KR20210154868A - 게놈 테스트 어세이를 위한 고성능 형광 이미징 모듈 - Google Patents

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KR20210154868A
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스티브 시앙링 첸
밍하오 구오
마이클 프레비테
춘홍 조우
데렉 풀러
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엘리먼트 바이오사이언스, 인크.
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Abstract

더 큰 시야, 증가된 공간 해상도, 개선된 변조 전달 및 이미지 품질, 더 높은 공간 샘플링 주파수, (예를 들어, 상이한 시야의) 일련의 이미지를 캡처하기 위해 샘플 평면을 재-위치 결정할 때 이미지 캡처 간의 더 빠른 전이, 및 개선된 이미징 시스템 듀티 사이클을 제공하여, 이에 따라 게놈학 및 다른 이미징 적용들을 위한 더 높은 처리량의 이미지 획득 및 분석을 가능하게 하는 형광 이미징 시스템 설계가 설명된다.

Description

게놈 테스트 어세이를 위한 고성능 형광 이미징 모듈
상호 참조
본 출원은 2020년 9월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 63/076,361 및 2020년 1월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/962,723의 이익을 주장하고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
일반적인 형광 기반 게놈 테스트 어세이(genomic testing assay), 예를 들어 유전형 분석 또는 핵산 시퀀싱(실시간 반응 방식, 순환 반응 방식 또는 단계적 반응 방식을 사용함)에서, 기판 상에 테더링(tethering)된 핵산 분자에 부착된 염료 분자는 여기 광원을 사용하여 여기되고, 형광 광자 신호가 기판 상의 하나 이상의 공간적으로 국부화된 위치에서 생성되고, 형광은 이후에 광학 시스템을 통해 이미지 센서 상으로 이미징(imaging)된다. 그 후 분석 프로세스를 사용하여 이미지를 분석하고, 기판 상에서 라벨링된 분자(또는 분자의 클론 증폭된 클러스터(clonally amplified cluster))의 위치를 발견하고, 파장 및 공간 좌표의 면에서 형광 광자 신호를 정량화하고, 이는 그 후 특정 화학 반응, 예를 들어 혼성화 이벤트 또는 염기 첨가 이벤트가 기판 상의 특정 위치에서 발생한 정도와 상관될 수 있다. 이미징 기반 방법은 대규모 병렬 처리 및 다중화 기능을 제공하여, 이러한 기술의 비용 및 접근성을 낮추는 데 도움이 된다. 그러나, 예를 들어, 기판 표면의 작은 구역 내에서 라벨링된 분자(또는 분자의 클론 증폭된 클러스터)의 과도하게 조밀한 패킹(packing)으로 인해 발생하거나 또는 이미지의 낮은 대조 대 잡음비(contrast-to-noise ratio)(CNR)로 인해 발생하는 검출 오류는, 이러한 형광 신호를 올바른 분자(또는 분자의 클론 증폭된 클러스터)에 귀속시키는 오류로 이어질 수 있다.
흐름 셀(flow cell)의 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면을 이미징하도록 구성된 이미징 시스템이 본 명세서에 개시되며, 이미징 시스템은, a) 대물 렌즈; b) 적어도 하나의 이미지 센서; c) 대물 렌즈와 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로에 배치된 적어도 하나의 튜브 렌즈(tube lens)를 포함하고, 여기서 상기 광학 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(field-of-view)(FOV)를 가지며, 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 흐름 셀의 제2 내부 표면의 이미지가 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖도록 이미징 성능을 보정하게 구성된다.
일부 실시예에서, 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의 제1 내부 표면과 제2 내부 표면 사이의 유체로 채워진 갭(gap)을 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면의 이미지는 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기(optical compensator)를 이동시키지 않고서 획득된다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA)를 갖는다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 0.3 초과의 개구수(NA)를 갖는다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 1.5 mm2 초과의 시야(FOV)를 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면의 이미지의 광학 해상도는 전체 시야(FOV)에 걸쳐 회절 제한된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는 비대칭 볼록-볼록 렌즈, 볼록-평면 렌즈, 비대칭 오목-오목 렌즈, 및 비대칭 볼록-오목 렌즈를 순서대로 포함한다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면에 대한 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함한다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면의 이미지를 획득하는 사이에 광학 시스템을 리포커싱(refocusing)하도록 구성된 포커싱 기구(focusing mechanism)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 제1 내부 표면 또는 제2 내부 표면 중 적어도 하나 상의 2 개 이상의 시야를 이미징하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅되고, 여기서 상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니(nucleic acid colony)/mm2의 표면 밀도로 그 위에 배치된 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템을 사용하여 획득된 제1 내부 표면 또는 제2 내부 표면의 이미지는 핵산 콜로니가 시아닌 염료 3(cyanine dye 3)(Cy3)으로 라벨링된 경우 적어도 5의 대조 대 잡음비(CNR)를 나타내고, 이미징 시스템은 Cy3 방출에 최적화된 다이크로익 미러(dichroic mirror) 및 대역 통과 필터 세트를 포함하며, 이미지는 표면이 25 mM ACES, pH 7.4 완충제에 잠겨 있는 동안 비-신호 포화 조건 하에서 획득된다. 일부 실시예에서, 상기 이미징 시스템은 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 별개의 검출 가능한 라벨로 라벨링된 상기 2 개의 별개의 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 이미징 채널을 포함한다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면 중 적어도 하나에서 결합활성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-avidity), 뉴클레오티드 염기 쌍형성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-nucleotide base-pairing), 뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱(sequencing-by-nucleotide binding), 또는 뉴클레오티드 통합 반응에 의한 시퀀싱(sequencing-by-nucleotide incorporation reaction)을 모니터링하고, 결합된 또는 통합된 뉴클레오티드 염기를 검출하도록 사용된다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 핵산 시퀀싱을 수행하는 데 사용된다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 샘플의 유전자형을 결정하는 데 사용되며, 여기서 샘플의 유전자형을 결정하는 것은 시퀀싱을 위해 샘플로부터 추출된 핵산 분자를 준비하고, 그 후 핵산 분자를 시퀀싱하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 이미지 센서는 이미징 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 이미징 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함한다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈와 적어도 하나의 튜브 렌즈의 조합은 샘플 평면에서 mm당 700 사이클 내지 mm당 1100 사이클의 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는 대물 렌즈와 적어도 하나의 튜브 렌즈의 조합에 대해, 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서의 변조 전달 함수(MTF), 디포커스(defocus), 구면 수차, 색수차, 코마(coma), 비점 수차, 필드 곡률, 이미지 왜곡, 이미지 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들의 임의의 조합을 보정하도록 설계된다.
또한 핵산 분자를 시퀀싱하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있으며, 이 방법은 a) 대물 렌즈 및 적어도 하나의 이미지 센서를 포함하는 광학 시스템을 사용하여 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면을 이미징하는 단계 - 상기 광학 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV)를 가지며, 여기서 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖는 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고서 획득됨 - ; 및 b) 제1 표면 또는 축 방향으로 변위된 제2 표면 상에 배치된 핵산 분자, 또는 그 보체를 포함하는 형광 라벨링된 조성물을 검출하여 핵산 분자 내의 뉴클레오티드의 아이덴티티(identity)를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지를 획득하는 사이에 광학 시스템을 리포커싱하기 위해 포커싱 기구가 이용된다. 일부 실시예에서, 이 방법은 제1 표면 또는 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상의 2 개 이상의 시야를 이미징하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면은 흐름 셀의 2 개의 표면을 포함한다. 일부 실시예에서, 흐름 셀의 상기 2 개의 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅된다. 일부 실시예에서, 상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 그 위에 배치된 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광학 시스템을 사용하여 획득된 상기 2 개의 표면 중 하나의 표면의 이미지는 핵산 콜로니가 시아닌 염료 3(Cy3)으로 라벨링될 때 적어도 5의 대조 대 잡음비(CNR)를 나타내고, 광학 시스템은 Cy3 방출에 최적화된 다이크로익 미러 및 대역 통과 필터 세트를 포함하며, 이미지는 표면이 25 mM ACES, pH 7.4 완충제에 잠겨 있는 동안 비-신호 포화 조건 하에서 획득된다. 일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 별개로 검출 가능한 라벨로 라벨링된 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널을 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 이미지 센서는 광학 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 광학 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함한다. 일부 실시예에서, 광학 시스템은 대물 렌즈와 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의 제1 내부 표면과 제2 내부 표면 사이의 갭을 갖는다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는 비대칭 볼록-볼록 렌즈, 볼록-평면 렌즈, 비대칭 오목-오목 렌즈, 및 비대칭 볼록-오목 렌즈를 순서대로 포함한다. 일부 실시예에서, 광학 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함한다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈와 튜브 렌즈의 조합은 중간 내지 높은 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 이미징 성능 메트릭은 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서의 변조 전달 함수(MTF), 디포커스, 구면 수차, 색수차, 코마, 비점 수차, 필드 곡률, 이미지 왜곡, 이미지 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들의 임의의 조합의 측정을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지의 광학 해상도는 전체 시야(FOV)에 걸쳐 회절 제한된다. 일부 실시예에서, 핵산 분자의 시퀀싱 단계는 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나에서 결합활성에 의한 시퀀싱, 뉴클레오티드 염기 쌍형성에 의한 시퀀싱, 뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱, 또는 뉴클레오티드 통합 반응에 의한 시퀀싱을 수행하는 단계 및 결합된 또는 통합된 뉴클레오티드 염기를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이 방법은 샘플의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 샘플의 유전자형을 결정하는 단계는 시퀀싱을 위해 상기 핵산 분자를 준비하는 단계, 및 그 후에 상기 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
2 개의 별개의 축 방향으로 변위된 표면을 이미징하도록 구성된 이미징 시스템이 본 명세서에 개시되어 있고, 이미징 시스템은 대물 렌즈 및 적어도 하나의 이미지 센서를 포함하고, 여기서 상기 이미징 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV)를 가지며, 여기서 상기 이미징 시스템은 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖는 2 개의 별개의 축 방향으로 변위된 표면의 이미지를 획득할 수 있다.
일부 실시예에서, 이미징 시스템은 0.3 초과의 개구수를 갖는다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 2 개의 별개의 축 방향으로 변위된 표면의 이미지를 획득하는 사이에 광학 시스템을 리포커싱하는 데 사용되는 포커싱 기구를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 상기 2 개의 별개의 축 방향으로 변위된 표면 중 적어도 하나 상의 2 개 이상의 시야를 이미징하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 2 개의 별개의 축 방향으로 변위된 표면은 흐름 셀의 2 개의 표면을 포함한다. 일부 실시예에서, 흐름 셀의 상기 2 개의 별개의 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅되고, 여기서 상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 그 위에 배치된 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 이미징 시스템은 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 별개의 검출 가능한 라벨로 라벨링된 상기 2 개의 별개의 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널을 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 이미지 센서는 이미징 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 이미징 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함한다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 대물 렌즈와 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의 제1 내부 표면과 제2 내부 표면 사이의 갭을 갖는다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함한다. 일부 실시예에서, 2 개의 별개의 축 방향으로 변위된 표면의 이미지의 광학 해상도는 전체 시야(FOV)에 걸쳐 회절 제한된다.
핵산 분자를 시퀀싱하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있으며, 이 방법은 a) 대물 렌즈 및 적어도 하나의 이미지 센서를 포함하는 무-보상 광학 시스템을 사용하여 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면을 이미징하는 단계 - 상기 광학 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV)를 가짐 - ; b) 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지가 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖도록 광학 수차를 보정하기 위해 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지를 처리하는 단계; 및 c) 제1 표면 또는 축 방향으로 변위된 제2 표면 상에 배치된 핵산 분자, 또는 그 보체를 포함하는 형광 라벨링된 조성물을 검출하여 핵산 분자 내의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고서 획득된다. 일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 광학 시스템을 리포커싱함으로써 획득된다. 일부 실시예에서, 이 방법은 제1 표면 또는 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상의 2 개 이상의 시야를 이미징하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면은 흐름 셀의 2 개의 표면을 포함한다. 일부 실시예에서, 흐름 셀의 상기 2 개의 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅된다. 일부 실시예에서, 상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 그 위에 배치된 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광학 시스템을 사용하여 획득된 상기 2 개의 표면 중 하나의 표면의 이미지는 핵산 콜로니가 시아닌 염료 3(Cy3)으로 라벨링될 때 적어도 5의 대조 대 잡음비(CNR)를 나타내고, 광학 시스템은 Cy3 방출에 최적화된 다이크로익 미러 및 대역 통과 필터 세트를 포함하며, 이미지는 표면이 25 mM ACES, pH 7.4 완충제에 잠겨 있는 동안 비-신호 포화 조건 하에서 획득된다. 일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 별개로 검출 가능한 라벨로 라벨링된 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널을 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 이미지 센서는 광학 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 광학 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함한다. 일부 실시예에서, 광학 시스템은 대물 렌즈와 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성되어 있다. 일부 실시예에서, 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의 제1 내부 표면과 제2 내부 표면 사이의 갭을 갖는다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는 비대칭 볼록-볼록 렌즈, 볼록-평면 렌즈, 비대칭 오목-오목 렌즈, 및 비대칭 볼록-오목 렌즈를 순서대로 포함한다. 일부 실시예에서, 광학 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함한다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈와 튜브 렌즈의 조합은 중간 내지 높은 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 이미징 성능 메트릭은 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서의 변조 전달 함수(MTF), 디포커스, 구면 수차, 색수차, 코마, 비점 수차, 필드 곡률, 이미지 왜곡, 이미지 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들의 임의의 조합의 측정을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지의 광학 해상도는 전체 시야(FOV)에 걸쳐 회절 제한된다. 일부 실시예에서, 핵산 분자의 시퀀싱 단계는 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나에서 결합활성에 의한 시퀀싱, 뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱, 또는 뉴클레오티드 통합 반응에 의한 시퀀싱을 수행하는 단계 및 결합된 또는 통합된 뉴클레오티드 염기를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이 방법은 샘플의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 샘플의 유전형을 결정하는 단계는 시퀀싱을 위해 상기 핵산 분자를 준비하는 단계, 및 그 후 상기 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
핵산 분자를 시퀀싱하기 위한 시스템이 본 명세서에 개시되어 있고, 이 시스템은 a) 대물 렌즈 및 적어도 하나의 이미지 센서를 포함하는 광학 시스템 - 상기 광학 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV)를 가지며, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지를 획득하도록 구성됨 - ; 및 b) 프로세서 - 상기 프로세서는 i) 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지가 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖도록 광학 수차를 보정하기 위해 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지를 처리하고; 및 ii) 제1 표면 또는 축 방향으로 변위된 제2 표면 상에 배치된 핵산 분자, 또는 그 보체를 포함하는 형광 라벨링된 조성물을 검출하여 핵산 분자 내의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하도록 프로그래밍됨 - 를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고서 획득된다. 일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 광학 시스템을 리포커싱함으로써 획득된다. 일부 실시예에서, 이미징 시스템은 0.3 초과의 개구수를 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면은 흐름 셀의 2 개의 표면을 포함한다. 일부 실시예에서, 흐름 셀의 상기 2 개의 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅되고, 여기서 상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 그 위에 배치된 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 별개의 검출 가능한 라벨로 라벨링된 제1 표면 또는 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널을 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 이미지 센서는 광학 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 광학 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함한다. 일부 실시예에서, 시스템은 대물 렌즈와 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의 제1 내부 표면과 제2 내부 표면 사이의 갭을 갖는다. 일부 실시예에서, 광학 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함한다.
본 명세서에는 형광 이미징 시스템이 개시되어 있고, 이 형광 이미징 시스템은 a) 하나 이상의 특정 파장 범위 내에서 여기 광을 제공하도록 구성된 적어도 하나의 광원; b) 샘플 평면이 여기 광에 노출될 때 샘플 평면의 지정된 시야 내에서 발생하는 형광을 수집하도록 구성된 대물 렌즈 - 여기서 대물 렌즈의 개구수는 적어도 0.3 이고, 여기서 대물 렌즈의 작동 거리는 적어도 700 ㎛이고, 여기서 시야는 적어도 2 mm2의 면적을 가짐 - ; 및 c) 적어도 하나의 이미지 센서 - 여기서 대물 렌즈에 의해 수집된 형광은 이미지 센서 상으로 이미징되고, 여기서 이미지 센서에 대한 픽셀 치수는 형광 이미징 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 형광 이미징 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택됨 - ;를 포함한다.
일부 실시예에서, 개구수는 적어도 0.75 이다. 일부 실시예에서, 개구수는 적어도 1.0 이다. 일부 실시예에서, 작동 거리는 적어도 850 ㎛이다. 일부 실시예에서, 작동 거리는 적어도 1,000 ㎛이다. 일부 실시예에서, 시야는 적어도 2.5 mm2의 면적을 갖는다. 일부 실시예에서, 시야는 적어도 3 mm2의 면적을 갖는다. 일부 실시예에서, 공간 샘플링 주파수는 형광 이미징 시스템의 광학 해상도의 적어도 2.5 배이다. 일부 실시예에서, 공간 샘플링 주파수는 형광 이미징 시스템의 광학 해상도의 적어도 3 배이다. 일부 실시예에서, 이 시스템은 이 시스템이 자동화된 방식으로 일련의 2 개 이상의 형광 이미지를 획득하도록 구성되도록 X-Y-Z 병진 스테이지(X-Y-Z translation stage)를 추가로 포함하고, 여기서 상기 일련의 이미지의 각 이미지는 서로 다른 시야에 대해 획득된다. 일부 실시예에서, 샘플 평면의 위치는 X 방향, Y 방향, 및 Z 방향으로 동시에 조정되어 서로 다른 시야에 대한 이미지를 획득하는 사이에 대물 렌즈 초점면의 위치를 정합시킨다. 일부 실시예에서, X 방향, Y 방향, 및 Z 방향으로의 동시 조정에 필요한 시간은 0.4 초 미만이다. 일부 실시예에서, 이 시스템은, 오류 신호가 Z 방향에서 초점면과 샘플 평면의 위치의 차이가 지정된 오류 임계값보다 크다는 것을 나타내는 경우, 다른 시야의 이미지를 획득하기 전에 초점면 위치를 조정하도록 구성된 오토 포커스 기구(autofocus mechanism)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 지정된 오류 임계값은 100 nm이다. 일부 실시예에서, 지정된 오류 임계값은 50 nm이다. 일부 실시예에서, 이 시스템은 3 개 이상의 이미지 센서를 포함하고, 여기서 이 시스템은 3 개 이상의 파장 범위 각각에서 형광을 서로 다른 이미지 센서 상으로 이미징하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 3 개 이상의 이미지 센서들 각각에 대한 초점면과 샘플 평면의 위치의 차이는 100 nm 미만이다. 일부 실시예에서, 3 개 이상의 이미지 센서 각각에 대한 초점면과 샘플 평면의 위치의 차이는 50 nm 미만이다. 일부 실시예에서, 샘플 평면을 다시 위치 결정하고, 필요한 경우 초점을 조정하고, 이미지를 획득하는 데 필요한 총 시간은 시야 당 0.4 초 미만이다. 일부 실시예에서, 샘플 평면을 다시 위치 결정하고, 필요한 경우 초점을 조정하고, 이미지를 획득하는 데 필요한 총 시간은 시야 당 0.3 초 미만이다.
또한, 본 명세서에는 흐름 셀의 양면 이미징을 위한 형광 이미징 시스템이 개시되어 있고, 이 형광 이미징 시스템은, a) 흐름 셀 내의 샘플 평면의 지정된 시야 내에서 발생하는 형광을 수집하도록 구성된 대물 렌즈; b) 대물 렌즈와 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈 - 여기서 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 내부 표면을 이미징할 때 대물 렌즈, 적어도 하나의 튜브 렌즈, 및 적어도 하나의 이미지 센서의 조합에 대한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성되고, 여기서 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의 상부 내부 표면과 하부 내부 표면 사이의 갭을 가짐 - 를 포함하고, 여기서 이미징 성능 메트릭은 광학 보상기를 흐름 셀과 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동시키지 않고, 광학 경로를 따라 튜브 렌즈의 하나 이상의 광학 요소를 이동시키지 않고, 그리고 튜브 렌즈의 하나 이상의 광학 요소를 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동시키지 않고 흐름 셀의 상부 내부 표면 또는 하부 내부 표면을 이미징하기 위해 실질적으로 동일하다.
일부 실시예에서, 대물 렌즈는 상업적으로 입수 가능한 현미경 대물 렌즈이다. 일부 실시예에서, 상업적으로 입수 가능한 현미경 대물 렌즈는 적어도 0.3 의 개구수를 갖는다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈는 적어도 700 ㎛의 작동 거리를 갖는다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈는 0.17 mm의 커버슬립 두께(또는 흐름 셀 벽 두께)를 보상하도록 보정된다. 일부 실시예에서, 형광 이미징 시스템은 대물 렌즈에 인접하게 그리고 대물 렌즈와 튜브 렌즈 사이에 위치된 전기 광학 위상판을 추가로 포함하고, 여기서 전기 광학 위상판은 흐름 셀의 상부 내부 표면과 하부 내부 표면 사이의 갭을 채우는 유체로 인한 광학 수차에 대한 보정을 제공한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는 3 개 이상의 광학 구성 요소를 포함하는 복합 렌즈이다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는 4 개의 광학 구성 요소를 포함하는 복합 렌즈이다. 일부 실시예에서, 4 개의 광학 구성 요소는 순서대로 제1 비대칭 볼록-볼록 렌즈, 제2 볼록-평면 렌즈, 제3 비대칭 오목-오목 렌즈, 및 제4 비대칭 볼록-오목 렌즈를 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는, 벽 두께가 적어도 1 mm인 흐름 셀의 내부 표면을 이미징할 때, 대물 렌즈, 적어도 하나의 튜브 렌즈, 및 적어도 하나의 이미지 센서의 조합에 대한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는, 적어도 100 ㎛의 갭을 갖는 흐름 셀의 내부 표면을 이미징할 때, 대물 렌즈, 적어도 하나의 튜브 렌즈, 및 적어도 하나의 이미지 센서의 조합에 대한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈는, 적어도 200 ㎛의 갭을 갖는 흐름 셀의 내부 표면을 이미징할 때, 대물 렌즈, 적어도 하나의 튜브 렌즈, 및 적어도 하나의 이미지 센서의 조합에 대한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 이 시스템은 단일 대물 렌즈, 2 개의 튜브 렌즈, 및 2 개의 이미지 센서를 포함하고, 2 개의 튜브 렌즈 각각은 상이한 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된다. 일부 실시예에서, 이 시스템은 단일 대물 렌즈, 3 개의 튜브 렌즈, 및 3 개의 이미지 센서를 포함하고, 3 개의 튜브 렌즈 각각은 상이한 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된다. 일부 실시예에서, 이 시스템은 단일 대물 렌즈, 4 개의 튜브 렌즈, 및 4 개의 이미지 센서를 포함하고, 4 개의 튜브 렌즈 각각은 상이한 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈 또는 적어도 하나의 튜브 렌즈의 설계는 중간 내지 높은 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 이미징 성능 메트릭은 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서의 변조 전달 함수(MTF), 디포커스, 구면 수차, 색수차, 코마, 비점 수차, 필드 곡률, 이미지 왜곡, 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들의 임의의 조합의 측정을 포함한다. 일부 실시예에서, 흐름 셀의 상부 내부 표면 및 하부 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭의 차이는 10 % 미만이다. 일부 실시예에서, 흐름 셀의 상부 내부 표면 및 하부 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭의 차이는 5 % 미만이다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈를 사용하면 대물 렌즈, 모션 작동 보상기(motion-actuated compensator) 및 이미지 센서를 포함하는 기존의 시스템에 비해 양면 이미징에 대한 이미징 성능 메트릭에서 적어도 동등하거나 또는 더 나은 개선을 제공한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 튜브 렌즈를 사용하면 대물 렌즈, 모션 작동 보상기, 및 이미지 센서를 포함하는 기존의 시스템에 비해 양면 이미징에 대한 이미징 성능 메트릭에서 적어도 10 % 개선을 제공한다.
이미징 기반의 고체상 유전형 분석 및 시퀀싱 적용 분야에 사용하기 위한 조명 시스템이 본 명세서에 개시되어 있고, 이 조명 시스템은, a) 광원; 및 b) 광원에 의해 방출된 광을 수집하고, 테더링된 생물학적 거대 분자를 포함하는 지지 표면 상의 특정 조명 필드로 전달하도록 구성된 액체 광 가이드를 포함한다.
일부 실시예에서, 조명 시스템은 집광 렌즈를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 지정된 조명 필드는 적어도 2 mm2의 면적을 갖는다. 일부 실시예에서, 지정된 조명 필드에 전달된 광은 지지 표면의 이미지를 획득하는 데 사용되는 이미징 시스템에 대해 지정된 시야에 걸쳐 균일한 강도를 갖는다. 일부 실시예에서, 지정된 시야는 적어도 2 mm2의 면적을 갖는다. 일부 실시예에서, 지정된 조명 필드에 전달된 광은 광 강도에 대한 변동 계수(CV)가 10 % 미만일 때 지정된 시야에 걸쳐 균일한 강도를 갖는다. 일부 실시예에서, 지정된 조명 필드에 전달된 광은 광 강도에 대한 변동 계수(CV)가 5 % 미만일 때 지정된 시야에 걸쳐 균일한 강도를 갖는다. 일부 실시예에서, 지정된 조명 필드에 전달된 광은 0.1 미만의 스페클 콘트라스트 값(speckle contrast value)을 갖는다. 일부 실시예에서, 지정된 조명 필드에 전달된 광은 0.05 미만의 스페클 콘트라스트 값을 갖는다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허, 또는 특허 출원이 그 전체가 참고로 통합되도록 구체적이고 그리고 개별적으로 규정된 것과 같이 동일한 정도로 그 전체가 참고로 여기에 통합된다. 본 명세서의 용어와 통합된 참조 문헌의 용어가 상충하는 경우, 본 명세서의 용어가 우선한다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 설명되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시예를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다.
도 1a 내지 도 1b는 본 명세서에 개시된 이미징 시스템에 의한 이미징을 위한 샘플 부위를 제시하기 위한 이미징 이중 표면 지지 구조의 비-제한적인 예를 개략적으로 예시한다. 도 1a는 흐름 셀의 전방 내부 표면 및 후방 내부 표면을 이미징하는 예시를 도시한다. 도 1b는 기판의 전방 외부 표면 및 후방 외부 표면을 이미징하는 예시를 도시한다.
