくつかの実施形態では、撮像システムを使用して取得された第１の内部表面または第２の内部表面の画像は、核酸コロニーがシアニン色素３（Ｃｙ３）で標識されるとき、少なくとも５のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示し、撮像システムはCy3発光のために最適化されたダイクロイックミラーおよび帯域通過フィルタセットを含み、画像は表面が２５ｍＭのＡＣＥＳ、ｐＨ ７．４緩衝液に浸されている間、非信号の飽和条件下で取得される。いくつかの実施形態では、前記撮像システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された前記２つの異なる表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む。いくつかの実施形態では、撮像システムは、第１の内部表面および第２の内部表面の少なくとも１つで、アビディティによる配列決定、ヌクレオチド塩基対合による配列決定、ヌクレオチド結合による配列決定、またはヌクレオチドの取り込み反応による配列決定をモニタリングするため、および結合または組み込まれたヌクレオチド塩基を検出するために、使用される。いくつかの実施形態では、撮像システムは核酸配列決定を実施するために使用される。いくつかの実施形態では、撮像システムはサンプルの遺伝子型を判定するために使用され、サンプルの遺伝子型を判定することは、配列決定のためにサンプルから抽出される核酸分子を調製することと、それから核酸分子の配列決定をすることと、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの画像センサは、撮像システムのための空間サンプリング周波数が撮像システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む。いくつかの実施形態では、対物レンズおよび少なくとも１つのチューブレンズの組み合わせは、サンプル平面において１ｍｍあたり７００サイクルから１ｍｍあたり１１００サイクルの空間周波数範囲において、変調伝送関数を最適化するように構成されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは、対物レンズおよび少なくとも１つのチューブレンズの組み合わせのために、１つ以上の特定された空間周波数での変調伝送関数（ＭＴＦ）、デフォーカス、球面収差、色収差、コマ、非点収差、像面湾曲、画像の歪み、画像コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを修正するように設計される。
また、本明細書に開示されるのは核酸分子の配列決定をする方法であって、前記方法は、ａ）対物レンズおよび少なくとも１つの画像センサを含む光学システムを使用して第１の表面および軸方向に変位した第２の表面を撮像する工程であって、前記光学システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有し、実質的に同じ光学解像度を有する第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく取得される、工程と、ｂ）核酸分子中のヌクレオチドの同一性を判定するために、第１の表面または軸方向に変位した第２の表面に配置された核酸分子、あるいはその補体を含む、蛍光で標識された組成物を検出する工程と、を含む方法。
いくつかの実施形態では、フォーカス機構は、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像を取得する間で、光学システムに再集光するために利用される。いくつかの実施形態では、方法は、第１の表面または軸方向に変位した第２の表面のうちの少なくとも１つで、２つ以上の視野を撮像する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面は、フローセルの２つの表面を含む。いくつかの実施形態では、フローセルの前記２つの表面は親水性コーティング層で被覆される。いくつかの実施形態では、前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり１０，０００個よりも大きい核酸コロニーの表面密度で、そこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記光学システムを使用して取得された前記２つの表面の１つの表面の画像は、核酸コロニーがシアニン色素３（Ｃｙ３）で標識されるとき、少なくとも５のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示し、光学システムはCy3発光のために最適化されたダイクロイックミラーおよび帯域通過フィルタセットを含み、画像は表面が２５ｍＭのＡＣＥＳ，ｐＨ７．４緩衝液に浸されている間、非信号の飽和条件下で取得される。いくつかの実施形態では、前記光学システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの画像センサは、光学システムのための空間サンプリング周波数が光学システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む。いくつかの実施形態では、光学システムは対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズを含み、少なくとも１つのチューブレンズはフローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックを修正するように構成される。いくつかの実施形態では、フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍのギャップを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは、順番に、非対称な凸－凸レンズ、凸－平面レンズ、非対称な凹－凹レンズ、および非対称な凸－凹レンズを含む。いくつかの実施形態では、光学システムは２つ以上の蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む。いくつかの実施形態では、対物レンズおよびチューブレンズの組み合わせは、中から高の空間周波数の範囲において変調伝送関数を最適化するように構成される。いくつかの実施形態では、撮像性能メトリックは、１つ以上の特定された空間周波数での変調伝送関数（ＭＴＦ）の測定値、デフォーカス、球面収差、色収差、コマ、非点収差、像面湾曲、画像の歪み、画像コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像の光学解像度は全視野（ＦＯＶ）にわたって回折限界である。いくつかの実施形態では、核酸分子の配列決定は、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つで、アビディティによる配列決定、ヌクレオチド塩基対合による配列決定、ヌクレオチド結合による配列決定、またはヌクレオチドの取り込み反応による配列決定を実施する工程、および結合または組み込まれたヌクレオチド塩基を検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルの遺伝子型を判定する工程をさらに含み、サンプルの遺伝子型を判定する工程は配列決定のための前記核酸分子を調製することと、それから前記核酸分子の配列決定をすることを含む。
本明細書に開示されるのは、２つの異なる軸方向に変位した表面を撮像するように構成された撮像システムであって、撮像システムは対物レンズおよび少なくとも１つの画像センサを含み、前記撮像システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有し、前記撮像システムは光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく、実質的に同じ光学解像度を有する２つの異なる軸方向に変位した表面の画像を取得することができる、撮像システムである。
いくつかの実施形態では、撮像システムは０．３より大きい開口数を有する。いくつかの実施形態では、撮像システムは２つの異なる軸方向に変位した表面の画像を取得する間で、光学システムに再集光するために使用されるフォーカス機構をさらに含む。いくつかの実施形態では、撮像システムは、前記２つの異なる軸方向に変位した表面の少なくとも１つで、２つ以上の視野を撮像するように構成される。いくつかの実施形態では、前記２つの異なる軸方向に変位した表面はフローセルの２つの表面を含む。いくつかの実施形態では、フローセルの前記２つの異なる表面は親水性コーティング層で被覆され、前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり１０，０００個よりも大きい核酸コロニーの表面密度でそこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記撮像システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された前記２つの異なる表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの画像センサは、撮像システムのための空間サンプリング周波数が撮像システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む。いくつかの実施形態では、撮像システムは対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズを含み、少なくとも１つのチューブレンズはフローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックを修正するように構成される。いくつかの実施形態では、フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍのギャップを有する。いくつかの実施形態では、撮像システムは２つ以上の蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む。いくつかの実施形態では、２つの異なる軸方向に変位した表面の画像の光学解像度は全視野（ＦＯＶ）にわたって回折限界である。
本明細書に開示されるのは核酸分子の配列決定をする方法であって、前記方法は、ａ）対物レンズおよび少なくとも１つの画像センサを含む補正がない光学システムを使用して第１の表面および軸方向に変位した第２の表面を撮像する工程であって、前記光学システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有する、工程と、ｂ）第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像が実質的に同じ光学解像度を有するように、光学収差を修正するために、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像を処理する、工程と、ｃ）核酸分子中のヌクレオチドの同一性を判定するために、第１の表面または軸方向に変位した第２の表面に配置された核酸分子、あるいはその補体を含む蛍光で標識された組成物を検出する、工程と、を含む、方法。
いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく、取得される。いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学システムに集光することによってのみ取得される。いくつかの実施形態では、方法は、第１の表面または軸方向に変位した第２の表面のうちの少なくとも１つで２つ以上の視野を撮像する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面はフローセルの２つの表面を含む。いくつかの実施形態では、フローセルの前記２つの表面は親水性コーティング層で被覆される。いくつかの実施形態では、前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり１０，０００個よりも大きい核酸コロニーの表面密度でそこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記光学システムを使用して取得された前記２つの表面の１つの表面の画像は、核酸コロニーがシアニン色素３（Ｃｙ３）で標識されるとき、少なくとも５のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示し、光学システムはCy3発光のために最適化されたダイクロイックミラーおよび帯域通過フィルタセットを含み、画像は表面が２５ｍＭのＡＣＥＳ，ｐＨ ７．４緩衝液に浸されている間、非信号の飽和条件下で取得される。いくつかの実施形態では、前記光学システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの画像センサは、光学システムのための空間サンプリング周波数が光学システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む。いくつかの実施形態では、光学システムは対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズを含み、少なくとも１つのチューブレンズはフローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックを修正するように構成される。いくつかの実施形態では、フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍのギャップを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは、順番に、非対称な凸－凸レンズ、凸－平面レンズ、非対称な凹－凹レンズ、および非対称な凸－凹レンズを含む。いくつかの実施形態では、光学システムは２つ以上の蛍光波長で、最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む。いくつかの実施形態では、対物レンズおよびチューブレンズの組み合わせは、中から高の空間周波数範囲において変調伝送関数を最適化するように構成される。いくつかの実施形態では、撮像性能メトリックは、１つ以上の特定された空間周波数での変調伝送関数（ＭＴＦ）の測定値、デフォーカス、球面収差、色収差、コマ、非点収差、像面湾曲、画像の歪み、画像コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像の光学解像度は全視野（ＦＯＶ）にわたって回折限界である。いくつかの実施形態では、核酸分子の配列決定は、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つで、アビディティによる配列決定、ヌクレオチド結合による配列決定、またはヌクレオチドの取り込み反応による配列決定を実施する工程と、結合または組み込まれたヌクレオチド塩基を検出する工程と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルの遺伝子型を判定する工程をさらに含み、サンプルの遺伝子型を判定する工程は配列決定のための前記核酸分子を調製することと、それから前記核酸分子の配列決定をすることと、を含む。
本明細書に開示されるのは、核酸分子の配列決定をするシステムであって、前記システムは、ａ）対物レンズおよび少なくとも１つの画像センサを含む光学システムであって、前記光学システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有し、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像を取得するように構成される、光学システムと、ｂ）プロセッサであって、前記プロセッサは、ｉ）第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像が実質的に同じ光学解像度を有するように、光学収差を修正するために、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像を処理し、ｉｉ）核酸分子中のヌクレオチドの同一性を判定するために、第１の表面または軸方向に変位した第２の表面に配置された核酸分子、あるいはその補体を含む、蛍光で標識された組成物を検出するように、プログラムされたプロセッサと、を含む、システム。
いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく取得される。いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学システムを再集光することによってのみ取得される。いくつかの実施形態では、撮像システムは０．３より大きい開口数を有する。いくつかの実施形態では、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面はフローセルの２つの表面を含む。いくつかの実施形態では、フローセルの前記２つの表面は親水性コーティング層で被覆され、前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり１０，０００個よりも大きい核酸コロニーの表面密度で、そこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記光学システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された第１の表面または軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの画像センサは、光学システムのための空間サンプリング周波数が光学システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む。いくつかの実施形態では、システムは対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズを含み、少なくとも１つのチューブレンズはフローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックを修正するように構成される。いくつかの実施形態では、フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍのギャップを有する。いくつかの実施形態では、光学システムは２つ以上の蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む。
本明細書に開示されるのは蛍光撮像システムであって、前記蛍光撮像システムは、ａ）１つ以上の特定された波長範囲内で励起光を提供するように構成された少なくとも１つの光源と、ｂ）サンプル平面を励起光に晒したときにサンプル平面の特定された視野内から生じる蛍光を収集するように構成された対物レンズであって、対物レンズの開口数は少なくとも０．３であり、対物レンズの作動距離は少なくとも７００μｍであり、視野は少なくとも２ｍｍ２の面積を有する、対物レンズと、ｃ）少なくとも１つの画像センサであって、対物レンズによって収集される蛍光は、画像センサの上へ撮像され、画像センサのための画素寸法は蛍光撮像システムのための空間サンプリング周波数が蛍光撮像システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択される、画像センサと、を含む、蛍光撮像システム。
いくつかの実施形態では、開口数は、少なくとも０．７５である。いくつかの実施形態では、開口数は、少なくとも１．０である。いくつかの実施形態では、作動距離は少なくとも８５０μｍである。いくつかの実施形態では、作動距離は少なくとも１，０００μｍである。いくつかの実施形態では、視野は少なくとも２．５ｍｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態では、視野は少なくとも３ｍｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態では、空間サンプリング周波数は、蛍光撮像システムの光学解像度の少なくとも２．５倍である。いくつかの実施形態では、空間サンプリング周波数は、蛍光撮像システムの光学解像度の少なくとも３倍である。いくつかの実施形態では、システムは、システムが自動化された形で一連の２つ以上の蛍光画像を取得するように構成されるように、Ｘ－Ｙ－Ｚ並進ステージをさらに含み、一連の各画像が異なる視野に対して取得される。いくつかの実施形態では、サンプル平面の位置は、画像を異なる視野で取得する間で、対物レンズの焦点平面の位置を一致させるために、Ｘ方向、Ｙ方向、Ｚ方向において、同時に調整される。いくつかの実施形態では、Ｘ方向、Ｙ方向、Ｚ方向において、同時調整のために必要な時間は、０．４秒未満である。いくつかの実施形態では、システムは、エラー信号がＺ方向における焦点平面およびサンプル平面の位置における差が特定されたエラーの閾値よりも大きいことを示す場合、異なる視野の画像を取得する前に、焦点平面の位置を調整するように構成されるオートフォーカス機構をさらに含む。いくつかの実施形態では、特定されたエラー閾値は１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、特定されたエラー閾値は５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、システムは３つ以上の画像センサを含み、システムは異なる画像センサの上へ３つ以上の波長範囲の各々における蛍光を撮像するように構成される。いくつかの実施形態では、３つ以上の画像センサおよびサンプル平面の各々のための焦点平面の位置の差は、１００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、３つ以上の画像センサおよびサンプル平面の各々のための焦点平面の位置の差は、５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、サンプル平面を再配置し、必要ならば焦点を調節し、画像を取得するために必要とされた総時間は、１視野あたり０．４秒未満である。いくつかの実施形態では、サンプル平面を再配置し、必要ならば焦点を調節し、画像を取得するために必要とされた総時間は、１視野あたり０．３秒未満である。
さらにフローセルの両面撮像のための蛍光撮像システムが本明細書に開示され、前記蛍光撮像システムは、ａ）フローセル内のサンプル平面の特定された視野内から生じる蛍光を収集するように構成された対物レンズと、ｂ）対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズであって、少なくとも１つのチューブレンズは、フローセルの内部表面を撮像するときに、対物レンズ、少なくとも１つのチューブレンズ、および少なくとも１つの画像センサの組み合わせのための撮像性能メトリックを修正するように構成され、フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および上部の内部表面と下部の内部表面との間の少なくとも５０μｍのギャップを有する、少なくとも１つのチューブレンズと、を含み、撮像性能メトリックは、光学補正器をフローセルと少なくとも１つの画像センサとの間の光路の内外に移動させることなく、チューブレンズの１つ以上の光学要素を光路に沿って移動させることなく、およびチューブレンズの１つ以上の光学要素を光路の内外に移動させることなく、フローセルの上部の内部表面または下部の内部表面を撮像することに対して実質的に同じである。
いくつかの実施形態では、対物レンズは市販の顕微鏡対物レンズである。いくつかの実施形態では、市販の顕微鏡対物レンズは少なくとも０．３の開口数を有する。いくつかの実施形態では、対物レンズは少なくとも７００μｍの作動距離を有する。いくつかの実施形態では、対物レンズは０．１７ｍｍのカバースリップの厚み（またはフローセルの壁厚）を補正するように修正される。いくつかの実施形態では、蛍光撮像システムはさらに対物レンズに隣接し、および対物レンズとチューブレンズとの間に位置する電気光学の位相プレートを含み、電気光学の位相プレートは、フローセルの上部の内部表面と下部の内部表面との間のギャップを液体で満たすことによって引き起こされる光学収差の修正を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは３つ以上の光学コンポーネントを含むコンジュゲートされたレンズである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは４つの光学コンポーネントを含むコンジュゲートされたレンズである。いくつかの実施形態では、４つの光学コンポーネントは、順番に、第１の非対称な凸－凸レンズ、第２の凸－平面レンズ、第３の非対称な凹－凹レンズ、および第４の非対称な凸凹レンズを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは、少なくとも１ｍｍの壁厚を有するフローセルの内部表面を撮像するときに、対物レンズ、少なくとも１つのチューブレンズ、および少なくとも１つの画像センサの組み合わせのための撮像性能メトリックを修正するように構成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは、少なくとも１００μｍのギャップを有するフローセルの内部表面を撮像するときに、対物レンズ、少なくとも１つのチューブレンズ、および少なくとも１つの画像センサの組み合わせのための撮像性能メトリックを修正するように構成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズは、少なくとも２００μｍのギャップを有するフローセルの内部表面を撮像するときに、対物レンズ、少なくとも１つのチューブレンズ、および少なくとも１つの画像センサの組み合わせのための撮像性能メトリックを修正するように構成される。いくつかの実施形態では、システムは単一の対物レンズ、２つのチューブレンズ、および２つの画像センサを含み、２つのチューブレンズの各々は異なる蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される。いくつかの実施形態では、システムは単一の対物レンズ、３つのチューブレンズ、および３つの画像センサを含み、３つのチューブレンズの各々は異なる蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される。いくつかの実施形態では、システムは単一の対物レンズ、４つのチューブレンズ、および４つの画像センサを含み、４つのチューブレンズの各々は異なる蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される。いくつかの実施形態では、対物レンズあるいは少なくとも１つのチューブレンズの設計は中から高の空間周波数範囲において変調伝送関数を最適化するように構成される。いくつかの実施形態では、撮像性能メトリックは、１つ以上の特定された空間周波数での変調伝送関数（ＭＴＦ）の測定値、デフォーカス、球面収差、色収差、コマ、非点収差、像面湾曲、画像の歪み、コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、フローセルの上部の内部表面および下部の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックにおける差は１０％未満である。いくつかの実施形態では、フローセルの上部の内部表面および下部の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックにおける差は５％未満である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズの使用は、対物レンズ、運動作動補正器、および画像センサを含む従来のシステムのための撮像性能メトリックと比べて、両面撮像のための撮像性能メトリックにおいて、少なくとも同等またはより良い改良を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチューブレンズの使用は、対物レンズ、運動作動補正器、および画像センサを含む従来のシステムのための撮像性能メトリックと比べて、両面撮像のための撮像性能メトリックにおいて、少なくとも１０％の改良を提供する。
本明細書に開示されるのは、画像に基づいた固相の遺伝子型判定および配列決定用途で使用する照明システムであり、前記照明システムは、ａ）光源と、ｂ）光源によって放射された光を収集し、それをテザーされる生体高分子を含む支持表面上で特定された照明のフィールドに送達するように構成された液体の導光路と、を含む、照明システム。
いくつかの実施形態では、照明システムは焦光レンズをさらに含む。いくつかの実施形態では、照明の特定されたフィールドは少なくとも２ｍｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態では、照明の特定されたフィールドに送達された光は、支持表面の画像を取得するために使用される撮像システムのための特定された視野にわたって均一の強度である。いくつかの実施形態では、特定された視野は少なくとも２ｍｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態では、照明の特定されたフィールドに送達された光は、光強度の変動係数（ＣＶ）が１０％未満である場合、特定された視野にわたって均一の強度である。いくつかの実施形態では、照明の特定されたフィールドに送達された光は、光強度の変動係数（ＣＶ）が５％未満である場合、特定された視野にわたって均一の強度である。いくつかの実施形態では、照明の特定されたフィールドに送達された光は、０．１未満のスペックルコントラスト値を有する。いくつかの実施形態では、照明の特定されたフィールドに送達された光は、０．０５未満のスペックルコントラスト値を有する。
引用による組み込み
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および、特許出願は、個々の出版物、特許、または、特許出願が具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書の用語と引用される文献の用語との間で矛盾が生じる場合には、本明細書の用語の方が優先される。
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の特徴と利点をより良く理解するには、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と添付図面とを参照されたい。
本明細書に開示される撮像システムによる撮像のためのサンプル部位を示すために、両面を撮像する支持構造の非限定的な例を概略的に図示する。図１Ａ：フローセルの前部と後部の内部表面を撮像する図である。図１Ｂ：基板の前部と後部の外面を撮像する図である。 本明細書に開示される撮像システムによる撮像のためのサンプル部位を示すために、両面を撮像する支持構造の非限定的な例を概略的に図示する。図１Ａ：フローセルの前部と後部の内部表面を撮像する図である。図１Ｂ：基板の前部と後部の外面を撮像する図である。 励起光ビームをサンプルへ透過するため、および受け取りそして結果としての蛍光発光を反射することによって４つの異なるそれぞれの波長または波長帯で蛍光発光の検出のために構成された４つの検出のチャネルにリダイレクトするためのダイクロイックビームスプリッタ含む、多チャネルの蛍光撮像モジュールの非限定的な例を図示する。図２Ａ：上面等角図である。図２ｂ：下面等角図である。 励起光ビームをサンプルへ透過するため、および受け取りそして結果としての蛍光発光を反射することによって４つの異なるそれぞれの波長または波長帯で蛍光発光の検出のために構成された４つの検出のチャネルにリダイレクトするためのダイクロイックビームスプリッタ含む、多チャネルの蛍光撮像モジュールの非限定的な例を図示する。図２Ａ：上面等角図である。図２ｂ：下面等角図である。 励起光ビームをサンプルへ透過するため、および受け取りそして結果としての蛍光発光を反射することとによって４つの異なるそれぞれの波長または波長帯で蛍光発光の検出のために構成された４つの検出のチャネルにリダイレクトするためのダイクロイックビームスプリッタ含む、図２Ａおよび２Ｂの多チャネルの蛍光撮像モジュール内の光路を図示する。図３Ａ：上面図である。図３Ｂ：側面図である。 励起光ビームをサンプルへ透過するため、および受け取りそして結果としての蛍光発光を反射することとによって４つの異なるそれぞれの波長または波長帯で蛍光発光の検出のために構成された４つの検出のチャネルにリダイレクトするためのダイクロイックビームスプリッタ含む、図２Ａおよび２Ｂの多チャネルの蛍光撮像モジュール内の光路を図示する。図３Ａ：上面図である。図３Ｂ：側面図である。 発生率のダイクロイックフィルタ性能とビーム角度との関係を図示するグラフである。 ダイクロイックフィルタ上の発生率のビームフットプリントサイズとビーム角度との関係を図示するグラフである。 多チャネルの蛍光撮像モジュールのダイクロイックフィルタおよび検出チャネルの例示的構成を概略的に図示し、ダイクロイックフィルタは、ダイクロイックフィルタの入射ビーム（例えば、中心の角度）と反射面との間の角度が４５未満であるように傾斜した反射面を有する。図６Ａ：４つの検出チャネルを含む多チャネルの蛍光撮像モジュールの概要図である。図６Ｂ：ダイクロイック反射体上のビームの入射角度（ＡＯＩ）を図示する詳細図である。 多チャネルの蛍光撮像モジュールのダイクロイックフィルタおよび検出チャネルの例示的構成を概略的に図示し、ダイクロイックフィルタは、ダイクロイックフィルタの入射ビーム（例えば、中心の角度）と反射面との間の角度が４５未満であるように傾斜した反射面を有する。図６Ａ：４つの検出チャネルを含む多チャネルの蛍光撮像モジュールの概要図である。図６Ｂ：ダイクロイック反射体上のビームの入射角度（ＡＯＩ）を図示する詳細図である。 図６Ａおよび６Ｂに図示される撮像モジュールの構成に対応する改良されたダイクロイックフィルタ性能を図示するグラフを提供する。 図６Ａおよび６Ｂに図示される撮像モジュールの構成に対応する改良されたダイクロイックフィルタ性能を図示するグラフを提供する。 図６Ａおよび６Ｂの撮像モジュールの構成の結果として減少した表面変形を図示するグラフを提供する。図９Ａ：ＰＶの球面屈折力の１波を最後のミラーに追加することによって起こる画質劣化に対する折り曲げ角度の影響を図示する。図９Ｂ：ＰＶの球面屈折力の０．１波を最後のミラーに追加することによって起こる画質劣化に対する折り曲げ角度の影響を図示する。 図６Ａおよび６Ｂの撮像モジュールの構成の結果として減少した表面変形を図示するグラフを提供する。図９Ａ：ＰＶの球面屈折力の１波を最後のミラーに追加することによって起こる画質劣化に対する折り曲げ角度の影響を図示する。図９Ｂ：ＰＶの球面屈折力の０．１波を最後のミラーに追加することによって起こる画質劣化に対する折り曲げ角度の影響を図示する。 励起ビームのｓ偏向を使用することの結果として改良された励起のフィルタ性能（例えば、通過帯域と周囲の阻止帯域との間のより鋭い遷移）を図示するグラフを提供する。図１０Ａ：４０度および４５度の入射角度での例示的な帯域通過ダイクロイックフィルタのための透過スペクトルであり、入射ビームは直線的に偏向され、ダイクロイックフィルタの平面に対してｐ－偏光される。図１０Ｂ：ダイクロイックフィルタに対する光源の配向を変えることによって、入射ビームはダイクロイックフィルタの平面に対してｓ－偏光されるようになり、結果的に通過帯域と阻止帯域との間の実質的により鋭いエッジをもたらす。 励起ビームのｓ偏向を使用することの結果として改良された励起のフィルタ性能（例えば、通過帯域と周囲の阻止帯域との間のより鋭い遷移）を図示するグラフを提供する。図１０Ａ：４０度および４５度の入射角度での例示的な帯域通過ダイクロイックフィルタのための透過スペクトルであり、入射ビームは直線的に偏向され、ダイクロイックフィルタの平面に対してｐ－偏光される。図１０Ｂ：ダイクロイックフィルタに対する光源の配向を変えることによって、入射ビームはダイクロイックフィルタの平面に対してｓ－偏光されるようになり、結果的に通過帯域と阻止帯域との間の実質的により鋭いエッジをもたらす。 ０．３の開口数（ＮＡ）を有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムの変調伝送関数（ＭＴＦ）を図示する。図１１Ａ：第１の表面である。図１１Ｂ：第２の表面である。 ０．３の開口数（ＮＡ）を有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムの変調伝送関数（ＭＴＦ）を図示する。図１１Ａ：第１の表面である。図１１Ｂ：第２の表面である。 ０．４のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１２Ａ：第１の表面である。図１２Ｂ：第２の表面である。 ０．４のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１２Ａ：第１の表面である。図１２Ｂ：第２の表面である。 ０．５のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１３Ａ：第１の表面である。図１３Ｂ：第２の表面である。 ０．５のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１３Ａ：第１の表面である。図１３Ｂ：第２の表面である。 ０．６のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１４Ａ：第１の表面である。図１４Ｂ：第２の表面である。 ０．６のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１４Ａ：第１の表面である。図１４Ｂ：第２の表面である。 ０．７のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１５Ａ：第１の表面である。図１５Ｂ：第２の表面である。 ０．７のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１５Ａ：第１の表面である。図１５Ｂ：第２の表面である。 ０．８のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１６Ａ：第１の表面である。図１６Ｂ：第２の表面である。 ０．８のＮＡを有する、本明細書に開示される例示的な両面撮像システムのＭＴＦを図示する。図１６Ａ：第１の表面である。図１６Ｂ：第２の表面である。 第１のフローセルの表面を通して第２のフローセルの表面を撮像するための計算されたストレール比のプロットを提供する。図１７Ａ：異なる対物レンズおよび／または光学システムの開口数のための介在する流体層（流体チャネルの高さ）の厚さの関数として第１のフローセルの表面を通して第２のフローセルの表面を撮像するためのストレール比のプロットである。図１７Ｂ：第１のフローセルの表面および０．１ｍｍの厚さを有する水の介在層を通して第２のフローセルの表面を撮像するための開口数の関数としてのストレール比のプロットである。 第１のフローセルの表面を通して第２のフローセルの表面を撮像するための計算されたストレール比のプロットを提供する。図１７Ａ：異なる対物レンズおよび／または光学システムの開口数のための介在する流体層（流体チャネルの高さ）の厚さの関数として第１のフローセルの表面を通して第２のフローセルの表面を撮像するためのストレール比のプロットである。図１７Ｂ：第１のフローセルの表面および０．１ｍｍの厚さを有する水の介在層を通して第２のフローセルの表面を撮像するための開口数の関数としてのストレール比のプロットである。 本開示の二波長の励起／４つのチャネルの放射蛍光の撮像システムの概略図を提供する。 ０．１７ｍｍ厚さのカバースリップの反対側で表面を撮像するために設計された対物レンズ設計のための光学のレイトレーシングダイアグラムを提供する。 ０．１７ｍｍ厚さのカバースリップの反対側で表面を撮像するために使用されるときの空間周波数の関数として、図１９に図示される対物レンズのための変調伝送関数のプロットを提供する。 ０．３ｍｍ厚さのカバースリップの反対側で表面を撮像するために使用されるときの空間周波数の関数として、図１９に図示される対物レンズのための変調伝送関数のプロットを提供する。 水性流体の０．１ｍｍ厚さの層によって０．３ｍｍ厚さのカバースリップの反対側にある表面から分離する表面を撮像するために使用されるときの空間周波数の関数として、図１９に図示される対物レンズのための変調伝送関数のプロットを提供する。 １．０ｍｍ厚さのカバースリップの反対側で表面を撮像するために使用されるときの空間周波数の関数として、図１９に図示される対物レンズのための変調伝送関数のプロットを提供する。 水性流体の０．１ｍｍ厚さの層によって１．０ｍｍ厚さのカバースリップの反対側にある表面から分離する表面を撮像するために使用されるときの空間周波数の関数として、図１９に図示される対物レンズのための変調伝送関数のプロットを提供する。 図１９に図示される対物レンズと併せて使用される場合に、１ｍｍ厚さのカバースリップを通して改良された両面撮像のために提供するチューブレンズ設計のためのレイトレーシングダイアグラムを提供する。 １．０ｍｍ厚さのカバースリップの反対側で表面を撮像するために使用されるときの空間周波数の関数として、図２５に図示される対物レンズおよびチューブレンズの組み合わせのための変調伝送関数のプロットを提供する。 水性流体の０．１ｍｍ厚さの層によって１．０ｍｍ厚さのカバースリップの反対側にある表面から分離する表面を撮像するために使用されるときの空間周波数の関数として、図２５に図示される対物レンズおよびチューブレンズの組み合わせのための変調伝送関数のプロットを提供する。 高品質な両面撮像性能を提供するために最適化された本開示のチューブレンズ設計（左）のためのレイトレーシングダイアグラムを提供する。チューブレンズはもはや無限遠補正ではないため、適切に設計されたヌルレンズ（右）は、製造および検査の目的で非無限遠補正のチューブレンズを補正するために、チューブレンズとの組み合わせで使用され得る。 ２つの流体アダプタを有する単一のキャピラリーフローセルの１つの非限定的な例を図示する。 ２つのキャピラリーを保持するために設計され、シャーシ、流体アダプタ、および随意に他のコンポーネントを含む、フローセルのカートリッジの１つの非限定的な例を図示する。 様々な流体の流れ制御コンポーネントに接続される単一のキャピラリーフローセルを含むシステムの１つの非限定的な例を図示し、単一のキャピラリーは、様々な撮像用途で使用するための顕微鏡ステージまたはカスタム撮像装置への取り付けと互換性がある。 デッドボリュームを減少または最小化、および一定の主要試薬を保存するために統合化されたダイヤフラム弁を有するキャピラリーフローセルのカートリッジを含むシステムの１つの非限定的な例を図示する。 キャピラリーフローセル、顕微鏡の仕組み、および温度制御機構を含むシステムの１つの非限定的な例を図示する。 フローセルのカートリッジと接触して設置される金属プレートの使用を通してキャピラリーフローセルの温度制御の１つの非限定的な例を図示する。 非接触熱制御機構を含むキャピラリーフローセルの温度制御のための１つの非限定的なアプローチを図示する。 フローセル装置の製作の非限定的な例を図示する。図３６Ａは１ピースのガラスフローセルの調製を示す。図３６Ｂは２ピースのガラスフローセルの調製を示す。図３６Ｃは３ピースのガラスフローセルの調製を示す。 フローセル装置の製作の非限定的な例を図示する。図３６Ａは１ピースのガラスフローセルの調製を示す。図３６Ｂは２ピースのガラスフローセルの調製を示す。図３６Ｃは３ピースのガラスフローセルの調製を示す。 フローセル装置の製作の非限定的な例を図示する。図３６Ａは１ピースのガラスフローセルの調製を示す。図３６Ｂは２ピースのガラスフローセルの調製を示す。図３６Ｃは３ピースのガラスフローセルの調製を示す。 ガラスフローセルの設計の非限定的な例を図示する。図３７Ａは１ピースのガラスフローセルの設計を示す。図３７Ｂは２ピースのガラスフローセルの設計を示す。図３７Ｃは３ピースのガラスフローセルの設計を示す。 ガラスフローセルの設計の非限定的な例を図示する。図３７Ａは１ピースのガラスフローセルの設計を示す。図３７Ｂは２ピースのガラスフローセルの設計を示す。図３７Ｃは３ピースのガラスフローセルの設計を示す。 ガラスフローセルの設計の非限定的な例を図示する。図３７Ａは１ピースのガラスフローセルの設計を示す。図３７Ｂは２ピースのガラスフローセルの設計を示す。図３７Ｃは３ピースのガラスフローセルの設計を示す。 キャピラリールーメンにおけるクラスタ増幅の視覚化を図示する。 本明細書に開示されるように、配列決定のシステムのためのブロックダイアグラムの非限定的な例を提供する。 本明細書に開示されるように、配列決定の方法のためのフローチャートの非限定的な例を提供する。 本明細書に開示されるように、構造化した照明システムのための概略の非限定的な例を提供する。 本明細書に開示されるように、フローセルの表面の構造化した照明画像を取得および処理するためのフローチャートの非限定的な例を提供する。 本明細書に開示されるように、多重読み取りヘッドの非限定的な概略図を提供する。図４３Ａ：個々のマイクロフルオロメータは共通の表面、例えば、フローセルの内部表面を撮像するように構成される、多重読み取りヘッドの側面図である。図４３Ｂ：多重読み取りヘッドの個々のマイクロフルオロメータによって取得される撮像経路を図示する多重読み取りヘッドの上面図である。 本明細書に開示されるように、多重読み取りヘッドの非限定的な概略図を提供する。図４３Ａ：個々のマイクロフルオロメータは共通の表面、例えば、フローセルの内部表面を撮像するように構成される、多重読み取りヘッドの側面図である。図４３Ｂ：多重読み取りヘッドの個々のマイクロフルオロメータによって取得される撮像経路を図示する多重読み取りヘッドの上面図である。 本明細書に開示されるように、多重読み取りヘッドの非限定的な概略図を提供する。図４４Ａ：複数の個々のマイクロフルオロメータの第１のサブセットは第１の表面、例えば、フローセルの第１の内部表面を撮像するように構成され、複数の個々のマイクロフルオロメータの第２のサブセットは第２の表面、例えば、フローセルの第２の内部表面を撮像するように構成される、多重読み取りヘッドの側面図である。図４４Ｂ：多重読み取りヘッドの個々のマイクロフルオロメータによって取得される撮像経路を図示する図４４Ａの多重読み取りヘッドの上面図である。 本明細書に開示されるように、多重読み取りヘッドの非限定的な概略図を提供する。図４４Ａ：複数の個々のマイクロフルオロメータの第１のサブセットは第１の表面、例えば、フローセルの第１の内部表面を撮像するように構成され、複数の個々のマイクロフルオロメータの第２のサブセットは第２の表面、例えば、フローセルの第２の内部表面を撮像するように構成される、多重読み取りヘッドの側面図である。図４４Ｂ：多重読み取りヘッドの個々のマイクロフルオロメータによって取得される撮像経路を図示する図４４Ａの多重読み取りヘッドの上面図である。
蛍光撮像の方法およびシステムが必要とされており、当該蛍光撮像のための方法およびシステムは、ゲノミクス用途のために光学解像度の向上と画質の改善をもたらし、ゲノムテストの精度における相応の改善に結びつく。本明細書に開示されるのは、高性能の蛍光撮像の方法およびシステムのための光学システム設計であり、（高性能の光学解像度を含む）光学解像度の改善、画質の改善、および蛍光撮像ベースのゲノミクス用途に対する高スループットの任意の１以上を提供してもよい。開示される光学照明および撮像システムの設計は、ダイクロイックフィルタ性能の改善、ダイクロイックフィルタの周波数応答の均一性の向上、励起ビームフィルタリングの改善、より大きな視野、空間解像度の向上、変調伝送の改善、コントラスト対ノイズ比の改善、および画質の改善、より高い空間サンプリング周波数、（例えば異なる視野の）一連の画像を捕捉するためのサンプル平面を再配置する時の画像捕捉間のより高速な遷移、撮像システム負荷サイクルの改善、およびより高いスループットの画像取得と画像解析、の利点の任意の１以上を提供してもよい。
いくつかの例では、撮像性能の改善、例えば、厚いフローセル壁（例えば、壁（またはカバ―スリップの）厚み＞７００μｍ）と流路（例えば、５０～２００μｍの流体チャネルの高さまたは厚み）との使用を含む、両面（フローセル）撮像用途の改善が、厚いカバースリップおよび／または対物レンズからの流体チャネルとは反対側の撮像面によって導入された光学収差を補正する、新規の対物レンズ設計を使用して、達成されてもよい。
いくつかの例では、撮像性能の改善、例えば、厚いフローセル壁（例えば、壁（またはカバ―スリップの）厚み＞７００μｍ）と流路（例えば、５０～２００μｍの流体チャネルの高さまたは厚み）との使用を含む、両面（フローセル）撮像用途の改善が、市販で既成の対物レンズを使用する時ですら、新規のチューブレンズ設計を使用することによって達成されてもよく、当該チューブレンズは、単に中間画像面で画像を形成する従来の顕微鏡のチューブレンズとは異なり、対物レンズとの組み合わせで、厚いフローセル壁および／または介在流体層によって、光学収差の補正が誘発される。
いくつかの例では、撮像性能の改善、例えばマルチチャネルの（例えば２色または４色の）撮像用途の改善が、各撮像チャネルに１つずつの、複数のチューブレンズを使用することによって達成されてもよく、ここで、各チューブレンズ設計は、その撮像チャネルで使用される特定の波長範囲のために最適化されている。
いくつかの例では、撮像性能の改善、例えば両面（フローセル）撮像用途の改善が、対物レンズとの組み合わせで、電気光学位相プレートを使用することによって達成されてもよく、それによって、フローセルの上部（近く）と下部（遠く）の内面を分離する、流体の層によって誘発される、光学収差を補正してもよい。いくつかの例では、この設計アプローチは、例えば、フローセルのどの表面が撮像されているのかに応じて光路の内外で移動する運動作動補正器によって導入される振動を補正してもよい。
様々なマルチチャネル蛍光撮像モジュール設計が開示され、当該マルチチャネル蛍光撮像モジュール設計は、照明と、折りたたまれた光路（ダイクロイックビームスプリッタまたは結合器などの、１以上のビームスプリッタまたは結合器）を含む撮像光路とを含むことができ、当該撮像光路は、励起光ビームを対物レンズに方向付け、そして対物レンズを通して透過された放射光を、複数の検出チャネルに方向付ける。本明細書に記載される蛍光撮像モジュールのいくつかの特に有利な特徴は、結果的に、ダイクロイックフィルタの通過帯域波長領域と阻止帯域波長領域との間の、鋭いおよび／またはより均一的な遷移をもたらす、ダイクロイックフィルタ入射角度の仕様を含む。そのようなフィルタは、折りたたまれた光学システム内に含まれていてもよく、また、ダイクロイックビームスプリッタまたは結合器を含んでもよい。開示される撮像光学設計のさらに有利な特徴は、対物レンズと、励起ビームを受け取るダイクロイックフィルタとに対する、１以上の励起光源と１以上の検出光路の、位置と配向とを含んでもよい。励起ビームはまた、直線的に偏光されていてもよく、そしてその直線偏光は、ｓ－偏光された光がダイクロイックフィルタのダイクロイック反射表面に入射するように配向される。そのような特徴は、潜在的に、励起ビームフィルタリングを改善してもよく、および／または、ダイクロイックフィルタの表面変形にって放射光ビームに導入される波面誤差を低減してもよい。本明細書に記載される蛍光撮像モジュールは、これらの特徴のいずれかを含んでいてもよく、または含んでいなくてもよく、そして、これらの利点のいずれかを含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。
さらに本明細書に記載されるのは、例えばフローセル表面に形成された固定化核酸分子または増幅核酸クラスタの配列を撮像することによって、多量の異なる核酸配列を分析するように構成される、デバイスおよびシステムである。本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、また、例えば、比較ゲノミクスのための配列決定の実施、遺伝子発現の追跡、マイクロＲＮＡ配列分析の実施、エピゲノミクス、アプタマー、およびファージディスプレイライブラリの特性評価に対して、および他の配列決定アプリケーションの実施に対して、有用である。本明細書に開示されるデバイスおよびシステムは、光学的、機械的、流体的、熱的、電気的、およびコンピューティング用のデバイス／態様の様々な組み合わせを含む。開示されるフローセルデバイス、カートリッジ、およびシステムによってもたらされる利点としては、限定されないが、以下が挙げられる：（ｉ）装置およびシステムの製造の複雑さとコストの低減、（ｉｉ）（例えば、現在入手可能な核酸配列決定システムのコストと比較した）消耗品コストの大幅な低下、（ｉｉｉ）典型的なフローセル表面の機能化方法との互換性、（ｉｖ）マイクロ流体構成要素、例えば、シリンジポンプおよびダイアフラム弁など、と組み合わせた場合の柔軟なフロー制御、および（ｖ）柔軟なシステムスループット。
本明細書に開示されるのは、流体アダプター、カートリッジシャーシ、１以上の一体型の流体フロー制御コンポーネント、またはそれらの任意の組み合わせをも含み得る、既製品の使い捨ての単一ルーメン（例えば、単一の流体フローチャネル）の、または複数ルーメンのキャピラリーから構成される、キャピラリーフローセルデバイスおよびキャピラリーフローセル・カートリッジである。さらに本明細書に開示されるのは、１以上のキャピラリーフローセルデバイス（またはマイクロ流体チップ）、１以上のキャピラリーフローセル・カートリッジ（またはマイクロ流体カートリッジ）、流体フローコントローラモジュール、温度制御モジュール、撮像モジュール、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る、キャピラリーフローセルベースのシステムである。
開示されているいくつかのキャピラリーフローセルデバイス、カートリッジ、およびシステムの設計上の特徴としては、限定されないが、（ｉ）単一のフローチャネル構造、（ｉｉ）システムとキャピラリーとの間の流体インターフェースが確実に密封され、そのことによって、キャピラリーの交換とシステムの再利用を容易にし、試薬濃度、ｐＨ、および温度などの反応条件の正確な制御を可能にするような、単純なロード／アンロード機構で実施され得る、試薬フロー間の密封された信頼性の高い反復的な切り替え、（ｉｉｉ）柔軟なシステムスループットを提供するために区別無く使用することができる、交換可能な単一流体フローチャネルデバイス、または複数のフローチャネルを含むキャピラリーフローセル・カートリッジ、および（ｉｖ）蛍光撮像などの多様な検出方法に対する適合性、が挙げられる。
開示されるキャピラリーフローセルデバイスおよびシステム、キャピラリーフローセル・カートリッジ、キャピラリーフローセルベースのシステム、マイクロ流体デバイスおよびカートリッジ、そしてマイクロ流体チップベースのフローセルシステムは、主に核酸配列決定用途のための使用の文脈で記載されているが、開示されるデバイスおよびシステムの様々な態様は、核酸配列決定だけでなく、任意の他のタイプの化学分析、生化学分析、核酸分析、細胞分析、または組織分析用途にも適用することができる。開示される方法、デバイス、およびシステムの異なる態様は、個別に、集合的に、または互いに組み合わせて評価され得ることを理解されたい。本明細書では、主に蛍光撮像（例えば、蛍光顕微鏡撮像、蛍光共焦点撮像、二光子蛍光などを含む）の文脈で議論されているが、開示される光学設計のアプローチと特徴の多くが、他の撮像モジュール、例えば明視野撮像、暗視野撮像、位相差撮像などに適用可能であることは、当業者によって理解されるであろう。
定義：別段の定義が無い限り、本明細書で使用される専門用語は全て、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書および添付の請求項で使用される時、単数形の「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈上明確に指示されない限り、複数の言及も含む。「ｏｒ（または）」への任意の言及は、別段の言及がない限り、「ａｎｄ／ｏｒ（および／または）」を包含することを意図している。
本明細書で使用される時、「約」という用語を伴う数字は、その数字のプラスまたはマイナス１０％の数字を指す。範囲の文脈で使用される時の「約」という用語は、最低値のマイナス１０％、および最大値のプラス１０％の範囲を指す。
本明細書に使用される時、「撮像モジュール」、「撮像ユニット」、「撮像システム」、「光学撮像モジュール」、「光学撮像ユニット」、および「光学撮像システム」の用語は、区別なく使用され、そして、より大きなシステムのコンポーネントまたはサブシステムを含んでもよく、それらはまた、流体工学モジュール、温度制御モジュール、並進ステージ、ロボット工学流体分配および／またはマイクロプレート処理、プロセッサまたはコンピュータ、機器制御ソフトウェア、データ分析、ディスプレイソフトウェアなどを含んでもよい。
本明細書に使用される時、「検出チャネル」は、サンプルから検出器に生じる光学信号を送達するように構成される光学システム内の、光路（および／またはその中の光学コンポーネント）を指す。いくつかの例では、検出チャネルは、分光計測、例えば、蛍光信号、または光電子倍増管などの検出器を使用する他の光学信号のモニタリング、を実行するように構成されいてもよい。いくつかの例では、「検出チャネル」は、「撮像チャネル」、つまり、画像を捕捉し、そして画像を画像センサに送達するように構成された光学システム内の光路（および／またはその中の光学コンポーネント）であってもよい。
本明細書に使用される時、「検出可能ラベル」は、当業者に既知の、様々な検出可能なラベルまたはタグのいずれかを指してもよい。例としては、発色団、フルオロフォア、量子ドット、アップコンバート蛍光体、発光性分子、または、化学発光分子、放射性同位体、磁気ナノ粒子、または質量タグなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、好ましいラベルは、フルオロフォアを含んでもよい。
本明細書で使用される時、「励起波長」は、蛍光指示薬（例えばフルオロフォアまたは色素分子）を励起して、蛍光を発生させるために使用される、光の波長を指す。励起波長は、単一波長、例えば６２０ｎｍ、として一般に指定されるが、それが、指定された波長を中心とする波長範囲または励起フィルタの帯域通過を指すことが、当業者によって理解されるだろう。例えば、いくつかの例では、指定された励起波長の光は、指定された波長±２ｎｍ、±５ｎｍ、±１０ｎｍ、±２０ｎｍ、±４０ｎｍ、±８０ｎｍ、またはそれ以上の光を含む。いくつかの例では、使用される励起波長は、蛍光指示薬の吸収ピーク最大値と一致してもよく、または一致しなくてもよい。
本明細書で使用される時、「発光波長」は、適切な波長の光による励起時に、蛍光指示薬（例えばフルオロフォアまたは色素分子）によって放出された光の波長を指す。発光波長は、単一波長、例えば６７０ｎｍ、として一般に指定されるが、それが、指定された波長を中心とする波長範囲または発光フィルタの帯域通過を指すことが、当業者によって理解されるだろう。いくつかの例では、指定された発光波長の光は、指定された波長±２ｎｍ、±５ｎｍ、±１０ｎｍ、±２０ｎｍ、±４０ｎｍ、±８０ｎｍ、またはそれ以上の光を含む。いくつかの例では、使用される発光波長は、蛍光指示薬の発行ピーク最大値と一致してもよく、または一致しなくてもよい。
本明細書で使用される時、蛍光は、表面上のオリゴヌクレオチドアダプタの対応するセグメントに対して逆相補性の領域を有し、そして対応するセグメントにアニーリングされた、蛍光標識された核酸配列などの、表面にアニールされたまたは他の方法でテザーされたフルオロフォアから生じる場合、「特異的」である。この蛍光は、そのようなアニーリングプロセスによって表面にテザーリングされていないフルオロフォアから生じる蛍光、または、場合によっては表面のバックグラウンド蛍光と対比される。
本明細書で使用される時、「核酸」（「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「リボ核酸（ＲＮＡ）」、または「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」とも呼ばれる）は、ヌクレオシド間の共有結合によって連結された２以上のヌクレオチドの線状ポリマー、またはその変異体もしくは機能的断片である。核酸の自然発生例では、ヌクレオシド間結合は、典型的にはリン酸ジエステル結合である。しかし、他の例は随意に、ホスホロチオレート結合などの他のヌクレオシド間結合を含み、リン酸基を含んでもよく、または含まなくてもよい。核酸は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリッドを含み、他のタイプの核酸修飾をも含むことがある。
本明細書で使用される時、「ヌクレオチド」はヌクレオチド、ヌクレオシド、またはそのアナログを指す。場合によっては、ヌクレオチドは、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ－グリコシドまたはＣ－グリコシド（例えば、２－デオキシ－Ｄ－リボースまたはリボヌクレオシド含有Ｄ－リボースを含有するデオキシリボヌクレオシド）である。他のヌクレオチドアナログの例としては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチドなどが挙げられる。
情報のパイプラインとして見られる蛍光撮像：典型的なゲノムアッセイ技術（核酸配列決定用途を含む）で蛍光撮像システムが果たす役割の有用な抽象化概念は、情報のパイプラインとしてのものであり、ここでは、光子信号は、パイプラインの一方の端部、例えば撮像に使用される対物レンズで進入し、蛍光信号に関する位置特異的情報がパイプラインの他方の端部、例えば画像センサの位置で現れる。より多くの情報が、このパイプラインを通じて送られる時、いくつかの内容は不可避的にこの伝送プロセス中に失われ、回収されない。この場合の例は、標識された分子（または分子のクローン増幅クラスタ）が、基板表面の小さな領域内に多く存在しすぎて、画像に明確に解像されない場合であり、画像センサの位置では、分子の隣接クラスタから発生する光子信号を区別することが難しくなり、そのため、信号が誤ったクラスタに起因し、検出エラーに結びつく可能性を高める。
光学撮像モジュールの設計：光学撮像モジュールを設計するゴールは、従って、この検出パイプラインを通る情報内容のフローを最大化して、検出エラーを最小化することである。設計プロセスで対処する必要のあるいくつかのキーとなる設計要素は、以下の通りである。
１）基板表面の物理的特徴密度を、光学撮像システムの全体的な画質および使用される画像センサの画素のサンプリング周波数に一致させること。これらのパラメータの不一致は、結果的に、情報が失われたり、場合によっては誤った情報が生成されたりすることになるかもしれず、例えば、画素のサンプリング周波数が光学解像度限界の２倍を下回る場合、空間エイリアシングを引き起こすかもしれない。
２）撮像されるエリアのサイズを、光学撮像システムの全体的な画質および視野全体にわたる焦点品質に一致させること。
３）バックグラウンド信号とシステムノイズを構成しつつ、光学システム設計の光学収集効率、変調伝送機能、および画像センサの性能特性を、入力励起光子束に期待される蛍光光子束、（色素吸光係数と蛍光量子収量に関連する）色素効率に一致させること。
４）蛍光撮像チャネル間のクロストークを低減するために、スペクトル成分の分離を最大化すること。
５）異なる視野の画像捕捉間でのサンプルまたは光学部品の再配置による画像取得工程の効果的な同期が、撮像システムのダウンタイムを最小化（または負荷サイクルを最大化）し、従って、画像捕捉プロセスの全体的なスループットを最大化すること。
本開示は、上に概説された設計要素の各々に対処し、そして撮像システムに対するコンポーネントレベルの仕様を作成するための、系統的な方法を記載する。
情報伝送とスループットとを改善するか、または最大化する、改善された光学解像度および画質：１つの非限定的な設計の慣例は、１ｍｍあたりのラインペア（ｌｐ／ｍｍ）の数、Ｘ、について指定される２つの隣接する特徴を識別し、かつそれを対応する開口数（ＮＡ）要件に変換するのに必要な光学解像度に始まってもよい。その後、開口数要件を、結果として生じる変調伝送機能と画像コントラストとに対する影響を評価するために使用することができる。
標準変調伝送関数（ＭＴＦ）は、光学システムを通じて伝送される画像コントラスト（変調）に対する空間周波数応答を説明する；画像コントラストは、空間周波数の関数として減少し、ＮＡが増加すると増加する。この関数は、所与のＮＡに対して達成することができるコントラスト／変調を制限する。さらに、波面誤差はＭＴＦに負の影響を与える可能性があり、従って、光学システム設計を、回折限界光学システムによって予測されるものの代わりに、真のシステムＭＴＦを使用して改善または最適化することが望ましい。本明細書で使用される時、ＭＴＦは、（カバースリップから画像センサまでの完全な光路を含む）システム全体のＭＴＦを指すが、設計の実践は、主に対物レンズのＭＴＦを考慮する場合があることに留意されたい。
撮像される標的は、（無作為に分散化されているかまたはパターン化されているかのいずれかの）表面上の一連の高密度「スポット」であり、ゲノムテスト用途では、２つの隣接するスポットを解像し、そして４つの可能性のある状態（例えば、オン－オフ、オン－オン、オフ－オン、およびオフ－オフ）を区別するために、下流分析によって必要とされる最小変調伝送値を決定することができる。例えば、スポットは、十分に小さく、光の点状のソースとして近似化されていると仮定する。検出タスクが、距離、ｄ、によって分離されている２つの隣接するスポットがオンかオフか（換言すれば明るいか暗いか）を判定し、および、サンプル平面（オブジェクト平面）のスポットから生じる蛍光信号のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）がＣｓａｍｐｌｅであると仮定すると、理想的な条件下では、画像センサ平面の２つの隣接するスポットに対する読み取り信号のＣＮＲ、Ｃｉｍａｇｅ、は、Ｃｉｍａｇｅ＝Ｃｓａｍｐｌｅ＊ＭＴＦ（１／ｄ）として厳密に近似化することができ、式中、ＭＴＦ（１／ｄ）は、空間周波数＝（１／ｄ）の時のＭＴＦ値である。
典型的な設計では、蛍光信号の誤分類を回避するために、単純閾法を使用することができるように、Ｃの値は少なくとも４である必要があるかもしれない。Ｃｉｍａｇｅ＞４の平均値の周りの蛍光信号強度のガウス分布を仮定すると、蛍光信号（例えばオンであるかオフであるか）を正確に分類する際の期待誤差は、＜０．０３５％である。米国特許出願第１６／３６３，８４２号に記載されているような独自の高ＣＮＲ配列決定と界面化学の使用によって、クローン増幅された、基板上面にテザーされている標識されたオリゴヌクレオチド分子のクラスタのサンプル平面ＣＮＲ（Ｃｓａｍｐｌｅ）値が、低密度フィールド（つまり、クラスタまたはスポットの表面密度が低い場合）で測定した時に、１２（あるいはそれよりもはるかに高い数）を超えることを達成することができるようになり、ここで、ＭＴＦは、１００％に近い値を有する。サンプル平面ＣＮＲ値が、Ｃｓａｍｐｌｅ＞１２であると仮定し、そして、分類エラー率＜０．１％を標的とする（したがって、Ｃｉｍａｇｅ＞４）と、いくつかの実装では、Ｍ（１／ｄ）の最小値は、Ｍ（１／ｄ）＝４／１２～３３％として判定することができる。従って、少なくとも３３％の変調伝送関数閾値が、伝送された画像の情報内容を保持するために使用されてもよい。
設計の慣例は、２つの特徴またはスポットの最小分離距離、ｄ、を、（Ｘ（ｌｐ／ｍｍ）について上に記載されて指定される通りの）光学解像度要件に、ｄ＝（１ｍｍ）／Ｘ、つまり、ｄは、光学システムによって完全に解像することができる２つの特徴またはスポットの間の最小分離距離であるものとして、関係付けることがでる。本明細書に開示されるいくつかの設計では、設計分析の目的は、関連する情報伝送を増加させるか、または最大化することであり、この設計基準は、ｄ＝（１ｍｍ）／Ｘ／Ａに緩和することができ、式中、２＞Ａ＞１である。Ｘ ｌｐ／ｍｍの同じ光学解像度については、ｄの値、つまりサンプル平面での最小の解像可能なスポット分離距離は低下され、より高い特徴密度の使用が可能になる。