도 2a 및 도 2b는 여기 광 빔을 샘플로 투과하고, 생성된 형광 방출을 수신하고 4 개의 상이한 파장 또는 파장 대역에서 형광 방출의 검출을 위해 구성된 4 개의 검출 채널로 반사에 의해 재지향시키기 위한 다이크로익 빔 스플리터를 포함하는 다중 채널 형광 이미징 모듈의 비-제한적인 예를 도시한다. 도 2a는 상부 등각도이다. 도 2b는 하부 등각도이다.
도 3a 내지 도 3b는 여기 광 빔을 샘플로 투과하고, 생성된 형광 방출을 수신하고 4 개의 상이한 각각의 파장 또는 파장 대역에서 형광 방출의 검출을 위해 4 개의 검출 채널로 반사에 의해 재지향시키기 위한 다이크로익 빔 스플리터를 포함하는, 도 2a 내지 도 2b의 다중 채널 형광 이미징 모듈 내의 광학 경로를 도시한다. 도 3a는 평면도이다. 도 3b는 측면도이다.
도 4는 다이크로익 필터 성능과 빔 입사각의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 다이크로익 필터에 대한 빔 풋프린트 크기와 빔 입사각 사이의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 6a 내지 도 6b는 다중 채널 형광 이미징 모듈의 다이크로익 필터 및 검출 채널의 예시적인 구성을 개략적으로 도시하고, 여기서 다이크로익 필터는 입사 빔(예를 들어, 중심각)과 다이크로익 필터의 반사 표면 사이의 각도가 45 도 미만이 되도록 기울어진 반사 표면을 갖는다. 도 6a는 4 개의 검출 채널을 포함하는 다중 채널 형광 이미징 모듈의 개략도이다. 도 6b는 다이크로익 반사기 상의 광 빔의 입사각(AOI)을 예시하는 상세도이다.
도 7은 도 6a 및 도 6b에 도시된 이미징 모듈 구성에 대응하는 개선된 다이크로익 필터 성능을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 8은 도 6a 및 도 6b에 도시된 이미징 모듈 구성에 대응하는 개선된 다이크로익 필터 성능을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 9a 내지 도 9b는 도 6a 및 도 6b의 이미징 모듈 구성으로 인한 감소된 표면 변형을 나타내는 그래프를 제공한다. 도 9a는 마지막 미러에 1 파의 PV 구형 파워를 추가함으로써 유도된 이미지 품질 저하에 대한 접힘 각도의 영향을 예시한다. 도 9b는 마지막 미러에 0.1 파의 PV 구형 파워를 추가함으로써 유도된 이미지 품질 저하에 대한 접힘 각도의 영향을 예시한다.
도 10a 내지 도 10b는 여기 빔의 s-편광의 사용으로 인한 개선된 여기 필터 성능(예를 들어, 통과 대역과 주변 저지 대역 사이의 더 날카로운 전이)을 예시하는 그래프를 제공한다. 도 10a는 40 도 및 45 도의 입사각에서 예시적인 대역 통과 다이크로익 필터에 대한 투과 스펙트럼을 도시하고, 여기서 입사 빔은 선형으로 편광되고, 다이크로익 필터의 평면에 대해 p-편광된다. 도 10b는 입사 빔이 다이크로익 필터의 평면에 대해 s-편광되도록 다이크로익 필터에 대한 광원의 방향을 변경하여, 통과 대역과 저지 대역 사이의 에지가 실질적으로 더 날카로워지는 것을 도시한다.
도 11a 내지 도 11b는 0.3의 개구수(NA)를 갖는 본 명세서에 개시된 예시적인 이중 표면 이미징 시스템의 변조 전달 함수(MTF)를 도시한다. 도 11a는 제1 표면을 도시한다. 도 11b는 제2 표면을 도시한다.
도 12a 내지 도 12b는 0.4의 NA를 갖는 본 명세서에 개시된 예시적인 이중 표면 이미징 시스템의 MTF를 예시한다. 도 12a는 제1 표면을 도시한다. 도 12b는 제2 표면을 도시한다.
도 13a 내지 도 13b는 0.5의 NA를 갖는 본 명세서에 개시된 예시적인 이중 표면 이미징 시스템의 MTF를 예시한다. 도 13a는 제1 표면을 도시한다. 도 13b는 제2 표면을 도시한다.
도 14a 내지 도 14b는 0.6의 NA를 갖는 본 명세서에 개시된 예시적인 이중 표면 이미징 시스템의 MTF를 예시한다. 도 14a는 제1 표면을 도시한다. 도 14b는 제2 표면을 도시한다.
도 15a 내지 도 15b는 0.7의 NA를 갖는 본 명세서에 개시된 예시적인 이중 표면 이미징 시스템의 MTF를 예시한다. 도 15a는 제1 표면을 도시한다. 도 15b는 제2 표면을 도시한다.
도 16a 내지 도 16b는 0.8의 NA를 갖는 본 명세서에 개시된 예시적인 이중 표면 이미징 시스템의 MTF를 예시한다. 도 16a는 제1 표면을 도시한다. 도 16b는 제2 표면을 도시한다.
도 17a 내지 도 17b는 제1 흐름 셀 표면을 통해 제2 흐름 셀 표면을 이미징하기 위해 계산된 스트렐 비율(Strehl ratio)의 플롯을 제공한다. 도 17a는 상이한 대물 렌즈 및/또는 광학 시스템 개구수에 대한 개재 유체 층의 두께(유체 채널 높이)의 함수로서 제1 흐름 셀 표면을 통해 제2 흐름 셀 표면을 이미징하기 위한 스트렐 비율의 플롯을 도시한다. 도 17b는 제1 흐름 셀 표면을 통해 제2 흐름 셀 표면을 이미징하기 위해 0.1 mm의 두께를 갖는 물의 개재 층에 대한 개구수의 함수로서의 스트렐 비율의 플롯을 도시한다.
도 18은 본 개시의 이중 파장 여기/4 채널 방출 형광 이미징 시스템의 개략도를 제공한다.
도 19는 0.17 mm 두께 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면을 이미징하기 위해 설계된 대물 렌즈 설계에 대한 광학 광선 추적 다이어그램을 제공한다.
도 20은 0.17 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 19에 도시된 대물 렌즈에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다.
도 21은 0.3 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 19에 도시된 대물 렌즈에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다.
도 22는 0.1 mm 두께의 수성 유체 층에 의해 0.3 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면과 분리된 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 19에 도시된 대물 렌즈에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다.
도 23은 1.0 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 19에 도시된 대물 렌즈에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다.
도 24는 0.1 mm 두께의 수성 유체 층에 의해 1.0 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면과 분리된 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 19에 도시된 대물 렌즈에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다.
도 25는 도 19에 도시된 대물 렌즈와 함께 사용되는 경우, 1 mm 두께의 커버슬립을 통해 개선된 양면 이미징을 제공하는 튜브 렌즈 설계에 대한 광선 추적 다이어그램을 제공한다.
도 26은 1.0 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 25에 도시된 대물 렌즈와 튜브 렌즈의 조합에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다.
도 27은 0.1 mm 두께의 수성 유체 층에 의해 1.0 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면과 분리된 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 25에 도시된 대물 렌즈와 튜브 렌즈의 조합에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다.
도 28은 고품질의 양면 이미징 성능을 제공하도록 최적화된 본 개시의 튜브 렌즈 설계(왼쪽)에 대한 광선 추적 다이어그램을 제공한다. 튜브 렌즈는 더 이상 무한 보정되지 않기 때문에, 제조 및 테스트 목적을 위해 무한 보정되지 않은 튜브 렌즈를 보상하기 위해 적절하게 설계된 널 렌즈(오른쪽)가 튜브 렌즈와 조합되어 사용될 수 있다.
도 29는 2 개의 유체 어댑터를 갖는 단일 모세관 흐름 셀의 하나의 비-제한적인 예를 예시한다.
도 30은 2 개의 모세관을 유지하도록 설계된, 섀시, 유체 어댑터, 및 선택적으로 다른 구성 요소를 포함하는 흐름 셀 카트리지의 하나의 비-제한적인 예를 도시한다.
도 31은 다양한 유체 흐름 제어 구성 요소에 연결된 단일 모세관 흐름 셀을 포함하는 시스템의 하나의 비-제한적인 예를 도시하고, 여기서 단일 모세관은 다양한 이미징 적용 분야에서 사용하기 위해 현미경 스테이지 또는 맞춤형 이미징 기기에 장착하는 것과 호환된다.
도 32는 사체적을 감소하거나 또는 최소화하고 특정 핵심 시약을 보존하기 위해 통합된 다이어프램 밸브를 갖는 모세관 흐름 셀 카트리지를 포함하는 시스템의 하나의 비-제한적인 예를 도시한다.
도 33은 모세관 흐름 셀, 현미경 설정, 및 온도 제어 기구를 포함하는 시스템의 하나의 비-제한적인 예를 도시한다.
도 34는 흐름 셀 카트리지와 접촉하여 배치되는 금속 플레이트의 사용을 통한 모세관 흐름 셀의 온도 제어를 위한 하나의 비-제한적인 예를 도시한다.
도 35는 비-접촉 열 제어 기구를 포함하는 모세관 흐름 셀의 온도 제어를 위한 하나의 비-제한적인 접근법을 예시한다.
도 36a 내지 도 36c는 흐름 셀 장치 제작의 비-제한적인 예를 도시한다. 도 36a는 1-피스 유리 흐름 셀의 제조를 보여준다. 도 36b는 2-피스 유리 흐름 셀의 제조를 도시한다. 도 36c는 3-피스 유리 흐름 셀의 제조를 보여준다.
도 37a 내지 도 37c는 유리 흐름 셀 설계의 비-제한적인 예를 도시한다. 도 37a는 1-피스 유리 흐름 셀 설계를 보여준다. 도 37b는 2-피스 유리 흐름 셀 설계를 보여준다. 도 37c는 3-피스 유리 흐름 셀 설계를 보여준다.
도 38은 모세관 루멘에서 클러스터 증폭의 시각화를 예시한다.
도 39는 본 명세서에 개시된 바와 같은 시퀀싱 시스템에 대한 블록도의 비-제한적인 예를 제공한다.
도 40은 본 명세서에 개시된 바와 같은 시퀀싱 방법에 대한 흐름도의 비-제한적인 예를 제공한다.
도 41은 본 명세서에 개시된 바와 같은 구조화된 조명 시스템에 대한 개략도의 비-제한적인 예를 제공한다.
도 42는 본 명세서에 개시된 바와 같은 흐름 셀 표면의 구조화된 조명 이미지를 획득하고 처리하기 위한 흐름도의 비-제한적인 예를 제공한다.
도 43a 내지 도 43b는 본 명세서에 개시된 바와 같은 다중화된 판독 헤드의 비-제한적인 개략도를 제공한다. 도 43a는 개별 마이크로 형광 측정기가 공통 표면, 예를 들어 흐름 셀의 내부 표면을 이미징하도록 구성된 다중화된 판독 헤드의 측면도를 도시한다. 도 43b는 다중화된 판독 헤드의 개별 마이크로 형광 측정기에 의해 획득된 이미징 경로를 예시하는 다중화된 판독 헤드의 평면도를 도시한다.
도 44a 내지 도 44b는 본 명세서에 개시된 바와 같은 다중화된 판독 헤드의 비-제한적인 개략도를 제공한다. 도 44a는 복수의 개별 마이크로 형광 측정기의 제1 서브 세트가 제1 표면, 예를 들어, 흐름 셀의 제1 내부 표면을 이미징하도록 구성되고 복수의 개별 마이크로 형광 측정기의 제2 서브 세트가 제2 표면, 예를 들어 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하도록 구성된 다중화된 판독 헤드의 측면도를 도시한다. 도 44b는 다중화된 판독 헤드의 개별 마이크로 형광 측정기에 의해 획득된 이미징 경로를 도시하는 도 44a의 다중화된 판독 헤드의 평면도를 도시한다.
게놈 테스트 정확도의 상응하는 개선으로 이어지는 게놈학 적용을 위한 향상된 광학 해상도 및 개선된 이미지 품질을 제공하는 형광 이미징 방법 및 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 형광 이미징 기반 게놈학 적용을 위한 개선된 광학 해상도(고성능 광학 해상도 포함), 개선된 이미지 품질, 및 더 높은 처리량 중 임의의 하나 이상을 제공할 수 있는 고성능 형광 이미징 방법 및 시스템을 위한 광학 시스템 설계가 본 명세서에 개시된다. 개시된 광학 조명 및 이미징 시스템 설계는 다음 이점들 중 임의의 하나 이상을 제공할 수 있다: 개선된 다이크로익 필터 성능, 다이크로익 필터 주파수 응답의 균일성 증가, 여기 빔 필터링 개선, 더 큰 시야, 공간 해상도 증가, 개선된 변조 전달, 대조 대 잡음비, 및 이미지 품질, 더 높은 공간 샘플링 주파수, 샘플 평면을 재-위치 결정하여 일련의 이미지(예를 들어, 다양한 시야)를 캡처할 때 이미지 캡처 간의 더 빠른 전이, 개선된 이미징 시스템 듀티 사이클, 더 높은 처리량 이미지 획득 및 분석.
일부 경우에, 두꺼운 흐름 셀 벽(예를 들어, 벽(또는 커버슬립) 두께 > 700 ㎛) 및 유체 채널(예를 들어, 유체 채널 높이 또는 두께 50 내지 200 ㎛)의 사용을 포함하는 예를 들어 양면 (흐름 셀) 이미징 적용을 위한 이미징 성능의 개선은 대물 렌즈로부터 두꺼운 커버슬립 및/또는 유체 채널 반대쪽 측면 상의 이미징 표면에 의해 도입된 광학 수차를 보정하는 신규한 대물 렌즈 설계를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 경우에, 두꺼운 흐름 셀 벽(예를 들어, 벽(또는 커버슬립) 두께 > 700 ㎛) 및 유체 채널(예를 들어, 유체 채널 높이 또는 두께 50 내지 200 ㎛)의 사용을 포함하는 예를 들어 양면 (흐름 셀) 이미징 적용을 위한 이미징 성능의 개선은, 중간 이미지 평면에서 단순히 이미지를 형성하는 기존의 현미경의 튜브 렌즈와 달리, 대물 렌즈와 조합하여 두꺼운 흐름 셀 벽 및/또는 중간 유체 층에 의해 유도된 광학 수차를 보정하는 신규한 튜브 렌즈 설계를 사용함으로써 상업적으로 입수 가능한 기성품 대물 렌즈를 사용하는 경우에도 달성될 수 있다.
일부 경우에, 예를 들어 다중 채널(예를 들어, 2-컬러 또는 4-컬러) 이미징 적용을 위한 이미징 성능의 개선은 각 이미징 채널에 대해 하나씩, 다중 튜브 렌즈를 사용하여 달성될 수 있고, 여기서 각 튜브 렌즈 설계는 해당 이미징 채널에서 사용되는 특정 파장 범위에 맞게 최적화되었다.
일부 경우에, 예를 들어 양면 (흐름 셀) 이미징 적용을 위한 이미징 성능의 개선은, 흐름 셀의 상부 (가까운) 내부 표면 및 하부 (먼) 내부 표면을 분리하는 유체 층에 의해 유도된 광학 수차를 보상하기 위해 대물 렌즈와 조합되어 전기 광학 위상판을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 경우에, 이 설계 접근 방식은 또한 흐름 셀의 어떤 표면이 이미징되는지에 따라 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동되는 예를 들어 모션 작동 보상기에 의해 도입된 진동을 보상할 수도 있다.
여기 광 빔을 대물 렌즈로 지향시키고 대물 렌즈를 통해 투과된 방출 광을 복수의 검출 채널로 지향시키는 접힌 광학 경로(예를 들어, 하나 이상의 빔 스플리터 또는 빔 결합기, 예를 들어 다이크로익 빔 스플리터 또는 빔 결합기를 포함함)를 포함하는 조명 및 이미징 광학 경로를 포함할 수 있는 다양한 다중 채널 형광 이미징 모듈 설계가 개시되어 있다. 여기에 설명된 형광 이미징 모듈의 일부의 특히 유리한 특징들은 다이크로익 필터의 통과 대역과 저지 대역 파장 구역 사이에서 더 날카롭고 및/또는 더 균일한 전이를 발생시키는 다이크로익 필터 입사각의 사양을 포함한다. 이러한 필터는 접힌 광학 장치 내에 포함될 수 있고, 다이크로익 빔 스플리터 또는 결합기를 포함할 수 있다. 개시된 이미징 광학 장치 설계의 추가의 유리한 특징은 여기 빔을 수신하는 대물 렌즈 및 다이크로익 필터에 대한 하나 이상의 여기 광원 및 하나 이상의 검출 광학 경로의 위치 및 배향을 포함할 수 있다. 여기 빔은 또한 선형 편광될 수 있고, 선형 편광의 배향은 s-편광된 광이 다이크로익 필터의 다이크로익 반사 표면에 입사되도록 이루어질 수 있다. 이러한 특징은 잠재적으로 여기 빔 필터링을 개선시키고 및/또는 다이크로익 필터의 표면 변형으로 인해 방출 광선에 도입되는 파면 오차를 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 설명된 형광 이미징 모듈은 이러한 특징들 중 임의의 것을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있고, 이러한 이점들 중 임의의 것을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
또한, 예를 들어 흐름 셀 표면 상에 형성된 고정화된 핵산 분자 또는 증폭된 핵산 클러스터의 어레이를 이미징함으로써 다수의 상이한 핵산 시퀀스를 분석하도록 구성된 장치 및 시스템이 본 명세서에 설명되어 있다. 여기에 설명된 장치 및 시스템은 또한 예를 들어 비교 게놈학을 위한 시퀀싱을 수행하고, 유전자 발현을 추적하고, 마이크로 RNA 시퀀스 분석, 후성 유전학, 앱타머 및 파지 디스플레이 라이브러리 특성화를 수행하고, 다른 시퀀싱 적용을 수행하는 데 유용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 장치 및 시스템은 광학, 기계적, 유체, 열, 전기, 및 컴퓨팅 장치/양태의 다양한 조합을 포함한다. 개시된 흐름 셀 장치, 카트리지, 및 시스템에 의해 제공되는 이점들은 다음을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다: (i) 장치 및 시스템 제조 복잡성 및 비용의 감소, (ii) (예를 들어, 현재 사용 가능한 핵산 시퀀싱 시스템의 비용과 비교하여) 상당히 낮은 소모품 비용, (iii) 일반적인 흐름 셀 표면 기능화 방법과의 호환성, (iv) 미세 유체 구성 요소, 예를 들어, 시린지 펌프 및 다이어프램 밸브 등과 조합될 때 유연한 흐름 제어, 및 (v) 유연한 시스템 처리량.
기성품, 일회용, 단일 루멘(예를 들어, 단일 유체 흐름 채널) 또는 유체 어댑터, 카트리지 섀시, 하나 이상의 통합된 유체 흐름 제어 구성 요소, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 다중 루멘 모세관으로 구성되는 모세관 흐름 셀 장치 및 모세관 흐름 셀 카트리지가 본 명세서에 개시된다. 또한 하나 이상의 모세관 흐름 셀 장치(또는 미세 유체 칩), 하나 이상의 모세관 흐름 셀 카트리지(또는 미세 유체 카트리지), 유체 흐름 제어기 모듈, 온도 제어 모듈, 이미징 모듈, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 모세관 흐름 셀 기반 시스템이 본 명세서에 개시되어 있다.
일부 개시된 모세관 흐름 셀 장치, 카트리지, 및 시스템의 설계 특징에는 다음이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다: (i) 단일 흐름 채널 구성, (ii) 시스템과 모세관 사이의 유체 인터페이스가 안정적으로 밀봉되어, 이에 따라 모세관 교체 및 시스템 재사용을 용이하게 하고, 시약 농도, pH 및 온도와 같은 반응 조건의 정확한 제어를 가능하게 하도록 간단한 로드/언로드 기구로 구현될 수 있는 시약 흐름들 사이의 밀봉되고, 안정적이며 반복적인 전환, (iii) 유연한 시스템 처리량을 제공하기 위해 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 다중 흐름 채널을 포함하는 교체 가능한 단일 유체 흐름 채널 장치 또는 모세관 흐름 셀 카트리지, 및 (iv) 형광 이미징과 같은 매우 다양한 검출 방법과의 호환성.
개시된 모세관 흐름 셀 장치 및 시스템, 모세관 흐름 셀 카트리지, 모세관 흐름 셀 기반 시스템, 미세 유체 장치 및 카트리지, 및 미세 유체 칩 기반 시스템이 주로 핵산 시퀀싱 적용 분야에 대한 사용의 맥락에서 설명되지만, 개시된 장치 및 시스템의 다양한 양태들은 핵산 시퀀싱뿐만 아니라 임의의 다른 유형의 화학 분석, 생화학적 분석, 핵산 분석, 세포 분석, 또는 조직 분석 적용에도 적용될 수 있다. 개시된 방법, 장치, 및 시스템의 상이한 양태는 개별적으로, 집합적으로, 또는 서로 조합되어 인식될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 여기에서는 형광 이미징(예를 들어, 형광 현미경 이미징, 형광 공초점 이미징, 2-광자 형광 등을 포함함)의 맥락에서 주로 논의되지만, 개시된 광학 설계 접근 방식 및 특징 중 다수가 다른 이미징 모드, 예를 들어 명시야 이미징, 암시야 이미징, 위상차 이미징 등에 적용 가능하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
정의: 달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술 용어는 본 개시가 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 표현 및 "상기"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 본 명세서에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '약' 숫자는 해당 숫자에 그 숫자의 10 %를 더하거나 또는 뺀 것을 의미한다. 범위의 맥락에서 사용될 때 '약'이라는 용어는 해당 범위에서 가장 낮은 값의 10 %를 뺀 값 및 최대 값의 10 %를 더한 값을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이미징 모듈", "이미징 유닛", "이미징 시스템", "광학 이미징 모듈", "광학 이미징 유닛", 및 "광학 이미징 시스템"이라는 문구는 상호 교환 가능하게 사용되고, 예를 들어, 유체학 모듈, 온도 제어 모듈, 병진 스테이지, 로봇 유체 분배 및/또는 마이크로 플레이트 취급, 프로세서 또는 컴퓨터, 기기 제어 소프트웨어, 데이터 분석 및 디스플레이 소프트웨어 등을 포함할 수도 있는 더 큰 시스템의 구성 요소 또는 서브 시스템을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "검출 채널"은 샘플에서 발생하는 광학 신호를 검출기로 전달하도록 구성된 광학 시스템 내의 광학 경로(및/또는 그 안의 광학 구성 요소)를 지칭한다. 일부 경우에, 검출 채널은 분광 측정을 수행하기 위해 구성될 수 있으며, 예를 들어 광전자 증배관과 같은 검출기를 사용하여 형광 신호 또는 다른 광학 신호를 모니터링하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, "검출 채널"은 "이미징 채널", 즉, 이미지를 캡처하여 이미지 센서에 전달하도록 구성된 광학 시스템 내의 광학 경로(및/또는 그 안의 광학 구성 요소)일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "검출 가능한 라벨"은 당업자에게 공지된 다양한 검출 가능한 라벨 또는 태그(tags) 중 임의의 것을 지칭할 수 있다. 예에는 발색단, 형광단, 양자점, 상향 변환 인광체, 발광 또는 화학 발광 분자, 방사성 동위 원소, 자기 나노 입자, 질량 태그 등이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 일부 경우에, 바람직한 라벨은 형광단을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "여기 파장"은 형광 지시자(예를 들어, 형광단 또는 염료 분자)를 여기시키고 형광을 생성하는 데 사용되는 광의 파장을 지칭한다. 여기 파장은 일반적으로 단일 파장, 예를 들어 620 nm로 지정되지만, 본 명세서는 지정된 파장을 중심으로 하는 여기 필터 대역 통과 또는 파장 범위를 지칭한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, 지정된 여기 파장의 광은 지정된 파장 ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm 또는 그 초과의 광을 포함한다. 일부 경우에, 사용된 여기 파장이 형광 지시자의 최대 흡수 피크와 일치하거나 또는 일치하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "방출 파장"은 적절한 파장의 광에 의해 여기될 때 형광 지시자(예를 들어, 형광단 또는 염료 분자)에 의해 방출되는 광의 파장을 지칭한다. 방출 파장은 일반적으로 단일 파장, 예를 들어 670 nm로 지정되지만, 본 명세서는 지정된 파장을 중심으로 하는 파장 범위 또는 방출 필터 대역 통과를 지칭한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 일부 경우에, 특정 방출 파장의 광은 특정 파장 ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm 또는 그 초과의 광을 포함한다. 일부 경우에, 사용된 방출 파장이 형광 지시자의 최대 방출 피크와 일치하거나 또는 일치하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 형광은 표면 상에 있는 올리고뉴클레오티드 어댑터의 해당 세그먼트에 역상보성 구역을 갖고 상기 해당 세그먼트에 어닐링된 형광 라벨링된 핵산 시퀀스와 같이, 표면에 어닐링되거나 또는 다른 방식으로 테더링되어 있는 형광단에서 발생하는 경우 '특이적'이다. 이러한 형광은 이러한 어닐링 과정을 통해 표면에 테더링되어 있지 않은 형광단에서 발생하는 형광, 또는 일부 경우에는 표면의 배경 형광과 대조된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "핵산"("핵산 분자", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", 리보핵산(RNA), 또는 데옥시리보핵산(DNA)이라고도 함)은 공유 뉴클레오시드간 연결 에이지들(covalent internucleosidic link ages)에 의해 결합된 2 개 이상의 뉴클레오티드의 선형 중합체, 또는 그의 변이체 또는 기능적 단편이다. 핵산의 자연 발생 예들에서, 뉴클레오시드간 연결은 일반적으로 포스포디에스테르 결합이다. 그러나, 다른 예는 선택적으로 포스포로티올레이트 연결과 같은 다른 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 포스페이트 기를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 핵산은 이중 및 단일 가닥 DNA, 이중 및 단일 가닥 RNA, DNA/RNA 하이브리드, 펩티드-핵산(PNA), PNA와 DNA 또는 RNA 간의 하이브리드를 포함하고, 또한 다른 유형의 핵산 변형을 포함할 수도 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 일부 경우에, 뉴클레오티드는 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드(예를 들어, 2-데옥시-D-리보스를 포함하는 데옥시리보뉴클레오시드 또는 D-리보스를 포함하는 리보뉴클레오시드)이다. 다른 뉴클레오티드 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드 등을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다.
정보 파이프라인으로 간주되는 형광 이미징: 형광 이미징 시스템이 일반적인 게놈 어세이 기술(핵산 시퀀싱 적용을 포함함)에서 수행하는 역할에 대한 유용한 추상화는 정보 파이프라인이고, 여기서 광자 신호는 파이프라인의 일 단부, 예를 들어, 이미징에 사용되는 대물 렌즈에 들어가고, 형광 신호에 관한 위치 특정 정보는 파이프라인의 다른 쪽 단부, 예를 들어, 이미지 센서의 위치에서 나타난다. 이러한 파이프라인을 통해 더 많은 정보가 펌핑되면, 일부 콘텐츠는 불가피하게 이러한 전송 프로세스 중에 손실되고 복구되지 않는다. 이러한 경우의 예는 이미지에서 명확하게 분해(resolved)되기에 너무 많은 라벨링된 분자(또는 분자의 클론 증폭 클러스터)가 기판 표면의 작은 구역 내에 존재하는 경우이다; 이미지 센서의 위치에서는, 인접한 분자 클러스터에서 발생하는 광자 신호를 구별하기 어려워지므로, 이에 따라 신호를 잘못된 클러스터에 귀속시키고 검출 오류로 이어질 확률이 높아진다.
광학 이미징 모듈의 설계: 광학 이미징 모듈을 설계하는 목표는 따라서 이러한 검출 파이프라인을 통한 정보 콘텐츠의 흐름을 최대화하고 검출 오류를 최소화하는 것이다. 다음을 포함하여, 설계 프로세스에서 몇 가지 주요 설계 요소가 처리될 필요가 있다:
1) 광학 이미징 시스템의 전체 이미지 품질 및 사용된 이미지 센서의 픽셀 샘플링 주파수와, 이미징될 기판 표면의 물리적 특징 밀도의 일치. 이러한 파라미터들이 일치하지 않으면 정보가 손실되거나 또는 때로는 심지어 잘못된 정보가 생성될 수 있는데, 예를 들어, 픽셀 샘플링 주파수가 광학 해상도 한계의 2 배보다 낮을 때 공간 앨리어싱(spatial aliasing)이 발생할 수 있다.
2) 전체 시야에 걸쳐 광학 이미징 시스템의 전체 이미지 품질 및 초점 품질과, 이미징될 영역의 크기의 일치.
3) 배경 신호 및 시스템 잡음 특성을 고려하면서, 입력 여기 광자 플럭스, (염료 흡광 계수 및 형광 양자 수율과 관련된) 염료 효율에 대해 예상되는 형광 광자 플럭스와, 광학 시스템 설계의 광 수집 효율, 변조 전달 함수, 및 이미지 센서 성능 특성의 일치.
4) 형광 이미징 채널 간의 크로스토크를 감소시키기 위해 스펙트럼 콘텐츠의 분리를 최대화.
5) 이미징 시스템의 다운 시간을 최소화(또는 듀티 사이클 최대화)하여 이에 따라 이미지 캡처 프로세스의 전체 처리량을 최대화하기 위해 서로 다른 시야의 이미지 캡처 간에 샘플 또는 광학 장치의 재-위치 결정과 이미지 획득 단계의 효과적인 동기화.
본 개시는 위에서 개략적으로 설명된 각각의 설계 요소를 처리하고 이미징 시스템에 대한 구성 요소 레벨 사양을 생성하는 체계적인 방법을 설명한다.
정보 전송 및 처리량을 개선하거나 또는 최대화하기 위한 개선된 광학 해상도 및 이미지 품질: 하나의 비-제한적인 설계 관행은 mm당 라인 쌍(line pairs)(lp/mm)의 개수(X)에 대해 지정된 바와 같이 2 개의 인접한 특징을 구별하는 데 필요한 광학 해상도로 시작하여 이를 해당 개구수(NA) 요구로 변환하는 것일 수 있다. 그런 다음 개구수 요구를 사용하여, 변조 전달 함수 및 이미지 콘트라스트에 미치는 결과적인 영향을 평가할 수 있다.
표준 변조 전달 함수(MTF)는 광학 시스템을 통해 전달된 이미지 콘트라스트(변조)에 대한 공간 주파수 응답을 설명한다: 이미지 콘트라스트는 공간 주파수의 함수로서 감소하고, NA가 증가함에 따라 증가한다. 이 함수는 주어진 NA에 대해 달성될 수 있는 콘트라스트/변조를 제한한다. 또한, 파면 오차는 MTF에 부정적인 영향을 줄 수 있으므로, 이에 따라 회절 제한 광학에 의해 예측되는 것 대신에 실제 시스템 MTF를 사용하여 광학 시스템 설계를 개선하거나 또는 최적화하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용되는 바와 같이, 설계 관행은 주로 대물 렌즈의 MTF를 고려할 수 있지만, MTF는 전체 시스템 MTF(커버슬립으로부터 이미지 센서까지의 전체 광학 경로를 포함함)를 의미한다.
이미징될 대상이 표면 상의 고밀도 "스폿"의 어레이(임의로 분포되거나 또는 패터닝됨)인 게놈 테스트 적용에서, 2 개의 인접한 스폿을 분해하고 4 개의 가능한 상태(예를 들어, 온-오프, 온-온, 오프-온 및 오프-오프)를 구별하기 위해, 다운스트림 분석에 필요한 최소 변조 전달 값을 결정할 수 있다. 예를 들어, 스폿이 포인트 광원으로 근사될 만큼 충분히 작다고 가정한다. 검출 작업이 거리(d)만큼 분리된 2 개의 인접한 스폿이 온인지 또는 오프인지(즉, 밝은지 또는 어두운지) 결정하는 것이라고 가정하고, 샘플 평면(또는 객체 평면)의 스폿에서 발생하는 형광 신호에 대한 대조 대 잡음비(CNR)는 Csample이라고 가정하면, 이 경우 이상적인 조건 하에서, 이미지 센서 평면에서 2 개의 인접한 스폿에 대한 판독 신호의 CNR(Cimage)은 Cimage = Csample * MTF(1/d)로 밀접하게 근사화될 수 있고, 여기서 MTF(1/d)는 공간 주파수 = (1/d)에서의 MTF 값이다.
일반적인 설계에서, C의 값은 형광 신호의 오분류를 회피하기 위해 간단한 임계값 방법이 사용될 수 있도록 적어도 4일 필요가 있을 수 있다. Cimage > 4 에서, 평균값 주변의 형광 신호 강도의 가우스 분포를 가정하면, 형광 신호를 올바르게 분류할 때(예를 들어, 온 또는 오프로) 예상되는 오류는 < 0.035 %이다. 미국 특허 출원 번호 16/363,842에 설명된 것과 같은 독점적인 높은 CNR 시퀀싱 및 표면 화학의 사용에 의해, MTF가 100 %에 가까운 값을 갖는 희박한 필드에 대해 (즉, 클러스터 또는 스폿의 낮은 표면 밀도에서) 측정될 때 12 초과의(또는 훨씬 더 높은) 기판 표면에 테더링된 클론 증폭된 라벨링된 올리고뉴클레오티드 분자의 클러스터에 대한 샘플 평면 CNR(Csample) 값을 달성할 수 있다. Csample > 12의 샘플 평면 CNR 값을 가정하고 < 0.1 %의 분류 오류율을 목표로 하여(따라서 Cimage > 4), 일부 구현에서 M(1/d)의 최소값은 M(1/d) = 4/12 ~ 33 %로 결정될 수 있다. 따라서, 적어도 33 %의 변조 전달 함수 임계값이 전달된 이미지의 정보 콘텐츠를 유지하는 데 사용될 수 있다.
설계 관행은, d = (1mm)/X 로서, 2 개의 특징 또는 스폿의 최소 분리 거리(d)를 광학 해상도 요구(위에서 X (lp/mm)으로 언급된 바와 같이 지정됨)에 관련시킬 수 있는데, 즉, d는 광학 시스템에 의해 완전히 분해될 수 있는 2 개의 특징 또는 스폿 사이의 최소 분리 거리이다. 설계 분석의 목적이 관련 정보 전달을 증가시키거나 또는 최대화하는 것인 본 명세서에 개시된 일부 설계에서, 이러한 설계 기준은 d = (1mm)/X/A로 완화될 수 있고, 여기서 2 > A > 1 이다. X lp/mm의 동일한 광학 해상도에 대해, 샘플 평면에서 최소 분해 가능한 스폿 분리 거리인 d의 값이 감소하여, 이에 따라 더 높은 특징 밀도를 사용할 수 있게 한다.
설계 관행은 나이키스트 기준(Nyquist criteria)을 사용하여 샘플 평면에서 최소 공간 샘플링 주파수를 결정하고, 여기서 공간 샘플링 주파수 S ≥ 2*X 이다(그리고 여기서 X는 위에서 언급된 바와 같이 X lp/mm로 지정된 이미징 시스템의 광학 해상도임). 시스템 공간 샘플링 주파수가 나이키스트 기준에 가까울 때, 종종 그러한 바와 같이, S 초과의 이미징 시스템 해상도는 광학 시스템에 의해 분해된 더 높은 주파수 정보가 이미지 센서에 의해 충분히 샘플링될 수 없기 때문에 앨리어싱을 발생시킨다.
본 명세서에 개시된 설계들 중 일부에서, S = B*Y(여기서 B ≥ 2이고, Y는 실제 광학 시스템 MTF 한계임) 관계에 기반한 오버샘플링 방식을 사용하여, 이미징 시스템의 정보 전달 용량을 더욱 개선시킬 수 있다. 위에 표시된 바와 같이, X (lp/mm)는 실제적인 0이 아닌(> 33 %) 최소 변조 전달 값에 해당하는 반면, Y (lp/mm)는 광학 해상도의 한계이므로 Y (lp/mm)에서의 변조는 0이다. 따라서, 개시된 설계에서, Y (lp/mm)는 유리하게는 X보다 상당히 더 클 수 있다. B ≥ 2의 값에 대해, 개시된 설계는 샘플 객체 주파수 X, 즉 S ≥ B*Y > 2*X에 대해 오버샘플링된다.
위의 관계는 시스템 배율을 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이미지 센서 픽셀 크기에 대한 상한을 제공할 수 있다. 이미지 센서 픽셀 크기의 선택은 시스템 광학 품질뿐만 아니라, 앨리어싱을 감소시키는 데 필요한 공간 샘플링 주파수와도 일치한다. 이미지 센서 픽셀 크기의 하한은, 픽셀이 작을수록 상대적 잡음 기여도가 증가하므로, 광자 처리량을 기반으로 결정될 수 있다.
그러나 다른 설계 접근 방식도 가능하다. 예를 들어, NA를 0.6 미만(예를 들어, 0.5 이하)으로 감소시키는 것은 증가된 피사계 심도를 제공할 수 있다. 이러한 증가된 피사계 심도는 이중 표면 이미지닝을 가능하게 할 수 있고, 여기서 상이한 깊이에 있는 2 개의 표면은 리포커싱을 갖거나 갖지 않고 동시에 이미징될 수 있다. 위에서 논의된 바와 같이, NA를 감소시키는 것은 광학 해상도를 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 더 높은 여기 빔 출력, 예를 들어 1 W 이상을 사용하여 강한 신호를 생성할 수 있다. 본질적으로 고 콘트라스트 샘플(즉, 강한 전경 신호(foreground signal) 및 극적으로 감소된 배경 신호를 나타내는 샘플 표면을 포함함)은, 핵산 시퀀싱 적용 등에서 염기 호출(base-calling)에 대한 개선된 신호 식별을 제공하는 예를 들어 > 20 의 CNR 값을 갖는 높은 대조 대 잡음비(CNR) 이미지의 획득을 용이하게 하도록 사용될 수도 있다. 본 명세서에 개시된 일부 광학 시스템 설계에서, 배경 잡음(background noise)을 감소시키기 위해 친수성 표면을 가진 흐름 셀과 같은 샘플 지지 구조가 사용된다.
다양한 구현에서, 개시된 광학 시스템에 의해 큰 시야(FOV)가 제공된다. 예를 들어, 2 또는 3 mm 초과의 FOV는 예를 들어 대물 렌즈 및 튜브 렌즈를 포함하는 일부 광학 이미징 시스템과 함께 제공될 수 있다. 일부 경우에, 광학 이미징 시스템이 축소된 배율, 예를 들어, 10x 미만의 배율을 제공한다. 이러한 축소된 배율은 일부 구현에서 큰 FOV 설계를 용이하게 할 수 있다. 축소된 배율에도 불구하고, 작은 픽셀 크기 또는 피치를 갖는 검출기 어레이가 사용될 수 있기 때문에, 이러한 시스템의 광학 해상도는 여전히 충분할 수 있다. 일부 구현에서, 광학 이미징 시스템(예를 들어, 대물 렌즈 및 튜브 렌즈)에 의해 제공되는 광학 해상도의 2 배보다 작은 픽셀 크기를 포함하는 이미지 센서는 나이키스트 정리(Nyquist theorem)를 만족시키도록 사용될 수 있다.
다른 설계도 또한 가능하다. 깊이가 다른 2 개의 표면이 동시에 이미징될 수 있는 이중 표면 이미징을 제공하도록 구성된 일부 광학 설계에서, 광학 이미징 시스템(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈)은 다른 깊이의 다른 위치(예를 들어, 다른 평면)에서보다 해당 2 개의 각각의 깊이에서 상기 2 개의 표면(예를 들어, 2 개의 평면)을 이미징하기 위한 광학 수차를 감소시키도록 구성된다. 추가적으로, 광학 이미징 시스템은 상기 샘플 지지 구조 상의 투과 층(예를 들어, 유리 층(예를 들어, 커버 슬립))을 통해 그리고 샘플을 포함하거나 또는 상기 2 개의 표면 중 적어도 하나의 표면 상에서 샘플과 접촉하는 용액(예를 들어, 수용액)을 통해 해당 2 개의 각각의 깊이에서 상기 2 개의 표면(예를 들어, 2 개의 평면)을 이미징하기 위한 수차를 감소시키도록 구성될 수 있다.
다중 채널 형광 이미징 모듈 및 시스템: 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 이미징 모듈 또는 시스템은 형광 이미징 모듈 또는 시스템을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 형광 이미징 시스템은 (단일 파장에서 또는 단일 여기 파장 범위 내에서 여기 광을 제공하기 위한) 단일 형광 여기 광원 및 여기 광을 샘플(예를 들어, 기판 표면 상에 배치된 형광-태그된 핵산 분자 또는 그 클러스터)에 전달하도록 구성된 광학 경로를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 형광 이미징 시스템은 단일 형광 방출 이미징 및 검출 채널, 예를 들어 샘플에 의해 방출된 형광을 수집하고 샘플의 이미지(예를 들어, 형광 태그된 핵산 분자 또는 그 클러스터가 배치된 기판 표면의 이미지)를 이미지 센서 또는 다른 광검출 장치로 전달하도록 구성된 광학 경로를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 형광 이미징 시스템은 2, 3, 4, 또는 4 개 초과의 형광 여기 광원 및/또는 2 개, 3 개, 4 개 또는 4 개 초과의 여기 파장에서(또는 2 개, 3 개, 4 개 또는 4 개 초과의 여기 파장 범위 내에서) 여기 광을 전달하도록 구성된 광학 경로를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 형광 이미징 시스템은 2, 3, 4 또는 4 개 초과의 방출 파장에서(또는 2 개, 3 개, 4 개 또는 4 개 초과의 방출 파장 범위 내에서) 샘플에 의해 방출된 형광을 수집하고 샘플의 이미지(예를 들어, 형광 태그된 핵산 분자 또는 그 클러스터가 배치된 기판 표면의 이미지)를 2 개, 3 개, 4 개 또는 4 개 초과의 이미지 센서 또는 다른 광검출 장치로 전달하도록 구성된 2 개, 3 개, 4 개 또는 4 개 초과의 형광 방출 이미징 및 검출 채널을 포함할 수 있다.
이중 표면 이미징: 일부 경우에, 형광 이미징 시스템을 포함하여 본 명세서에 개시된 이미징 시스템은 단일 샘플 지지 구조 또는 기판 표면의 고 해상도 이미지를 획득하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 형광 이미징 시스템을 포함하여 본 명세서에 개시된 이미징 시스템은 2 개 이상의 샘플 지지 구조 또는 기판 표면, 예를 들어 흐름 셀의 2 개 이상의 표면의 고 해상도 이미지를 획득하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 개시된 이미징 시스템에 의해 제공되는 고 해상도 이미지는 다양한 시약이 흐름 셀을 통해 또는 흐름 셀 기판 주위로 흐를 때 흐름 셀의 2 개 이상의 표면에서 발생하는 반응(예를 들어, 핵산 혼성화, 증폭, 및/또는 시퀀싱 반응)을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 도 1a 및 도 1b는 이러한 이중 표면 지지 구조의 개략도를 제공한다. 도 1a는 분석물 또는 시약이 흐를 수 있는 내부 흐름 채널을 포함하는 흐름 셀과 같은 이중 표면 지지 구조를 도시한다. 흐름 채널은 도시된 바와 같이 제1 및 제2, 상단 및 하단, 및/또는 전방 및 후방 플레이트와 같은 제1 및 제2, 상단 및 하단, 및/또는 전방 및 후방 층 사이에 형성될 수 있다. 하나 이상의 플레이트는 커버슬립 등과 같은 유리 플레이트를 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 층은 붕규산 유리, 석영, 또는 플라스틱을 포함한다. 이러한 상단 및 하단 층의 내부 표면은 흐름 셀의 흐름 채널을 통한 분석물 또는 시약의 흐름을 제한하는 데 도움이 되는 흐름 채널의 벽을 제공한다. 일부 설계에서, 이러한 내부 표면은 평면이다. 유사하게, 상단 및 하단 층은 평면일 수 있다. 일부 설계에서, 적어도 하나의 추가 층(도시되지 않음)이 상단 및 하단 층 사이에 배치된다. 이러한 추가 층은, 하나 이상의 흐름 채널을 정의하고 흐름 채널 내에서 분석물 또는 시약의 흐름을 제어하는 데 도움이 되는 하나 이상의 경로가 내부에 절단되어 있을 수 있다. 샘플 지지 구조, 예를 들어, 흐름 셀에 대한 추가 논의는 아래에서 발견될 수 있다.
도 1a는 흐름 셀의 제1 및 제2, 상단 및 하단, 및/또는 전방 및 후방 내부 표면 상의 복수의 형광 샘플 부위를 개략적으로 예시한다. 일부 구현에서, 형광이 이러한 부위에서 방출되도록 샘플을 결합하기 위해 이러한 부위에서 반응이 발생할 수 있다(도 1a는 개략적이고 축척에 맞게 그려진 것이 아니라는 점에 유의하도록 한다; 예를 들어, 형광 샘플 부위의 크기 및 간격은 도시된 것보다 더 작을 수 있다).
도 1b는 이미징될 형광 샘플 부위를 포함하는 2 개의 표면을 갖는 또 다른 이중 표면 지지 구조를 도시한다. 샘플 지지 구조는 제1 및 제2, 상단 및 하단, 및/또는 전방 및 후방 외부 표면을 갖는 기판을 포함한다. 일부 설계에서, 이러한 외부 표면은 평면이다. 다양한 구현에서, 분석물 또는 시약은 이러한 제1 및 제2 외부 표면을 가로질러 흐른다. 도 1b는 샘플 지지 구조의 제1 및 제2, 상단 및 하단, 및/또는 전방 및 후방 외부 표면 상의 복수의 형광 샘플 부위를 개략적으로 예시한다. 일부 구현에서, 형광이 이러한 부위에서 방출되도록 샘플을 결합하기 위해 이러한 부위에서 반응이 발생할 수 있다(도 1b는 개략적이며 축척에 맞게 그려진 것이 아니라는 점에 유의하도록 한다; 예를 들어, 형광 샘플 부위의 크기 및 간격은 도시된 것보다 더 작을 수 있다).
일부 경우에, 본 명세서에 설명된 형광 이미징 모듈 및 시스템은 대물 렌즈로부터 상이한 거리에서 제1 및 제2 표면 상의 이러한 형광 샘플 부위를 이미징하도록 구성될 수 있다. 일부 설계에서는, 한 번에 제1 또는 제2 표면 중 하나만이 인-포커스(in focus)된다. 따라서, 이러한 설계에서, 표면 중 하나는 제1 시간에 이미징되고, 다른 표면은 제2 시간에 이미징된다. 형광 이미징 모듈의 초점은, 2 개의 표면의 이미지가 동시에 인-포커스되지는 않기 때문에, 비슷한 광학 해상도로 다른 표면을 이미징하기 위해 표면 중 하나를 이미징한 후 변경될 수 있다. 일부 설계에서, 광학 보상 요소는 2 개의 표면 중 하나를 이미징하기 위해 샘플 지지 구조와 이미지 센서 사이의 광학 경로에 도입될 수 있다. 이러한 형광 이미징 구성에서 피사계 심도는 제1 및 제2 표면을 모두 포함할 만큼 충분히 크지 않을 수 있다. 본 명세서에 설명된 형광 이미징 모듈의 일부 구현에서, 제1 및 제2 표면 모두는 같은 시간에, 즉 동시에 이미징될 수 있다. 예를 들어, 형광 이미징 모듈은 양쪽 표면을 모두 포함할 수 있을 만큼 충분히 큰 피사계 심도를 가질 수 있다. 일부 경우에, 이러한 증가된 피사계 심도는 예를 들어 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이 대물 렌즈(또는 현미경 대물 렌즈)의 개구수를 감소시킴으로써 제공될 수 있다.
도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 이미징 광학 장치(예를 들어, 대물 렌즈)는 검출 채널의 이미지 센서 상에 제1 및 제2 표면의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해 제1 및 제2 표면으로부터 적절한 거리(예를 들어, 작동 거리에 대응하는 거리)에 위치될 수 있다. 도 1a 및 도 1b의 예에 도시된 바와 같이, 제1 표면은 상기 대물 렌즈와 제2 표면 사이에 있을 수 있다. 예를 들어, 도시된 바와 같이, 대물 렌즈는 제1 및 제2 표면 모두 위에 배치되고, 제1 표면은 제2 표면 위에 배치된다. 예를 들어, 제1 및 제2 표면은 서로 다른 깊이에 있다. 제1 및 제2 표면은 형광 이미징 모듈, 조명 및 이미징 모듈, 이미징 광학 장치, 또는 대물 렌즈 중 임의의 하나 이상으로부터 서로 다른 거리에 있다. 제1 및 제2 표면은 제1 표면이 제2 표면 위로 이격되어 서로 분리된다. 도시된 예에서, 제1 및 제2 표면은 평면 표면이고, 상기 제1 및 제2 평면 표면에 수직인 방향을 따라 서로 분리되어 있다. 또한, 도시된 예에서, 상기 대물 렌즈는 광축을 갖고, 상기 제1 및 제2 표면은 상기 광축의 방향을 따라 서로 분리되어 있다. 유사하게, 제1 표면과 제2 표면 사이의 분리는 예를 들어 여기 빔의 광학 경로를 따라 및/또는 형광 이미징 모듈 및/또는 대물 렌즈를 통한 광축을 따라 종 방향 거리에 대응할 수 있다. 따라서, 이들 2 개의 표면은 여기 빔의 중심축 및/또는 대물 렌즈 및/또는 형광 이미징 모듈의 광축의 방향을 따를 수 있는 종 방향(Z) 방향으로 서로 거리만큼 분리될 수 있다. 이러한 분리는 예를 들어 일부 구현에서 흐름 셀 내의 흐름 채널에 대응할 수 있다.
다양한 설계에서, (가능하게는 예를 들어 튜브 렌즈와 같은 다른 광학 구성 요소와 조합된) 대물 렌즈는 적어도 제1 표면과 제2 표면 사이의 종 방향 분리(Z 방향으로)만큼 큰 피사계 심도 및/또는 초점 심도를 갖는다. 따라서, 대물 렌즈는, 단독으로 또는 추가 광학 구성 요소과 조합되어, 하나 이상의 검출 채널의 이미지 센서 상의 제1 및 제2 표면 모두의 인-포커스 이미지를 동시에 형성할 수 있고, 여기서 이들 이미지는 유사한 광학 해상도를 갖는다. 일부 구현에서, 이미징 모듈은 유사한 광학 해상도로 제1 및 제2 표면 모두의 이미지를 캡처하기 위해 리포커싱될 필요가 있을 수도 있고 또는 리포커싱될 필요가 없을 수도 있다. 일부 구현에서, 보상 광학 장치는 제1 및 제2 표면의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해 이미징 모듈의 광학 경로 내부 또는 외부로 이동될 필요가 없다. 유사하게, 일부 구현에서, 이미징 모듈(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈)의 하나 이상의 광학 요소(예를 들어, 렌즈 요소)는 제2 표면의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해 사용될 때 상기 하나 이상의 광학 요소의 위치와 비교하여 제1 표면의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해 예를 들어 제1 및/또는 제2 광학 경로를 따라(예를 들어, 이미징 광학 장치의 광축을 따라) 종 방향으로 이동될 필요가 없다. 그러나, 일부 구현에서, 이미징 모듈은 동시에 인-포커스된 제1 및 제2 표면 모두를 제공하도록 구성된 오토 포커스 시스템을 포함한다. 다양한 구현에서, 샘플은 측면 방향으로(예를 들어, X 및 Y 방향) 서로 밀접하게 이격된 샘플 부위를 충분히 분해하도록 인-포커스되어 있다. 따라서, 다양한 구현에서, 샘플 지지 구조의 제1 표면 및 상기 샘플 지지 구조의 제2 표면 상에 형광 샘플 부위의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해 광학 요소는 적어도 하나의 검출 채널에서 이미지 센서(또는 광검출기 어레이)와 샘플 지지 구조 사이의(예를 들어, 샘플 지지 구조를 지지하는 병진 스테이지 사이의) 광학 경로에 진입하지 않는다. 유사하게, 다양한 구현에서, 이미지 센서 또는 광검출기 어레이의 샘플 지지 구조의 제1 표면에 형광 샘플 부위의 인-포커스 이미지를 형성하는 데 광학 보상이 사용되지 않고, 이는 이미지 센서 또는 광검출기 어레이에서 샘플 지지 구조의 제2 표면에 형광 샘플 부위의 인-포커스 이미지를 형성하는 데 사용되는 광학 보상과 동일하지 않다. 추가적으로, 특정 구현에서, 샘플 지지 구조의 제2 표면에 형광 샘플 부위의 인-포커스 이미지를 형성하는 것과 샘플 지지 구조의 제1 표면에 형광 샘플 부위의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해, 적어도 하나의 검출 채널에서 이미지 센서와 샘플 지지 구조 사이의(예를 들어, 샘플 지지 구조를 지지하는 병진 스테이지 사이의) 광학 경로에 있는 광학 요소는 다르게 조정되지 않는다. 유사하게, 일부 다양한 구현에서, 이미지 센서 상의 상기 샘플 지지 구조의 제2 표면 상에 형광 샘플 부위의 인-포커스 이미지를 형성하는 것과 이미지 센서 상의 샘플 지지 구조의 제1 표면 상에 형광 샘플 부위의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해, 적어도 하나의 검출 채널에서 이미지 센서와 샘플 지지 구조 사이의(예를 들어, 샘플 지지 구조를 지지하는 병진 스테이지 사이의) 광학 경로에 있는 광학 요소는 다른 양 또는 다른 방향으로 이동되지 않는다. 이러한 특징들의 임의의 조합이 가능하다. 예를 들어, 일부 구현에서, 흐름 셀과 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로의 내부로 또는 외부로 광학 보상기를 이동하지 않고 그리고 이미징 시스템의 하나 이상의 광학 요소(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈)를 그 사이의 광학 경로(예를 들어, 광축)를 따라 이동하지 않고, 흐름 셀의 상부 내부 표면과 하부 내부 표면의 인-포커스 이미지를 획득할 수 있다. 예를 들어, 튜브 렌즈의 하나 이상의 광학 요소를 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동시키지 않고 또는 튜브 렌즈의 하나 이상의 광학 요소를 그 사이의 광학 경로(예를 들어, 광축)를 따라 이동시키지 않고, 흐름 셀의 상부 내부 표면 및 하부 내부 표면의 인-포커스 이미지를 획득할 수 있다.