設計の慣例では、ナイキスト基準を使用して、サンプル平面での最小空間サンプリング周波数を決定し、ここで、空間サンプリング周波数はＳ＞＝２＊Ｘであり、（そして式中、Ｘは、上記のような、Ｘ ｌｐ／ｍｍについて指定された撮像システムの光学解像度である）。よくあるように、システムの空間サンプリング周波数がナイキスト基準に近い時、Ｓを上回る撮像システム解像度は、光学システムによって分解される高周波情報が画像センサによって十分にサンプリングされ得ないため、結果的にエイリアシングを発生させる。
本明細書に開示される設計のいくつかでは、Ｓ＝Ｂ＊Ｙ（式中、Ｂ＞＝２、および、Ｙは真の光学システムのＭＴＦ限界である）の関係に基づくオーバーサンプリングスキームが、撮像システムの情報転送容量をさらに改善するために使用されてもよい。上に示されるように、Ｘ（ｌｐ／ｍｍ）は、実用的な、非０（＞３３％）の最小変調伝送値に相当し、ここで、Ｙ（ｌｐ／ｍｍ）は、Ｙ（ｌｐ／ｍｍ）での変調が０になるような、光学解像度の限界である。従って、開示される設計では、Ｙ（ｌｐ／ｍｍ）は、有利に、Ｘを有意に上回っていてもよい。Ｂ＞＝２の値については、開示される設計は、サンプルオブジェクト周波数Ｘのオーバーサンプリング、つまり、Ｓ＞＝Ｂ＊Ｙ＞２＊Ｘ、である。
上記の関係は、システム倍率を判定するために使用することができ、そして、画像センサの画素サイズの上界を提供してもよい。画像センサの画素サイズの選択は、システムの光学品質と、エイリアシングを低減するために必要な空間サンプリング周波数とに一致させられる。画像センサの画素サイズの下界は、光子スループットに基づいて判定することができ、その理由は、画素が小さいほど相対的なノイズの寄与が大きくなるためである。
しかし、他の設計的アプローチも可能である。例えば、ＮＡを０．６未満（例えば０．５以下）に低下させると、被写界深度の増加をもたらす場合がある。そのような被写界深度の増加が両面撮像を可能になる場合があり、ここで、異なる深度の２つの表面は、再集光有りまたは無しで、同時に撮像することができる。上に議論されるように、ＮＡの低下は、光学解像度を低下させるかもしれない。いくつかの実装では、より高い励起ビーム電力、例えば１Ｗ以上の使用が、強い信号を生成するために利用されてもよい。また、本質的に高コントラスなサンプル（つまり、強い前景信号と劇的に低下されたバックグラウンド信号とを呈するサンプル表面を含む）が、高コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）の画像、例えば＞２０のＣＮＲ値を有する画像の取得を容易にするために使用されてもよく、これによって、核酸配列決定用途などで、塩基呼び出しのための、信号識別の改善が提供される。本明細書に開示されるいくつかの光学システム設計では、親水性表面を有するフローセルなどのサンプル支持構造が、バックグラウンドノイズを低下させるために使用される。
様々な実装では、大きな視野（ＦＯＶ）が、開示される光学システムによって提供される。例えば、２ｍｍまたは３ｍｍを上回るＦＯＶが、例えば対物レンズやチューブレンズを含む、いくつかの光学撮像システムに提供されてもよい。場合によっては、光学撮像システムは、低倍率、例えば１０ｘ未満の倍率を提供する。そのような低下倍率は、いくつかの実装で、大きなＦＯＶ設計を容易にすることができる。低下倍率にもかかわらず、そのようなシステムの光学解像度は、小さな画素サイズまたはピッチを有する検出器アレイとしてなお十分で有り得、あるいは、それが使用されてもよい。いくつかの実装では、光学撮像システム（例えば対物レンズとチューブレンズ）によって提供される光学解像度の２倍よりも小さな画素サイズを含む画像センサが、ナイキスト定理を充足するために使用されてもよい。
他の設計もなお可能である。異なる深度の２つの表面を同時に撮像することができる両面撮像を提供するように構成されたいくつかの光学設計では、光学撮像システム（例えば、対物レンズおよび／またはチューブレンズ）は、その２つのそれぞれの深度の２つの表面（例えば２つの平面）を撮像するための光学収差を、他の深度の他の場所（例えば他の平面）よりも、低下させるように構成されている。加えて、光学撮像システムは、上記サンプル支持構造上の透過層（ガラスの層（例えばカバースリップ）など）を通じて、および、サンプルを含むか、２つの表面の少なくとも１つの上で、溶液（例えば水溶液）またはサンプルと接触している溶液（例えば水溶液）を通じて、その２つのそれぞれの深度の２つの表面（例えば２つの平面）を撮像するための収差を低下させるように構成されてもよい。
マルチチャネル蛍光撮像モジュールおよびシステム：いくつかの例では、本明細書に開示される撮像モジュールまたはシステムは、蛍光撮像モジュールまたはシステムを含んでもよい。いくつかの例では、本明細書に開示される蛍光撮像システムは、単一の蛍光励起光源（単一の波長において、または単一の励起波長範囲内で励起光を提供するため）と、励起光をサンプルに送達するように構成された光路（例えば、蛍光タグ付けされた核酸分子またはそのクラスタが基板表面に配置されている）とを含んでもよい。いくつかの例では、本明細書に開示される蛍光撮像システムは、単一の蛍光発光撮像検出チャネル、例えば、サンプルによって発光される蛍光を収集し、サンプルの画像（例えば、蛍光タグ付けされた核酸分子またはそのクラスタがその上に配置されている、基板表面の画像）を、画像センサまたは他の光検出デバイスに、送達するように構成された光路を含んでもよい。いくつかの例では、蛍光撮像システムは、２、３、４、または４を超える蛍光励起光、および／または、２、３、４、または４を超える励起波長（あるいは２、３、４、または４を超える励起波長範囲内）の励起光を送達するように構成された光路を含んでもよい。いくつかの例では、本明細書に開示される蛍光撮像システムは、２、３、４、または４を超える蛍光放射撮像検出チャネルを含んでもよく、当該蛍光発光撮像検出チャネルは、２、３、４、または４を超える発光波長（あるいは２、３、４、または４を超える発光波長範囲内）でサンプルによって発光される蛍光を収集し、そしてサンプルの画像（例えば、その上に蛍光タグ付けされた核酸分子またはそのクラスタが配置されている、基板の画像）を、２、３、４、または４を超える画像センサまたは他の光検出デバイスに送達するように構成されている。
両面撮像：いくつかの例では、本明細書に開示される蛍光撮像システムを含む撮像システムは、単一のサンプル支持構造または基板表面の高解像度画像を取得するように構成されてもよい。いくつかの例では、本明細書に開示される蛍光撮像システムを含む撮像システムは、２以上のサンプル支持構造または基板表面（例えば、フローセルの２以上の表面）の高解像度画像を取得するように構成されてもよい。いくつかの例では、開示される撮像システムによって提供される高解像度画像は、フローセルの２以上の表面で発生する反応（例えば、核酸ハイブリダイゼーション反応、増幅反応、および／または配列決定反応）を、様々な試薬が、フローセルを通って、あるいはフローセル基板の周りを流れる時に、モニタリングするように構成されてもよい。図１Ａと図１Ｂは、そのような両面支持構造の概略図を提供する。図１Ａは、分析物または試薬が中を通って流れることができる内部フローチャネルを含むフローセルなどの、両面支持構造を示す。フローチャネルは、示されるように、第１のプレートと第２のプレート、上部プレートと下部プレート、および／または前方プレートと後方プレートなどの、第１の層と第２の層との間、上部層と下部層との間、および／または前方層と後方層との間に形成されてもよい。プレートの１以上は、カバースリップなどのガラスプレートを含んでもよい。いくつかの実装では、層は、ホウケイ酸ガラス、石英、またはプラスチックを含む。これらの上部層と下部層の内部表面は、フローセルのフローチャネルを通る分析物または試薬の流れを制限するのに役立つ、フローチャネルの壁を提供する。いくつかの設計では、これらの内部表面は平面である。同様に、上部層と下部層は平面であってもよい。いくつかの設計では、少なくとも１つの追加層（図示されず）が、上部層と下部層との間に配置される。この追加層は、その中に１以上の割り込み経路を有していてもよく、当該割り込み経路は、１以上のフローチャネルを画定し、そしてフローチャネル内の分析物または試薬の流れを制御するのに役立ち得る。サンプル支持構造、例えばフローセルに関するさらなる議論は、以下に確認できる。
図１Ａは、フローセルの、第１の内部表面と第２の内部表面、上部内部表面と下部内部表面、および／または前方内部表面と後方内部表面上の、複数の蛍光サンプリング部位を概略的に示す。いくつかの実装では、これらの部位でサンプルを結合させる反応が発生してもよく、それによって蛍光がこれらの部位から発光されてもよい（図１Ａは概略的であり縮尺通りではなく；例えば、蛍光サンプリング部位のサイズと間隔とは、示されるものより小さい場合があることに、留意されたい）。
図１Ｂは、撮像される蛍光サンプリング部位を含有する２つの表面を有する、別の両面支持構造を示す。サンプル支持構造は、第１の外部表面と第２の外部表面、上部外部表面と下部外部表面、および／または前部外部表面と後部外部表面を有する基板を含む。いくつかの設計では、これらの外部表面は平面である。様々な実装では、分析物または試薬は、これらの第１の外部表面と第２の外部表面にわたって流される。図１Ｂは、サンプル支持構造の、第１の外部表面と第２の外部表面、上部外部表面と下部外部表面、および／または前方外部表面と後方外部表面上の、複数の蛍光サンプリング部位を概略的に示す。いくつかの実装では、これらの部位でサンプルを結合させる反応が発生してもよく、それによって蛍光がこれらの部位から発光されてもよい（図１Ｂは概略的であり縮尺通りではなく；例えば、蛍光サンプリング部位のサイズと間隔とは、示されるものより小さい場合があることに、留意されたい）。
いくつかの例では、本明細書に記載される蛍光撮像モジュールおよびシステムは、対物レンズから様々な距離にある、第１の表面と第２の表面上の蛍光サンプリング部位を撮像するように構成されてもよい。いくつかの設計では、第１の表面または第２の表面の一方のみで一時に焦点が合う。従って、そのような設計では、表面の１つは第１の時間に撮像され、そしてもう一方の表面は第２の時間に撮像される。蛍光撮像モジュールの焦点は、２つの表面の画像で同時に焦点が合わない時に、同等の光学解像度で一方の表面を撮像するために、もう一方の表面を撮像した後に変更されてもよい。いくつかの設計では、光学補正要素が、２つの表面の１つを撮像するために、サンプル支持構造と画像センサとの間の光路に導入されもよい。そのような蛍光撮像構成内の被写界深度は、第１の表面と第２の表面の両方を含むほどの大きさではない場合がある。本明細書に記載される蛍光撮像モジュールのいくつかの実装では、第１の表面と第２の表面の両方は、同じ時に、つまり同時に撮像されてもよい。例えば、蛍光撮像モジュールは、両方の表面を含むほどの大きさである被写界深度を有していてもよい。いくつかの例では、このような被写界深度の増加は、以下により詳細に議論されるとおり、例えば、対物レンズ（または顕微鏡対物レンズ）の開口数を少なくすることによって提供することができる。
図１Ａと図１Ｂに示されるように、撮像光学部品（例えば対物レンズ）は、第１の表面と第２の表面から適切な距離（例えば作動距離に対応する距離）に配置されてもよく、それによって検出チャネルの画像センサ上の、第１の表面と第２の表面の焦点画像を形成してもよい。図１Ａと図１Ｂの例に示されるように、第１の表面は、当該対物レンズと第２の表面との間にあってもよい。例えば、示されるように、対物レンズが第１の表面と第２の表面の両方の上方に配置され、そして、第１の表面が第２の表面の上部に配置される。第１の表面と第２の表面は、例えば、異なる深度である。第１の表面と第２の表面は、蛍光撮像モジュール、照明撮像モジュール、撮像光学部品、または対物レンズの任意の１以上から、異なる距離にある。第１の表面と第２の表面は互いから分離されており、第１の表面は、第２の表面の上方に離間されている。示される例では、第１の表面と第２の表面は平面の表面であり、当該第１の平面と第２の平面に対して垂直の方向に沿って互いから分離されている。また、示される例では、当該対物レンズは光軸を有しており、そして当該第１の表面と当該第２の表面は当該光軸の方向に沿って互いから分離されている。同様に、第１の表面と第２の表面との間の分離は、励起ビームの光路に沿って、および／または蛍光撮像モジュールおよび／または対物レンズを通る光軸に沿ってなどの、長手方向の距離に相当してもよい。従って、これらの２つの表面は、長手方向（Ｚ）に互いからある距離だけ分離されていてもよく、当該長手方向（Ｚ）は、励起ビームの中心軸、および／または、対物レンズおよび／または蛍光撮像モジュールの光軸の方向に沿うものであってもよい。この分離は、例えば、いくつかの実装のフローセル内のフローチャネルに相当してもよい。
様々な設計では、（恐らく別の光学コンポーネント、例えばチューブレンズとの組み合わせで）対物レンズは、第１の表面と第２の表面との間の長手方向（Ｚ方向）の分離と少なくとも同じ大きさの被写界深度および／または焦点深度を有する。対物レンズは、従って、単独でまたは追加的な光学コンポーネントとの組み合わせで、１以上の検出チャネルの画像センサ上で、第１の表面と第２の表面の両方の焦点画像を同時に形成してもよく、ここで、これらの画像は同等の光学解像度を有する。いくつかの実装では、撮像モジュールは、同等の光学解像度で第１の表面と第２の表面の両方の画像を捕捉するために、再集光を必要とするかもしれず、または必要としないかもしれない。いくつかの実装では、補正光学部品は、第１の表面と第２の表面の焦点画像を形成するために、撮像モジュールの光路の内外へ、動かされなくてもよい。同様に、いくつかの実装では、撮像モジュール（例えば対物レンズおよび／またはチューブレンズ）の１以上の光学要素（例えばレンズ要素）は、第２の表面の焦点画像を形成するために使用される時の前記１以上の光学要素の位置と比較して、第１の表面の焦点画像を形成するために、第１の光路および／または第２の光路に沿って（例えば撮像光学部品の光軸に沿って）、長手方向に動かされる必要は無い。しかし、いくつかの実装では、撮像モジュールは、第１の表面と第２の表面の両方で同時に焦点が合うように構成された、オートフォーカスシステムを含む。様々な実装では、サンプルは、サンプリング部位を十分に解像するように焦点が合っており、当該サンプリング部位は、側方方向（例えばＸ方向やＹ方向）に、共に緊密に離間されている。従って、様々な実装では、光学要素は、少なくとも１つの検出チャネルの、サンプル支持構造の第１の表面と当該サンプル支持構造の第２の表面上で蛍光サンプリング部位の焦点画像を形成するために、サンプル支持構造（例えばサンプル支持構造を支持する並進ステージ）と画像センサ（または光検出器アレイ）との間の光路に進入することはない。同様に、様々な実装では、光学補正が、画像センサまたは光検出器アレイ上で、サンプル支持構造の第１の表面上の蛍光サンプリング部位の焦点画像を形成するために使用されることは無く、当該光学補正は、画像センサまたは光検出器アレイ上で、サンプル支持構造の第２の表面上の蛍光サンプリング部位の焦点画像を形成するために使用される光学補正と、同一ではない。追加的に、特定の実装では、少なくとも１つの検出チャネルの、サンプル支持構造（例えばサンプル支持構造を支持する並進ステージ）と画像センサとの間の光路の光学要素は、サンプル支持構造の第１の表面上の蛍光サンプリング部位の焦点画像を形成するために、サンプル支持構造の第２の表面上の蛍光サンプリング部位の焦点画像を形成するためと異なって調整されることはない。同様に、様々な実装では、少なくとも１つの検出チャネルの、サンプル支持構造（例えばサンプル支持構造を指示する並進ステージ）と画像センサとの間の光路の光学要素は、画像センサ上のサンプル支持構造の第１の表面の蛍光サンプリング部位の焦点画像を形成するために、画像センサ上のサンプル支持構造の第２の表面上の蛍光サンプリング部位の焦点画像を形成するためと異なる量、または異なる方向で、画像センサ上で動かされる。特徴の任意の組み合わせが可能である。例えば、いくつかの実装では、フローセルの上部の内部表面の焦点画像と下部の内部表面の焦点画像とは、光学補正器を、フローセルと少なくとも１つの画像センサとの間の光路の内外に移動させることなく、および、撮像システム（例えば、対物レンズおよび／またはチューブレンズ）の１以上の光学要素を、その間の光路（例えば光軸）に沿って移動させることなく、取得することができる。例えば、フローセルの上部の内部表面の焦点画像と下部の内部表面の焦点画像とは、チューブレンズの１以上の光学要素を光路の内外に移動させることなく、または、チューブレンズの１以上の光学要素をその間の光路（例えば光軸）に沿って移動させることなく、取得することができる。
蛍光撮像モジュール、照明光路、撮像光路、対物レンズ、またはチューブレンズの任意の１以上は、フローセル上の２つの表面に対応する２つの平面、または他のサンプル支持構造、例えば蛍光サンプル部位が位置するところなどの、２つの位置における光学収差を低下させる、または最小化するように設計されていてもよい。蛍光撮像モジュール、照明光路、撮像光路、対物レンズ、またはチューブレンズの任意の１以上は、両面フローセル上の蛍光サンプル部位を含む第１の表面と第２の表面などの、他の位置または平面に対して選択された位置または平面における光学収差を低下させる、または最小化するように設計されていてもよい。例えば、蛍光撮像モジュール、照明光路、撮像光路、対物レンズ、またはチューブレンズの任意の１以上は、他の深度、または対物レンズからの他の距離の平面に関連する収差と比較して、対物レンズから異なる距離に位置する２つの深度または平面での光学収差を低下させる、または最小化するように設計されていてもよい。例えば、光学収差は、第１の表面と第２の表面とを撮像するのに、対物レンズから約１ｍｍ～約１０ｍｍに及ぶ領域の他の場所よりも小さくてもよい。追加的に、蛍光撮像モジュール、照明光路、撮像光路、対物レンズ、またはチューブレンズの任意の１以上は、いくつかの例では、サンプルが接着している面の１つ、ならびにサンプルと接触している恐らくは溶液を含む層などの、サンプル支持構造の１以上の部分を通る放射光の透過によって誘発される光学収差を補正するように構成されてもよい。この層（例えば、カバースリップまたはフローセルの壁）は、例えば、ガラス、石英、プラスチック、または屈折率を有し、光学収差を導入する他の透明な材料を含んでもよい。
従って、第１の表面と第２の表面を撮像する時、撮像性能は実質的に同じであってもよい。例えば、光学伝送関数（ＯＴＦ）および／または変調伝送関数（ＭＴＦ）は、第１の表面と第２の表面との撮像に対して実質的に同じであってもよい。これらの伝送関数のいずれかまたは両方は、例えば、１以上の指定された空間周波数での、または空間周波数の範囲にわたって平均化された時の、互いの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内、あるいは これらの値のいずれかによって形成される任意の範囲内であってもよい。従って、撮像性能メトリックは、光学補正器を、フローセルと少なくとも１つの画像センサとの間の光路の内外に移動させることなく、そして、撮像システムの１以上の光学要素（例えば、対物レンズおよび／またはチューブレンズ）をそれらの間の光路（例えば光軸）に沿って移動させることなく、フローセルの上部の内部表面または下部の内部表面の撮像に対して実質的に同じであってもよい。例えば、撮像性能メトリックは、チューブレンズの１以上の光学要素を光路の内外に移動させることなく、またはチューブレンズの１以上の光学要素をそれらの間の光路（例えば光軸）に沿って移動させることなく、フローセルの上部の内部表面または下部の内部表面の撮像に対して実質的に同じであってもよい。ＭＴＦの追加的な議論は、以下と、２０２０年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９６２，７２３号とに含まれており、当該仮特許出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
開示される撮像モジュールまたはシステムは、いくつかの例では、サンプルまたは基板表面を撮像するように設計された自立型光学システムであってもよいことが、当業者によって理解されるであろう。いくつかの例では、それらは、１以上のプロセッサまたはコンピュータを含んでもよい。いくつかの例では、それらは、機器制御機能および／または画像処理機能を提供する１以上のソフトウェアパッケージを含んでもよい。いくつかの例では、光源（例えば、固体レーザー、色素レーザー、ダイオードレーザー、アークランプ、タングステンハロゲンランプなど）、レンズ、プリズム、ミラー、ダイクロイックリフレクタ、ビームスプリッタ、光学フィルタ、光学通過帯域フィルタ、導光路、光ファイバー、開口部、および画像センサ（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサとカメラ、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサとカメラなど）などの光学部品に加えて、それらはまた、Ｘ－Ｙ並進ステージ、Ｘ－Ｙ－Ｚ並進ステージ、圧電性集光機構、電気光学位相プレートなどの機械コンポーネントおよび／または光学機械コンポーネントを含んでもよい。いくつかの例では、それらは、例えば、ゲノミクス用途（例えば、遺伝子テスト用途および／または核酸配列決定用途）のために設計されたより大きなシステムのモジュール、コンポーネント、サブアセンブリ、またはサブシステムとして機能してもよい。例えば、いくつかの例では、それらは、より大きなシステムのモジュール、コンポーネント、サブアセンブリ、またはサブシステムとして機能してもよく、それらは、遮光のおよび／または他の環境制御の筐体、温度制御モジュール、フローセルとカートリッジ、流体学制御モジュール、流体分配ロボット工学部品、カートリッジおよび／またはマイクロプレート処理（ピックアンドプレース（ｐｉｃｋ－ａｎｄ－ｐｌａｃｅ））ロボット工学部品、１以上のプロセッサまたはコンピュータ、１以上のローカルのおよび／またはクラウドベースのソフトウェアパッケージ（例えば、機器／システム制御ソフトウェアパッケージ、画像処理ソフトウェアパッケージ、データ分析ソフトウェアパッケージ）、データ記憶モジュール、データ通信モジュール（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、ＷｉＦｉ、イントラネット、またはインターネット通信ハードウェアと関連ソフトウェア）、ディスプレイモジュールなど、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。より大きなシステム、例えばゲノミクス用途のために設計されたシステムの、これらの追加的なコンポーネントは、以下により詳細に議論される。
図２Ａと図２Ｂは、マルチチャネル蛍光撮像のための照明撮像モジュール（１００）の非限定的な例を示す。照明撮像モジュール（１００）は、対物レンズ（１１０）、照明源（１１５）、複数の検出チャネル（１２０）、および第１のダイクロイックフィルタ（１３０）を含み、当該ダイクロイックフィルタは、ダイクロイックリフレクタとビームスプリッタとを含んでもよい。いくつかの設計ではオートフォーカスシステムが含まれていてもよく、当該オートフォーカスシステムは、例えばオートフォーカスレーザー（１０２）を含んでもよく、当該オートフォーカスレーザーは、画像システムの焦点が合っている時を判定するためにそのサイズがモニタリングされる、スポットを投影する。照明撮像モジュール（１００）のいくつかのまたは全てのコンポーネントは、ベースプレート（１０５）に連結されていてもよい。
照明または光源（１１５）は、少なくとも望ましい励起波長の光を生成するように構成された、任意の適切な光源も含んでもよい（以下により詳細に議論される）。光源は、１以上の励起波長範囲（またはバンド）内で光を放射する、広帯域ソースであってもよい。光源は、１以上の狭い波長範囲内で光を放射する、狭帯域ソースであってもよい。いくつかの例では、光源は望ましい励起波長に対応する、単一の隔離された波長（またはライン）、または複数の隔離された波長（またはライン）を生成してもよい。いくつかの例では、ラインは、いくつかの非常に狭い帯域幅を有していてもよい。照明源（１１５）での使用に適しているかもしれない例示的な光源は、白熱フィラメント、キセノンアークランプ、水銀ランプ、発光ダイオード、レーザーダイオードまたは固体レーザーなどのレーザー源、または他のタイプの光源、を含むがこれらに限定されない。以下に議論されるように、いくつかの設計では、光源は、直線偏光光源などの、偏光光源を含んでもよい。いくつかの実装では、光源は、ｓ－偏光光が、１以上のダイクロイックフィルタのダイクロイック反射表面などの、１以上の光学コンポーネントの１以上の表面に入射するように配向される。
照明源（１１５）は、必要に応じて、レンズ、フィルタ、光ファイバー、または任意の他の適切な透過性または反射性光学部品などの、１以上の追加的な光学コンポーネントをさらに含んでもよく、それによって、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）に対する適切な特性を有する励起光ビームを出力してもよい。例えば、ビーム成形光学部品が含まれてもよく、それによって、例えば、光源の光エミッタからの光を受け取り、およびビームを生成し、および／または望ましいビーム特性を提供してもよい。そのような光学部品は、例えば、光の逸脱を低下させ、および／またはコリメーションを増加させ、および／または光をコリメートするように構成された、コリメートレンズを含んでもよい。
いくつかの実装では、複数の光源は、照明撮像モジュール（１００）に含まれている。いくつかのそのような実装では、異なる光源は、例えば、異なる蛍光色素を励起させるために、異なるスペクトル特性を有する光を生成してもよい。いくつかの実装では、異なる光源によって生成された光は、一致して集合励起光ビームを形成するように方向付けられてもよい。この複合励起光ビームは、光源の各々からの励起光ビームで構成されてもよい。複合励起光ビームは、オーバーラップし複合ビームを形成する個別ビームよりも、多くの光学パワーを有しているだろう。例えば、２つの励起光ビームを生成する２つの光源を含むいくつかの実装では、２つの個別励起光ビームから形成された複合励起光ビームは、個別ビームの光学パワーの合計となる光学パワーを有していてもよい。同様に、いくつかの実装では、３、４、５、またはそれ以上の光源が含まれていてもよく、そして、これらの光源は、各々、共に複合ビームを形成する励起光ビームを出力してもよく、当該複合ビームは、個別ビームの光学パワーの合計となる光学パワーを有していてもよい。
いくつかの実装では、光源（１１５）は、十分に強い蛍光発光を生成するのに十分な、大量の光を出力する。より強い蛍光発光は、信号対ノイズ比（ＳＮＲ）と、蛍光撮像モジュールによって取得される画像のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）とを増加させることができる。いくつかの実装では、光源からの出力および／またはそこから導出された励起光ビーム（複合励起光ビームを含む）は、（以下により詳細に議論される通り）約０．５Ｗ～約５．０Ｗ、またはそれ以上の電力に及んでもよい。
図２Ａと図２Ｂを再び参照すると、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）は、光源からの光を受け取るために、光源に対して配置される。第１のダイクロイックフィルタは、ダイクロイックミラー、ダイクロイックリフレクタ、ダイクロイックビームスプリッタ、または第１のスペクトル領域（あるいは波長範囲）の光を透過し、かつ第２のスペクトル領域（あるいは波長範囲）を有する光を反射するように構成されたダイクロイックビーム結合器を含んでもよい。第１のスペクトル領域は、１以上のスペクトル帯、例えば紫外線および青色の波長範囲の１以上のスペクトル帯を含んでもよい。同様に、第２のスペクトル領域は、１以上のスペクトル帯、例えば、緑色から赤色に延長する波長、および赤外線の波長の１以上のスペクトル帯を含んでもよい。他のスペクトル領域または波長範囲もまた、可能である。
いくつかの実装では、第１のダイクロイックフィルタは、光源から光を、顕微鏡用スライド、キャピラリー、フローセル、マイクロ流体チップ、または他の基版あるいは支持構造などのサンプル支持構造に透過するように構成されてもよい。サンプル支持構造は、照明撮像モジュール（１００）に対して、サンプル、例えば、蛍光標識された核酸分子またはその補体を含む組成物を、支持して配置する。従って、第１の光路は、第１のダイクロイックフィルタを介して光源からサンプルに延長する。様々な実装では、サンプル支持構造は、サンプルが配置されるか、サンプルが結合するかの少なくとも１つの表面を含む。いくつかの例では、サンプルは、サンプル支持構造の少なくとも１つの表面上の異なる局所化された領域または部位内に配置されてもよく、またはそれらに結合されてもよい。
いくつかの例では、支持構造は、対物レンズ（１１０）から異なる距離（つまり、対物レンズ（１１０）の光軸に沿った異なる位置または深度）に位置する２つの表面を含んでもよく、その上にサンプルが配置される。以下に議論されるように、例えば、フローセルは、第１の内部表面と第２の内部表面（例えば上部の内部表面と下部の内部表面）によって少なくとも一部形成されている流体チャネルを含んでもよく、そして、サンプルは、第１の内部表面、第２の内部表面、および両方の内部表面上の局在化された部位に配置されてもよい。第１の表面と第２の表面は、溶液が通って流れる流体チャネルに対応する領域によって分離されてもよく、そしてそのため、照明撮像モジュール（１００）の対物レンズ（１１０）に対して、異なる距離または深度にあってもよい。
対物レンズ（１１０）は、第１のダイクロイックフィルタとサンプルとの間の第１の光路に含まれていてもよい。この対物レンズは、例えば、焦点距離、作動距離を有するように、および／または、光源からの光をサンプル上に、例えば、顕微鏡スライド、キャピラリー、フローセル、マイクロ流体チップ、または他の基板あるいは支持構造上に集中させるように設置されるように、構成されてもよい。同様に、対物レンズ（１１０）は、適切な焦点距離、作動距離を有するように、および／または、サンプルから反射され、散乱され、そして発光された光（例えば蛍光発光）を収集するように設置されるように、そしてサンプルの画像（例えば蛍光画像）を形成するように、構成されてもよい。
いくつかの実装では、対物レンズ（１１０）は、既製の対物レンズなどの顕微鏡用対物レンズを含んでもよい。いくつかの実装では、対物レンズ（１１０）は、カスタムメイドの対物レンズを含んでもよい。カスタムメイドの対物レンズおよび／またはカスタムメイドの対物レンズ－チューブレンズの組み合わせの例は、以下、および２０２０年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９６２，７２３号に記載されており、それは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。対物レンズ（１１０）は、フローセルまたは他のサンプル支持構造の２つの表面に対応する２つの平面などの２つの位置で、光学収差を低下させるか最小化するように設計されてもよい。対物レンズ（１１０）は、光路中の他の位置または平面に対して、選択された位置または平面、例えば両面フローセルの第１の表面と第２の表面で、光学収差を低下させるように設計されてもよい。例えば、対物レンズ（１１０）は、対物レンズから他の距離の他の深度または平面に関連する光学収差と比較して、対物レンズから異なる距離の２つの深度または２つの平面で光学収差を低下させるように設計されてもよい。例えば、いくつかの例では、フローセルの第１の表面と第２の表面の撮像に対する光学収差は、対物レンズの前方表面から１～１０ｍｍにわたる範囲のどこかに示されるものよりも、小さいかもしれない。追加的に、カスタムメイドの対物レンズ（１１０）は、いくつかの例では、サンプルが配置されるフローセル表面の１以上を含む層、またはフローセルの流体チャネルを満たす溶液を含む層などの、サンプル支持構造の１以上の部分を通る蛍光放射光の透過によって誘発される光学収差を補正するように構成されてもよい。これらの層は、例えばガラス、石英、プラスチック、または、屈折率を有し、そして光学収差を導入するかもしれない透明材料を含んでもよい。
いくつかの実装では、対物レンズ（１１０）は、（以下により詳細に議論されているように）０．６以上の開口数（ＮＡ）を有していてもよい。そのような開口数は、焦点および／または被写界深度の低下、バックグラウンドの識別の改善、および画像解像度の改善を提供してもよい。
いくつかの実装では、対物レンズ（１１０）は、（以下により詳細に議論されているように）０．６以下の開口数（ＮＡ）を有していてもよい。そのような開口数は、焦点深度および／または被写界深度の増加を提供してもよい。そのような焦点深度および／または被写界深度の増加は、両面フローセルの第１の表面と第２の表面を分離する距離によって分離された平面を画像化する能力を増加させてもよい。
上に議論される通り、フローセルは、例えば、分析物または試薬が流れることができる流体チャネルによって分離される、第１の内部表面と第２の内部表面とをそれぞれ含む第１の層と第２層とを含んでもよい。いくつかの実装では、対物レンズ（１１０）および／または照明撮像モジュール（１００）は、同等の光学解像度で、第１の表面と第２の表面との撮像間で撮像モジュールを再集光させることによって連続的に、または被写界深度および／または焦点深度を確実に十分な大きさにすることによって同時に、のいずれかで、フローセルの第１の内部表面と第２の内部表面の両方を撮像するのに十分大きな被写界深度および／または焦点深度とを提供するように、構成されてもよい。いくつかの例では、被写界深度および／または焦点深度は、フローセルの第１の内部表面と第２の内部表面などの、撮像されるフローセルの第１の表面と第２の表面とを分離する距離と同じくらい大きくてもよく、またはそれより大きくてもよい。いくつかの例では、第１の表面と第２の表面、例えば、両面フローセルまたは他のサンプル支持構造の第１の内部表面と第２の内部表面は、例えば、（以下により詳細に議論されるように）約１０μｍ～約７００μｍ、またはそれ以上に及ぶ距離によって分離されていてもよい。いくつかの例では、被写界深度および／または焦点深度は、従って、（以下により詳細に議論されるように）約１０μｍ～約７００μｍ、またはそれ以上に及んでもよい。
いくつかの設計では、補正光学部品（例えば「光学補正器」または「補正器」）は、撮像モジュールの光路、例えば対物レンズ（１１０）によって収集される光が画像センサに送達される光路の内外に移動されてもよく、それによって、撮像モジュールが、両面フローセルの第１の表面と第２の表面とを撮像することを可能にしてもよい。撮像モジュールは、補正光学部品が、対物レンズと、第１の表面の画像を捕捉するように構成された画像センサまたは光検出器アレイとの間の光路に含まれている時、例えば、第１の表面を撮像するように構成されてもよい。そのような設計では、撮像モジュールは、補正光学部品が対物レンズ（１１０）と、第２の表面の画像を捕捉するように構成された画像センサまたは光検出器アレイとの間の光路から取り出されるか、またはそこに含まれていない時、第２の表面を撮像するように構成されてもよい。光学補正器の必要性は、高い開口数（ＮＡ）値、例えば、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも１．０、またはそれ以上の開口数で、対物レンズ（１１０）を使用する時に、より顕著になるかもしれない。いくつかの実装では、光学補正光学部品（例えば光学補正器または補正器）は、レンズなどの光学要素、ガラス、などの光学透明材料などのプレート、ガラスなどの光学透明材料のプレート、あるいは偏光ビームの場合には、１／４波長プレート、または１／２波長プレートを含む。他の構成が、第１の表面と第２の表面が異なる時間で撮像されることを可能にするために、使用されてもよい。例えば、１以上のレンズまたは光学要素は、対物レンズ（１１０）と画像センサとの間の光路の内外へ、またはそれに沿って、並進されるように構成されてもよい。
しかし、特定の設計では、そのような補正光学部品が、対物レンズと画像センサまたは光検出器アレイとの間の光路などの撮像モジュールの光路の中外へ移動することなく、同等の光学解像度で、第１の表面と第２の表面が撮像され得るように、対物レンズ（１１０）は十分に大きな焦点深度および／または被写界深度を提供するように構成されている。同様に、様々な設計では、光学部品が移動することなく、例えば、１以上の対物レンズまたは光学コンポーネントが、画像センサまたは光検出器アレイとの間の光路などの撮像モジュールの光路に沿って並進することなく、同等の光学解像度で、第１の表面と第２の表面が撮像され得るように、対物レンズ（１１０）は十分に大きな焦点深度および／または被写界深度を提供するように構成されている。そのような対物レンズの例は、以下により詳細に記載されるだろう。
いくつかの実装では、対物レンズ（または顕微鏡対物レンズ）（１１０）は、低下倍率を有するように構成されてもよい。対物レンズ（１１０）は、例えば、蛍光撮像モジュールが（以下により詳細に議論されるように）２ｘ未満から１０ｘ未満の倍率を有するように、構成されてもよい。他の設計パラメータが達成され得るように、そのような低下倍率が設計制約を変更してもよい。例えば、対物レンズ（１１０）はまた、蛍光撮像モジュールが、以下により詳細に議論されるように、約１．０ｍｍから約５．０ｍｍ（例えば直径、幅、長さ、または最長寸法で）にわたる大きな視野（ＦＯＶ）を有するように構成されてもよい。
いくつかの実装では、対物レンズ（１１０）は、上に示されるような視野を蛍光撮像モジュールに提供するように構成されていてもよく、それによって、ＦＯＶは、以下により詳細に議論されるように、例えば収差の０．１５未満の回折限界性能を、フィールドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％にわたって有することになる。
いくつかの実装では、対物レンズ（１１０）は、上に示されるような視野を蛍光撮像モジュールに提供するように構成されていてもよく、それによって、ＦＯＶは、以下により詳細に議論されるように、例えば０．８を超えるストレール比の回折限界性能を、フィールドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％にわたって有することになる。
図２Ａと図２Ｂとを再び参照すると、第１のダイクロイックビームスプリッタまたはビーム結合器は、１以上の励起ビームでサンプルを照らすように、光源とサンプルとの間の第１の光路内に配置される。この第１のダイクロイックビームスプリッタまたは結合器は、蛍光発光を検知するために使用されるサンプルから異なる光学チャネルへの、１以上の第２の光路中に存在する。従って、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）は、照明源（１１５）によって発光された励起ビームの第１の光路を、様々な光学チャネルへのサンプル試料によって発光された放射光の第２の光路に連結し、ここで、光は、サンプルの捕捉画像に対するそれぞれの画像センサまたは光検出器アレイに方向付けられる。
様々な実装では、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）、例えば第１のダイクロイックリフレクタ、ビームスプリッタは、望ましい励起波長を含む特定波長または恐らくは複数の波長バンド内、のみの照明源（１１５）から光を透過するために選択される通過帯域を有する。例えば、第１のダイクロイックビームスプリッタ（１３０）は、分光固有透過率レスポンスを有するダイクロイックリフレクタを含む反射表面を含み、すなわち、例えば、励起ビームの一部を形成する光源によって出力される波長の少なくともいくらかを有する光を、透過するように構成されている。分光固有透過率レスポンスは、１以上の他の波長、例えば、１以上の他の蛍光発光波長の光を透過しないように（例えば代わりに反射するように）、構成されてもよい。いくつかの実装では、分光固有透過率レスポンスはまた、光源による、１以上の他の波長出力の光を透過しないように（例えば代わりに反射するように）、構成されてもよい。従って、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）は、光源による光出力のどの波長がサンプルに到達するかを選択するために利用されてもよい。反対に、第１のダイクロイックビームスプリッタ（１３０）中のダイクロイックリフレクタは、サンプルからの望ましい蛍光発光に対応する１以上の波長を有する光を反射し、および、サンプルに到達するように意図されている光源からの１以上の波長出力を有する光を反射することができる、分光反射率レスポンスを有する。従って、いくつかの実装では、ダイクロイックリフレクタは、サンプルに入射する光を透過する１以上の通過帯域と、当該通過帯域の外側の光、例えば、サンプルに到達するように意図されていない、１以上の発光波長の光と、光源によって出力される恐らくは１以上の波長の光とを、反射する１以上の阻止帯域とを含む、分光固有透過率を有する。同様に、いくつかの実装では、ダイクロイックリフレクタは、サンプルに到達するように意図されていない、１以上の発光波長、および光源によって出力される恐らくは１以上の波長とを、反射するように構成される１以上のスペクトル領域と、これらの反射領域の外側の光を透過する１以上の領域とを含む、分光反射率を有する。第１のダイクロイックフィルタ（１３０）中に含まれるダイクロイックリフレクタは、適切な分光透過率分配と分光反射率分配とを提供するように構成される、干渉フィルタ（例えば１／４波スタック）などの、反射フィルタを含んでもよい。図２Ａと図２Ｂはまた、例えば、オートフォーカスレーザー（１０２）を対物レンズを通ってサンプル支持構造に方向付けるために使用され得る、ダイクロイックビームスプリッタまたはビーム結合器を含み得る、ダイクロイックフィルタ（１０５）を示す。
図２Ａと図２Ｂとに示され、そして上に議論される撮像モジュール（１００）は、励起ビームが第１のダイクロイックフィルタ（１３０）によって対物レンズ（１１０）に透過されるように構成されるが、いくつかの設計では、照明源（１１５）は、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）に対して配置されてもよく、および／または、第１のダイクロイックフィルタは、励起ビームが第１のダイクロイックフィルタ（１３０）によって対物レンズ（１１０）に反射されるように、構成される（例えば配向付けられる）。同様に、いくつかのそのような設計では、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）は、サンプルから蛍光発光を透過するように、そして恐らくは、サンプルに到達するようには意図されていない光源からの１以上の波長出力を有する光を透過するように、構成される。以下に議論されるように、蛍光発光が反射される代わりに透過される設計は、潜在的に、検出された発光の波長エラーを低下させてもよく、および／または、恐らくは他の利点を有していてもよい。いずれの場合も、様々な実装では、第１のダイクロイックリフレクタ（１３０）は、第２の光路中に、サンプルからの蛍光発光を受け取るように配置され、当該蛍光発光の少なくともいくらかは、検出チャネル（１２０）に続く。
図３Ａと図３Ｂは、図２Ａと図２Ｂのマルチチャネル蛍光撮像モジュール内の光路を示す。図２Ａと図３Ａに示される例では、検出チャネル（１２０）は、対物レンズ（１１０）によって透過され、そして第１のダイクロイックフィルタ（１３０）によって反射される、サンプル試料からの蛍光発光を受け取るように配置される。上に言及され、そして以下により詳細に記載されるように、いくつかの設計では、検出チャネル（１２０）は、第１のダイクロイックフィルタによって反射されるよりはむしろ、透過される放射光の一部を受け取るように配置されてもよい。いずれの場合も、検出チャネル（１２０）は、放射光の少なくとも一部を受け取るための光学部品を含んでもよい。例えば、検出チャネル（１２０）は、チューブレンズなどの１以上のレンズを含んでいてもよく、そして、光検出器アレイ（例えばＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサアレイ）などの、撮像するためのまたは受け取られた光を基に信号を生成するための、１以上の画像センサを含んでもよい。チューブレンズは、例えば、サンプルの画像を、その画像を捕捉するためのセンサまたは光検出器アレイ上に形成するように構成された、１以上のレンズ要素を含んでもよい。検出チャネルについてのさらなる議論は、以下、および２０２０年１月１７日に出願された米国の仮特許出願６２／９６２，７２３号に含まれ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、改善された光学解像度は、適切なサンプリングスキームと併せて、比較的高感度、小画素、および高画素数を有する画像センサを使用して達成されてもよく、それはオーバーサンプリングまたはアンダーサンプリングを含んでもよい。
図３Ａと３Ｂは、図２Ａと図２Ｂの照明撮像モジュール（１００）の光路を示す、光線追跡ダイアグラムである。図３Ａは、照明撮像モジュール（１００）の平面図に相当する。図３Ｂは、照明撮像モジュール（１００）の側面図に相当する。これらの図に示される照明撮像モジュール（１００）は、４つの検出チャネル（１２０）を含む。しかし、開示される照明撮像モジュールが、４を上回るまたは下回る検出チャネル（１２０）を含むシステムに等しく実装されてもよいことが理解されるだろう。例えば、本明細書に開示されるマルチチャネルシステムは、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、わずか１つの検出チャネル（１２０）、または２つもの検出チャネル（１２０）、３つもの検出チャネル（１２０）、４つのもの検出チャネル（１２０）、５つもの検出チャネル（１２０）、６つもの検出チャネル（１２０）、７つもの検出チャネル（１２０）、８つもの検出チャネル（１２０）で実装されてもよい。
図３Ａと図３Ｂに示される、撮像モジュール（１００）の非限定的な例は、４つの検出チャネル（１２０）と、放射光のビーム（１５０）を反射する第１のダイクロイックフィルタ（１３０）と、ビーム（１５０）を透過分と反射分とに分割する第２のダイクロイックフィルタ（例えばダイクロイックビームスプリッタ）（１３５）と、個々の検出チャネル（１２０）の中で、ビーム（１５０）の透過分と反射分をさらに分割する２つのチャネル特異的ダイクロイックフィルタ（例えばダイクロイックビームスプリッタ）（１４０）と、を含む。検出チャネルの中のビーム（１５０）を分割するためのダイクロイックビームスプリッタ（１３５）と（１４０）中のダイクロイック反射表面は、ビーム（１５０）の軸、または撮像モジュールの光軸に対して４５度に配置されて示されている。しかし、以下に議論されるように、４５度未満の角度が使用されてもよく、そして、通過帯域から阻止帯域への鋭い遷移などの利点を提供してもよい。
異なる検出チャネル（１２０）が撮像デバイス（１２４）を含み、当該撮像デバイス（１２４）が画像センサまたは光検出器アレイ（例えばＣＣＤまたはＣＭＯＳ検出器アレイ）を含んでもよい。異なる検出チャネル（１２０）は、レンズ（例えば１以上のチューブレンズで、各々が１以上のレンズ要素を含む）などの光学部品（１２６）をさらに含み、当該レンズ要素は、光検出器アレイ（１２４）の平面と一致する焦点平面で検出チャネル（１２０）に進入する放射光の一部を集光するように配置される。対物レンズ（１１０）と組み合わされた光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、サンプルの画像、例えばフローセルまたは他のサンプル支持構造の表面の画像を捕捉するために、サンプルが表面に結合された後に、サンプルの画像を光検出器アレイ（１２４）上に形成するように構成されている。従って、サンプルのそのような画像は、サンプル支持構造の空間範囲にわたる、複数の蛍光発光スポットまたは蛍光放射領域を含んでいてもよく、ここで、サンプルは蛍光光を放射している。対物レンズ（１１０）は光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）と共に、サンプルの一部またはサンプル全体を含む視野（ＦＯＶ）を提供してもよい。同様に、異なる検出チャネル（１２０）の光検出器アレイ（１２４）は、対物レンズとチューブレンズ、またはそれらの一部によって提供される視野（ＦＯＶ）の全フィールドの画像を捕捉するように構成されてもよい。いくつかの実装では、いくらかまたは全ての検出チャネル（１２０）の光検出器アレイ（１２４）は、サンプル支持構造、例えばフローセルの表面上に配置されたサンプルによって発光される放射光、またはその一部を検出することができ、そして、その画像を表わす電子化データを記録することができる。いくつかの実装では、いくらかまたはすべての検出チャネル（１２０）の光検出器アレイ（１２４）は、フローセル上に配置されたサンプルの、および／または対物レンズと光学部品（１２６）および／または（１２２）（例えばチューブレンズの要素）によって提供される視野（ＦＯＶ）の全視野の画像を捕捉する、および／または記憶することなく、試料によって発光される放射光中の特徴を検知することができる。いくつかの実装では、以下に議論されるように、開示される例えば対物レンズ（１１０）と、光学部品（１２６）および／または（１２２）との組み合わせによって提供される）撮像モジュール（のＦＯＶは、例えば約１ｍｍ～５ｍｍ（例えば直径、幅、長さ、または最長寸法で）に及んでもよい。ＦＯＶは、例えば、撮像モジュールの倍率と解像度との間のバランスを提供するように、および／または画像センサおよび／または対物レンズの１以上の特性に基づいて、選択されてもよい。例えば、比較的小さなＦＯＶは、高スループットを達成するために、より小さくより高速な画像センサと併せて提供されてもよい。
図３Ａと図３Ｂを再び参照すると、いくつかの実装では、検出チャネル（例えばチューブレンズ）中の光学部品（１２６）は、対物レンズ（１１０）との組み合わせで光学部品（１２６）を使用して、取得した画像中の光学収差を低下させるように構成されてもよい。異なる発光波長で撮像するための複数の検出チャネルを含むいくつかの実装では、異なる検出チャネルに対する光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、それぞれの発光波長に対する収差を低下させるために異なる設計を有しており、特定のチャネルは、当該発光波長で撮像するように構成されている。いくつかの実装では、光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、蛍光サンプル部位をその上に配置して含むサンプル支持構造上の特定の表面（例えば平面、対物平面など）を撮像する時に、他の位置（例えば対物スペースの他の平面）と比較して、収差を低下させるように構成されていていてもよい。同様に、いくつかの実装では、光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、蛍光サンプル部位をその上に配置して有する、両面サンプル支持構造（例えば両面フローセル）上の第１の表面と第２の表面（例えば、第１の対物平面と第２の対物平面など）を撮像する時に、他の位置（例えば対物スペースの他の平面）と比較して、収差を低下させるように構成されてもよい。例えば、検出チャネル中の光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、対物レンズから他の距離の他の深度または平面に関連する収差と比較して、対物レンズから異なる距離の２つの深度または２つの平面で収差を低下させるように設計されてもよい。例えば、光学収差は、対物レンズから約１ｍｍ～約１０ｍｍの領域の他の場所よりも、第１の表面と第２の表面の撮像に対して小さくなるかもしれない。追加的に、検出チャネル中のカスタムメイドの光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、いくつかの実施形態では、サンプルが配置される表面の１つを含む層、ならびにサンプルが配置される表面に隣接し、そして接触している恐らくは溶液などの、サンプル支持構造の１以上の部分を通る放射光の透過によって誘発される収差を補正するように構成されてもよい。サンプルが配置される表面の１つを含む層は、例えばガラス、石英、プラスチック、または屈折率を有し、そして光学収差を導入する他の透明な材料を含んでもよい。検出チャネルの光学部品（１２６）（例えばチューブチャネル）は、例えば、いくつかの実装では、サンプル支持構造、例えばカバースリップまたはフローセル壁、あるいは他のサンプル支持構造コンポーネントならびにサンプルが配置される表面に隣接し、そして接触している恐らくは溶液など、によって誘発される光学収差を補正するように構成されてもよい。
いくつかの実装では、検出チャネルの光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、低下倍率を有するように構成されている。検出チャネルの光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、以下にさらに議論されるように、例えば、蛍光撮像モジュールが、例えば１０ｘ未満の倍率を有するように構成されてもよい。他の設計パラメータが達成され得るように、そのような低下倍率が設計制約を変更してもよい。例えば、光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）はまた、以下にさらに議論されるように、蛍光撮像モジュールが、例えば、少なくとも１．０ｍｍ以上（例えば直径、幅、長さ、または最長寸法）の視野（ＦＯＶ）を有するように構成されてもよい。
いくつかの実装では、光学部品（１２６）（例えばチューブレンズ）は、以下にさらに議論されるように、ＦＯＶが、０．１５波未満の収差を、フィールドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％にわたって有するように、上に示される視野を撮像モジュールに提供するように構成されてもよい。
図３Ａと図３Ｂを再び参照すると、様々な実装では、サンプルは、対物レンズ（１１０）の焦点位置（１１２）に、またはその近くに位置する。図２Ａと図２Ｂに関連して上に記載されるように、レーザー源などの光源は、励起ビームをサンプルに提供して蛍光を誘発する。蛍光放射の少なくとも一部は、放射光として対物レンズ（１１０）によって収集される。対物レンズ（１１０）は、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）の方に放射光を透過し、前記第１のダイクロイックフィルタ（１３０）は、放射光のいくらかまたは全てを、第２のダイクロイックフィルタ（１３５）に入射する異なる検出チャネルへのビーム（１５０）として反射し、当該検出チャネルの各々は、サンプルの画像（例えばサンプル支持構造の表面上の複数の蛍光サンプル部位）を光検出アレイ（１２４）上に形成する光学部品（１２６）を含む。
上に議論されるように、いくつかの実装では、サンプル支持構造は、蛍光放射を発光するサンプリング部位を含む、２つの表面（例えば２つの内部表面、第１の表面および第２の表面など）を有する両面フローセルなどのフローセルを含む。これらの２つの表面は、長手方向（Ｚ）に互いからある距離だけ分離されていてもよく、当該長手方向（Ｚ）は、励起ビームの中心軸、および／または、対物レンズの光軸の方向に沿うものであってもよい。この分離は、例えば、フローセル内のフローチャネルに相当してもよい。分析物または試薬は、フローチャネルを通じて流されて、フローセルの第１の内部表面と第２の内部表面に接触してもよく、そのことによって、分析物または試薬が結合組成物と接触してもよく、その結果、蛍光発光が第１の内部表面と第２の内部表面上の複数の部位から放射される。撮像光学部品（例えば対物レンズ（１１０））は、サンプルから適切な距離（例えば作動距離に対応する距離）に配置されて、サンプルの焦点画像を１以上の検出器アレイ（１２４）上に形成してもよい。上に議論されるように、様々な設計では、（恐らくは光学部品（１２６）との組み合わせによる）対物レンズ（１１０）は、第１の表面と第２の表面との間に、縦方向の分離と少なくとも同じくらいの大きさの被写界深度および／または焦点深度を有していてもよい。（各検出チャネルの）対物レンズ（１１０）と光学部品（１２６）は、そのため、第１のフローセル表面と第２のフローセル表面の両方の画像を、光検出器アレイ（１２４）上に同時に形成することができ、そして、第１の表面と第２の表面のこれらの画像は、両方とも焦点が合っており、そして同等の光学解像度を有している（または、同等の光学解像度を有する第１の表面と第２の表面の画像を取得するために、対物レンズのわずかな再集光のみで焦点を合わせることができる）。様々な実装では、補正光学部品は、同等の光学解像度である第１の表面と第２の表面の焦点画像を形成するために、撮像モジュールの光路の内外（例えば第１の光路および／または第２の光路の中外へ）移動される必要はない。同様に、様々な実装では、撮像モジュール（例えば対物レンズ（１１０）またはチューブレンズ（１２６））の１以上の光学要素（例えばレンズ要素）は、例えば、第２の表面の焦点画像を形成するために使用される時の前記１以上の光学要素の位置と比較して、第１の表面の焦点画像を形成するために、第１の光路および／または第２の光路に沿って、長手方向に動かされる必要は無い。いくつかの実装では、撮像モジュールは、画像が同等の光学解像度を有するように、第１の表面と第２の表面上で、撮像モジュールを高速かつ連続的に再集光させるように構成されているオートフォーカスシステムを含む。いくつかの実装では、対物レンズ（１１０）および／または光学部品（１２６）は、光学補正器を第１の光路および／または第２の光路の内外に移動させることなく、そして、１以上のレンズ要素（例えば対物レンズ（１１０）および／または光学部品（１２６）（チューブレンズなど））を第１の光路および／または第２の光路に沿って長手方向に移動させることなく、第１のフローセル表面と第２のフローセル表面の両方が、同時に同等の光学解像度で焦点が合うように、構成されてもよい。いくつかの実装では、本明細書に開示される新規の対物レンズおよび／またはチューブレンズ設計を使用して、（例えば表面間の再集光で）連続的に、または（例えば表面間の再集光無しで）同時にのいずれかで取得された、第１の表面および／または第２の表面の画像は、第１の表面と第２の表面の画像が同等の光学解像度を有するように、適切な画像処理アルゴリズムを使用してさらに処理されて、画像の有効光学解像度を向上させてもよい。様々な実装では、サンプル平面は、第１のフローセル表面および／または第２のフローセル表面上のサンプル部位を解像するように十分に焦点が合っており、サンプル部位は、側方方向（例えばＸ方向とＹ方向）に緊密に離間されている。
上に議論されるように、ダイクロイックフィルタは、異なる屈折率と特定の厚みを有する光学コーティングの層を使用して、異なる波長の光を薄膜干渉の原理に基づいて選択的に透過し、そして反射する、干渉フィルタを含んでもよい。従って、マルチチャネル蛍光撮像モジュール内に実装されたダイクロイックフィルタのスペクトル応答（例えば透過スペクトルおよび／または反射スペクトル）は、励起ビームおよび／または発光ビームの光がダイクロイックフィルタに入射する入射角度、または入射角度の範囲に少なくとも部分的に左右されてもよい。そのような効果は、検出光経路（例えば図３Ａと図３Ｂのダイクロイックフィルタ（１３５）と（１４０））のダイクロイックフィルタに関して、特に重要であるかもしれない。
図４は、ダイクロイックフィルタの性能とビームの入射角度（ＡＯＩ）との関係を示すグラフである。具体的には、図４のグラフは、ダイクロイックフィルタの遷移幅またはスペクトルスパンに対する入射角度の影響を示し、それは、波長の範囲に相当し、ここで、スペクトル応答（例えば透過スペクトルおよび／または反射スペクトル）は、ダイクロイックフィルタの通過帯域領域と阻止帯域領域との間で遷移する。そのため、比較的小さなスペクトルスパン（例えば図４のグラフの小さなデルタλ値）を有する透過エッジ（または反射エッジ）は、通過帯域領域と阻止帯域領域との間、あるいは、透過領域と反射領域との間（あるいは反対に反射領域と透過領域との間）の、より鋭い遷移に相当し、他方、比較的大きなスペクトルスパン（例えば図４のグラフの大きなデルタ＿λ値）を有する透過エッジ（または反射エッジ）は、通過帯域領域と阻止帯域領域との間の、より穏やかな遷移に相当する。様々な実装では、通過帯域領域と阻止帯域領域との間のより鋭い遷移が、一般に望ましい。さらに、視野および／またはビームエリアの全てにわたる、または大部分にわたる、一貫性の向上、または比較的一貫した遷移幅を有することもまた、望ましいかもしれない。
蛍光撮像モジュールは、その中にダイクロイックミラーが放射高のビーム軸の中心または（例えば対物レンズおよび／またはチューブレンズの）光路の光軸に対して４５度に配置されており、従って、図４に示されるように、例示的ダイクロイックフィルタに対して、およそ５０ｎｍの遷移幅を有することができる。放射光ビームがコリメートされず、そして数度の逸脱を有するので、蛍光撮像モジュールは、ビームの対向側面間でおよそ５度の、一連の入射角度を有していてもよい。そのため、図４に示されるように、放射光のビームの異なる部分は、４０度と５０度との間の様々な入射角度でチャネル分割ダイクロイックフィルタに入射してもよい。比較的大きな入射角度のこの範囲は、約４０ｎｍと約６２ｎｍとの間の一連の遷移幅の範囲に相当する。比較的大きな入射角度のこの範囲は、このことによって、撮像モジュールでダイクロイックフィルタの遷移幅の増加に結びつく。マルチチャネル蛍光撮像モジュールの性能は、従って、全ビームにわたってより小さな入射角度を提供することによって改善されてもよく、このことによって、透過エッジはより鋭くなり、異なる蛍光発光バンド間でより良い区別が可能になる。
図５は、ダイクロイックフィルタのビームフットプリントサイズ（ＤＢＳ）とビームの入射角度（ＤＢＳ角度）との間の関係を示すグラフである。いくつかの例では、より小さなビームフットプリントが望ましいかもしれない。例えば、小さなビームフットプリントによって、ダイクロイックフィルタは、ビームを異なる波長範囲に分割するために使用され得る。より小さなダイクロイックフィルタを使用すると、代わりに、製造コストが低下し、そして適切に水平なダイクロイックフィルタの製造が容易になる。図５に示されるように、０度（つまりダイクロイックフィルタの表面に垂直）を超える任意の入射角度は、結果的に、ビームの断面積より大きな面積を有する楕円形のビームフットプリントをもたらす。４５度の入射角度は、結果的に、０度で入射する時のビームの断面積の１．４倍を超える大きなビームフットプリントを、ダイクロイックリフレクタ上にもたらす。
図６Ａと図６Ｂは、マルチチャネル蛍光撮像モジュール中のダイクロイックフィルタと検出チャネルとの非限定的な例示的構成を概略的に示し、ここで、ダイクロイックミラーは、放射光のビーム軸中心または（例えば対物レンズおよび／またはチューブレンズの）光路の光軸に対して、４５度未満の角度で配置される。図６Ａは、複数の検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）、（５２０ｃ）、（５２０ｄ）を含む撮像モジュール（５００）を描写する。図６Ｂは、図６Ａに示されるような円（５Ｂ）の内の撮像モジュール（５００）の一部についての詳細図である。より詳細に記載されるように、図６Ａと図６Ｂに示される構成は、結果的に、従来のマルチチャネル蛍光撮像モジュール設計を上回る大幅な改善をもたらし得る、多くの態様を含む。しかし、いくつかの例では、本開示の蛍光撮像モジュールおよびシステムは、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、図６Ａと図６Ｂに関して記載される特徴の１つまたはサブセットで実装されてもよい。
図６Ａに描写される撮像モジュール（５００）は、対物レンズ（５１０）と、対物レンズ（５１０）によって透過される放射光を受け取るおよび／または撮像するように配置された４つの検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）、（５２０ｃ）、および（５２０ｄ）とを含む。第１のダイクロイックフィルタ（５３０）は、励起光路と検出光路とを連結するために提供される。図２Ａと図２Ｂ図ならびに図３Ａと図３Ｂに示される設計とは対照的に、第１のダイクロイックフィルタ（５３０）（例えばダイクロイックビームスプリッタまたは結合器）は、光源から対物レンズ（５１０）およびサンプルへの光を反射するように、そして、サンプルから検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）、（５２０ｃ）、および（５２０ｄ）への蛍光発光を透過するように構成される。第２のダイクロイックフィルタ（５３５）は、第１の部分（５５０ａ）を透過し、かつ第２の部分（５５０ｂ）を反射することによって、少なくとも２つの検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）の中の放射光のビームを分割する。追加的なダイクロイックフィルタ（５４０ａ）、（５４０ｂ）は、放射光をさらに分割するために提供される。ダイクロイックフィルタ（５４０ａ）は、放射光の第１の部分（５５０ａ）の少なくとも一部を透過し、そして第３の検出チャネル（５２０ｃ）の一部（５５０ｃ）を反射する。ダイクロイックフィルタ（５４０ｂ）は、放射光の第２の部分（５５０ｂ）の少なくとも一部を透過し、そして第４の検出チャネル（５２０ｄ）の一部（５５０ｄ）を反射する。撮像モジュール（５００）は４つの検出チャネルと共に描写されているが、様々な実施形態で、撮像モジュール（５００）は、より多くの検出チャネルまたはより少ない検出チャネルを、対応するより多数またはより少数のダイクロイックフィルタと共に含んでもよく、それによって、必要に応じて、放射光の一部を各検出チャネルに提供する。例えば、いくつかの実施形態では、撮像モジュール（５００）の特徴が、２つの検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）のみを含み、かつ追加的ダイクロイックフィルタ（５４０ａ）、（５４０ｂ）を省略する、簡易版撮像モジュールに、同様の有利な効果と共に実装されてもよい。いくつかの実装では、１つの検出チャネルのみが含まれていてもよい。代替的に、３以上の検出チャネルが使用されてもよい。
図６Ａに示され検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）、（５２０ｃ）、（５２０ｄ）は、図２Ａ－図３Ｂに示される検出チャネル（１２０）のコンポーネントと同じ、または同様のコンポーネントのいくつかまたは全てを含んでもよい。例えば、異なる検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）、（５２０ｃ）、（５２０ｄ）は、１以上の画像センサまたは光検出器アレイを含んでいてもよく、そして、検出チャネルによってそれぞれの画像センサまたは光検出アレイ上に受け取られた光を集光する、１以上のレンズ（例えばチューブレンズ）などの、透過光学部品および／または反射光学部品を含んでもよい。
対物レンズ（５１０）は、試料からの蛍光によって発光される放射光を受け取るために配置される。特に、第１のダイクロイックフィルタ（５３０）は、対物レンズ（５１０）によって収集されそして透過された放射光を受け取るように配置される。上に議論され、そして図６Ａに示されるように、いくつかの設計では、レーザー源などの照明源（例えば図２Ａと図２Ｂの照明源（１１５））は、第１のダイクロイックフィルタ（５３０）に入射する励起ビームを提供するように配置され、それによって、第１のダイクロイックフィルタ（５３０）が励起ビームを同じ対物レンズ（５１０）に反射し、当該対物レンズ（１５０）が、放射光を例えば 落射蛍光構成で透過する。いくつかの他の設計では、照明源は、同じ対物レンズ（５１０）を含まない、異なる光路に沿った他の光学コンポーネントによって、試料に方向付けられてもよい。そのような構成では、第１のダイクロイックフィルタ（５３０）は省略されてもよい。
同様に、上に議論され、そして図６Ａに示されるように、検出光学部品（例えば検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）、（５２０ｃ）、（５２０ｄ）と、対物レンズ（５１０）と検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）、（５２０ｃ）、（５２０ｄ）との間の光路に沿ったダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、（５４０ｂ）などの任意の光学コンポーネントを含む）は、第１のダイクロイックフィルタ（５３０）の反射経路上というよりはむしろ、第１のダイクロイックフィルタ（５３０）の透過経路上に配置されてもよい。１つの例示的実装では、対物レンズ（５１０）と検出光学部品とは、対物レンズ（５１０）が放射光のビーム（５５０）を第２のダイクロイックフィルタ（５３５）の方へ直接透過するように、配置される。放射光の波面品質は、放射光のビーム（５５０）の経路に沿った第１のダイクロイックフィルタ（５３０）の存在によって（例えばビーム（５５０）にいくらか波面誤差を与えることによって）悪化させられるかもしれない。しかし、ダイクロイックビームスプリッタのダイクロイックリフレクタを通して透過されるビームによって導入される波面誤差は、通常、ダイクロイックビームスプリッタのダイクロイック反射表面から反映されたビームの波面誤差よりも、有意に小さい（桁違いに小さい）。そのため、マルチチャネル蛍光撮像モジュール中の放射光の波面品質と結果としての撮像品質とは、検出光学部品を、第１のダイクロイックフィルタ（５３０）の反射ビーム経路に沿ってというよりはむしろ、透過ビーム経路に沿って配置することによって、実質的に改善されてもよい。