형광 이미징 모듈, 조명 광학 경로, 이미징 광학 경로, 대물 렌즈, 또는 튜브 렌즈 중 임의의 하나 이상은 예를 들어 형광 샘플 부위가 위치되는 흐름 셀 또는 다른 샘플 지지 구조의 2 개의 표면에 해당하는 2 개의 평면과 같은 2 개의 위치에서 광학 수차를 감소시키거나 또는 최소화하도록 설계할 수 있다. 형광 이미징 모듈, 조명 광학 경로, 이미징 광학 경로, 대물 렌즈, 또는 튜브 렌즈 중 임의의 하나 이상은 이중 표면 흐름 셀 상의 형광 샘플 부위를 포함하는 제1 및 제2 표면과 같은 다른 위치 또는 평면에 비해 선택된 위치 또는 평면에서 광학 수차를 감소시키거나 또는 최소화하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 형광 이미징 모듈, 조명 광학 경로, 이미징 광학 경로, 대물 렌즈, 또는 튜브 렌즈 중 임의의 하나 이상은 대물 렌즈로부터 다른 거리에 있는 다른 깊이 또는 평면과 관련된 수차와 비교하여 대물 렌즈로부터 상이한 거리에 위치된 2 개의 깊이 또는 평면에서 광학 수차를 감소시키거나 또는 최소화하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 광학 수차는 대물 렌즈로부터 약 1 내지 약 10 mm 범위의 구역에서 다른 곳보다 제1 및 제2 표면을 이미징하는 데에 더 적을 수 있다. 추가적으로, 형광 이미징 모듈, 조명 광학 경로, 이미징 광학 경로, 대물 렌즈, 또는 튜브 렌즈 중 임의의 하나 이상은, 일부 경우에, 가능하게는 샘플과 접촉하고 있는 용액뿐만 아니라 샘플이 부착되는 표면 중 하나를 포함하는 층과 같은 샘플 지지 구조의 하나 이상의 부분을 통한 방출 광의 투과에 의해 유도되는 광학 수차를 보상하도록 구성될 수 있다. 이 층(예를 들어, 커버슬립 또는 흐름 셀의 벽)은 예를 들어 유리, 석영, 플라스틱, 또는 굴절률을 갖고 광학 수차를 도입하는 다른 투명 재료를 포함할 수 있다.
따라서, 제1 표면 및 제2 표면을 이미징할 때 이미징 성능이 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 광학 전달 함수(optical transfer functions)(OTF) 및/또는 변조 전달 함수(MTF)는 제1 및 제2 표면의 이미징에 대해 실질적으로 동일할 수 있다. 이들 전달 함수 중 어느 하나 또는 둘 모두는, 예를 들어 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서 또는 공간 주파수 범위에 대해 평균화될 때 서로의 20 % 이내, 15 % 이내, 10 % 이내, 5 % 이내, 2.5 % 이내, 또는 1 % 이내, 또는 이러한 값들 중 임의의 것에 의해 형성된 임의의 범위 내에 있을 수 있다. 따라서, 이미징 성능 메트릭은 광학 보상기를 흐름 셀과 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동시키지 않고 그리고 그 사이의 광학 경로(예를 들어, 광축)를 따라 이미징 시스템의 하나 이상의 광학 요소(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈)를 이동시키지 않고, 흐름 셀의 상부 내부 표면 또는 하부 내부 표면을 이미징하기 위해 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 이미징 성능 메트릭은 튜브 렌즈의 하나 이상의 광학 요소를 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동시키지 않고 또는 그 사이의 광학 경로(예를 들어, 광축)를 따라 튜브 렌즈의 하나 이상의 광학 요소를 이동시키지 않고, 흐름 셀의 상부 내부 표면 또는 하부 내부 표면을 이미징하기 위해 실질적으로 동일할 수 있다. MTF에 대한 추가 논의는 아래 및 2020년 1월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/962,723에 포함되어 있으며, 이 출원은 전체가 참조로 여기에 통합된다.
개시된 이미징 모듈 또는 시스템은, 일부 경우에, 샘플 또는 기판 표면을 이미징하기 위해 설계된 독립형 광학 시스템일 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 일부 경우에, 이들은 하나 이상의 프로세서 또는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이들은 기기 제어 기능 및/또는 이미지 처리 기능을 제공하는 하나 이상의 소프트웨어 패키지를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 광원(예를 들어, 고체 레이저, 염료 레이저, 다이오드 레이저, 아크 램프, 텅스텐-할로겐 램프 등), 렌즈, 프리즘, 미러, 다이크로익 반사기, 빔 스플리터, 광학 필터, 광 대역 통과 필터, 광 가이드, 광섬유, 조리개, 및 이미지 센서(예를 들어, CMOS(상보형 금속산화 반도체)(complementary metal oxide semiconductor) 이미지 센서 및 카메라, CCD(전하 결합 소자)(charge-coupled device) 이미지 센서 및 카메라 등)와 같은 광학 구성 요소 외에도, 이들은 또한 X-Y 병진 스테이지, X-Y-Z 병진 스테이지, 압전 포커싱 기구, 전기 광학 위상판 등과 같은 기계적 및/또는 광기계적 구성 요소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이들은 예를 들어 게놈학 적용(예를 들어, 유전자 검사 및/또는 핵산 시퀀싱 적용)을 위해 설계된 더 큰 시스템의 모듈, 구성 요소, 서브 조립체, 또는 서브 시스템으로 기능할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 이들은 차광(light-tight) 및/또는 다른 환경 제어 하우징, 온도 제어 모듈, 흐름 셀 및 카트리지, 유체학 제어 모듈, 유체 분배 로봇, 카트리지 및/또는 마이크로 플레이트 취급 (픽 앤 플레이스) 로봇, 하나 이상의 프로세서 또는 컴퓨터, 하나 이상의 로컬 및/또는 클라우드 기반 소프트웨어 패키지(예를 들어, 기기/시스템 제어 소프트웨어 패키지, 이미지 처리 소프트웨어 패키지, 데이터 분석 소프트웨어 패키지), 데이터 저장 모듈, 데이터 통신 모듈(예를 들어, 블루투스, WiFi, 인트라넷, 또는 인터넷 통신 하드웨어 및 관련 소프트웨어), 디스플레이 모듈 등, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 더 큰 시스템의 모듈, 구성 요소, 서브 조립체 또는 서브 시스템으로 기능할 수 있다. 더 큰 시스템, 예를 들어, 게놈학 적용을 위해 설계된 시스템의 이러한 추가 구성 요소는 아래에서 더 자세히 설명하도록 한다.
도 2a 및 도 2b는 다중 채널 형광 이미징을 위한 조명 및 이미징 모듈(100)의 비-제한적인 예를 도시한다. 조명 및 이미징 모듈(100)은 대물 렌즈(110), 조명 소스(115), 복수의 검출 채널(120), 및 다이크로익 반사기 또는 빔 스플리터를 포함할 수 있는 제1 다이크로익 필터(130)를 포함한다. 예를 들어, 이미징 시스템이 인-포커스되어 있는 때를 결정하기 위해 그 크기가 모니터링되는 스폿을 투사하는 오토 포커스 레이저(102)를 포함할 수 있는 오토 포커스 시스템이 일부 설계에 포함될 수 있다. 조명 및 이미징 모듈(100)의 일부 또는 모든 구성 요소는 베이스 플레이트(105)에 커플링될 수 있다.
조명 소스 또는 광원(115)은 적어도 원하는 여기 파장의 광을 생성하도록 구성된 임의의 적합한 광원을 포함할 수 있다(아래에서 더 상세히 논의됨). 광원은 하나 이상의 여기 파장 범위(또는 대역) 내에서 광을 방출하는 광대역 소스일 수 있다. 광원은 하나 이상의 더 좁은 파장 범위 내에서 광을 방출하는 협대역 소스일 수 있다. 일부 경우에, 광원은 원하는 여기 파장에 대응하는 단일의 분리된 파장(또는 라인), 또는 다중의 분리된 파장(또는 라인들)을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 이 라인들은 일부 매우 좁은 대역폭을 가질 수 있다. 조명 소스(115)에 사용하기에 적합할 수 있는 예시적인 광원은 백열 필라멘트, 크세논 아크 램프, 수은 증기 램프, 발광 다이오드, 레이저 다이오드 또는 고체 레이저와 같은 레이저 소스, 또는 다른 유형의 광원을 포함하지만, 그러나 이들에 한정되지 않는다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 일부 설계에서, 광원은 선형 편광된 광원과 같은 편광된 광원을 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 광원의 배향은 s-편광된 광이 하나 이상의 다이크로익 필터의 다이크로익 반사 표면과 같은 하나 이상의 광학 구성 요소의 하나 이상의 표면에 입사하도록 이루어진다.
조명 소스(115)는 제1 다이크로익 필터(130)를 향해 적절한 특성을 갖는 여기 광 빔을 출력하기에 적절한 렌즈, 필터, 광섬유, 또는 임의의 다른 적절한 투과 또는 반사 광학 장치와 같은 하나 이상의 추가 광학 구성 요소를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 광원의 광 방출기로부터 광을 수신하고 빔을 생성하고 및/또는 원하는 빔 특성을 제공하기 위해 예를 들어 빔 성형 광학 장치가 포함될 수 있다. 이러한 광학 장치는, 예를 들어, 광의 발산을 감소시키고 및/또는 시준을 증가시키고 및/또는 광을 시준하도록 구성된 시준 렌즈를 포함할 수 있다.
일부 구현에서, 복수의 광원이 조명 및 이미징 모듈(100)에 포함된다. 일부 이러한 구현에서, 상이한 광원은 예를 들어 상이한 형광 염료를 여기시키기 위해 상이한 스펙트럼 특성을 갖는 광을 생성할 수 있다. 일부 구현에서, 상이한 광원에 의해 생성된 광은 총 여기 광 빔을 일치시키고 형성하도록 지향될 수 있다. 이러한 합성 여기 광 빔은 각각의 광원으로부터의 여기 광 빔으로 구성될 수 있다. 합성 여기 광 빔은 합성 빔을 형성하기 위해 중첩되는 개별 빔보다 더 많은 광 파워를 가질 것이다. 예를 들어, 2 개의 여기 광 빔을 생성하는 2 개의 광원을 포함하는 일부 구현에서, 2 개의 개별 여기 광 빔으로부터 형성된 합성 여기 광 빔은 개별 빔의 광 파워의 합인 광 파워를 가질 수 있다. 유사하게, 일부 구현에서, 3 개, 4 개, 5 개 또는 그 초과의 광원이 포함될 수 있고, 이들 광원은 각각 개별 빔의 광 파워의 합인 광 파워를 갖는 합성 빔을 함께 형성하는 여기 광 빔을 출력할 수 있다.
일부 구현들에서, 광원(115)은 충분히 강한 형광 방출을 생성하기 위해 충분히 많은 양의 광을 출력한다. 더 강한 형광 방출은 형광 이미징 모듈에 의해 획득된 이미지의 신호 대 잡음비(SNR) 및 대조 대 잡음비(CNR)를 증가시킬 수 있다. 일부 구현에서, 광원 및/또는 이로부터 유도된 여기 광 빔의 출력(복합 여기 광 빔을 포함함)은 파워 범위가 약 0.5 W 내지 약 5.0 W 또는 그 초과일 수 있다(아래에서 더 자세히 논의됨).
다시 도 2a 내지 도 2b를 참조하면, 제1 다이크로익 필터(130)는 광원에 대해 이로부터 광을 수신하도록 배치된다. 제1 다이크로익 필터는 제1 스펙트럼 구역(또는 파장 범위)의 광을 투과시키고 제2 스펙트럼 구역(또는 파장 범위)을 갖는 광을 반사하도록 구성된 다이크로익 미러, 다이크로익 반사기, 다이크로익 빔 스플리터, 또는 다이크로익 빔 결합기를 포함할 수 있다. 제1 스펙트럼 구역은 하나 이상의 스펙트럼 대역, 예를 들어 자외선 및 청색 파장 범위의 하나 이상의 스펙트럼 대역을 포함할 수 있다. 유사하게, 제2 스펙트럼 구역은 하나 이상의 스펙트럼 대역, 예를 들어 녹색 내지 적색 및 적외선 파장으로 연장되는 하나 이상의 스펙트럼 대역을 포함할 수 있다. 다른 스펙트럼 구역 또는 파장 범위도 또한 가능하다.
일부 구현에서, 제1 다이크로익 필터는 광원으로부터의 광을 현미경 슬라이드, 모세관, 흐름 셀, 미세 유체 칩, 또는 다른 기판 또는 지지 구조와 같은 샘플 지지 구조로 투과시키도록 구성될 수 있다. 샘플 지지 구조는 조명 및 이미징 모듈(100)에 대해 샘플, 예를 들어 형광 라벨링된 핵산 분자 또는 그 보체를 포함하는 조성물을 지지하고 위치시킨다. 따라서, 제1 광학 경로는 제1 다이크로익 필터를 통해 광원으로부터 샘플까지 연장된다. 다양한 구현에서, 샘플 지지 구조는 샘플이 배치되거나 또는 샘플이 결합되는 적어도 하나의 표면을 포함한다. 일부 경우에, 샘플은 샘플 지지 구조의 적어도 하나의 표면에 있는 다른 국부적인 구역 또는 부위 내에 배치되거나 또는 이에 결합될 수 있다.
일부 경우에, 지지 구조는 샘플이 배치되는 대물 렌즈(110)로부터 상이한 거리에(즉, 대물 렌즈(110)의 광축을 따라 상이한 위치 또는 깊이에) 위치된 2 개의 표면을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아래에서 논의되는 바와 같이, 흐름 셀은 제1 및 제2 (예를 들어, 상부 및 하부) 내부 표면에 의해 적어도 부분적으로 형성된 유체 채널을 포함할 수 있으며, 샘플은 제1 내부 표면, 제2 내부 표면, 또는 양 내부 표면 모두의 국부적인 부위에 배치될 수 있다. 제1 및 제2 표면은 용액이 흐르는 유체 채널에 대응하는 구역에 의해 분리되고, 이에 따라 조명 및 이미징 모듈(100)의 대물 렌즈(110)에 대해 서로 다른 거리 또는 깊이에 있을 수 있다.
대물 렌즈(110)는 제1 다이크로익 필터와 샘플 사이의 제1 광학 경로에 포함될 수 있다. 이러한 대물 렌즈는 예를 들어 초점 거리, 작동 거리를 갖도록 구성될 수 있고, 및/또는 광원(들)으로부터의 광을 샘플 상으로, 예를 들어 현미경 슬라이드, 모세관, 흐름 셀, 미세 유체 칩, 또는 다른 기판 또는 지지 구조의 표면 상으로 포커싱하도록 위치될 수 있다. 유사하게, 대물 렌즈(110)는 적절한 초점 거리, 작동 거리를 갖도록 구성될 수 있고, 및/또는 샘플로부터 반사되거나, 산란되거나, 또는 방출되는 광(예를 들어, 형광 방출)을 수집하고 샘플의 이미지(예를 들어, 형광 이미지)를 형성하도록 위치될 수 있다.
일부 구현에서, 대물 렌즈(110)는 기성품 대물 렌즈와 같은 현미경 대물 렌즈를 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 대물 렌즈(110)는 맞춤형 대물 렌즈를 포함할 수 있다. 맞춤형 대물 렌즈 및/또는 맞춤형 대물 렌즈-튜브 렌즈 조합의 예는 아래 및 2020년 1월 17일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/962,723에 설명되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 여기에 포함된다. 대물 렌즈(110)는 흐름 셀 또는 다른 샘플 지지 구조의 2 개의 표면에 대응하는 2 개의 평면과 같은 2 개의 위치에서 광학 수차를 감소시키거나 또는 최소화하도록 설계될 수 있다. 대물 렌즈(110)는 광학 경로의 다른 위치 또는 평면에 비해, 선택된 위치 또는 평면, 예를 들어 이중 표면 흐름 셀의 제1 및 제2 표면에서 광학 수차를 감소시키도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 대물 렌즈(110)는 대물 렌즈로부터 다른 거리에 있는 다른 깊이 또는 평면과 관련된 광학 수차와 비교하여 대물 렌즈로부터 상이한 거리에 위치된 2 개의 깊이 또는 평면에서의 광학 수차를 감소시키도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 광학 수차는 대물 렌즈의 전방 표면으로부터 1에서 10 mm에 걸쳐 있는 구역의 다른 곳에서 나타나는 것보다 흐름 셀의 제1 및 제2 표면을 이미징하기 위해 더 적을 수 있다. 추가적으로, 맞춤형 대물 렌즈(110)는, 일부 경우에, 샘플이 배치되는 흐름 셀 표면들 중 하나 이상을 포함하는 층, 또는 흐름 셀의 유체 채널을 채우는 용액을 포함하는 층과 같은 샘플 지지 구조의 하나 이상의 부분을 통한 형광 방출 광의 투과에 의해 유도된 광학 수차를 보상하도록 구성될 수 있다. 이들 층은 예를 들어 유리, 석영, 플라스틱, 또는 굴절률을 갖고 광학 수차를 도입할 수 있는 다른 투명 재료를 포함할 수 있다.
일부 구현에서, 대물 렌즈(110)는 0.6 이상의 개구수(NA)를 가질 수 있다(아래에서 더 자세히 논의됨). 이러한 개구수는 감소된 초점 심도 및/또는 피사계 심도, 개선된 배경 식별, 및 증가된 이미징 해상도를 제공할 수 있다.
일부 구현에서, 대물 렌즈(110)는 0.6 이하의 개구수(NA)를 가질 수 있다(아래에서 더 자세히 논의됨). 이러한 개구수는 증가된 초점 심도 및/또는 피사계 심도를 제공할 수 있다. 이러한 증가된 초점 심도 및/또는 피사계 심도는 이중 표면 흐름 셀의 제1 및 제2 표면을 분리하는 것과 같은 거리만큼 분리된 평면을 이미징할 수 있는 능력을 증가시킬 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 흐름 셀은 예를 들어 분석물 또는 시약이 흐를 수 있는 유체 채널에 의해 분리되는 제1 및 제2 내부 표면을 각각 포함하는 제1 및 제2 층을 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 대물 렌즈(110) 및/또는 조명 및 이미징 모듈(100)은 제1 표면과 제2 표면을 이미징하는 사이에 이미징 모듈을 리포커싱함으로써 순차적으로, 또는 비슷한 광학 해상도로 충분히 큰 피사계 심도 및/또는 초점 심도를 보장함으로써 동시에, 흐름 셀의 제1 및 제2 내부 표면 모두를 이미징하기에 충분히 큰 피사계 심도 및/또는 초점 심도를 제공하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 피사계 심도 및/또는 초점 심도는 흐름 셀의 제1 및 제2 내부 표면과 같이, 이미징될 흐름 셀의 제1 및 제2 표면을 분리하는 거리만큼 적어도 크거나 또는 이보다 클 수 있다. 일부 경우에, 제1 및 제2 표면, 예를 들어 이중 표면 흐름 셀 또는 다른 샘플 지지 구조의 제1 및 제2 내부 표면은 예를 들어 약 10 ㎛ 내지 약 700 ㎛ 또는 그 초과 범위의 거리만큼 분리될 수 있다(아래에서 더 자세히 논의될 것임). 일부 경우에, 피사계 심도 및/또는 초점 심도는 따라서 약 10 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 또는 그 초과의 범위일 수 있다(아래에서 보다 상세히 논의됨).
일부 설계에서, 보상 광학 장치(예를 들어, "광학 보상기" 또는 "보상기")는 이미징 모듈의 광학 경로, 예를 들어 대물 렌즈(110)에 의해 수집된 광이 이미지 센서에 전달되는 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동될 수 있어, 이미징 모듈이 이중 표면 흐름 셀의 제1 및 제2 표면을 이미징할 수 있게 한다. 이미징 모듈은, 예를 들어 보상 광학 장치가 대물 렌즈와 이미지 센서 또는 제1 표면의 이미지를 캡처하도록 구성된 광검출기 어레이 사이의 광학 경로에 포함될 때 제1 표면을 이미징하도록 구성될 수 있다. 이러한 설계에서, 이미징 모듈은 보상 광학 장치가 제2 표면의 이미지를 캡처하도록 구성된 이미지 센서 또는 광검출기 어레이와 대물 렌즈(110) 사이의 광학 경로로부터 제거되거나 또는 이러한 광학 경로에 포함되지 않을 때 제2 표면을 이미징하도록 구성될 수 있다. 개구수(NA) 값이 높은 대물 렌즈(110)를 사용하는 경우, 예를 들어, 개구수 값이 적어도 0.6, 적어도 0.65, 적어도 0.7, 적어도 0.75, 적어도 0.8, 적어도 0.85, 적어도 0.9, 적어도 0.95, 적어도 1.0, 또는 그 이상인 경우, 광학 보상기에 대한 필요성이 더욱 부각될 수 있다. 일부 구현에서, 광학 보상 광학 장치(예를 들어, 광학 보상기 또는 보상기)는 렌즈와 같은 굴절 광학 요소, 유리와 같은 광학적으로 투명한 재료의 플레이트, 유리와 같은 광학적으로 투명한 재료의 플레이트, 또는 편광된 광 빔의 경우, 1/4 파장판 또는 반 파장판 등을 포함한다. 제1 및 제2 표면이 서로 다른 시간에 이미징될 수 있도록 다른 구성이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 렌즈 또는 광학 요소는 대물 렌즈(110)와 이미지 센서 사이의 광학 경로를 따라, 또는 이러한 광학 경로의 내부로 또는 외부로 병진되도록 구성될 수 있다.
그러나 특정 설계에서, 대물 렌즈(110)는 충분히 큰 초점 심도 및/또는 피사계 심도를 제공하여, 예를 들어 대물 렌즈와 이미지 센서 또는 광검출기 어레이 사이의 광학 경로와 같은, 이미징 모듈의 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동하는 보상 광학 장치 없이 제1 및 제2 표면이 유사한 광학 해상도로 이미징될 수 있게 하도록 구성된다. 마찬가지로, 다양한 설계에서, 대물 렌즈(110)는 충분히 큰 초점 심도 및/또는 피사계 심도를 제공하여, 대물 렌즈와 이미지 센서 또는 광검출기 어레이 사이의 광학 경로와 같은, 이미징 모듈의 광학 경로를 따라 병진되는 하나 이상의 렌즈 또는 다른 광학 구성 요소와 같이, 광학 장치가 이동하지 않고, 제1 및 제2 표면이 유사한 광학 해상도로 이미징될 수 있게 하도록 구성된다. 이러한 대물 렌즈의 예는 아래에서 더 자세히 설명될 것이다.
일부 구현에서, 대물 렌즈(또는 현미경 대물 렌즈)(110)는 축소된 배율을 갖도록 구성될 수 있다. 대물 렌즈(110)는, 예를 들어, 형광 이미징 모듈이 2x 미만 내지 10x 미만의 배율을 갖도록 구성될 수 있다(아래에서 더 자세히 논의될 것이다). 이러한 축소된 배율은 다른 설계 파라미터가 달성될 수 있도록 설계 제약을 변경할 수 있다. 예를 들어, 대물 렌즈(110)는 또한, 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 형광 이미징 모듈이 예를 들어, 약 1.0 mm 내지 약 5.0 mm 범위의 큰 시야(FOV)를 갖도록 구성될 수 있다(예를 들어, 직경, 폭, 길이 또는 가장 긴 치수).
일부 구현에서, 대물 렌즈(110)는 FOV가 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이 회절 제한 성능, 예를 들어 필드의 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 또는 95 %에 걸쳐 0.15 미만의 수차 파동을 갖도록, 전술한 바와 같이 형광 이미징 모듈에 시야를 제공하도록 구성될 수 있다.
일부 구현에서, 대물 렌즈(110)는 FOV가 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이 회절 제한 성능, 예를 들어 필드의 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %에 걸쳐 0.8 초과의 스트렐 비율을 갖도록, 전술한 바와 같이 형광 이미징 모듈에 시야를 제공하도록 구성될 수 있다.
다시 도 2a 및 도 2b를 참조하면, 제1 다이크로익 빔 스플리터 또는 빔 결합기는 하나 이상의 여기 빔으로 샘플을 조명하도록 광원과 샘플 사이의 제1 광학 경로에 배치된다. 이러한 제1 다이크로익 빔 스플리터 또는 결합기는 또한 샘플로부터 형광 방출을 검출하는 데 사용되는 다른 광학 채널까지 하나 이상의 제2 광학 경로(들)에 있다. 따라서, 제1 다이크로익 필터(130)는 조명 소스(115)에 의해 방출된 여기 빔의 제1 광학 경로 및 샘플 시료에 의해 방출된 방출 광의 제2 광학 경로를 다양한 광학 채널에 커플링하고, 여기서 광은 샘플의 이미지를 캡처하기 위해 각각의 이미지 센서 또는 광검출기 어레이로 지향된다.