さらに図６Ａを参照すると、撮像モジュール（５００）の検出光学部品内では、ダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、および（５４０ｂ）が、検出チャネル（５２０ａ）、（５２０ｂ）、（５２０ｃ）、（５２０ｄ）の中の放射光のビーム（５５０）を分割するために提供される。例えば、ダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、および（５４０ｂ）は、放射光の第１の波長または波長域が第１の検出チャネル（５２０ａ）によって受け取られ得るように、放射光の第２の波長または波長域が第２の検出チャネル（５２０ｂ）によって受け取られ得るように、放射光の第３の波長または波長域が第３の検出チャネル（５２０ｃ）によって受け取られ得るように、そして、放射光の第４の波長または波長域が第４の検出チャネル（５２０ｄ）によって受け取られ得るように、波長に基づいてビーム（５５０）を分解する。いくつかの実装では、複数の分離された波長または波長域が、検出チャネルによって受け取られ得る。
図２Ａと図２Ｂ、ならびに図３Ａと図３Ｂに示されるマルチチャネル蛍光撮像モジュール設計とは対照的に、撮像モジュール（５００）は、入射ビームの中心ビーム軸に対して４５度未満の入射角度で配置された、ダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、および（５４０ｂ）を有する。図６Ｂに示されるように、異なるビーム（５５０）、（５５０ａ）、（５５０ｂ）は、それぞれの中心ビーム軸（５５２）、（５５２ａ）、（５５２ｂ）を有する。様々な実装では、中心ビーム軸（５５２）、（５５２ａ）、（５５２ｂ）は、ビームの伝搬方向に対して直交するビームの断面の中心にある。これらの中心ビーム軸（５５２）、（５５２ａ）、（５５２ｂ）は、別のチャネル内の対物レンズおよび／または光学部品の光軸、例えばそれぞれのチューブレンズの光軸に相当してもよい。各ビーム（５５０）、（５５０ａ）、（５５０ｂ）の追加的な光線（５５４）、（５５４ａ）、（５５４ｂ）が、各ビーム（５５０）、（５５０ａ）、（５５０ｂ）の直径を示すために、図６Ｂに示される。ビーム直径は、例えば、最大直径の半分での全幅、Ｄ４σ（つまり、σの４倍で、式中σは、ビームの水平または垂直のそれぞれの周辺分布の標準偏差である）、または、二次モーメント幅、またはビーム直径の任意の他の適切な定義として定義されてもよい。
放射光のビーム（５５０）の中心ビーム軸（５５２）は、第２のダイクロイックフィルタ（５３５）へのビーム（５５０）の入射角度を定義するための基準点として役立ち得る。従って、ビーム（５５０）の「入射角度」（ＡＯＩ）は、例えば、入射ビーム（５５０）の中心ビーム軸（５５２）と、ビームが入射する表面（例えばダイクロイック反射面）に対して垂直なラインＮとの間の角度であってもよい。放射光のビーム（５５０）が入射角度ＡＯＩでの第２のダイクロイックフィルタ（５３５）のダイクロイック反射表面に入射する時、第２のダイクロイックフィルタ（５３５）は、放射光の第１の部分（５５０ａ）（例えば第２のダイクロイックフィルタ（５３５）の通過帯域領域内の波長を有する部分）を透過させ、そして放射光の第２の部分（５５０ｂ）（例えば第２のダイクロイックフィルタ（５３５）の阻止帯域領域内の波長を有する部分）を反射する。第１の部分（５５０ａ）と第２の部分（５５０ｂ）は、各々、中心ビーム軸（５５２ａ）、（５５２ｂ）に関して同様に説明されてもよい。上に参照されるように、光軸は、二者択一的に、または追加的に使用されてもよい。
図６Ａと図６Ｂの例示的な構成では、第２のダイクロイックフィルタ（５３５）は、ビーム（５５０）の中心ビーム軸（５５２）が３０度の入射角度で入射するように配置される。同様に、追加的なダイクロイックフィルタ（５４０ａ）、（５４０ｂ）は、ビーム（５５０）の第１の部分と第２の部分（５５０ａ）、（５５０ｂ）の中心ビーム軸（５５２ａ）、（５５２ｂ）も３０度の入射角度で入射するように配置される。しかし、様々な実装では、これらの入射角度は、４５度未満の他の角度であってもよい。いくつかの例では、例えば、以下にさらに議論されるように、入射角度は、約２０度から約４５度に及んでもよい。さらに、ダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、（５４０ｂ）の各々の入射角度は、必ずしも同じである必要はない。いくつかの実施形態では、ダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、（５４０ｂ）のいくつかまたは全ては、それらの入射ビーム（５５０）、（５５０ａ）、（５５０ｂ）が異なる入射角度を有するように、配置されてもよい。上に記載されるように、入射角度は、撮像モジュール内の光学部品、例えば、対物レンズ、および／または検出チャネル中の光学部品（例えばチューブレンズ）、およびそれぞれのダイクロイックビームスプリッタのそれぞれのダイクロイック反射表面の、光軸に対してのものであってもよい。入射角度に対する同様の範囲と値とは、光軸がＡＯＩを指定するために使用される場合に当てはまる。
蛍光撮像モジュールシステム中の放射光のビーム（５５０）、（５５０ａ）、（５５０ｂ）は、一般に、発散ビームである。上に記されるように、放射光のビームは、ビーム直径内のビームの領域が中心ビーム軸および／または光学部品の光学軸の入射角度に対して最大５度以上異なる入射角度でダイクロイックフィルタに入射するのに十分な大きさの、ビームの逸脱を有することができる。いくつかの設計では、対物レンズ（５１０）は、例えば、顕微鏡の所与の視野に対してより小さなビーム直径を生成するように選択された、Ｆ－ナンバーまたは開口数を有するように構成されてもよい。一例では、対物レンズ（５１０）のＦ－ナンバーまたは開口数は、ビーム（５５０）、（５５０ａ）、（５５０ｂ）の全直径が、ダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）（５４０ｂ）に、中心ビーム軸（５５２）、（５５２ａ）、（５５２ｂ）の入射角度の、例えば、１度、１．５度、２度、２．５度、３度、３．５度、４度、４．５度、あるいは５度内の入射角度で入射するように、選択されてもよい。
いくつかの実装では、そのような狭いビーム直径を生成するのに適切な対物レンズの焦点距離は、一般に蛍光の顕微鏡または撮像システムで使用されるものよりも、長くてもよい。例えば、いくつかの実装では、以下にさらに議論されるように、対物レンズの焦点距離は、２０ｍｍから４０ｍｍに及んでもよい。一例では、３６ｍｍの焦点距離を有する対物レンズ（５１０）は、ビーム（５５０）の全直径にわたる光が、中心ビーム軸の入射角度の２．５度内の角度で、第２のダイクロイックフィルタ（５３５）に入射するのに十分に小さな逸脱によって特徴付けられる、ビーム（５５０）を生成してもよい。
図７と図８は、図６Ａと図６Ｂの撮像モジュール構成の態様（あるいは本明細書に開示される撮像モジュール構成のいずれか）による、ダイクロイックフィルタ性能の改善を示すグラフを提供する。図７のグラフは、図４のそれと類似しており、そして、ダイクロイックフィルタの遷移幅（例えば透過エッジのスペクトルスパン）への入射角度の影響を示す。図７は、ダイクロイックフィルタ（例えばダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、および（５４０ｂ））とそれらのダイクロイック反射表面が、その入射ビームが４５度というよりはむしろ３０度の入射角度を有するように配向されている例を示す。図７は、この入射角度の低下が、全ビーム直径にわたる遷移幅の鋭さおよび均一性をどれほど有意に改善するかを示す。例えば、中心ビーム軸における４５度の入射角度は、結果的に、約４０ｎｍ～約６２ｎｍの一連の遷移幅をもたらし、中心ビーム軸における３０度の入射角度は、結果的に、約１６ｎｍ～約３０ｎｍの一連の遷移幅をもたらす。この例では、平均遷移幅は、約５１ｎｍから約２３ｎｍに低下され、通過帯域と阻止帯域との間のより鋭い遷移を示す。さらに、ビーム直径にわたる遷移幅の変動は、２２ｎｍの範囲から１４ｎｍの範囲にほぼ４０％低下され、ビームエリアにわたる遷移のより均一的な鋭さを示す。
図８は、本明細書に開示される撮像モジュール構成のいずれかで、ビーム逸脱を低下させるように対物レンズに対するＦ－ナンバーまたは開口数を選択することによって実現され得る、追加的な利点を示す。いくつかの実装では、より長い焦点距離が使用される。図８の例では、対物レンズ（５１０）は、３６ｍｍの焦点距離を有しており、当該焦点距離は、適切な開口数（例えば５未満）と共に使用すると、ビーム（５５０）内の入射角度の範囲を、３０度±５度から３０度±２．５度に低下させる。この設計で、遷移幅の範囲は、約１９ｎｍから約２６ｎｍの間に低下されてもよい。図７の改善されたシステムと比較される時、平均遷移幅は実質的に同じ（例えばおよそ２３ｎｍのスペクトルスパン）であるが、ビーム直径にわたる遷移幅の変動は、７ｎｍの範囲にさらに低下され、図４に示される遷移幅の範囲に対してほぼ７０％の低下を表わす。
図５を再び参照すると、入射角度が中心ビーム軸において４５度から３０度まで低下すると、ダイクロイックフィルタ上のビームスポットサイズが低下するので、さらに有利である。図５に示されるように、４５度の入射角度は、結果として、ビームの断面積の１．４倍を超える面積を有するビームフットプリントをダイクロイックフィルタ上にもたらす。しかし、３０度の入射角度は、結果として、ビームの断面積のわずか約１．１５倍の面積を有するビームフットプリントをダイクロイックフィルタ上にもたらす。そのため、ダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、（５４０ｂ）における入射角度を、４５度から３０度に低下させると、結果的に、ダイクロイックフィルタ（５３５）、（５４０ａ）、（５４０ｂ）上のビームフットプリントの面積が約１８％低下する。ビームフットプリント面積のこの減少は、より小さなダイクロイックフィルタが使用されることを可能にする。
ここで図９Ａ－図９Ｂを共に参照すると、入射角度の４５度から３０度への減少はまた、変調伝送関数における改善によって示されるように、本明細書に開示される撮像モジュール構成のいずれかにおけるダイクロイックフィルタによって引き起こされる表面変形に関連する性能の改善を提供してもよい。一般に、表面変形の量は、光学要素の面積が大きくなるにつれて増加する。ダイクロイックフィルタのより大きな面積が使用されると、より大量の表面変形が引き起こされ、それによって、より多くの波面誤差がビームに導入される。図９Ａは、最後のミラーに、球面度数のＰＶの１波の追加によって誘発される、画質劣化に対する、折り畳み角度の影響を示す。図９Ｂは、最後のミラーに、球面度数のピークトゥｐｅａｋ－ｔｏ－ｖａｌｌｅｙ）（ＰＶ）の０．１波の追加によって誘発される、画質劣化に対する、折り畳み角度の影響を示す。図９Ａと図９Ｂに示されるように、３０度の入射角度の低下は、表面変形の影響を有意に低下させて、検出光学部品の回折限界に近い性能を達成する。
本明細書に開示される撮像モジュールのいくつかの実装では、本明細書に開示されるマルチチャネル蛍光撮像モジュールの性能をさらに改善するために、励起ビームの偏光状態が利用されてもよい。例えば図２Ａ、図２Ｂ、および図６Ａを再度参照すると、本明細書に開示されるマルチチャネル蛍光撮像モジュールのいくつかの実装は落射蛍光構成を有し、当該落射蛍光構成では、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）または（５３０）は、励起光と放射光の両方が対物レンズ（１１０）、（５１０）を通って透過されるように、励起ビームの光路と放射光のビームの光路を統合する。上に議論されるように、照明源（１１５）は、励起ビームを形成する光を提供する、レーザー源または他のソースなどの光源を含んでもよい。いくつかの設計では、光源は、直線偏光光源を含み、そして励起ビームは、直線偏光されていてもよい。いくつかの設計では、光を偏光させるため、および／または、光の偏光を回転させるための、偏光光学部品が含まれている。例えば、直線偏光子などの偏光子が、励起ビームを偏光するために、励起ビームの光路中に含まれていてもよい。半波リターダ、または複数の１／４波リターダ、または位相差の他の量を有する他のリターダなどのリターダが、いくつかの設計で、直線偏光を回転させるために含まれていてもよい。
任意のダイクロイックフィルタまたは他の平面境界面に入射する時、直線偏光励起ビームは、ビーム内で、ｐ－偏光（例えば入射面に平行な電界成分を有する）されてもよく、ｓ－偏光（例えば入射面に垂直な電界成分を有する）されてもよく、またはｐ－偏光状態とｓ－偏光状態の組み合わせを有してもよい。励起ビームのｐ－偏光状態またはｓ－偏光状態は、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）、（５３０）に対して、および／または励起ビームが相互作用する任意の他の表面に対する、照明源（１１５）および／またはその１以上のコンポーネントの配向を選択することによって、選択されてもよく、および／または変更されてもよい。光源が直線偏光光を出力するいくつかの実装では、光源は、ｓ－偏光光を提供するように構成され得る。例えば、光源は、光軸またはビームの中心軸を中心に回転されて、そこからの直線偏光光出力を配向することができる、固体レーザー、またはレーザーダイオードなどのエミッタを含んでもよい。代替的に、または追加的に、リターダは、直線偏光を光軸またはビームの中心軸を中心に回転させるために使用されてもよい。上に議論されるように、いくつかの実装では、例えば、光源が偏光光を出力しない時、励起ビームの光路中に配置される偏光子は、励起ビームを偏光することができる。いくつかの設計では、例えば、直線偏光子は、励起ビームの光路中に配置される。この偏光子は、直線偏光の適切な配向を提供するために回転されて、ｓ－偏光光を提供してもよい。
いくつかの設計では、直線偏光は、ｓ－偏光がダイクロイックビームスプリッタのダイクロイックリフレクタに入射するように、光軸またはビームの中心軸を中心に回転される。ダイクロイックビームスプリッタのダイクロイックリフレクタにｐ－偏光光入射する時と対照的に、ｓ－偏光光がダイクロイックビームスプリッタのダイクロイックリフレクタに入射する時は、通過帯域と阻止帯域との間の遷移は鋭い。
図１０Ａと図１０Ｂに示されるように、励起ビームのｐ－偏光状態またはｓ－偏光状態の使用は、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）、（５３０）などの任意の励起フィルタの狭帯域性能に有意に影響するかもしれない。図１０Ａは、４０度と４５度の入射角度での、例示的な帯域通過ダイクロイックフィルタに対する６１０ｎｍと６７０ｎｍとの間の透過スペクトルを示し、ここで入射ビームは直線偏光であり、ダイクロイックフィルタの平面に関してｐ－偏光される。図１０Ｂに示されるように、ダイクロイックフィルタに対する光源の配向を、入射ビームがダイクロイックフィルタの平面に対してｓ－偏光されるように変更することは、結果的に、ダイクロイックフィルタの通過帯域と阻止低域との間で実質的により鋭いエッジをもたらす。そのため、本明細書に開示される照明撮像モジュール（１００）と（５００）は、励起ビームが第１のダイクロイックフィルタ（１３０）、（５３０）の平面に対してｓ－偏光されるように、第１のダイクロイックフィルタ（１３０）、（５３０）に対して配向された、照明源（１１５）を、有利に有してもよい。上に議論されるように、いくつかの実装では、直線偏光子などの偏光子は、励起ビームを偏光するために使用されてもよい。この偏光子は、ｓ－偏光光に対応する直線偏光光の配向を提供するために回転されてもよい。また、上に議論されるように、いくつかの実装では、直線偏光光を回転させるための他のアプローチが使用されてもよい。例えば、半波リターダ、または複数の１／４波リターダのなどの光学リターダが、偏光方向を回転させるために使用されてもよい。他の配置も可能である。
本明細書の他の場所で議論されるように、蛍光撮像モジュールおよび／または対物レンズの開口数（ＮＡ）の低下は、フィールドの深度を増加させ、２つの表面の同等の撮像を可能にしてもよい。図１１Ａ－図１６Ｂは、高開口数と比較して低開口数で、ＭＴＦが第１の表面と第２の表面とにおいて、１ｍｍのガラスによってどれほど類似してくるか、を示す。
図１１Ａと図１１Ｂは、０．３のＮＡに対する第１の表面（図１１Ａ）と第２の表面（図１１Ｂ）とにおける、ＭＴＦを示す。
図１２Ａと図１２Ｂは、０．４のＮＡに対する第１の表面（図１２Ａ）と第２の表面（図１２Ｂ）とにおける、ＭＴＦを示す。
図１３Ａと図１３Ｂは、０．５のＮＡに対する第１の表面（図１３Ａ）と第２の表面（図１３Ｂ）とにおける、ＭＴＦを示す。
図１４Ａと図１４Ｂは、０．６のＮＡに対する第１の表面（図１４Ａ）と第２の表面（図１４Ｂ）とにおける、ＭＴＦを示す。
図１５Ａと図１５Ｂは、０．７のＮＡに対する第１の表面（図１５Ａ）と第２の表面（図１５Ｂ）とにおける、ＭＴＦを示す。
図１６Ａと図１６Ｂは、０．８のＮＡに対する第１の表面（図１６Ａ）と第２の表面（図１６Ｂ）とにおける、ＭＴＦを示す。これらの図の各々の第１の表面と第２の表面は、例えば、フローセルの上部表面と下部表面とに相当する。
図１７Ａ－図１７Ｂは、第１のフローセル表面を通じて第２のフローセル表面を撮像するための、計算されたストレール比（つまり、光学システムによって集光または収集されたピーク光強度対、理想的な光学システムと点光源によって集光または収集されたピーク光強度の比）のプロットを提供する。図１７Ａは、異なる対物レンズおよび／または光学システム開口数に対して、介在流体層の厚み（流体チャネル高さ）の関数として、第１のフローセル表面を通じて第２のフローセル表面を撮像するための、ストレール比のプロットを示す。示されるように、ストレール比は、第１の表面と第２の表面との間で分離が増加すると、減少する。表面の１つでは、従って、２つの表面間で分離が増加すると、画質が劣化するだろう。２つの表面間での分離距離の増加に伴う、第２の表面の撮像性能の減少は、より大きな開口数を有するものと比較して、より小さな開口数を有する撮像システムに対して低下される。図１７Ｂは、第１のフローセル表面と０．１ｍｍの厚みを有する水の介在層とを通じて、第２のフローセル表面を撮像するための開口数の関数としてのストレール比のプロットを示す。より高い開口数での撮像性能の損失は、第２の表面撮像に対して流体によって誘発された、光学収差の増加に起因するかもしれない。ＮＡの増加に伴い、第２の表面撮像に対して流体によって導入された光学収差の増加は、画質を著しく劣化させる。しかし、一般に、光学システムの開口数を低下させると、達成可能な解像度が低下する。画質のこの損失は、例えば、標識された核酸クラスタの蛍光発光を向上させ、および／または、バックグラウンド蛍光発光を低下させる、核酸配列決定用途用の化学的性質を使用することによって、サンプル平面（またはオブジェクト平面）のコントラスト対ノイズ比を高めることによって、少なくとも部分的に相殺することができる。いくつかの例では、例えば、親水性の基板材料および／または親水性コーティングを含むサンプル支持構造が使用されてもよい。ある場合には、そのような親水性の基板および／または親水性コーティングは、バックグラウンドノイズを低下させてもよい。例えば核酸配列決定用途に対する、サンプル支持構造、親水性表面、および親水性コーティング、ならびにコントラスト対ノイズ比を向上させるための方法に関する追加的な議論は、以下に確認することができる。
いくつかの実装では、蛍光撮像システム、照明撮像モジュール（１００）、撮像光学部品（例えば光学部品（１２６））、対物レンズ、および／またはチューブレンズの任意の１以上は、以下にさらに議論されるように、１０ｘ未満の倍率などの、低下倍率を有するように構成されてもよい。他の設計パラメータが達成され得るように、そのような低下倍率が設計制約を調節してもよい。例えば、蛍光顕微鏡、照明撮像モジュール（１００）、撮像光学部品（例えば光学部品（１２６））、対物レンズ、またはチューブレンズの任意の１以上はまた、以下にさらに議論されるように、蛍光撮像モジュールが大きな視野（ＦＯＶ）、例えば、少なくとも３．０ｍｍ以上（例えば直径、幅、高さ、または最長寸法で）の視野を有するように、構成されてもよい。蛍光撮像システム、照明撮像モジュール（１００）、撮像光学部品（例えば光学部品（１２６））、対物レンズ、および／またはチューブレンズの任意の１以上は、ＦＯＶが例えばフィールドの少なくとも８０％にわたって例えば０．１波未満の収差を有するような視野を、蛍光顕微鏡に提供するように構成されてもよい。同様に、蛍光撮像システム、照明撮像モジュール（１００）、撮像光学部品（例えば光学部品（１２６））、対物レンズ、および／またはチューブレンズの任意の１以上は、蛍光撮像モジュールがそのようなＦＯＶを有し、そして回折限界であるか、またはそのようなＦＯＶにわたって回折限界であるように、構成されてもよい。
上に議論されるように、様々な実装では、大きな視野（ＦＯＶ）が、開示される光学システムによって提供される。いくつかの実装では、ＦＯＶの増加の取得は、より大きな画像センサまたは光検出器アレイの使用によって一部容易になる。光検出器アレイは、例えば、以下にさらに議論されるように、少なくとも１５ｍｍ以上の対角線を有する作用面積を有していてもよい。上に議論されるように、いくつかの実装では、開示される光学撮像システムは、大きなＦＯＶ設計を促進し得る、例えば１０ｘ未満の低下倍率を提供する。低下倍率にもかかわらず、撮像モジュールの光学解像度は、小さな画素サイズまたはピッチを有する検出器アレイとしてなお十分で有り得、あるいは、それが使用されてもよい。画素サイズおよび／またはピッチは、例えば、以下により詳細に議論されるように、約５μｍ以下であってもよい。いくつかの実装では、画素サイズは、ナイキスト定理を充足するために、光学撮像システム（例えば対物レンズとチューブレンズ）によって提供される光学解像度の２倍よりも小さい。従って、画像センサのための画素寸法および／またはピッチは、撮像モジュールの空間サンプリング周波数が撮像モジュールの光学解像度の少なくとも２倍となるようなものであってもよい。例えば、光検出器アレイの空間サンプリング周波数は、蛍光撮像モジュール（例えば照明撮像モジュール、対物レンズとチューブレンズ、検出チャネル中の対物レンズと光学部品（１２６）、サンプル支持ステージを支持するように構成されたサンプル支持構造またはステージと光検出器アレイとの間の光学部品）の少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍、あるいはこれらの値のいずれかの間の範囲にある空間サンプリング周波数であってもよい。
蛍光撮像モジュールに関して、広範囲の特徴が本明細書で議論されているが、本明細書に記載される特徴と設計のいずれかは、明視野撮像と暗視野撮像とを限定無く含む光学撮像システムの他のタイプに適用されてもよく、そして、発光撮像または燐光撮像にあてはまるかもしれない。
両面波長励起／４チャネル撮像システム：図１８は、両面撮像用途のための両面励起波長／４チャネル撮像システムを示し、当該両面励起波長／４チャネル撮像システムは、光軸に対して垂直の方向にスキャンされて、大面積の撮像を提供する、対物レンズとチューブレンズの組み合わせを含み、例えばいくつかの画像をタイル化して、全視野（ＦＯＶ）を有する合成画像を作成し、当該全視野（ＦＯＶ）は、各個々の画像のそれよりもはるかに大きい。システムは、２つの励起光源、例えば、異なる波長とオートフォーカスレーザーで動作するレーザーまたはレーザーダイオード、を含む。２つの励起光ビームとオートフォーカスレーザービームとは、一連のミラーおよび／またはダイクロイックリフレクタを使用して組み合わされ、そして、対物レンズを通じてフローセルの上部の内部表面または下部の内部表面に送達される。フローセル表面の１つにテザーされた、標識されたオリゴヌクレオチド（または他の生体分子）によって発光される蛍光は、対物レンズによって収集され、チューブレンズを通じて透過され、そして一連の中間ダイクロイックリフレクタによる放射光の波長によって４つの撮像センサの１つに方向付けられる。フローセル表面から反射されたオートフォーカスレーザー光は、対物レンズによって収集され、チューブレンズを通じて透過され、一連の中間ダイクロイックリフレクタによってオートフォーカスセンサに方向付けられる。システムは、対物レンズ／チューブレンズの組み合わせが対物レンズの光軸に対して垂直の方向にスキャンされている間に、正確な焦点が維持されることを可能にする（例えば、オートフォーカス画像センサの反射光スポットサイズを低下させるまたは最小化するために、精密リニアアクチュエータ、並進ステージ、または顕微鏡タレット載置焦点調節機構を使用して、フローセル表面と対物レンズとの間の相対距離を調節することによって）。４チャネル（つまり４波長）撮像能力との組み合わせで使用される両面波長励起は、フローセルの上部の（近い）内部表面と下部の（遠い）内部表面の高スループット画像を提供する。
多重光学読み取りヘッド：
いくつかの例では、本明細書に記載される撮像モジュールのいずれかの小型化バージョンは、サンプル表面、例えばフローセルの内部表面に対して平行な１以上の方向に並進され得る、多重読み取りヘッドを作り出すように組み立てられてもよく、それによって、表面のいくつかのセクションを同時に撮像してもよい。多重読み取りヘッドの非限定的な例は、近年、米国公開特許出願第２０２０／０１３９３７５Ａ１で開示された。
いくつかの例では、例えば、小型化撮像モジュールは、ＬＥＤまたはレーザーダイオード（または外部光源に接続された光ファイバーの先端）などの照明光源または励起光源、照明光または励起光をコリメートするか、または集光する１以上のレンズ、１以上のダイクロイックリフレクタ、１以上の光学フィルタ、１以上のミラー、ビームスプリッタ、プリズム、開口部など、１以上の対物レンズ、本明細書の他の場所に記載されるような、最小限の焦点調節で両面撮像を可能にするための１以上のカスタムメイドのチューブレンズ、１以上の画像センサ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、「マイクロフルオロメータ」を含んでもよい。いくつかの例では、小型化撮像モジュール（例えば「マイクロフルオロメータ」）は、オートフォーカス機構、マイクロプロセッサ、電力およびデータ転送コネクタ、遮光筐体などをさらに含んでもよい。結果として生じる小型化撮像モジュールは、そのため、スモールフォームファクタを有する一体型撮像パッケージまたは一体型撮像ユニットを含んでもよい。いくつかの例では、小型化撮像モジュールの最短寸法（例えば幅または直径）は、５ｃｍ未満、４．５ｃｍ未満、４ｃｍ未満、３．５ｃｍ未満、３ｃｍ未満、２．５ｃｍ未満、２ｃｍ未満、１．８ｃｍ未満、１．６ｃｍ未満、１．４ｃｍ未満、１．２ｃｍ未満、１ｃｍ未満、０．８ｃｍ未満または０．６ｃｍ未満であってもよい。いくつかの例では、小型化撮像モジュールの最長寸法（例えば高さまたは長さ）は、１６ｃｍ未満、１４ｃｍ未満、１２ｃｍ未満、１０ｃｍ未満、９ｃｍ未満、８ｃｍ未満、７ｃｍ未満、５ｃｍ未満、５ｃｍ未満、４．５ｃｍ未満、４ｃｍ未満、３．５ｃｍ未満、３ｃｍ未満、２．５ｃｍ未満、２ｃｍ未満、１．８ｃｍ未満、１．６ｃｍ未満、１．４ｃｍ未満、１．２ｃｍ未満、または１ｃｍ未満であってもよい。いくつかの例では、多重読み取りヘッド内の１以上の個々の小型化撮像モジュールは、オートフォーカス機構を含んでもよい。
いくつかの例では、本明細書に記載される多重読み取りヘッドは、互いに対して固定の位置に保持された、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１２を超える、小型化撮像モジュールまたはマイクロフルオロメータのアセンブリを含んでもよい。いくつかの例では、個々の小型化撮像モジュールまたはマイクロフルオロメータ光学設計仕様と性能特性、例えば、開口数、視野、フィールドの深度、画像解像度などは、開示される撮像モジュールの他のバージョンに対して本明細書の他の場所で記載されているのと同じであってもよい。いくつかの例では、複数の、個々の小型化撮像モジュールは、１、２、３、４、または４を超える行および／または列を含む線形配置に配置されてもよい。いくつかの例では、複数の、個々の小型化撮像モジュールは、例えば六角形の緊密充填配置（ｈｅｘａｇｏｎａｌ ｃｌｏｓｅ ｐａｃｋ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）で配置されてもよい。いくつかの例では、複数の、小型化撮像モジュールは、円形または螺旋状配置、ランダム分散配置（ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）、または当業者に既知の任意の他の配置で、配置されてもよい。
図４３Ａ－図４３Ｂは、本明細書に開示されるように、多重読み取りヘッドの非限定的な概略図を提供する。図４３Ａは多重読み取りヘッドの側面図を示し、当該多重読み取りヘッドでは、共通の光学設計仕様、例えば開口数、視野、作用距離などを有する、個々のマイクロフルオロメータの２つの行（端部から見た時）は、共通の表面、例えばフローセルの第１の内部表面を撮像するように構成されている。図４３Ｂは、同じ多重読み取りヘッドの上面図を示し、読み取りヘッドはフローセルに対して並進（またはその逆）する時の、多重読み取りヘッドの個々のマイクロフルオロメータによって取得される撮像経路のオーバーラップを示す。いくつかの例では、図４３Ｂに示されるように、個々のマイクロフルオロメータに対する個々の視野はオーバーラップするかもしれない。いくつかの例では、それらはオーバーラップしないかもしれない。いくつかの例では、多重読み取りヘッドは、フローセル内の既定の特徴、例えば個々の流体チャネルと、位置合わせし、かつそれを撮像するように、設計されてもよい。
図４４Ａ－図４４Ｂは、多重読み取りヘッドの非限定的な概略図を提供し、ここで、複数の個々の小型化撮像モジュールの第１のサブセットは、第１のサンプル平面、例えばフローセルの第１の内部表面を撮像するように構成されており、そして、複数の個々の小型化撮像モジュールの第２のサブセットは、第２のサンプル平面、例えばフローセルの第２の内部表面を同時に撮像するように構成されている。図４４Ａは、多重読み取りヘッドの側面図を示し、ここで、個々のマイクロフルオロメータの第１のサブセットは、例えばフローセルの第１の内部表面または上部の内部表面を撮像するように構成されており、そして、第２のサブセットは、第２の表面、例えばフローセルの第２の内部表面または下部の内部表面を撮像するように構成されている。図４４Ｂは、多重読み取りヘッドの個々のマイクロフルオロメータによって取得される撮像経路を示す図４４Ａの多重読み取りヘッドの上面図を示す。さらに、いくつかの例では、所与のサブセット中の個々のマイクロフルオロメータに対する個々の視野はオーバーラップしてもよい。いくつかの例では、それらはオーバーラップしないかもしれない。いくつかの例では、多重読み取りヘッドは、第１のサブセットと第２のサブセットの個々の小型化撮像モジュールが、フローセル内の既定の特徴、例えば個々の流体チャネルと、位置合わせし、かつそれを撮像するように、設計されてもよい。
より厚いカバースリップでの使用のために改善された、または最適化された、対物レンズおよび／またはチューブレンズ：既存の設計の慣例は、対物レンズの設計および／または一般的に入手可能な既製の顕微鏡対物レンズを使用して、薄い（例えば＜２００μｍの厚みの）顕微鏡カバースリップを通じて画像を取得する場合の画質を最適化することが含まれる。流体チャネルまたはフローセルの両側で撮像するために使用される時、２つの表面間のギャップの余分な高さ（つまり、流体チャネルの高さ；通常約５０μｍから２００μｍ）は、流体チャネルの非最適な側面に対して捕捉された画像における光学収差を導入し、それによって、光学解像度の低下を引き起こす。これは、主に、追加のギャップ高さが、最適なカバースリップの厚みと比較して顕著であるからである（一般的な流体チャネルまたはギャップの高さ５０－２００μｍ対カバースリップ厚み＜２００μｍ）。別の共通の設計の慣例は、撮像が流体チャネルまたはフローセルの非最適な側面で実行されることになっている時に、光路中の追加的な「補正器」レンズを利用することである。この「補正器」レンズと、フローセルのいずれかの側面が撮像され得るように光路の内外に移動するのに必要なメカニズムとは、システムの複雑さと撮像システムのダウンタイムとをさらに増加させ、そして、振動などによって画質を劣化させる可能性がある。
本開示では、撮像システムは、より厚いカバースリップまたはフローセル壁（厚み＞＝７００μｍ）を含む消費用フローセルと互換性を有するように設計される。対物レンズ設計は、真のカバースリップ厚みプラス有効ギャップ厚みの半分（例えば、７００μｍ＋１／２の流体チャネル（ギャップ）の高さ）と等しいカバースリップのために、改善されか、または最適化される。この設計は、流体チャネルの２つの側面の画質に対する、ギャップ高さの影響を有意に低下させ、そして、２つの表面の画像に対する光学品質を平衡化し、その理由は、カバースリップの全厚みに対してギャップ高さが小さく、従って、光学品質に対するその影響が低下されるからである。
より厚いカバースリップを使用することによる追加的な利点は、製造中の厚みの許容誤差の改善と、カバースリップが熱負荷および載置によって誘発される負荷のために変形を起こす可能性の低下とを含む。カバースリップ厚みの誤差と変形は、フローセルの上部表面と下部表面の両方の撮像品質に対して不利な影響を与える。
配列決定用途に対する両面撮像品質をさらに改善するために、我々の光学システム設計は、小さなスポットまたはクラスタを撮像および解像するのに最も適した、中～高空間周波数範囲における（例えば、対物レンズおよび／またはチューブレンズの設計の改善または最適化を通じての）ＭＴＦの改善または最適化に重点を置く。
市販の既製の対物レンズとの組み合わせによる使用のための、改善された、または最適化されたチューブレンズ設計：低コストの配列決定装置設計については、市販の既製の対物レンズの使用が、その比較的低い価格のために好まれることがある。しかし、上に記されるように、低コストで既製の対物レンズは、厚み約１７０μｍの薄いカバースリップとの使用のために、ほとんどが最適化されている。いくつかの例では、開示される光学システムは、両面撮像用途のフローセルの両方の内部表面に対して、高画質を可能にしながら、より厚いフローセルカバースリップに対して補正を行う、チューブレンズ設計を利用してもよい。いくつかの例では、本明細書に開示されるチューブレンズ設計は、光学補正器をフローセルと画像センサとの間の光路の内外に移動させることなく、１以上の光学要素またはチューブレンズのコンポーネントを光路に沿って移動させることなく、および１以上の光学要素またはチューブレンズのコンポーネントを光路の内外に移動させることなく、フローセルの両方の内部表面の高品質撮像を可能にする。
図１９は、低光対物レンズに対する光学光線追跡ダイアグラムを提供し、これは、厚み０．１７ｍｍのカバースリップの対向面の表面の撮像に対して改善または最適化されている。図２０に示されるこの対物レンズに対する変調伝送関数のプロットは、厚み０．１７ｍｍのカバースリップ用に設計されたものと共に使用された時の、回折限界に近い撮像性能を示す。
図２１は、図１９に示される同じ対物レンズの変調伝送関数のプロットを、厚み０．３ｍｍのカバースリップの対向面の表面を撮像するために使用される空間周波数の関数として提供する。約１００～約８００ライン／ｍｍ（またはサイクル／ｍｍ）に及ぶの空間周波数範囲にわたるＭＴＦ値の比較的小さな偏差は、厚み０．３ｍｍのカバースリップを使用する時に取得された画質が、なお妥当であることを示す。
図２２は、図１９に示される同じ対物レンズの変調伝送関数のプロットを、厚み０．３ｍｍのカバースリップの対向面の表面から、０．１ｍｍの厚みの液体の層によって分離されている（つまり、遠方の表面を撮像する時のフローセルの両面撮像が遭遇する種類の条件下における）表面を撮像するために使用される時の空間周波数の関数として提供する。図２２のプロットに確認できるように、撮像性能は、約５０ｌｐ／ｍｍ～約９００ｌｐ／ｍｍの空間周波数範囲にわたる理想的な回折限界の場合に対するＭＴＦ曲線の偏差によって示されるように、低下する。
図２３と図２４は、変調伝送関数のプロットを、図１９に示される対物レンズを厚み１．０ｍｍのカバースリップを通じて使用して撮像される時と、上部の内部表面と下部の内部表面とが厚み１．０ｍｍの液体の層によって分離される時の、フローセルの上部の（近い）内部表面（図２３）と下部の（遠い）内部表面（図２４）についての空間周波数の関数として示す。確認できるように、撮像性能は、両表面のついて著しく低下する。
図２５は、図１９に示される対物レンズと併せて使用される場合に、厚み１ｍｍのカバースリップを通じて両面撮像の改善をもたらす、チューブレンズ設計の光線追跡ダイアグラムを提供する。合成対物レンズ（レンズ要素（７０２）、（７０３）、（７０４）、（７０５）、（７０６）、（７０７）、（７０８）、（７０９）、および（７１０））とおよびチューブレンズ（レンズ要素（７１１）、（７１２）、（７１３）、および（７１４））とを含む光学設計（７００）は、厚いカバースリップ（または壁）、例えば７００μｍを超えるカバースリップ（または壁）と少なくとも５０μｍの厚みの流体チャネルとを含むフローセルとの使用のために、改善されるか、または最適化され、そして、フローセル（７０１）から画像センサ（７１５）に、劇的に改善された光学画質とより高いＣＮＲで、内部表面の画像を伝送する。
いくつかの例では、チューブレンズ（またはチューブレンズアセンブリ）は、少なくとも２つの光学レンズ要素、少なくとも３つの光学レンズ要素、少なくとも４つの光学レンズ要素、少なくとも５つの光学レンズ要素、少なくとも６つの光学レンズ要素、少なくとも７つの光学レンズ要素、少なくとも８つの光学レンズ要素、少なくとも９つの光学レンズ要素、少なくとも１０の光学レンズ要素、またはそれ以上を含んでもよく、ここで、光学レンズ要素の数、各要素の表面形状、およびそれらがアセンブリ中で配置される順序は、フローセルの厚い壁によって誘発される光学収差を補正するように改善または最適化され、そして場合によっては、高品質の、両面撮像能力を維持しながらもなお、市販の既製の対物レンズを使用することを可能にする。
いくつかの例では、図２５に示されるように、チューブレンズアセンブリは、順番に、第１の非対称の凸－凸レンズ（７１１）、第２の凸－平面レンズ（７１２）、第３の非対称の凹－凹レンズ（７１３）、および第４の非対称の凸－凹レンズ（７１４）を含んでもよい。
図２６と図２７は、変調伝送関数のプロットを、図２５に示される対物レンズ（０．１７ｍｍのカバースリップに修正されている）とチューブレンズと組み合わせを１．０ｍｍの厚みのカバースリップを通じて使用して撮像される時と、上部の内部表面と下部の内部表面とが厚み１．０ｍｍの液体の層によって分離される時の、フローセルの上部の（近い）内部表面（図２６）と下部の（遠い）内部表面（図２７）についての空間周波数の関数として示す。確認できるように、達成された撮像性能は、ほぼ、回折限界の光学設計に期待されるものである。
図２８は、高品質の両面撮像性能を提供するために改善または、最適化された、本開示のチューブレンズ設計（左）の光線追跡ダイアグラムを提供する。チューブレンズがもはや無限遠に修正されないので、適切に設計されたヌルレンズ（右）を、チューブレンズと組み合わせて使用して、製造目的およびテスト目的で無限遠非修正チューブレンズを補正してもよい。
撮像チャネルに特異的なチューブレンズ適応または最適化：撮像システム設計では、対物レンズとチューブレンズの両方を、全ての撮像チャネルに対して同じ波長領域で改善、または最適化することが可能である。一般に、同じ対物レンズは、全ての撮像チャネルによって共有され（例えば図１８を参照）、そして、各撮像チャネルは、同じチューブレンズを使用するか、または同じ設計を共有するチューブレンズを有する。
いくつかの例では、本明細書に開示される撮像システムは、各撮像チャネルに対するチューブレンズをさらに含んでもよく、ここで、チューブレンズは、特定の撮像チャネルに対して個々に改善、または最適化されて、画質を改善し、例えば、ひずみや像面湾曲を低下、または最小化し、そして各チャネルに対する被写界深度（ＤＯＦ）性能を改善する。各々の特定の撮像チャネルに対する波長範囲（または帯域通過）は全てのチャネルに対する組み合わされた波長範囲よりもはるかに狭いので、開示されるシステムで使用されるチューブレンズの、波長に特異的なまたはチャネルに特異的な適応または最適化は、結果的に、撮像の品質と性能における有意な改善をもたらす。このチャネルに特異的な適応または最適化は、結果的に、両面撮像用途におけるフローセルの両方の上部表面と下部表面の両方に、画質の改善をもたらす。
フローセル中の流体無しでの両面撮像：フローセルの上部内部表面と下部内部表面両方の最適な撮像性能については、（一般に約５０－２００μｍの流体層厚みを含む）フローセル中の流れによって誘発される光学収差を修正するために、一般に、運動作動補正器が必要とされる。開示される光学システム設計のいくつかの例では、フローセルの上部内部表面は、フローセル中に存在する流体と共に撮像されてもよい。一旦配列決定化学サイクルが完了すると、流体は、下部内部表面の撮像のために、フローセルから抽出されてもよい。そのため、いくつかの例では、補正器の使用無しであっても、下部表面の画質は維持される。
電気光学位相プレートを使用する、光学収差および／または振動の補正：いくつかの例では、両面画質は、流体の存在によって誘発される光学収差を相殺するために、対物レンズとの組み合わせで電気光学位相プレート（または他の修正レンズ）を使用することによって、フローセルから流体を排除する必要無しに改善され得る。いくつかの例では、電気光学位相プレート（またはレンズ）が、運動作動補正器の機械的運動から生じる振動を排除するために使用されてもよく、より高速な画像取得時間とゲノム配列決定用途の配列決定サイクル時間とを提供してもよい。
情報の転送とスループットを向上、または最大化するための、コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、視野（ＦＯＶ）、スペクトル分離、およびタイミング設計の改善：ゲノミクス用途用に設計された撮像システムにおける情報転送を向上、または最大化させる別の方法は、視野（ＦＯＶ）のサイズを増加させ、そして特定のＦＯＶを撮像するのに必要な時間を短縮することである。一般的な大きなＮＡ光学撮像システムでは、約１ｍｍ２の面積上の視野の画像を取得するのが一般的である場合があるが、一方で、現在開示されている撮像システム設計では、長い作動距離を有する大きなＦＯＶ対物レンズが、２ｍｍ２以上の面積の撮像を可能にするために指定される。
いくつかの場合では、開示される撮像システムは、独自の低結合基板表面と、様々な交絡信号から生じる蛍光バックグラウンドを低下させるＤＮＡ増幅処理との、組み合わせにおける使用のために設計されており、その例としては、基板表面への蛍光色素の非特異的吸着、非特異的核酸増幅産物（例えば、核酸分子のクローン増幅クラスタ（すなわち、特異的に増幅されたコロニー）に対応するスポットまたは特徴の間のエリアにおける基板表面を生じる核酸増幅産物）、増幅コロニー内で生じ得る非特異的核酸増幅産物、位相核酸鎖と位相前核酸鎖などを含むが、それらに限定されない。低結合基板表面と、蛍光バックグラウンドを低下させるＤＮＡ増幅処理の使用を、開示される光学撮像システムとの組み合わせで使用すると、各ＦＯＶを撮像するのに必要な時間を大幅に短縮する可能性がある。
現在開示されているシステム設計は、撮像シーケンスの改善または最適化を通じて、必要とされる撮像時間をさらに低下させてもよく、ここで、蛍光画像の複数のチャネルは、同時に、またはオーバーラップするタイミングで取得され、またここで、蛍光信号のスペクトル分離は、蛍光検出チャネルの間、および励起光と蛍光信号との間の、クロストークを低下させるように設計されている。
現在開示されているシステム設計は、運動シーケンスのスキャンの改善、または最適化を通じて、必要とされる撮像時間をさらに低下させてもよい。一般的なアプローチでは、Ｘ－Ｙ並進ステージが、標的ＦＯＶを対物レンズの下の位置に移動させるために使用され、オートフォーカス工程が、最適焦点位置が判定されて、対物レンズが焦点位置を判定するためにＺ方向に移動されるところで実行され、そして画像が取得される。一連の蛍光画像が、一連の標的ＦＯＶ位置を通じた循環によって取得される。情報伝送負荷サイクルの観点から、情報は、サイクルの蛍光画像取得部分の間でのみ伝送される。現在開示されている撮像システム設計では、全ての軸（Ｘ－Ｙ－Ｚ）が同時に再配置される、単一工程運動が実行され、そして、オートフォーカス工程が、焦点位置エラーをチェックするために使用される。焦点位置エラー（つまり焦点面位置とサンプル平面位置との差）が、特定の限度（例えば指定されたエラー閾値）を越える場合にのみ、追加的なＺ方向の運動が命令される。このアプローチは、高速Ｘ－Ｙ運動と連結されて、システムの負荷サイクルを増加させ、そして従って、単位当りの撮像スループットを増加させる。
さらに、バックグラウンド信号とシステムノイズ特性を考慮しながら、設計の、光収集効率、変調伝達関数、および画像センサの性能特性を、入力励起光子束、（染料励起係数と蛍光量子収率に関連する）染料効率に対して期待される蛍光光子束に一致させることによって、高品質（高コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）画像）を取得するために必要とされる時間は、短縮されてもよく、または最小化されてもよい。
効率的な画像取得と、改善された、または最適化された並進ステージ工程および整定時間との組み合わせは、高速の撮像時間（つまり、１視野あたりに必要とされる全時間）とより高いスループットの撮像システム性能に繋がる。
大きなＦＯＶと高速画像取得負荷サイクルと共に、開示される設計はまた、特定の画像平面度、蛍光検出チャネル間の色彩フォーカス性能、センサ平面度、画像の歪み、およびフォーカス品質の仕様を含んでもよい。
色彩フォーカス性能は、各検出チャネルに対する最良の焦点平面がオーバーラップするように、画像センサを異なる蛍光検出チャネルに対して個別に位置合わせすることによって、さらに改善される。設計目標は、視野の９０％以上にわたる画像が、各チャネルの最良の焦点平面に対して±１００ｎｍ（またはそれ以下）内で確実に取得されるようにすることであり、これによって、個々のスポット強度信号の転送が増加される、または最大化される 。いくつかの例では、開示される設計は、さらに、視野の９９％以上にわたる画像が、各チャネルの最良の焦点平面に対して±１５０ｎｍ（またはそれ以下）内で確実に取得されるようにし、そして、視野全体にわたる画像が、各撮像チャネルの最良の焦点平面に対して±２００ｎｍ（またはそれ以下）内で確実に取得されるようにする。
照明光路設計：信号対ノイズ比（ＳＮＲ）の改善、コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）の改善、および／またはスループットの増加のための別の要因は、サンプルに対する照明パワー強度を増加させることである。いくつかの例では、開示される撮像システムは、液体導光路と連結された高パワーのレーザーまたはレーザーダイオードを利用する照明経路設計を含んでもよい。液体導光路は、レーザーとレーザーダイオードなどの可干渉光源に内在する光のスペックルを取り除く。さらに、結合光学部品は、液体導光路の入口アパーチャをアンダーフィルするような方法で設計されている。液体導光路入口アパーチャのアンダーフィルは、対物レンズに進入する照明ビームの有効開口数を低下させ、そしてそのため、対物レンズを通るサンプル平面上への光送達効率を改善させる。この設計イノベーションで、大きな視野（ＦＯＶ）にわたる、従来設計の照明パワー強度の３ｘまでの照明パワー強度が達成され得る。
ｓ－偏光とｐ－偏光の角度に依存する区別を利用することによって、くつかの例では、照明ビーム偏光は、撮像センサに到達する後方散乱照明と後方反射照明の量を低下させるために、配向されてもよい。
構造化照明システム：いくつかの例では、開示される撮像モジュールおよびシステムは、撮像システムの有効空間解像度を増加させるための、構造化照明光学設計を含んでもよく、そしてそのため、配列決定スループットの改善のために、フローセル表面上における、クローン増幅された標的核酸配列（クラスタ）のより高い表面密度の使用を可能にする。構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）は、サンプル平面の照明に対して空間的に構造化された（つまり周期的な）光のパターンを利用し、そして、モアレ縞として知られる干渉パターンの生成に依存する。いくつかの画像が、構造化照明のパターンをシフトさせること、および／または回転させることによって、わずかに異なる照明条件下で取得されて、モアレ縞を作り出す。結果として生じる干渉信号の数学的ディコンボリューションによって、回折限界撮像光学部品を使用して達成されるものを上回って、最大で約２倍の空間解像度の改善を有する超解像画像の再構成が可能になる。［Ｌｕｔｚ （２０１１）， ”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ Ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ． ）， ｖｏｌ． １， ５７９－５８９頁， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｆｅｉｎｅｒ－Ｇｒａｃｉａ， ｅｔ ａｌ． （２０１８）， ”１５ － Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”， Ｓｍａｒｔ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ： Ｍｉｃｒｏ ａｎｄ Ｎａｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ２１９－２３６頁， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｎｙｌｋ， ｅｔ ａｌ． （２０１９）， ”Ｌｉｇｈｔ－Ｓｈｅｅｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｗｉｔｈ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｇｈｔ”， Ｎｅｕｒｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ４７７－５０１頁， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ］。構造化照明顕微鏡撮像システムの一例は、近年、Ｈｏｎｇ、米国特許出願公開第２０２０／０２１８０５２に開示されている。
図４１は、本明細書に開示されるような分岐構造照明光学設計を含む撮像システム（４１００）の非限定的な概略図を提供する。システム（４１００）の照明光路の第１の分岐（またはアーム）は、例えば、光源（光エミッタ）（４１１０Ａ）、光源（４１１０Ａ）によって放射された光をコリメーとするための光学コリメータ（４１２０Ａ）、光軸に対して第１の配向にある回析格子（４１３０Ａ）、回転ウィンドウ（４１４０Ａ）、およびレンズ（４１５０Ａ）を含む。システム（４１００）の照明光路の第２の分岐は、例えば、光源（４１１０Ｂ）、光源（４１１０Ｂ）によって放射された光をコリメートするための光学コリメータ（４１２０Ｂ）、光軸に対して第２の配向にある回析格子（４１３０Ｂ）、回転ウィンドウ（４１４０Ｂ）、およびレンズ（４１５０Ｂ）を含む。回析格子（４１３０Ａ）と（４１３０Ｂ）は、サンプル平面上の光干渉縞のパターンの投影を可能にする。
いくつかの例では、光源（４１１０Ａ）と（４１１０Ｂ）は、（例えば１以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む）非干渉光源、または（例えば１以上のレーザーまたはレーザーダイオードを含む）可干渉光源であってもよい。いくつかの例では、光源（４１１０Ａ）と（４１１０Ｂ）は、例えば、後にそれぞれのコリメータレンズ（４１２０Ａ）と（４１２０Ｂ）によってコリメートされるビームを出力するＬＥＤ、レーザー、またはレーザーダイオードに連結される光ファイバーを含んでもよい。いくつかの例では、光源（４１１０Ａ）と（４１１０Ｂ）は、同じ波長の光を出力してもよい。いくつかの例では、光源（４１１０Ａ）と（４１１０Ｂ）は、異なる波長の光を出力してもよい。光源（４１１０Ａ）と（４１１０Ｂ）のいずれかは、本明細書の他の場所に記載される、任意の波長および／または波長範囲の光を出力するように構成されてもよい。撮像中、光源（４１１０Ａ）と（４１１０Ｂ）は、例えば、光路に配置された高速シャッター（図示されず）を使用して、または所定の周波数で光源をパルス化することによって、オンまたはオフに切り替えがなされてもよい。
図４１に示される例では、システム（４１００）の第１の照明アームは、第１の配向の格子パターン（例えば垂直の光干渉縞パターン）をサンプル平面、例えばフローセル（４１８７）の第１の内部表面（４１８８）、に投影するために使用される垂直格子（４１３０Ａ）を含み、そして、第２の照明アームは、第２の配向の格子パターン（例えば水平の光干渉縞パターン）をサンプル平面（４１８８）に投影するために使用される水平格子（４１３０Ｂ）を含む。有利には、撮像システム（４１００）の回析格子は、この非限定的な例において、撮像中に機械的に回転される、または並進される必要がなく、そのことで、改善された撮像速度、システム信頼性、およびシステム再現性が提供され得る。いくつかの例では、回析格子（４１３０Ａ）および／または（４１３０Ｂ）は、それぞれの光軸の周りで、サンプル平面に投影された光干渉縞パターン間の角度が調整可能になるように、回転可能であってもよい。
図４１に示されるように、いくつかの例では、回析格子（４１３０Ａ）と（４１３０Ｂ）は、ガラス基板または他の適切な表面で形成された、複数の回折要素（例えば平行なスリットまたは溝）を含む、伝送可能な回折格子であってもよい。いくつかの例では、格子は、格子材料の屈折率の周期的な変動を提供する、位相格子として実装されてもよい。いくつかの例では、溝または特徴についての間隔は、適切な角度で光を回折させるように、および／または撮像システムの（４１００）の動作のための撮像サンプルの最小の解像可能な特徴サイズに調製されるように、選択されてもよい。他の例では、回析格子は、反射回析格子であってもよい。
図４１に示される例では、垂直の光干渉縞パターンと水平の光干渉縞パターンの配向は、約９０度でオフセットされる。他の例では、回析格子の他の配向が、約９０度のオフセットを作り出すために使用されてもよい。例えば、回析格子は、それらがサンプル平面（４１８８）（例えば第１の内部フローセル表面）のｘ軸またはｙ軸から±４５度オフセットされる光干渉縞パターンを投影するように、配向されてもよい。図４１に示される撮像システム（４１００）の構成は、構造化照明アプローチを使用する画像解像度の向上は、２つの垂直な格子配向（例えば、垂直格子配向と水平格子配向）のみを使用して達成され得るので、長方形のグリッド上に配置された規則的にパターン化された特徴を含むサンプル支持表面（例えば、フローセル（４１８７）の内部表面（４１８８））の場合に、特に有利になるかもしれない。
回析格子（４１３０Ａ）と（４１３０Ｂ）は、システム（４１００）の例では、以下の関係に従って、構造的な干渉によって、入力照明ビームを一連の最大強度に回折するように構成されてもよい。
ｍ＝次数＝ｄ ｓｉｎ（θ）／λ
式中、ｄ＝回析格子のスリットまたは溝の間の距離、θ＝回析格子の表面の法線に対する照明光の入射角度、λ＝照明光の波長、および、ｍ＝回折光の最大強度に対応する整数値、例えばｍ＝０、±１、±２、など。いくつかの例では、回折された照明光の特定の次数の光、例えば、１次の（ｍ＝±１）の光は、サンプル平面（例えば内部フローセル表面（４１８８））に投影されてもよい。いくつかの例では、例えば、垂直の格子（４１３０Ａ）は、コリメートされた光ビームを、第１の配向でサンプル平面に集光される１次の回折ビーム（±１次）に回折してもよく、そして、水平の格子（４１３０Ｂ）は、コリメートされた光ビームを、第２の配向でサンプル平面に集光される１次の回折ビームに回折してもよい。いくつかの例では、ゼロ次のビームおよび／または全ての他のより高次のビーム（例えば、ｍ＝±２またはそれ以上）は遮断されてもよく、つまり、例えば、回折格子後の光路に挿入され得る次数フィルタなどの、ビーム遮断要素（図示されず）を使用して、サンプル平面（４１８８）上に投影される照明パターンからフィルタによって除去されてもよい。
（４１００）の例における構造化放射システムの各分岐は、回析格子（４１３０Ａ）と（４１３０Ｂ）の各々によって透過されるか、または反射される回折光を位相シフトするために、光学位相変調器または位相シフタ（４１４０Ａ）と（４１４０Ｂ）とを含む。構造化撮像中、各回折ビームの光学位相は、構造化パターンの各干渉縞のピッチ（Ｘ）のいくつかの画分（例えば１／２、１／２、１／４など）によってシフトされてもよい。図４１の例では、位相変調器（４１４０Ａ）と（４１４０Ｂ）が、例えば、各回折ビームの光路長を回転させ、そして変調するために、回転アクチュエータ機構または他のアクチュエータ機構によって起動される回転光学位相プレートとして、実装されてもよい。例えば、光学位相プレート（４１４０Ａ）が垂直軸を中心に回転されて、垂直格子（４１３０Ａ）によってサンプル平面（４１８８）上に投影される画像を左または右にシフトしてもよく、光学位相プレート（４１４０Ｂ）が水平軸を中心に回転されて、水平格子（４１３０Ｂ）によってサンプル平面（４１８８）上に投影される画像を垂直方向にシフトしてもよい。
他の実装では、回折光（例えば線形の並進ステージ上に載置された光学くさび）の光路長を変更する、他のタイプの位相変調器が使用されてもよい。さらに、光学位相変調器（４１４０Ａ）と（４１４０Ｂ）は、回析格子（４１３０Ａ）と（４１３０Ｂ）の後に配置されるものとして示されているが、他の実装では、それらが照明光路中の他の位置に配置されてもよい。いくつかの例では、単一の光学位相変調器は、異なる光干渉縞パターンを生成するために、２つの異なる方向で操作されてもよく、または、単一の光学位相変調器の位置が、照明光路の両方のアームの経路長を同時に調節するために、単一の運動を使用して調節されてもよい。
図４１に示される例では、光学コンポーネント（４１６０）が、２つの照明光路からの光を組み合わせるために使用されてもよい。光学コンポーネント（４１６０）は、例えば、部分的にシルバー化したミラー、（光源（４１１０）と（４１１０Ｂ）によって出力された力の波長に依存する）ダイクロイックミラー、照明システムの２つのアームからの光が、損失の無い、またはほぼ無損の無い方法で（例えば、反射コーティングによる少量の吸収以外の光パワーの大幅な損失無しに）組み合わされるような、穴部のパターンまたはパターン化された反射コーティングを含むミラー、偏光ビームスプリッタ（光源（４１１０Ａ）と（４１１０Ｂ）が、偏光光を生成するように構成される場合）など、を含んでもよい。光学コンポーネント（４１６０）は、回折格子の各々によって反射、または透過された望ましい回折次数の光が、空間的に解像され、そして望まれない次数の光が遮断されるように、配置されてもよい。いくつかの例では、光学コンポーネント（４１６０）は、第１の照明光路によって出力された１次の光を通してもよく、そして、第２の照明光路によって出力された１次の光を反射してもよい。いくつかの例では、サンプル表面（４１８８）上の構造化照明パターンは、各光源をオンかオフに替えることによって、または、光源のための光路中の光学シャッターを開閉することによって、（例えば回折格子（４１３０Ａ）を使用する）垂直配向から、（例えば回折格子（４１３０Ｂ）を使用する）水平配向に切り替えてもよい。他の例では、構造化照明パターンは、光学スイッチを使用することによって切り替えられて、サンプル平面を照らすために使用される照明光路を変更してもよい。
図４１を再び参照すると、レンズ（４１７０）、半反射ミラー、またはダイクロイックミラー（４１８０）、および対物レンズ（４１８５）が、構造化照明光をサンプル表面（４１８８）（例えば、フローセル（４１８７）の第１の内部表面）上に集光するために使用されてもよい。サンプル表面（４１８８）によって発光されるか、反射されるか、または散乱される光は、その後、対物レンズ（４１８５）によって収集され、ミラー（４１８０）を通じて透過され、そして画像センサまたはカメラ（４１９５）によって撮像される。記されるように、ミラー（４１８０）は、サンプル平面（４１８８）上への投影のために、対物レンズ（４１８５）の中への照明光路の各分岐から受け取られた構造照明光を反射するための、そして、画像センサ（４１９５）上への撮像のために、サンプル平面（４１８８）によって放射された光（例えば、励起光とは異なる波長で放射される蛍光光）を通過させるための、ダイクロイックミラーであってもよい。
いくつかの例では、システム（４１００）は、随意に、撮像システムの焦点がフローセル（４１８７）の第１の内部表面（４１８８）から第２の内部表面（４１８９）にシフトされて、最小の調節で両面撮像を可能にするように、本明細書に他の場所に記載されるように、カスタムメイドのチューブレンズ（４１９０）を含んでもよい。いくつかの例では、レンズ（４１７０）は、、照明光路の焦点がフローセル（４１８７）の第１の内部表面（４１８８）から第２の内部表面（４１８９）にシフトされて、最小の調節で両面撮像を可能にするように、本明細書に他の場所に記載されるように、カスタムメイドのチューブレンズを含んでもよい。いくつかの例では、レンズ（４１７０）は、光軸に沿って連結するように実装されて、サンプル平面上の構造化照明パターンの焦点を調節してもよい。いくつかの例では、システム（４１００）は、画像センサ（４１９５）の平面における、照明光の焦点および／または画像の焦点を調節するための、オートフォーカス機構（図示されず）を含んでもよい。いくつかの例では、図４１に示されるシステム（４１００）は、光路中の偏光子の欠如により、高い光学効率を提供してもよい。非偏光光の使用は、対物レンズ（４１８５）の開口数に依存する照明パターンのコントラストに、有意な影響を及ぼすかもしれず、または及ぼさないかもしれない。
簡潔性を目的として、撮像システム（４１００）のいくつかの光学コンポーネントは、図４１および先の議論から省略されていたかもしれない。システム（４１００）は、この非限定的な例では単一チャネル検出システムとして示されているが、他の例では、（例えば、２つの異なる画像センサと適切な光学部品、ならびに２つの異なる波長で発光する光源を使用する）マルチチャネル検出システムとして実装されてもよい。さらに、システム（４１００）の照明光路が、この非限定的な例では２つの分岐を含むものとして示されているが、いくつかの例では、分岐の各々が、互いに対して固定の配向で、または調節可能な相対配向で回折格子を含む、例えば３つの分岐、４つの分岐、または４を超える分岐を含むものとして実装されてもよい。
いくつかの例では、代替の照明光路設計が、構造化照明を作り出すために使用されてもよい。例えば、いくつかの例では、単一の大きな回転光学位相変調器が、光学コンポーネント（４１６０）の後に配置されて、光学位相変調器（４１４０Ａ）と（４１４０Ｂ）の代わりに使用されてもよく、それによって、垂直回折格子と水平回折格子（４１３０Ａ）と（４１３０Ｂ）によって出力される両方の回折ビームの位相を変調してもよい。いくつかの例では、単一回転光学補正器の回転軸は、回析格子の１つの光軸に対して平行である代わりに、垂直回折格子と水平回析格子の各々の光軸から４５度オフセット（または他の角度のオフセット）されてもよく、それによって、両方の照明方向に沿った位相シフトを可能にしてもよい。いくつかの例では、単一回転光学位相変調器は、例えば、垂直のビーム軸を中心に回転するくさび型光学コンポーネントによって、置きかえられてもよい。
別の代替照明光路設計では、回析格子（４１３０Ａ）と（４１３０Ｂ）は、それらが並進されて、回折格子（４１３０Ａ）と（４１３０Ｂ）によって反射される、または透過される光の光路長を（そしてそのため位相を）が変更され得るように、それぞれの直動ステージ上に載置されてもよい。直動ステージの運動の軸は、垂直であってもよく、または、それらのそれぞれの回折格子からオフセットされて、サンプル平面（４１８８）に沿った回析格子の干渉縞パターンの並進を提供してもよい。適切な並進ステージは、回析格子の精確な線形並進を提供するために、例えば、交差ローラーベアリングステージ、リニアモータ、高精度リニアエンコーダ、および／またはリニアアクチュエータであってもよい。
図４２は、撮像システムの空間解像度を向上させるために、構造化された照明を使用して画像を取得し、かつ処理するための、ワークフローの非限定的な例を提供する。いくつかの例では、図４２に示されるワークフローは、サンプル平面全体を（例えば画像タイリングによって、フローセルの内部表面を）撮像するために実行されてもよく、またはより大きなサンプル平面の単一エリアを撮像するために実行されてもよい。図４１に示されるシステム（４１００）の垂直の（４１３０Ａ）および水平の（４１３０Ｂ）回析格子は、照明光干渉縞を、異なる既知の配向および／または異なる既知の位相シフトを有するサンプル平面上に投影するために使用されてもよい。例えば、撮像システム（４１００）は、垂直の格子（４１３０Ａ）と水平の格子（４１３０Ｂ）とを使用して、水平の照明パターンと垂直の照明パターンをそれぞれ生成してもよく、一方で、光学位相変調器（４１４０Ａ）と（４１４０Ｂ）が３つの異なる位置にセットされて、各配向について示される３つの位相シフトを生成してもよい。
作動中、第１の照明条件（例えば回析格子の特定の配向と位相シフト設定）が、サンプル平面、例えばフローセル表面上に格子光干渉縞を投影するために使用されてもよい。第一の照明条件を使用する画像の捕捉後に、１以上の位相シフト照明パターンを使用して取得された１以上の追加的画像（例えば、１、２、３、４、５、６、または６を超える位相シフト照明パターンを使用して取得された、１、２、３、４、５、６、または６を超える追加的画像）が、取得されてもよい。撮像システムが照明光路の第２の分岐を含む場合、画像取得処理は、始点として第２の照明条件（例えば、回析格子および位相シフト設定の第２の特定の配向）を使用して反復されてもよく、そして、その画像取得処理が繰り返されてもよい。いくつかの例では、画像は、少なくとも５つの異なる位相シフト光干渉縞パターンを使用して、回析格子の少なくとも３の異なる配向（例えば、互いに対して６０度ずつ離間されている）に対して、取得されてもよい。これ以上画像が、回折格子の異なる配向または位相シフト照明光干渉縞パターンを使用して取得されない場合、画像再構成アルゴリズムが、画像を取得しそして再構成された超解像度の画像を生成するために、使用されてもよい。いくつかの例では、画像は、回析格子の少なくとも１、２、３、４、５、６、または６を超える配向について、各配向で少なくとも１、２、３、４、５、６、または６を超える異なる位相シフト光干渉縞パターンを使用して、取得されてもよい。
単一の、超解像度画像を再構成する際の使用のために複数の画像を取得することの潜在的な欠点は、投影された光干渉縞パターンの配向および／または相対位相シフトを調整するために必要とされる時間と、各画像を取得するために必要とされる露光時間と、並びに下流画像処理である。したがって、高効率な画像再構成アルゴリズムと共に、回折格子の配向と相対位相を変更するのに必要とされる時間を最小限に抑える光学設計が好ましい。いくつかの例では、例えば、本明細書の他の場所で説明される低非特異的結合表面にテザーされた増幅された標的核酸配列の離散的な蛍光に標識されたクラスタを含むフローセル表面の、超解像度画像を再構成するために必要とされる画像は、従来のサンプル、例えば、染色された組織サンプルの、より高い解像度の画像を再構成するために通常必要とされるものよりも、少ないかもしれない。
図４２を再び参照すると、例えば、フローセル表面全体のより高い解像度画像を作成するために、画像がタイル化される場合には、既述のサイクルが、所与のフローセル表面の異なる面積に対して繰り返されてもよい。いくつかの例では、例えば、第２のフローセル表面が撮像されることになっている場合には、既述のサイクルが、撮像システムの焦点を調節した後に繰り返されてもよい。
他の超解像度撮像技術：いくつかの例では、開示される撮像システムは、代替的な超解像度撮像技術、例えば光活性化局限顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、蛍光光活性化限局顕微鏡法（ＦＰＡＬＭ））、および／または、確率的な光学再構成顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）［例えば、Ｌｕｔｚ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）， ”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ Ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ． ）， ｖｏｌ． １， ５７９－５８９頁， Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照）、を含んでもよく、 これは、単一分子の点広がり関数（ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（ＰＳＦ）の画像で観察される強度分布の、ガウス分布関数への統計的曲線適合に基づいている。その後、ガウス分布関数が、古典的な解像度限界によって可能となるものよりもはるかに高精度で、分子の位置をサンプル平面に定義するために使用される。同じアプローチが、例えば、サンプル支持体上の低非特異的結合表面、またはフローセルの内部表面にテザーされた、標的核酸配列のクローン増幅クラスタなどの、蛍光標識分子の小さな分散サブセットを撮像するために、使用されてもよい。
これらの方法を使用して達成されたる空間精度または解像度は、それが光染色（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｅｄ）される前に分子から収集された光子の数と、バックグラウンドノイズレベルとに左右される ［Ｌｕｔｚ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）， ｉｂｉｄ］。バックグラウンドノイズが無視できる程度であり、そして１分子あたり少なくとも１０，０００の光子の収集が可能である場合には、１－２ｎｍの位置精度が実証されている。いくつかの例では、例えば、本明細書の他の場所に記載されているアビディティ―による配列決定アプローチを使用して、高い光子数を確実にするために、複数の蛍光標識（例えば、１コンジュゲートあたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超える標識）を含む、ポリマーヌクレオチドコンジュゲートが、非常に低いバックグラウンド信号を確実にするために、本明細書の他の場所に開示されている低い非特異的結合表面との組み合わせで随意に使用されて、これらの超解像度撮像技術の使用を、遺伝子テストと配列決定用途のために、促進してもよい。空間精度または解像度は、収集された光子の数が減少すると共に減少するが、わずか中程度の数の光子が収集される場合には、２０ｎｍの位置精度または解像度が可能である。いくつかの場合では、側面空間解像度における１０倍またはより良い改善が達成されてもよい。いくつかの場合では、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ、または１０ｎｍよりも良い画像解像度が達成されてもよい。
このクラスの撮像にとっての第２の必須の原理は、サンプル内の少数の空間的に分離された蛍光分子が、所与の時間に撮像されることである。
いくつかの例では、サンプル平面の蛍光分子の、小さく分散したサブセットの蛍光発光を制御する能力は、超解像度撮像を容易にするキーである。蛍光光活性化限局顕微鏡法（ＦＰＡＬＭ）と光活性化局限顕微鏡法（ＰＡＬＭ）の場合には、例えば、光活性可能な緑色蛍光タンパク質（ＰＡ－ＧＦＰ）の標識としての使用は、４０５ｎｍの光の短いパルスを使用して、サンプル中の蛍光サブセットの制御された誘導を可能にし、ＰＡ－ＧＦＰを、暗い、非蛍光状態から、４８８ｎｍの励起可能蛍光状態に光変換（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｔ）することを可能にし、それによって、結果的に、撮像され得る蛍光分子の空間的に分離されたサブセットをもたらす［Ｌｕｔｚ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）， ｉｂｉｄ］。確率的な光学再構成顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）の場合には、例えば、シアニン色素ペアＣｙ５－Ｃｙ３の光子切り替え特性が、同様の方法で使用されて、所与の時間における、サンプル内の分子の小さなサブセット、例えば、少なくともいくつかの解像度単位によって空間的に分離されている分子の小さなサブセットからの、Ｃｙ５蛍光の確率的誘導を可能にしてもよい。いくつかの例では、例えば、本明細書の他の場所に記載される、アビディティ―による配列決定と組み合わされた時、ポリマーヌクレオチドコンジュゲートは、光活性可能な緑色蛍光タンパク質（ＰＡ－ＧＦＰ）、またはサブドメイン、あるいはその一部を含んでもよい。いくつかの例では、ポリマーヌクレオチドコンジュゲートは、第１の部分が例えばＣｙ３標識で標識され、第２の部分が例えばＣｙ５標識で標識されているコンジュゲートの混合物を含んでもよい。いくつかの例では、ポリマーヌクレオチドコンジュゲートは、同じコンジュゲート内に、例えばＣｙ３標識とＣｙ５標識の混合物を含んでもよい。
超解像度画像は、取得した画像の時間スタック（ｔｉｍｅ ｓｔａｃｋ）で撮像された、すべての分子または特徴（例えば、識別された核酸クラスタ）からのガウス適合（Ｇａｕｓｓｉａｎ ｆｉｔ）の合計から再構成され［Ｌｕｔｚ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）， ｉｂｉｄ］、ここで強度は、分子の各分子またはサブセットの位置の不確実性に相当する。この種のデータセットに固有なのは、異なる局在精度または解像度を有する画像をレンダリングする能力である。いくつかの例では、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）光学撮像設計を含む撮像モジュールは、蛍光の励起に使用されるエバネセント波が、軸の次元において、サンプル支持またはフローセル表面から２００ｎｍ未満に制限されており、そしてそのため、バックグラウンド蛍光信号を抑えるので、これらの超解像度撮像技術の使用を実装する際に有利であるかもしれない。いくつかの例では、撮像システムは、本明細書に開示される他の撮像モジュール設計に利用されるより高い開口数の対物レンズを含んでもよい。より高い開口数の対物レンズの使用は、エバネセント波励起の実装と、蛍光プローブからの高効率な光子の捕捉とを、容易にするかもしれない。いくつかの例では、単一光子感受性ＥＭ－ＣＣＤカメラ、または他のタイプの画像センサを使用する、広フィールド撮像は、１フレームあたりで、多くの分子または分子のサブセット（例えば、核酸配列クラスタ）の同時撮像を可能にし得る。
いくつかの例では、特徴の適切な定義と解像度の十分な画像を取得するのに必要なデータ取得時間は、バックグラウンドを低下または排除しながら信号を増加させるために、本明細書に開示される、アビディティによる配列決定の試薬と低非特異的結合表面の使用、および改善された画像再構成アルゴリズムの使用を通じて、撮像システムの感度と速度における改善によって短縮されてもよい。
画質の評価：本明細書に開示される光学撮像設計の実施形態のいずれかに関して、撮像性能または撮像品質は、当業者に既知の様々な性能メトリックのいずれかを使用して評価されてもよい。例は、１以上の特定された空間周波数の変調伝送関数（ＭＴＦ）の測定値、デフォーカス、球面収差、色収差、コマ、非点収差、像面湾曲、画像の歪み、コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
いくつかの例では、両面撮像のための開示される光学設計（例えば、開示される対物レンズ設計、チューブレンズ設計、対物レンズとの組み合わせによる電気光学位相プレートの使用などを、単独でまたは組み合わせで）は、フローセルの上部（近い）内部表面と下部（遠い）内部表面の両方に有意な改善をもたらしてもよく、それによって、フローセルの上部内部表面と下部内部表面を撮像するための撮像性能メトリックの差異は、上に列挙される撮像性能メトリックについて、単独でまたは組み合わせでのいずれかで、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満になる。
いくつかの例では、開示される両面撮像のための光学設計（例えば、開示されるチューブレンズ設計、対物レンズとの組み合わせによる電気光学位相プレートの使用など）は、画質に有意な改善をもたらしてもよく、それによって、両面撮像の画質性能メトリックは、従来システムと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも、３０％の両面撮像の撮像性能における改善を提供し、従来システムは、例えば、対物レンズ、（フローセルの近い内部表面または遠い内部表面を撮像する時に、光路の内外に動かされる）運動作動補正器、および上に列挙される撮像性能メトリックのいずれかのための画像センサを、単独でまたは組み合わせでのいずれかで、含んでいる。いくつかの例では、開示されるチューブレンズ設計の１以上を含む蛍光撮像システムは、対物レンズ、運動作動補正器、および画像センサを含む従来システムの撮像性能と比較して、両面撮像のための撮像性能メトリックにおける少なくとも同等の改善、またはより良い改善をもたらす。いくつかの例では、開示されるチューブレンズ設計の１以上を含む蛍光撮像システムは、対物レンズ、運動作動補正器、および画像センサを含む従来システムの撮像性能と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％の両面撮像の撮像性能における改善を提供する。
撮像モジュール仕様：
励起光波長：開示される光学撮像モジュール設計のいずれにおいても、開示される撮像モジュールの光源は、緑色光および／または赤色光などの可視光線を生成してもよい。いくつかの例では、光源は、単独でまたは１以上の光学コンポーネント、例えば励起光学フィルタおよび／またはダイクロイックビームスプリッタとの組み合わせで、約３５０ｎｍ、３７５ｎｍ、４００ｎｍ、４２５ｎｍ、４５０ｎｍ、４７５ｎｍ、５００ｎｍ、５２５ｎｍ、５５０ｍ、５７５ｎｍ、６００ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７００ｎｍ、７２５ｎｍ、７５０ｎｍ、７７５ｎｍ、８００ｎｍ、８２５ｎｍ、８５０ｎｍ、８７５ｎｍ、または９００ｎｍの励起光を生成してもよい。当業者は、励起波長が、この範囲内、例えば約６２０ｎｍ内のいずれの値を有してもよいことを認識するだろう。
励起光帯域幅：開示される光学撮像モジュール設計のいずれにおいても、光源は、単独でまたは１以上の光学コンポーネント、例えば励起光学フィルタおよび／またはダイクロイックビームスプリッタとの組み合わせで、±２ｎｍ、±５ｎｍ、±１０ｎｍ、±２０ｎｍ、±４０ｎｍ、±８０ｎｍ、またはそれ以上の帯域幅内の特定の励起波長の光を生成してもよい。当業者は、励起帯域が、この範囲内の任意の値、例えば約±１８ｎｍを有してもよいことを認識するだろう。
光源電力出力：開示される光学撮像モジュール設計のいずれにおいても、光源からの出力および／またはそこから導出された励起光ビーム（複合励起光ビームを含む）は、（以下により詳細に議論される通り）約０．５Ｗ～約５．０Ｗ、またはそれ以上の電力に及んでもよい。いくつかの例では、光源からの出力および／またはそこから導出された励起光ビームの電力は、少なくとも０．５Ｗ、少なくとも０．６Ｗ、少なくとも０．７Ｗ、少なくとも０．８Ｗ、少なくとも１Ｗ、少なくとも１．１Ｗ、少なくとも１．２Ｗ、少なくとも１．３Ｗ、少なくとも１．４Ｗ、少なくとも１．５Ｗ、少なくとも１．６Ｗ、少なくとも１．８Ｗ、少なくとも２．０Ｗ、少なくとも２．２Ｗ、少なくとも２．４Ｗ、少なくとも２．６Ｗ、少なくとも２．８Ｗ、少なくとも３．０Ｗ、少なくとも３．５Ｗ、少なくとも４．０Ｗ、少なくとも４．５Ｗ、または少なくとも５．０Ｗであってもよい。いくつかの実装では、光源からの出力および／またはそこから導出された励起光ビーム（複合励起光ビームを含む）の電力は、最大で５．０Ｗ、最大で４．５Ｗ、最大で４．０Ｗ、最大で３．５Ｗ、最大で３．０Ｗ、最大で２．８Ｗ、最大で２．６Ｗ、最大で２．４Ｗ、最大で２．２Ｗ、最大で２．０Ｗ、最大で１．８Ｗ、最大で１．６Ｗ、最大で１．５Ｗ、最大で１．４Ｗ、最大で１．３Ｗ、最大で１．２Ｗ、最大で１．１Ｗ、最大で１Ｗ、最大で０．８Ｗ、最大で０．７Ｗ、最大で０．６Ｗ、または最大で０．５Ｗであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、光源からの出力および／またはそこから導出された励起光ビームの電力（複合励起光ビームを含む）は、約０．８Ｗから約２．４Ｗに及んでもよい。当業者は、光源からの出力および／またはそこから導出された励起光ビームの電力（複合励起光ビームを含む）が、この範囲内の任意の値、例えば約１．２８Ｗを有してもよいことを認識するだろう。
光源出力電力とＣＮＲ：開示される光学撮像モジュール設計のいくつかの実装では、光源からの出力電力および／またはそこから導出された励起光ビーム（複合励起光ビームを含む）は、適切なサンプルとの組み合わせで、照明撮像モジュールによって取得された画像において、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、または少なくとも５０、またはそれ以上のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、あるいはこれらの値のいずれかによって形成される任意の範囲内の任意のＣＮＲを提供するのに十分である。
蛍光発光バンド：いくつかの例では、開示される蛍光光学撮像モジュールは、当業者に既知の様々なフルオロフォアのいずれかによって生成される蛍光発光を検知するように構成されてもよい。（例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質への結合による）遺伝子型決定や核酸配列決定用途における使用に適切な蛍光色素の例としては、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、シアニン、およびシアニン誘導体シアニン色素－３（Ｃｙ３）、シアニン色素－５（Ｃｙ５）、シアニン色素－７など（Ｃｙ７）などを含むシアニン誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。
蛍光発光波長：開示される光学撮像モジュール設計のいずれにおいても、開示される光学システムの検出チャネルまたは撮像チャネルは、１以上の光学部品、例えば発光光学フィルタおよび／またはダイクロイックビームスプリッタを含んでいてもよく、当該光学部品は、約３５０ｎｍ、３７５ｎｍ、４００ｎｍ、４２５ｎｍ、４５０ｎｍ、４７５ｎｍ、５００ｎｍ、５２５ｎｍ、５５０ｍ、５７５ｎｍ、６００ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７００ｎｍ、７２５ｎｍ、７５０ｎｍ、７７５ｎｍ、８００ｎｍ、８２５ｎｍ、８５０ｎｍ、８７５ｎｍ、または９００ｎｍの放射光を収集するように構成されてもよい。当業者は、発光波長が、この範囲内の任意の値、例えば約８２５ｎｍを有してもよいことを認識するだろう。
蛍光放射光帯域幅：開示される光学撮像モジュール設計のいずれにおいても、検出チャネルまたは撮像チャネルは、１以上の光学コンポーネント、例えば発光光学フィルタおよび／またはダイクロイックビームスプリッタを含んでいてもよく、当該光学コンポーネントは、＋／－２ｎｍ、＋／－５ｎｍ、＋／－１０ｎｍ、＋／－２０ｎｍ、＋／－４０ｎｍ、＋／－８０ｎｍ、またはそれ以上の帯域幅内の特定の発光波長の光を収集するように構成されてもよい。当業者は、励起帯域幅が、この範囲内の任意の値、例えば約１８ｎｍを有してもよいことを認識するだろう。
開口数：いくつかの例では、開示される光学システム設計のいずれかにおける対物レンズおよび／または光学撮像モジュール（例えば、対物レンズおよび／またはチューブレンズを含む）の開口数は、約０．１～約１．４に及んでもよい。いくつかの例では、開口数は、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、または少なくとも１．４であってもよい。いくつかの例では、開口数は、最大で１．４、最大で１．３、最大で１．２、最大で１．１、最大で１．０、最大で０．９、最大で０．８、最大で０．７、最大で０．６、最大で０．５、最大で０．４、最大で０．３、最大で０．２、または最大で０．１であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、開口数は、約０．１～約０．６に及んでもよい。当業者は、開口数が、この範囲内の任意の値、例えば約０．５５を有してもよいことを認識するだろう。
光学解像度：いくつかの例では、対物レンズおよび／または光学システム（例えば、対物レンズおよび／またはチューブレンズを含む）の開口数に応じて、開示される光学システム設計のいずれかによって達成されるサンプル平面における最小分解可能スポット（または特徴）分離距離は、約０．５μｍ～約２μｍに及んでもよい。いくつかの例では、サンプル平面における最小分解可能スポット分離距離は、少なくとも０．５μｍ、少なくとも０．６μｍ、少なくとも０．７μｍ、少なくとも０．８μｍ、少なくとも０．９μｍ、少なくとも１．０μｍ、少なくとも１．２μｍ、少なくとも１．４μｍ、少なくとも１．６μｍ、少なくとも１．８μｍ、または少なくとも１．０μｍであってもよい。いくつかの例では、最小分解可能スポット分離距離は、最大で２．０μｍ、最大で１．８μｍ、最大で１．６μｍ、最大で１．４μｍ、最大で１．２μｍ、最大で１．０μｍ、最大で０．９μｍ、最大で０．８μｍ、最大で０．７μｍ、最大で０．６μｍ、または最大で０．５μｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、最小分解可能スポット分離距離は、約０．８μｍ～約１．６μｍに及んでもよい。当業者は、最小分解可能スポット分離距離が、この範囲内の任意の値、例えば約０．９５μｍを有してもよいことを認識するだろう。
異なる深度での第１の表面と第２の表面の光学解像度：いくつかの例では、本明細書に開示される新規の対物レンズおよび／またはチューブレンズ設計の使用は、本明細書に開示される光学モジュールまたは光学システムのいずれかにおいて、第１の表面と第２の表面の画像の取得間での再集光を必要として、または必要とすることなく、第１の表面と第２の表面（例えばフローセルの上部の内部表面と下部の内部表面）に対して同等の光学解像度を与えてもよい。いくつかの例では、第１の表面と第２の表面の、このように取得された画像の光学解像度は、互いの２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、または１％、あるいはこの範囲内の任意の値内であってもよい。
倍率：いくつかの例では、開示される光学構成のいずれかにおける対物レンズおよび／またはチューブレンズ、および／または光学システム（例えば対物レンズおよび／またはチューブレンズを含む）の倍率は、約２ｘ～約２０ｘに及んでもよい。いくつかの例では、光学システム倍率は、少なくとも２ｘ、少なくとも３ｘ、少なくとも４ｘ、少なくとも５ｘ、少なくとも６ｘ、少なくとも７ｘ、少なくとも８ｘ、少なくとも９ｘ、少なくとも１０ｘ、少なくとも１５ｘ、または少なくとも２０ｘであってもよい。いくつかの例では、光学システム倍率は、最大で２０ｘ、最大で１５ｘ、最大で１０ｘ、最大で９ｘ、最大で８ｘ、最大で７ｘ、最大で６ｘ、最大で５ｘ、最大４ｘ、最大３ｘ、最大２ｘであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、光学システム倍率は、約３ｘ～約１０ｘに及んでもよい。当業者は、光学システム倍率が、この範囲内の任意の値、例えば約７．５ｘを有してもよいことを認識するだろう。
対物レンズ焦点距離：開示される光学設計のいくつかの実装では、対物レンズの焦点距離は、２０ｍｍ～４０ｍｍに及んでもよい。いくつかの例では、対物レンズの焦点距離は、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、少なくとも３０ｍｍ、少なくとも３５ｍｍ、または少なくとも４０ｍｍであってもよい。いくつかの例では、対物レンズの焦点距離は、最大で４０ｍｍ、最大で３５ｍｍ、最大で３０ｍｍ、最大で２５ｍｍ、または最大で２０ｍｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、対物レンズの焦点距離は、２５ｍｍ～３５ｍｍに及んでもよい。当業者は、対物レンズの焦点距離が、上に指定された値の範囲内の任意の値、例えば約３７ｍｍを有してもよいことを認識するだろう。
対物レンズ作動距離：開示される光学設計のいくつかの実装では、対物レンズの作動距離は、約１００μｍ～３０ｍｍに及んでもよい。いくつかの例では、作動距離は、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも９００μｍ、少なくとも１ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、または少なくとも３０ｍｍであってもよい。いくつかの例では、作動距離は、最大で３０ｍｍ、最大で２５ｍｍ、最大で２０ｍｍ、最大で１５ｍｍ、最大で１０ｍｍ、最大で８ｍｍ、最大で６ｍｍ、最大で４ｍｍ、最大で２ｍｍ、最大で１ｍｍ、最大で９００μｍ、最大で８００μｍ、最大で７００μｍ、最大で６００μｍ、最大で５００μｍ、最大で４００μｍ、最大で３００μｍ、最大で２００μｍ、最大で１００μｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、対物レンズの作動距離は、５００μｍ～２ｍｍに及んでもよい。当業者は、対物レンズの作動距離が、上に指定された値の範囲内の任意の値、例えば約１．２５ｍｍを有してもよいことを認識するだろう。
厚いカバースリップを通る撮像のために最適化された対物レンズ：開示される光学設計のいくつかの例では、対物レンズの設計は、フローセル厚みの異なるカバースリップに対して改善されてもよく、または最適化されてもよい。例えば、いくつかの例では、対物レンズは、約２００μｍ～約１，０００μｍの厚みであるカバースリップについて、最適な光学性能のために設計されてもよい。いくつかの例では、対物レンズは、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも９００μｍ、または少なくとも１，０００μｍの厚みであるカバースリップでの、最適性能のために設計されてもよい。いくつかの例では、対物レンズは、最大で１，０００μｍ、最大で９００μｍ、最大で８００μｍ、最大で７００μｍ、最大で６００μｍ、最大で５００μｍ、最大で４００μｍ、最大で３００μｍ、または最大で２００μｍの厚みであるカバースリップでの、最適性能のために設計されてもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、対物レンズは、約３００μｍ～約９００μｍに及び得るカバースリップでの、最適な光学性能のために設計されてもよい。当業者は、対物レンズが、この範囲内の任意の値、例えば約７２５μｍであるカバースリップでの、最適な光学性能のために設計されてもよい。
被写界深度と焦点深度：いくつかの例では、開示される撮像モジュール（例えば、対物レンズおよび／またはチューブレンズを含む）設計のいずれかに対する被写界深度および／または焦点深度は、約１０μｍ～約８００μｍ、またはそれ以上に及んでもよい。いくつかの例では、被写界深度および／または焦点深度は、少なくとも１０μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１２５μｍ、少なくとも１５０μｍ、少なくとも１７５μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも２５０μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、またはそれ以上であってもよい。いくつかの例では、被写界深度および／または焦点深度、最大で８００μｍ、最大で７００μｍ、最大で６００μｍ、最大で５００μｍ、最大で４００μｍ、最大で３００μｍ、最大で２５０μｍ、最大で２００μｍ、最大で１７５μｍ、最大で１５０μｍ、最大で１２５μｍ、最大で１００μｍ、最大で７５μｍ、最大で５０μｍ、最大で４０μｍ、最大で３０μｍ、最大で２０μｍ、最大で１０μｍ、またはそれ以下であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、被写界深度および／または焦点深度は、約１００μｍ～約１７５μｍに及んでもよい。当業者は、被写界深度および／または焦点深度が、上に指定された値の範囲内の任意の値、例えば約１３２μｍを有してもよいことを認識するだろう。
視野（ＦＯＶ）：いくつかの実装では、開示される撮像モジュール設計（例えば対物レンズと検出チャネル光学部品（チューブレンズなど）との組み合わせによって提供される）のいずれかのＦＯＶは、例えば約１ｍｍ～５ｍｍ（例えば直径、幅、長さ、または最長寸法で）に及んでもよい。いくつかの例では、ＦＯＶは、少なくとも１．０ｍｍ、少なくとも１．５ｍｍ、少なくとも２．０ｍｍ、少なくとも２．５ｍｍ、少なくとも３．０ｍｍ、少なくとも３．５ｍｍ、少なくとも４．０ｍｍ、少なくとも４．５ｍｍ、または少なくとも５．０ｍｍ（例えば直径、幅、長さ、または最長寸法で）であってもよい。いくつかの例では、ＦＯＶは、最大で５．０ｍｍ、最大で４．５ｍｍ、最大で４．０ｍｍ、最大で３．５ｍｍ、最大で３．０ｍｍ、最大で２．５ｍｍ、最大で２．０ｍｍ、最大で１．５ｍｍ、または最大で１．０ｍｍ（例えば直径、幅、長さ、または最長寸法で）であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、ＦＯＶは、約１．５ｍｍ～約３．５ｍｍ（例えば直径、幅、長さ、または最長寸法で）に及んでもよい。当業者は、ＦＯＶが、上に指定された値の範囲内の任意の値、例えば約３．２ｍｍ（例えば直径、幅、長さ、または最長寸法で）を有してもよいことを認識するだろう。
視野（ＦＯＶ）面積：開示される光学システム設計のいくつかの例では、視野の面積は、約２ｍｍ２～約５ｍｍ２に及んでもよい。いくつかの例では、視野は、少なくとも２ｍｍ２、少なくとも３ｍｍ２、少なくとも４ｍｍ２、または少なくとも５ｍｍ２の面積であってもよい。いくつかの例では、視野は、最大で５ｍｍ２、最大で４ｍｍ２、最大で３ｍｍ２、または最大で２ｍｍ２の面積であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、視野は、約３ｍｍ２～約４ｍｍ２の面積に及んでもよい。当業者は、視野の面積が、この範囲内の任意の値、例えば２．７５ｍｍ２を有してもよいことを認識するだろう。
対物レンズおよび／またはチューブレンズＭＴＦの最適化：いくつかの例では、開示される撮像モジュールおよびシステムの、対物レンズおよび／または少なくとも１つのチューブレンズの設計は、中程度から高程度の空間周波数範囲で、変調伝送関数を最適化するように構成されている。例えば、いくつかの例では、開示される撮像モジュールおよびシステムの、対物レンズおよび／または少なくとも１つのチューブレンズの設計は、サンプル平面で、１ｍｍあたり５００サイクル～１ｍｍあたり９００サイクル、１ｍｍあたり７００サイクル～１ｍｍあたり１１００のサイクル、１ｍｍあたり８００サイクル～１ｍｍあたり１２００サイクル、または１ｍｍあたり６００サイクル～１ｍｍあたり１０００サイクルの空間周波数範囲で、変調伝送関数を最適化するように構成されている。
光学収差と回折限界撮像性能：本明細書に開示される光学撮像モジュール設計のいずれかのいくつかの実装では、対物レンズおよび／またはチューブレンズは、ＦＯＶが、フィールドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％にわたる収差の０．１５未満の波を有するように、上に示される視野を撮像モジュールに提供するように構成されてもよい。いくつかの実装では、対物レンズおよび／またはチューブレンズは、ＦＯＶが、フィールドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％にわたる収差の０．１未満の波を有するように、上に示される視野を撮像モジュールに提供するように構成されてもよい。いくつかの実装では、対物レンズおよび／またはチューブレンズは、ＦＯＶが、フィールドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％にわたたる０．０７５未満の波の収差を有するように、上に示される視野を撮像モジュールに提供するように構成されてもよい。いくつかの実装では、対物レンズおよび／またはチューブレンズは、ＦＯＶが、フィールドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％にわたる回折限界を有するように、上に示される視野を撮像モジュールに提供するように構成されてもよい。
ダイクロイックリフレクタ、ビームスプリッタ、およびビーム結合器への光ビームの入射角度：開示される光学設計のいくつかの例では、ダイクロイックリフレクタ、ビームスプリッタ、またはビーム結合器に入射する光ビームの入射角度は、約２０度～約４５度に及んでもよい。いくつかの例では、入射角度は、少なくとも２０度、少なくとも２５度、少なくとも３０度、少なくとも３５度、少なくとも４０度、または少なくとも４５度であってもよい。いくつかの例では、入射角度は、最大で４５度、最大で４０度、最大で３５度、最大で３０度、最大で２５度、または最大で２０度であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、入射角度は、約２５度～約４０度に及んでもよい。当業者は、入射角度が、上に指定された値の範囲内の任意の値、例えば約４３度を有してもよいことを認識するだろう。
画像センサ（光検出器アレイ）サイズ：いくつかの例では、開示される光学システムは、約１０ｍｍ～約３０ｍｍ、またはそれ以上に及ぶ対角線を有する作用面積を有する画像センサを含んでもよい。いくつかの例では、画像センサは、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１２ｍｍ、少なくとも１４ｍｍ、少なくとも１６ｍｍ、少なくとも１８ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２２ｍｍ、少なくとも２４ｍｍ、少なくとも２６ｍｍ、少なくとも２８ｍｍ、または少なくとも３０ｍｍの対角線を有する作用面積を有していてもよい。いくつかの例では、画像センサは、最大で３０ｍｍ、最大で２８ｍｍ、最大で２６ｍｍ、最大で２４ｍｍ、最大で２２ｍｍ、最大で２０ｍｍ、最大で１８ｍｍ、最大で１６ｍｍ、最大で１４ｍｍ、最大で１２ｍｍ、または最大で１０ｍｍの対角線を伴う作用面積を有していてもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、画像センサは、約１２ｍｍ～約２４ｍｍに及ぶ対角線を有する作用面積を有していてもよい。当業者は、画像センサが、上に指定された値の範囲内の任意の値、例えば約２８．５ｍｍを有してもよいことを認識するだろう。
画像センサの画素サイズおよびピッチ：いくつかの例では、開示される光学システム設計で使用される画像センサに対して選択される画素サイズおよび／またはピッチは、約１μｍ～約１０μｍの少なくとも１つの寸法に及でもよい。いくつかの例では、画素サイズおよび／またはピッチは、少なくとも１μｍ、少なくとも２μｍ、少なくとも３μｍ、少なくとも４μｍ、少なくとも５μｍ、少なくとも６μｍ、少なくとも７μｍ、少なくとも８μｍ、少なくとも９μｍ、少なくとも１０μｍであってもよい。いくつかの例では、画素サイズおよび／またはピッチは、最大で１０μｍ、最大で９μｍ、最大で８μｍ、最大で７μｍ、最大で６μｍ、最大で５μｍ、最大で４μｍ、最大で３μｍ、最大で２μｍ、最大で１μｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、画素サイズおよび／またはピッチは、約３μｍ～約９μｍに及んでもよい。当業者は、画素サイズおよび／またはピッチが、この範囲内の任意の値、例えば約１．４μｍを有してもよいことを認識するだろう。
オーバーサンプリング：開示される光学設計のいくつかの例では、空間オーバーサンプリングスキームが利用され、ここで、空間サンプリング周波数は、少なくとも２ｘ、２．５ｘ、３ｘ、３．５ｘ、４ｘ、４．５ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、または１０ｘ光学解像度Ｘ（ｌｐ／ｍｍ）である。
最大並進ステージ速度：開示される光学撮像モジュールのいくつかの例では、任意の１軸上の最大並進ステージ速度は、約１ｍｍ／秒～約５ｍｍ／秒に及んでもよい。いくつかの例では、最大並進ステージ速度は、少なくとも１ｍｍ／秒、少なくとも２ｍｍ／秒、少なくとも３ｍｍ／秒、少なくとも４ｍｍ／秒、または少なくとも５ｍｍ／秒であってもよい。いくつかの例では、最大並進ステージ速度は、最大で５ｍｍ／秒、最大で４ｍｍ／秒、最大で３ｍｍ／秒、最大で２ｍｍ／秒、または最大で１ｍｍ／秒であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、最大並進ステージ速度は、約２ｍｍ／秒～約４ｍｍ／秒に及んでもよい。当業者は、最大並進ステージ速度が、この範囲内の任意の値、例えば約２．６ｍｍ／秒を有してもよいことを認識するだろう。
最大並進ステージ加速度：開示される光学撮像モジュールのいくつかの例では、運動の任意の１軸上の最大加速度は、約２ｍｍ／秒２～約１０ｍｍ／秒２に及でもよい。いくつかの例では、最大加速度は、少なくとも２ｍｍ／秒２、少なくとも３ｍｍ／秒２、少なくとも４ｍｍ／秒２、少なくとも５ｍｍ／秒２、少なくとも６ｍｍ／秒２、少なくとも７ｍｍ／秒２、少なくとも８ｍｍ／秒２、少なくとも９ｍｍ／秒２、または少なくとも１０ｍｍ／秒２であってもよい。いくつかの例では、最大加速度は、最大で１０ｍｍ／秒２、最大で９ｍｍ／秒２、最大で８ｍｍ／秒２、最大で７ｍｍ／秒２、最大で６ｍｍ／秒２、最大で５ｍｍ／秒２、最大で４ｍｍ／秒２、最大で３ｍｍ／秒２、または最大で２ｍｍ／秒２であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、最大加速度は、約２ｍｍ／秒２～約８ｍｍ／秒２に及んでもよい。当業者は、最大加速度が、この範囲内の任意の値、例えば約３．７ｍｍ／秒２を有してもよいことを認識するだろう。
並進ステージ配置再現性：開示される光学撮像モジュールのいくつかの例では、任意の１軸に対する配置の再現性は、約０．１μｍ～約２μｍに及んでもよい。いくつかの例では、配置の再現性は、少なくとも０．１μｍ、少なくとも０．２μｍ、少なくとも０．３μｍ、少なくとも０．４μｍ、少なくとも０．５μｍ、少なくとも０．６μｍ、少なくとも０．７μｍ、少なくとも０．８μｍ、少なくとも０．９μｍ、少なくとも１．０μｍ、少なくとも１．２μｍ、少なくとも１．４μｍ、少なくとも１．６μｍ、少なくとも１．８μｍ、または少なくとも２．０μｍであってもよい。いくつかの例では、配置の再現性は、最大で２．０μｍ、最大で１．８μｍ、最大で１．６μｍ、最大で１．４μｍ、最大で１．２μｍ、最大で１．０μｍ、最大で０．９μｍ、最大で０．８μｍ、最大で０．７μｍ、最大で０．６μｍ、最大で０．５μｍ、最大で０．４μｍ、最大で０．３μｍ、最大で０．２μｍ、最大で０．１μｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、配置の再現性は、約０．３μｍ～約１．２μｍに及んでもよい。当業者は、配置の再現性が、この範囲内の任意の値、例えば約０．４７μｍを有してもよいことを認識するだろう。
ＦＯＶ再配置時間：開示される光学撮像モジュールのいくつかの例では、光学部品に対してサンプル平面（視野）を再配置する、またはその逆のために必要な最大時間は、約０．１秒～約０．５秒に及んでもよい。いくつかの例では、最大再配置時間（つまりスキャンステージ工程および整定の時間）は、少なくとも０．１秒、少なくとも０．２秒、少なくとも０．３秒、少なくとも０．４秒、または少なくとも０．５秒であってもよい。いくつかの例では、最大再配置時間は、最大で０．５秒、最大で０．４秒、最大で０．３秒、最大で０．２秒、または最大で０．１秒であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、最大再配置時間は、約０．２秒～約０．４秒に及んでもよい。当業者は、最大再配置時間が、この範囲内の任意の値、例えば約０．４５秒を有してもよいことを認識するだろう。
オートフォーカス修正のためのエラー閾値：開示される光学撮像モジュールのいくつかの例では、オートフォーカス修正を引き起こすように指定されたエラー閾値は、約５０ｎｍ～約２００ｎｍに及んでもよい。いくつかの例では、エラー閾値は、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも７５ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１２５ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも１７５ｎｍ、または少なくとも２００ｎｍであってもよい。いくつかの例では、エラー閾値は、最大で２００ｎｍ、最大で１７５ｎｍ、最大で１５０ｎｍ、最大で１２５ｎｍ、最大で１００ｎｍ、最大で７５ｎｍ、または最大で５０ｎｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、エラー閾値は、約７５ｎｍ～約１５０ｎｍに及んでもよい。当業者は、エラー閾値が、この範囲内の任意の値、例えば約１０５ｎｍを有してもよいことを認識するだろう。
画像取得時間：開示される光学撮像モジュールのいくつかの例では、画像取得時間は、約０．００１秒～約１秒に及んでもよい。いくつかの例では、画像取得時間は、少なくとも０．００１秒、少なくとも０．０１秒、少なくとも０．１秒、または少なくとも１秒であってもよい。いくつかの例では、画像取得時間は、最大で１秒、最大で０．１秒、最大で０．０１秒、または最大で０．００１秒であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、画像取得時間は、約０．０１秒～約０．１秒に及んでもよい。当業者は、画像取得時間が、この範囲内の任意の値、例えば約０．２５０秒を有してもよいことを認識するだろう。
ＦＯＶあたりの撮像時間：いくつかの例では、撮像時間は、視野あたり約０．５秒～約３秒に及んでもよい。いくつかの例では、撮像時間は、ＦＯＶあたり、少なくとも０．５秒、少なくとも１秒、少なくとも１．５秒、少なくとも２秒、少なくとも２．５秒、または少なくとも３秒であってもよい。いくつかの例では、撮像時間は、ＦＯＶあたり、最大で３秒、最大で２．５秒、最大で２秒、最大で１．５秒、最大で１秒、または最大で０．５秒であってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、撮像時間は、約１秒～約２．５秒に及んでもよい。当業者は、撮像時間が、この範囲内の任意の値、例えば約１．８５秒を有してもよいことを認識するだろう。
フィールドの平面度：いくつかの例では、視野の８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のパーセントにわたる画像が、各蛍光（または他の撮像モード）検出チャネルの最良の焦点平面に対して、±２００ｎｍ、±１７５ｎｍ、±１５０ｎｍ、±１２５ｎｍ、±１００ｎｍ、±７５ｎｍ、または±５０ｎｍ内で取得される。
ゲノミクス用途および他の用途のためのシステムおよびシステムコンポーネント：上に記されるように、いくつかの実装では、開示される光学撮像モジュールは、例えば、ゲノミクス用途（例えば、遺伝子テスト用途および／または核酸配列決定用途）、または他の化学分析、生化学分析、核酸分析、細胞分析、または組織分析の用途を実行するように構成されたより大きなシステムの、モジュール、コンポーネント、サブアセンブリ、またはサブシステムとして機能してもよい。図３９は、例えば本明細書に開示されるような配列決定システムのためのブロック図の非限定的な例を提供する。１、２、３、４の、または４を超える、本明細書に開示されるような撮像モジュール（それらの各々が、１以上の照明光路および／または１以上の検出光路（例えば画像センサ上に特定波長範囲内の蛍光発光を撮像するように構成された１以上の検出チャネル）を含んでもよい）に加え、そのようなシステムは、１以上のＸ－Ｙ並進ステージ、１以上のＸ－Ｙ－Ｚ並進ステージ、フローセルまたはカートリッジ、流体光学システムと流体フロー制御モジュール、試薬カートリッジ、温度制御モジュール、流体分配ロボット工学部品、カートリッジおよび／またはマイクロプレート処理（ピックアンドプレース）ロボット工学部品、遮光筐体および／または環境制御チャンバ、１以上のプロセッサまたはコンピュータ、データ記憶モジュール、データ通信モジュール（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、ＷｉＦｉ、イントラネット、またはインターネット通信ハードウェアと関連ソフトウェア）、ディスプレイモジュール、１以上のローカルのおよび／またはクラウドベースのソフトウェアパッケージ（例えば、機器／システム制御ソフトウェアパッケージ、画像処理ソフトウェアパッケージ、データ分析ソフトウェアパッケージ）など、またはその任意の組み合わせを含んでもよい。
並進ステージ：本明細書に開示される撮像システムと分析システム（例えば核酸配列決定システム）のいくつかの実装では、システムは、１以上の（例えば１、２、３、４の、または４を超える）高精度Ｘ－Ｙ（または場合によってはＸ－Ｙ－Ｚ）並進ステージを含んでもよく、当該並進ステージは、例えば、各々が撮像モジュールの視野に対応する状態で１以上の画像をタイル化して、フローセル表面全体の複合画像を再構成するために、１以上のサンプル支持構造（例えばフローセル）を、１以上の撮像モジュールに対して再配置するためのものである。本明細書に開示される撮像システムとゲノミクス分析システム（例えば核酸配列決定システム）のいくつかの実装では、システムは、１以上の（例えば１、２、３、４の、または４を超える）高精度Ｘ－Ｙ（または場合によってはＸ－Ｙ－Ｚ）並進ステージを含んでもよく、当該並進ステージは、例えば、各々が撮像モジュールの視野に対応する状態で１以上の画像をタイル化して、フローセル表面全体の複合画像を再構成するために、１以上の撮像モジュールを、１以上のサンプル支持構造（例えばフローセル）に対して再配置するためのものである。
適切な並進ステージは、様々なベンダー、例えばＰａｒｋｅｒ Ｈａｎｎｉｆｉｎから市販で入手可能である。精度の良い並進ステージシステムは、一般に、いくつかのコンポーネントの組み合わせを含み、当該コンポーネントの例としては、リニアアクチュエータ、光学エンコーダ、サーボモータおよび／またはステップモータ、およびモータコントローラまたは駆動ユニットを含むが、これらに限定されない。ステージ動作の高度な精度および高度な再現性は、試薬送達と光検出との反復工程を散在させる時に、例えば蛍光信号を、正確かつ再現性良く確実に配置して撮像するために、必要とされる。
従って、本明細書に開示されるシステムは、精度を指定することを含んでもよく、当該精度で、並進ステージがサンプル支持構造を照明および／または撮像光学部品に関連して（またはその逆で）配置するように構成される。本開示の一態様では、１以上の並進ステージの精度は、約０．１μｍ～約１０μｍである。他の態様では、並進ステージの精度は、約１０μｍ以下、約９μｍ以下、約８μｍ以下、約７μｍ以下、約６μｍ以下、約５μｍ以下、約４μｍ以下、約３μｍ以下、約２μｍ以下、約１μｍ以下、約０．９μｍ以下、約０．８μｍ以下、約０．７μｍ以下、約０．６μｍ以下、約０．５μｍ以下、約０．４μｍ以下、約０．３μｍ以下、約０．２μｍ以下、または約０．１μｍ以下である。いくつかの例では、当業者は、並進ステージの配置が、これらの値の２つのいずれかによって境界付けられた任意の範囲（例えば約０．５μｍ～約１．５μｍ）内に存在してもよいことを理解するであろう。いくつかの例では、並進ステージの配置精度は、この段落に含まれる値の範囲内の任意の値、例えば約０．１２μｍを有してもよい。
フローセル、マイクロ流体デバイス、およびカートリッジ：本明細書に開示されるフローセルデバイスとフローセル・カートリッジは、様々な化学分析、生化学分析、核酸分析、細胞分析、または組織分析用途のために設計されたシステムのコンポーネントとして使用されてもよい。一般に、そのようなシステムは、開示される単一のキャピラリーフローセルデバイス、複数のキャピラリーフローセルデバイス、キャピラリーフローセル・カートリッジ、および／または本明細書に記載されるマイクロ流体デバイおよびカートリッジの１以上を含んでもよい。開示されるフローセルデバイスおよびカートリッジの追加的な説明は、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０２０／１１８２５５に確認することができ、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの例では、本明細書に開示されるシステムは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上の単一のキャピラリーフローセルデバイス、複数のキャピラリーフローセルデバイス、キャピラリーフローセル・カートリッジ、および／またはマイクロ流体デバイスおよびカートリッジを含んでもよい。いくつかの例では、単一のキャピラリーフローセルデバイス、複数のキャピラリーフローセルデバイス、および／またはマイクロ流体デバイスおよびカートリッジは、開示されるシステムの固定されたコンポーネントであってもよい。いくつかの例では、単一のキャピラリーフローセルデバイス、複数のキャピラリーフローセルデバイス、および／またはマイクロ流体デバイスおよびカートリッジは、開示されるシステムの取り外し可能で交換可能なコンポーネントであってもよい。いくつかの例では、単一のキャピラリーフローセルデバイス、複数のキャピラリーフローセルデバイス、および／またはマイクロ流体デバイスおよびカートリッジは、開示されるシステムの使い捨て可能で消費可能なコンポーネントであってもよい。
いくつかの実装では、開示された単一のキャピラリーフローセルデバイス（または単一のキャピラリーフローセル・カートリッジ）は、単一のキャピラリーであって、例えばガラスまたは溶融シリカのキャピラリーを含み、当該キャピラリーは、そのルーメンが流体の流動経路を形成し、その流動経路を通って試薬または溶液が流れてもよく、また、その内部表面がサンプル支持構造を形成して、そのサンプル支持構造に対象のサンプルが結合される、またはテザーされる。いくつかの実装では、本明細書に開示される複数のキャピラリーフローセルデバイス（または複数のキャピラリーフローセル・カートリッジ）は、検出方法としての撮像をさらに含む分析手法を実行するように構成される、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０以上のキャピラリーを含んでもよい。
いくつかの例では、１以上のキャピラリーは、容易な取り扱いを促進し、外部流体接続を作り出すためのアダプタまたはコネクタを組み込み、試薬リザーバ、廃棄物リザーバ、弁（例えばマイクロ弁）、ポンプ（例えばマイクロポンプ）など、あるいはそれらの任意の組み合わせなどの、追加的な統合機能を随意に含む、カートリッジを形成するためのシャーシ内にパッケージ化されていてもよい。
図２９は、単一のキャピラリーフローセルの非限定的な例を示し、当該キャピラリーフローセルは、ガラスキャピラリーのピースのそれぞれの端部に１つずつ取り付けられている２つの流体アダプタを含み、標準ＯＤ流体管類と嵌合して、外部流体フロー制御システムへの、簡便な交換可能な流体接続を提供するように設計されている。流体アダプタは、圧入、接着結合、溶剤結合、レーザ溶接など、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、技術分野の当業者にとって既知である、様々な技法のいずれかを使用して、キャピラリーに取り付けることができる。
一般に、開示されるキャピラリーフローセルデバイスとキャピラリーフローセル・カートリッジで使用されるキャピラリーは、キャピラリーの全長を走る、少なくとも１つの内部の、軸方向に位置合わせされた流体フローチャネル（または「ルーメン」）を有する。いくつかの例では、キャピラリーは、２、３、４、５、または５を超える、内部の、軸方向に位置合わせされた流体フローチャネル（または「ルーメン」）を有していてもよい。
適切なキャピラリー（またはルーメン）の多数の指定された断面形状は、本開示と一致しており、その例としては、円形、楕円形、正方形、長方形、三角形、丸みを帯びた正方形、丸みを帯びた長方形、または丸みを帯びた三角形の断面形状が挙がられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、キャピラリー（またはそのルーメン）は、任意の指定された断面寸法または寸法のセットを有していてもよい。例えば、いくつかの例では、キャピラリールーメンの最大の断面寸法（例えばルーメンが円形の形状をしている場合は直径、あるいは、ルーメンが正方形または長方形の形状をしている場合は対角線）は、約１０μｍ～約１０ｍｍに及んでもよい。いくつかの態様では、キャピラリールーメンの最大の断面寸法は、少なくとも１０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも９００μｍ、少なくとも１ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも３ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも９ｍｍ、または少なくとも１０ｍｍであってもよい。いくつかの態様では、キャピラリールーメンの最大の断面寸法は、最大で１０ｍｍ、最大で９ｍｍ、最大で８ｍｍ、最大で７ｍｍ、最大で６ｍｍ、最大で５ｍｍ、最大で４ｍｍ、最大で３ｍｍ、最大で２ｍｍ、最大で１ｍｍ、最大で９００μｍ、最大で８００μｍ、最大で７００μｍ、最大で６００μｍ、最大で５００μｍ、最大で４００μｍ、最大で３００μｍ、最大で２００μｍ、最大で１００μｍ、最大で７５μｍ、最大で５０μｍ、最大で２５μｍ、最大で１０μｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、キャピラリールーメンの最大の断面寸法は、約１００μｍ～約５００μｍに及んでもよい。当業者は、キャピラリールーメンの最大の断面寸法が、この範囲内の任意の値、例えば約１２４μｍを有してもよいことを認識するだろう。
例えば、フローセルデバイスまたはカートリッジの１以上のキャピラリーのルーメンが、正方形または長方形の断面を有しているいくつかの例では、流体フローチャネルのギャップの高さまたは厚みを定義する、第１の内部表面（例えば上部表面または上部の表面）と第２の内部表面（例えば下部表面または下部の表面）との間の距離は、約１０μｍ～約５００μｍに及んでもよい。いくつかの例では、ギャップの高さは、少なくとも１０μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも６０μｍ、少なくとも７０μｍ、少なくとも８０μｍ、少なくとも９０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１２５μｍ、少なくとも１５０μｍ、少なくとも１７５μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも２２５μｍ、少なくとも２５０μｍ、少なくとも２７５μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも３２５μｍ、少なくとも３５０μｍ、少なくとも３７５μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも４２５μｍ、少なくとも４５０μｍ、少なくとも４７５μｍ、または少なくとも５００μｍであってもよい。いくつかの例では、ギャップの高さは、最大で５００μｍ、最大で４７５μｍ、最大で４５０μｍ、最大で４２５μｍ、最大で４００μｍ、最大で３７５μｍ、最大で３５０μｍ、最大で３２５μｍ、最大で３００μｍ、最大で２７５μｍ、最大で２５０μｍ、最大で２２５μｍ、最大で２００μｍ、最大で１７５μｍ、最大で１５０μｍ、最大で１２５μｍ、最大で１００μｍ、最大で９０μｍ、最大で８０μｍ、最大で７０μｍ、最大で６０μｍ、最大で５０μｍ、最大で４０μｍ、最大で３０μｍ、最大で２０μｍ、または最大で１０μｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、ギャップの高さは、約４０μｍ～約１２５μｍに及んでもよい。当業者は、ギャップの高さが、この段落の値の範囲内の任意の値、例えば約１２２μｍを有してもよいことを認識するだろう。
いくつかの例では、開示されるキャピラリーフローセルデバイスまたはフローセル・カートリッジを製造するのに使用される１以上のキャピラリーの長さは、約５ｍｍ～約５ｃｍ以上に及んでもよい。いくつかの例では、１以上のキャピラリーの長さは、５ｍｍ未満、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１ｃｍ、少なくとも１．５ｃｍ、少なくとも２ｃｍ、少なくとも２．５ｃｍ、少なくとも３ｃｍ、少なくとも３．５ｃｍ、少なくとも４ｃｍ、少なくとも４．５ｃｍ、または少なくとも５ｃｍであってもよい。いくつかの例では、１以上のキャピラリーの長さは、最大で５ｃｍ、最大で４．５ｃｍ 最大で４ｃｍ、最大で３．５ｃｍ、最大で３ｃｍ、最大で２．５ｃｍ、最大で２ｃｍ、最大で１．５ｃｍ、最大で１ｃｍ、または最大で５ｍｍであってもよい。この段落内で記載されるより低い値とより高い値のいずれかは、本開示内に含まれる範囲を形成するために組み合わされてもよく、例えばいくつかの例では、１以上のキャピラリーの長さは、約１．５ｃｍ～約２．５ｃｍに及んでもよい。当業者は、１以上のキャピラリーの長さが、この範囲内の任意の値、例えば約１．８５ｃｍを有してもよいことを認識するだろう。いくつかの例では、デバイスまたはカートリッジは、同じ長さである複数の２以上のキャピラリーを含んでもよい。いくつかの例では、デバイスまたはカートリッジは、異なる長さである複数の２以上のキャピラリーを含んでもよい。
本開示のキャピラリーフローセルデバイスまたはキャピラリーフローセル・カートリッジを構築するために使用されるキャピラリーは、限定されないが、ガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス、ソーダライムガラスなど）、溶融シリカ（石英）、ポリマー（例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、マクロポーラスポリスチレン（ＭＰＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）など）、より化学的に不活性な代替品としてポリエーテルイミド（ＰＥＩ）およびパーフルオロエラストマー（ＦＦＫＭ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、当業者に知られている様々な材料のいずれかから作製されてもよい。ＰＥＩは、コストと化学的適合性の観点から、ポリカーボネートとＰＥＥＫの中間に位置する。ＦＦＫＭはカルレッツ（Ｋａｌｒｅｚ）としても知られている。
キャピラリーを作製するために使用される１つ以上材料は、分光法または撮像に基づく検出技術との使用を促進するために、多くの場合、光学的に透明である。いくつかの例では、キャピラリー全体が光学的に透明であり得る。代替的に、いくつかの例では、キャピラリーの一部（例えば、光学的に透明な「窓」）のみが光学的に透明である。
本開示のキャピラリーフローセルデバイスとキャピラリーフローセル・カートリッジを構築するために使用されるキャピラリーは、当業者に知られている様々な技術のいずれかを使用して作製され得、ここで作製技術の選択は使用される材料の選択にしばしば依存し、その逆も然りである。適切なキャピラリー作製技術の例としては、限定されないが、押出成形、絞り加工、精密コンピュータ数値制御（ＣＮＣ）機械加工およびボーリング、レーザー光アブレーションなどが挙げられる。
いくつかの実装では、本開示のキャピラリーフローセルデバイスおよびカートリッジにおいて使用されるキャピラリーは、既製の商用製品であり得る。精密キャピラリーチューブを提供している市販業者の例としては、Ａｃｃｕ－Ｇｌａｓｓ（ミズーリ州セントルイス、精密ガラスキャピラリーチューブ）、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アリゾナ州フェニックス、精密ガラスおよび溶融シリカキャピラリーチューブ）、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ＆ Ｄｉｍｍｏｃｋ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ミルヴィル、カスタム精密ガラスキャピラリーチューブ）、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルバニア州ブルームオール、ＯＥＭガラスおよびプラスチックキャピラリーチューブ）が挙げられる。
本明細書に開示されたキャピラリーフローセルデバイスとカートリッジのキャピラリーに付属の流体のアダプタ、およびキャピラリーフローセルデバイスまたはカートリッジの他の構成要素は、様々な適切な技術（例えば、押し出し成形、射出成形、圧縮成形、精密ＣＮＣ機械成形など）と材料（例えば、ガラス、溶融シリカ、セラミック、金属、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、マクロ多孔性のポリスチレン（ＭＰＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）など）のうちのいずれを使用して作製されてもよく、ここで再び、作製技術の選択は使用される材料の選択にしばしば依存し、その逆も然りである。
図３０は、２つのガラス・キャピラリー、流体工学アダプタ（この例では、１つのキャピラリーあたり２）と、キャピラリーがカートリッジに対して固定された配向で保持されるように、キャピラリーおよび／または流体工学アダプタを嵌合するカートリッジ・シャーシを含むキャピラリーフローセル・カートリッジの非限定的な例を提供する。いくつかの例では、流体のアダプタは、カートリッジ・シャーシに統合されることがある。いくつかの例では、カートリッジは、キャピラリーおよび／またはキャピラリー流体工学アダプタと嵌合する付加的なアダプタを含み得る。本明細書の他の箇所で留意されるように、いくつかの例において、カートリッジは付加的な機能的構成要素を含み得る。いくつかの例では、キャピラリーは、カートリッジに恒久的に載置される。いくつかの例では、カートリッジ・シャーシは、フローセル・カートリッジの１つ以上のキャピラリーが交換可能に取り除かれ、および置き換えられることを可能にするように設計されている。例えば、いくつかの例では、カートリッジ・シャーシは、それを開くことを可能にするヒンジ式の「クラムシェル」構成を含み得、その結果、１つ以上のキャピラリーが取り除かれ置き換えられ得る。いくつかの例では、カートリッジ・シャーシは、例えば、蛍光顕微鏡のステージ上、あるいは蛍光撮像モジュールのカートリッジ・ホルダー、または本開示の機器システム内に載置されるように構成される。
いくつかの例では、本開示のフローセルデバイスはマイクロ流体デバイス（または「マイクロ流体チップ」）およびカートリッジを含む場合があり、ここで、マイクロ流体デバイスは、流体チャネルを適切な材料の１つ以上の層に形成することにより作製され、および、検出方法として撮像をさらに含む分析技術を実行するように構成された１つ以上の流体チャネル（例えば、「分析」チャネル）を含む。いくつかの実装では、本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスまたはカートリッジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０以上の流体チャネル（例えば、「分析」流体チャネル）を含み得、該流体チャネルは検出方法としてさらに撮像を含む分析技術を実行するように構成されている。いくつかの例において、開示されるマイクロ流体デバイスは、デバイスの内部に統合された「チップ上のラボ」の機能を提供するために、付加的な流体チャネル（例えば、試薬の希釈または混合のための）、試薬リザーバ、廃棄物リザーバ、外部に流体接続するためのアダプタなどをさらに含んでもよい。
マイクロ流体フローセル・カートリッジの非限定的な例は、チップ上に形成された２つ以上の平行なガラスチャネルを含むチップと、チップに連結された流体アダプタと、チップがカートリッジに対して固定された配向で置かれるようにチップおよび／または流体アダプタと嵌合するカートリッジ・シャーシと、を含む。いくつかの例では、流体アダプタは、カートリッジ・シャーシに統合され得る。いくつかの例では、カートリッジは、前記チップおよび／または流体工学アダプタと嵌合する付加的なアダプタを含み得る。いくつかの例では、チップは、カートリッジに恒久的に載置される。いくつかの例では、カートリッジ・シャーシは、フローセル・カートリッジの１つ以上のチップが取り除かれ、および置き換えられて、交換可能であることを可能にするように設計されている。例えば、いくつかの例では、カートリッジ・シャーシは、開かれることを可能にするヒンジ式の「クラムシェル」構成を含み得、その結果、１つ以上のチップが取り除かれ置き換えられ得る。いくつかの例では、カートリッジ・シャーシは、例えば、顕微鏡システムのステージ上に、または撮像システムのカートリッジホルダ内に載置されるように構成される。ただ一つのチップが非限定的な例において記載されているが、マイクロ流体フローセル・カートリッジに１つを超える数のチップを使用し得ることは理解される。本開示のフローセル・カートリッジは、単一のマイクロ流体チップまたは複数のマイクロ流体チップを含み得る。いくつかの例では、フローセル・カートリッジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０以上のマイクロ流体チップを含み得る。カートリッジ内に１つ以上のマイクロ流体デバイスをパッケージングすることは、光学撮像システム内でのデバイスの取り扱いやすさと正確な配置を促進し得る。
本開示のマイクロ流体デバイスおよびカートリッジ内の流体チャネルは、限定されないが、円形、楕円形、正方形、長方形、三角形、丸みを帯びた正方形、丸みを帯びた長方形、または丸みを帯びた三角形の断面の幾可学的形状を含む、様々な断面の幾可学的形状を有し得る。いくつかの例では、流体チャネルは、いかなる具体的な横断面の寸法または寸法のセットを有してもよい。例えば、いくつかの例では、流体チャネルの高さ（例えば、ギャップ高さ）、幅、または最大の横断面寸法（例えば、流体チャネルが正方形、丸みを帯びた正方形、長方形、または丸みを帯びた長方形の断面を有する場合、対角線）は、約１０μｍから約１０ｍｍまでの範囲にあり得る。いくつかの態様において、流体チャネルの高さ（例えば、ギャップ高さ）、幅、または最大の横断面寸法は、少なくとも１０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも９００μｍ、少なくとも１ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも３ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも９ｍｍ、または少なくとも１０ｍｍであり得る。いくつかの態様では、流体チャネルの高さ（例えば、ギャップ高さ）、幅、または最大の横断面寸法は、最大で１０ｍｍ、最大で９ｍｍ、最大で８ｍｍ、最大で７ｍｍ、最大で６ｍｍ、最大で５ｍｍ、最大で４ｍｍ、最大で３ｍｍ、最大で２ｍｍ、最大で１ｍｍ、最大で９００μｍ、最大で８００μｍ、最大で７００μｍ、最大で６００μｍ、最大で５００μｍ、最大で４００μｍ、最大で３００μｍ、最大で２００μｍ、最大で１００μｍ、最大で７５μｍ、最大で５０μｍ、最大で２５μｍ、または、最大で１０μｍ、であり得る。この段落に記載されている下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、流体チャネルの高さ（例えば、ギャップ高さ）、幅、または最大の横断面寸法は、約２０μｍ～約２００μｍの範囲であってもよい。当業者であれば、流体チャネルの高さ（例えばギャップ高さ）、幅、または最大の横断面寸法がこの範囲内のどんな値も（例えば、約１２２μｍ）有し得ることを認識であろう。
いくつかの例では、本開示のマイクロ流体デバイスおよびカートリッジ中の流路の長さは、約５ｍｍ～約１０ｃｍ、またはそれ以上に及び得る。いくつかの例では、流体チャネルの長さは、５ｍｍ未満、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１ｃｍ、少なくとも１．５ｃｍ、少なくとも２ｃｍ、少なくとも２．５ｃｍ、少なくとも３ｃｍ、少なくとも３．５ｃｍ、少なくとも４ｃｍ、少なくとも４．５ｃｍ、少なくとも５ｃｍ、少なくとも６ｃｍ、少なくとも７ｃｍ、少なくとも８ｃｍ、少なくとも９ｃｍ、または少なくとも１０ｃｍであり得る。いくつかの例では、流体チャネルの長さは、最大で１０ｃｍ、最大で９ｃｍ、最大で８ｃｍ、最大で７ｃｍ、最大で６ｃｍ、最大で５ｃｍ、最大で４．５ｃｍ、最大で４ｃｍ、最大で３．５ｃｍ、最大で３ｃｍ、最大で２．５ｃｍ、最大で２ｃｍ、最大で１．５ｃｍ、最大で１ｃｍ、または、少なくとも５ｍｍであり得る。この段落に記載されている下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、流体チャネルの長さは、約１．５ｃｍ～約２．５ｃｍの範囲であってもよい。当業者であれば、流体チャネルの長さは、この範囲内の任意の値、例えば、約１．３５ｃｍを有してもよいことを認識するであろう。いくつかの例では、マイクロ流体デバイスまたはカートリッジは、同じ長さの複数の流体チャネルを含んでもよい。いくつかの例では、マイクロ流体デバイスまたはカートリッジは、異なる長さの複数の流体チャネルを含んでもよい。
開示されるマイクロ流体デバイスは、材料の少なくとも１つの層を含み得、その中に１つ以上の流体チャネルを形成される。いくつかの例では、マイクロ流体チップは、１つ以上の流体チャネルを形成するために共に結合された２つの層を含み得る。いくつかの例では、マイクロ流体チップは、１つ以上の流体チャネルを形成するために共に結合された３つの層を含み得る。いくつかの例では、マイクロ流体の流体チャネルは、オープントップを有し得る。いくつかの例では、マイクロ流体の流体チャネルは、１つの層内に、例えば、下部層の天面に作製され、および、材料の、下部層の天面を上部層の底面に結合することによって密閉され得る。いくつかの例では、マイクロ流体チャネルは、１つの層内に、例えば、深さが層の全厚みにわたって延在するパターン化されたチャネルとして、作製され、そして、流体チャネルを密閉するために、２つのパターン化されていない層の間に挟まれ、および結合されてもよい。いくつかの例では、マイクロ流体チャネルは、基板の表面上の犠牲層を除去することによって作製される。この方法は、大量の基板（例えば、ガラスまたはシリコンウェーファー）が削り取られることを必要としない。その代わりに、流体チャネルは、基板の表面に位置する。いくつかの例では、マイクロ流体チャネルは基板の表面の中で、あるいはその表面上で作製され、その後、チップ中で表面下のチャネルあるいは埋め込まれたチャネルを作るために、基板の表面にコンフォーマルフィルムまたは層を沈着させることにより、密閉され得る。