다양한 구현에서, 제1 다이크로익 필터(130), 예를 들어, 제1 다이크로익 반사기 또는 빔 스플리터 또는 빔 결합기는 지정된 파장 대역 또는 가능하게는 원하는 여기 파장 또는 파장들을 포함하는 복수의 파장 대역 내에서만 조명 소스(115)로부터의 광을 투과시키도록 선택된 통과 대역을 갖는다. 예를 들어, 제1 다이크로익 빔 스플리터(130)는 예를 들어 여기 빔의 일부를 형성하는 광원에 의해 출력된 파장의 적어도 일부를 갖는 광을 투과시키도록 구성된 스펙트럼 투과율 응답을 갖는 다이크로익 반사기를 포함하는 반사 표면을 포함한다. 스펙트럼 투과율 응답은 하나 이상의 다른 파장, 예를 들어 하나 이상의 다른 형광 방출 파장의 광을 투과하지 않도록(예를 들어, 대신에 반사하도록) 구성될 수 있다. 일부 구현에서, 스펙트럼 투과율 응답은 또한 광원에 의해 출력된 하나 이상의 다른 파장의 광을 투과하지 않도록(예를 들어, 대신에 반사하도록) 구성될 수 있다. 따라서, 제1 다이크로익 필터(130)는 광원에 의해 출력된 광의 어떤 파장 또는 파장들이 샘플에 도달하는지 선택하기 위해 활용될 수 있다. 반대로, 제1 다이크로익 빔 스플리터(130)의 다이크로익 반사기는 샘플로부터 원하는 형광 방출에 대응하는 하나 이상의 파장을 갖는 광을 반사하고 가능하게는 샘플에 도달하도록 의도되지 않은 광원으로부터 출력되는 하나 이상의 파장을 갖는 광을 반사하는 스펙트럼 반사도 응답을 갖는다. 따라서, 일부 구현에서, 다이크로익 반사기는 샘플에 입사할 광을 투과시키는 하나 이상의 통과 대역 및 통과 대역 외부의 광, 예를 들어 하나 이상의 방출 파장 및 가능하게는 샘플에 도달하도록 의도되지 않은 광원에 의해 출력된 하나 이상의 파장의 광을 반사하는 하나 이상의 저지 대역을 포함하는 스펙트럼 투과율을 갖는다. 마찬가지로, 일부 구현에서, 다이크로익 반사기는, 샘플에 도달하도록 의도되지 않은 광원에 의해 출력되는 하나 이상의 방출 파장 및 가능한 하나 이상의 파장을 반사하도록 구성된 하나 이상의 스펙트럼 구역을 포함하고 이러한 반사 구역 외부의 광을 투과하는 하나 이상의 구역을 포함하는 스펙트럼 반사도를 가지고 있다. 제1 다이크로익 필터(130)에 포함된 다이크로익 반사기는 적절한 스펙트럼 투과 및 반사 분포를 제공하도록 구성된 간섭 필터(예를 들어, 1/4 파장 스택)와 같은 반사 필터를 포함할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는 또한 오토 포커스 레이저(102)를 대물 렌즈를 통해 샘플 지지 구조로 지향시키는 데 사용될 수 있는, 예를 들어 다이크로익 빔 스플리터 또는 빔 결합기를 포함할 수 있는 다이크로익 필터(105)를 도시한다.
비록 도 2a 및 도 2b에 도시되고 위에서 논의된 이미징 모듈(100)은 여기 빔이 제1 다이크로익 필터(130)에 의해 대물 렌즈(110)로 투과되도록 구성되지만, 일부 설계에서, 여기 빔이 제1 다이크로익 필터(130)에 의해 대물 렌즈(110)로 반사되도록, 조명 소스(115)는 제1 다이크로익 필터(130)에 대해 배치될 수 있고 및/또는 제1 다이크로익 필터는 구성(예를 들어, 배향)된다. 유사하게, 일부 이러한 설계에서, 제1 다이크로익 필터(130)는 샘플로부터의 형광 방출을 투과시키고, 샘플에 도달하도록 의도되지 않은 광원으로부터 출력된 하나 이상의 파장을 갖는 광을 가능하게는 투과시키도록 구성된다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 형광 방출이 반사되는 대신에 투과되는 설계는 검출된 방출의 파면 오차를 잠재적으로 감소시키고 및/또는 가능하게는 다른 이점을 가질 수 있다. 어느 경우든, 다양한 구현에서, 제1 다이크로익 반사기(130)는 샘플로부터 형광 방출을 수신하도록 제2 광학 경로에 배치되며, 그 중 적어도 일부는 검출 채널(120)로 계속된다.
도 3a 및 도 3b는 도 2a 및 도 2b의 다중 채널 형광 이미징 모듈 내의 광학 경로를 도시한다. 도 2a 및 도 3a에 도시된 예에서, 검출 채널(120)은 대물 렌즈(110)에 의해 투과되고 제1 다이크로익 필터(130)에 의해 반사된 샘플 시료로부터의 형광 방출을 수신하도록 배치된다. 위에서 참조되고 아래에서 더 설명되는 바와 같이, 일부 설계에서, 검출 채널(120)은 제1 다이크로익 필터에 의해 반사되기보다는 투과되는 방출 광의 일부를 수신하도록 배치될 수 있다. 어느 경우든, 검출 채널(120)은 방출 광의 적어도 일부를 수신하기 위한 광학 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출 채널(120)은 튜브 렌즈와 같은 하나 이상의 렌즈를 포함할 수 있고, 수신된 광에 기초하여 신호를 이미징하거나 또는 달리 생성하기 위한 광검출기 어레이(예를 들어, CCD 또는 CMOS 센서 어레이)와 같은 하나 이상의 이미지 센서 또는 검출기를 포함할 수 있다. 튜브 렌즈는 예를 들어 샘플의 이미지를 캡처하기 위해 센서 또는 광검출기 어레이에 샘플의 이미지를 형성하도록 구성된 하나 이상의 렌즈 요소를 포함할 수 있다. 검출 채널에 대한 추가 논의는 아래 및 2020년 1월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/962,723에 포함되어 있으며, 이는 전체가 참조로 여기에 통합된다. 일부 경우에, 오버샘플링 또는 언더샘플링을 포함할 수 있는 적절한 샘플링 방식과 함께, 상대적으로 높은 감도, 작은 픽셀, 및 높은 픽셀 카운트를 갖는 이미지 센서를 사용하여 개선된 광학 해상도가 달성될 수 있다.
도 3a 및 도 3b는 도 2a 및 도 2b의 조명 및 이미징 모듈(100)의 광학 경로를 나타내는 광선 추적 다이어그램이다. 도 3a는 조명 및 이미징 모듈(100)의 평면도에 대응한다. 도 3b는 조명 및 이미징 모듈(100)의 측면도에 대응한다. 이들 도면에 도시된 조명 및 이미징 모듈(100)은 4 개의 검출 채널(120)을 포함한다. 그러나, 개시된 조명 및 이미징 모듈은 4 개보다 많거나 더 적은 검출 채널(120)을 포함하는 시스템에서 동일하게 구현될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 다중 채널 시스템은, 본 개시의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서, 1 개의 검출 채널(120)만큼 적거나, 또는 많게는 2 개의 검출 채널(120), 3 개의 검출 채널(120), 4 개의 검출 채널(120), 5 개의 검출 채널(120), 6 개의 검출 채널(120), 7 개의 검출 채널(120), 8 개의 검출 채널(120), 또는 8 개 초과의 검출 채널(120)로 구현될 수 있다.
도 3a 및 도 3b에 도시된 이미징 모듈(100)의 비-제한적인 예는 4 개의 검출 채널(120), 방출 광의 빔(150)을 반사시키는 제1 다이크로익 필터(130), 빔(150)을 투과된 부분 및 반사된 부분으로 분할하는 제2 다이크로익 필터(예를 들어, 다이크로익 빔 스플리터)(135), 및 개별 검출 채널(120) 사이에서 빔(150)의 투과된 부분 및 반사된 부분을 추가로 분할하는 2 개의 채널 특정 다이크로익 필터(예를 들어, 다이크로익 빔 스플리터)(140)를 포함한다. 검출 채널들 사이에서 빔(150)을 분할하기 위한 다이크로익 빔 스플리터(135, 140)에서 다이크로익 반사 표면은 빔(150)의 중심 빔 축 또는 이미징 모듈의 광축에 대해 45 도로 배치되는 것으로 도시된다. 그러나 아래에서 논의되는 바와 같이, 45 도보다 작은 각도가 사용될 수 있으며, 통과 대역으로부터 저지 대역으로의 더 날카로운 전이와 같은 이점을 제공할 수 있다.
상이한 검출 채널(120)은 이미지 센서 또는 광검출기 어레이(예를 들어, CCD 또는 CMOS 검출기 어레이)를 포함할 수 있는 이미징 장치(124)를 포함한다. 상이한 검출 채널(120)은 예를 들어 광검출기 어레이(124)의 평면과 일치하는 초점면에서 검출 채널(120)에 들어가는 방출 광의 일부를 포커싱하도록 배치된 렌즈(예를 들어, 각각 하나 이상의 렌즈 요소를 포함하는 하나 이상의 튜브 렌즈)와 같은 광학 장치(126)를 추가로 포함한다. 대물 렌즈(110)와 조합된 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 샘플이 해당 표면에 결합된 후 샘플의 이미지, 예를 들어 흐름 셀 또는 다른 샘플 지지 구조 상의 표면의 이미지를 캡처하기 위해 광검출기 어레이(124) 상에 샘플의 이미지를 형성하도록 구성된다. 따라서, 샘플의 이러한 이미지는 샘플이 형광 광을 방출하는 샘플 지지 구조의 공간적 범위에 걸쳐 복수의 형광 방출 스폿 또는 구역을 포함할 수 있다. 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)와 함께 대물 렌즈(110)는 샘플의 일부 또는 전체 샘플을 포함하는 시야(FOV)를 제공할 수 있다. 유사하게, 상이한 검출 채널(120)의 광검출기 어레이(124)는 대물 렌즈 및 튜브 렌즈에 의해 제공되는 전체 시야(FOV), 또는 그 일부의 이미지를 캡처하도록 구성될 수 있다. 일부 구현에서, 일부 또는 모든 검출 채널(120)의 광검출기 어레이(124)는 샘플 지지 구조, 예를 들어 흐름 셀의 표면 상에 배치된 샘플에 의해 방출된 방출 광, 또는 그 일부를 검출하고 그 이미지를 나타내는 전자 데이터를 기록할 수 있다. 일부 구현에서, 일부 또는 모든 검출 채널(120)의 광검출기 어레이(124)는 흐름 셀 표면 상에 배치된 샘플의 이미지 및/또는 대물 렌즈 및 광학 장치(126 및/또는 122)(예를 들어, 튜브 렌즈의 요소)에 의해 제공되는 전체 시야(FOV)의 이미지를 캡처 및/또는 저장하지 않고 시료에 의해 방출된 방출 광의 특징을 검출할 수 있다. 일부 구현에서, 개시된 이미징 모듈의 FOV(예를 들어, 대물 렌즈(110)와 광학 장치(126 및/또는 122)의 조합에 의해 제공되는 것)는 아래에서 설명되는 바와 같이 예를 들어, 약 1 mm 내지 5 mm(예를 들어, 직경, 폭, 길이 또는 가장 긴 치수) 범위일 수 있다. FOV는 예를 들어 이미징 모듈의 배율과 해상도 사이의 균형을 제공하도록 및/또는 이미지 센서 및/또는 대물 렌즈의 하나 이상의 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 더 작은 FOV는 더 작고 더 빠른 이미징 센서와 함께 제공되어 높은 처리량을 달성할 수 있다.
다시 도 3a 및 도 3b를 참조하면, 일부 구현에서, 검출 채널의 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 광학 장치(126)를 대물 렌즈(110)와 조합하여 사용하여 획득된 이미지의 광학 수차를 감소시키도록 구성될 수 있다. 상이한 방출 파장에서의 이미징을 위한 다중 검출 채널을 포함하는 일부 구현에서, 상이한 검출 채널에 대한 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 특정 채널이 이미징하도록 구성되는 각각의 방출 파장에 대한 수차를 감소시키기 위해 상이한 설계를 갖는다. 일부 구현에서, 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 다른 위치(예를 들어, 객체 공간의 다른 평면)와 비교하여 그 위에 배치된 형광 샘플 부위를 포함하는 샘플 지지 구조 상의 특정 표면(예를 들어, 평면, 객체 평면 등)을 이미징할 때 수차를 감소시키도록 구성될 수 있다. 유사하게, 일부 구현에서, 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 다른 위치(예를 들어, 객체 공간의 다른 평면)와 비교하여 그 위에 배치된 형광 샘플 부위를 갖는 이중 표면 샘플 지지 구조(예를 들어, 이중 표면 흐름 셀) 상에 제1 및 제2 표면(예를 들어, 제1 및 제2 평면, 제1 및 제2 객체 평면 등)을 이미징할 때 수차를 감소시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 검출 채널의 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 대물 렌즈로부터 다른 거리에 있는 다른 깊이 또는 평면과 관련된 수차와 비교하여 대물 렌즈로부터 상이한 거리에 위치한 2 개의 깊이 또는 평면에서 수차를 감소시키도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 광학 수차는 대물 렌즈로부터 약 1 내지 약 10 mm에 있는 구역의 다른 곳보다 제1 및 제2 표면을 이미징하는 데 더 적을 수 있다. 추가적으로, 검출 채널의 맞춤형 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 일부 실시예에서 가능하게는 샘플이 배치된 표면에 인접하고 접촉하는 용액뿐만 아니라, 샘플이 배치된 표면 중 하나를 포함하는 층과 같은 샘플 지지 구조의 하나 이상의 부분을 통한 방출 광의 투과에 의해 유도된 수차를 보상하도록 구성될 수 있다. 샘플이 배치되는 표면 중 하나를 포함하는 층은 예를 들어 유리, 석영, 플라스틱, 또는 굴절률을 갖고 광학 수차를 도입하는 다른 투명 재료를 포함할 수 있다. 검출 채널의 맞춤형 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 예를 들어 일부 구현에서 가능하게는 샘플이 배치된 표면에 인접하고 접촉하는 용액뿐만 아니라, 샘플 지지 구조, 예를 들어 커버슬립 또는 흐름 셀 벽, 또는 다른 샘플 지지 구조 구성 요소에 의해 유도된 광학 수차를 보상하도록 구성될 수 있다.
일부 구현에서, 검출 채널의 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 축소된 배율을 갖도록 구성된다. 검출 채널의 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는, 예를 들어, 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이 형광 이미징 모듈이 예를 들어 10x 미만의 배율을 갖도록 구성될 수 있다. 이러한 축소된 배율은 다른 설계 파라미터가 달성될 수 있도록 설계 제약을 변경할 수 있다. 예를 들어, 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 또한 아래에서 더 논의되는 바와 같이, 형광 이미징 모듈이 예를 들어 적어도 1.0 mm 이상의(예를 들어, 직경, 폭, 길이 또는 가장 긴 치수) 큰 시야(FOV)를 갖도록 구성될 수 있다.
일부 구현에서, 광학 장치(126)(예를 들어, 튜브 렌즈)는 아래에서 더 논의되는 바와 같이, FOV가 필드의 적어도 60 %, 70 %, 80%, 90 % 또는 95 %에 걸쳐 0.15 미만의 수차 파동을 갖도록 위에 표시된 바와 같은 시야를 형광 이미징 모듈에 제공하도록 구성될 수 있다.
다시 도 3a 및 도 3b를 참조하면, 다양한 구현에서, 샘플은 대물 렌즈(110)의 초점 위치(112)에 또는 그 근처에 위치된다. 도 2a 및 도 2b를 참조하여 상술한 바와 같이, 레이저 소스와 같은 광원은 형광을 유도하기 위해 샘플에 여기 빔을 제공한다. 형광 방출의 적어도 일부는 방출 광으로서 대물 렌즈(110)에 의해 수집된다. 대물 렌즈(110)는 방출 광을 제1 다이크로익 필터(130)를 향해 투과하고, 이 제1 다이크로익 필터는 제2 다이크로익 필터(135)에 입사하는 빔(150)으로서 방출 광의 일부 또는 전부를, 각각 샘플(예를 들어, 샘플 지지 구조의 표면에 있는 복수의 형광 샘플 부위)의 이미지를 형성하는 광학 장치(126)를 포함하는 상이한 검출 채널로 광검출기 어레이(124) 상으로 반사한다.
위에서 논의한 바와 같이, 일부 구현에서, 샘플 지지 구조는 형광 방출을 방출하는 샘플 부위를 포함하는 2 개의 표면(예를 들어, 2 개의 내부 표면, 제1 표면 및 제2 표면 등)을 갖는 이중 표면 흐름 셀과 같은 흐름 셀을 포함한다. 이들 2 개의 표면은 여기 빔의 중심축 및/또는 대물 렌즈의 광축 방향을 따라 종 방향(Z)으로 서로 거리만큼 분리될 수 있다. 이러한 분리는 예를 들어 흐름 셀 내의 흐름 채널에 해당할 수 있다. 분석물 또는 시약은 흐름 채널을 통해 흐르고, 흐름 셀의 제1 및 제2 내부 표면과 접촉할 수 있고, 이는 이로써 형광 방출이 제1 및 제2 내부 표면 상의 복수의 부위로부터 방사되도록 결합 조성물과 접촉될 수 있다. 이미징 광학 장치(예를 들어, 대물 렌즈(110))는 하나 이상의 검출기 어레이(124) 상에 샘플의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해 샘플로부터 적절한 거리(예를 들어, 작동 거리에 대응하는 거리)에 위치될 수 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 다양한 설계에서, 대물 렌즈(110)(가능하게는 광학 장치(126)와 조합됨)는 적어도 제1 표면과 제2 표면 사이의 종 방향 분리만큼 큰 피사계 심도 및/또는 초점 심도를 가질 수 있다. 따라서 (각 검출 채널의) 대물 렌즈(110) 및 광학 장치(126)는 광검출기 어레이(124) 상의 제1 및 제2 흐름 셀 표면 모두의 이미지를 동시에 형성할 수 있으며, 제1 및 제2 표면의 이러한 이미지는 모두 인-포커스되고 유사한 광학 해상도를 갖는다(또는 유사한 광학 해상도를 갖는 제1 및 제2 표면의 이미지를 획득하기 위해 물체의 약간의 리포커싱만으로 초점이 맞춰질 수 있음). 다양한 구현에서, 보상 광학 장치는 광학 해상도가 유사한 제1 및 제2 표면의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해 이미징 모듈의 광학 경로의 내부로 또는 외부로(예를 들어, 제1 및/또는 제2 광학 경로의 내부로 또는 외부로) 이동될 필요가 없다. 유사하게, 다양한 구현에서, 이미징 모듈(예를 들어, 대물 렌즈(110) 또는 광학 장치(126))의 하나 이상의 광학 요소(예를 들어, 렌즈 요소)는 예를 들어 제2 표면의 인-포커스 이미지를 형성하는 데 사용될 때 상기 하나 이상의 광학 요소의 위치와 비교하여 제1 표면의 인-포커스 이미지를 형성하기 위해 제1 및/또는 제2 광학 경로를 따라 종 방향으로 이동될 필요가 없다. 일부 구현에서, 이미징 모듈은 이미지가 유사한 광학 해상도를 갖도록 이미징 모듈을 제1 및/또는 제2 표면 상에 신속하고 순차적으로 리포커싱하도록 구성된 오토 포커스 시스템을 포함한다. 일부 구현에서, 대물 렌즈(110) 및/또는 광학 장치(126)는 광학 보상기를 제1 및/또는 제2 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동시키지 않고 그리고 제1 및/또는 제2 광학 장치 경로를 따라 종 방향으로 하나 이상의 렌즈 요소(예를 들어, 대물 렌즈(110) 및/또는 광학 장치(126)(튜브 렌즈와 같은))를 이동시키지 않고, 제1 및 제2 흐름 셀 표면 모두가 동시에 유사한 광학 해상도로 인-포커스되도록 구성된다. 일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 신규한 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈 설계를 사용하여 (예를 들어, 표면들 사이에 리포커싱에 의해) 순차적으로 또는 (예를 들어, 표면들 사이에 리포커싱을 하지 않고) 동시에 획득된 제1 및/또는 제2 표면의 이미지는, 제1 및 제2 표면의 이미지가 유사한 광학 해상도를 갖도록 이미지의 유효 광학 해상도를 향상시키기 위해 적절한 이미지 처리 알고리즘을 사용하여 추가 처리될 수 있다. 다양한 구현에서, 샘플 평면은 제1 및/또는 제2 흐름 셀 표면 상의 샘플 부위를 분해하기에 충분히 인-포커스되어 있고, 샘플 부위는 측면 방향으로(예를 들어, X 및 Y 방향으로) 밀접하게 이격되어 있다.
위에서 논의한 바와 같이, 다이크로익 필터는 상이한 굴절률 및 특정 두께를 갖는 광학 코팅의 층을 사용하여 박막 간섭의 원리에 기초하여 상이한 파장의 광을 선택적으로 투과시키고 그리고 반사시키는 간섭 필터를 포함할 수 있다. 따라서, 다중 채널 형광 이미징 모듈 내에서 구현된 다이크로익 필터의 스펙트럼 응답(예를 들어, 투과 및/또는 반사 스펙트럼)은 여기 및/또는 방출 빔의 광이 다이크로익 필터에 입사하는 입사각 또는 입사각들의 범위에 적어도 부분적으로 의존할 수 있다. 이러한 효과는 검출 광학 경로의 다이크로익 필터(예를 들어, 도 3a 및 도 3b의 다이크로익 필터(135, 140))와 관련하여 특히 중요할 수 있다.
도 4는 다이크로익 필터 성능과 빔 입사각(AOI)의 관계를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 도 4의 그래프는 스펙트럼 응답(예를 들어, 투과 스펙트럼 및/또는 반사 스펙트럼)이 다이크로익 필터의 통과 대역과 저지 대역 구역들 사이에서 전이되는 파장 범위에 해당하는 다이크로익 필터의 전이 폭 또는 스펙트럼 스팬(spectral span)에 대한 입사각의 영향을 예시한다. 따라서, 상대적으로 작은 스펙트럼 스팬(예를 들어, 도 4의 그래프에서 작은 델타 λ 값)을 갖는 투과 에지(또는 반사 에지)는 통과 대역과 저지 대역 구역 또는 투과 구역과 반사 구역 사이의(또는 반대로 반사 구역과 투과 구역 사이의) 더 날카로운 전이에 해당하고, 비교적 큰 스펙트럼 스팬(예를 들어, 도 4의 그래프에서 큰 delta_λ 값)을 갖는 투과 에지(또는 반사 에지)는 통과 대역과 저지 대역 구역 사이의 덜 날카로운 전이에 해당한다. 다양한 구현에서, 통과 대역과 저지 대역 구역 사이의 더 날카로운 전이가 일반적으로 바람직하다. 더욱이, 시야 및/또는 빔 영역의 전부 또는 대부분에 걸쳐 증가된 일관성 또는 비교적 일관된 전이 폭을 갖는 것이 또한 바람직할 수 있다.
방출 광의 중심 빔 축 또는 광학 경로의 광축을 기준으로 45 도 각도로 다이크로익 미러가 배치되는 형광 이미징 모듈(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈)는 따라서 도 4에 도시된 바와 같이 예시적인 다이크로익 필터에 대해 대략 50 nm의 전이 폭을 가질 수 있다. 방출 광이 시준되지 않고 어느 정도 발산하기 때문에, 형광 이미징 모듈은 빔의 대향하는 측면들 사이에서 대략 5 도의 입사각의 범위를 가질 수 있다. 따라서, 도 4에 도시된 바와 같이, 방출 광의 빔의 상이한 부분들은 40 도 내지 50 도의 다양한 입사각에서 채널 분할 다이크로익 필터에 입사될 수 있다. 비교적 큰 입사각의 이러한 범위는 약 40 nm 내지 약 62 nm의 전이 폭의 범위에 해당한다. 상대적으로 큰 입사각의 이러한 범위는 이에 따라 이미징 모듈에서 다이크로익 필터의 전이 폭의 증가로 이어진다. 따라서, 다중 채널 형광 이미징 모듈의 성능은 전체 빔에 걸쳐 더 작은 입사각을 제공함으로써 개선될 수 있으며, 이에 의해 투과 에지를 더 날카롭게 만들고 다른 형광 방출 대역 사이의 더 나은 구별을 허용한다.
도 5는 다이크로익 필터에서 빔 풋프린트 크기(beam footprint size)(DBS)와 빔 입사각(DBS 각도) 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 일부 경우에, 더 작은 빔 풋프린트가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 빔 풋프린트가 작으면 더 작은 다이크로익 필터를 사용하여 빔을 다른 파장 범위로 분할할 수 있다. 더 작은 다이크로익 필터의 사용은 차례로 제조 비용을 감소시키고, 적절하게 평평한 다이크로익 필터의 제조 용이성을 개선한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 0 도보다 큰 임의의 입사각(즉, 다이크로익 필터의 표면에 수직)은 빔의 단면적보다 큰 면적을 갖는 타원형 빔 풋프린트를 발생시킨다. 45 도의 입사각은 0 도에서 입사할 때 빔의 단면적의 1.4 배보다 큰 다이크로익 반사기에 큰 빔 풋프린트를 생성한다.
도 6a 및 도 6b는 다이크로익 미러가 방출 광의 중심 빔 축 또는 광학 경로의 광축에 대해 45 도 미만의 각도로 배치되는 다중 채널 형광 이미징 모듈(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈)에서 다이크로익 필터 및 검출 채널의 비-제한적인 예시적인 구성을 개략적으로 도시한다. 도 6a는 복수의 검출 채널(520a, 520b, 520c, 520d)을 포함하는 이미징 모듈(500)을 도시한다. 도 6b는 도 6a에 도시된 원(5B) 내의 이미징 모듈(500) 부분의 상세도이다. 더 자세히 설명되는 바와 같이, 도 6a 및 도 6b에 도시된 구성은 종래의 다중 채널 형광 이미징 모듈 설계에 비해 상당한 개선을 발생시킬 수 있는 다수의 양태를 포함한다. 일부 경우에, 그러나, 본 개시의 형광 이미징 모듈 및 시스템은 본 개시의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 도 6a 내지 도 6b와 관련하여 설명된 특징들 중 하나 또는 서브 세트로 구현될 수 있다.