マイクロ流体チップは、微細加工処理の組み合わせを使用して製造することができる。デバイスが微細加工されるために、基板材料は、典型的には、既知の微細加工技術との互換性に基づいて、選択されることになり、例えば、フォトリトグラフィー、ウェットケミカルエッチング、レーザアブレーション、レーザー照射、空気アブレーション技法、射出成形、エンボス加工、およびその他の技術が挙げられる。基板材料はまた、一般的には、マイクロ流体デバイスが曝され得るあらゆる条件との互換性に関して選ばれ、前記条件は、極端なｐＨ、温度、塩濃度、および電磁場（例えば、光）または電場の適用を含む。
本開示のマイクロ流体チップは、限定されないが、ガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス、ソーダライムガラスなど）、溶融シリカ（石英）、シリコン、ポリマー（例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、マクロポーラスポリスチレン（ＭＰＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）など）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）およびパーフルオロエラストマー（ＦＦＫＭ）（より化学的に不活性な代替品として）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、当業者に知られている様々な材料のいずれかから作製されてもよい。いくつかの好ましい例では、基板材料は、他の基板材料と同様に、ホウケイ酸ガラスおよび石英などのシリカ系基板を含むことがある。
開示されるマイクロ流体デバイスは、当業者に知られている様々な技術のいずれかを使用して作製され得、ここで作製技術の選択は使用される材料の選択にしばしば依存し、その逆も然りである。チップ上のマイクロ流体チャネルは、基板の表面にマイクロパターンまたはマイクロ構造を形成するのに適した技術を用いて構築することができる。いくつかの態様では、流体チャネルは、レーザー照射によって形成される。いくつかの態様では、マイクロ流体チャネルは、集光フェムト秒レーザー照射によって形成される。いくつかの例では、マイクロ流体チャネルはフォトリトグラフィー、および、限定されないが、ケミカルエッチング、プラズマエッチング、または深層反応性イオンエッチングを含むエッチングによって形成される。いくつかの例では、マイクロ流体チャネルはレーザー・エッチングを使用して形成される。いくつかの例では、マイクロ流体チャネルは直接の書き込みのリソグラフィ技術を使用して形成される。直接書き込みリソグラフィーの例としては、電子ビーム直接描画および集束イオンビームミリングが挙げられる。
付加的な好ましい例では、基板材料は、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ（商標））、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスルホンなどのポリマー材料などのプラスチックを含み得る。そのようなポリマー基板は、上に記載されたような利用可能な微細加工技術を使用して、容易にパターン化されるか、あるいは微細加工され得る。いくつかの例では、マイクロ流体チップは、射出成形、エンボス、型押し、または型内でのポリマー前駆体材料の重合などの周知の成形技術を使用して、ポリマー材料から、例えば微細加工されたマスターから、作製され得る（例えば、米国特許第第５，５１２，１３１号を参照）。いくつかの例では、そのようなポリマー基板材料は、製造の容易さ、低いコスト、および使い捨て可能であることにより、並びに、ほとんどの極端な反応条件に全般的に不活性であることにより、選好される。他の材料、例えば、ガラスから作製されたフローセルデバイスと同様に、これらのポリマー材料から作製されたフローセルデバイスは、マイクロ流体システムの中でそれらの有用性を高めるために、処理面、例えば誘導化された表面またはコーティングされた表面を含んでもよく、そのことは以下でより詳細に説明される。
マイクロ流体デバイスの流体チャネルおよび／または流体チャンバは、典型的には、上に記載の微細加工技術を使用して、マイクロスケールのチャネル（例えば、溝、くぼみなど）として第１の基板の上部表面において作製される。第１の基板は、第１の平面を有する上面と底面を含む。本明細書に記載された方法により準備されたマイクロ流体デバイスでは、複数の流体チャネル（例えば、溝および／またはくぼみ）は、第１の平面上に形成される。いくつかの例では、第１の平面（第２の基板に結合する前の）に形成された流体チャネル（例えば、溝および／またはくぼみ）は、底面壁と側面壁を有し、上面は解放されたままである。いくつかの例では、第１の平面（第２の基板に結合する前の）に形成された流体チャネル（例えば、溝および／またはくぼみ）は、底面壁と側面壁とを有し、上面は閉じられたままである。いくつかの例では、第１の平面（第２の基板に結合する前の）に形成された流体チャネル（例えば、溝および／またはくぼみ）は、側面壁のみを有し、上面も底面も持たない（すなわち、流体チャネルは、第１基板の全厚みにわたる）。
流体チャネルおよびチャンバは、第１の基板の第１の平面を第２の基板の平面に接触および結合させて配置することにより、密閉され得、２つの構成要素の界面でデバイスのチャネルおよび／またはチャンバ（例えば内部部分）を形成し得る。いくつかの例では、第１の基板が第２の基板に結合された後、その構造物は第３の基板に接触および結合されて、さらに配置され得る。いくつかの例では、第３の基板は、第２の基板に接触していない第１の基板の側面に接触して配置されてもよい。いくつかの例では、第１の基板は第２の基板と第３の基板との間に配置される。いくつかの例では、第２の基板と第３の基板は、溝およびくぼみ、または第１基板上に形成されたアパーチャを被覆および／または密閉して、これらの構成要素の界面でデバイスのチャネルおよび／またはチャンバ（例えば、内部部分）を形成し得る。
デバイスは、デバイスの内部部分に形成された流体チャネルおよび／または流体チャンバの少なくとも１つと流体連通にあるように配向される開口部を有し得、それにより、流体入口および／または流体出口を形成する。いくつかの例では、開口部は第１の基板上に形成される。いくつかの例では、開口部は第１の基板上および第２の基板上に形成される。いくつかの例では、開口部は第１、第２、および第３の基板の上で形成される。いくつかの例では、開口部はデバイスの上面横に配置される。いくつかの例では、開口部はデバイスの底横に配置される。いくつかの例では、開口部は、デバイスの第１のおよび／または第２の端部に配置され、および、チャネルは、第１の端部から第２の端部に向かう方向に沿って延びる。
基板が共に結合され得る条件は、一般的に当業者に広く理解され、および、基板のそのような結合は、一般的には、様々な方法のうちのいずれかによって実行され得、その結合の方法の選択は、使用される基板材料の性質に依存して様々であり得る。例えば、基板の熱結合は、多くの基板材料に適用されてもよく、例えば、ガラス、シリカベースの基板、並びに、何らかのポリマーベースの基板が挙げられる。そのような熱結合技術は、典型的には高温の条件下で、場合によっては外圧の適用下で、結合されるべき基板の表面を貼り合わせることを含む。利用された正確な温度と圧力は、一般的に、使用される基板材料の性質に依存して変更されることになる。
例えば、シリカベースの基板材料、すなわち、ガラス（ホウケイ酸ガラス、パイレックス（Ｐｙｒｅｘ）（商標）、ソーダ石灰ガラスなど）、溶融シリカ（石英）などについては、基板の熱結合は、典型的に、約５００℃から約１４００℃までの、および好ましくは約５００℃から約１２００℃までの範囲の温度で実行される。例えば、ソーダ石灰ガラスは、典型的に約５５０℃の温度で結合されるのに対し、ホウケイ酸ガラスは、典型的に８００℃またはその付近の温度で、熱結合される。他方、石英基板は、典型的に、１２００℃またはその付近の温度で熱結合される。これらの結合温度は、アニール用オーブンの高温中に結合される基板を置くことにより典型的に達成される。
他方、熱により結合されるポリマー基板は、基板の過度の溶解、および／または、例えば、デバイス（すなわち、流体チャネルまたはチャンバ）の内部部分の平板化といったひずみを予防するために、シリカベースの基板より、典型的には、低温および／または低圧力を利用することになる。通常、ポリマー基板を結合するためのそのような上昇された温度は、使用されるポリマー材料に依存して、約８０℃から約２００℃までにわたって様々であり得、好ましくは約９０℃と約１５０℃の間であり得る。ポリマー基板の結合に必要とされる温度が有意に低減されるため、そのような結合は、典型的には、シリカベースの基板の結合に使用される高温オーブンを必要とせずに実行され得る。このことは、以下でより詳細に記載されるように、単一の統合された結合システム中に熱源を組み込むことを可能する。
公知の方法によって基板をともに結合するために粘着剤が使用されてもよく、前記方法は、結合される基板の間に粘着剤の層を適用すること、および、粘着性が固まるまでそれらをともにプレスすることを典型的に含む。これらの方法に従って、様々な粘着剤が使用されてもよく、例えば、商業的に入手可能な、ＵＶ硬化可能な粘着剤が挙げられる。本発明に従って基板をともに結合するために代替的な方法が使用されてもよく、例えば、ポリマー部品の音響溶接あるいは超音波溶接、および／または溶剤溶接が挙げられる。
典型的には、例えば、「ウエハスケール」の作製を使用して、多くの記載されたマイクロ流体チップまたはデバイスが同時に製造されることになる。例えば、ポリマー基板は、大きな分離可能なシートにおいて、型押し又は型成型され、その後、ともに貼り合わせ及び結合され得る。個々のデバイスまたは結合した基板は、その後、切断するかさいの目に切ることによって、より大きなシートから分離され得る。同様に、シリカベースの基板については、個々のデバイスは、より大きな基板ウエハあるいはプレートから作製することができ、製造プロセスのより高い生産量が可能とされる。具体的には、複数の流体チャネル構造は、第１の基板ウエハあるいはプレート上に作製され、その後、それは第２の基板ウエハあるいはプレートによって覆われてそれと結合され、および、随意に、第３の基板ウエハあるいはプレートによってさらに覆われてそれと結合される。その後、個々のデバイスは、鋸引き（ｓａｗｉｎｇ）、スクライビング（ｓｃｒｉｂｉｎｇ）、ブレーキング（ｂｒｅａｋｉｎｇ）などの既知の方法を使用して、より大きな基板から分離される。
上記に留意されるように、最上または第２の基板は、様々なチャネルおよびチャンバを密閉するために、底部または第１の基板上を覆う。本開示の方法による結合プロセスを実行する際に、２つの基板表面を最適な接触に保つために第１および第２の基板の結合は、真空および／または圧力を使用して実行されてもよい。特に、底部基板は、例えば、底部基板の平面を上部基板の平面と貼り合わせ、そして上部基板を通って配される孔から真空を適用することによって、上部基板との最適な接触状態に保たれ得る。典型的には、上部基板の孔への真空の適用は真空チャック上に上部基板を配置することにより実行され、前記真空チャックは、載置台または表面を典型的に含み、真空源が統合されている。シリカベースの基板の場合には、結合される基板が初期の結合を作るために、上昇された温度にさらされる、その結果、結合される基板は、互いに対してずれることなく、焼きなましオーブンに移動され得る。
本明細書に記載の機器に組み込むための代替の結合システムは、例えば、２つの基板平面の間に粘着剤層を適用するための粘着剤塗布システムが挙げられる。これは、基板を貼り合わせる前に粘着剤層を適用することによって、または、２つの貼り合わせられた基板のウィッキング作用が２つの基板間の空間にわたって粘着剤を引くことを可能にして隣接した基板の１つのエッジにある量の粘着剤を配置することによって、行われてもよい。
ある例では、全体的な結合システムは、上部および底部の基板を載置表面上に配置し、および後の結合のためにそれらを位置合わせするための自動化可能なシステムを含み得る。典型的には、そのようなシステムは、取り付け表面または上部および底部の基板の１つ以上のいずれかを互いに対して動かすための平行移動システムを含む。例えば、上部および底部の基板のそれぞれを持ち上げ、平行移動させ、および配置するために、載置台上で、および整列構造内に、順番に、ロボットシステムが使用されてもよい。結合処理に続いて、そのようなシステムは、また、載置面から完成品を取り除き、および、後のオペレーション、例えば、分離する又はさいの目に切るオペレーション、また、付加的な基板を結合させるためにその上に配置する前にシリカベースの基板を焼きなますオーブンなどに、これらの貼り合わせられた基板を移動させ得る。
いくつかの例では、マイクロ流体チップの製造は、チップを産生するために、基板、例えば、パターン化された、およびパターン化されていないポリマーシートの２つ以上の層を層状化または積層化することを含む。例えば、マイクロ流体デバイスでは、デバイスのマイクロ流体の機構は、第１の層の表面へのレーザー照射、エッチング、または他の作製用の機構によって典型的に生み出される。次に、第２の層を第１の層の表面に積層または結合して、これらの機構を密閉し、デバイスの流体要素、例えば、流体チャネルを提供する。
上述したように、いくつかの例では、キャピラリーフローセル・カートリッジまたはマイクロ流体カートリッジを形成するために、１つまたは複数のキャピラリーフローセルデバイスまたはマイクロ流体チップがカートリッジシャーシに載置され得る。いくつかの例では、キャピラリーフローセル・カートリッジまたはマイクロ流体カートリッジは、特定の応用向けに強化された性能を提供するために、カートリッジと統合された付加的な構成要素をさらに含んでいてもよい。カートリッジの中へ統合され得る付加的な構成要素の例は、限定されないが、システムの他の構成要素と流体的に接続するためのアダプタまたはコネクタ、流体流動制御部品（例えば、ミニチュア弁、ミニチュアポンプ、ミキシングマニホールドなど）、温度制御部品（例えば、抵抗発熱体、熱源またはヒートシンクとなる金属板、加熱または冷却用の圧電素子（ペルチェ素子）、温度センサー）、または、光学的部品（例えば、光学レンズ、ウィンドウ、フィルタ、ミラー、プリズム、光ファイバーおよび／または発光ダイオード（ＬＥＤ）、または１つ以上のキャピラリーまたは流体流動チャネルの分光測定および／またはイメージングを促進するために集合的に使用することができる他の小型光源）、を含む。
流体アダプタ、カートリッジ・シャーシ、および他のカートリッジ構成要素が、キャピラリー、キャピラリーフローセルデバイス（複数可）、マイクロ流体チップ（複数可）（またはチップの中の流体チャネル）に取り付けられてもよく、その取り付けには、当業者に既知の、プレスばめ、粘着結合、溶剤結合、レーザ溶接など、またはその任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々な技術が使用される。マイクロ流体チップ内のマイクロ流体チャネルの入口および／または出口は、チップの上面のアパーチャであり、流体アダプタは、チップ内のマイクロ流体チャネルの入口および／または出口に取り付けまたは連結され得る。いくつかの例では、カートリッジは付加的なアダプタを含んでもよく（すなわち、流体アダプタに加えて）、それは、チップおよび／または流体アダプタと結合され、およびカートリッジ内にチップを配置するのを助ける。これらのアダプタは、前述の流体アダプタと同様の作製技術と材料を用いて構築され得る。
カートリッジのシャーシ（または「筐体」）は、アルミニウム、陽極酸化アルミニウム、ポリカーボネート（ＰＣ）、アクリル（ＰＭＭＡ）、またはウルテム（ＰＥＩ）などの金属および／またはポリマー材料で作製されてもよく、一方、他の材料も本開示に矛盾しない。筐体は、ＣＮＣ機械加工および／または成形技術を用いて作製され、１つ、または２つ以上のキャピラリまたはマイクロ流体チップがシャーシによって固定された配向で拘束されることで、１つ以上の独立した流路が作り出されるように設計され得る。キャピラリまたはチップは、例えば、圧縮嵌合設計、またはシリコンやフルオロエラストマー製の圧縮可能なアダプタとの嵌合により、シャーシに取り付けられ得る。いくつかの例では、カートリッジ・シャーシの２以上の構成要素（例えば、上半分と下半分）は、２つの半分の部分が分離可能であるように、例えば、ネジ、クリップ、クランプ、またはその他の留め具を使用して組み立てられる。いくつかの例では、カートリッジ・シャーシの２つ以上の構成要素は、２つ以上の構成要素が恒久的に取り付けられるように、例えば、結合剤、溶剤、レーザー溶接などを用いて組み立てられる。
フローセル表面コーティング：いくつかの例では、本開示のフローセルデバイスのキャピラリーのルーメンまたはマイクロ流体チャネルの１つ以上の内部表面 は、当業者に既知の様々な表面改質技術やポリマーコーティングのいずれかを用いてコーティングされ得る。いくつかの例では、コーティングは、例えば、オリゴヌクレオチドアダプター／プライマー配列にハイブリダイズした標識核酸分子から発生する蛍光信号などの前景信号を増加または最大化させるために、１つ以上の内部表面上の利用可能な結合部位（例えば、テザーされたオリゴヌクレオチドのアダプタ／プライマー配列）の数を増加または最大化するように配合され得る。いくつかの例では、コーティングは、フルオロフォアおよびその他の小分子、または、標識あるいは非標識のヌクレオチド、タンパク質、酵素、抗体、オリゴヌクレオチド、または核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の非特異的結合を減少または最小化させるように配合され得るが、これは、バックグラウンド信号、例えば、標識された生体分子の非特異的な結合または試料支持構造の自家蛍光などのバックグラウンド信号を減少または最小化させるためである。本開示のコーティングを使用することによりいくつかの例で達成され得る前景信号の増加と背景信号の減少の組み合わせは、このように、分光計測におけるＳＮＲ（信号対ノイズ比）の向上や、撮像方法におけるＣＮＲ（コントラスト対ノイズ比）の向上をもたらし得る。
以下により詳細に説明されることになるが、開示される親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスは、随意に改善されたハイブリダイゼーションおよび／または増幅プロトコルと組み合わせて使用され、固相バイオアッセイ反応をもたらし、該反応は：（ｉ）タンパク質と他の反応成分との無視できる程度の非特異的結合（従って、基板バックグラウンドの縮小または最小化）と、（ｉｉ）無視できる程度の非特異的核酸増幅産物と、を示し、および、（ｉｉｉ）調整可能な核酸増幅反応を提供する。本明細書では、主に核酸のハイブリダイゼーション、増幅、配列決定のアッセイについて記載するが、本開示の低結合性支持体は、限定されないが、サンドイッチ免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など、さまざまなバイオアッセイ方式に使用され得ることは、当業者に理解されるであろう。
好ましい態様では、コーティング材の１つ以上の層がフローセルデバイスの内部表面に適用されてもよく、ここで、層の数および／または各層の材料組成は、米国特許出願第１６／３６３，８４２号に記載されているように、フローセルデバイスの内部表面の１つ以上の表面特性を調整するために選択される。調節されることがある表面特性の例は、限定されないが、表面の親水性／疎水性、全体的なコーティング厚さ、化学反応性官能基の表面密度、グラフト化されたリンカー分子あるいはオリゴヌクレオチドアダプター／プライマーの表面密度など、である。いくつかの好ましい応用例では、キャピラリーまたはチャネルのルーメンの１つ以上の表面特性は、例えば、（ｉ）固相核酸増幅および／または配列決定の応用を含む化学的または生物学的分析の応用において、タンパク質、オリゴヌクレオチド、フルオロフォアと、他の分子成分との非特異的結合を非常に低くするように、（ｉｉ）固相核酸ハイブリダイゼーションの特異性および効率を改善するように、（ｉｉｉ）固相核酸増幅の速度、特異性、および効率を改善するように、調整される。
シラン、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、他のモノマーまたはポリマー、またはその組み合わせを含み、これらに限定されない当業者に既知の様々な分子のうちのいずれかが、フローセルデバイスの内部表面上の１つ以上の化学的に修飾された層を作るのに使用されてもよく、ここで、支持表面の１つ以上の特性を変更するために、使用される成分の選択は様々であり得、例えば、官能基および／またはテザーされたオリゴヌクレオチドプライマーの表面密度、支持表面の親水性／疎水性、または支持表面の三次元的な性質（すなわち、「厚さ」）などが挙げられる。
化学的に修飾された第１の層をフローセル（キャピラリーまたはチャネル）の内部表面にグラフトするために使用される付着化学は、一般に、フローセルデバイスが作製される材料と層の化学的性質の両方に依存する。いくつかの例では、第１の層は、フローセルデバイスの内部表面へ共有結合で付着され得る。いくつかの例では、第１の層は、非共有結合的に付着する場合があり、例えば、表面と第１の層の分子成分との間の静電相互作用、水素結合、またはファンデルワールス相互作用などの非共有結合により、表面に吸着し得る。いずれの場合も、基板表面は第１の層の付着または堆積に先立って処置され得る。支持表面を洗浄または処理するために、当業者に知られている様々な表面処理技術のいずれかが使用され得る。例えば、ガラスまたはシリコン面は、ピラニア（Ｐｉｒａｎｈａ）溶液（硫酸（Ｈ２ＳＯ４）と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の混合物）を使用して酸洗浄してもよく、および／または酸素プラズマ処理法を使用して洗浄してもよい。
シラン化学は、ガラスやシリコンの表面のシラノール基を共有結合で修飾し、より反応性の高い官能基（例えば、アミンまたはカルボキシル基）を付着させる非限定的なアプローチの１つであり、リンカ分子（例えば、Ｃ６、Ｃ１２、Ｃ１８炭化水素などの様々な長さの線形炭化水素分子、または線状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子）、または、層分子（例えば、分岐状ＰＥＧ分子または他のポリマー）を表面へカップリングさせるために使用されてもよい。開示される低結合支持表面のうちのいずれかを作るのに使用され得る適切なシランの例は、限定されないが、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、様々なＰＥＧシラン（例えば、１Ｋ、２Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋなどの分子量を含む）のうちのいずれか、アミノ－ＰＥＧシラン（つまり、遊離アミノ官能基を含む）、マレイミド－ＰＥＧシラン、ビオチン－ＰＥＧシラン、などを含む。
開示される支持表面のいずれかにおいて低非特異的結合材料の１つ以上の層を作るために使用され得る好ましいポリマーの例は、限定されないが、様々な分子量と分岐構造のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ストレプトアビジン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、デキストラン、ポリリジン、ポリ－リジンコポリマー、またはそのいかなる組み合わせも含む。支持表面に材料の１つ以上の層（例えば、ポリマー層）をグラフト化したり、層を互いに架橋したりするために使用され得るコンジュゲーション化学の例としては、限定されないが、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用（またはそのバリエーション）、ｈｉｓタグ－Ｎｉ／ＮＴＡコンジュゲーション化学、メトキシエーテルコンジュゲーション化学、カルボキシレートコンジュゲーション化学、アミンコンジュゲーション化学、ＮＨＳエステル、マレイミド、チオール、エポキシ、アジド、ヒドラジド、アルキン、イソシアネート、およびシランが挙げられる。
フローセルデバイスの内部表面上のポリマー層または他の化学層の数は、１～約１０までの範囲であり得、または１０より大きくてもよい。いくつかの例では、層の数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０である。いくつかの例では、層の数は、最大で１０、最大で９、最大で８、最大で７、最大で６、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、または最大で１であってもよい。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、層の数は約２～約４に及び得る。いくつかの例では、１つ以上層はすべて同じ材料を含む場合がある。いくつかの例では、各層は異なる材料を含んでもよい。いくつかの例では、複数の層は複数の材料を含んでもよい。
多重層の表面の１つ以上層は、分枝状ポリマーを含んでも、線状であってもよい。適切な分枝状ポリマーの例は、限定されないが、分岐ＰＥＧ、分岐ポリ（ビニルアルコール）（分岐ＰＶＡ）、分岐ポリ（ビニルピリジン）、分岐ポリ（ビニルピロリドン）（分岐ＰＶＰ）、分岐ポリ（アクリル酸）（分岐ＰＡＡ）、分岐ポリアクリルアミド、分岐ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（分岐ＰＮＩＰＡＭ）、分岐ポリ（メタクリル酸メチル）（分岐ＰＭＡ）、分岐ポリ（２－ヒドロキシルエチルメタクリレート（分岐ＰＨＥＭＡ）、分岐ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（分岐ＰＯＥＧＭＡ）、分岐ポリグルタミン酸（分岐ＰＧＡ）、分岐ポリリジン、分岐ポリグルコシド、およびデキストラン、を含む。
いくつかの例では、本明細書に開示される多重層の表面のうちのいずれかの１つ以上層を作るために使用された分枝状ポリマーは、少なくとも４つの分岐、少なくとも５つの分岐、少なくとも６つの分岐、少なくとも７つの分岐、少なくとも８つの分岐、少なくとも９つの分岐、少なくとも１０の分岐、少なくとも１２の分岐、少なくとも１４の分岐、少なくとも１６の分岐、少なくとも１８の分岐、少なくとも２０の分岐、少なくとも２２の分岐、少なくとも２４の分岐、少なくとも２６の分岐、少なくとも２８の分岐、少なくとも３０の分岐、少なくとも３２の分岐、少なくとも３４の分岐、少なくとも３６の分岐、少なくとも３８の分岐、少なくとも４０の分岐、を含む。分子は、しばしば「２の累乗」数の分岐、２、４、８、１６、３２、６４、または１２８の分岐を持っている。
いくつかの例では、１つ以上の層の堆積に続く、表面から遠位の、結果的に生じた官能的な末端基、例えば、ポリマー層は、限定されないが、ビオチン、メトキシエーテル、カルボキシレート、アミン、ＮＨＳエステル、マレイミド、および、ｂｉｓ－シランを含み得る。
明細書に開示される多重層の表面のうちのいずれかの１つ以上の層を作るために使用される線状、分岐、または多分岐ポリマーは、少なくとも５００ダルトン、少なくとも１，０００ダルトン、少なくとも１，５００ダルトン、少なくとも２，０００ダルトン、少なくとも２，５００ダルトン、少なくとも３，０００ダルトン、少なくとも３，５００ダルトン、少なくとも４，０００ダルトン、少なくとも４，５００ダルトン、少なくとも５，０００ダルトン、少なくとも７，５００ダルトン、少なくとも１０，０００ダルトン、少なくとも１２，５００ダルトン、少なくとも１５，０００ダルトン、少なくとも１７，５００ダルトン、少なくとも２０，０００ダルトン、少なくとも２５，０００ダルトン、少なくとも３０，０００のダルトン、少なくとも３５，０００ダルトン、少なくとも４０，０００ダルトン、少なくとも４５，０００ダルトン、または少なくとも５０，０００ダルトンの分子量を有し得る。いくつかの例では、明細書に開示される多重層の表面のうちのいずれかの１つ以上の層を作るために使用される線状、分岐、または多分岐ポリマーは、最大で５０，０００ダルトン、最大で４５，０００ダルトン、最大で４０，０００ダルトン、最大で３５，０００ダルトン、最大で３０，０００ダルトン、最大で２５，０００ダルトン、最大で２０，０００ダルトン、最大で１７，５００ダルトン、最大で１５，０００ダルトン、最大で１２，５００ダルトン、最大で１０，０００ダルトン、最大で７，５００ダルトン、最大で５，０００ダルトン、最大で４，５００ダルトン、最大で４，０００ダルトン、最大で３，５００ダルトン、最大で３，０００ダルトン、最大で２，５００ダルトン、最大で２，０００ダルトン、最大で１，５００ダルトン、最大で１，０００ダルトン、または、最大で５００ダルトン、の分子量を有し得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、明細書に開示される多重層の表面のうちのいずれかの１つ以上の層を作るために使用される線状、分岐、または多分岐ポリマーは、約１，５００ダルトン～約２０，０００ダルトンに及び得る。当業者であれば、本明細書に開示されるいずれかの多重層の表面のうちの１つ以上の層を作るために使用される線状、分岐状、または多分岐状のポリマーの分子量は、この範囲内の任意の値、例えば、約１，２６０ダルトンを有してもよいことを認識するであろう。
いくつかの例では、２つ以上の層が、互いに共有結合でカップリングされるか、または内部的に架橋されて、結果として生じる表面の安定性を改善し得る。いくつかの例では、例えば、多重層の表面の少なくとも１つの層は、分枝状ポリマーを含み、堆積される層の分岐状ポリマー分子と直前の層の分子との間における共有結合の数は、分子あたり約１の共有結合から分子あたり約３２の共有結合の範囲にあり得る。いくつかの例では、新しい層の分岐状ポリマー分子と直前の層の分子の間の共有結合の数は、分子あたり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８、少なくとも３０、あるいは少なくとも３２、または３２を超える。いくつかの例では、新しい層の分岐状ポリマー分子と直前の層の分子との間の共有結合の数は、最大で３２、最大で３０、最大で２８、最大で２６、最大で２４、最大で２２、最大で２０、最大で１８、最大で１６、最大で１４、最大で１２、最大で１０、最大で９、最大で８、最大で７、最大で６、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、または最大で１であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、新しい層の分岐状ポリマー分子と直前の層の分子との間の共有結合の数は、約４～約１６までに及び得る。当業者であれば、新しい層の分岐状ポリマー分子と直前の層の分子との間の共有結合の数がこの範囲の中のいかなる値を有していてもよい、例えば、いくつかの例では、約１１、また別の例では、約４．６の平均数であり得ることを認識するであろう。
フローセルデバイスの内部表面に材料層をカップリングさせた後に残るいずれの反応性官能基も、高収率のカップリング化学を用いて低分子の不活性分子をカップリングさせることにより随意にブロックされ得る。例えば、新しい材料層を直前の材料層に付着させるためにアミンカップリング化学を使用する場合、任意のアミン残基は、その後、グリシンなどの低級アミノ酸とのカップリングにより、アセチル化または不活性化され得る。
結合部位の表面密度、例えば、オリゴヌクレオチドのアダプタ／プライマーの表面密度をスケールアップするために、および、親水性や両性の表面にさらなる寸法を加えるために、ＰＥＧおよびその他の親水性ポリマーを多重層にコーティングした基板が開発されてきた。以下に記載するポリマー／コポリマー材料を含むが、これらに限定されない親水性および両性の表面積層アプローチを使用することで、表面上のアダプタ／プライマーの充填密度を大幅に高めることが可能である。単一分子の配列決定の応用に関して試験され及び報告されている従来のＰＥＧコーティングアプローチは、単相プライマー蒸着を使用するが、核酸増幅の応用では高いコピー数を得ることができない。本明細書で記載されるように、「積層」は、２つ以上の高度に架橋された層を含む表面が順次構築できるように、任意の適合性のあるポリマーまたはモノマーのサブユニットを用いて、従来の架橋アプローチを使用して達成することができる。適切なポリマーの例としては、限定されないが、ストレプトアビジン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、デキストラン、ポリリジン、およびポリリジンとＰＥＧのコポリマーが挙げられる。いくつかの例では、異なる層は、限定されないが、ビオチン－ストレプトアビジン結合、アジド－アルキンクリック反応、アミン－ＮＨＳエステル反応、チオール－マレイミド反応、および正電荷ポリマーと負電荷ポリマーとの間のイオン相互作用を含む様々なコンジュゲーション反応のいずれかを介して互いに架橋可能である。いくつかの例では、高アダプタ／プライマー密度材料を溶液中で構築し、その後、複数の工程で表面に積層させ得る。
典型的なＰＥＧ多重層は、ＰＥＧアミン－ＡＰＴＥＳにＰＥＧ（８アーム、１６アーム、８アーム）を含む。８ｕＭのプライマーにさらされたＰＥＧ－アミン－ＡＰＴＥＳ上の３層マルチアームＰＥＧ（８アーム，１６アーム，８アーム）と（８アーム，６４アーム，８アーム）について、および、１６アームと６４アームに置き換えて星型ＰＥＧ－アミンを用いた３層マルチアームＰＥＧ（８アーム、８アーム、８アーム）について、同様の濃度が観測された。また、第１、第２、第３のＰＥＧ層を有するＰＥＧ多重層も考慮に入れられる。
いくつかの例では、フローセルデバイスの内部表面上で結果として生じた結合部位の表面密度、例えばオリゴヌクレオチドアダプター／プライマー表面密度は、μｍ２あたり約１００プライマー分子からμｍ２あたり約１，０００，０００プライマー分子までに及び得る。いくつかの例では、結合部位の表面密度は、μｍ２あたり、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも３，５００、少なくとも４，０００、少なくとも４，５００、少なくとも５，０００、少なくとも５，５００、少なくとも６，０００、少なくとも６，５００、少なくとも７，０００、少なくとも７，５００、少なくとも８，０００、少なくとも８，５００、少なくとも９，０００、少なくとも９，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも３５，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも４５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも５５，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも６５，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも７５，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも８５，０００、少なくとも９０，０００、少なくとも９５，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１５０，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも３５０，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも４５０，０００、少なくとも５５，０００、少なくとも６００，０００、少なくとも６５０，０００、少なくとも７００，０００、少なくとも７５０，０００、少なくとも８００，０００、少なくとも８５０，０００、少なくとも９００，０００、少なくとも９５０，０００、または、少なくとも１，０００，０００分子であり得る。いくつかの例では、結合部位の表面密度は、μｍ２あたりの分子が、最大で１，０００，０００、最大で９５０，０００、最大で９００，０００、最大で８５０，０００、最大で８００，０００、最大で７５０，０００、最大で７００，０００、最大で６５０，０００、最大で６００，０００、最大で５５０，０００、最大で５００，０００、最大で４５０，０００、最大で４００，０００、最大で３５０，０００、最大で３００，０００、最大で２５０，０００、最大で２００，０００、最大で１５０，０００、最大で１００，０００、最大で９５，０００、最大で９０，０００、最大で８５，０００、最大で８０，０００、最大で７５，０００、最大で７０，０００、最大で６５，０００、最大で６０，０００、最大で５５，０００、最大で５０，０００、最大で４５，０００、最大で４０，０００、最大で３５，０００、最大で３０，０００、最大で２５，０００、最大で２０，０００、最大で１５，０００、最大で１０，０００、最大で９，５００、最大で９，０００、最大で８，５００、最大で８，０００、最大で７，５００、最大で７，０００、最大で６，５００、最大で６，０００、最大で５，５００、最大で５，０００、最大で４，５００、最大で４，０００、最大で３，５００、最大で３，０００、最大で２，５００、最大で２，０００、最大で１，５００、最大で１，０００、最大で９００、最大で８００、最大で７００、最大で６００、最大で５００、最大で４００、最大で３００、最大で２００分子、またはμｍ２あたり最大で１００分子であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、結合部位の表面密度はμｍ２あたり約１０，０００分子～約１００，０００分子の範囲であってもよい。当業者であれば、結合部位の表面密度が、例えば、いくつかの例ではμｍ２あたり約３，８００分子、また他の例ではμｍ２あたり約４５５，０００分子というように、この範囲内のどんな値を有してもよいことを認識するであろう。いくつかの例では、核酸配列決定の応用について以下でさらに説明されるとおり、フローセルデバイスの内部表面にテザーされたアダプタまたはプライマーの配列に初めにハイブリダイズされる鋳型ライブラリ核酸配列（例えば、試料ＤＮＡ分子）の表面密度は、結合部位の表面密度について示されるもの以下であり得る。いくつかの例では、また以下でさらに説明されるとおり、フローセルデバイスの内部表面上のアダプタまたはプライマー配列にハイブリダイズされる、クローン的に増幅される鋳型ライブラリ核酸配列の表面密度は、テザーされたオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマーの表面密度について示される範囲と同じ範囲にわたっても、異なる範囲にわたってもよい。
フローセルデバイスの内部表面上に結合部位の局所的な表面密度は、面を横断する密度における偏差を排除せず、その結果、表面が、例えば、結合部位の密度として５００，０００／ｕｍ２を有する領域を含んでいるが、その一方で実質的に異なる局所的表面密度を有する第２の領域を少なくとも含むような場合がある。
いくつかの例では、捕捉プローブ、例えば、様々な塩基配列と塩基修飾（または他の生体分子、例えば、酵素、または抗体）を有するオリゴヌクレオチドプライマー、が、結果として生じる表面の様々な表面密度にある１つ以上の層にテザーされ得る。いくつかの例では、例えば、官能基表面密度、およびカップリングに使用される捕捉プローブの濃度の両方は、ある捕捉プローブの表面密度の範囲を標的とするように変化してもよい。さらに、捕捉プローブの表面密度は、当該表面へのカップリングのための反応性官能基と同じ反応性官能基を有する他の「不活性な」分子で捕捉プローブを希釈することにより制御され得る。例えば、アミンで標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、ＮＨＳエステルのコーティング面との反応において、最終のプライマー密度を減少させるために、アミンで標識されたポリエチレングリコールで希釈され得る。オリゴヌクレオチドアダプター／プライマーの場合、ハイブリダイゼーション領域と表面付着官能基との間のリンカーの長さが様々なプローブ配列は、また、面密度を変化させるために適用され得る。適切なリンカーの例として、プライマーの５’末端のポリＴ鎖とポリＡ鎖（例えば、０～２０塩基）、ＰＥＧリンカー（例えば、３～２０のモノマー単位）、および、炭素鎖（例えば、Ｃ６、Ｃ１２、Ｃ１８など）が挙げられる。捕捉プローブ表面密度を測定または推定するために、蛍光性に標識された捕捉プローブが当該表面にテザーされ、そして、蛍光の読取り値が既知の濃度のフルオロフォアを含む校正液の値と比較される場合がある。
いくつかの例では、本開示の支持表面、例えば、フローセルデバイスの内部表面の親水性の程度（あるいは水溶液との「水和性」）は、水の小さな液滴が表面に配置され、表面と液滴との接触角が、例えば、光学的張力計を使用して測定される、水接触角度の測定によって評価され得る。いくつかの例では、静止接点角が求められ得る。いくつかの例では、前進または後退接触角度が求められ得る。いくつかの例では、本明細書に開示される親水性で低結合性の支持表面の水接触角は、約０度～約５０度に及び得る。いくつかの例では、本明細書に開示される親水性で低結合性の支持表面の水接触角は、５０度以下、４５度以下、４０度以下、３５度以下、３０度以下、２５度以下、２０度以下、１８度以下、１６度以下、１４度以下、１２度以下、１０度以下、８度以下、６度以下、４度以下、２度以下、または、１度以下であり得る。多くの場合、接触角はこの範囲内の任意の値以下、例えば、４０度以下であり得る。当業者は、本開示の所与の親水性・低結合性支持表面が、この範囲内のどこかの値、例えば、２７度、を有する水接触角を示し得ることを理解するであろう。いくつかの例では、本開示の低非特異的結合表面は、４５度未満の水接触角を有し得る。いくつかの例では、本開示の低非特異的結合表面は、３５度未満の水接触角を有し得る。
留意されるように、本開示の親水性コーティングされたフローセルデバイスの内部表面は、タンパク質、核酸、フルオロフォア、および、生物学的・生化学アッセイ法の他の成分との非特異的結合の低減を示す。所与の支持表面、例えば、フローセルデバイスの内部表面、によって示される非特異的結合の程度は、定性的または定量的のどちらかで評価され得る。例えば、いくつか例では、標準化された条件セット下での、蛍光染料（例えば、シアニン色素３（Ｃｙ３）、シアニン色素５（Ｃｙ５）など）、蛍光で標識されたヌクレオチド、蛍光で標識されたオリゴヌクレオチド、および／または、蛍光で標識されたタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）への表面の曝露、その後に続く規定されたすすぎプロトコル、および、蛍光撮像は、様々な表面調合物を含む支持体における非特異的結合の比較のための定性的ツールとして使用され得る。いくつかの例では、蛍光染料への表面の曝露、蛍光で標識されたヌクレオチド、蛍光で標識されたオリゴヌクレオチド、および／または、疾病の標準化されたセットの下の蛍光で標識されたタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）、後に続く規定されたすすぎプロトコル、および、蛍光撮像は、様々な表面調合物を含む支持体における非特異的結合の比較のための定量的ツールとして使用されてもよく、但しここで、蛍光撮像は、蛍光信号が支持表面上のフルオロフォアの数と線形的に関連する（または予測可能に関連する）という条件下で（例えば、フルオロフォアの信号飽和および／または自己失活が起こっていない条件下で）実行されることを確かなものにするためのケアが行なわれ、かつ適切な校正標準が使用されることとする。いくつかの例では、当業者に既知の他の技術、例えば、放射性同位元素の標識と計数方法は、本開示の様々な支持表面調合物によって非特異的結合が発生する程度を定量的に評価するために使用されてもよい。
いくつかの例では、本開示の低非特異性結合の支持表面によって示される非特異的結合の程度は、表面を標識されたタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ストレプトアビジン、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヘリカーゼ、単鎖の結合タンパク質（ＳＳＢ）など、またはその任意の組み合わせ）、標識されたヌクレオチド、標識されたオリゴヌクレオチド、などと接触させるための標準化されたプロトコルを使用して、インキュベーションおよびすすぎ条件の標準化されたセットのもとで、評価される場合があり、その後、表面上に残る標識の量の検出、およびそこから結果的に得られる信号の適切な校正標準との比較が、続いて行われ得る。いくつかの例では、標識は蛍光標識を含み得る。いくつかの例では、標識は放射性同位元素を含み得る。いくつかの例では、標識は、当業者に既知の他のあらゆる検知可能な標識を含み得る。いくつかの例では、所与の支持表面調合物によって示される非特異的結合の程度は、このように、単位面積あたりの非特異的に結合されたタンパク質分子（あるいは他の分子）の数の点から評価され得る。いくつかの例では、本開示の低非特異的結合支持体は、非特異的たんぱく質あるいは他の指定された分子、例えば、μｍ２あたり０．００１未満の分子、μｍ２あたり０．０１未満の分子、μｍ２あたり０．１未満の分子、μｍ２あたり０．２５未満の分子、μｍ２あたり０．５未満の分子、μｍ２あたり１未満の分子、μｍ２あたり１０未満の分子、μｍ２あたり１００未満の分子、または、μｍ２あたり１，０００未満の分子、のシアニン色素３（Ｃｙ３）の非特異的結合を示し得る。当業者は、本開示の所与の支持表面が、この範囲内のどこかに属する値の非特異的結合、例えば、μｍ２あたり８６未満の分子を示し得ることを理解する。例えば、本明細書に開示されるいくつかの修飾された表面は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中の、Ｃｙ３で標識されたストレプトアビジン （ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ）の１ｕＭ溶液と１５分間接触され、続いて脱イオン水で３回すすがれた後、０．５分子／μｍ２未満の非特異的たんぱく質結合を示す。本明細書に開示されるいくつかの修飾された表面は、μｍ２あたり０．２５分子未満のＣｙ３色素分子の非特異的結合を示す。独立した非特異的結合アッセイにおいて、１μＭの標識Ｃｙ３ ＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１ｕＭのＣｙ５ ＳＡ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０ｕＭのアミノアリル－ｄＵＴＰ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１０ｕＭのアミノアリル－ｄＵＴＰ－ＡＴＴＯ－Ｒｈｏ１１（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１０ｕＭのアミノアリル－ｄＵＴＰ－ＡＴＴＯ－Ｒｈｏ１１（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１０ｕＭの７－プロパルギルアミノ－７－ｄｅａｚａ－ｄＧＴＰ－Ｃｙ５（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および、１０のｕＭ ７－プロパルギルアミノ－７－ｄｅａｚａ－ｄＧＴＰ－Ｃｙ３（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を３８４ウェルプレート・フォーマット中で低非特異的結合の基板上で３７℃にて１５分間、インキュベートした。各ウェルを５０ ｕｌの脱イオン化したＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ Ｆｒｅｅ水で２～３ 回、および、２５ｍＭのＡＣＥＳ緩衝剤ｐＨ ７．４で２～３回すすいだ。３８４ウェルプレートは、ＧＥ Ｔｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）機器上で撮像され、前記機器は、製造業者によって規定されたように８００のＰＭＴゲイン設定と５０～１００μｍの分解能にて、Ｃｙ３、ＡＦ５５５、またはＣｙ５フィルタ・セット（実施された色素試験による）を使用した。より高解像度の撮像のために、画像は、全内部反射率蛍光（ＴＩＲＦ）対物鏡（２０ｘ０．７５ＮＡまたは１００Ｘ１．５ＮＡ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ｓＣＭＯＳ Ａｎｄｏｒカメラ（Ｚｙｌａ ４．２）を備えたＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐ．， Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ， ＰＡ）上で収集された。ダイクロイックミラー、例えば、４０５、４８８、５３２、または、６３３ｎｍのダイクロイック・リフレクタ／ビームスプリッタ、を、Ｓｅｍｒｏｃｋ（ＩＤＥＸ Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＬＬＣ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から購入し、および、バンドパスフィルタは、適切な励起波長に一致する５３２ＬＰまたは６４５のＬＰを選択した。本明細書に開示されるいくつかの修飾表面は、μｍ２あたり０．２５分子未満の色素分子の非特異的結合を示す。
いくつかの例では、本明細書に開示されるコーティングを施したフローセルデバイス表面は、Ｃｙ３などのフルオロフォアの特異的結合の非特異的結合に対する比率として、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、あるいは１００を超える比率、またはこれらの範囲にわたるどんな中間値も示し得る。
いくつかの例では、１つ以上の表面修飾および／またはポリマー層は、化学蒸着法（ＣＶＤ）などの技術を使用して、フローセルデバイスの内部表面に適用され得る。いくつかの例では、１つの表面修飾および／またはポリマー層は、意図された用途に使用する前に、１つ以上の適切な化学的カップリングまたはコーティング試薬をキャピラリーまたは流路に流すことによってフローセルデバイスの内部表面に適用することができる。いくつかの例では、１つ以上のコーティング試薬は、フローセルデバイスの内部表面の動的コーティングを提供するために、例えば、核酸ハイブリダイゼーション、増幅反応、および／または配列決定反応緩衝液に使用される緩衝液に添加されてもよい。
いくつかの例では、化学修飾層は、基板または支持構造の表面を横断して一様に適用され得る。あるいは、基板または支持構造の表面は、化学修飾層が基板の１つ以上の離散した領域に留まるように非一様に分配されるか又はパターン化され得る。例えば、基板表面は、写真石版の技術を使用して表面上の化学修飾された領域の規則的なアレイまたはランダムなパターンを作り出して、パターン化される場合がある。替わりにあるいは組み合わせて、基板表面は、例えば、接触印刷および／またはインクジェット印刷技術を使用して、パターン化される場合がある。いくつかの例では、化学修飾された分離した領域の規則的なアレイまたは無作為のパターンは、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、あるいは１０，０００、またはそれ以上の分離した領域を含んでもよく、または、この範囲の任意の中間数の分離した領域を含んでもよい。
いくつかの例では、開示される低非特異的結合表面の蛍光画像は、例えば、ハイブリダイズあるいはクローン的に増幅された核酸分子のクラスタ（例えば、フルオロフォアで直接あるいは間接的に標識された「分離した領域」）を作るために核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅の応用において使用される時、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、またはそれ以上のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示すが、この時、核酸分子はＣｙ３で標識され、画像は２０ｘ、０．７５ＮＡ対物鏡、５３２ｎｍ光源、５３２ｎｍのロングパス励起に適合または最適化されたバンドパスおよびダイクロイックミラーフィルタ、Ｃｙ３蛍光エミッションフィルタ、Ｓｅｍｒｏｃｋ５３２ｎｍダイクロイックリフレクタ、ならびに、カメラ（Ａｎｄｏｒ ｓＣＭＯＳ，Ｚｙｌａ ４．２）を装備したオリンパスＩＸ８３倒立型蛍光顕微鏡を使用して取得され、ここで、励起光強度は信号飽和を回避するように調節され、および、画像が取得される間、表面は緩衝剤（例えば、２５ｍＭ ＡＣＥＳ，ｐＨ ７．４緩衝剤）に浸される。本明細書で使用されるように、コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は次のように計算される：
ＣＮＲ＝（Ｓ－Ｂ）／ノイズ
式中、Ｓ＝前景信号（例えば、試料支持表面上の標識された核酸コロニーあるいはクラスタから生じる画像において測定される蛍光信号）、Ｂ＝背景信号（ここで、Ｂ＝Ｂｉｎｔｅｒ＋ Ｂｉｎｔｒａ）、Ｂｉｎｔｅｒ＝標識された核酸コロニーあるいはクラスタの間にある試料支持表面上の位置で測定された背景信号、Ｂｉｎｔｒａ＝核酸コロニーあるいはクラスタの位置で測定された背景信号（例えば、試料支持表面を標識された非相補鎖のオリゴヌクレオチドと接触させて最終的な蛍光を測定することによって決定される）、およびノイズ＝信号ノイズ、とする。配列決定表面の画像のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は、例えば、核酸増幅特異性と支持体上の非特異的結合の評価において重要な指標を提供する。信号対ノイズ比（ＳＮＲ）が信号品質全体のベンチマークであるとしばしば考えられているが、急速な画像キャプチャを必要とする撮像の応用（例えば、サイクルタイムが最小化されなければならない核酸配列決定の応用）において、改善されたＣＮＲは、信号品質についてのベンチマークとしてＳＮＲに対する著しい利点を提供し得ることが示され得る。
いくつかの例では、ポリマーコーティングされた試料支持体構造（例えば、開示される親水性ポリマーコーティングを含むフローセルデバイスの内部表面）は、溶剤への反復的な曝露、温度変化、ｐＨ変化、または長期保管に対する改善された安定性を示し得る。
流体工学システムと流体流動制御モジュール：いくつかの実装では、開示される撮像および／または分析システムは、システムに連結された１台以上のフローセルデバイスまたはフローセル・カートリッジ（例えば、単一キャピラリーのフローセルデバイスまたはマイクロ流体チャネルフローセルデバイス）に試料または試薬を送達するための流体流動制御能力を提供する場合がある。試薬と緩衝剤は、配管と弁マニホールドによってフローセル入口に連結されるボトル、試薬および緩衝剤カートリッジ、または他の適切な容器に保存され得る。開示されるシステムは、また、キャピラリーフローセルデバイスまたはキャピラリーフローセル・カートリッジの下流側への流体を収集するために、ボトル、カートリッジ、または他の適切な容器の形で、処理済み試料と廃棄物用のリザーバを含んでもよい。いくつかの実施形態では、流体流動（あるいは「流体工学」）制御モジュールは、様々なソース、例えば、機器内に位置する試料あるいは試薬リザーバ、またはボトルと、中央領域（例えば、キャピラリーフローセルまたはマイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの中の大きな流体チャンバなどの、大きな流体チャンバ）への入口との間において、プログラム可能なフローの切り替えを提供し得る。いくつかの例では、流体流動制御モジュールは、中央領域（例えば、キャピラリーフローセルまたはマイクロ流体デバイス）からの出口と、様々な収集ポイント、例えば、システムに接続された処理済試料リザーバ、廃棄物リザーバなどとの間において、プログラム可能なフローの切換を提供し得る。いくつかの例では、試料、試薬、および／または緩衝剤は、フローセル・カートリッジまたはマイクロ流体カートリッジ自体へ統合されるリザーバ内に保存され得る。いくつかの例では、処理済試料、使い切った試薬、および／または使用済緩衝剤は、フローセル・カートリッジまたはマイクロ流体デバイスカートリッジ自体へ統合されるリザーバ内に保存され得る。
いくつかの実装では、１つ以上の流体流動制御モジュールは、１つ以上のキャピラリーフローセル、キャピラリーフローセル・カートリッジ、マイクロ流体デバイス、マイクロ流体カートリッジ、またはその任意の組み合わせへの流体の送達を制御するように構成され得る。いくつかの例では、１つ以上の流体工学制御デバイスは、１つ以上の流体あるいは試薬の体積流量、１つ以上の流体または試薬の直線的な流速、１つ以上の流体または試薬の混合比、またはそれらの任意の組み合わせを制御するように構成され得る。開示されるシステムにおける流体流動の制御は、典型的には、ポンプ（または他の流体作動機構）と弁（例えば、プログラム可能なポンプと弁）を使用して行われることになる。適切なポンプの例として、限定されないが、シリンジポンプ、プログラム可能なシリンジポンプ、蠕動ポンプ、ダイアフラムポンプなどが挙げられる。適切な弁の例として、限定されないが、チェック弁、電気機械式の２ウェイまたは３ウェイ弁、空気圧式の２ウェイおよび３ウェイ弁などが挙げられる。いくつかの例では、システムを通る流体流動は、試薬および緩衝剤の容器の１つ以上の入口、またはフローセル・カートリッジ（例えば、キャピラリーフローセルまたはマイクロ流体カートリッジ）の中に組み込まれた入口に正の空気圧を適用することによって制御され得る。
いくつかの実施形態では、システムを通る流体流動は、廃棄物リザーバの１つ以上の出口、あるいはフローセル・カートリッジ（例えば、キャピラリーフローセルまたはマイクロ流体カートリッジ）へ組み込まれた１つ以上の出口に真空吸引することによって制御され得る。いくつかの例では、流体流動制御の様々なモードは、アッセイまたは分析の手順における様々な点で利用され、例えば、順流（所与のキャピラリーフローセルデバイスの入口と出口に対して相対的に）、逆流、振動流あるいは脈動流、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの応用では、振動流あるいは拍動流は、例えば、１つ以上のフローセルデバイスまたはフローセル・カートリッジ（例えば、キャピラリーフローセルデバイスまたはカートリッジ、およびマイクロ流体デバイスまたはカートリッジ）内の流体の完全で効率的な交換を促進するために、アッセイ洗浄／すすぎ工程の間に、適用され得る。
同様に、いくつかの場合では、フローセルデバイス内の異なる場所、または、アッセイあるいは分析プロセスのワークフローの異なるポイントで、異なる流体流動量が利用される場合があり、例えば、いくつかの例では、体積流量が－１００ｍｌ／秒から＋１００ｍｌ／ｓｅｃの範囲にあり得る。いくつかの実施形態では、体積流量の絶対値は、少なくとも０．００１ｍｌ／秒、少なくとも０．０１ｍｌ／秒、少なくとも０．１ｍｌ／秒、少なくとも１ｍｌ／秒、少なくとも１０ｍｌ／秒、あるいは少なくとも１００ｍｌ／秒であり得る。いくつかの実施形態では、体積流量の絶対値は、最大で１００ｍｌ／秒、最大で１０ｍｌ／秒、最大で１ｍｌ／秒、最大で０．１ｍｌ／秒、最大で０．０１ｍｌ／秒、または、最大で０．００１ｍｌ／秒であり得る。フローセルデバイスを用いる所与の位置、あるいは所与の時点での体積流量は、この範囲内のどんな値も持ち得、例えば２．５ｍｌ／秒の前進流量、－０．０５ｍｌ／秒の逆流量、あるいは０ｍｌ／秒（つまり、止められた流れ）であり得る。
いくつかの実装では、流体工学システムは、例えば、ゲノム解析の応用の実行に必要な主要な試薬（例えば、高価な試薬）の消費を最小限に抑えるように設計され得る。例えば、いくつかの実装では、開示される流体工学システムは、第１の試薬または溶液を収容する第１のリザーバ、第２の試薬または溶液を収容する第２のリザーバ、および中央領域、例えば、中央キャピラリーフローセルまたは中央マイクロ流体デバイス、を含んでもよく、ここで、第１のリザーバの出口から中央キャピラリーフローセルまたは中央マイクロ流体デバイスの入口まで単位時間あたりに流れる第１の試薬または溶液の体積は、第２のリザーバの出口から中央領域の入口まで単位時間あたりに流れる第２の試薬または溶液の体積より少なくなるように、第１のリザーバからの出口および第２のリザーバからの出口は、少なくとも１つの弁を通って中央キャピラリーフローセルまたは中央マイクロ流体デバイスの入口に流体工学的に連結される。いくつかの実装では、第１のリザーバーと第２のリザーバーは、キャピラリーフローセル・カートリッジまたはマイクロ流体カートリッジへ統合されることがある。いくつかの例では、少なくとも１つの弁は、また、キャピラリーフローセル・カートリッジまたはマイクロ流体カートリッジへ統合される場合がある。
いくつかの例では、第１のリザーバーは、第１の弁を介して中央のキャピラリーフローセルあるいはマイクロ流体デバイスに流体工学的に連結され、および、第２のリザーバーは、第２の弁を介して中央のキャピラリーフローセルあるいはマイクロ流体デバイスに流体工学的に連結される。いくつかの例では、第１および／または第２の弁は、例えば、ダイアフラム弁、ピンチ弁、ゲート弁、または他の適切な弁であり得る。いくつかの例では、第１のリザーバは、第１の試薬溶液の送達に関するデッドボリュームを削減するために、中央のキャピラリーフローセルあるいはマイクロ流体デバイスの入口のごく近傍に配置される。いくつかの例では、第１のリザーバーは、中央のキャピラリーフローセルあるいは第２のリザーバーであるマイクロ流体デバイスの入口のさらに近傍に配置される。いくつかの例では、第１のリザーバは、複数の「第２の」試薬（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上の「第２の」試薬）を複数の「第２の」リザーバー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上の「第２の」リザーバー）から送達する場合に比べ、第１の試薬の送達に関するデッドボリュームを削減するように、第２の弁のごく近傍に配置される。
上に記載された第１と第２のリザーバーは、同じまたは異なる試薬あるいは溶液を収容するために使用され得る。いくつかの例では、第１のリザーバーに収容される第１の試薬は、第２のリザーバーに収容される第２の試薬とは異なり、および、第２の試薬は、中央の中央キャピラリーフローセルまたは中央マイクロ流体デバイスにおいて生じる複数の反応によって共通に使用される少なくとも１つの試薬を含む。いくつかの例では、例えば、中央キャピラリーフローセルあるいは中央マイクロ流体デバイス内の核酸配列決定化学を実施するために構成される流体工学システムでは、第１の試薬は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログからなる群から選択される少なくとも１つの試薬を含む。いくつかの例では、第２の試薬は低コストの試薬、例えば溶剤、を含む。
いくつかの例では、１つ以上流体チャネルあるいは流体チャンバを含む中央領域、例えば中央のキャピラリーフローセル・カートリッジあるいはマイクロ流体デバイス、の内部容積は、実施される特定の応用、例えば、核酸配列決定、に基づいて、調節され得る。いくつかの実施形態では、中央領域は、真核生物ゲノムを配列決定するのに適した内部容積を含む。いくつかの実施形態では、中央領域は、原核生物ゲノムを配列決定するのに適した内部容積を含む。いくつかの実施形態では、中央領域はウイルスゲノムを配列決定するのに適した内部容積を含む。いくつかの実施形態では、中央領域は、トランスクリプトームを配列決定するのに適した内部容積を含む。例えば、いくつかの実施形態では、中央領域の内部容積は、０．０５μｌ未満の、０．０５μｌと０．１μｌとの間の、０．０５μｌと０．２μｌとの間の、０．０５μｌと０．５μｌとの間の、０．０５μｌと０．８μｌとの間の、０．０５μｌと１μｌとの間の、０．０５μｌと１．２μｌとの間の、０．０５μｌと１．５μｌとの間の、０．１μｌと１．５μｌとの間の、０．２μｌと１．５μｌとの間の、０．５μｌと１．５μｌとの間の、０．８μｌと１．５μｌとの間の、１μｌと１．５μｌとの間の、１．２μｌと１．５μｌとの間の、あるいは、１．５μｌを超える、または、前掲のいずれか２つで定義される範囲の、容積を含み得る。いくつかの実施形態では、中央領域の内部容積は、０．５μｌ未満の、０．５μｌと１μｌとの間の、０．５μｌと２μｌとの間の、０．５μｌと５μｌとの間の、０．５μｌと８μｌとの間の、０．５μｌと１０μｌとの間の、０．５μｌと１２μｌとの間の、０．５μｌと１５μｌとの間の、１μｌと１５μｌとの間の、２μｌと１５μｌとの間の、５μｌと１５μｌとの間の、８μｌと１５μｌとの間の、１０μｌと１５μｌとの間の、１２μｌと１５μｌとの間の、または、１５μｌを超える、または、前掲のいずれか２つで定義される範囲の、容積を含み得る。いくつかの実施形態では、中央領域の内部容積は、５μｌ未満の、５μｌと１０μｌとの間の、５μｌと２０μｌとの間の、５μｌと５００μｌとの間の、５μｌと８０μｌとの間の、５μｌと１００μｌとの間の、５μｌと１２０μｌとの間の、５μｌと１５０μｌとの間の、１０μｌと１５０μｌとの間の、２０μｌと１５０μｌとの間の、５０μｌと１５０μｌとの間の、８０μｌと１５０μｌとの間の、１００μｌと１５０μｌとの間の、１２０μｌと１５０μｌとの間の、あるいは、１５０μｌを超える、または、前掲のいずれか２つで定義される範囲の、容積を含み得る。いくつかの実施形態では、中央領域の内部容積は、０．０５μｌ未満の、５０μｌと１００μｌとの間の、５０μｌと２００μｌとの間の、５０μｌと５００μｌとの間の、５０μｌと８００μｌとの間の、５０μｌと１０００μｌとの間の、５０μｌと１２００μｌとの間の、５０μｌと１５００μｌとの間の、１００μｌと１５００μｌとの間の、２００μｌと１５００μｌとの間の、５００μｌと１５００μｌとの間の、８００μｌと１５００μｌとの間の、１０００μｌと１５００μｌとの間の、１２００μｌと１５００μｌとの間の、あるいは、１５００％を超える、または、前掲のいずれか２つで定義される範囲の、容積を含み得る。いくつかの実施形態では、中央領域の内部容積は、５００μｌ未満の、５００μｌと１０００μｌとの間の、５００μｌと２０００μｌとの間の、５００μｌと５ｍｌとの間の、５００μｌと８ｍｌとの間の、５００μｌと１０ｍｌとの間の、５００μｌと１２ｍｌとの間の、５００μｌと１５ｍｌとの間の、１ｍｌと１５ｍｌとの間の、２ｍｌと１５ｍｌとの間の、５ｍｌと１５ｍｌとの間の、８ｍｌと１５ｍｌとの間の、１０ｍｌと１５ｍｌとの間の、１２ｍｌと１５ｍｌとの間の、あるいは、１５ｍｌを超える、または、前掲のいずれか２つで定義される範囲の、容積を含み得る。いくつかの実施形態では、中央領域の内部容積は、５ｍｌ未満の、５ｍｌと１０ｍｌとの間の、５ｍｌと２０ｍｌとの間の、５ｍｌと５０ｍｌとの間の、５ｍｌと８０ｍｌとの間の、５ｍｌと１００ｍｌとの間の、５ｍｌと１２０ｍｌとの間の、５ｍｌと１５０ｍｌとの間の、１０ｍｌと１５０ｍｌとの間の、２０ｍｌと１５０ｍｌとの間の、５０ｍｌと１５０ｍｌとの間の、８０ｍｌと１５０ｍｌとの間の、１００ｍｌと１５０ｍｌとの間の、１２０ｍｌと１５０ｍｌとの間の、あるいは、１５０ｍｌを超える、または、前掲のいずれか２つで定義される範囲の、容積を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムは、フローセルデバイスのアレイまたはコレクション、または、複数の分離したキャピラリー、マイクロ流体チャネル、流体チャネル、チャンバ、またはルーメン領域を含むシステムを含み、ここで、合わされた内部容積は、ここに開示される範囲内の容積であるか、前記範囲内の１つ以上の容積を含むか、または包含する。
いくつかの例では、第１の試薬を中央のキャピラリーフローセルまたはマイクロ流体デバイスに送達するための容積流量の、第２の試薬を中央のキャピラリーフローセルまたはマイクロ流体デバイスに送達するための容積流量に対する比率は、１：２０未満、１：１６未満、１：１２未満、１：１０未満、１：８未満、１：６未満、または、１：２未満、であり得る。いくつかの例では、第１の試薬を中央のキャピラリーフローセルまたはマイクロ流体デバイスに送達するための容積流量の、第２の試薬を中央のキャピラリーフローセルまたはマイクロ流体デバイスに送達するための容積流量に対する比率は、これらの値が及ぶ範囲のいかなる値も持ち得る（例えば、１：１５未満）。
留意されるように、本明細書に開示されるフローセルデバイスおよび／または流体工学システムは、特に、様々な配列決定化学工程で使用される高価な試薬について、例えば、他の配列決定デバイスおよびシステムで達成されたよりも、効率的な試薬の使用を達成するように構成され得る。いくつかの例では、第１の試薬は、第２の試薬よりも高価な試薬を含む。いくつかの例では、第１の試薬は、反応特異的な試薬を含み、および第２の試薬は、中央キャピラリーフローセルあるいは中央マイクロ流体デバイスの領域の中で実施されるすべての反応に共通の非特異的な試薬を含み、および、ここで、反応特異的な試薬は非特異的な試薬よりも高価である。いくつかの例では、本明細書に開示されるフローセルデバイスおよび／または流体システムの利用は、高価な試薬の消費の削減の点で利点をもたらし得る。
いくつかの例では、例えば、本明細書に開示されるフローセルデバイスおよび／または流体システムの利用は、例えば、現在市販で入手可能な核酸配列決定システムを運用する場合と比較して、試薬の消費において、結果として、少なくとも約５％、少なくとも約７．５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１２．５％、少なくとも約１５％、少なくとも約１７．５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２．５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、または、少なくとも５０％、の削減をもたらし得る。
図３１は、様々な流体流動制御部品に連結された単一のキャピラリーフローセルを含むシンプルな流体工学システムの非限定的な例を図示し、ここで単一のキャピラリーは、顕微鏡ステージ上に又は様々な撮像の応用で使用される特製の撮像機器に載置することについて、光学的に利用可能かつ適合性がある。複数の試薬リザーバが、単一のキャピラリーフローセルデバイスの入口端と流体的に連結され、ここで、いずれかの所与の時点においてキャピラリーを通る試薬は、ユーザーが試薬のフローのタイミングおよび持続時間を制御することを可能にするプログラム可能なロータリー弁によって制御される。この非限定的な例では、流体流動は、流体流動体積と流体流動速度の正確な制御およびタイミングを提供するプログラム可能なシリンジ・ポンプによって制御される。
図３２は、流体工学システムの非限定的な例を示し、該流体工学システムは、デッドボリュームを削減または最小化し、かつ特定の重要な試薬を保存するためにダイアフラム弁を統合されたキャピラリーフローセル・カートリッジを含む。カートリッジへの小型のダイアフラム弁の統合は、弁がキャピラリーの入口のごく近傍に位置決めされることを可能にし、それにより、デバイス内のデッドボリュームを削減または最小化し、および高価な試薬の消費を削減する。キャピラリーフローセル・カートリッジ内への弁および他の流体制御部品の統合は、また、より大きな流体流動制御の機能がカートリッジ設計の中へ組み入れられることを可能にする。
図３３は、顕微鏡機構と組み合わせて使用されるキャピラリーフローセル・カートリッジに基づく流体工学システムの非限定的な例を図示し、ここでカートリッジには、カートリッジ内のキャピラリーと接触して熱源／ヒートシンクとなる金属板などの温度制御部品に組み込まれるか、または貼り合わされる。顕微鏡機構は、照明システム（例えば、光源として、レーザー、ＬＥＤ、またはハロゲンランプなどを含む）対物レンズ、撮像システム（例えば、ＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラ）、および、光学系に対してカートリッジを動かすための並進運動ステージ、から成り、前記並進運動ステージは、ステージが動かされるにつれて、キャピラリーフローセルの異なる領域の、例えば、蛍光および／または明視野の、画像を取得することを可能にする。
温度制御モジュール：いくつかの実装では、開示されるシステムは、アッセイまたは分析の結果の正確さと再現性を促進する目的で温度制御機能を含むことになる。機器システム（またはキャピラリーフローセル・カートリッジ）設計の中へ組み込まれ得る温度制御部品の例は、限定されないが、抵抗加熱素子、赤外線光源、ペルチェ加熱または冷却デバイス、ヒートシンク、サーミスター、熱電対などを含む。いくつかの例では、温度制御モジュール（あるいは「温度調節器」）は、特定のアッセイあるいは分析の工程を実施する前の規定された調整可能な時間におけるプログラム可能な温度変更を提供する場合がある。いくつかの例では、温度調節器は、規定された時間間隔にわたる温度のプログラム可能な変更を提供する場合がある。いくつかの実施形態では、温度調節器は、増幅反応のための熱循環が実行され得るように、指定された頻度および傾斜率で２つ以上の設定温度間での温度循環をさらに提供する場合がある。
図３４は、フローセル（例えば、キャピラリーフローセルまたはマイクロ流体デバイスがベースのフローセル）の、フローセル・カートリッジに接触して配置される金属板の使用による、温度制御の非限定的な例を図示する。いくつかの例では、金属板はカートリッジ・シャーシに統合されることがある。いくつかの例では、金属板はペルチェまたは抵抗ヒータを使用して温度制御され得る。
図３５は、非接触熱制御機構を含む、フローセル（例えば、キャピラリーまたはマイクロ流体チャネルフローセル）の温度制御について１つの非限定的なアプローチを図示する。このアプローチでは、温度制御された空気の流れは、空気温度制御システムを使用して、フローセル・カートリッジを通るように（例えば、単一キャピラリーフローセルデバイスまたはマイクロ流体チャネル・フローセルデバイスに向かって）方向づけられる。空気温度制御システムは、例えば、抵抗ヒータコイル、ペルチェ素子に取り付けられたフィンなど、空気を加熱および／または冷却でき、およびそれをユーザーに規定された一定の温度に保持することができる、熱交換器を含む。空気温度制御システムは、また、加熱または冷却された空気の流れをキャピラリーフローセル・カートリッジに向ける、ファンなどの、空気送達デバイスを含む。いくつかの例では、空気温度制御システムが一定温度Ｔ１にセットされ、その結果、空気の流れ、および従って、フローセルまたはカートリッジ（例えば、キャピラリーフローセルまたはマイクロ流体チャネル・フローセル）が、一定温度Ｔ２で維持されてもよく、Ｔ２は、場合により、環境温度、空気流量などに依存して設定温度Ｔ１と異なり得る。いくつかの例では、２つ以上のそのような空気温度制御システムが、キャピラリーフローセルデバイスまたはフローセル・カートリッジの周囲に据え付けられてもよく、その結果、どの空気温度制御システムが所与の時点において稼働中であるかを制御することにより、キャピラリーまたはカートリッジが、いくつかの異なる温度の間で急速にサイクルされ得る。別のアプローチでは、空気温度制御システムの温度設定は変更されてもよく、その結果、キャピラリーフローセルまたはカートリッジの温度がそれに従って変化し得る。
流体分配ロボット工学：いくつかの実装では、本開示のシステムは、例えば、マイクロプレート、キャピラリーフローセルデバイスおよびカートリッジ、マイクロ流体デバイスおよびカートリッジなどの中へ試薬または他の溶液を分配する用途の自動式でありプログラム可能な流体分配（または液体分配）システムを含み得る。適切な、自動式のプログラム可能な流体分配システムは、多くのベンダーから市販で入手可能であり、例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ １１、および他にも多くがある。本開示のシステムの好ましい態様では、流体分配システムは、プログラム可能な液体の容量（例えば、約１マイクロリットルから数ミリリットルまでの範囲で）をフローセル・カートリッジまたはマイクロ流体カートリッジ上の複数のウェルまたは位置に同時送達するために、例えば、４チャネル、８チャネル、１６チャネル、９６チャネル、または３８４チャネルの分配ヘッドの、多チャネル分配ヘッドをさらに含む。
カートリッジ取扱および／またはマイクロプレート取扱（ピックアンドプレース）ロボット工学：いくつかの実装では、開示されるシステムは、光学撮像システムに関して、マイクロプレート、キャピラリーフローセル・カートリッジ、またはマイクロ流体デバイスカートリッジの自動化された交換および位置決めのための、または、マイクロプレート、キャピラリーフローセル・カートリッジ、またはマイクロ流体デバイスカートリッジを、光学撮像システムと流体分配システムとの間で随意に移動させるための、カートリッジ取り扱いおよび／またはマイクロプレート取り扱いロボットシステムを含み得る。適切な、自動化された、プログラム可能なマイクロプレート取り扱いロボットシステムは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｅｍｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ １１、その他多くを含む供給業者から市販で入手可能である。開示されるシステムの好ましい態様では、自動化されたマイクロプレート取り扱いロボットシステムは、試料および／または試薬を含む微小ウェルプレートの集合を、例えば、冷凍保管ユニットから及び冷凍保管ユニットへと動かすように構成される。
分光あるいは撮像モジュール：上に示されたように、いくつかの実装では、本開示の分析システムは、光学的撮像能力を含み、また、他の分光学の測定能力を含む場合がある。例えば、開示される撮像モジュールは、明視野、暗視野、蛍光、ルミネセンス、または燐光撮像を含み、これらに限定されない、当業者に既知の様々な撮像モードのいずれかにおいて動作するように構成され得る。いくつかの例では、流体工学サブシステムの１つ以上のキャピラリーフローセルまたはマイクロ流体デバイスは、各フローセルまたはマイクロ流体デバイス内の１つ以上のキャピラリーまたは１つ以上の流体チャネルの少なくとも一区画を照明して画像化することを可能にするウィンドウを含む。
いくつかの実施形態では、単一波長励起および放射蛍光撮像が実施され得る。いくつかの実施形態では、両面波長励起および放射（または多波長励起あるいは放射）の蛍光撮像が実施され得る。いくつかの例では、撮像モジュールはビデオ画像を取得するように構成される。撮像モードの選択は、フローセルデバイスあるいはカートリッジの設計に影響を与える可能性があるが、それはキャピラリーあるいはカートリッジの全部または一部が、対象となるスペクトル範囲において光学的に透明である必要があるためである。いくつかの例では、キャピラリーフローセル・カートリッジ内の複数のキャピラリーは、それらの全体が単一画像内に撮像される場合がある。いくつかの例では、キャピラリーフローセル・カートリッジ内の単一のキャピラリーまたはキャピラリーのサブセット、あるいはその一部のみが単一の画像内に撮像され得る。いくつかの例では、一連の画像が「タイル化」されてカートリッジ内の１本、２本、数本、または複数のキャピラリー全体の単一の高解像度画像が生成され得る。いくつかの例では、マイクロ流体チップ内の複数の流体チャネルは、それらの全体が単一画像内に撮像され得る。いくつかの例では、マイクロ流体チップ内の単一の流体チャネルまたは流体チャネルのサブセット、あるいはその一部のみが単一画像内に撮像され得る。いくつかの例では、一連の画像が「タイル化」されてカートリッジ内の１本、２本、数本、または複数の流体チャネル全体の単一の高解像度画像が生み出され得る。
分光または撮像モジュールは、例えば、ＣＣＤカメラのＣＭＯＳを装備した顕微鏡を含み得る。いくつかの例では、分光または撮像モジュールは、例えば、特定の分光学的あるいは対象の撮像技術を実施するように構成される本明細書に記載の撮像モジュールのうちの１つなどの、特製の機器を含み得る。一般的に、分光モジュールまたは撮像モジュールに関連するハードウェアには、光源、検出器、およびその他の光学部品、ならびにプロセッサまたはコンピュータが含まれ得る。
光源：撮像光や励起光を提供するために、さまざまな光源を使用してもよく、限定されないが、タングステンランプ、タングステン・ハロゲンランプ、アークランプ、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはレーザーダイオードなどが挙げられる。いくつかの例では、１つ以上の光源と、付加的な光学部品、例えば、レンズ、フィルタ、アパーチャ、ダイヤフラム、ミラーなど、の組み合わせが、照明システム（またはサブシステム）として構成され得る。
検出器：様々なイメージセンサーのうちのいずれが使用されてもよく、限定されないが、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤ（電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ））カメラ、ＣＭＯＳ（相補型金属－酸化膜－半導体）イメージセンサーなどが挙げられる。本明細書で使用されるように、「撮像センサー」は一次元（線形）センサーまたは２次元アレイセンサーであり得る。多くの例では、１つ以上の画像センサー、および付加的な光学部品、例えばレンズ、フィルタ、アパーチャ、ダイアフラム、ミラーなど、の組み合わせは、撮像システム（あるいはサブシステム）として構成され得る。いくつかの例では、例えば、撮像ではなく分光測定がシステムによって行われる場合、適切な検出器は、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、および光電子増倍管を含むが、これらに限定されない。
他の光学部品：分光測定または撮像モジュールのハードウェア構成要素は、システム内で光ビームをステアリング、シェーピング、フィルタリング、またはフォーカシングするための様々な光学部品を含み得る。適切な光学部品の例として、限定されないが、レンズ、ミラー、プリズム、アパーチャ、回折格子、色ガラスフィルタ、ロングパスフィルタ、ショートパスフィルタ、バンドパスフィルタ、狭帯域干渉フィルタ、広帯域干渉フィルタ、ダイクロイックリフレクタ、光ファイバー、光導波路などが挙げられる。いくつかの例では、上述したように、分光測定または撮像モジュールは、キャピラリーフローセルデバイスおよびカートリッジを照明および／または検出／撮像サブシステムに相対的に、あるいはその逆の関係において、移動させる目的で、１以上の並進移動機構または他の動作制御機構をさらに含み得る。
全内部反射：光学モジュールまたはサブシステムは、フローセルデバイスあるいはカートリッジ内のキャピラリーあるいはマイクロ流体チャネルの光学的に透明な壁の全部または一部を、全内部反射によってキャピラリーやチャネルのルーメンに励起光を供給する導波路として使用するように設計され得る。入射励起光がキャピラリーまたはチャネルルーメンの表面に表面への法線に対して臨界角（キャピラリーまたはチャネルの壁の材料とキャピラリーまたはチャネル内の水性バッファとの相対的な屈折率よって決定される）より大きい角度であたるとき、全内部反射が表面で生し、および、光は、キャピラリーまたはチャネルの壁によってキャピラリーまたはチャネルの長さに沿って伝播する。全内部反射は、極めて短距離の間ルーメン内部を貫通するルーメン表面でエバネッセント波を生成し、および、それは、例えば、ポリメラーゼによって固相プライマー伸長反応によって成長中のオリゴヌクレオチドに取り込まれた標識ヌクレオチドなど、表面のフロオロフォアを選択的に励起するために使用され得る。
遮光筐体および環境制御チャンバ：いくつかの実装では、開示されるシステムは、逸れた周辺光がグレアを生じること、および、例えば、相対的に微弱な蛍光信号などを不明瞭にすることを予防するために、遮光筐体を含み得る。いくつかの実装では、本開示のシステムは、該システムがしっかりと制御された温度、湿度レベルなどの下で作動することを可能にする環境制御チャンバーを含み得る。
プロセッサとコンピュータ：いくつかの例では、本開示のシステムは１つ以上のプロセッサまたはコンピュータを含み得る。プロセッサは、中央処理デバイス（ＣＰＵ）、映像処理デバイス（ＧＰＵ）、汎用処理デバイスなどのハードウェア・プロセッサ、またはコンピューティング・プラットフォームであり得る。プロセッサは、様々な適切な集積回路、マイクロプロセッサ、論理回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）のいずれかで構成され得る。いくつかの例では、プロセッサは、シングルコアまたはマルチコアプロセッサであってもよく、また、複数のプロセッサが並列処理のために構成されていてもよい。本開示では、プロセッサに言及して記載するが、他のタイプの集積回路および論理デバイスも適用可能である。プロセッサは、任意の適切なデータ演算能力を有し得る。例えば、プロセッサは、５１２ビット、２５６ビット、１２８ビット、６４ビット、３２ビット、または１６ビットのデータ演算を行い得る。
プロセッサまたはＣＰＵは、プログラムまたはソフトウェアに統合され得る一連の機械可読命令を実行することができる。その命令は記憶域に保存されることがある。命令はＣＰＵにダイレクトすることができ、その後、例えば本開示のシステム制御方法を実行するようにＣＰＵをプログラムするか、でなければ構成することができる。ＣＰＵによって実行される演算の例は、フェッチ、デコード、実行、またはライトバックを含み得る。
いくつかのプロセッサは、コンピュータシステムの処理デバイスを含むことがある。コンピュータシステムは、クラウドベースのデータ記憶および／またはコンピューティングを可能にする場合がある。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、通信インターフェースを用いて、コンピュータネットワーク（以下、「ネットワーク」）に動作可能に結合されていてもよい。ネットワークは、インターネット、イントラネットおよび／またはエクストラネット、インターネットと通信状態にあるイントラネットおよび／またはエクストラネット、あるいはローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）であり得る。ネットワークは、場合によっては、テレコミュニケーションおよび／またはデータネットワークである。ネットワークは、クラウドなどの分散コンピューティングを可能にする１つ以上のコンピュータサーバーを含み得る。
コンピュータシステムは、また、メモリまたは記憶域（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶デバイス（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース（例えば、ネットワークアダプタ）、および、キャッシュ、他のメモリユニット、データ記憶デバイス、および／あるいは電子ディスプレイアダプターなどの周辺機器を含む。いくつかの例では、通信インターフェースは、コンピュータが１つ以上の付加的なデバイスと通信することを可能にし得る。コンピュータは、分析のために、連結されるデバイスの入力データを受け入れることができる場合がある。メモリユニット、記憶（ストレージ）ユニット、通信インターフェース、および周辺機器は、マザーボードに統合され得るようなコミュニケーション・バス（有線）を介してプロセッサまたはＣＰＵと通信状態にあり得る。メモリまたは記憶ユニットは、データを保存するためのデータ記憶ユニット（またはデータレポジトリ）であり得る。メモリまたは記憶ユニットは、ドライバー、ライブラリ、およびセーブされたプログラムなどのファイルを記憶し得る。メモリまたは記憶ユニットは、ユーザーデータ、例えばユーザーの好み、およびユーザープログラムを記憶し得る。
本明細書に記載されるようなシステム制御、画像処理、および／またはデータ分析方法は、コンピュータシステム、例えば、メモリまたは電子記憶ユニットなどにおける電子記憶位置に保存された機械実行可能コードとして、実現することができる。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形で提供することができる。使用中、コードはプロセッサにより実行され得る。
いくつかの場合では、コードは、記憶ユニットから取り出され、そしてプロセッサによる即時のアクセスのためのメモリに保存され得る。いくつかの状況において、電子記憶ユニットは除外され、および機械実行可能命令がメモリに保存される。いくつかの例では、コードは、事前にコンパイルされ、当該コードを実行するのに適したプロセッサを有する機械で使用するように構成されてもよい。いくつかの例では、コードはランタイムでコンパイルされ得る。コードは、あらかじめコンパイルされたまたはアズコンパイルされた（ａｓ－ｃｏｍｐｉｌｅｄ）様式でコードが実行を可能にするために選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
本明細書に提供されたシステムと方法のいくつかの態様は、ソフトウェアで具体化することができる。本技術の様々な態様は、典型的には、機械（またはプロセッサ）が実行可能なコードおよび／または関連するデータの形で、機械読み取り可能な媒体に搭載または具現化された「製品」または「製造の物品」と考えられる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶ユニットに記憶することができる。「記憶」型の媒体は、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの、コンピュータやプロセッサの有形メモリ、あるいはその関連するモジュールのいずれかまたは全てを含むことができ、これらは、ソフトウェアのプログラミングのためにいかなる時も非一時的な記憶を提供し得る。ソフトウェアの全てまたは一部は、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを介して時々通信される。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサから別のものへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータから応用サーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得る。ゆえに、ソフトウェア要素を持ち得る別のタイプの媒体は、有線および光地上通信線ネットワークを通じた、および様々なエアリンク（ａｉｒ－ｌｉｎｋｓ）上での、ローカルデバイス間の物理インターフェースにわたって使用されるものなどの、光波、電波、および電磁波を含む。有線または無線リンク、光リンクなどの、そのような波を運ぶ物理要素はまた、ソフトウェアを持つ培地と考慮され得る。本明細書で使用されるように、非一時的で有形の「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する媒体を指す。
いくつかの例では、本開示のシステム制御、画像処理、および／またはデータ解析方法は、１つ以上のアルゴリズムの形で実装されてもよい。アルゴリズムは、中央処理ユニットで実行されるソフトウェアの形で実装され得る。
システム制御ソフトウェア：いくつかの例では、システムは、コンピュータ（またはプロセッサ）と、すべてのシステム機能を手動、半自動、または完全自動で制御し、並びにユーザーインターフェースを提供するためのコードを含む、コンピュータ可読媒体とを含む場合があり、前記システム機能の例として、流体制御モジュール、温度制御モジュール、および／または分光あるいは撮像モジュールの制御、並びにその他のデータ分析および表示オプションが挙げられる。システムコンピュータまたはプロセッサは、システムの統合された構成要素（例えば、機器内に組み込まれたマイクロプロセッサまたはマザーボード）であってよく、例えば、メインフレームコンピュータ、パーソナルコンピュータ、またはラップトップコンピュータなどの独立したモジュールであってもよい。システム制御ソフトウェアが提供する流体制御機能の例としては、限定されないが、体積流体流動量、流体流動速、試料および試薬を添加するタイミングと持続時間、バッファーを添加するタイミングと持続時間、すすぎ工程のタイミングと持続時間が挙げられる。システム制御ソフトウェアによってもたらされる温度制御機能の例として、限定されないが、設定温度の指定、および、温度変化のタイミング、継続時間、並びに傾斜率の制御が挙げられる。システム制御ソフトウェアにより提供される分光測定または撮像制御機能の例として、限定されないが、オートフォーカス機能、照明または励起光の露光時間および強度の制御、画像取得レート、露光時間、およびデータ保存オプションの制御などが挙げられる。
画像処理ソフトウェア：いくつかの例では、システムは、コンピュータ（またはプロセッサ）と、画像処理および分析能力を提供するためのコードを含むコンピュータ可読媒体とをさらに含み得る。ソフトウェアが提供する画像処理および分析機能の例は、限定されないが、手動、半自動、または全自動の画像露出調節（ホワイトバランス、コントラスト調整、信号平均化、およびその他のノイズ低減能力など）、自動化された統計分析（例えば、キャピラリールーメンの表面の単位面積あたりに識別されたオリゴヌクレオチドのクローン的に増幅されたクラスタの数を求めるための、または核酸配列決定の応用における自動化されたヌクレオチドのベースコールのための）、および、手動測定（例えば、クラスタまたは他の対象の間の距離の測定など）の能力が挙げられる。随意に、機器制御および画像処理／分析ソフトウェアは、別個のソフトウェアモジュールとして記述され得る。いくつかの実施形態では、機器制御および画像処理／分析ソフトウェアが統合パッケージに組み込まれている場合がある。
当業者に既知の様々な画像処理方法のうちのいかなるものも、画像処理／前処理に使用され得る。例としては、限定されないが、Ｃａｎｎｙエッジ検出法、Ｃａｎｎｙ－Ｄｅｒｉｃｈｅエッジ検出法、一次勾配エッジ検出法（例えば、Ｓｏｂｅｌ演算子）、２次差分エッジ検出法、位相一致（フェーズコヒーレンス）エッジ検出法、その他の画像分割アルゴリズム（強度閾値、強度クラスタリング法、強度ヒストグラムベース法など）、特徴認識、パターン認識のアルゴリズム（任意の形状を検出するための一般化ハフ変換、円形ハフ変換など）、および、数学的解析アルゴリズム（フーリエ変換、高速フーリエ変換、ウェーブレット解析、自己相関など）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
核酸配列決定システムおよび応用：核酸配列決定は、本開示のフローセルデバイス（例えば、キャピラリーフローセルデバイスまたはカートリッジ、およびマイクロ流体デバイスおよびカートリッジ）と撮像システムのための応用の１つの非限定的な例を提供する。多くの「第２世代」および「第３世代」の配列決定技術は、超並列のサイクリックアレイアプローチを利用して、ヌクレオチドの取り込みによる配列決定を行っており、ここで、固体支持体にテザーされた単鎖の鋳型オリゴヌクレオチド配列を正確に解読することは、ポリメラーゼによってＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴのヌクレオチドを相補的なオリゴヌクレオチド鎖に段階的に付加することで生じる信号を成功裏に分類することに懸かっている。これらの方法では、典型的に、オリゴヌクレオチドの鋳型が、固定された長さの既知のアダプタ配列で修飾され、固体支持体表面にテザーされた前記アダプタ配列に相補的な既知の配列の捕捉プローブ（本明細書では、フローセルの内部表面にテザーされた「アダプタ」または「プライマー」とも言う）へのハイブリダイゼーションによって、ランダムに又はパターン化されたアレイのかたちで、前記固体支持体（例えば、本開示のキャピラリーフローセルデバイスまたはマイクロ流体チップのルーメン表面）に取り付けられ、そして、鋳型オリゴヌクレオチドの塩基配列を特定するために、例えば、蛍光標識されたヌクレオチドを用いる一塩基付加プライマー伸長反応を周期的に行って、プローブされることを必要とする。これらのプロセスは、従って、小型化された流体工学システムを使用することを必要し、前記小型化された流体工学システムは、配列決定反応が実施されるフローセルへの試薬注入のタイミングの正確で再現可能な制御、および高価な試薬の消費を削減または最小化する小さな容量を提供する。
現在市販されているＮＧＳフローセルは、撮像、冷却、および／または他の要件から必要とされる厳しい寸法公差を満たすために、エッチング、ラッピング、および／または他の方法で加工されたガラスの層で構築される。フローセルが消耗品として使用される場合、それらの製造に必要とされるコストの高い作製プロセスによって、結果として、配列決定を実行するごとにかかるコストが高くなりすぎ、研究と臨床の分野における科学者および医療従事者が慣例的に配列決定を利用することができない。
この開示は、低コストガラスまたはポリマーのキャピラリー、またはマイクロ流体チャネル、流体工学アダプタ、およびカートリッジ・シャーシを含む、低コストのフローセルのアーキテクチャの例を提供する。最終的な断面幾可学的形状に成型されるガラスまたはポリマーのキャピラリーを利用することは、複数の高精度で高価なガラス製造プロセスの必要性を消滅させ得る。キャピラリーあるいはマイクロ流体チャネルの配向を強固に拘束し、および、成型プラスチックおよび／またはエラストマーの構成要素を使用する便利な流体接続部を提供することは、さらにコストを削減させる。ポリマーカートリッジ・シャーシの構成要素をレーザーで結合させることは、キャピラリーまたはマイクロ流体チャネルを密閉し、および留め具または粘着剤の使用を必要とせずにキャピラリーまたはチャネルおよびフローセル・カートリッジを構造的に安定させる、迅速で効率的な手段をもたらす。
開示されるデバイスおよびシステムは、様々な「ヌクレオチドの取り込みによる配列決定」、「ヌクレオチドの結合による配列決定」、「ヌクレオチドの塩基対合による配列決定」、および「アビディティによる配列決定」のいずれかの配列決定生化学を用いて核酸配列決定を行うように構成され得る。本明細書で開示されるフローセルデバイスの設計の改善は、例えば、それ自体の上に配置された蛍光標識されるなどした核酸クラスタの前景信号を最大化する一方で背景信号を最小化する親水性コーティングされた表面を含んでおり、より大きな被写界およびより大きな視野深度を備える改善された対物レンズおよび／またはチューブレンズの設計によって得られる高速二面性フローセル撮像（フローセル内部の表面の同時またはほぼ同時の撮像を含む）のための光学撮像システムの設計の改善と組み合わされることで、ベースコールの目的で使われる画像のＣＮＲの改善をもたらし得、および、試薬消費量の削減（改善されたフローセルの設計による）により、ベースコール精度の劇的な改善、撮像サイクルタイムの短縮、配列決定反応全体のサイクルタイムの短縮、塩基あたりのコスト削減による核酸配列決定の高スループット化をもたらし得る。
本明細書に開示されるシステムは、様々な異なる配列決定化学を使用して、様々な異なる配列決定方法のうちのいずれかを実施するように構成され得る。例えば、図４０は、アビディティによる配列決定の方法を実現するためのフローチャートの非限定的な例を提供する。ポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲートは、フローセルの１つ以上の内部表面などの支持面にテザーされた複数のプライミングされた標的核酸配列と多価結合複合体を形成するために使用することができ、その結果、多価結合複合体は、単一のヌクレオチドと単一のプライミングされた標的核酸配列との間の結合相互作用によってもたらされるよりも有意に長い持続時間を示すようになる。一般的に、そのようなアビディティによる配列決定のアプローチは、下記の工程の１つ以上を含む：支持表面にテザーされたアダプタ／プライマー配列にターゲット核酸配列をハイブリダイズする工程；支持表面で増幅された標的配列のクラスタを作るためにクローン増幅する工程；支持表面をポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲートと接触させる工程であって、複数のヌクレオチド部分が安定した多価結合複合体を形成するようにポリマーコアにコンジュゲートしており、ここでポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲートは、１つ以上の検出可能な標識、例えば、蛍光体をさらに含み得る、工程；任意の過剰な、結合されないポリマーヌクレオチド・コンジュゲートを洗浄して取り除く工程；多価結合複合体を、例えば、支持表面の蛍光の撮像により、検出する工程；標的核酸配列中のヌクレオチドを同定する工程（ベースコール）；多価結合複合体を、例えば、イオン強度、イオンの組成、および／または緩衝液のｐＨを変更して、不安定化させる工程；フローセルをすすぐ工程；および、同定されたヌクレオチドに対する相補的塩基を含むヌクレオチドを添加するためにプライマー伸長反応を実施する工程。当該サイクルは、配列のさらなるヌクレオチド塩基を同定するために反復され得、後に続けて配列データの処理およびアセンブリが行われ得る。いくつかの例では、データ処理は、配列決定が実行されるときに同時に、または実行後のデータ処理工程の一部として、Ｑスコアなどの配列決定性能測定法の指標を含む場合がある。
いくつかの例では、本明細書で開示される光学結像システムと組み合わせて使用される本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスは、核酸配列決定システムのために以下の付加的な利点の１つ以上を与え得る：（ｉ）流体の洗浄時間の減少（非特異的結合の抑制、つまり速い配列決定サイクルタイムによって）、（ｉｉ）撮像時間の減少（従って、アッセイ読出しおよび配列決定サイクルのより速い所要時間）、（ｉｉｉ）全体的なワークフローに必要な時間の減少（サイクルタイムの減少による）、（ｉｖ）検出計装コストの減少（ＣＮＲの改善による）、（ｖ）読出し（ベースコール）精度の改善（ＣＮＲの改善による）、（ｖｉ）試薬安定性の改善および試薬使用法の必要条件の減少（従って、試薬コストの低減）、（ｖｉｉ）核酸増幅の失敗に起因する実行時間中の失敗がより少なくなること。
核酸配列決定の実施のための本明細書に開示される方法、デバイス、およびシステムは、様々な配列決定の応用に、および様々な試料およびソースのうちのいずれに由来した核酸分子でも配列決定することに適している。核酸は、いくつかの例では、様々な生体試料、例えば、血液試料、だ液試料、尿試料、細胞試料、組織試料など、のうちのいずれからも抽出され得る。例えば、本開示のデバイスおよびシステムは、当業者に既知の様々な異なる細胞、組織、あるいは試料タイプのうちのいずれに由来した核酸分子の分析にも使用され得る。例えば、核酸は、真核生物（動物、植物、菌類、原生生物など）、始原細菌、または真性細菌に由来する１つ以上の細胞型を含む細胞、あるいは組織試料から抽出され得る。いくつかの場合では、核酸は、付着性または非付着性の真核細胞など、原核細胞または真核細胞から抽出され得る。核酸は、例えば、げっ歯類、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、霊長類、またはヒトの、初代培養または不死化した細胞株などから様々に抽出され得る。核酸は、様々な異なる細胞、臓器、または組織型（例えば、白血球、赤血球、血小板、上皮細胞、内皮細胞、ニューロン、膠細胞、アストロサイト、線維芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、配偶子、または心臓、肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胸腺、膀胱、胃、結腸、あるいは小腸からの細胞）のいずれからでも抽出され得る。核酸は正常または正常細胞から抽出されることがある。交互にあるいは組み合わせて、酸は、癌細胞などの異常細胞から、または宿主を感染させている病原性の細胞から抽出される。いくつかの核酸は、明確な細胞型のサブセット、例えば、免疫細胞（Ｔ細胞、細胞毒性（キラー）Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、リンパ系幹細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、形質細胞、記憶細胞、好中球、好酸球、好塩基性細胞、マスト細胞、単球、樹状細胞、および／またはマクロファージ、あるいはその任意の組み合わせ、など）、未分化のヒト幹細胞、分化するように誘導されたヒト幹細胞、希少細胞（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環上皮細胞、循環内皮細胞、循環子宮内膜細胞、骨髄細胞、前駆細胞、泡沫細胞、間葉細胞、または栄養芽層）、から抽出され得る。他の細胞は考慮に入れられ、かつ本明細書の開示に矛盾しない。
核酸は、例えば、核酸の５’末端、または３’末端のいずれかとの共有結合または非共有結合を介して、標識および他の小分子、大分子（タンパク質、脂質、糖など）、および固体または半固体の支持体などの１つ以上の非ヌクレオチド部分に随意に結合してもよい。標識は、当業者に知られている様々な検出方法のいずれかを用いて検出可能であり、したがって、付着したオリゴヌクレオチドまたは核酸を同様に検出可能にする任意の部分を含む。いくつかの標識、例えば、フルオロフォア、は、光学的に検知できるか目に見える電磁放射線を放射する。代替的に、または、組み合わせて、いくつかの標識は、標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸を質量スペクトルデータで可視化する質量タグ、あるいは、標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸をアンペロメトリーまたはボルタンメトリーによって検出可能にするレドックスタグを含む。いくつかの標識は、標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸の分離および／または精製を容易にする磁気タグを含む。しばしば、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは標識に付着されず、オリゴヌクレオチドまたは核酸の存在は直接検出される。
配列決定のために構成されたフローセルデバイス：いくつかの例では、本開示による１つ以上のフローセルデバイスは、核酸配列決定の適用のために構成される場合があり、例えば、ここで、２つ以上のフローセルデバイスの内部表面が、１つ以上のキャプチャー・オリゴヌクレオチド、例えば、アダプタ／プライマー・オリゴヌクレオチド、あるいは本明細書に開示される他のオリゴヌクレオチドをさらに含む親水性ポリマーコーティングを含む。いくつかの例では、本開示のフローセルデバイスの親水性のポリマーコーティングされた表面は、真核生物ゲノムの配列決定に使用するために選択された複数のオリゴヌクレオチドを、前記表面にテザーして、含む場合がある。いくつかの例では、本開示のフローセルデバイスの親水性のポリマーコーティングされた表面は、原核生物ゲノムまたはそのタンパク質の配列決定に使用するために選択された複数のオリゴヌクレオチドを、前記表面にテザーして、含む場合がある。いくつかの例では、本開示のフローセルデバイスの親水性のポリマーコーティングされた表面は、ウィルスゲノムまたはそのタンパク質の配列決定に使用するために選択された複数のオリゴヌクレオチドを、前記表面にテザーして、含む場合がある。いくつかの例では、本開示のフローセルデバイスの親水性のポリマーコーティングされた表面は、トランスクリプトームの配列決定に使用するために選択された複数のオリゴヌクレオチドを、前記表面にテザーして、含む場合がある。
いくつかの例では、本開示のフローセルデバイスは、流路の内部に全般的に面する配向にある第１の表面と、全般的に流路の内部に面し、かつ、さらに全般的に第１の表面に面するか又は平行な配向にある、第２の表面と、第２の流路の内部に全般的に面する第３の表面と、全般的に第２の流路の内部に面し、かつ、全般的に第３の表面に対向するか又は平行な、第４の表面と、を含む場合があり、ここで、前記第２および第３の表面は、反射するか、透明か、半透明の基板であり得る全般的に平面の基板の対向面に位置するか又は付着され得る。いくつかの例では、撮像面またはフローセル内の撮像面は、フローセルの中心部内、またはフローセルの２つのサブユニットの間の区分あるいは小区分の内に、またはその部分として、位置してもよく、ここで、前記フローセルは、天面と底面を含んでもよく、そのうちの１つまたは両方は、利用されるような検出モードのために透明であり得、および、ここで、１つ以上のポリマーコーティングにテザーされたオリゴヌクレオチドアダプター／プライマーを含む表面は、フローセルのルーメン内に配置されるか又は挿入され得る。いくつかの例では、天面および／または底面は、付着したオリゴヌクレオチドアダプター／プライマーを含まない。いくつかの例では、前記天面および／または底面は、付着したオリゴヌクレオチドアダプター／プライマーを含む。いくつかの例では、前記天面または前記底面のどちらでも、付着するオリゴヌクレオチドアダプター／プライマーを含み得る。フローセルのルーメン内に配置されたか挿入された表面（複数可）は、反射性基板、透明基板、または半透明基板である一般的な平面基板の片面、反対面、または両面に位置するか、または取り付けられている場合がある。
一般的に、フローセルデバイス表面の低非特異的結合コーティングの１つまたは複数の層のうち、少なくとも１つの層は、オリゴヌクレオチド分子、例えば、アダプタまたはプライマー配列、を共有結合または非共有結合するための官能基を含む場合があり、または、少なくとも１つの層は、支持表面に堆積された時点で、共有結合または非共有結合のオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー配列をすでに含んでいる場合がある。いくつかの例では、少なくとも３分の１の層のポリマー分子にテザーされたオリゴヌクレオチドは、層の全体にわたって複数の深さで分布し得る。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー分子は、溶液中で、つまり、ポリマーを表面に連結または堆積させる前に、ポリマーに共有結合される。
いくつかの例では、オリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー分子は、表面に連結または堆積された後、ポリマーに共有結合される。いくつかの例では、少なくとも１つの親水性ポリマーの層は、複数の共有結合されたオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー分子を含む。いくつかの例では、親水性ポリマーの少なくとも２つ、３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの層が、複数の共有結合されたアダプタまたはプライマー分子を含む。
いくつかの例では、オリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー分子は、当業者に既知の様々な適切なコンジュゲーション化学のうちのいずれかを使用して、親水性ポリマーの１つ以上の層に連結され得る。例えば、オリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー配列は、アミン基、カルボキシル基、チオール基などと反応性である部分を含み得る。使用され得る適切なアミン反応性のコンジュゲーション化学の例は、限定されないが、イソチオシアナート、イソシアン酸、アシルアジ化物、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、およびフルオロフェニルエステル基に関与する反応を含む。適切なカルボキシル反応性のコンジュゲーション化学の例は、限定されないが、カルボジイミド化合物、例えば、水溶性のＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣＬ）に関与する反応を含む。適切なスルフィドリル反応性のコンジュゲーション化学の例は、マレイミド類、ハロアセチル類、およびピリジルジスルフィド類を含む。
オリゴヌクレオチド分子の１つ以上の型は、支持表面に付着またはテザーされ得る。いくつかの例では、１つ以上型のオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマーは、スペーサー配列、アダプタに結紮された鋳型ライブラリー核酸配列へのハイブリダイゼーションのためのアダプタ配列、順方向増幅プライマー、逆方向増幅プライマー、配列決定プライマー、および／または分子バーコード付け配列、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの例では、１つのプライマーまたはアダプタ配列が表面の少なくとも１つの層にテザーされ得る。いくつかの例では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超える様々なプライマーあるいはアダプタ配列が、表面の少なくとも１つの層にテザーされ得る。
いくつかの例では、テザーされたオリゴヌクレオチドアダプターおよび／またはプライマー配列の長さは約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまで及び得る。いくつかの例では、テザーされたオリゴヌクレオチドアダプターおよび／またはプライマー配列の長さは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００ヌクレオチドであり得る。いくつかの例では、テザーされたオリゴヌクレオチドアダプターおよび／またはプライマー配列の長さは、最大で１００、最大で９０、最大で８０、最大で７０、最大で６０、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、または最大で１０ヌクレオチドであり得る。この段落に記載されている下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、テザーされたオリゴヌクレオチドアダプターおよび／またはプライマー配列の長さは、約２０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチドに及び得る。当業者であれば、テザーされたオリゴヌクレオチドアダプターおよび／またはプライマー配列の長さは、この範囲内の任意の値、例えば、約２４ヌクレオチドを有してもよいことを認識するであろう。
いくつかの例では、コーティング層の数および／または各層の材料組成は、コーティングされたフローセルの内部表面上のオリゴヌクレオチドアダプター／プライマー（あるいは他の付着された分子）の結果として生じた表面密度を調節するように選択される。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドアダプター／プライマーの表面密度は、μｍ２あたり約１，０００のプライマー分子からμｍ２あたり約１，０００，０００のプライマー分子まで及び得る。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドプライマーの表面密度は、μｍ２あたり少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、あるいは少なくとも１，０００，０００分子であり得る。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドプライマーの表面密度は、μｍ２あたり、最大で１，０００，０００、最大で１００，０００、最大で１０，０００、または、最大で１，０００分子である。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、プライマーの表面密度はμｍ２あたり約１０，０００分子～約１００，０００分子に及び得る。当業者であれば、プライマー分子の表面密度が、例えば、μｍ２あたり約４５５，０００分子など、この範囲内のどんな値を有してもよいことを認識するであろう。いくつかの例では、キャピラリーまたはチャネルルーメンコーティングの表面特性は、テザーされたオリゴヌクレオチドプライマーの表面密度を含めて、例えば、固相核酸ハイブリダイゼーションの特異性と効率、および／または固相核酸増幅の速度、特異性、効率を、改善するか最適化するために、調節され得る。
いくつかの例では、テザーされたアダプタまたはプライマー配列は、低結合支持体上で実施されるような核酸増幅の特異性と効率を促進することを目指した修飾を含み得る。例えば、いくつかの例では、プライマーは、表面のコンジュゲーション点と修飾部位の間のプライマー配列の伸張が、常に単鎖の形態であり、いくつかのヘリカーゼ依存型等温増幅法において５’から３’のヘリカーゼのためのローディング部位として機能するように、ポリメラーゼ停止点を含み得る。ポリメラーゼ停止点を作るために使用され得るプライマー修飾の他の例として、限定されないが、５’末端に向かって２つのヌクレオチド間においてプライマーのバックボーンに鎖状ＰＥＧを挿入すること、脱塩基ヌクレオチド（つまり、プリンもピリミジン塩基もないヌクレオチド）を挿入すること、またはヘリカーゼによって回避することができる病変部位、が挙げられる。
核酸ハイブリダイゼイション：いくつかの例では、いくつかの例では、本明細書で開示される親水性の、ポリマーコーティングされたフローセルデバイスの表面は、単独で、または改良された緩衝製剤と組み合わせて使用することで、固相核酸ハイブリダイゼーション、および／または固相核酸増幅反応をジェノタイピングあるいは核酸配列決定の一部として実施するために、利点をもたらし得る。いくつかの例では、本明細書に開示されるポリマーコーティングされたフローセルデバイスは、改善された核酸ハイブリダイゼーション速度および特異性における利点、および本開示の以下のさらなる態様の１つ以上によって達成され得る改善された核酸増幅速度および特異性をもたらし得る：（ｉ）プライマー設計（例えば、配列および／または修飾）、（ｉｉ）固体支持体上にテザーされたプライマーの密度の制御、（ｉｉｉ）固体支持体の表面の組成、（ｉｖ）固体支持体の表面のポリマー密度、（ｖ）増幅前および増幅中における改善されたハイブリダイゼーション条件の使用、および／または（ｖｉ）非特異的プライマー増幅を減少させる、または鋳型増幅の効率を増大させる、改善された増幅調合物の使用。
いくつかの例では、例えば、所与の増幅方法を使用する時に、支持体を最適なパフォーマンスに「調律する」ために、コーティングされたフローセル表面上にテザーされたオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマーの表面密度、および／またはテザーされたアダプタまたはプライマーの間隔を、コーティングされたフローセル表面から離して（例えば、表面にアダプタまたはプライマーをテザーするために使用されるテザーリンカ分子の長さを変えることによって）変化させることが望ましい場合がある。いくつかの例では、テザーされたオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマーの表面密度の調節は、表面上で観察される特異的および／または非特異的増幅のレベルに、選択された増幅方法によって変化するように、影響を与え得る。いくつかの例では、テザーされたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはプライマーの表面密度は、支持表面を作るために使用される分子の成分の比率を調節することにより変化され得る。例えば、その場合に、オリゴヌクレオチドプライマー－ＰＥＧコンジュゲートは、低結合の支持体の最終層を生成するために使用され、オリゴヌクレオチドプライマー－ＰＥＧコンジュゲートの非コンジュゲートＰＥＧ分子に対する比率は、変化され得る。テザーされたプライマー分子の結果的な表面密度は、その後、当業者に既知の様々な技術のうちのいずれかを使用して、評価または測定され得る。例としては、限定されないが、ラジオアイソトープ標識付けおよび計数法の使用または蛍光撮像法の使用が挙げられ、ここで、蛍光信号が表面上のフルオロフォアの数に線形に関連すること（例えば、表面上にフルオロフォアの有意な自己失活がないこと）を確かなものにするために標識付けの反応条件と画像取得の設定に注意が払われるという条件下で、支持表面の画定された領域から剥離される、光学的に検知可能なタグ（例えば、蛍光性のタグ）を含む、切断可能な分子の共有結合カップリングが、適切な溶剤の一定体積に収集され、その後、蛍光信号と光学的タグの濃度が既知の校正液とを比較することによって定量される。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの使用は、単独で、または改善あるいは最適化された緩衝製剤と組み合わせて、の、どちらかで、従来のハイブリダイゼーション・プロトコルに対して約２倍～約２０倍に及ぶ速さの相対的なハイブリダイゼーション速度をもたらし得る。いくつかの例では、相対的なハイブリダイゼーション速度は、従来のハイブリダイゼーション・プロトコルに対して少なくとも、２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１４倍、少なくとも１６倍、少なくとも１８倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、あるいは少なくとも４０倍であり得る。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの使用は、単独で、または改善あるいは最適化された緩衝製剤と組み合わせて、のどちらかで、これらの完了指標のいずれかについて、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、または５分未満の、合計ハイブリダイゼーション反応時間（つまり、ハイブリダイゼーション反応の９０％、９５％、９８％、または９９％の完了に達するのに必要な時間）をもたらし得る。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの使用は、単独で、または改善あるいは最適化された緩衝製剤と組み合わせて、のどちらかで、従来のハイブリダイゼーション・プロトコル用のものと比較して、ハイブリダイゼーション特異性の改善をもたらし得る。いくつかの例では、達成され得るハイブリダイゼーション特異性は、１０のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、２０ハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、３０のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、４０のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、５０のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、７５のハイブリダイゼーション事象での１つの底部ミスマッチ、１００ハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、２００ハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、３００ハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、４００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、５００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、６００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、７００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、８００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、９００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、１，０００のハイブリダイゼーション事象での１の塩基ミスマッチ、２，０００のハイブリダイゼーション事象での１の塩基ミスマッチ、３，０００のハイブリダイゼーション事象での１の塩基ミスマッチ、４，０００のハイブリダイゼーション事象での１の塩基ミスマッチ、５，０００のハイブリダイゼーション事象での１の塩基ミスマッチ、６，０００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、７，０００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、８，０００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、９，０００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、または、１０，０００のハイブリダイゼーション事象での１つの塩基ミスマッチ、よりも優れている。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの使用は、単独で、または改善あるいは最適化された緩衝製剤と組み合わせて、のどちらかで、従来のハイブリダイゼーションプロトコルに比較して、ハイブリダイゼーション効率（例えば、標的オリゴヌクレオチド配列と成功裡にハイブリダイズされる、支持表面上の利用可能なオリゴヌクレオチドプライマーの分率）の改善をもたらし得る。いくつかの例では、達成され得るハイブリダイゼーション効率は、以下に明示される投入標的オリゴヌクレオチド濃度のうちのいずれについても、および、上記に明示されたハイブリダイゼーション反応時間のいずれにおいても、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％、よりも優れている。いくつかの例では、例えば、ハイブリダイゼーション効率が１００％未満である場合、支持表面にハイブリダイズされた標的核酸配列の最終的な表面密度は、表面上のオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー配列の表面密度より小さい場合がある。
いくつかの例では、従来のハイブリダイゼーション（または増幅）プロトコル、または、改善あるいは最適化されたハイブリダイゼーション（または増幅）プロトコルを使用する核酸ハイブリダイゼーション（または核酸増幅）の応用のための、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの使用は、支持表面と接触される標的（または試料）核酸分子の投入濃度について、必要の抑制をもたらし得る。例えば、いくつかの例では、標的（あるいは試料）核酸分子は、約１０ｐＭから約１μＭまで及ぶ濃度（つまり、アニールまたは増幅の前）で支持表面と接触され得る。いくつかの例では、標的（あるいは試料）核酸分子は、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも４０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも３００ｐＭ、少なくとも４００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも６００ｐＭ、少なくとも７００ｐＭ、少なくとも８００ｐＭ、少なくとも９００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも３０ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも６０ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも８０ｎＭ、少なくとも９０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも３００ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも８００ｎＭ、少なくとも９００ｎＭ、または少なくとも１μＭ、の濃度で投与され得る。いくつかの例では、標的（あるいは試料）核酸分子は、最大で１μＭ、最大で９００ｎＭ、最大で８００ｎｍ、最大で７００ｎＭ、最大で６００ｎＭ、最大で５００ｎＭ、最大で４００ｎＭ、最大で３００ｎＭ、最大で２００ｎＭ、最大で１００ｎＭ、最大で９０ｎＭ、最大で８０ｎＭ、最大で７０ｎＭ、最大で６０ｎＭ、最大で５０ｎＭ、最大で４０ｎＭ、最大で３０ｎＭ、最大で２０ｎＭ、最大で１０ｎＭ、最大で１ｎＭ、最大で９００ｐＭ、最大で８００ｐＭ、最大で７００ｐＭ、最大で６００ｐＭ、最大で５００ｐＭ、最大で４００ｐＭ、最大で３００ｐＭ、最大で２００ｐＭ、最大で１００ｐＭ、最大で９０ｐＭ、最大で８０ｐＭ、最大で７０ｐＭ、最大で６０ｐＭ、最大で５０ｐＭ、最大で４０ｐＭ、最大で３０ｐＭ、最大で２０ｐＭ、または最大で１０ｐＭ、の濃度で投与され得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例において、標的（または試料）核酸分子は、約９０ｐＭから約２００ｎＭまで及ぶ濃度で投与されて得る。当業者であれば、この範囲内のいかなる値を有している濃度（例えば約８５５ｎＭ）で標的（または試料）核酸分子が投与されてもよいことを認識するであろう。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの使用は、単独で、または改善あるいは最適化されたハイブリダイゼーション緩衝製剤と組み合わせて、のどちらかで、結果として、μｍ２あたり約０．０００１～約１，０００，０００標的オリゴヌクレオチド分子に及ぶハイブリダイズされた標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子の表面密度（すなわち、後のいかなる固相またはクローンの増幅反応も実行する前の）をもたらし得る。いくつかの例では、ハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチド分子の表面密度は、μｍ２あたり、少なくとも０．０００１、少なくとも０．０００５、少なくとも０．００１、少なくとも０．００５、少なくとも０．０１、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも３，５００、少なくとも４，０００、少なくとも４，５００、少なくとも５，０００、少なくとも５，５００、少なくとも６０００、少なくとも６５００、少なくとも７０００、少なくとも７５００、少なくとも８０００、少なくとも８５００、少なくとも９０００、少なくとも９５００、少なくとも１００００、少なくとも１５０００、少なくとも２００００、少なくとも２５０００、少なくとも３００００、少なくとも３５０００である。少なくとも４０，０００、少なくとも４５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも５５，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも６５，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも７５，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも８５，０００、少なくとも９０，０００、少なくとも９５，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１５０，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも３５０，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも４５０，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも５５０，０００、少なくとも６００，０００、少なくとも６５０，０００、少なくとも７０００００、少なくとも７５０，０００、少なくとも８００，０００、少なくとも８５０，０００、少なくとも９００，０００、少なくとも９５０，０００、１，０００，０００分子であり得る。いくつかの例では、ハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチド分子の表面密度は、μｍ２あたりの分子が、最大で１，０００，０００、最大で９５０，０００、最大で９００，０００、最大で８５０，０００、最大で８００，０００、最大で７５０，０００、最大で７００，０００、最大で６５０，０００、最大で６００，０００、最大で５５０，０００、最大で５００，０００、最大で４５０，０００、最大で４００，０００、最大で３５０，０００、最大で３００，０００、最大で２５０，０００、最大で２００，０００、１５０，０００、最大で１００，０００、最大で９５，０００、最大で９０，０００、最大で８５，０００、最大で８０，０００、最大で７５，０００、最大で７０，０００、最大で６５，０００、最大で６０，０００、最大で５５，０００、最大で５０，０００、最大で４５，０００、最大で４０，０００、最大で３５，０００、最大で３０，０００、最大で２５，０００、最大で２０，０００、最大で１５，０００、最大で１０，０００、最大で９，５００、最大で９，０００、最大で８，５００、最大で８，０００、最大で７，５００、最大で７，０００、最大で６，５００、最大で６，０００、最大で５，５００、最大で５，０００、最大で４，５００、最大で４，０００、最大で３，５００、最大で３，０００、最大で２，５００、最大で２，０００、最大で１，５００、最大で１，０００、最大で９００、最大で８００、最大で７００、最大で６００、最大で５００、最大で４００、最大で３００、最大で２００、最大で１００、最大で９０、最大で８０、最大で７０、最大で６０、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１０、最大で５、最大で１、最大で０．５、最大で０．１、最大で０．０５、最大で０．０１、最大で０．００５、最大で０．００１、最大で０．０００５、または、最大で０．０００１分子であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、ハイブリダイズされた標識オリゴヌクレオチド分子の表面密度は、μｍ２あたり、約３，０００分子～約２０，０００分子に及び得る。当業者であれば、ハイブリダイズされた標識オリゴヌクレオチド分子の表面密度は、この範囲内の任意の値、例えば、μｍ２あたり、約２，７００分子を有してもよいことを認識するであろう。
換言すれば、いくつかの例では、本開示の低結合の支持体の、単独での、または改善あるいは最適化されたハイブリダイゼーション緩衝剤調合物と組み合わせての使用は、結果として、ｍｍ２あたり、約１００のハイブリダイズされた標識オリゴヌクレオチド分子から約１×１０１２のハイブリダイズされた標識オリゴヌクレオチド分子に及ぶ、ハイブリダイズされた標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子の表面密度（すなわち、後のいかなる固相またはクローンの増幅反応も実行する前の）をもたらし得る。いくつかの例では、ハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチド分子の表面密度は、ｍｍ２あたり、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも３５，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも４５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも５５，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも６５，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも７５，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも８５，０００、少なくとも９０，０００、少なくとも９５，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１５０，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも３５０，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも４５０，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも５５０，０００、少なくとも６００，０００、少なくとも６５０，０００、少なくとも７００，０００、少なくとも７５０，０００、少なくとも８００，０００、少なくとも８５０，０００、少なくとも９００，０００、少なくとも９５０，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１×１０７、少なくとも５×１０７、少なくとも１×１０８、少なくとも５×１０８、少なくとも１×１０９、少なくとも５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、少なくとも１×１０１１、少なくとも５×１０１１、または、少なくとも１×１０１２分子であり得る。いくつかの例では、ハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチド分子の表面密度は、最大で１×１０１２、最大で５×１０１１、最大で１×１０１１、最大で５×１０１０、最大で１×１０１０、最大で５×１０９、最大で１×１０９、最大で５×１０８、最大で１×１０８、最大で５×１０７、最大で１×１０７、最大で５，０００，０００、最大で１，０００，０００、最大で９５０，０００、最大で９００，０００、最大で８５０，０００、最大で８００，０００、最大で７５０，０００、最大で７００，０００、最大で６５０，０００、最大で６００，０００、最大で５５０，０００、最大で５００，０００、最大で４５０，０００、最大で４００，０００、最大で３５０，０００、最大で３００，０００、最大で２５０，０００、最大で２００，０００、最大で１５０，０００、最大で１００，０００、最大で９５，０００、最大で９０，０００、最大で８５，０００、最大で８０，０００、最大で７５，０００、最大で７０，０００、最大で６５，０００、最大で６０，０００、最大で５５，０００、最大で５０，０００、最大で４５，０００、最大で４０，０００、最大で３５，０００、最大で３０，０００、最大で２５，０００、最大で２０，０００、最大で１５，０００、最大で１０，０００、最大で５，０００、最大で１，０００、最大で５００、または、最大で１００分子であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、ハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチド分子の表面密度は、ｍｍ２あたり約５，０００分子～約５０，０００分子に及び得る。当業者であれば、標的オリゴヌクレオチド分子の表面密度は、この範囲内の任意の値、例えば、ｍｍ２あたり、約５０，７００分子を有してもよいことを認識するであろう。