도 6a에 도시된 이미징 모듈(500)은 대물 렌즈(510) 및 대물 렌즈(510)에 의해 투과된 방출 광을 수신하고 및/또는 이미징하도록 배치된 4 개의 검출 채널(520a, 520b, 520c, 520d)을 포함한다. 제1 다이크로익 필터(530)는 여기 및 검출 광학 경로를 커플링하도록 제공된다. 도 2a 및 도 2b 뿐만 아니라 도 3a 및 도 3b에 도시된 설계와 대조적으로, 제1 다이크로익 필터(530)(예를 들어, 다이크로익 빔 스플리터 또는 결합기)는 광원으로부터 대물 렌즈(510) 및 샘플로 광을 반사하도록 구성되고, 샘플로부터의 형광 방출을 검출 채널(520a, 520b, 520c, 520d)로 투과한다. 제2 다이크로익 필터(535)는 제1 부분(550a)을 투과시키고 제2 부분(550b)을 반사함으로써 적어도 2 개의 검출 채널(520a, 520b) 사이에서 방출 광의 빔을 분할한다. 추가적인 다이크로익 필터(540a, 540b)는 방출 광을 더 분할하도록 제공된다. 다이크로익 필터(540a)는 방출 광의 제1 부분(550a)의 적어도 일부를 투과시키고, 부분(550c)을 제3 검출 채널(520c)로 반사시킨다. 다이크로익 필터(540b)는 방출 광의 제2 부분(550b)의 적어도 일부를 투과시키고, 부분(550d)을 제4 검출 채널(520d)로 반사시킨다. 이미징 모듈(500)이 4 개의 검출 채널로 도시되어 있지만, 다양한 실시예에서, 이미징 모듈(500)은 각각의 검출 채널에 방출 광의 일부를 제공하기에 적절하게 상응하는 더 많은 또는 더 적은 수의 다이크로익 필터를 갖는 더 많은 또는 더 적은 수의 검출 채널을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 이미징 모듈(500)의 특징은 2 개의 검출 채널(520a, 520b)만을 포함하고 추가적인 다이크로익 필터(540a, 540b)를 생략하는 단순화된 이미징 모듈에서 유사한 유리한 효과로 구현될 수 있다. 일부 구현에서는, 하나의 검출 채널만이 포함될 수 있다. 대안적으로, 3 개 이상의 검출 채널이 사용될 수도 있다.
도 6a에 도시된 검출 채널(520a, 520b, 520c, 520d)은 도 2a 내지 도 3b에 도시된 검출 채널(120)과 동일하거나 또는 유사한 구성 요소들 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상이한 검출 채널(520a, 520b, 520c, 520d)은 하나 이상의 이미지 센서 또는 광검출기 어레이를 포함할 수 있고, 검출 채널에 의해 수신된 광을 그 각각의 이미지 센서 또는 광검출기 어레이에 포커싱하는 하나 이상의 렌즈(예를 들어, 튜브 렌즈)와 같은 투과성 및/또는 반사성 광학 장치를 포함할 수 있다.
대물 렌즈(510)는 시료로부터 형광에 의해 방출되는 방출 광을 수신하도록 배치된다. 특히, 제1 다이크로익 필터(530)는 대물 렌즈(510)에 의해 집광되어 투과되는 방출 광을 수신하도록 배치된다. 위에서 논의되고 도 6a에 도시된 바와 같이, 일부 설계에서, 레이저 소스 등과 같은 조명 소스(예를 들어, 도 2a 및 도 2b의 조명 소스(115))는 제1 다이크로익 필터(530)에 입사되는 여기 빔을 제공하도록 배치되어, 제1 다이크로익 필터(530)는 여기 빔을 예를 들어 동일-형광(epifluorescence) 구성에서 방출 광을 투과시키는 동일한 대물 렌즈(510)로 반사시킨다. 일부 다른 설계에서 조명 소스는 동일한 대물 렌즈(510)를 포함하지 않는 다른 광학 경로를 따라 다른 광학 구성 요소에 의해 시료로 지향될 수 있다. 이러한 구성에서, 제1 다이크로익 필터(530)는 생략될 수 있다.
유사하게, 위에서 논의되고 도 6a에 도시된 바와 같이, 검출 광학 장치(예를 들어, 대물 렌즈(510)와 검출 채널(520a, 520b, 520c, 520d) 사이의 광학 경로를 따라 검출 채널(520a, 520b, 520c, 520d) 및 다이크로익 필터(535, 540a, 540b)와 같은 임의의 광학 구성 요소를 포함함)는, 제1 다이크로익 필터(530)의 반사 경로가 아닌 제1 다이크로익 필터(530)의 투과 경로 상에 배치될 수 있다. 하나의 예시적인 구현에서, 대물 렌즈(510) 및 검출 광학 장치는 대물 렌즈(510)가 제2 다이크로익 필터(535)를 향해 직접적으로 방출 광의 빔(550)을 투과시키도록 배치된다. 방출 광의 파면 품질은 (예를 들어, 빔(550)에 약간의 파면 오차를 부여함으로써) 방출 광의 빔(550)의 경로를 따라 제1 다이크로익 필터(530)의 존재에 의해 다소 저하될 수 있다. 그러나, 다이크로익 빔 스플리터의 다이크로익 반사기를 통해 투과된 빔에 의해 도입되는 파면 오차는 일반적으로 다이크로익 빔 스플리터의 다이크로익 반사 표면으로부터 반사된 빔의 파면 오차보다 훨씬 더 작다(예를 들어, 10 배 더 작음). 따라서, 다중 채널 형광 이미징 모듈에서 방출 광의 파면 품질 및 후속 이미징 품질은 반사된 빔 경로를 따라가 아니라 제1 다이크로익 필터(530)의 투과된 빔 경로를 따라 검출 광학 장치를 배치함으로써 실질적으로 개선될 수 있다.
여전히 도 6a를 참조하면, 이미징 모듈(500)의 검출 광학 장치 내에서, 검출 채널(520a, 520b, 520c, 520d) 사이에서 방출 광의 빔(550)을 분할하기 위해 다이크로익 필터(535, 540a, 540b)가 제공된다. 예를 들어, 다이크로익 필터(535, 540a, 540b)는 파장에 기초하여 빔(550)을 분할하여, 방출 광의 제1 파장 또는 파장 대역은 제1 검출 채널(520a)에 의해 수신될 수 있고, 방출 광의 제2 파장 또는 파장 대역은 제2 검출 채널(520b)에 의해 수신될 수 있고, 방출 광의 제3 파장 또는 파장 대역은 제3 검출 채널(520c)에 의해 수신될 수 있고, 방출 광의 제4 파장 또는 파장 대역은 제4 검출 채널(520d)에 의해 수신될 수 있다. 일부 구현에서, 복수의 분리된 파장 또는 파장 대역은 검출 채널에 의해 수신될 수 있다.
도 2a 및 도 2b뿐만 아니라 도 3a 및 도 3b에도 도시되어 있는 다중 채널 형광 이미징 모듈 설계와 대조적으로, 이미징 모듈(500)은 입사 빔의 중심 빔 축에 대해 45 도 미만의 입사각으로 배치된 다이크로익 필터(535, 540a, 540b)를 갖는다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 상이한 빔(550, 550a, 550b)은 각각의 중심 빔 축(552, 552a, 552b)을 갖는다. 다양한 구현들에서, 중심 빔 축들(552, 552a, 552b)은 빔의 전파 방향에 직교하는 빔의 단면의 중심에 있다. 이러한 중심 빔 축(552, 552a, 552b)은 대물 렌즈 및/또는 개별 채널 내의 광학 장치의 광축, 예를 들어, 각 튜브 렌즈의 광축에 대응할 수 있다. 각 빔(550, 550a, 550b)의 추가 광선(554, 554a, 554b)이 각 빔(550, 550a, 550b)의 직경을 나타내도록 도 6b에 도시되어 있다. 빔 직경은 예를 들어 최대 직경의 절반에서 전체 폭, D4σ(즉, σ의 4 배, 여기서 σ는 각각 빔의 수평 또는 수직 주변 분포의 표준 편차임) 또는 2 차 모멘트 폭, 또는 빔 직경의 임의의 다른 적절한 정의로 정의될 수 있다.
방출 광의 빔(550)의 중심 빔 축(552)은 제2 다이크로익 필터(535)에 대한 빔(550)의 입사각을 정의하기 위한 기준점으로서 역할을 할 수 있다. 따라서, 빔(550)의 "입사각"(AOI)은 입사 빔(550)의 중심 빔 축(552)과, 빔이 입사하는 표면, 예를 들어, 다이크로익 반사 표면에 법선인 라인(N) 사이의 각도일 수 있다. 방출 광의 빔(550)이 제2 다이크로익 필터(535)의 다이크로익 반사 표면에 입사각(AOI)으로 입사되면, 제2 다이크로익 필터(535)는 방출 광의 제1 부분(550a)(예를 들어, 제2 다이크로익 필터(535)의 통과 대역 구역 내의 파장을 갖는 부분)을 투과시키고 방출 광의 제2 부분(550b)(예를 들어, 제2 다이크로익 필터(535)의 저지 대역 구역 내의 파장을 갖는 부분)을 반사시킨다. 제1 부분(550a) 및 제2 부분(550b)은 각각 중심 빔 축(552a, 552b)과 관련하여 유사하게 설명될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 광축은 대안적으로 또는 추가적으로 사용될 수 있다.
도 6a 및 도 6b의 예시적인 구성에서, 제2 다이크로익 필터(535)는 빔(550)의 중심 빔 축(552)이 30 도의 입사각으로 입사되도록 배치된다. 유사하게, 추가적인 다이크로익 필터(540a, 540b)는 빔(550)의 제1 및 제2 부분(550a, 550b)의 중심 빔 축(552a, 552b)이 또한 30 도의 입사각으로 입사하도록 배치된다. 그러나, 다양한 구현에서, 이러한 입사각은 45 도보다 작은 다른 각도일 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 입사각은 약 20 도 내지 약 45 도의 범위일 수 있으며, 이는 아래에서 더 논의될 것이다. 또한, 다이크로익 필터(535, 540a, 540b) 각각에 대한 입사각은 반드시 동일할 필요는 없다. 일부 실시예에서, 다이크로익 필터(535, 540a, 540b)의 일부 또는 전부는 이들의 입사 빔(550, 550a, 550b)이 상이한 입사각을 갖도록 배치될 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 입사각은 이미징 모듈 내의 광학 장치, 예를 들어 대물 렌즈 및/또는 검출 채널 내의 광학 장치(예를 들어, 튜브 렌즈)의 광축 및 각각의 다이크로익 빔 스플리터의 다이크로익 반사 표면에 대한 것일 수 있다. 입사각에 대한 동일한 범위들 및 값들은 광축이 AOI를 지정하는 데 사용되는 경우에 적용된다.
형광 이미징 모듈 시스템에서 방출 광의 빔(550, 550a, 550b)은 일반적으로 발산 빔이다. 위에서 언급된 바와 같이, 방출 광의 빔은 빔 직경 내의 빔의 구역들이 광학 장치의 중심 빔 축 및/또는 광축의 입사각에 대해 최대 5 도 이상만큼 다른 입사각으로 다이크로익 필터에 입사하기에 충분히 큰 빔 발산을 가질 수 있다. 일부 설계에서, 대물 렌즈(510)는 예를 들어 현미경의 주어진 시야에 대해 더 작은 빔 직경을 생성하도록 선택된 f-수(f-number) 또는 개구수를 갖도록 구성될 수 있다. 일 예에서, 대물 렌즈(510)의 f-수 또는 개구수는 빔(550, 550a, 550b)의 전체 직경이 예를 들어 중심 빔 축(552, 552a, 552b)의 입사각의 1 도, 1.5 도, 2 도, 2.5 도, 3 도, 3.5 도, 4 도, 4.5 도, 또는 5 도 이내의 입사각으로 다이크로익 필터(535, 540a, 540b)에 입사하도록 선택될 수 있다.
일부 구현에서, 이러한 좁은 빔 직경을 생성하기에 적합한 대물 렌즈의 초점 거리는 형광 현미경 또는 이미징 시스템에서 일반적으로 사용되는 것들보다 더 길 수 있다. 예를 들어, 일부 구현에서, 대물 렌즈의 초점 거리는 아래에서 더 논의되는 바와 같이 20 mm 내지 40 mm의 범위일 수 있다. 일 예에서, 초점 거리가 36 mm인 대물 렌즈(510)는 빔(550)의 전체 직경에 걸친 광이 중심 빔 축의 입사각의 2.5 도 이내의 각도로 제2 다이크로익 필터(535)에 입사하기에 충분히 작은 발산을 특징으로 하는 빔(550)을 생성할 수 있다.
도 7 및 도 8은 도 6a 및 도 6b의 이미징 모듈 구성의 양태들(또는 본 명세서에 개시된 이미징 모듈 구성들 중 임의의 것)로 인한 개선된 다이크로익 필터 성능을 예시하는 그래프를 제공한다. 도 7의 그래프는 도 4의 그래프와 유사하고, 다이크로익 필터의 전이 폭(예를 들어, 투과 에지의 스펙트럼 스팬)에 대한 입사각의 영향을 예시한다. 도 7은 다이크로익 필터(예를 들어, 다이크로익 필터(535, 540a, 540b)) 및 그 내부의 다이크로익 반사 표면의 배향이 그 입사 빔이 45 도가 아닌 30 도의 입사각을 갖도록 이루어진 예를 도시한다. 도 7은 이러한 감소된 입사각이 전체 빔 직경에 걸친 전이 폭의 균일성 및 날카로움을 어떻게 크게 향상시키는지를 보여준다. 예를 들어, 중심 빔 축에서 45 도의 입사각은 약 40 nm 내지 약 62 nm의 전이 폭의 범위를 발생하지만, 중심 빔 축에서 30 도의 입사각은 약 16 nm 내지 약 30 nm의 전이 폭의 범위를 발생한다. 이 예에서, 평균 전이 폭은 약 51 nm로부터 약 23 nm로 감소되어, 통과 대역과 저지 대역 사이의 더 날카로운 전이를 나타낸다. 더욱이, 빔 직경에 걸친 전이 폭의 변화는 22 nm 범위로부터 14 nm 범위로 거의 40 % 감소되어, 빔의 영역에 대한 전이의 더 균일한 날카로움을 나타낸다.
도 8은 여기에 개시된 이미징 모듈 구성들 중 임의의 것에서 빔 발산을 감소시키기 위해 대물 렌즈에 대한 적절한 f-수 또는 개구수를 선택함으로써 구현될 수 있는 추가 이점을 예시한다. 일부 구현에서는 더 긴 초점 거리가 사용된다. 도 8의 예에서, 대물 렌즈(510)는 적절한 개구수(예를 들어, 5 미만)로 빔(550) 내의 입사각의 범위를 30 도 ± 5 도로부터 30 도 ± 2.5 도로 감소시키는 36 mm의 초점 거리를 갖는다. 이러한 설계로, 전이 폭의 범위는 약 19 nm 내지 약 26 nm로 감소될 수 있다. 도 7의 개선된 시스템과 비교할 때, 평균 전이 폭은 실질적으로 동일하지만(예를 들어, 대략 23 nm의 스펙트럼 스팬), 빔 직경에 걸친 전이 폭의 변화는 7 nm 범위로 더 감소되며, 이는 도 4에 예시된 전이 폭의 범위에 비해 거의 70 %의 감소를 나타낸다.
다시 도 5를 참조하면, 중심 빔 축에서 입사각을 45 도로부터 30 도로 감소시키는 것은 다이크로익 필터 상의 빔 스폿 크기를 감소시키기 때문에 더욱 유리하다. 도 5에 도시된 바와 같이, 45 도의 입사각은 빔의 단면적의 1.4 배보다 큰 면적을 갖는 다이크로익 필터 상의 빔 풋프린트를 발생시킨다. 그러나, 30 도의 입사각은 빔의 단면적의 단지 약 1.15 배의 면적을 갖는 다이크로익 필터 상의 빔 풋프린트를 발생시킨다. 따라서, 다이크로익 필터(535, 540a, 540b)에서의 입사각을 45 도로부터 30 도로 감소시키는 것은 다이크로익 필터(535, 540a, 540b) 상의 빔 풋프린트의 면적의 약 18 %의 감소를 발생시킨다. 빔 풋프린트 면적의 이러한 감소로 인해 더 작은 다이크로익 필터를 사용할 수 있다.
이제 도 9a 내지 도 9b를 함께 참조하면, 입사각을 45 도로부터 30 도로 감소하는 것은 변조 전달 함수의 개선에 의해 나타나는 바와 같이, 여기에 개시된 이미징 모듈 구성들 중 임의의 것에서 다이크로익 필터에 의해 유발된 표면 변형과 관련하여 개선된 성능을 제공할 수도 있다. 일반적으로, 표면 변형의 양은 광학 요소의 면적이 클수록 증가한다. 다이크로익 필터의 더 큰 면적이 사용되면, 더 많은 양의 표면 변형이 발생하여, 이에 따라 빔에 더 많은 파면 오차가 도입된다. 도 9a는 마지막 미러에 1 파의 피크-투-밸리(peak-to-valley)(PV) 구형 파워를 추가함으로써 유도된 이미지 품질 저하에 대한 접힘 각도의 영향을 예시한다. 도 9b는 마지막 미러에 0.1 파의 PV 구형 파워를 추가함으로써 유도된 이미지 품질 저하에 대한 접힘 각도의 영향을 예시한다. 도 9a 및 도 9b에 도시된 바와 같이, 30 도로 입사각을 감소시키면 검출 광학 장치의 회절 제한된 성능에 근접하게 달성될 표면 변형의 효과를 상당히 감소시킨다.
개시된 이미징 모듈의 일부 구현에서, 여기 빔의 편광 상태는 본 명세서에 개시된 다중 채널 형광 이미징 모듈의 성능을 추가로 개선하기 위해 이용될 수 있다. 다시 도 2a, 도 2b, 및 도 6a를 참조하면, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 다중 채널 형광 이미징 모듈의 일부 구현은 동일-형광 구성을 가지며, 여기서 제1 다이크로익 필터(130 또는 530)는 여기 광 및 방출 광이 모두 대물 렌즈(110, 510)를 통해 투과되도록 여기 빔과 방출 광의 빔의 광학 경로를 병합한다. 위에서 논의된 바와 같이, 조명 소스(115)는 여기 빔을 형성하는 광을 제공하는 레이저 또는 다른 소스와 같은 광원을 포함할 수 있다. 일부 설계에서, 광원은 선형 편광된 광원을 포함하고, 여기 빔은 선형으로 편광될 수 있다. 일부 설계에서, 편광 광학 장치가 포함되어 광을 편광하고 및/또는 광의 편광을 회전시킨다. 예를 들어, 선형 편광기와 같은 편광기는 여기 빔을 편광시키기 위해 여기 빔의 광학 경로에 포함될 수 있다. 일부 설계에서, 선형 편광을 회전시키기 위해, 반파 지연기 또는 복수의 1/4 파장 지연기 또는 다른 양의 지연을 갖는 지연기와 같은 지연기가 포함될 수 있다.
선형 편광된 여기 빔은, 임의의 다이크로익 필터 또는 다른 평면 인터페이스에 입사할 때, p-편광되거나(예를 들어, 입사 평면에 평행한 전기장 성분을 가짐), s-편광되거나(예를 들어, 입사 평면에 수직인 전기장 성분을 가짐), 또는 빔 내에서 p-편광 및 s-편광 상태의 조합을 가질 수 있다. 여기 빔의 p-편광 또는 s-편광 상태는 제1 다이크로익 필터(130, 530)에 대한 및/또는 여기 빔이 상호 작용하는 임의의 다른 표면에 대한 조명 소스(115) 및/또는 그 하나 이상의 구성 요소의 배향을 선택함으로써 선택되고 및/또는 변경될 수 있다. 광원이 선형 편광된 광을 출력하는 일부 구현에서, 광원은 s-편광된 광을 제공하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 광원은 이로부터의 선형 편광된 광 출력을 배향시키기 위해 빔의 광축 또는 중심축을 중심으로 회전될 수 있는 고체 레이저 또는 레이저 다이오드와 같은 방출기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 빔의 광축 또는 중심축을 중심으로 선형 편광을 회전시키기 위해 지연기가 사용될 수 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 일부 구현들에서, 예를 들어 광원이 편광된 광을 출력하지 않을 때, 여기 빔의 광학 경로에 배치된 편광기는 여기 빔을 편광시킬 수 있다. 일부 설계에서, 예를 들어, 선형 편광기는 여기 빔의 광학 경로에 배치된다. 이러한 편광기는 s-편광된 광을 제공하기 위해 선형 편광의 적절한 배향을 제공하도록 회전될 수 있다.
일부 설계에서, 선형 편광은 s-편광이 다이크로익 빔 스플리터의 다이크로익 반사기에 입사되도록 빔의 광축 또는 중심축을 중심으로 회전된다. 다이크로익 빔 스플리터의 다이크로익 반사기에 s-편광된 광이 입사될 때, 통과 대역과 저지 대역 사이의 전이는 p-편광된 광이 다이크로익 빔 스플리터의 다이크로익 반사기에 입사할 때와 반대로 더 날카롭다.
도 10a 및 도 10b에 도시된 바와 같이, 여기 빔의 p-편광 또는 s-편광 상태의 사용은 제1 다이크로익 필터(130, 530)와 같은 임의의 여기 필터의 협대역 성능에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 도 10a는 40 도 및 45 도의 입사각에서 예시적인 대역 통과 다이크로익 필터에 대한 610 nm 내지 670 nm의 투과 스펙트럼을 도시하며, 여기서 입사 빔은 선형 편광되고 다이크로익 필터의 평면에 대해 p-편광된다. 도 10b에 도시된 바와 같이, 입사 빔이 다이크로익 필터의 평면에 대해 s-편광되도록 다이크로익 필터에 대한 광원의 배향을 변경하는 것은 다이크로익 필터의 통과 대역과 저지 대역 사이의 실질적으로 더 날카로운 에지를 발생시킨다. 따라서, 본 명세서에 개시된 조명 및 이미징 모듈(100, 500)은 유리하게는 여기 빔이 제1 다이크로익 필터(130, 530)의 평면에 대해 s-편광되도록 제1 다이크로익 필터(130, 530)에 대해 배향된 조명 소스(115)를 가질 수 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 일부 구현에서, 선형 편광기와 같은 편광기가 여기 빔을 편광시키기 위해 사용될 수 있다. 이 편광기는 s-편광된 광에 대응하는 선형 편광된 광의 배향을 제공하도록 회전될 수 있다. 또한 위에서 논의된 바와 같이, 일부 구현에서, 선형 편광된 광을 회전시키는 다른 접근법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 반파 지연기 또는 다중 1/4 파장 지연기와 같은 광학 지연기를 사용하여 편광 방향을 회전시킬 수 있다. 다른 배열도 가능하다.
본 명세서에서 다른 곳에서 논의되는 바와 같이, 형광 이미징 모듈 및/또는 대물 렌즈의 개구수(NA)를 감소시키는 것은 2 개의 표면의 유사한 이미징을 가능하게 하도록 피사계 심도를 증가시킬 수 있다. 도 11a 내지 도 16b는 더 큰 개구수보다 더 낮은 개구수에 대해 1 mm의 유리에 의해 분리된 제1 및 제2 표면에서 MTF가 어떻게 더 유사한지를 보여준다.
도 11a 및 도 11b는 0.3의 NA에 대한 제1 표면(도 11a) 및 제2 표면(도 11b)에서의 MTF를 도시한다.
도 12a 및 도 12b는 0.4의 NA에 대한 제1 표면(도 12a) 및 제2 표면(도 12b)에서의 MTF를 도시한다.
도 13a 및 도 13b는 0.5의 NA에 대한 제1 표면(도 13a) 및 제2 표면(도 13b)에서의 MTF를 도시한다.
도 14a 및 도 14b는 0.6의 NA에 대한 제1 표면(도 14a) 및 제2 표면(도 14b)에서의 MTF를 도시한다.
도 15a 및 도 15b는 0.7의 NA에 대한 제1 표면(도 15a) 및 제2 표면(도 15b)에서의 MTF를 도시한다.
도 16a 및 도 16b는 0.8의 NA에 대한 제1 표면(도 16a) 및 제2 표면(도 16b)에서의 MTF를 도시한다. 각 도면의 제1 및 제2 표면은 예를 들어 흐름 셀의 상단 및 하단 표면에 해당한다.
도 17a 내지 도 17b는 제1 흐름 셀 표면을 통해 제2 흐름 셀 표면을 이미징하기 위해 계산된 스트렐 비율의 플롯을 제공한다(즉, 광학 시스템에 의해 포커싱되거나 또는 수집된 피크 광도 대 이상적인 광학 시스템 및 점 광원에 의해 포커싱되거나 또는 수집된 피크 광도의 비율). 도 17a는 상이한 대물 렌즈 및/또는 광학 시스템 개구수에 대한 개재 유체 층의 두께(유체 채널 높이)의 함수로서 제1 흐름 셀 표면을 통해 제2 흐름 셀 표면을 이미징하기 위한 스트렐 비율의 플롯을 도시한다. 도시된 바와 같이, 스트렐 비율은 제1 표면과 제2 표면 사이의 분리가 증가함에 따라 감소한다. 따라서 표면들 중 하나는 2 개의 표면들 사이의 분리가 증가함에 따라 이미지 품질이 저하된다. 2 개의 표면들 사이의 증가된 분리 거리에 따른 제2 표면 이미징 성능의 감소는 더 큰 개구수를 갖는 것들에 비해 더 작은 개구수를 갖는 이미징 시스템에 대해 감소된다. 도 17b는 제1 흐름 셀 표면을 통해 제2 흐름 셀 표면을 이미징하기 위해 0.1 mm의 두께를 갖는 물의 개재 층에 대한 개구수의 함수로서의 스트렐 비율의 플롯을 도시한다. 더 높은 개구수에서 이미징 성능의 손실은 제2 표면 이미징을 위해 유체에 의해 유도된 광학 수차 증가에 기인할 수 있다. NA가 증가함에 따라, 제2 표면 이미징을 위해 유체에 의해 도입된 광학 수차가 증가하여 이미지 품질이 크게 저하된다. 그러나, 일반적으로, 광학 시스템의 개구수를 감소시키면 달성 가능한 해상도가 감소된다. 이러한 이미지 품질의 손실은 예를 들어, 라벨링된 핵산 클러스터에 대한 형광 방출을 향상시키고 및/또는 배경 형광 방출을 감소시키는 핵산 시퀀싱 적용들에 화학을 사용함으로써, 증가된 샘플 평면(또는 객체 평면) 대조 대 잡음비를 제공함으로써 적어도 부분적으로 상쇄될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 친수성 기판 재료 및/또는 친수성 코팅을 포함하는 샘플 지지 구조가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 친수성 기판 및/또는 친수성 코팅은 배경 잡음을 감소시킬 수 있다. 샘플 지지 구조, 친수성 표면 및 코팅, 그리고 예를 들어 핵산 시퀀싱 적용들에 대해 대조 대 잡음비를 향상시키는 방법에 대한 추가 논의는 아래에서 발견될 수 있다.
일부 구현에서, 형광 이미징 시스템, 조명 및 이미징 모듈(100), 이미징 광학 장치(예를 들어, 광학 장치(126)), 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈 중 임의의 하나 이상은 아래에서 더 논의되는 바와 같이 10x 미만의 배율과 같이 축소된 배율을 갖도록 구성된다. 이러한 축소된 배율은 다른 설계 파라미터가 달성될 수 있도록 설계 제약을 조정할 수 있다. 예를 들어, 형광 현미경, 조명 및 이미징 모듈(100), 이미징 광학 장치(예를 들어, 광학 장치(126)), 대물 렌즈 또는 튜브 렌즈 중 임의의 하나 이상은 또한, 아래에서 더 논의되는 바와 같이, 형광 이미징 모듈이 큰 시야(FOV), 예를 들어, 적어도 3.0 mm 이상의 시야(예를 들어, 직경, 폭, 높이 또는 가장 긴 치수)를 갖도록 구성될 수 있다. 형광 이미징 시스템, 조명 및 이미징 모듈(100), 이미징 광학 장치(예를 들어, 광학 장치(126)), 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈 중 임의의 하나 이상은 FOV가 예를 들어 필드의 적어도 80 %에 걸쳐 0.1 미만의 수차 파동을 갖도록 그러한 시야를 갖는 형광 현미경을 제공하도록 구성될 수 있다. 유사하게, 형광 이미징 시스템, 조명 및 이미징 모듈(100), 이미징 광학 장치(예를 들어, 광학 장치(126)), 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈 중 임의의 하나 이상은 형광 이미징 모듈이 이러한 FOV를 갖고 회절 제한되거나 또는 이러한 FOV에 대해 회절 제한되도록 구성될 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 다양한 구현에서, 넓은 시야(FOV)가 개시된 광학 시스템에 의해 제공된다. 일부 구현에서, 증가된 FOV를 얻는 것은 더 큰 이미지 센서 또는 광검출기 어레이의 사용에 의해 부분적으로 용이하게 된다. 광검출기 어레이는, 예를 들어, 아래에서 더 논의되는 바와 같이, 적어도 15 mm 이상의 대각선을 갖는 활성 영역을 가질 수 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 일부 구현에서, 개시된 광학 이미징 시스템은 예를 들어 큰 FOV 설계를 용이하게 할 수 있는 10x 미만의 축소된 배율을 제공한다. 축소된 배율에도 불구하고, 작은 픽셀 크기 또는 피치를 갖는 검출기 어레이가 사용될 수 있기 때문에, 이미징 모듈의 광학 해상도는 여전히 충분할 수 있다. 픽셀 크기 및/또는 피치는 예를 들어 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이 약 5 ㎛ 이하일 수 있다. 일부 구현에서, 픽셀 크기는 나이키스트 정리를 충족시키기 위해 광학 이미징 시스템(예를 들어, 대물 렌즈 및 튜브 렌즈)에 의해 제공되는 광학 해상도의 2 배보다 더 작다. 따라서, 이미지 센서(들)에 대한 픽셀 치수 및/또는 피치는 이미징 모듈에 대한 공간 샘플링 주파수가 이미징 모듈의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 이루어질 수 있다. 예를 들어, 광검출기 어레이에 대한 공간 샘플링 주파수는 형광 이미징 모듈(예를 들어, 조명 및 이미징 모듈, 대물 렌즈 및 튜브 렌즈, 검출 채널의 대물 렌즈 및 광학 장치(126), 샘플 지지 구조 또는 샘플 지지 스테이지를 지지하도록 구성된 스테이지와 광검출기 어레이 사이의 이미징 광학 장치)의 광학 해상도의 적어도 2 배, 적어도 2.5 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 또는 적어도 5 배 또는 이러한 값들 중 임의의 것 사이의 범위에 있는 임의의 공간 샘플링 주파수일 수 있다.
형광 이미징 모듈과 관련하여 광범위한 특징들이 여기에서 논의되지만, 여기에 설명된 특징들 및 설계들 중 임의의 것이 명시야 및 암시야 이미징을 제한 없이 포함하는 다른 유형의 광학 이미징 시스템에 적용될 수 있으며, 발광 또는 인광 이미징에 적용될 수 있다.
이중 파장 여기/4 채널 이미징 시스템: 도 18은 예를 들어, 여러 이미지를 타일링하여(tiling) 각 개별 이미지에 대한 것보다 훨씬 큰 전체 시야(FOV)를 갖는 합성 이미지를 생성함으로써, 큰 영역 이미징을 제공하기 위해 광축에 수직인 방향으로 스캐닝되는 대물 렌즈 및 튜브 렌즈 조합을 포함하는 양면 이미징 적용을 위한 이중 여기 파장/4 채널 이미징 시스템을 도시한다. 이 시스템은 서로 다른 파장에서 작동하는 2 개의 여기 광원, 예를 들어, 레이저 또는 레이저 다이오드 및 오토 포커스 레이저를 포함한다. 2 개의 여기 광 빔 및 오토 포커스 레이저 빔은 일련의 미러 및/또는 다이크로익 반사기를 사용하여 결합되고, 대물 렌즈를 통해 흐름 셀의 상부 또는 하부 내부 표면으로 전달된다. 흐름 셀 표면들 중 하나에 테더링되고 라벨링된 올리고뉴클레오티드(또는 다른 생체 분자)에 의해 방출되는 형광은 대물 렌즈에 의해 수집되고, 튜브 렌즈를 통해 투과되고, 일련의 중간 다이크로익 반사기에 의해 방출된 광의 파장에 따라 4 개의 이미징 센서 중 하나로 지향된다. 흐름 셀 표면에서 반사된 오토 포커스 레이저 광은 대물 렌즈에 의해 수집되어, 튜브 렌즈를 통해 투과되고, 일련의 중간 다이크로익 반사기에 의해 오토 포커스 센서로 지향된다. 시스템은 (예를 들어, 정밀 선형 액추에이터, 병진 스테이지, 또는 현미경 터릿 장착(turret-mounted) 초점 조정 기구를 사용하여 흐름 셀 표면과 대물 렌즈 사이의 상대 거리를 조정하여, 오토 포커스 이미지 센서의 반사된 광 스폿 크기를 감소시키거나 또는 최소화함으로써) 정확한 초점이 유지될 수 있게 하고, 대물 렌즈/튜브 렌즈 조합은 대물 렌즈의 광축에 수직인 방향으로 스캐닝된다. 4 채널(즉, 4 파장) 이미징 기능과 조합되어 사용되는 이중 파장 여기는 흐름 셀의 상부 (가까운) 및 하부 (먼) 내부 표면의 높은 처리량 이미징을 제공한다.
다중화된 광학 판독 헤드:
일부 경우에, 본 명세서에 설명된 이미징 모듈의 소형 버전은 동시에 표면의 여러 섹션들을 이미징하기 위해 샘플 표면, 예를 들어 흐름 셀의 내부 표면에 대해 수평으로 하나 이상의 방향으로 병진될 수 있는 다중화된 판독 헤드를 생성하도록 조립될 수 있다. 다중화된 판독 헤드의 비-제한적인 예는 최근 미국 공개 특허 출원 번호 2020/0139375 A1에 설명되어 있다.
일부 경우에, 예를 들어, 소형화된 이미징 모듈은 본 명세서의 다른 곳에서 설명되는 바와 같이 LED 또는 레이저 다이오드(또는 외부 광원에 연결된 광섬유의 팁)와 같은 조명 또는 여기 광원을 포함하는 "마이크로 형광 측정기“, 조명 또는 여기 광을 시준하거나 또는 포커싱하기 위한 하나 이상의 렌즈, 하나 이상의 다이크로익 반사기, 하나 이상의 광학 필터, 하나 이상의 미러, 빔 스플리터, 프리즘, 조리개 등, 하나 이상의 대물 렌즈, 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 최소한의 초점 조정으로 이중 표면 이미징을 가능하게 하기 위한 하나 이상의 맞춤형 튜브 렌즈, 하나 이상의 이미지 센서, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 소형화된 이미징 모듈(예를 들어, "마이크로 형광 측정기")은 오토 포커스 기구, 마이크로프로세서, 전원 및 데이터 전송 커넥터, 차광 하우징 등을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 결과적인 소형화된 이미징 모듈은 소형 폼 팩터를 갖는 통합 이미징 패키지 또는 유닛을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 소형화된 이미징 모듈의 최단 치수(예를 들어, 폭 또는 직경)는 5 cm 미만, 4.5 cm 미만, 4 cm 미만, 3.5 cm 미만, 3 cm 미만, 2.5 cm 미만, 2 cm 미만, 1.8 cm 미만, 1.6 cm 미만, 1.4 cm 미만, 1.2 cm 미만, 1 cm 미만, 0.8 cm 미만, 또는 0.6 cm 미만일 수 있다. 일부 경우에, 소형화된 이미징 모듈의 가장 긴 치수(예를 들어, 높이 또는 길이)는 16 cm 미만, 14 cm 미만, 12 cm 미만, 10 cm 미만, 9 cm 미만, 8 cm 미만, 7 cm 미만, 5 cm 미만, 5 cm 미만, 4.5 cm 미만, 4 cm 미만, 3.5 cm 미만, 3 cm 미만, 2.5 cm 미만, 2 cm 미만, 1.8 cm 미만, 1.6 cm 미만, 1.4 cm 미만, 1.2 cm 미만, 또는 1 cm 미만일 수 있다. 일부 경우에, 다중화된 판독 헤드 내의 하나 이상의 개별 소형 이미징 모듈은 오토 포커스 기구를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 설명된 다중 판독 헤드는 서로에 대해 고정된 위치에 유지되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 12 개 초과의 소형화된 이미징 모듈 또는 마이크로 형광 측정기의 조립체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 개구수, 시야, 피사계 심도, 이미지 해상도 등에 대한 개개의 소형화된 이미징 모듈 또는 마이크로 형광 측정기의 광학 설계 사양 및 성능 특성은 개시된 이미징 모듈의 다른 버전에 대해 여기의 다른 곳에서 설명된 것과 동일할 수 있다. 일부 경우에, 복수의 개별 소형 이미징 모듈은 1, 2, 3, 4 또는 4 개 초과의 행 및/또는 열을 포함하는 선형 배열로 배열될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 개별 소형화 이미징 모듈은 예를 들어 육각형 클로즈 팩 배열로 배열될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 개별 소형화된 이미징 모듈은 원형 또는 나선형 배열, 무작위로 분포된 배열, 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 배열로 배열될 수 있다.
도 43a 내지 도 43b는 본 명세서에 개시된 바와 같은 다중화된 판독 헤드의 비-제한적인 개략도를 제공한다. 도 43a는 다중화된 판독 헤드의 측면도를 도시하고, 여기서 공통 광학 설계 사양, 예를 들어, 개구수, 시야, 작동 거리 등을 갖는 개별 마이크로 형광 측정기의 2 개의 행(단부에서 보았을 때)은 흐름 셀의 제1 내부 표면과 같은 공통 표면을 이미징하도록 구성된다. 도 43b는 판독 헤드가 흐름 셀에 대해 병진될 때(혹은 그 반대로) 다중화된 판독 헤드의 개별 마이크로 형광 측정기에 의해 획득된 중첩 이미징 경로를 예시하는 동일한 다중화된 판독 헤드의 평면도를 보여준다. 일부 경우에, 개별 마이크로 형광 측정기에 대한 개별 시야는 도 43b에 나타낸 바와 같이 중첩될 수 있다. 일부 경우에, 이들은 중첩되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 다중 판독 헤드는 흐름 셀 내에서 미리 결정된 특징, 예를 들어 개별 유체 채널과 정렬되어 이미징하도록 설계될 수 있다.
도 44a 내지 도 44b는 다중화된 판독 헤드의 비-제한적인 개략도를 제공하고, 여기서 복수의 개별 소형화된 이미징 모듈의 제1 서브 세트는 제1 샘플 평면, 예를 들어 흐름 셀의 제1 내부 표면을 이미징하도록 구성되고, 복수의 개별 소형화된 이미징 모듈의 제2 서브 세트는 제2 샘플 평면, 예를 들어 흐름 셀의 제2 내부 표면을 동시에 이미징하도록 구성된다. 도 44a는 다중화된 판독 헤드의 측면도를 도시하고, 여기서 개별 마이크로 형광 측정기의 제1 서브 세트는 예를 들어 흐름 셀의 제1 또는 상부 내부 표면을 이미징하도록 구성되고, 제2 서브 세트는 제2 표면, 예를 들어 흐름 셀의 제2 또는 하부 내부 표면을 이미징하도록 구성된다. 도 44b는 다중화된 판독 헤드의 개별 마이크로 형광 측정기에 의해 획득된 이미징 경로를 도시하는 도 44a의 다중화된 판독 헤드의 평면도를 도시한다. 다시 말하자면, 일부 경우에, 주어진 서브 세트의 개별 마이크로 형광 측정기에 대한 개별 시야가 중첩될 수 있다. 일부 경우에, 이들은 중첩되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 다중화된 판독 헤드는 제1 및 제2 서브 세트의 개별 소형화된 이미징 모듈이 흐름 셀 내에서 미리 결정된 특징, 예를 들어 개별 유체 채널과 정렬되어 이미징하도록 설계될 수 있다.
더 두꺼운 커버슬립과 함께 사용하기 위해 개선되거나 또는 최적화된 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈: 기존 설계 관행에는 얇은(예를 들어, < 200 ㎛ 두께) 현미경 커버슬립을 통해 이미지가 획득될 때 이미지 품질을 최적화하기 위해 대물 렌즈의 설계 및/또는 일반적으로 사용 가능한 기성품 현미경 대물 렌즈의 사용이 포함된다. 유체 채널 또는 흐름 셀의 양면에 대해 이미징하도록 사용되는 경우, 2 개의 표면 사이의 갭의 추가 높이(즉, 유체 채널의 높이; 일반적으로 약 50 ㎛ 내지 200 ㎛)는 유체 채널의 최적이 아닌 면에 대해 캡처된 이미지에 광학 수차를 도입하여, 이에 따라 광학 해상도가 낮아진다. 이는 기본적으로 추가 갭 높이가 최적의 커버슬립 두께(전형적인 유체 채널 또는 갭 높이 50 내지 200 ㎛ 대 커버슬립 두께 < 200 ㎛)에 비해 상당하기 때문이다. 또 다른 일반적인 설계 관행은 유체 채널 또는 흐름 셀의 최적이 아닌 면에서 이미징을 수행할 때 광학 경로에 추가 "보상기" 렌즈를 사용하는 것이다. 이러한 "보상기" 렌즈 및 흐름 셀의 양면이 이미징될 수 있도록 이를 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동하는 데 필요한 기구를 통해, 시스템 복잡성 및 이미징 시스템 다운 타임이 더욱 증가하고, 진동 등으로 인해 이미지 품질이 잠재적으로 저하될 수 있다.
본 개시에서, 이미징 시스템은 더 두꺼운 커버슬립 또는 흐름 셀 벽(두께 ≥ 700 ㎛)을 포함하는 흐름 셀 소모품과의 호환성을 위해 설계된다. 대물 렌즈 설계는 실제 커버 슬립 두께에 유효 갭 두께의 절반을 더한 것(예를 들어, 700 ㎛ + ½ * 유체 채널(갭) 높이)과 동일한 커버 슬립에 대해 개선되거나 또는 최적화될 수 있다. 이러한 설계는 유체 채널의 2 개의 표면에 대한 이미지 품질에 대한 갭 높이의 영향을 크게 감소시키고 2 개의 표면의 이미지에 대한 광학 품질의 균형을 유지하는데, 왜냐하면 갭 높이가 총 커버슬립 두께에 비해 작고 이에 따라 광학 품질에 미치는 그 영향이 감소되기 때문이다.
더 두꺼운 커버슬립을 사용하는 추가 이점은, 제조 중 두께 공차 오류의 제어가 개선되고, 커버슬립이 열 및 장착 유도 응력으로 인해 변형을 겪게 될 가능성이 감소된다는 것을 포함한다. 커버슬립 두께 오류 및 변형은 흐름 셀의 상단 표면과 하단 표면 모두에 대한 이미징 품질에 부정적인 영향을 미친다.
시퀀싱 적용들을 위한 이중 표면 이미징 품질을 더욱 향상시키기 위해, 본 광학 시스템 설계는 작은 스폿 또는 클러스터를 이미징하고 분해하는 데 가장 적합한 중간 내지 높은 공간 주파수 범위에서 (예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈 설계의 개선 또는 최적화를 통해) MTF 개선 또는 최적화에 강한 중점을 둔다.
상업적으로 입수 가능한 기성품 대물 렌즈에 사용할 수 있도록 개선되거나 또는 최적화된 튜브 렌즈 설계: 저비용 시퀀서 설계의 경우, 비교적 저렴한 가격으로 인해 상업적으로 입수 가능한 기성품 대물 렌즈를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 위에서 언급한 바와 같이, 저비용 기성품 대물 렌즈는 대부분 두께가 약 170 ㎛인 얇은 커버슬립과 함께 사용하도록 최적화되어 있다. 일부 경우에, 개시된 광학 시스템은 이중 표면 이미징 적용들에서 흐름 셀의 두 개의 내부 표면 모두에 대해 높은 이미지 품질을 가능하게 하면서 더 두꺼운 흐름 셀 커버슬립을 보상하는 튜브 렌즈 설계를 사용할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 튜브 렌즈 설계는 흐름 셀과 이미지 센서 사이의 광학 경로의 내부로 또는 외부로 광학 보상기를 이동하지 않고, 광학 경로를 따라 튜브 렌즈의 하나 이상의 광학 요소 또는 구성 요소를 이동하지 않고, 그리고 튜브 렌즈의 하나 이상의 광학 요소 또는 구성 요소를 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동시키지 않고, 흐름 셀의 두 개의 내부 표면 모두에 대한 고품질 이미징을 가능하게 한다.
도 19는 0.17 mm 두께 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면을 이미징하기 위해 개선되거나 또는 최적화된 저조도 대물 렌즈 설계에 대한 광학 광선 추적 다이어그램을 제공한다. 도 20에 도시되어 있는 이러한 대물 렌즈를 위한 변조 전달 함수의 플롯은 0.17 mm 두께에 대해 설계된 커버슬립과 함께 사용될 때 근접 회절 제한 이미징 성능을 나타낸다.
도 21은 0.3 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 19에 예시된 동일한 대물 렌즈에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다. 약 100 내지 약 800 라인/mm(또는 사이클/mm)의 공간 주파수 범위에 걸쳐 MTF 값의 상대적으로 작은 편차는 0.3 mm 두께의 커버슬립을 사용하는 경우에도 획득된 이미지 품질이 여전히 합리적이라는 것을 나타낸다.
도 22는 (즉, 먼 표면을 이미징할 때 흐름 셀의 양면 이미징을 위해 직면하는 조건의 종류 하에서) 수성 유체의 0.1 mm 두께 층에 의해 0.3 mm 두께의 커버슬립의 반대쪽 측면 상의 표면과 분리된 표면을 이미징하는 데 사용될 때 공간 주파수의 함수로서 도 19에 예시된 동일한 대물 렌즈에 대한 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다. 도 22의 플롯에서 알 수 있는 바와 같이, 약 50 lp/mm 내지 약 900 lp/mm의 공간 주파수 범위에 걸쳐 이상적인 회절 제한 사례에 대한 것들의 MTF 곡선의 편차로 표시되는 바와 같이, 이미징 성능이 저하된다.
도 23 및 도 24는 1.0 mm 두께의 커버슬립을 통해 도 19에 도시된 대물 렌즈를 사용하여 이미징될 때, 및 상부 및 하부 내부 표면이 0.1 mm 두께의 수성 유체 층에 의해 분리될 때 흐름 셀의 상부(또는 가까운) 내부 표면(도 23) 및 하부(또는 먼) 내부 표면(도 24)에 대한 공간 주파수의 함수로서 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다. 알 수 있는 바와 같이, 이미징 성능은 두 개의 표면 모두에서 크게 저하된다.
도 25는 도 19에 도시된 대물 렌즈와 함께 사용되는 경우, 1 mm 두께의 커버슬립을 통해 개선된 양면 이미징을 제공하는 튜브 렌즈 설계를 위한 광선 추적 다이어그램을 제공한다. 복합 대물 렌즈(렌즈 요소(702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710)) 및 튜브 렌즈(렌즈 요소(711, 712, 713, 714))를 포함하는 광학 설계(700)는 예를 들어 두께가 700 ㎛ 초과이고 유체 채널 두께가 적어도 50 ㎛인 두꺼운 커버슬립(또는 벽)을 포함하는 흐름 셀과 함께 사용되도록 개선되거나 또는 최적화되고, 내부 표면의 이미지를 흐름 셀(701)로부터 이미지 센서(715)로 전송하여 광학 이미지 품질이 크게 개선되고 CNR이 높아진다.
일부 경우에, 튜브 렌즈(또는 튜브 렌즈 조립체)는 적어도 2 개의 광학 렌즈 요소, 적어도 3 개의 광학 렌즈 요소, 적어도 4 개의 광학 렌즈 요소, 적어도 5 개의 광학 렌즈 요소, 적어도 6 개의 광학 렌즈 요소, 적어도 7 개의 광학 렌즈 요소, 적어도 8 개의 광학 렌즈 요소, 적어도 9 개의 광학 렌즈 요소, 적어도 10 개의 광학 렌즈 요소, 또는 그 초과를 포함할 수 있고, 여기서 광학 렌즈 요소의 개수, 각 요소의 표면 기하학적 구조, 및 이들이 조립체에 배치되는 순서는 흐름 셀의 두꺼운 벽에 의해 유도된 광학 수차를 보정하기 위해 개선되거나 또는 최적화되며, 일부 경우에, 고품질의 양면 이미징 기능을 유지하면서 상업적으로 이용 가능한 기성품 대물 렌즈를 사용하는 것을 가능하게 한다.
일부 경우에, 도 25에 도시된 바와 같이, 튜브 렌즈 조립체는 제1 비대칭 볼록-볼록 렌즈(711), 제2 볼록-평면 렌즈(712), 제3 비대칭 오목-오목 렌즈(713), 및 제4 비대칭 볼록-오목 렌즈(714)를 순서대로 포함할 수 있다.
도 26 및 도 27은 1.0 mm 두께의 커버슬립을 통해 도 25에 도시된 대물 렌즈(0.17 mm 커버슬립에 대해 보정됨) 및 튜브 렌즈 조합을 사용하여 이미징될 때, 및 상부 및 하부 내부 표면이 0.1 mm 두께의 수성 유체 층에 의해 분리될 때 흐름 셀의 상부(또는 가까운) 내부 표면(도 26) 및 하부(또는 먼) 내부 표면(도 27)에 대한 공간 주파수의 함수로서 변조 전달 함수의 플롯을 제공한다. 알 수 있는 바와 같이, 달성된 이미징 성능은 회절 제한 광학 설계에 대해 예상되는 것과 거의 같다.
도 28은 고품질의 양면 이미징 성능을 제공하도록 개선되거나 또는 최적화된 본 개시의 튜브 렌즈 설계(왼쪽)에 대한 광선 추적 다이어그램을 제공한다. 튜브 렌즈는 더 이상 무한 보정되지 않기 때문에, 제조 및 테스트 목적을 위해 무한 보정되지 않은 튜브 렌즈를 보상하기 위해 적절하게 설계된 널 렌즈(오른쪽)가 튜브 렌즈와 조합되어 사용될 수 있다.
이미징 채널 특정 튜브 렌즈 적응 또는 최적화: 이미징 시스템 설계에서, 모든 이미징 채널에 대해 동일한 파장 구역에서 대물 렌즈 및 튜브 렌즈를 모두 개선하거나 또는 최적화할 수 있다. 일반적으로, 동일한 대물 렌즈는 모든 이미징 채널에 의해 공유되며(예를 들어, 도 18 참조), 각 이미징 채널은 동일한 튜브 렌즈를 사용하거나, 또는 동일한 설계를 공유하는 튜브 렌즈를 갖는다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 이미징 시스템은 각 이미징 채널에 대한 튜브 렌즈를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 튜브 렌즈는 이미지 품질을 개선하기 위해, 예를 들어, 왜곡 및 필드 곡률을 감소시키거나 또는 최소화하고 각 채널에 대한 피사계 심도(DOF) 성능을 개선하기 위해, 특정 이미징 채널에 대해 독립적으로 개선되거나 또는 최적화되었다. 각 특정 이미징 채널에 대한 파장 범위(또는 대역 통과)는 모든 채널에 대한 조합된 파장 범위보다 훨씬 더 좁기 때문에, 개시된 시스템에 사용된 튜브 렌즈의 파장 또는 채널 특정 적응 또는 최적화는 이미징 품질 및 성능에서 상당한 개선을 가져온다. 이러한 채널 특정 조정 또는 최적화를 통해 양면 이미징 적용에서 흐름 셀의 상단 및 하단 표면 모두에 대한 이미지 품질이 개선된다.
흐름 셀에 유체가 존재하지 않는 상태에서의 양면 이미징: 흐름 셀의 상단 및 하단 내부 표면 모두에 대한 최적의 이미징 성능을 위해, 일반적으로 모션 작동 보상기(motion-actuated compensator)가 (일반적으로 약 50 내지 200 ㎛의 유체 층 두께를 포함하는) 흐름 셀의 유체에 의해 유도된 광학 수차를 보정하는 데 필요하다. 개시된 광학 시스템 설계의 일부 경우에서, 흐름 셀의 상단 내부 표면은 흐름 셀에 존재하는 유체로 이미징될 수 있다. 시퀀싱 화학 사이클이 완료되면, 하단 내부 표면의 이미징을 위해 흐름 셀로부터 유체가 추출될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 보상기를 사용하지 않아도, 하단 표면에 대한 이미지 품질이 유지된다.
전기 광학 위상판을 사용하여 광학 수차 및/또는 진동을 보상: 일부 경우에, 유체의 존재에 의해 인해 유도된 광학 수차를 상쇄시키기 위해 대물 렌즈와 조합되어 전기 광학 위상판(또는 다른 보정 렌즈)을 사용함으로써 흐름 셀로부터 유체를 제거할 필요 없이도 양면 이미지 품질이 개선될 수 있다. 일부 경우에, 전기 광학 위상판(또는 렌즈)의 사용은 모션 작동 보상기의 기계적 모션으로부터 발생하는 진동의 영향을 제거하는 데 사용될 수 있으며, 게놈 시퀀싱 적용에 대해 더 빠른 이미지 획득 시간 및 시퀀싱 사이클 시간을 제공할 수 있다.
정보 전송 및 처리량을 증가시키거나 또는 최대화하기 위한 개선된 대조 대 잡음비(CNR), 시야(FOV), 스펙트럼 분리, 및 타이밍 설계: 게놈학 적용을 위해 설계된 이미징 시스템에서 정보 전송을 증가시키거나 또는 최대화하는 또 다른 방법은 FOV(시야)의 크기를 증가시키고 특정 FOV를 이미징하는 데 필요한 시간을 감소시키는 것이다. 일반적인 큰 NA 광학 이미징 시스템을 사용하면, 1 mm2 정도의 영역에 해당하는 시야에 대한 이미지를 획득하는 것이 일반적일 수 있고, 여기서 현재 개시된 이미징 시스템 설계에서 긴 작동 거리를 갖는 큰 FOV 대물 렌즈는 2 mm2 이상의 영역의 이미징을 가능하게 하도록 지정된다.