いくつかの例では、低結合の支持表面に付着されたオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー分子にハイブリダイズされた標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子（または核酸分子）は、約０．０２キロベース（ｋｂ）～約２０ｋｂ、または約０．１キロベース（ｋｂ）～約２０ｋｂの長さに及び得る。いくつかの例では、標的オリゴヌクレオチド分子は、少なくとも０．００１ｋｂ、少なくとも０．００５ｋｂ、少なくとも０．０１ｋｂ、少なくとも０．０２ｋｂ、少なくとも０．０５ｋｂ、少なくとも０．１ｋｂの長さ、少なくとも０．２ｋｂの長さ、少なくとも０．３ｋｂの長さ、少なくとも０．４ｋｂの長さ、少なくとも０．５ｋｂの長さ、少なくとも０．６ｋｂの長さ、少なくとも０．７ｋｂの長さ、少なくとも０．８ｋｂの長さ、少なくとも０．９ｋｂの長さ、少なくとも１ｋｂの長さ、少なくとも２ｋｂの長さ、少なくとも３ｋｂの長さ、少なくとも４ｋｂの長さ、少なくとも５ｋｂの長さ、少なくとも６ｋｂの長さ、少なくとも７ｋｂの長さ、少なくとも８ｋｂの長さ、少なくとも９ｋｂの長さ、少なくとも１０ｋｂの長さ、少なくとも１５ｋｂの長さ、少なくとも２０ｋｂの長さ、少なくとも３０ｋｂの長さ、または少なくとも４０ｋｂの長さであり得、または、ここに記載した範囲にわたる、どんな中間値でも、例えば、長さが少なくとも０．８５ｋｂでもあり得る。
いくつかの例では、標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子（または核酸分子）は単鎖または二本鎖の、規則的に生じるモノマー単位の反復をさらに含む多量体核酸分子（例えば、コンカテマー）を含み得る。いくつかの例では、単鎖または二本鎖の、多量体の核酸分子は、は、少なくとも０．００１ｋｂ、少なくとも０．００５ｋｂ、少なくとも０．０１ｋｂ、少なくとも０．０２ｋｂ、少なくとも０．０５ｋｂ、少なくとも０．１ｋｂの長さ、少なくとも０．２ｋｂの長さ、少なくとも０．３ｋｂの長さ、少なくとも０．４ｋｂの長さ、少なくとも０．５ｋｂの長さであってもよい。 ５ｋｂの長さ、少なくとも１ｋｂの長さ、少なくとも２ｋｂの長さ、少なくとも３ｋｂの長さ、少なくとも４ｋｂの長さ、少なくとも５ｋｂの長さ、少なくとも６ｋｂの長さ、少なくとも７ｋｂの長さ、少なくとも８ｋｂの長さ、少なくとも９ｋｂの長さ、少なくとも１０ｋｂの長さ、少なくとも１５ｋｂの長さ、または、少なくとも２０ｋｂの長さ、少なくとも３０ｋｂの長さ、または、少なくとも４０ｋｂの長さであり得、または、ここに記載した範囲にわたる、いかなる中間値でも、例えば、少なくとも約２．４５ｋｂの長さでもあり得る。
いくつかの例では、標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子（または核酸分子）は単鎖または二本鎖の、規則的に繰り返す約２から約１００のモノマー単位を含む多量体核酸分子（例えば、コンカテマー）を含み得る。いくつかの例では、規則的に繰り返すモノマー単位のコピーの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、および少なくとも１００であり得る。いくつかの例では、規則的に繰り返すモノマー単位のコピーの数は、最大で１００、最大で９５、最大で９０、最大で８５、最大で８０、最大で７５、最大で７０、最大で６５、最大で６０、最大で５５、最大で５０、最大で４５、最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２５、最大で２０、最大で１５、最大で１０、最大で５、最大で４、最大で３、あるいは最大で２であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、規則的に繰り返すモノマー単位のコピーの数は約４～約６０に及び得る。当業者であれば、規則的に繰り返すモノマーユニットのコピーの数は、この範囲内の任意の値、例えば、約１７を有してもよいことを認識するであろう。従って、いくつかの例において、ハイブリダイゼーション効率が１００％未満であっても、支持表面の単位面積あたりの標的配列のコピーの数でのハイブリダイズされた標的配列の表面密度は、オリゴヌクレオチドプライマーの表面密度を超過してもよい。
核酸表面増幅（ＮＡＳＡ）：本明細書で使用されるように、句「核酸表面増幅」（ＮＡＳＡ）は、句「固相核酸増幅」（あるいは単に「固体相増幅」）と交換可能に使用される。本開示のいくつかの態様では、改善された増幅速度、増幅特異性、および増幅効率を備えた核酸増幅調合物は、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスと組み合わせて記載される。本明細書に使用されるように、特異的増幅は、固体支持体に共有結合でまたは非共有結合でテザーされた鋳型ライブラリオリゴヌクレオチド鎖の増幅を指す。本明細書に使用されるように、非特異的増幅はプライマー二量体または他の非鋳型核酸の増幅を指す。本明細書に使用されるように、増幅効率は、所与の増幅サイクルまたは増幅反応中に成功裡に増幅される、支持表面上のテザーされたオリゴヌクレオチドのパーセンテージの指標である。本明細書に開示される表面上で実施される核酸増幅は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または、９８％あるいは９９％などの、９５％より大きい増幅効率を得る場合がある。
様々な熱循環または等温の核酸増幅スキームのいかなるものも、本開示の低結合の支持物と使用されてもよい。本開示の低結合支持体とともに利用され得る核酸増幅方法の例は、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ブリッジ増幅、等温ブリッジ増幅、ローリングサークル増幅、サークルトゥーサークル（ｃｉｒｃｌｅ－ｔｏ－ｃｉｒｃｌｅ）増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、レコンビナーゼ依存性増幅、あるいは単鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質依存性増幅を含む。
いくつかの例では、増幅速度、増幅特異性と増幅効率における改善は、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスを単独で、あるいは増幅反応成分の製剤との組み合わせで、使用して、達成され得る。ヌクレオチドの取り込みに加えて、１つ以上の複数のポリメラーゼ、ヘリカーゼ、一本鎖結合タンパク質（またはそれらの任意の組み合わせ）、増幅反応混合物は、性能を向上させるために、様々な方法で調整することができ、限定されないが、緩衝液の種類、緩衝液のｐＨ、有機溶媒の混合、緩衝液の粘度、洗浄剤および双性イオン成分、イオン強度（１価と２価のイオン濃度の調整を含む）酸化防止剤、還元剤、糖質、ＢＳＡ、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸、ベタイン、その他の添加剤などを選択することが挙げられる。
本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの、単独での、または改善あるいは最適化された増幅反応調合物と組み合わせての、使用は、増幅反応調合物、従来の支持物および増幅プロトコルを使用して得られたものと比較して、増加した増幅速度をもたらしてもよい。従来の支持体および増幅プロトコルを使用して得られるものと比較して、増幅速度の増加をもたらし得る。いくつかの例では、達成されることがある相対的な増幅速度は、上記のあらゆる増幅方法に従来の支持体と増幅プロトコルを使用した場合の、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１４倍、少なくとも１６倍、少なくとも１８倍、または、少なくとも２０倍であり得る。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの、単独での、または改善あるいは最適化された緩衝製剤と組み合わせての、使用は、これらの完了指標のいずれかについて、１８０分、１２０分、９０分、６０分、５０分、４０分、３０分、２０分、１５分、１０分、５分、３分、１分、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、または１０秒未満の総増幅反応時間（すなわち、増幅反応の９０％、９５％、９８％、または９９％の完了に達するのに必要な時間）をもたらし得る。
いくつかの例では、本開示の低結合支持体の、単独での、または改善あるいは最適化された増幅緩衝剤調合物と組み合わせての使用は、６０分、５０分、４０分、３０分、２０分、または１０分以下のより速い増幅反応時間（すなわち、増幅反応の９０％、９５％、９８％、または９９％の完了に達するのに必要な時間）を可能にする場合がある。同様に、本開示の低結合支持体の、単独での、または改善あるいは最適化された緩衝剤調合物と組み合わせての使用は、場合によっては、最大で２、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、最大で９、最大で１０、最大で１５、または最大で３０サイクルで増幅反応を完了させ得る。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの、単独での、または改善あるいは最適化された増幅反応調合物と組み合わせての、使用は、従来の支持体と増幅プロトコルを用いて得られるものと比較して、特異的な増幅の増加および／または非特異的な増幅の減少をもたらし得る。いくつかの例では、特異的増幅の、非特異的増幅に対する、達成され得る最終的な比率は、少なくとも、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、または、１，０００：１である。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの、単独での、または改善あるいは最適化された増幅反応調合物と組み合わせての、使用は、従来の支持体や増幅プロトコルを用いた場合に比べて、増幅効率の向上をもたらし得る。いくつかの例では、達成され得る増幅効率は、上記で規定された増幅反応時間のいずれかで、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％よりも優れている。
いくつかの例では、親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイス表面に付着されたオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマー分子にハイブリダイズされた、クローン的に増幅された標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子（または核酸分子）は、は、約０．０２キロベース（ｋｂ）～約２０ｋｂ、または約０．１キロベース（ｋｂ）～約２０ｋｂの長さに及び得る。いくつかの例では、クローン的に増幅された標的オリゴヌクレオチド分子は、少なくとも０．００１ｋｂ、少なくとも０．００５ｋｂ、少なくとも０．０１ｋｂ、少なくとも０．０２ｋｂ、少なくとも０．０５ｋｂ、少なくとも０．１ｋｂの長さ、少なくとも０．２ｋｂの長さ、少なくとも０．３ｋｂの長さ、少なくとも０．４ｋｂの長さ、少なくとも０．５ｋｂの長さ、少なくとも１ｋｂの長さ、少なくとも２ｋｂの長さ、少なくとも３ｋｂの長さ、少なくとも４ｋｂの長さ、少なくとも５ｋｂの長さ、少なくとも６ｋｂの長さ、少なくとも７ｋｂの長さ、少なくとも８ｋｂの長さ、少なくとも９ｋｂの長さ、少なくとも１０ｋｂの長さ、少なくとも１５ｋｂの長さ、または、少なくとも２０ｋｂの長さ、またはここに記載された範囲にわたるどんな中間値も、例えば、少なくとも０．８５ｋｂの長さ、であり得る。
いくつかの例では、クローン的に増幅された標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子（または核酸分子）は、一本鎖または二本鎖の、規則的に発生するモノマー単位の繰り返しをさらに含む多量体核酸分子（例えば、コンカタマー）を含み得る。いくつかの例では、クローン的に増幅された単鎖の、二本鎖の、多量体の核酸分子は、少なくとも０．１ｋｂの長さ、少なくとも０．２ｋｂの長さ、少なくとも０．３ｋｂの長さ、少なくとも０．４ｋｂの長さ、少なくとも０．５ｋｂの長さ、少なくとも１ｋｂの長さ、少なくとも２ｋｂの長さ、少なくとも３ｋｂの長さ、少なくとも４ｋｂの長さ、少なくとも５ｋｂの長さ、少なくとも６ｋｂの長さ、少なくとも７ｋｂの長さ、少なくとも８ｋｂの長さ、少なくとも９ｋｂの長さ、少なくとも１０ｋｂの長さ、少なくとも１５ｋｂの長さ、または少なくとも２０ｋｂの長さであり得、または、ここに記載した範囲にわたる、いかなる中間値でも、例えば、少なくとも約 ２．４５ｋｂの長さでもあり得る。
いくつかの例では、クローン的に増幅された標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子（または核酸分子）は、規則的に繰り返すモノマー単位の約２～約１００のコピーを含む、単鎖または二本鎖の、多量体の核酸（例えば、コンカテマー）分子を含み得る。いくつかの例では、規則的に繰り返すモノマー単位のコピーの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００であり得る。いくつかの例では、規則的に繰り返すモノマー単位のコピーの数は、最大で１００、最大で９５、最大で９０、最大で８５、最大で８０、最大で７５、最大で７０、最大で６５、最大で６０、最大で５５、最大で５０、最大で４５、最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２５、最大で２０、最大で１５、最大で１０、最大で５、最大で４、最大で３、または最大で２あり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、規則的に繰り返すモノマー単位のコピーの数は、約４～約６０に及び得る。当業者であれば、規則的に繰り返すモノマー単位のコピーの数は、この範囲内の任意の値、例えば、約１２を有してもよいことを認識するであろう。従って、いくつかの例において、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅効率が１００％未満であっても、支持表面の単位面積あたりの標的配列のコピーの数で、クローン的に増幅された標的配列の表面密度は、オリゴヌクレオチドプライマーの表面密度を超過してもよい。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの、単独での、または改善あるいは最適化された増幅反応調合物と組み合わせての、使用は、従来の支持体と増幅プロトコルを用いた場合に比べて、増幅コピー数の増加をもたらし得る。いくつかの例では、例えば、クローン的に増幅された標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子が、連結された、単量体標的配列の多量体反復を含む場合、クローンのコピー数は、従来の支持体と増幅プロトコルを使用して得られたものと比較して、実質的に小さいことがある。従って、いくつかの例では、クローンのコピー数は、増幅コロニーにつき、約１分子～約１００，０００分子（例えば、標的配列分子）に及び得る。いくつかの例では、クローンコピーの数は、増幅コロニーあたりの分子が、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、少なくとも８，０００、少なくとも９，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも３５，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも４５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも５５，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも６５，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも７５，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも８５，０００、少なくとも９０，０００、少なくとも９５，０００、または１００，０００であり得る。いくつかの例では、クローンコピーの数は、増幅コロニーあたりの分子が、最大で１００，０００、最大で９５，０００、最大で９０，０００、最大で８５，０００、最大で８０，０００、最大で７５，０００、最大で７０，０００、最大で６５，０００、最大で６０，０００、最大で５５，０００、最大で５０，０００、最大で４５，０００、最大で４０，０００、最大で３５，０００、最大で３０，０００、最大で２５，０００、最大で２０，０００、最大で１５，０００、最大で１０，０００、最大で９，０００、最大で８，０００、最大で７，０００、最大で６，０００、最大で５，０００、最大で４，０００、最大で３，０００、最大で２，０００、最大で１，０００、最大で５００、最大で１００、最大で５０、最大で１０、最大で５、または、最大で１であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、クローンコピーの数は約２，０００分子～約９，０００分子に及び得る。当業者であれば、コピー数の表面密度が、例えば、いくつかの例ではμｍ２あたり約２，２２０分子、またの他の例ではμｍ２あたり約２分子というように、この範囲内のどんな値を有してもよいことを認識するであろう。
上記に留意されるように、いくつかの例において、増幅された標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子（または核酸分子）は、連結された単量体標的配列の多量体反復を含み得る。いくつかの例では、増幅された標的（あるいは試料）オリゴヌクレオチド分子（あるいは核酸分子）は、多数の分子含むことがある、各々が単一の単量体標的配列を含み得る。このように、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの、単独での、または改善あるいは最適化された増幅反応調合物と組み合わせての、使用は、結果として、ｍ２あたり約１００標的配列コピーからｍｍｍ２あたり約１×１０１２標的配列コピーに及ぶ標的配列コピーの表面密度をもたらし得る。いくつかの例では、標的配列コピーの表面密度は、ｍｍ２あたりのクローン的に増幅された標的配列分子が、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも３５，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも４５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも５５，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも６５，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも７５，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも８５，０００、少なくとも９０，０００、少なくとも９５，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１５０，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも３５０，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも４５０，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも５５０，０００、少なくとも６００，０００、少なくとも６５０，０００、少なくとも７００，０００、少なくとも７５０，０００、少なくとも８００，０００、少なくとも８５０，０００、少なくとも９００，０００、少なくとも９５０，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１×１０７、少なくとも５×１０７、少なくとも１×１０８、少なくとも５×１０８、少なくとも１×１０９、少なくとも５×１０９、少なくとも１×１０１０、少なくとも５×１０１０、少なくとも１×１０１１、少なくとも５×１０１１、あるいは少なくとも１×１０１２であり得る。いくつかの例では、標的配列コピーの表面密度は、ｍｍ２あたりのクローン的に増幅された標的配列分子が、最大で１×１０１２、最大で５×１０１１、最大で１×１０１１、最大で５×１０１０、最大で１×１０１０、最大で５×１０９、最大で１×１０９、最大で５×１０８、最大で１×１０８、最大で５×１０７、最大で１×１０７、最大で５，０００，０００、最大で１，０００，０００、最大で９５０，０００、最大で９００，０００、最大で８５０，０００、最大で８００，０００、最大で７５０，０００、最大で７００，０００、最大で６５０，０００、最大で６００，０００、最大で５５０，０００、最大で５００，０００、最大で４５０，０００、最大で４００，０００、最大で３５０，０００、最大で３００，０００、最大で２５０，０００、最大で２００，０００、最大で１５０，０００、最大で１００，０００、最大で９５，０００、最大で９０，０００、最大で８５，０００、最大で８０，０００、最大で７５，０００、最大で７０，０００、最大で６５，０００、最大で６０，０００、最大で５５，０００、最大で５０，０００、最大で４５，０００、最大で４０，０００、最大で３５，０００、最大で３０，０００、最大で２５，０００、最大で２０，０００、最大で１５，０００、最大で１０，０００、最大で５，０００、最大で１，０００、最大で５００、または最大で１００であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、いくつかの例では、標的配列コピーの表面密度は、ｍｍ２あたり約１，０００の標的配列コピーから、ｍｍ２あたり約６５，０００の標的配列コピーに及び得る。当業者であれば、標的配列コピーの表面密度は、この範囲内の任意の値、例えば、ｍｍ２あたり約４９，６００標的配列コピーを有してもよいことを認識するであろう。
いくつかの例では、本開示の低結合支持体の、単独での、または改善あるいは最適化された増幅緩衝剤調合物と組み合わせての使用は、結果として、表面密度、ｍｍ２あたり約１００分子からｍｍ２あたり約１×１０１２コロニーに及ぶクローン的に増幅された標的（または試料）オリゴヌクレオチド分子（またはクラスタ）の表面密度をもたらし得る。いくつかの例では、クローン的に増幅された分子の表面密度は、ｍｍ２あたりの分子が、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも３５，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも４５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも５５，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも６５，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも７５，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも８５，０００、少なくとも９０，０００、少なくとも９５，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１５０，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも３５０，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも４５０，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも５５０，０００、少なくとも６００，０００、少なくとも６５０，０００、少なくとも７００，０００、少なくとも７５０，０００、少なくとも８００，０００、少なくとも８５０，０００、少なくとも９００，０００、少なくとも９５０，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１×１０７、少なくとも５×１０７、少なくとも１×１０８、少なくとも５×１０８、少なくとも１×１０９、少なくとも５×１０９、少なくとも１×１０１０、少なくとも５×１０１０、１×１０１１、少なくとも５×１０１１、または少なくとも１×１０１２であり得る。いくつかの例では、クローン的に増幅された分子の表面密度は、ｍｍ２あたりの分子が、最大で１×１０１２、最大で５×１０１１、最大で１×１０１１、最大で５×１０１０、最大で１×１０１０、最大で５×１０９、最大で１×１０９、最大で５×１０８、最大で１×１０８、最大で５×１０７、最大で１×１０７、最大で５，０００，０００、最大で１，０００，０００、最大で９５０，０００、最大で９００，０００、最大で８５０，０００、最大で８００，０００、最大で７５０，０００、最大で７００，０００、最大で６５０，０００、最大で６００，０００、最大で５５０，０００、最大で５００，０００、最大で４５０，０００、最大で４００，０００、最大で３５０，０００、最大で３００，０００、最大で２５０，０００、最大で２００，０００、最大で１５０，０００、最大で１００，０００、最大で９５，０００、最大で９０，０００、最大で８５，０００、最大で８０，０００、最大で７５，０００、最大で７０，０００、最大で６５，０００、最大で６０，０００、最大で５５，０００、最大で５０，０００、最大で４５，０００、最大で４０，０００、最大で３５，０００、最大で３０，０００、最大で２５，０００、最大で２０，０００、最大で１５，０００、最大で１０，０００、最大で５，０００、最大で１，０００、最大で５００、または、最大で１００であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、クローン的に増幅された分子の表面密度は、ｍｍ２あたり約５０００分子～ｍｍ２あたり約５００００分子に及び得る。当業者であれば、１つの表面密度は、この範囲内のどんな値、例えば、ｍｍ２あたり約４８，８００分子をも有し得ることを認識するであろう。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの、単独での、または改善あるいは最適化された増幅反応調合物と組み合わせての、使用は、増幅および標識された核酸集団からの、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、または５％未満などの５０％以下の変動係数を有する信号（例えば、蛍光信号）をもたらし得る。
同様に、いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスの、単独での、または改善あるいは最適化された増幅反応調合物と組み合わせての、使用は、増幅され及び非標識の核酸集団からの、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または５％未満などの５０％以下の変動係数を有する、信号をもたらし得る。
親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイス表面の蛍光撮像：本開示の、例えば、それ自体の上に標識された標的核酸分子のクローンのクラスタを堆積されて含む、親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスは、様々な核酸分析の応用のどんなものにおいても、例えば、核酸塩基識別、核酸塩基分類、核酸ベースコール、核酸検出の応用、核酸配列決定の応用、および核酸に基づく（遺伝学的およびゲノム的）診断の応用において、使用され得る。これらの応用の多くでは、蛍光画像処理技術が、低結合支持体上で実施される、ハイブリダイゼーション、増幅、および／または配列決定反応をモニタリングするために使用され得る。蛍光撮像は本明細書に開示される光学的撮像モジュール、並びに、様々なフルオロフォア、蛍光画像処理技術、および当業者に既知の他の蛍光撮像デバイス、のうちのいずれを使用して実行されてもよい。
いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングしたフローセルデバイスと反応緩衝液調合物を使用する核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅反応の実行は、蛍光画像処理技術を使用して評価されてもよく、ここで、画像のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は、増幅特異性と支持体上の非特異的結合の評価において重要な指標を提供する。ＣＮＲは、次のように一般的に定義される：ＣＮＲ＝（信号－バックグラウンド）／ノイズ。バックグラウンド項は、一般的に、特定された関心領域（ＲＯＩ）における特別の特徴（回折限界点（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｐｏｔ）、ＤＬＳ）を取り巻く隙間の領域について測定された信号とされる。上に留意されるように、信号対ノイズ比（ＳＮＲ）が信号品質全体のベンチマークであるとしばしば考えられているが、急速なキャプチャを必要とする撮像の応用（例えば、サイクルタイムが削減または最小化されるべき配列決定の応用）において、改善されたＣＮＲは、信号品質についてのベンチマークとしてＳＮＲに対する著しい利点を提供し得ることが示され得る。高いＣＮＲにおいて、正確な信号識別（従って、配列決定の応用の場合、的確なベースコール）に達するのに必要な撮像時間は、ＣＮＲにおける穏やかな改善でさえ徹底的に削減され得る。
ほとんどのアンサンブル・ベースの配列決定アプローチでは、バックグラウンド項は、典型的に、「隙間の」領域と関連づけられる信号として測定される。「隙間の」バックグラウンド（Ｂｉｎｔｅｒ）に加えて、「実質内の」バックグラウンド（Ｂｉｎｔｒａ）が、増幅されたＤＮＡコロニーによって占められる離散した領域内に存在する。これらの２つのバックグラウンド信号項の組み合わせは、画像中で達成可能なＣＮＲを指示し、および直接光学機械要件、アーキテクチャのコスト、試薬コスト、実行回数、コスト／ゲノム、および、最終的に、サイクリックアレイ・ベースの配列決定の応用のための正確さとデータ品質に影響を与える。Ｂｉｎｔｅｒバックグラウンドは様々な源から発生し、いくつかの例として、消費可能なフローセルの自家蛍光、ＲＯＩの前景信号を不明瞭にすることがある偽性の蛍光信号を産出する検出分子の非特異的吸着、および非特異的ＤＮＡ増幅産物（例えば、プライマー二量体から発生するもの）の存在が挙げられる。典型的な次世代配列決定（ＮＧＳ）の応用では、現在の視野（ＦＯＶ）におけるこのバックグラウンドは、経時的に平均され、減算される。個々のＤＮＡコロニー（すなわち、ＦＯＶ内の（Ｓ）－Ｂｉｎｔｅｒ）から発生する信号は、分類され得る識別可能な特徴をもたらす。いくつかの例では、実質内のバックグラウンド（Ｂｉｎｔｒａ）は、対象の標的に特有でないが、同じＲＯＩの中にある紛らわしい信号を増やし、それにより、平均し減算することがはるかに困難になり得る。
本開示の親水性のポリマーコーティングされた基板表面上の核酸増幅の実施は、非特異的結合を抑制することによりＢｉｎｔｅｒバックグラウンドを減少させる場合があり、特異的な核酸増幅の改善につながる場合があり、および、隙間領域と実質内領域の両方から生じるバックグラウンド信号に影響を与える非特異的増幅の減少につながる場合がある。いくつかの例では、改善されたハイブリダイゼーションおよび／または増幅反応緩衝剤調合物と組み合わせて随意に使用される本開示の低非特異的結合の支持表面は、従来の支持体とハイブリダイゼーション、増幅、および／または配列決定プロトコルを用いた場合と比較して、ＣＮＲを２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍に向上させ得る。本明細書では、蛍光撮像を読み出しまたは検出モードとして使用するコンテキストで記載してきたが、同じ原理は、光学的と非光学的の両方のモードを含む他の検出モードにおいても同様に、本開示の低非特異的結合支持体と核酸ハイブリダイゼーション並びに増幅調合物の使用に適用される。
代替的な配列決定生化学：上に記載されたヌクレオチドを配列決定の取り込みアプローチに加えて、本開示のフローセルデバイスと光学撮像システムは、他の新興の核酸配列決定生化学にも同様に適合する。例として、米国特許第１０，６５５，１７６ Ｂ２号に記載されている「ヌクレオチド結合による配列決定」アプローチ、および米国特許第１０，７６８，１７３ Ｂ２号に記載されている「無効性による配列決定」アプローチが挙げられる。
現在、Ｏｍｎｉｏｍｅ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）が開発している「核酸結合による配列決定」アプローチは、プライマー中への同族のヌクレオチドの共有結合の取り込みを予防する条件下で、鋳型に沿った各位置に３つの複合体（例えば、プライミングされた鋳型（試料支持構造にテザーされた）、ポリメラーゼ、およびその位置に対する同族ヌクレオチドを含む）を形成する安定化した複合体を検出するサイクルを繰り返し実行すること、および、次に、鋳型に沿って次の位置の検出を可能にするようにプライマーを拡張することに基づく。結合による配列決定アプローチでは、鋳型の各位置でのヌクレオチドの検出が次の位置へのプライマーの伸長に先立って生じる。一般的に、この方法論は、各タイプの三元複合体（すなわち、含まれるヌクレオチドのタイプが異なる、異なるタイプの三元複合体）を一意に標識するか、各タイプの三元複合体を形成するために必要な試薬を個別に送達することによって、核酸鋳型に沿った位置に存在し得る４つの異なるヌクレオチドタイプを区別するために使用される。いくつかの例では、標識は、例えば、同族のヌクレオチドや三元複合体の一部であるポリメラーゼを蛍光標識することを含む。前記アプローチは、従って、本開示のフローセルデバイスおよび撮像システムと適合する。
現在、Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって開発されている「アビディティによる配列決定」のアプローチは、複数の非共有結合性の相互作用からなる複合体の形成に由来するアビディティ（または「機能的親和性」）の増加に依存する。Ｅｌｅｍｅｎｔのアプローチは、蛍光標識されたポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲート、ポリメラーゼ、および試料支持構造にテザーされた複数のプライミングされた標的核酸分子の間に形成される多価の結合複合体の検出に基づき、これにより、検出／ベースコールの工程をヌクレオチド取り込みの工程から分離することが可能となっている。蛍光撮像は、結合した複合体を検出し、それによって標的核酸配列のＮ＋１ヌクレオチドのアイデンティティを決定するために使用される（ここで、プライマー延長鎖はＮヌクレオチドの長さである）。撮像の工程の後、多価の結合複合体は破壊され、および洗浄で除かれ、正しいブロックされたヌクレオチドがプライマー延長鎖に組み込まれ、このサイクルが繰り返される。
いくつかの例では、本開示のポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲートは、直接またはリンカーを介して、例えばヌクレオチドの５’末端を介して、ポリマーコアにコンジュゲートされた複数のヌクレオチド部分またはヌクレオチドアナログ部分を含み得る。非限定的な例として、ヌクレオチド部分は、リボヌクレオチド部分、リボヌクレオチドアナログ部分、デオキシリボヌクレオチド部分、デオキシリボヌクレオチドアナログ部分、あるいはそのいずれかの組み合わせを含み得る。いくつかの例では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、アデノシン、グアノシン、５－メチル－ウリジン、および／またはシチジンを含み得る。いくつかの例では、ヌクレオチドあるいはヌクレオチドアナログ部分は、ポリメラーゼ反応あるいは配列決定反応中の伸長を阻害するように修飾されたヌクレオチドを含む場合があり、ここで、少なくとも１つのヌクレオチドあるいはヌクレオチドアナログは、３’水酸基を欠くヌクレオチド、３’位置でブロック基を含有するように修飾されたヌクレオチド、および／または、３’－０－アジド基、３’－０－アジドメチル基、３’－０－アルキルヒドロキシルアミノ基、３’－ホスホロチオエート、３つの’－０－マロニル基、または３’－０－ベンジル基で修飾されたヌクレオチドなどである。
いくつかの例では、ポリマーコアは線状または分岐状ポリマーを含む場合があり、例えば、線状または分岐状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ－グリシン、ポリ酢酸ビニル、デキストラン、タンパク質、または、前掲の任意の２つ以上のポリマーを取り込む、あるいは当該技術分野で既知の他のポリマーを取り込む、他のそのようなポリマーあるいはコポリマーが挙げられる。いくつかの例では、ポリマー部分はＰＥＧを含む。いくつかの例では、ポリマーは分岐状ＰＥＧである。いくつかの例では、分岐状ポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３の、１４、１５、あるいは１６以上の分岐またはアーム、または２、４、８、１６、３２、あるいは６４以上の分岐あるいはアームを含み得る。いくつかの例では、分岐またはアームは、中央部分から放射する場合がある。
いくつかの例では、ポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲートは、１つ以上の検知可能な標識、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２０以上の検知可能な標識をさらに含み得る。いくつかの例では、１つ以上の検知できるラベルは、１つ以上フルオロフォア（例えば、シアニン色素３（Ｃｙ３）、シアニン色素５（Ｃｙ５）など）、１つ以上量子ドット、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナー、および／または、ＦＲＥＴ受容体を含む場合がある。
いくつかの例では、ポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲートは、ポリマーコアの各分岐または分岐のサブセットに付着された結合部分をさらに含み得る。適切な結合部分の例として、限定されないが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、など、ポリヒスチジンドメイン、相補対核酸ドメイン、Ｇ－カルテット形成核酸ドメイン、カルモジュリン、マルトース結合タンパク質、セルラーゼ、マルトース、スクロース、グルタチオン－Ｓ－転移酵素、グルタチオン、０－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ベンジルグアニンとその誘導体、ベンジルシステイン（ｂｅｎｚｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）とその誘導体、抗体、エピトープ、Ａタンパク質、または、Ｇタンパク質が挙げられる。結合部分は、タンパク質間で、タンパク質と核酸との間で、タンパク質リガンドと間で、核酸間で、または小分子相互作用ドメインあるいは部分の間で、結合または相互作用を促進することが当該技術分野において知られている任意の相互作用分子あるいは断片であり得る。
上に留意されるように、アビディティによる配列決定のアプローチでは、ポリマーヌクレオチド・コンジュゲートのヌクレオチド部分が標的配列のヌクレオチド残基に相補的であるとき、例えば、蛍光標識されたポリマーヌクレオチド・コンジュゲート、ポリメラーゼと、試料支持構造（例えば、フローセル表面）にテザーされた複数のプライミングされた標的核酸分子との間で、多価結合複合体が形成される。このように形成された、多価結合複合体の安定性は、配列決定反応サイクルの検出／ベースコールの工程が、ヌクレオチド取り込みの工程から分離されることを可能にする。
多価結合複合体－ポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲートの２つ以上のヌクレオチド部分、２つ以上のポリメラーゼ分子、および２つ以上のプライミングされた標的核酸配列の間で形成される３元複合体－の安定性は、複合体の持続時間の長さによって証拠づけられている。例えば、いくつかの例では、前記多価結合複合体（三元複合体）は、０．５秒未満、１秒未満、１秒を超える、２秒を超える、３秒を超える、４秒を超える、５秒を超える、１０秒を超える、１５秒を超える、２０秒を超える、３０秒を超える、６０秒を超える、１２０秒を超える、３６０秒を超える、７２０秒を超える、１，４４０秒を超える、３，６００秒を超える、またはこれらの値のいずれか２つ以上で定義される範囲内の持続時間を有し得る。
ポリメラーゼとプライミングされた標的核酸との多価結合複合体を形成するポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲートの使用は、結果として、単一の非コンジュゲートのヌクレオチドやテザーされていないヌクレオチドを用いた場合の平均的なヌクレオチド濃度の何倍にもなるヌクレオチドの有効局所濃度をもたらし、続いて、複合体の安定性が向上し、洗浄の工程後の信号強度が増加する。高い信号強度は、結合、洗浄、および撮像の工程全体にわたって存続し、および、より短い画像取得時間に寄与する。撮像工程に続いて、多価結合複合体は、例えば、イオン組成、イオン強度、および／または緩衝液のｐＨを変えることによって不安定化され、洗い流され得る。その後、相補鎖を１塩基だけ伸長するために、プライマー伸長反応が実行され得る。
核酸配列決定システム性能：いくつかの例では、本開示の光学撮像システムの１つ以上と組み合わせて使用される本開示のフローセルデバイスの１つ以上を含む、および上に記載された「トラッピングによる配列決定」（または「アビディティによる配列決定」）アプローチなどの新興の配列決定生化学のうちの１つを随意に利用する、本開示の核酸配列決定システムは、例えば、試料投入要求の削減、画像取得サイクル時間の削減、還元された配列決定反応サイクル時間の削減、配列決定実行時間の削減、ベースコール精度の改善、試薬と消費とコストの削減、より高い配列決定スループット、および配列決定コストの削減の点で、核酸配列決定性能の改善をもたらし得る。
核酸試料の投入（ｐＭ）：いくつかの例では、本開示のシステムのための試料投入要求は、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスと撮像システムを使用することで、改善されたハイブリダイゼーションと到達し得る増幅効率、および、ベースコールについて取得され得る高ＣＮＲの画像によって、有意に削減され得る。いくつかの例では、本開示のシステムのための核酸サンプル投入要求は約１ｐＭから約１０，０００ｐＭに及び得る。いくつかの例では、核酸サンプルの投入要求は、少なくとも１ｐＭ、少なくとも２ｐＭ、少なくとも５ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも１，０００ｐＭ、少なくとも２，０００ｐＭ、少なくとも５，０００ｐＭ、少なくとも１０，０００ｐＭであり得る。いくつかの例では、本開示のシステムのための核酸試料の投入要求は、最大で１０，０００ｐＭ、最大で５，０００ｐＭ、最大で２，０００ｐＭ、最大で１，０００ｐＭ、最大で５００ｐＭ、最大で２００ｐＭ、最大で１００ｐＭ、最大で５０ｐＭ、最大で２０ｐＭ、最大で１０ｐＭ、最大で５ｐＭ、最大で２ｐＭ、または最大で１ｐＭであり得る。この段落に記載されている下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、本開示のシステムのための核酸試料の投入要求は、約５ｐＭ～約５００ｐＭに及び得る。当業者であれば、核酸試料の投入要求は、この範囲内の任意の値、例えば、約１３２ｐＭを有してもよいことを認識するであろう。１つの典型的な例では、約１００ｐＭの核酸試料投入は信頼できるベースコールの信号を生成するのに十分である。
核酸試料の投入（ナノグラム）：いくつかの例では、本開示のシステムのための核酸サンプルの投入要求は、約０．０５ナノグラム～約１，０００ナノグラムに及び得る。いくつかの例では、核酸試料の投入要求は、少なくとも０．１ナノグラム、少なくとも０．２ナノグラム、少なくとも０．４ナノグラム、少なくとも０．０５ナノグラム、少なくとも０．６ナノグラム、少なくとも０．８ナノグラム、少なくとも１．０ナノグラム、少なくとも２ナノグラム、少なくとも４ナノグラム、少なくとも６ナノグラム、少なくとも８ナノグラム、少なくとも１０ナノグラム、少なくとも２０ナノグラム、少なくとも４０ナノグラム、少なくとも６０ナノグラム、少なくとも８０ナノグラム、少なくとも１００ナノグラム、少なくとも２００ナノグラム、少なくとも４００ナノグラム、少なくとも６００ナノグラム、少なくとも８００ナノグラム、または、少なくとも１，０００ナノグラムであり得る。いくつかの例では、核酸試料の投入要求は、最大で１，０００ナノグラム、最大で８００ナノグラム、最大で６００ナノグラム、最大で４００ナノグラム、最大で２００ナノグラム、最大で１００ナノグラム、最大で８０ナノグラム、最大で６０ナノグラム、最大で４０ナノグラム、最大で２０ナノグラム、最大で１０ナノグラム最大で８ナノグラム、最大で６ナノグラム、最大で４ナノグラム、最大で２ナノグラム、最大で１ナノグラム、最大で０．８ナノグラム、最大で０．６ナノグラム、最大で０．４ナノグラム、最大で０．２ナノグラム、最大で０．１ナノグラム、または、最大で０．０５ナノグラムであり得る。この段落に記載されている下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、本開示のシステムのための核酸試料の投入要求は、約０．６ナノグラム～約４００ナノグラムに及び得る。当業者であれば、核酸試料の投入要求は、この範囲内の任意の値、例えば、約２．６５ナノグラムを有してもよいことを認識するであろう。
フローセルをタイル化するために必要とされるＦＯＶ画像：いくつかの例では、本開示の光学撮像モジュールの視野（ＦＯＶ）は十分に大きいため、本開示のマルチチャネル（またはマルチレーン）のフローセル（すなわち、それらの流体チャネル部分）は、約１０のＦＯＶ画像（または「フレーム」）から約１，０００のＦＯＶ画像（または「フレーム」）までのタイル化（ｔｉｌｉｎｇ）によって撮像され得る。いくつかの例では、マルチチャネルのフローセル全体の画像は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、または、少なくとも１，０００のＦＯＶ画像（あるいは「枠」）のタイル化を必要とし得る。いくつかの例では、マルチチャネルのフローセル全体の画像は、最大で１，０００、最大で９５０、最大で９００、最大で８５０、最大で８００、最大で７５０、最大で７００、最大で６５０、最大で６００、最大で５５０、最大で５００、最大で４５０、最大で４００、最大で３５０、最大で３００、最大で２５０、最大で２００、最大で１５０、最大で１００、最大で９０、最大で８０、最大で８０、最大で７０、最大で６０、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、または、最大で１０のＦＯＶ画像（あるいは「枠」）のタイル化を必要とし得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、マルチチャネルのフローセル全体の画像は、約３０～約１００のＦＯＶ画像のタイル化を必要とし得る。当業者であれば、必要とされるＦＯＶ画像の数は、この範囲内の任意の値、例えば、約５４のＦＯＶ画像であり得ることを認識するであろう。
撮像サイクル時間：いくつかの例では、大きなＦＯＶ、画像センサー応答感度、および／または、速いＦＯＶ翻訳時間の組み合わせは、撮像サイクル時間（つまり、マルチチャネルのフローセル全体（あるいはその流路部分）をタイル化するためにＦＯＶ画像の十分な数を取得するために必要とされる時間）の短縮を可能にする。いくつかの例では、撮像サイクル時間は、約１０秒から約１０分に及び得る。いくつかの例では、撮像サイクル時間は、少なくとも１０秒、少なくとも２０秒、少なくとも３０秒、少なくとも４０秒、少なくとも５０秒、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、または、少なくとも１０分であり得る。いくつかの例では、撮像サイクル時間は、最大で１０分、最大で９分、最大で８分、最大で７分、最大で６分、最大で５分、最大で４分、最大で３分、最大で２分、最大で１分、最大で５０秒、最大で４０秒、最大で３０秒、最大で２０秒、または、最大で１０秒であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、層の画像化サイクルは約２０秒～約１分に及び得る。当業者であれば、撮像サイクル時間は、この範囲内の任意の値、例えば、約５７秒であり得ることを認識するであろう。
配列決定サイクル時間：いくつかの例では、短くされた配列決定反応の工程は、例えば、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルための削減された洗浄時間の条件により、結果として配列決定サイクル時間全体の短縮をもたらし得る。いくつかの例では、本開示のシステムのための配列決定サイクル時間は、約１分から約６０分に及び得る。いくつかの例では、配列決定サイクル時間は、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分、少なくとも３０分、少なくとも３５分、少なくとも４０分、少なくとも４５分、少なくとも５０分、少なくとも５５分、または、少なくとも６０分であり得る。いくつかの例では、配列決定反応サイクル時間は、最大で６０分、最大で５５分、最大で５０分、最大で４５分、最大で４０分、最大で３５分、最大で３０分、最大で２５分、最大で２０分、最大で１５分、最大で１０分、最大で９分、最大で８分、最大で７分、最大で６分、最大で５分、最大で４分、最大で３分、最大で２分、または、最大で１分であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、配列決定サイクル時間は、約２分～約１５分に及び得る。当業者であれば、撮像サイクル時間は、この範囲内の任意の値、例えば、約１分、１２秒であり得ることを認識するであろう。
配列決定読み取り長さ：いくつかの例では、本開示の親水性のポリマーコーティングされたフローセルデバイスを、本開示の撮像システムと、場合によってはより穏やかな配列決定生化学の使用と、組み合わせて使用して達成し得る、高められたＣＮＲの画像は、本開示のシステムのためのより長い配列決定読み取り長さを可能にし得る。いくつかの例では、最大（単一の読み取り）読み取り長さは、約５０ｂｐ～約５００ｂｐに及び得る。いくつかの例では、最大（単一の読み取り）読み取り長さは、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも３５０ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも４５０ｂｐ、または、少なくとも５００ｂｐであり得る。いくつかの例では、最大（単一の読み取り）読み取り長さは、最大で５００ｂｐ、最大で４５０ｂｐ、最大で４００ｂｐ、最大で３５０ｂｐ、最大で３００ｂｐ、最大で２５０ｂｐ、最大で２００ｂｐ、最大で１５０ｂｐ、最大で１００ｂｐ、または、最大で５０ｂｐである。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、最大（単一の読み取り）読み取り長さは、約１００ｂｐ～約４５０ｂｐに及び得る。当業者であれば、最大（単一の読み取り）読み取り長さは、この範囲内の任意の値、例えば、約３８０ｂｐであり得ることを認識するであろう。
配列決定実行時間：いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムのための配列決定実行時間は、約８時間から約２０時間に及び得る。いくつかの例では、配列決定実行時間は、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、または、少なくとも２０時間である。いくつかの例では、配列決定実行時間は、最大で２０時間、最大で１８時間、最大で１６時間、最大で１４時間、最大で１２時間、最大で１０時間、最大で９時間、または、最大で８時間である。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、配列決定実行時間は、約１０時間～約１６時間に及び得る。当業者であれば、配列決定実行時間は、この範囲内の任意の値、例えば、約７時間、３５分であり得ることを認識するであろう。
平均ベースコール精度：いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、配列決定実行の過程にわたって、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または、少なくとも９９．９％正確な平均ベースコール精度を提供し得る。いくつかの例では、開示された核酸配列決定システムは、ベースコールされた１，０００塩基ごとに、１０、００００塩基ごとに、２５，０００塩基ごとに、５０，０００塩基ごとに、７５，０００塩基ごとに、または、１００，０００塩基ごとに、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または、少なくとも９９．９％正確な平均ベースコール精度を提供し得る。
平均Ｑスコア：いくつかの例では、実行される配列決定の品質または正確さは、Ｐｈｒｅｄクオリティスコア（クオリティスコアあるいは「Ｑスコア」とも呼ばれる）の計算によって評価されることがあり、該スコアは、所与の塩基が配列決定システムによって不正確にコールされる確率を示す。例えば、いくつかの例では、特定の配列決定化学および／または配列決定システムのためのベースコールの精度は、既知の核酸配列のライブラリについての配列決定の実行から得られる大きな経験的データセットに対して評価され得る。その後、Ｑスコアは以下の方程式によって計算され得る：
Ｑ＝－１０ｌｏｇ１０Ｐ
式中、Ｐはベースコールのエラーの確率である。例えば、Ｑスコア３０は、ベースコールのエラーを、ベースコールされた１０００塩基ごとに１にする確率（あるいは、９９．９％のベースコール精度）を示す。
いくつかの例では、開示された核酸配列決定システムはより精密なベースコールを提供し得る。いくつかの例では、例えば、本開示の核酸配列決定システムは、配列決定実行にわたるベースコール精度として約２０～約５０に及ぶＱスコアをもたらし得る。いくつかの例では、当該実行のための平均Ｑスコアは、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、あるいは少なくとも５０であり得る。当業者は、平均Ｑスコアが、例えば、約３２など、この範囲内のどんな値を有してもよいことを認識するだろう。
Ｑスコア対同定ヌクレオチド％：いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、同定された末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％について、２０を超えるＱスコアを提供し得る。いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、同定された末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％について、２５を超えるＱスコアを提供し得る。いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、同定された末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％について、３０を超えるＱスコアを提供し得る。いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、同定された末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％について、３５を超えるＱスコアを提供し得る。いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、同定された末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％について、４０を超えるＱスコアを提供し得る。いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、同定された末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％について、４５を超えるＱスコアを提供し得る。いくつかの例では、核酸配列決定のための本開示の組成物と方法は、同定された末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％について、５０を超えるＱスコアを提供し得る。
試薬の消費：いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、例えば、流体チャネルの容量およびデッドボリュームを最小化する本開示のフローセルデバイスと流体工学システムの使用によって、より低い試薬消費速度およびコストを有し得る。いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサーによって消費される配列決定Ｇｂａｓｅあたりの平均試薬体積より、少なくとも５％小さい、少なくとも１０％小さい、少なくとも１５％小さい、少なくとも２０％小さい、少なくとも２５％小さい、少なくとも３０％小さい、少なくとも３５％小さい、少なくとも４０％小さい、少なくとも４５％小さい、または、少なくとも５０％小さい体積の試薬しか必要としない場合がある。
配列決定のスループット：いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、約５０Ｇｂａｓｅ／実行から約２００Ｇｂａｓｅ／実行まで及ぶ配列決定スループットを提供し得る。いくつかの例では、配列決定スループットは、少なくとも５０Ｇｂａｓｅ／実行、少なくとも７５Ｇｂａｓｅ／実行、少なくとも１００Ｇｂａｓｅ／実行、少なくとも１２５Ｇｂａｓｅ／実行、少なくとも１５０Ｇｂａｓｅ／実行、少なくとも１７５Ｇｂａｓｅ／実行または、少なくとも２００Ｇｂａｓｅ／実行であり得る。いくつかの例では、配列決定スループットは、最大で２００Ｇｂａｓｅ／実行か、最大で１７５Ｇｂａｓｅ／実行、最大で１５０Ｇｂａｓｅ／実行、最大で１２５Ｇｂａｓｅ／実行、最大で１００Ｇｂａｓｅ／実行、最大で７５Ｇｂａｓｅ／実行、または、最大で５０Ｇｂａｓｅ／実行であり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、配列決定スループットは、約７５Ｇｂａｓｅ／実行～約１５０Ｇｂａｓｅ／実行に及び得る。当業者であれば、配列決定スループットは、この範囲内の任意の値、例えば、約１１９Ｇｂａｓｅ／実行であり得ることを認識するであろう。
配列決定のコスト：いくつかの例では、本開示の核酸配列決定システムは、Ｇｂａｓｅにつき約５ドル（＄５）からＧｂａｓｅにつき約３０ドルに及ぶコストで核酸配列決定を提供し得る。いくつかの例では、配列決定コストは、Ｇｂａｓｅあたり少なくとも５ドル、Ｇｂａｓｅあたり少なくとも１０ドル、Ｇｂａｓｅあたり少なくとも１５ドル、Ｇｂａｓｅあたり少なくとも２０ドル、Ｇｂａｓｅあたり少なくとも２５ドル、または、Ｇｂａｓｅあたり少なくとも３０ドルであり得る。いくつかの例では、配列決定コストは、Ｇｂａｓｅあたり最大で３０ドル、Ｇｂａｓｅあたり最大で２５ドル、Ｇｂａｓｅあたり最大で２０ドル、Ｇｂａｓｅあたり最大で１５ドル、Ｇｂａｓｅあたり最大で１０ドル、または、Ｇｂａｓｅあたり最大で３０ドルであり得る。この段落に記載される下限値と上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、配列決定実行時間は、Ｇｂａｓｅあたり約１０ドル～Ｇｂａｓｅあたり約１６ドルに及び得る。当業者であれば、配列決定コストは、この範囲内の任意の値、例えば、Ｇｂａｓｅあたり約７．２５ドル、であり得ることを認識するであろう。
これらの実施例は説明目的のために提供されるにすぎず、請求項の範囲を制限するものではない。
実施例１－ゲノミクスに応用するための蛍光撮像モジュールの設計仕様
本開示の蛍光撮像モジュールの設計仕様の非限定的な例は、テーブル１に提供される。
表１．ゲノミクスに応用するための蛍光撮像モジュールの設計仕様の例。
Figure 2022540970000002
実施例２－ガラスのマイクロ流体フローセルデバイスの作製
フローセルとして使用されるマイクロ流体デバイスのウエハスケールの作製は、図３６Ａから図３６Ｃに例示される処理と、集束フェムト秒レーザー光剥離および／またはレーザガラスボンディングなどの処理技術とを使用して、ガラス、例えば、ホウケイ酸ガラス、溶融シリカガラス、または石英ガラスの、例えば１、２、あるいは３層から構築することができる。
図３６Ａでは、ウエハ材を剥離しパターン化された表面を提供するために、第１のウエハがレーザー（例えば、フェムト秒レーザー光線を生成するレーザー）で処理される。パターン化されたウエハ面は、複数のマイクロ流体デバイス（例えば、２１０ｍｍ直径のウエハあたり１２のデバイス）を含み得、該マイクロ流体デバイスのそれぞれは、複数の流体チャネルを含み得る。その後、処理されたウエハは、例えば、フィルムでシーリングするか又は当該デバイスを別の支持表面にクランプすることによって後で随意に密閉されてもよい開放された流体チャネルを含む個々のマイクロ流体チップを作るために、さいの目に切られ得る。
図３６Ｂでは、第１のウエハは、パターン化された表面を作るために処理され、その後、流路を密閉するために第２のウエハに接して置かれ、および結合され得る。使用される材料（例えばガラスウエハ、シリコンウエハなど）に依存して、結合は、例えば、熱結合処理、陽極結合処理、レーザガラス結合処理など使用して、実施され得る。第２のウェハは、パターン化された表面を持つウェハ上の溝、くぼみ、および／または開口部を被覆および／または密封して、２つのウェハ構成要素の界面にデバイスの流体チャネルおよび／または流体チャンバ（例えば、内部部分）を形成する。その後、結合構造は、個々のマイクロ流体チップ（例えば、２１０ｍｍ直径のウエハあたり１２のマイクロ流体チップ）へと、さいの目に切られ得る。
図３６Ｃでは、第１のウエハは、ウエハの全厚みを貫通してカットされるかエッチングされる（すなわち、ウエハのどちらの表面も開いている）流体チャネルのパターンを生成するために処理される。その後、第１のウエハは、片側に第２のウエハ、および別の側に第３のウエハがあるように、間にはさまれ、および両者に結合される。使用される材料（例えばガラスウエハ、シリコンウエハなど）に依存して、結合は、例えば、熱結合処理、陽極結合処理、レーザガラス結合処理など使用して、実施され得る。第２および第３のウェハは、パターン化された第１のウェハ上の溝、くぼみ、および／または開口部を被覆および／または密封して、デバイスの流体チャネルおよび／または流体チャンバ（例えば、内部部分）を形成する。その後、結合構造は、個々のマイクロ流体チップ（例えば、２１０ｍｍ直径のウエハあたり１２のマイクロ流体チップ）へと、さいの目に切られ得る。
実施例３－親水性ポリマーによるフローセル表面のコーティング
ガラスフローセルデバイスは、準備されたガラスチャネルを洗浄し、その後、エタノールで洗浄し、次に３０分間６５℃にてシラン化することにより、コーティングされた。流体チャネル表面を、３０分間ＥＤＣ－ＮＨＳで活性化し、その後、活性化した表面を２０分間５μｍプライマーでインキュベーションすることによりオリゴヌクレオチドプライマーをグラフトし、そして、アミノ基でテザーされたポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＮＨ２）３０μｍを用いて不動態化を行なった。
多重層の表面は、上に記載されたアプローチに従って作製され、ここで、ＰＥＧ－ＮＨ２不動態化工程の後で、マルチアームのＰＥＧ－ＮＨＳを流体チャネル通して流し、続いて、さらなるＰＥＧ－ＮＨ２を追加し、続いて、随意に、ＰＥＧ－ＮＨＳでさらにインキュベーションし、そして、随意に、マルチアームのＰＥＧ－ＮＨ２でさらにインキュベートした。これらの表面については、プライマーはどの工程でも、特に最後のマルチアームのＰＥＧ－ＮＨ２の添加に続いて、グラフトされ得る。
実施例４－核酸配列決定のためのフローセルデバイス
図３７Ａは、１ピースのガラスマイクロ流体チップ／フローセル設計の非限定的な例を図示する。この設計では、流体チャネルおよび入口／出口孔は、例えば、集光フェムト秒レーザー光線使用して、作製され得る。フローセルデバイスには２つの流体チャネル（「レーン」）があり、および、各流体チャネルは、例えば、２つの行の各々に２６のフレームを含み（すなわち、「フレーム」が対応する撮像モジュールの視野と同等の画像域である場合）、その結果、２×２６＝５２画像へのタイル化は全流体チャネルを撮像するために十分である。流体チャネルは、例えば、約１００μｍの深さを有し得る。流体チャネル１は入口孔Ａ１および出口孔Ａ２を有し、および、流体チャネル２は、入口孔Ｂ１および出口孔Ｂ２を有する。フローセルデバイスは、また、１Ｄライナー、人間が読み取り可能および／または機械読取り可能なバーコード、および随意に２Ｄマトリックスバーコードを含み得る。
図３７Ｂは、２ピースのガラスマイクロ流体チップ／フローセル設計の非限定的な例を図示する。この設計では、流体チャネルおよび入口／出口孔は、例えば、集光フェムト秒レーザー光線、またはフォトリトグラフィー、および化学エッチングを使用して、作製され得る。２つのピースは、上に記載されるような様々な技術のうちのいずれかを使用して、ともに結合され得る。入口孔および出口孔は、最上層に配置され得、および、デバイスの内部部分に形成された流体チャネルおよび／または流体チャンバの少なくとも１つとの流体連通にあるように配向され得る。フローセルデバイスには、２つの流体チャネルがあり、および、図３７Ａで例示したデバイスのように、各流体チャネルは、例えば、各々に２６のフレームがある２つの行を含む。流体チャネルは、例えば、約１００μｍの深さを有し得る。流体チャネル１は入口孔Ａ１および出口孔Ａ２を有し、および、流体チャネル２は、入口孔Ｂ１および出口孔Ｂ２を有する。フローセルデバイスは、また、１Ｄライナー、人間が読み取り可能および／または機械読取り可能なバーコード、および随意に２Ｄマトリックスバーコードを含み得る。
図３７Ｃは、３ピースのガラスマイクロ流体チップ／フローセル設計の非限定的な例を図示する。この設計では、流体チャネルおよび入口／出口孔は、例えば、集光フェムト秒レーザー光線、またはフォトリトグラフィー、および化学エッチングを使用して、作製され得る。３つのピースは、上に記載されるような様々な技術のうちのいずれかを使用して、ともに結合され得る。第１のウエハ（貫通パターンの流体チャネルまたは流体チャンバを含む）は、片側に第２のウエハ、および別の側に第３のウエハがあるように、間にはさまれ、および両者に結合され得る。入口孔および孔は、最上層に配置され得、および、デバイスの内部部分に形成された流体チャネルおよび／または流体チャンバの少なくとも１つとの流体連通にあるように配向され得る。フローセルデバイスには、２つの流体チャネルがあり、および、図３７Ａと図３７Ｂで例示したデバイスのように、各流体チャネルは、各行に２６のフレームがある２つの行を有する。流体チャネルは、例えば、約１００μｍの深さを有し得る。流体チャネル１は入口孔Ａ１および出口孔Ａ２を有し、および、流体チャネル２は、入口孔Ｂ１および出口孔Ｂ２を有する。フローセルデバイスは、また、１Ｄライナー、人間が読み取り可能および／または機械読取り可能なバーコード、および随意に２Ｄマトリックスバーコードを含み得る。
実施例５－キャピラリーフローセルにおける核酸クラスタの撮像
核酸クラスタをキャピラリー内に定着させ、蛍光撮像にかけた。当該試験のために、キャピラリーチューブを有するフローデバイスを使用した。最終的なクラスタ画像の一例を、図３８に示す。前記図面は、本明細書に記載されるようなキャピラリーフローセルデバイスのルーメン内での増幅によって形成された核酸クラスタは、確実に形成され、および視覚化され得ることを実証した。
実施例６－プラスチック試料支持構造
いくつかの例では、本開示の試料支持構造は、ポリマーから作製され得る。試料支持構造、例えば、キャピラリーフローセルデバイス、を作製する材料の例としては、限定されないが、溶融、ポリマー（、ポリスチレン（ＰＳ）、マクロポーラスポリスチレン（ＭＰＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
ガラス基板とプラスチック基板の両方を含む様々な組成も企図されている。本明細書に開示される表面コーティング用途のためのポリマー表面の修飾は、表面を、アミンを含む他の化学基（－Ｒ）で反応的にすることを必要とする。適切な基板上に準備されたとき、これらの反応的な表面は、例えば、いくつかの例では、少なくとも３か月以上、室温での長期保存が可能である。そのような表面は、本明細書に別記されるように、核酸の表面上増幅（ｏｎ－ｓｕｒｆａｃｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のために、Ｒ－ＰＥＧおよびＲプライマーオリゴマーでさらにグラフトされ得る。環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック表面は、当技術分野において既知の様々な方法のうちのいずれかを使用して、修飾され得る。例えば、それらは、アミンなどの様々な化学基に対して数カ月間反応的なままであり得る親水性表面を作り出すために、Ｔｉで処置することができる：サファイアレーザーアブレーション、ＵＶを媒介としたエチレングリコールメタクリルレート光グラフト法、プラズマ処置、または機械的撹拌（例えば、サンドブラスト、または研磨など）。その後、これらの化学基は、生化学的活性を損失せずに、ＰＥＧなどの不動態化ポリマー、または、ＤＮＡあるいはタンパク質などの生体分子とコンジュゲートすることが可能になる。例えば、ＤＮＡプライマーオリゴマーの付着は、不動態化されたプラスチック表面上のＤＮＡ増幅を可能にし、一方で、タンパク質、フルオロフォア分子、または他の疎水性分子の非特異的な吸着を抑制または最小化する。
付加的に、いくつかの例において、表面修飾は、パターン化された表面を生成するために、レーザー印刷、またはＵＶマスキングと組み合わされ得る。これは、ＤＮＡオリゴマー、タンパク質、または他の部分のパターン化された付着を可能にして、表面に基づく酵素活性、結合、検出、または処理を提供する。例えば、ＤＮＡオリゴマーは、パターン化された特徴内でのみＤＮＡを増幅するために、または、増幅された長鎖ＤＮＡコンカテマーをパターン化されたかたちで捕捉するために、使用され得る。いくつかの実施形態では、パターン化された領域に、溶液ベースの基質と反応する能力がある酵素の島が生成され得る。プラスチック表面がこれらの処理モードに特に適用可能であるため、本明細書に意図されるようないくつかの実施形態では、プラスチックの試料支持表面またはフローセルデバイスが、とりわけ有利であることが認められてもよい。
さらに、プラスチックは、ガラス基板よりももっと容易に、マイクロ流体デバイスを含むあらゆる形態を形成するために、射出成形、エンボス加工、型押し、または３Ｄプリントすることができ、および、従って、複数の構成、例えば、バイオマーカー検出あるいはＤＮＡ塩基配列決定のための、試料から結果までのマイクロ流体チップにおいて、生体試料の結合と分析のための表面を作り出すために使用することができる。
修飾されたプラスチック表面上での特異的かつ局所的なＤＮＡ増幅は、蛍光標識でプローブしたとき、超高コントラスト／ノイズ比と超低バックグラウンドの核酸スポットを生成することができる。
アミン－プライマーとアミン－ＰＥＧで親水化されたアミン反応性の環状オレフィンポリマー表面は、調製することができ、およびローリングサークル増幅を支持することが説明されてきた。フルオロフォアで標識されたプライマーでプローブされたとき、または標識されたｄＮＴＰｓがポリメラーゼによってハイブリダイズされたプライマーに添加されたとき、ＤＮＡ増幅の輝点が観察され、該輝点は、極めて低いバックグラウンドで１００を超える信号対ノイズ比を有して、非常に特異的な増幅、および、非特異的なタンパク質や疎水性の蛍光体の結合が非常に少ないことを示し、それらは、蛍光ベースのＤＮＡシーケンサーなどのシステムに求められる高精度な検出を証明する。
実施例７－配列決定ために構造化照明撮像システムを使用した予見的な例
図４１に例示された非限定的な例などの構造化照明撮像システム（４１００）が、核酸配列決定を実施するための低非特異的結合表面を含むフローセル（４１８７）と組み合わせて使用され得る。標的核酸配列を、フローセル（４１８７）の内部の低非特異的結合表面（４１８８）に高い表面密度で付着されたアダプタ／プライマー配列にハイブリダイズし、および前記表面が特異的なハイブリダイゼーションおよび増幅速度を高めるように特別に調合したハイブリダイゼーションおよび増幅用緩衝剤を使用して、クローン的に増幅した。
フローセル（４１８７）を、構造化照明撮像システム（４１００）にマウントし、および、例えば、上に記載されたポリマーヌクレオチドのコンジュゲート化学と図４０に例示されたワークフローの使用を含む配列決定反応サイクルを始めた。ポリマーヌクレオチド・コンジュゲートのヌクレオチド部分が標的配列のヌクレオチドに相補的な場合に多価結合複合体を形成するように、蛍光で標識されたポリマーヌクレオチド・コンジュゲートをフローセル（４１８７）の中へ導入し、および、表面（４１８８）に接触させた。その後、過剰で結合されていないポリマーヌクレオチド・コンジュゲートをすすぎ落とした。
各検出工程について、表面（４１８８）に照明光縞模様を投影するために照明光路の少なくとも１つの分岐の中で、および光学の相モジュレーター、例えば、（４１４０Ａ）、のいくつかの様々な位置で、回折格子（例えば４１３０Ａ）の様々な配向を使用して表面（４１８８）の一連の画像を捕捉した。画像取得の後、回折限界光学を単独で使用して達成可能なものよりも高い解像度の画像を生成するために、画像再構成アルゴリズム使用して一連の画像を処理した。前記処理は、フローセルの内部表面のタイル化された画像を作り出すために、表面（４１８８）上のいくつかの位置に対して反復され得る。随意に、第２のフローセル内部表面（４１８９）のより高い解像度の画像を生成するために、焦点面が調節されることがあり、および、前記処理が反復されることがある。
高いコントラスト対ノイズ比の画像（本開示の低結合表面と多重標識ポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲート配列決定化学を使用して達成される）と、フローセル表面を超解像で撮像するための構造化照明撮像システムを用いて取得した比較的少数の画像の効率的な処理とを組み合わせる（したがって、標的配列クラスタのより高い表面密度を使用することができる）ことは、全体的なシーケンシングスループットの向上に貢献し得る。
実施例８－多重読取りヘッドをデュアル表面撮像に使用する先駆的な例
図４４Ａと図４４Ｂに概略的に説明したような多重読取りヘッドは、デュアルに表面撮像を実行するように設計されている。読取りヘッドは、互いに対して一定位置に保持されるように組み立てられる複数のマイクロフルオロメーターを含み、および、各々の表面の一区画の画像を取得するために１対の対向したフローセル内部表面に水平な方向に走査され得る。図４４Ａで例示されるように、複数のマイクロフルオロメーターの第１の部分集合は初めにフローセルの内部表面の画像を取得するように構成され、また、複数のマイクロフルオロメーターの第２の部分集合は、第１の内部表面に対面し及び間に入っている流体チャネルの厚みだけそれから分離されている第２のフローセル内部表面の画像を取得するように構成される。
核酸配列決定を実施するために、低非特異的結合表面コーティングを含むフローセルを使用する。標的核酸配列は、フローセルの内部の低非特異的結合表面へ付着されたアダプター／プライマー配列にハイブリダイズされ、前記表面が特定のハイブリダイゼーションと増幅速度を増強するために特に調合されたハイブリダイゼーションおよび増幅用緩衝液を使用して、クローン的に増幅される。
フローセルを多重化された読取りヘッドを備えた撮像システムに取り付けて、上記ポリマー－ヌクレオチド・コンジュゲート化学と図４０に示されたワークフローの使用を含む配列決定反応サイクルを開始する。蛍光標識されたポリマーヌクレオチド・コンジュゲートをフローセルに導入し、内部表面と接触させることで、ポリマーヌクレオチドコンジュゲートのヌクレオチド部分が標的配列のヌクレオチドと相補的であれば、多価の結合複合体を形成する。その後、過剰で結合されていないポリマーヌクレオチド抱合体はすすぎ落とされる。各々の検出工程について、オートフォーカスの機構が多重読み取りヘッドの対物レンズとフローセルの少なくとも１つの内部表面との間で適切な作動距離を保っている間に、多重読み取りヘッドは、少なくともフローセルの内部表面に平行な１つの方向に走査され（または、フローセルは多重読み取りヘッドに相対的に走査されてもよい）、および、第１および第２の内部フローセル表面の両方の画像は、図４４Ｂにおいて例示されるように、同時に取得される。
フローセルの単一路走査を使用して、両方のフローセル表面を同時に撮像する性能は、（読み取りヘッドの設計に依存して）配列決定スループットにおける著しい改善を提供し得る。
追加的に番号付けされた実施形態
１．核酸分子の配列決定をするためのシステムであって、前記システムは、
ａ）内部表面に連結される複数の刺激された標的核酸配列を含む内部表面を有するフローセルであって、複数の刺激された標的核酸配列の１つの刺激された標的核酸配列はそれに結合されるポリメラーゼを有する、フローセルと、
ｂ）試薬をフローセルの内部表面への連続的および反復的な送達を制御するように構成された流体流動コントローラーと、
ｃ）撮像モジュールであって、前記撮像モジュールは、
ｉ）構造化された照明システムと、
ｉｉ）フローセルの内部表面の画像を取得するように構成された画像取得システムと、を含む、撮像モジュールと、
ｄ）プロセッサであって、プロセッサは反復性の方法を実施するためのシステムを指示するようにプログラムされ、前記方法は、
ｉ）ヌクレオチド組成物のヌクレオチドの部分が刺激された標的核酸配列のヌクレオチドに相補的であるとき、複数の刺激された標的核酸配列と複数のヌクレオチドの部分との間で一過性の結合複合体を形成するために、フローセルの内部表面に連結された複数の刺激された標的核酸配列をヌクレオチド組成物と接触させる工程と、
ｉｉ）一過性の結合複合体を検出し、それによって刺激された標的核酸配列のヌクレオチドの同一性を判定するため、フローセルの内部表面を撮像する工程と、を含むプロセッサと、を含むシステム。
２．構造化された照明システムはフローセルの内部表面で光の周期性パターンを投影するように設定された光学システムを含み、光の複数の周期性パターンの相対方位または位相シフトは既知の方法で変化し得る、請求項１に記載のシステム。
３．構造化された照明システムは、光を放射するための第１の光エミッタと、フローセルの内部表面で第１の複数の縞を投影するために第１の光エミッタによって放射された光を分割するための第１のビームスプリッタと、を含む第１の光学アームを含む、請求項１に記載のシステム。
４．構造化された照明システムは、光を放射するための第２の光エミッタと、フローセルの内部表面で第２の複数の縞を投影するために第２の光エミッタによって放射された光を分割するための第２のビームスプリッタと、を含む第２の光学アームをさらに含む、請求項３に記載のシステム。
５．構造化された照明システムは、第１のアームおよび第２のアームの光路を結びつけるために光学要素をさらに含む、請求項４に記載のシステム。
６．第１のビームスプリッタは第１の透過する回折格子を含み、第２のビームスプリッタは第２の透過する回折格子を含む、請求項４または請求項５に記載のシステム。
７．第１の光エミッタおよび第２の光エミッタは無偏光を放射し、第１の透過する回折格子および第２の透過する回折格子は、第１の光エミッタおよび第２の光エミッタのそれぞれの１つによって放射された無偏光を回折することである、請求項４または請求項５に記載のシステム。
８．第１の複数の縞および第２の複数の縞の光路を結びつけるための光学要素は穴のあるミラーを含み、ミラーは第１の透過する回折格子によって回折された光を反射するように設けられ、穴は第２の透過する回折格子によって回折された光の少なくとも１次を通過するように設けられる、請求項６または請求項７に記載のシステム。
９．システムであって、前記システムは、第１の複数の縞および第２の複数の縞を位相シフトさせるための１つ以上の光学要素、をさらに含む、請求項８に記載のシステム。
１０．第１の複数の縞および第２の複数の縞を位相シフトさせるための１つ以上の光学要素は、第１の複数の縞を位相シフトさせるための第１の回転する光学窓および第２の複数の光学縞を位相シフトさせるための第２の回転する光学窓を含む、請求項９に記載のシステム。
１１．第１の複数の縞および第２の複数の縞を位相シフトさせるための１つ以上の光学要素は、第１の回折格子を並進させるための第１の直動ステージおよび第２の回折格子を並進させるための第２の直動ステージを含む、請求項９または請求項１０に記載のシステム。
１２．第１の複数の縞および第２の複数の縞を位相シフトさせるための１つ以上の光学要素は、単一の回転する光学窓を含み、単一の回転する光学窓はサンプルへの光路における穴のあるミラーの後ろに位置する、請求項９から１１のいずれか１つに記載のシステム。
１３．単一の回転する光学窓の回転軸は、格子の各々の光軸から約４５度相殺される、請求項１２に記載のシステム。
１４．第１の複数の縞は、サンプル平面で第２の複数の縞から約９０度角度的に相殺される、請求項９から１３のいずれか１つに記載のシステム。
１５．サンプルは長方形アレイまたは六角形アレイで規則的にパターン化される複数の特徴を含む、請求項１４に記載のシステム。
１６．システムであって、前記システムは、サンプルで第１の複数の縞および第２の複数の縞の各々を投影するための対物レンズ、をさらに含む、請求項９から１５のいずれか１つに記載のシステム。
１７．システムであって、前記システムは、第１の回折格子および第２の回折格子の各々によって放射された光の０次をブロックするための１つ以上の光学ビームブロッカー、をさらに含む、請求項９から１６のいずれか１つに記載のシステム。
１８．１つ以上の光学ビームブロッカーはブラッグ格子を含む、請求項１７に記載のシステム。
１９．第１のアームおよび第２のアームの光路を結びつけるための光学要素は、偏光ビームスプリッタを含み、第１の回折格子は偏光を垂直に回折し、第２の回折格子は偏光を水平に回折する、請求項６から１８のいずれか１つに記載のシステム。
２０．第１のビームスプリッタおよび第２のビームスプリッタの各々は、ビームスプリッタキューブまたはビームスプリッタプレートを含む、請求項４から１９のいずれか１つに記載のシステム。
２１．第１のビームスプリッタは第１の反射回折格子を含み、および第２のビームスプリッタは第２の反射回折格子を含む、請求項３から２０のいずれか１つに記載のシステム。
２２．構造化された照明システムは、複数のビームスプリッタがシステムの光軸に対して固定された配向を有するように、直線の並進ステージで取り付けられた複数のビームスプリッタを含む多数のビームスプリッタスライドを含む、請求項１から２１のいずれか１つに記載のシステム。
２３．複数のビームスプリッタは複数の回折格子を含む、請求項２２に記載のシステム。
２４．複数の回折格子は２つの回折格子を含む、請求項２３に記載のシステム。
２５．構造化された照明システムは、フローセルの内部表面で１次元の回折パターンを投影するために、空間フィルタホイールとの組み合わせで使用される固定された２次元の回折格子を含む、請求項１から２４のいずれか１つに記載のシステム。
２６．画像取得システムはカスタムチューブレンズを含み、カスタムチューブレンズは、対物レンズとの組み合わせにおいて実質的に同じ画像解像度で第１の内部のフローセルの表面および第２の内部のフローセルの表面の撮像することを可能にする、請求項１から２５のいずれか１つに記載のシステム。
２７．ヌクレオチド組成物はコンジュゲートされたポリマーヌクレオチド組成物を含む、請求項１から２６のいずれか１つに記載のシステム。
２８．コンジュゲートされたポリマーヌクレオチド組成物はポリマーコアにコンジュゲートされた複数のヌクレオチドの部分を含む、請求項２７に記載のシステム。
２９．複数のヌクレオチドの部分はヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２８に記載のシステム。
３０．複数のヌクレオチドの部分は複数の同一のヌクレオチドの部分を含む、請求項２８または請求項２９に記載のシステム。
３１．一過性の結合複合体を形成する前に、ヌクレオチド組成物にはポリメラーゼが不足している、請求項１から３０のいずれか１つに記載のシステム。
３２．核酸分子の配列決定をする方法であって、前記方法は、
ａ）表面にテザーされる複数の刺激された標的核酸配列を提供する工程であって、複数の刺激された標的核酸配列の１つの刺激された標的核酸配列はそれに結合されるポリメラーゼを有する工程と、
ｂ）ヌクレオチド組成物のヌクレオチドの部分が、刺激された標的核酸配列のヌクレオチドに相補的であるとき、複数の刺激された標的核酸配列と複数のヌクレオチドの部分との間で一過性の結合複合体を形成するために、複数の刺激された標的核酸配列をヌクレオチド組成物と接触させる工程と、
ｃ）刺激された標的核酸配列のヌクレオチドの同一性を判定するために、一過性の結合複合体を検出する工程であって、前記検出する工程は、
ｉ）表面上で特定の方向において配向された第１の複数の縞を投影するために、第１のセットの照明条件下で構造化された照明システムによって提供される光で表面を照明することと、
ｉｉ）表面の第１の複数の位相画像を捕捉することであって、第１の複数の画像を捕捉する間、第１の複数の縞の位置は表面上でシフトされる、捕捉することと、
ｉｉｉ）表面上で第２の複数の縞を投影するために第２のセットの照明条件下で構造化された照明システムによって提供される光で表面を照明することであって、第２の複数の縞は表面上で第１の複数の縞から角度的に相殺される、照明することと、
ｉｖ）第２の複数の縞で照明された表面の第２の複数の位相画像を捕捉することであって、第２の複数の縞を捕捉する間、第２の複数の縞の位置は表面上でシフトされる、捕捉することと、を含む、検出する工程と、を含む、方法。
３３．構造化された照明システムは、表面上で特定の方向において配向された第１の複数の縞を投影するために、光を放射するための第１の光エミッタおよび第１の光エミッタによって放射された光を回折するための第１の回折格子を含む第１の光学アームを含む、請求項３２に記載の方法。
３４．構造化された照明システムは、表面上で第１の複数の縞から角度的に相殺される第２の複数の縞を投影するために、光を放射するための第２の光エミッタおよび第２の光エミッタによって放射された光を回折するための第２の回折格子を含む第２の光学アームを含む、請求項３３に記載の方法。
３５．構造化された照明システムは、複数のビームスプリッタがシステムの光軸に対して固定された配向を有するように、直線の並進ステージで取り付けられた複数のビームスプリッタを含む多数のビームスプリッタスライドを含み、第１のセットの照明条件は直線の並進ステージの第１の位置に対応し、第２のセットの照明条件は直線の並進ステージの第２の位置に対応する、請求項３２から３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．複数のビームスプリッタは複数の回折格子を含む、請求項３５に記載の方法。
３７．複数の回折格子は２つの回折格子を含む、請求項３６に記載の方法。
３８．構造化された照明システムは、表面上で１次元の回折パターンを投影するために、空間フィルタホイールとの組み合わせで使用される固定された２次元の回折格子を含み、第１のセットの照明条件は空間フィルタホイールの第１の位置に対応し、第２のセットの照明条件は空間フィルタホイールの第２の位置に対応する、請求項３２から３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．第１の回折格子および第２の回折格子は透過する回折格子であり、構造化された照明システムは、第１の回折格子によって回折された光を反射させるため、および第２の回折格子によって回折された光の少なくとも１次を通過するための、穴のあるミラーを含む、請求項３４から３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．方法は、第１の複数の捕捉された位相画像および第２の複数の捕捉された位相画像の各々よりも高い解像度を有する１つ以上の画像を計算的に再構築するために、少なくとも第１の複数の捕捉された位相画像および第２の複数の位相画像を使用する工程をさらに含む、請求項３２から３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．第１の複数の縞は表面上で第２の複数の縞から約９０度角度的に相殺される、請求項４０に記載の方法。
４２．表面は長方形アレイまたは六角形アレイで規則的にパターン化される複数の特徴を含む、請求項３２から４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．第１の複数の縞および第２の複数の縞は、表面と第１の回折格子および第２の回折格子の各々との間の光路において位置する単一の光学窓を回転させることによって位相シフトされ、単一の回転する光学窓の回転軸は、回折格子の各々の光軸から相殺される、請求項３２から４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．第１の複数の位相画像を捕捉した後、第１の光学アームをオフにして、構造化された照明システムの第２の光学アームをオンにする、請求項３４から４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．第１の回折格子および第２の回折格子は、画像捕捉の間、機械的に固定される、請求項３４から４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．ヌクレオチド組成物はコンジュゲートされたポリマーヌクレオチド組成物を含む、請求項３２から４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．コンジュゲートされたポリマーヌクレオチド組成物はポリマーコアにコンジュゲートされた複数のヌクレオチドの部分を含む、請求項４６に記載の方法。
４８．複数のヌクレオチドの部分は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４７に記載の方法。
４９．複数のヌクレオチドの部分は、複数の同一のヌクレオチドの部分を含む、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
５０．方法は、刺激された標的核酸配列のプライマー鎖のＮ＋１または末端ヌクレオチドの同一性を判定するために使用される、請求項３２から４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．一過性の結合複合体を形成する前に、ヌクレオチド組成物にはポリメラーゼが不足している、請求項３２から５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．検出機器であって、前記検出機器は、
ａ）複数のマイクロフルオロメータを含む読み取りヘッドアセンブリであって、複数のマイクロフルオロメータは多重読み取りヘッドを形成するために互いに対して固定位置で保持され、複数のマイクロフルオロメータの第１のサブセットの少なくとも１つは第１のサンプル平面の異なる面積の広フィールド画像を取得するように構成され、複数のマイクロフルオロメータの第２のサブセットの少なくとも１つは第２のサンプル平面の異なる面積の広フィールド画像を取得するように構成される、読み取りヘッドアセンブリ、を含む、検出機器。
５３．検出機器は、第１のサンプル平面および第２のサンプル平面に平行な少なくとも１つの方向で読み取りヘッドアセンブリを移動させるように構成される並進ステージをさらに含む、請求項５２に記載の検出機器。
５４．検出機器は第１の内部表面が第１のサンプル平面で保持され、第２の内部表面が第２のサンプル平面で保持されるように、第１の内部表面および第２の内部表面を含むフローセルを保持するように構成されるサンプルステージをさらに含む、請求項５２または請求項５３に記載の検出機器。
５５．複数のマイクロフルオロメータの少なくとも１つのマイクロフルオロメータは、少なくとも１ｍｍの視野を有する広フィールド画像を取得するように構成される、請求項５２から５４のいずれか１つに記載の検出機器。
５６．複数のマイクロフルオロメータの少なくとも１つのマイクロフルオロメータは、少なくとも１．５ｍｍの視野を有する広フィールド画像を取得するように構成される、請求項５２から５５のいずれか１つに記載の検出機器。
５７．マイクロフルオロメータの少なくとも１つは特化したオートフォーカス機構をさらに含む、請求項５２から５６のいずれか１つに記載の検出機器。
５８．第１のマイクロフルオロメータのためのオートフォーカス機構は、第２のマイクロフルオロメータのためのオートフォーカス機構からのデータを統合するように構成され、それによって、第１のマイクロフルオロメータのためのオートフォーカス機構は、第１のマイクロフルオロメータのフォーカス位置および第２のマイクロフルオロメータのフォーカス位置に基づいて、第１のマイクロフルオロメータのフォーカスを変化させる、請求項５７に記載の検出機器。
５９．個々のマイクロフルオロメータは対物レンズ、ビームスプリッタ、および検出器をさらに含み、ビームスプリッタは、励起の放射線源から対物レンズまでの励起の放射線を方向付けるように、および対物レンズから検出器まで発光放射を方向付けるように位置する、請求項５２から５８のいずれか１つに記載の検出機器。
６０．少なくとも１つの個々のマイクロフルオロメータは、個々の励起の放射線源をさらに含む、請求項５９に記載の検出機器。
６１．励起の放射線源は、２つ以上の個々のマイクロフルオロメータが励起の放射線源を共有するように、励起の放射線を複数のうちの２つ以上の個々のマイクロフルオロメータの対物レンズに方向付けする、請求項５９または請求項６０に記載の検出機器。
６２．複数のうちの２つ以上の個々のマイクロフルオロメータは、少なくとも２つの励起の放射線源をさらに含むか、あるいは共有する、請求項５９から６１のいずれか１つに記載の検出機器。
６３．複数の個々のマイクロフルオロメータの対物レンズは、０．２と０．５との間の開口数を有する、請求項５９から６２のいずれか１つに記載の検出機器。
６４．複数のマイクロフルオロメータは、５０ミクロン未満離れている特徴を区別するためには十分な解像度で画像を取得するように構成される、請求項５２から６３のいずれか１つに記載の検出機器。
６５．複数のマイクロフルオロメータは、フローセルの第１の内部表面と第２の内部表面との間の分離距離よりも小さい被写界深度を有するように構成される、請求項５２から６４のいずれか１つに記載の検出機器。
６６．複数のマイクロフルオロメータの第１のサブセットは第１の蛍光発光の波長で広フィールド画像を取得するように構成され、複数のマイクロフルオロメータの第２のサブセットは第２の蛍光発光の波長で広フィールド画像を取得するように構成される、請求項５２から６５のいずれか１つに記載の検出機器。
６７．標的核酸配列中のヌクレオチドの同一性を判定する方法であって、前記方法は、
ａ）複数の刺激された標的核酸配列を提供する工程であって、複数の刺激された標的核酸配列の１つの刺激された標的核酸配列はそれに結合されるポリメラーゼを有する、工程と、
ｂ）ヌクレオチド組成物のヌクレオチドの部分が刺激された標的核酸配列のヌクレオチドに相補的である場合、複数の刺激された標的核酸配列と複数のヌクレオチドの部分との間で一過性の結合複合体を形成するために、複数の刺激された標的核酸配列をヌクレオチド組成物と接触させる工程と、
ｃ）刺激された標的核酸配列のヌクレオチドの同一性を判定するために一過性の結合複合体を検出する工程であって、前記検出する工程は、
複数の刺激された標的核酸配列がテザーされる表面に平行な少なくとも１つの方向で多重読み取りヘッドを並進させることを含み、
多重読み取りヘッドは互いに対して固定位置で保持される複数のマイクロフルオロメータを含み、
複数のマイクロフルオロメータの少なくとも１つのマイクロフルオロメータは複数の他のマイクロフルオロメータとは異なる表面の面積の広フィールド画像を取得するように構成される、工程と、を含む、方法。
６８．ヌクレオチド組成物はコンジュゲートされたポリマーヌクレオチド組成物を含む、請求項６７に記載の方法。
６９．コンジュゲートされたポリマーヌクレオチド組成物はポリマーコアにコンジュゲートされた複数のヌクレオチドの部分を含む、請求項６８に記載の方法。
７０．複数のヌクレオチドの部分は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６９に記載の方法。
７１．複数のヌクレオチドの部分は複数の同一のヌクレオチドの部分を含む、請求項６９または請求項７０に記載の方法。
７２．方法は、刺激された標的核酸配列のプライマー鎖のＮ＋１または末端ヌクレオチドの同一性を判定するために使用される、請求項６７から７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．一過性の結合複合体を形成する前に、ヌクレオチド組成物にはポリメラーゼが不足している、請求項６７から７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．複数の刺激された標的核酸配列はフローセルの第１の内部表面および第２の内部表面にテザーされ、複数のマイクロフルオロメータの第１のサブセットはフローセルの第１の内部表面の異なる面積の広フィールド画像を取得するように構成され、複数のマイクロフルオロメータの第２のサブセットはフローセルの第２の内部表面の異なる面積の広フィールド画像を取得するように構成される、請求項６７から７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．核酸分子を配列決定するためのシステムであって、前記システムは、
ａ）内部表面に連結される複数の刺激された標的核酸配列を含む少なくとも１つの内部表面を有するフローセルであって、複数の刺激された標的核酸配列の１つの刺激された標的核酸配列はそれに結合されるポリメラーゼを有する、フローセルと、
ｂ）試薬をフローセルの少なくとも１つの内部表面への連続的および反復的な送達を制御するように構成された流体フローコントローラと、
ｃ）フローセルの少なくとも１つの内部表面を撮像するように構成された撮像モジュールであって、前記撮像モジュールは、
互いに対して固定位置で保持される複数のマイクロフルオロメータを含む多重読み取りヘッドであって、
複数のマイクロフルオロメータの少なくとも１つのマイクロフルオロメータは複数の他のマイクロフルオロメータとは異なる少なくとも１つの表面の面積の広フィールド画像を取得するように構成される、多重読み取りヘッド、を含む、撮像モジュールと、
ｄ）プロセッサであって、プロセッサは反復的な方法を実施するようにシステムに指示するようにプログラムされ、前記プロセッサは、
ｉ）ヌクレオチド組成物のヌクレオチドの部分が刺激された標的核酸配列のヌクレオチドに相補的であるとき、複数の刺激された標的核酸配列と複数のヌクレオチドの部分との間で一過性の結合複合体を形成するために、フローセルの少なくとも１つの内部表面に連結された複数の刺激された標的核酸配列をヌクレオチド組成物と接触させることと、
ｉｉ）一過性の結合複合体を検出し、それによって刺激された標的核酸配列のヌクレオチドの同一性を判定するために多重読み取りヘッドを使用してフローセルの少なくとも１つの内部表面を撮像することと、を含む、プロセッサと、を含む、システム。
７６．ヌクレオチド組成物はコンジュゲートされたポリマーヌクレオチド組成物を含む、請求項７５に記載のシステム。
７７．コンジュゲートされたポリマーヌクレオチド組成物はポリマーコアにコンジュゲートされた複数のヌクレオチドの部分を含む、請求項７６に記載のシステム。
７８．複数のヌクレオチドの部分は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７７に記載のシステム。
７９．複数のヌクレオチドの部分は複数の同一のヌクレオチドの部分を含む、請求項７７または請求項７８に記載のシステム。
８０．方法は、刺激された標的核酸配列のプライマー鎖のＮ＋１または末端ヌクレオチドの同一性を判定するために使用される、請求項７５から７９のいずれか１つに記載のシステム。
８１．一過性の結合複合体を形成する前に、ヌクレオチド組成物にはポリメラーゼが不足している、請求項７５から８０のいずれか１つに記載のシステム。
８２．複数の刺激された標的核酸配列はフローセルの第１の内部表面および第２の内部表面にテザーされ、複数のマイクロフルオロメータの第１のサブセットはフローセルの第１の内部表面の異なる面積の広フィールド画像を取得するように構成され、複数のマイクロフルオロメータの第２のサブセットはフローセルの第２の内部表面の異なる面積の広フィールド画像を取得するように構成される、請求項７５から８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．第１のサンプル平面および第２のサンプル平面に平行な少なくとも１つの方向で多重読み取りヘッドアセンブリを移動させるように構成される並進ステージをさらに含む、請求項７５から８２のいずれか１つに記載のシステム。
８４．複数のマイクロフルオロメータの少なくとも１つのマイクロフルオロメータは、少なくとも１ｍｍの視野を有する広フィールド画像を取得するように構成される、請求項７５から８３のいずれか１つに記載のシステム。
８５．複数のマイクロフルオロメータの少なくとも１つのマイクロフルオロメータは、少なくとも１．５ｍｍの視野を有する広フィールド画像を取得するように構成される、請求項７５から８４のいずれか１つに記載のシステム。
８６．マイクロフルオロメータの少なくとも１つは、特化したオートフォーカス機構をさらに含む、請求項７４から８５のいずれか１つに記載のシステム。
８７．第１のマイクロフルオロメータのためのオートフォーカス機構は、第２のマイクロフルオロメータのためのオートフォーカス機構からのデータを統合するように構成され、それによって、第１のマイクロフルオロメータのためのオートフォーカス機構は、第１のマイクロフルオロメータのフォーカス位置および第２のマイクロフルオロメータのフォーカス位置に基づいて、第１のマイクロフルオロメータのフォーカスを変化させる、請求項８６に記載のシステム。
８８．複数の個々のマイクロフルオロメータは対物レンズ、ビームスプリッタ、および検出器をさらに含み、ビームスプリッタは、励起放射源から対物レンズへ励起放射を方向付けるように、および対物レンズから検出器へ発光放射を方向付けるように位置する、請求項７５から８７のいずれか１つに記載のシステム。
８９．少なくとも１つの個々のマイクロフルオロメータは、個々の励起放射源をさらに含む、請求項８８に記載のシステム。
９０．励起放射源は、２つ以上の個々のマイクロフルオロメータが励起の放射線源を共有するように、励起の放射線を複数の２つ以上の個々のマイクロフルオロメータの対物レンズに方向付ける、請求項８９に記載のシステム。
９１．複数の２つ以上の個々のマイクロフルオロメータは、少なくとも２つの励起の放射線源をさらに含むか、あるいは共有する、請求項８８から９０のいずれか１つに記載のシステム。
９２．複数の個々のマイクロフルオロメータの対物レンズは、０．２と０．５との間の開口数を有する、請求項８８から９１のいずれか１つに記載のシステム。
９３．複数のマイクロフルオロメータは、５０ミクロン未満離れている特徴を区別するのに十分な解像度で画像を取得するように構成される、請求項７５から９２のいずれか１つに記載のシステム。
９４．複数のマイクロフルオロメータは、フローセルの第１の内部表面と第２の内部表面との間の分離距離よりも小さい被写界深度を有するように構成される、請求項８２から９３のいずれか１つに記載のシステム。
９５．複数のマイクロフルオロメータの第１のサブセットは第１の蛍光発光の波長で広フィールド画像を取得するように構成され、複数のマイクロフルオロメータの第２のサブセットは第２の蛍光発光の波長で広フィールド画像を取得するように構成される、請求項８２から９４のいずれか１つに記載のシステム。
９６．核酸分子の配列決定をする方法であって、前記方法は、
ａ）表面を提供する工程であって、前記表面は、
ｉ）基板と、
ｉｉ）少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層と、
ｉｉｉ）少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層に付着した複数のオリゴヌクレオチド分子と、
ｉｖ）前記複数の付着したオリゴヌクレオチド分子に固定化された複数のクローン増幅されたサンプル核酸分子を含む前記表面の少なくとも１つの分離した領域であって、前記複数の固定化されたクローン増幅されたサンプル核酸分子はλ／（２＊ＮＡ）未満の距離で存在し、λは励起エネルギー源の中心波長であり、およびＮＡは撮像システムの開口数である、領域と、を含む、工程と、
ｂ）前記複数のクローン増幅されたサンプル核酸分子に、確率的な光子スイッチングによって最大４つの異なる色でオンとオフの事象で蛍光を発光させるために、確率的な光子スイッチング化学を前記複数のクローン増幅されたサンプル核酸分子に同時に適用する工程と、
ｃ）前記クローン増幅されたサンプル核酸分子のヌクレオチドの同一性を判定するために、オンとオフの事象が前記複数のクローン増幅されたサンプル核酸分子に対して発生しているときに、リアルタイムで各色の色チャネルにおける前記オンとオフの事象を検出する工程と、を含む、方法。
９７．前記確率的な光子スイッチングのための試薬の濃度は、前記複数のクローン増幅されたサンプル核酸分子の所与のクローン増幅されたサンプル核酸分子の所与のヌクレオチドのオン事象が、前記所与のクローン増幅されたサンプル核酸分子に隣接するクローン増幅されたサンプル核酸分子の所与のヌクレオチドのオン事象と同時に発生する可能性が約０．５％未満となるのに十分である、請求項９６に記載の方法。
９８．所与のクローン増幅されたサンプル核酸分子の所与のヌクレオチドのオン事象が、前記所与のクローン増幅されたサンプル核酸分子に隣接するクローン増幅されたサンプル核酸分子のヌクレオチドのオン事象と同時に発生する可能性を制御するために、前記オンとオフ事象が発生する割合を制御する工程をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
９９．前記オンとオフ事象が発生する前記割合を制御する工程は、前記確率的な光子スイッチング化学において、ヌクレオチドおよび酵素の濃度を調整することを含む、請求項９８に記載の方法。
１００．色チャネルにおける検出事象の照明強度は所定の閾値よりも大きいかどうかを判定する工程をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
１０１．色チャネルにおける検出事象のスポットサイズは所定の閾値よりも大きいかどうかを判定する工程をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
１０２．少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層はＰＥＧを含む、請求項９６に記載の方法。
１０３．検出する工程は前記表面の画像を取得することを含み、前記画像は少なくとも４０のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示す、請求項９６に記載の方法。
１０４．検出する工程は前記表面の画像を取得することを含み、前記画像は少なくとも６０のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示す、請求項９６に記載の方法。
１０５．前記基板はガラスを含む、請求項９６に記載の方法。
１０６．前記基板はプラスチックを含む、請求項９６に記載の方法。
１０７．前記表面はフローチャネルの内側に位置する、請求項９６に記載の方法。
１０８．前記少なくとも１つの親水性ポリマー層は少なくとも８つの分岐を有する分岐親水性ポリマーを含む、請求項９６に記載の方法。
１０９．前記少なくとも１つの分離した領域から側方に変位した前記表面の領域で測定されたバックグラウンド蛍光強度は、前記クローン増幅よりも前に、前記少なくとも１つの分離した領域で測定された強度のわずか２倍である、請求項９６に記載の方法。
１１０．前記サンプル核酸分子は、定期的に発生するモノマー単位の反復を含む一本鎖の多量体の核酸分子を含む、請求項９６に記載の方法。
１１１．前記一本鎖の多量体の核酸分子は少なくとも１０ｋｂの長さである、請求項１１０に記載の方法。
１１２．定期的に発生するモノマー単位の二本鎖のモノマーコピーをさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
１１３．前記表面は、前記基板の表面にテザーされるポリマー分子の単層を含む第１の層と、前記第１の層の前記ポリマー分子にテザーされるポリマー分子を含む第２の層と、前記第２の層の前記ポリマー分子にテザーされるポリマー分子を含む第３の層とを含み、少なくとも層で分岐ポリマー分子を含む、請求項９６に記載の方法。
１１４．前記第３の層は、前記第３の層の前記ポリマー分子にテザーされるオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
１１５．前記第３の層の前記ポリマー分子にテザーされる前記オリゴヌクレオチドは、前記第３の層の至る所で複数の深度で分布される、請求項１１４に記載の方法。
１１６．前記第３の層の前記ポリマー分子にテザーされる分岐ポリマー分子を含む第４の層と、前記第４の層の前記分岐ポリマー分子にテザーされるポリマー分子を含む第５の層とをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
１１７．前記第５の層の前記ポリマー分子は前記第５の層の前記ポリマー分子にテザーされるオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
１１８．前記第５の層の前記ポリマー分子にテザーされる前記オリゴヌクレオチドは、前記第５の層の至る所で複数の深度で分布される、請求項１１７に記載の方法。
１１９．前記少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＡ）、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリル酸）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチル エーテル メタクリル酸）（ＰＯＥＧＭＡ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリリジン、ポリグルコシド、ストレプトアビジン、およびデキストランからなる群から選択された分子を含む、請求項９６に記載の方法。
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明の実施に際していかなる組み合わせで利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、これらの請求項とそれらの均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

Claims (80)

  1. 核酸分子を配列決定する方法であって、前記方法は、
    ａ）対物レンズおよび少なくとも１つの画像センサを含む光学システムを使用して第１の表面および軸方向に変位した第２の表面を撮像する工程であって、前記光学システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有し、実質的に同じ光学解像度を有する第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく取得される、工程と
    ｂ）核酸分子中のヌクレオチドの同一性を判定するために、第１の表面または軸方向に変位した第２の表面に配置された核酸分子、あるいはその補体を含む蛍光で標識された組成物を検出する工程と、を含む、方法。
  2. フォーカス機構は、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像を取得する間に、光学システムに再集光するために利用される、請求項１に記載の方法。
  3. 第１の表面または軸方向に変位した第２の表面のうちの少なくとも１つで２つ以上の視野を撮像する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面はフローセルの２つの表面を含む、請求項１に記載の方法。
  5. フローセルの前記２つの表面は親水性コーティング層で被覆される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり10,000個より大きな核酸コロニーの表面密度でそこに配置された標識核酸コロニーをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記光学システムを使用して取得された前記２つの表面の１つの表面の画像は、核酸コロニーがシアニン色素３（Ｃｙ３）で標識されるとき、少なくとも５のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示し、光学システムはCy3発光のために最適化されたダイクロイックミラーおよび帯域通過フィルタセットを含み、画像は表面が２５ｍＭのＡＣＥＳ，ｐＨ ７．４緩衝液に浸されている間、非信号の飽和条件下で取得される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記光学システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む、請求項１に記載の方法。
  9. 少なくとも１つの画像センサは、光学システムのための空間サンプリング周波数が光学システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 光学システムは対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズを含み、少なくとも１つのチューブレンズはフローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックを修正するように構成される、請求項１に記載の方法。
  11. フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍのギャップを有する、請求項１０に記載の方法。
  12. 少なくとも１つのチューブレンズは、順番に、非対称な凸－凸レンズ、凸－平面レンズ、非対称な凹－凹レンズ、および非対称な凸－凹レンズを含む、請求項１０に記載の方法。
  13. 光学システムは２つ以上の蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 対物レンズおよびチューブレンズの組み合わせは、中から高の空間周波数の範囲において変調伝送関数を最適化するように構成される、請求項１０に記載の方法。
  15. 撮像性能メトリックは、１つ以上の特定された空間周波数での変調伝送関数（ＭＴＦ）の測定値、デフォーカス、 球面収差、色収差、コマ、非点収差、像面湾曲、画像の歪み、画像コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。
  16. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像の光学解像度は、全視野（ＦＯＶ）にわたって回折限界である、請求項１に記載の方法。
  17. 核酸分子の配列決定は、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つで、アビディティによる配列決定、ヌクレオチド塩基対合による配列決定、ヌクレオチド結合による配列決定、またはヌクレオチドの取り込み反応による配列決定を実施する工程、および結合または組み込まれたヌクレオチド塩基を検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  18. サンプルの遺伝子型を判定する工程をさらに含み、サンプルの遺伝子型を判定する工程は配列決定のための前記核酸分子を調製することと、それから前記核酸分子を配列決定することを含む、請求項１に記載の方法。
  19. ２つの異なる軸方向に変位した表面を撮像するように構成された撮像システムであって、撮像システムは対物レンズおよび少なくとも１つの画像センサを含み、前記撮像システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有し、前記撮像システムは 光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく、実質的に同じ光学解像度を有する２つの異なる軸方向に変位した表面の画像を取得することができる、撮像システム。
  20. 撮像システムは０．３より大きい開口数を有する、請求項１９に記載の撮像システム。
  21. ２つの異なる軸方向に変位した表面の画像を取得する間に、光学システムに再集光するために使用されるフォーカス機構をさらに含む、請求項１９に記載の撮像システム。
  22. 撮像システムは、前記２つの異なる軸方向に変位した表面の少なくとも１つで、２つ以上の視野を撮像するように構成される、請求項１９に記載の撮像システム。
  23. 前記２つの異なる軸方向に変位した表面はフローセルの２つの表面を含む、請求項１９に記載の撮像システム。
  24. フローセルの前記２つの異なる表面は親水性コーティング層で被覆され、前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり10,000個よりも大きい核酸コロニーの表面密度でそこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む、請求項２３に記載の撮像システム。
  25. 前記撮像システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された前記２つの異なる表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む、請求項１９に記載の撮像システム。
  26. 少なくとも１つの画像センサは、光学システムのための空間サンプリング周波数が光学システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む、請求項１９に記載の撮像システム。
  27. 撮像システムは対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズを含み、少なくとも１つのチューブレンズはフローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックを修正するように構成される、請求項１９に記載の撮像システム。
  28. フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍのギャップを有する、請求項２７に記載の撮像システム。
  29. 撮像システムは２つ以上の蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む、請求項２７に記載の撮像システム。
  30. ２つの異なる軸方向に変位した表面の画像の光学解像度は、全視野（ＦＯＶ）にわたって回折限界である、請求項１９に記載の撮像システム。
  31. フローセルの第１の内部表面および第２の内部表面を撮像するように構成された撮像システムであって、前記撮像システムは、
    ａ）対物レンズと、
    ｂ）少なくとも１つの画像センサと
    ｃ）対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間の光路に配置された少なくとも１つのチューブレンズと、を含み、
    前記光学システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有し、および、
    少なくとも１つのチューブレンズは、フローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面の画像が実質的に同じ光学解像度を有するように、撮像性能を修正するように構成される、撮像システム。
  32. フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍの液体で満たされたギャップを有する、請求項３１に記載の撮像システム。
  33. 第１の内部表面および第２の内部表面の画像は、光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく、取得される、請求項３１に記載の撮像システム。
  34. 撮像システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）を有する、請求項３１に記載の撮像システム。
  35. 撮像システムは０．３より大きい開口数（ＮＡ）を有する、請求項３１に記載の撮像システム。
  36. 撮像システムは１．５ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有する、請求項３１に記載の撮像システム。
  37. 第１の内部表面および第２の内部表面の画像の光学解像度は全視野（ＦＯＶ）にわたって回折限界である、請求項３６に記載の撮像システム。
  38. 少なくとも１つのチューブレンズは、順番に、非対称な凸－凸レンズ、凸－平面レンズ、非対称な凹－凹レンズ、および非対称な凸－凹レンズを含む、請求項３１に記載の撮像システム。
  39. 撮像システムは、２つ以上の蛍光波長で第１の内部表面および第２の内部表面のために最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む、請求項３１に記載の撮像システム。
  40. 第１の内部表面および第２の内部表面の画像を取得する間に、光学システムに再集光するように構成されたフォーカス機構をさらに含む、請求項３１に記載の撮像システム。
  41. 撮像システムは第１の内部表面または第２の内部表面の少なくとも１つで２つ以上の視野を撮像するように構成される、請求項３１に記載の撮像システム。
  42. フローセルの第１の内部表面および第２の内部表面は親水性コーティング層で被覆され、前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり10,000個よりも大きい核酸コロニーの表面密度でそこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む、請求項３１に記載の撮像システム。
  43. 撮像システムを使用して取得された第１の内部表面または第２の内部表面の画像は、核酸コロニーがシアニン色素３（Ｃｙ３）で標識されるとき、少なくとも５のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示し、撮像システムはCy3発光のために最適化されたダイクロイックミラーおよび帯域通過フィルタセットを含み、画像は表面が２５ｍＭのＡＣＥＳ，ｐＨ ７．４緩衝液に浸されている間、非信号の飽和条件下で取得される、請求項４２に記載の撮像システム。
  44. 前記撮像システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された前記２つの異なる表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む、請求項４２に記載の撮像システム。
  45. 撮像システムは、第１の内部表面および第２の内部表面の少なくとも１つで、アビディティによる配列決定、ヌクレオチド塩基対合による配列決定、ヌクレオチド結合による配列決定、またはヌクレオチドの取り込み反応による配列決定をモニタリングするため、および結合または組み込まれたヌクレオチド塩基を検出するために使用される、請求項４２に記載の撮像システム。
  46. 撮像システムは核酸配列決定を実施するために使用される、請求項４２に記載の撮像システム。
  47. 撮像システムはサンプルの遺伝子型を判定するために使用され、サンプルの遺伝子型を判定することは、配列決定のためにサンプルから抽出される核酸分子を調製することと、それから核酸分子を配列決定することと、を含む、請求項４２に記載の撮像システム。
  48. 少なくとも１つの画像センサは、撮像システムのための空間サンプリング周波数が撮像システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む、請求項３１に記載の撮像システム。
  49. 対物レンズおよび少なくとも１つのチューブレンズの組み合わせは、サンプル平面において１ｍｍあたり７００サイクルから１ｍｍあたり１１００サイクルの空間周波数範囲において、変調伝送関数を最適化するように構成されている、請求項３１に記載の撮像システム。
  50. 少なくとも１つのチューブレンズは、対物レンズおよび少なくとも１つのチューブレンズの組み合わせのために、１つ以上の特定された空間周波数での変調伝送関数（ＭＴＦ）、デフォーカス、球面収差、色収差、コマ、非点収差、像面湾曲、画像の歪み、画像コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを修正するように設計される、請求項３１に記載の撮像システム。
  51. 核酸分子を配列決定する方法であって、前記方法は、
    ａ）対物レンズおよび少なくとも１つの画像センサを含む補正がない光学システムを使用して第１の表面および軸方向に変位した第２の表面を撮像する工程であって、前記光学システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有する、工程と、
    ｂ）第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像が実質的に同じ光学解像度を有するように、光学収差を修正するために、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像を処理する、工程と、
    ｃ）核酸分子中のヌクレオチドの同一性を判定するために、第１の表面または軸方向に変位した第２の表面に配置された核酸分子、あるいはその補体を含む、蛍光で標識された組成物を検出する、工程と、を含む、方法。
  52. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく、取得される、請求項５１に記載の方法。
  53. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学システムに再集光することによってのみ取得される、請求項５１に記載の方法。
  54. 第１の表面または軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つで、２つ以上の視野を撮像する工程をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  55. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面は、フローセルの２つの表面を含む、請求項５１に記載の方法。
  56. フローセルの前記２つの表面は親水性コーティング層で被覆される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり10,000個よりも大きい核酸コロニーの表面密度で、そこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記光学システムを使用して取得された前記２つの表面の１つの表面の画像は、核酸コロニーがシアニン色素３（Ｃｙ３）で標識されるとき、少なくとも５のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を示し、光学システムはCy3発光のために最適化されたダイクロイックミラーおよび帯域通過フィルタセットを含み、画像は表面が２５ｍＭのＡＣＥＳ，ｐＨ ７．４緩衝液に浸されている間、非信号の飽和条件下で取得される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記光学システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む、請求項５１に記載の方法。
  60. 少なくとも１つの画像センサは、光学システムのための空間サンプリング周波数が光学システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む、請求項５１に記載の方法。
  61. 光学システムは対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズを含み、少なくとも１つのチューブレンズはフローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックを修正するように構成される、請求項５１に記載の方法。
  62. フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面の間の少なくとも５０μｍのギャップを有する、請求項６１に記載の方法。
  63. 少なくとも１つのチューブレンズは、順番に、非対称な凸－凸レンズ、凸－平面レンズ、非対称な凹－凹レンズ、および非対称な凸－凹レンズを含む、請求項６１に記載の方法。
  64. 光学システムは２つ以上の蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む、請求項６１に記載の方法。
  65. 対物レンズおよびチューブレンズの組み合わせは、中から高の空間周波数範囲において変調伝送関数を最適化するように構成される、請求項６１に記載の方法。
  66. 撮像性能メトリックは、１つ以上の特定された空間周波数での変調伝送関数（ＭＴＦ）の測定値、デフォーカス、球面収差、色収差、コマ、非点収差、像面湾曲、画像の歪み、画像コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６１に記載の方法。
  67. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像の光学解像度は全視野（ＦＯＶ）にわたって回折限界である、請求項５１に記載の方法。
  68. 核酸分子の配列決定は、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つで、アビディティによる配列決定、ヌクレオチド結合による配列決定、またはヌクレオチドの取り込み反応による配列決定を実施する工程、および結合または組み込まれたヌクレオチド塩基を検出する工程をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  69. サンプルの遺伝子型を判定する工程をさらに含み、サンプルの遺伝子型を判定する工程は配列決定のための前記核酸分子を調製することと、それから前記核酸分子を配列決定することと、を含む、請求項５１に記載の方法。
  70. 核酸分子を配列決定するシステムであって、前記システムは、
    ａ）対物レンズおよび少なくとも１つの画像センサを含む光学システムであって、前記光学システムは０．６未満の開口数（ＮＡ）および１．０ｍｍ２よりも大きい視野（ＦＯＶ）を有し、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像を取得するように構成される、光学システムと、
    ｂ）プロセッサーであって、前記プロセッサーは、
    ｉ）第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像が実質的に同じ光学解像度を有するように、光学収差を修正するために、第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像を処理し、
    ｉｉ）核酸分子中のヌクレオチドの同一性を判定するために、第１の表面または軸方向に変位した第２の表面に配置された核酸分子、あるいはその補体を含む蛍光で標識された組成物を検出するように、プログラムされたプロセッサーと、を含む、システム。
  71. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学補正器を前記対物レンズと前記少なくとも１つの画像センサとの間の光路へ移動させることなく取得される、請求項７０に記載のシステム。
  72. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面の画像は、光学システムに再集光することによってのみ取得される、請求項７０に記載のシステム。
  73. 撮像システムは０．３より大きい開口数を有する、請求項７０に記載のシステム。
  74. 第１の表面および軸方向に変位した第２の表面は、フローセルの２つの表面を含む、請求項７０に記載のシステム。
  75. フローセルの前記２つの表面は親水性コーティング層で被覆され、前記親水性コーティング層は１ｍｍ２あたり10,000個よりも大きい核酸コロニーの表面密度でそこに配置される標識核酸コロニーをさらに含む、請求項７４に記載のシステム。
  76. 前記光学システムは、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる検出可能な標識で標識された第１の表面または軸方向に変位した第２の表面の少なくとも１つに配置される核酸コロニーを検出するように構成される１つ、２つ、３つ、または４つの撮像チャネルを含む、請求項７０に記載のシステム。
  77. 少なくとも１つの画像センサは、光学システムのための空間サンプリング周波数が光学システムの光学解像度の少なくとも２倍であるように選択された画素寸法を有する画素を含む、請求項７０に記載のシステム。
  78. システムは対物レンズと少なくとも１つの画像センサとの間に位置する少なくとも１つのチューブレンズを含み、少なくとも１つのチューブレンズはフローセルの第１の内部表面およびフローセルの第２の内部表面を撮像するための撮像性能メトリックを修正するように構成される、請求項７０に記載のシステム。
  79. フローセルは少なくとも７００μｍの壁厚および第１の内部表面と第２の内部表面との間の少なくとも５０μｍのギャップを有する、請求項７８に記載のシステム。
  80. 光学システムは２つ以上の蛍光波長で最適な撮像性能を提供するように設計される２つ以上のチューブレンズを含む、請求項７８に記載のシステム。
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