일부 경우에, 개시된 이미징 시스템은, 기판 표면에 대한 형광 염료의 비-특이적 흡착, 비-특이적 핵산 증폭 생성물(예를 들어, 핵산 분자(즉, 특이적 증폭된 콜로니)의 클론 증폭된 클러스터에 해당하는 특징들 또는 스폿들 사이의 영역에서 기판 표면에서 발생하는 핵산 증폭 생성물), 증폭된 콜로니 내에서 발생할 수 있는 비-특이적 핵산 증폭 생성물, 페이즈드(phased) 및 프리-페이즈드(pre-phased) 핵산 가닥 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 교란 신호에서 발생하는 형광 배경을 감소시키는 독점 저 결합 기판 표면 및 DNA 증폭 프로세스와 조합되어 사용하도록 설계된다. 개시된 광학 이미징 시스템과 조합되어 형광 배경을 감소시키는 저 결합 기판 표면 및 DNA 증폭 프로세스의 사용은 각 FOV를 이미징하는 데 필요한 시간을 상당히 줄일 수 있다.
현재 개시된 시스템 설계는 이미징 시퀀스 개선 또는 최적화를 통해 필요한 이미징 시간을 추가로 감소시킬 수 있고, 여기서 형광 이미지의 다중 채널이 동시에 또는 중첩 타이밍으로 획득되고, 형광 신호의 스펙트럼 분리는 형광 검출 채널들 사이의 그리고 여기 광과 형광 신호(들) 사이의 크로스토크를 감소시키도록 설계된다.
현재 개시된 시스템 설계는 스캐닝 모션 시퀀스의 개선 또는 최적화를 통해 필요한 이미징 시간을 추가로 감소시킬 수 있다. 일반적인 접근 방식에서, X-Y 병진 스테이지를 사용하여 표적 FOV를 대물 렌즈 아래 위치로 이동시키고, 오토 포커스 단계가 수행되며, 여기서 최적 초점 위치가 결정되고 대물 렌즈가 결정된 초점 위치로 Z 방향으로 이동되어, 이미지가 획득된다. 일련의 표적 FOV 위치를 통해 사이클링함으로써 형광 이미지의 시퀀스가 획득된다. 정보 전송 듀티 사이클 관점에서, 정보는 사이클의 형광 이미지 획득 부분 동안에만 전송된다. 현재 개시된 이미징 시스템 설계에서는, 모든 축(X-Y-Z)이 동시에 재-위치 결정되는 단일 단계 모션이 수행되고, 오토 포커스 단계는 초점 위치 오류를 확인하는 데 사용된다. 추가 Z 모션은 초점 위치 오류(즉, 초점면 위치와 샘플 평면 위치 간의 차이)가 특정 한계(예를 들어, 지정된 오류 임계값)를 초과하는 경우에만 명령된다. 고속 X-Y 모션과 커플링되어, 이 접근 방식은 시스템의 듀티 사이클을 증가시켜, 이에 따라 단위 시간당 이미징 처리량을 증가시킨다.
또한, 배경 신호 및 시스템 잡음 특성을 고려하면서, 입력 여기 광자 플럭스에 대해 예상되는 형광 광자 플럭스, (염료 흡광 계수 및 형광 양자 수율 관련된) 염료 효율과 설계의 광 수집 효율, 변조 전달 함수, 및 이미지 센서 성능 특성을 일치시킴으로써, 고 품질(높은 대조 대 잡음비(CNR) 이미지)을 획득하는 데 필요한 시간이 감소되거나 또는 최소화될 수 있다.
효율적인 이미지 획득과 개선되거나 또는 최적화된 병진 스테이지 단계 및 정착 시간의 조합은 빠른 이미징 시간(즉, 시야 당 필요한 전체 시간) 및 더 높은 처리량 이미징 시스템 성능으로 이어진다.
큰 FOV 및 빠른 이미지 획득 듀티 사이클과 함께, 개시된 설계는 이미지 평면 평탄도, 형광 검출 채널들 사이의 색 초점 성능, 센서 평탄도, 이미지 왜곡, 및 초점 품질 사양을 지정하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
각 검출 채널에 가장 적합한 초점면이 중첩되도록 서로 다른 형광 검출 채널에 대해 이미지 센서들을 개별적으로 정렬함으로써 크로매틱 초점 성능이 더욱 개선된다. 설계 목표는 시야의 90 % 초과에 걸친 이미지가 각 채널에 대한 최상의 초점면에 대해 ± 100 nm(또는 그 미만) 내에서 획득되도록 보장하여, 이에 따라 개별 스폿 강도 신호의 전송을 증가시키거나 또는 최대화하는 것이다. 일부 경우에, 개시된 설계는 시야의 99 %에 걸친 이미지가 각 채널에 대한 최상의 초점면에 대해 ± 150 nm(또는 그 미만) 내에서 획득되도록 그리고 더 많은 전체 시야에 걸친 이미지가 각 이미징 채널에 대한 최상의 초점면에 대해 ± 200 nm(또는 그 미만) 내에서 획득되도록 추가로 보장한다.
조명 광학 경로 설계: 신호 대 잡음비(SNR), 대조 대 잡음비(CNR)를 개선하고 및/또는 처리량을 증가시키기 위한 또 다른 요소는 샘플에 대한 조명 출력 밀도를 높이는 것이다. 일부 경우에, 개시된 이미징 시스템은 액체 광 가이드와 커플링된 고출력 레이저 또는 레이저 다이오드를 사용하는 조명 경로 설계를 포함할 수 있다. 액체 광 가이드는 레이저 및 레이저 다이오드와 같은 간섭성 광원에 고유한 광학 스페클을 제거한다. 또한, 커플링 광학 장치는 액체 광 가이드의 입구 조리개를 언더필링(underfill)하도록 설계된다. 액체 광 가이드 입구 조리개의 언더필링은 대물 렌즈에 들어가는 조명 빔의 유효 개구수를 감소시키고, 따라서 대물 렌즈를 통해 샘플 평면으로의 광 전달 효율을 개선시킨다. 이러한 설계 혁신을 통해, 넓은 시야(FOV)에 걸쳐 기존 설계의 조명 출력 밀도의 최대 3 배까지의 조명 출력 밀도를 달성할 수 있다.
s-편광 및 p-편광의 각도 의존적 식별을 이용함으로써, 일부 경우에, 조명 빔 편광이 이미징 센서에 도달하는 후방 산란 및 후방 반사 조명 광의 양을 감소시키도록 배향될 수 있다.
구조화된 조명 시스템: 일부 경우에, 개시된 이미징 모듈 및 시스템은 이미징 시스템의 유효 공간 해상도를 증가시키고 따라서 개선된 시퀀싱 처리량을 위해 흐름 셀 표면에서 클론 증폭된 표적 핵산 시퀀스(클러스터)의 더 높은 표면 밀도의 사용을 가능하게 하는 구조화된 조명 광학 설계를 포함할 수 있다. 구조화된 조명 현미경(SIM)은 샘플 평면의 조명을 위해 공간적으로 구조화된 (즉, 주기적인) 광 패턴을 사용하고, 모아레 프린지로 알려진 간섭 패턴의 생성에 의존한다. 모아레 프린지를 생성하기 위해, 예를 들어 구조화된 조명의 패턴을 시프트하고 및/또는 회전함으로써 약간 다른 조명 조건 하에서 여러 이미지가 획득된다. 결과적인 간섭 신호의 수학적 디콘볼루션(deconvolution)을 통해, 공간 해상도가 회절 제한된 이미징 광학 장치를 사용하여 달성되는 것보다 최대 약 2 배 개선된 초해상도 이미지를 재구성할 수 있다[Lutz (2011), "초해상도 광학 현미경에 의한 생물학적 이미징", 컴프리헨시브 바이오테크놀로지(Comprehensive Biotechnology) (제2 판), 1 권, 579 내지 589 페이지, 엘제비어(Elsevier); Feiner-Gracia, 등 (2018), "15 - 셀-나노입자 상호 작용의 조사를 위한 고급 광학 현미경 기술", 생물 의학용 스마트 나노입자(Smart Nanoparticles for Biomedicine): 마이크로 및 나노 기술, 219 내지 236 페이지, 엘제비어; Nylk, 등 (2019), "구조화된 광을 사용한 라이트 시트 형광 현미경", 신경 광자학 및 생의학 분광학(Neurophotonics and Biomedical Spectroscopy), 477 내지 501 페이지, 엘제비어]. 구조화된 조명 현미경 이미징 시스템의 예가 최근 Hong, 미국 특허 출원 공개 번호 2020/0218052 에 설명되어 있다.
도 41은 본 명세서에 개시된 바와 같은 분지형 구조화된 조명 광학 설계를 포함하는 이미징 시스템(4100)의 비-제한적인 개략도를 제공한다. 시스템(4100)의 조명 광학 경로의 제1 분지(또는 아암)는, 예를 들어, 광원(광 방출기)(4110A), 광원(4110A)에 의해 방출된 광을 시준하기 위한 광 시준기(4120A), 광축에 대한 제1 배향의 회절 격자(4130A), 회전창(4140A) 및 렌즈(4150A)를 포함한다. 시스템(4100)의 조명 광학 경로의 제2 분지는, 예를 들어, 광원(4110B), 광원(4110B)에 의해 방출된 광을 시준하기 위한 광 시준기(4120B), 광축에 대한 제2 배향의 회절 격자(4130B), 회전 창(4140B), 및 렌즈(4150B)를 포함한다. 회절 격자(4130A 및 4130B)는 샘플 평면에 광 프린지의 패턴의 투사를 가능하게 한다.
일부 경우에, 광원(4110A 및 4110B)은 간섭성 광원(예를 들어, 하나 이상의 발광 다이오드(LED)을 포함함) 또는 간섭성 광원(예를 들어, 하나 이상의 레이저 또는 레이저 다이오드를 포함함)일 수 있다. 일부 경우에, 광원(4110A 및 4110B)은 예를 들어 LED, 레이저, 또는 그 후 각각의 시준기 렌즈(4120A 및 4120B)에 의해 시준되는 광 빔을 출력하는 레이저 다이오드에 커플링된 광섬유를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 광원(4110A 및 4110B)은 동일한 파장의 광을 출력할 수 있다. 일부 경우에, 광원(4110A 및 4110B)은 상이한 파장의 광을 출력할 수 있다. 광원(4110A 및 4110B) 중 어느 하나는 여기의 다른 곳에서 설명된 임의의 파장 및/또는 파장 범위의 광을 출력하도록 구성될 수 있다. 이미징 동안, 광원(4110A, 4110B)은 예를 들어, 광학 경로에 위치된 고속 셔터(도시되지 않음)를 사용하거나 또는 광원을 미리 정해진 주파수로 펄싱함으로써 스위칭 온 또는 오프될 수 있다.
도 41에 도시된 예에서, 시스템(4100)의 제1 조명 아암은 샘플 평면, 예를 들어 흐름 셀(4187)의 제1 내부 표면(4188) 상에 제1 배향으로 격자 패턴(예를 들어, 수직 광 프린지 패턴)을 투사하는 데 사용되는 고정된 수직 격자(4130A)를 포함하고, 제2 조명 아암은 샘플 평면(4188) 상에 제2 배향으로 격자 패턴(예를 들어, 수평 광 프린지 패턴)을 투사하기 위해 고정된 수평 격자(4130B)를 포함한다. 유리하게는, 이미징 시스템(4100)의 회절 격자는 이러한 비-제한적인 예에서 이미징 동안 기계적으로 회전되거나 또는 병진될 필요가 없으며, 이는 개선된 이미징 속도, 시스템 신뢰성, 및 시스템 반복성을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 회절 격자(4130A 및/또는 4130B)는 샘플 평면에 투사된 광 프린지 패턴들 사이의 각도가 조정 가능하도록 이들의 각각의 광축을 중심으로 회전될 수 있다.
도 41에 도시된 바와 같이, 일부 경우에, 회절 격자(4130A 및 4130B)는 유리 기판 또는 다른 적절한 표면에 형성된 복수의 회절 요소(예를 들어, 평행 슬릿 또는 홈)를 포함하는 투과형 회절 격자일 수 있다. 일부 경우에, 격자는 격자 재료의 굴절률의 주기적인 변화를 제공하는 위상 격자로서 구현될 수 있다. 일부 경우에, 홈 또는 특징부 간격은 적절한 각도로 광을 회절시키고 및/또는 이미징 시스템(4100)의 작동을 위해 이미징된 샘플의 분해 가능한 최소 특징부 크기로 튜닝되도록 선택될 수 있다. 다른 경우에, 회절 격자는 반사성 회절 격자일 수 있다.
도 41에 도시된 예에서, 수직 및 수평 광 프린지 패턴의 배향은 약 90 도만큼 오프셋되어 있다. 다른 경우에, 회절 격자의 다른 배향은 약 90 도의 오프셋을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 회절 격자는 이들이 샘플 평면(예를 들어, 제1 내부 흐름 셀 표면)(4188)의 x 또는 y 축으로부터 ±45 도만큼 오프셋된 광 프린지 패턴을 투사하도록 배향될 수 있다. 도 41에 도시된 이미징 시스템(4100)의 구성은 직사각형 그리드 상에 배치된 규칙적으로 패터닝된 특징을 포함하는 샘플 지지 표면(예를 들어, 흐름 셀(4187)의 내부 표면(4188))의 경우에 특히 유리할 수 있는데, 왜냐하면 구조화된 조명 방식을 사용한 이미지 해상도의 향상은 2 개의 수직 격자 배향(예를 들어, 수직 격자 배향 및 수평 격자 배향)만을 사용하여 달성될 수 있기 때문이다.
시스템(4100)의 예에서 회절 격자(4130A 및 4130B)는 다음 관계식에 따른 보강 간섭으로 인해 입력 조명 광 빔을 일련의 최대 강도로 회절시키도록 구성될 수 있다:
m = 차수 = d sin(θ)/λ
여기서 d = 회절 격자의 슬릿들 또는 홈들 사이의 거리, θ = 회절 격자의 표면에 대한 법선에 대한 조명 광의 입사각, λ = 조명 광의 파장, m = 회절된 광의 최대 강도에 대응하는 정수 값, 예를 들어, m = 0, ±1, ±2 등이다. 일부 경우에, 회절된 조명 광의 특정 차수, 예를 들어 1 차(m = ±1) 광이 샘플 평면, 예를 들어 내부 흐름 셀 표면(4188) 상에 투사될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 수직 격자(4130A)는 시준된 광 빔을, 1 차 배향으로 샘플 평면 상에 포커싱되는 1 차 회절된 빔(±1 차)으로 회절시킬 수 있고, 수평 격자(4130B)는 시준된 광 빔을, 제2 배향으로 샘플 평면 상에 포커싱되는 1 차 회절된 빔으로 회절시킬 수 있다. 일부 경우에, 0 차 빔 및/또는 다른 모든 고차 빔(예를 들어, m = ±2 이상)은 차단될 수 있는데, 즉, 예를 들어 회절 격자 다음에 광학 경로 내로 삽입될 수 있는 차수 필터와 같은 빔 차단 요소(도시되지 않음)를 사용하여 샘플 평면(4188)에 투사된 조명 패턴에서 필터링될 수 있다.
4100의 예에서 구조화된 조명 시스템의 각 분지는 각각의 회절 격자(4130A 및 4130B)에 의해 투과되거나 또는 반사된 회절된 광을 위상 시프트하기 위한 광학 위상 변조기 또는 위상 시프터(4140A 및 4140B)를 포함한다. 구조화된 이미징 동안, 각 회절된 빔의 광학 위상은 구조화된 패턴의 각 프린지의 피치(X)의 일부 분율(예를 들어, 1/2, 1/2, 1/4 등)만큼 시프트될 수 있다. 도 41의 예에서, 위상 변조기(4140A 및 4140B)는, 예를 들어 회전식 액추에이터 또는 다른 액추에이터 기구에 의해 작동되는 회전 광학 위상판으로서 구현되어 각각의 회절된 빔의 광학 경로 길이를 회전시키고 변조할 수 있다. 예를 들어, 광학 위상판(4140A)은 수직 축을 중심으로 회전되어 샘플 평면(4188) 상의 수직 격자(4130A)에 의해 투사된 이미지를 왼쪽 또는 오른쪽으로 시프트시킬 수 있고, 광학 위상판(4140B)은 수평 축을 중심으로 회전되어 수직 방향으로 샘플 평면(4188) 상의 수평 격자(4130B)에 의해 투사된 이미지를 시프트시킬 수 있다.
다른 구현에서, 회절된 광의 광학 경로 길이를 변경하는 다른 유형의 위상 변조기(예를 들어, 선형 병진 스테이지 상에 장착된 광학 웨지 등)가 사용될 수 있다. 추가적으로, 광학 위상 변조기(4140A 및 4140B)가 회절 격자(4130A 및 4130B) 이후에 배치되는 것으로 도시되어 있지만, 다른 구현에서, 이들은 조명 광학 경로의 다른 위치에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 단일 광학 위상 변조기는 2 개의 서로 다른 방향으로 작동되어 서로 다른 광 프린지 패턴을 생성하거나, 또는 단일 광학 위상 변조기의 위치는 단일 모션을 사용하여 조정되어 조명 광학 경로의 양쪽 아암의 경로 길이를 동시에 조정할 수 있다.
도 41에 도시된 예에서, 광학 구성 요소(4160)는 2 개의 조명 광학 경로로부터의 광을 결합하기 위해 사용될 수 있다. 광학 구성 요소(4160)은, 예를 들어, 부분적으로 은색인 미러, (광원(4110A 및 4110B)에 의해 출력되는 광의 파장에 따라) 다이크로익 미러, 조명 시스템의 2 개의 아암에서 나오는 광이 (예를 들어, 반사 코팅에 의한 소량의 흡수를 제외하고는 광 파워의 현저한 손실 없이) 무-손실 또는 거의 무-손실 방식으로 결합되도록 구멍의 패턴 또는 패터닝된 반사 코팅을 포함하는 미러, 편광 빔 스플리터(광원(4110A 및 4110B)이 편광된 광을 생성하도록 구성된 경우) 등을 포함할 수 있다. 광학 구성 요소(4160)는 각각의 회절 격자에 의해 반사되거나 또는 투과된 원하는 회절된 차수의 광이 공간적으로 분해되고 원하지 않는 차수의 광이 차단되도록 위치될 수 있다. 일부 경우에, 광학 구성 요소(4160)는 제1 조명 광학 경로에 의해 출력된 1 차 광을 통과시키고 제2 조명 광학 경로에 의해 출력된 1 차 광을 반사할 수 있다. 일부 경우에, 샘플 표면(4188) 상의 구조화된 조명 패턴은 각 광원을 턴온하거나 또는 턴오프함으로써, 또는 광원에 대한 광학 경로에서 광학 셔터를 개방하고 폐쇄함으로써, 수직 배향(예를 들어, 회절 격자(4130A)를 사용함)으로부터 수평 방향(예를 들어, 회절 격자(4130B)를 사용함)으로 스위칭될 수 있다. 다른 경우에, 구조화된 조명 패턴은 샘플 평면을 조명하는 데 사용되는 조명 광학 경로를 변경하기 위해 광학 스위치를 사용하여 스위칭될 수 있다.
다시 도 41을 참조하면, 렌즈(4170), 반-반사 미러 또는 다이크로익 미러(4180), 및 대물 렌즈(4185)는 구조화된 조명 광을 샘플 표면(4188)(예를 들어, 흐름 셀(4187)의 제1 내부 표면) 상에 포커싱하기 위해 사용될 수 있다. 샘플 표면(4188)에 의해 방출되거나, 반사되거나, 또는 산란된 광은 이 경우 대물 렌즈(4185)에 의해 수집되고, 미러(4180)을 통해 투과되며, 이미지 센서 또는 카메라(4195)에 의해 이미징된다. 언급된 바와 같이, 미러(4180)는 조명 광학 경로의 각 분지로부터 수신된 구조화된 조명 광을 샘플 평면(4188) 상으로 투사하기 위해 대물 렌즈(4185)로 반사하고 이미지 센서(4195) 상에 이미징하기 위해 샘플 평면(4188)에 의해 방출된 광(예를 들어, 여기 광과 다른 파장으로 방출되는 형광 광)을 통과시키는 다이크로익 미러일 수 있다.
일부 경우에, 시스템(4100)은 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 맞춤형 튜브 렌즈(4190)를 선택적으로 포함할 수 있어, 이미징 시스템의 초점이 흐름 셀(4187)의 제1 내부 표면(4188)으로부터 제2 내부 표면(4189)으로 시프트되어 최소한의 조정으로 이중 표면 이미징이 가능하게 할 수 있다. 일부 경우에, 렌즈(4170)는 조명 광학 경로의 초점이 흐름 셀(4187)의 제1 내부 표면(4188)으로부터 제2 내부 표면(4189)으로 시프트되어 최소 조정으로 이중 표면 이미징을 가능하게 할 수 있도록 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 맞춤형 튜브 렌즈를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 렌즈(4170)는 샘플 평면 상의 구조화된 조명 패턴의 초점을 조정하기 위해 광축을 따라 관절 연결되도록 구현될 수 있다. 일부 경우에, 시스템(4100)은 조명 광의 초점 및/또는 이미지 센서(4195)의 평면에서 이미지의 초점을 조정하기 위한 오토 포커스 기구(도시되지 않음)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 도 41에 예시된 시스템(4100)은 광학 경로에 편광기가 없기 때문에 높은 광 효율을 제공할 수 있다. 편광되지 않은 광의 사용은 대물 렌즈(4185)의 개구수에 따라 조명 패턴 콘트라스트에 큰 영향을 미칠 수도 있고 또는 그렇지 않을 수도 있다.
단순화를 위해, 이미징 시스템(4100)의 일부 광학 구성 요소는 도 41 및 전술한 논의에서 생략될 수 있다. 시스템(4100)은 이러한 비-제한적인 예에서 단일 채널 검출 시스템으로 예시되어 있지만, 다른 경우에, 이것은 다중 채널 검출 시스템(예를 들어, 2 개의 서로 다른 이미지 센서 및 적절한 광학 장치 그리고 2 개의 서로 다른 파장에서 방출하는 광원을 사용함)으로 구현될 수 있다. 또한, 시스템(4100)의 조명 광학 경로가 이러한 비-제한적인 예에서 2 개의 분지를 포함하는 것으로 예시되어 있지만, 일부 경우에, 이것은 예를 들어 3 개의 분지, 4 개의 분지, 또는 4 개 초과의 분지를 포함하는 것으로 구현될 수 있으며, 이들 각각은 서로에 대해 고정되거나 또는 조정 가능한 상대 배향으로 회절 격자를 포함한다.
일부 경우에, 구조화된 조명을 생성하기 위해 대안적인 조명 경로 광학 설계가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 단일의 큰 회전 광학 위상 변조기가 광학 구성 요소(4160) 이후에 위치될 수 있고, 광학 위상 변조기(4140A 및 4140B) 대신에 사용되어 수직 및 수평 회절 격자(4130A 및 4130B)에 의해 출력된 두 개의 회절된 빔 모두의 위상을 변조할 수 있다. 일부 경우에, 회절 격자 중 하나의 광축에 대해 평행인 대신에, 단일 회전 광학 보상기에 대한 회전 축은 수직 및 수평 회절 격자 각각의 광축으로부터 45 도(또는 다른 각진 오프셋)만큼 오프셋되어 두 개의 조명 방향을 따라 위상 시프트를 허용할 수 있다. 일부 경우에, 단일 회전 광학 위상 변조기는 예를 들어 공칭 빔 축을 중심으로 회전하는 웨지형 광학 구성 요소로 대체될 수 있다.
또 다른 대안적인 조명 광학 경로 설계에서, 회절 격자(4130A 및 4130B)는 회절 격자(4130A 및 4130B)에 의해 반사되거나 또는 투과된 광의 광학 경로 길이(및 이에 따라 위상)를 변경하기 위해 병진될 수 있도록 각각의 선형 이동 스테이지 상에 장착될 수 있다. 선형 이동 스테이지의 모션 축은 샘플 평면(4188)을 따라 회절 격자의 프린지 패턴의 병진을 제공하기 위해 각각의 회절 격자의 배향으로부터 수직이거나 또는 그렇지 않으면 오프셋될 수 있다. 적합한 병진 스테이지는 예를 들어 교차된 롤러 베어링 스테이지, 선형 모터, 고-정밀 선형 인코더, 및/또는 회절 격자의 정확한 선형 병진을 제공하는 다른 선형 액추에이터 기술을 포함할 수 있다.
도 42는 이미징 시스템의 공간 해상도를 향상시키기 위해 구조화된 조명을 사용하여 이미징된 이미지를 획득하고 처리하기 위한 워크플로우의 비-제한적인 예를 제공한다. 일부 경우에, 도 42에 도시된 워크플로우는 전체 샘플 평면(예를 들어, 이미지 타일링을 통한 흐름 셀의 내부 표면)을 이미징하거나 또는 더 큰 샘플 평면의 단일 영역을 이미징하기 위해 수행될 수 있다. 도 41에 도시된 시스템(4100)의 수직(4130A) 및 수평(4130B) 회절 격자는, 조명 광 프린지 패턴을, 서로 다른 알려진 배향 및/또는 서로 다른 알려진 위상 시프트를 갖는 샘플 평면 상으로 투사하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이미징 시스템(4100)은 수평 및 수직 조명 패턴을 각각 생성하기 위해 수직 격자(4130A) 및 수평 격자(4130B)를 사용할 수 있고, 광학 위상 변조기(4140A 및 4140B)는 각각의 배향에 대해 도시된 3 개의 위상 시프트를 생성하기 위해 3 개의 상이한 위치로 설정될 수 있다.
작동 중에, 제1 조명 조건(예를 들어, 회절 격자의 특정 배향 및 위상 시프트 설정)을 사용하여 샘플 평면, 예를 들어, 흐름 셀 표면 상에 격자 광 프린지 패턴을 투사할 수 있다. 제1 조명 조건을 사용하여 이미지를 캡처한 후, 하나 이상의 위상 시프트 조명 패턴을 사용하여 획득된 하나 이상의 추가 이미지(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 6 개 초과의 위상 시프트된 조명 패턴을 사용하여 획득된 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 6 개 초과의 추가 이미지)가 획득될 수 있다. 이미징 시스템이 조명 광학 경로의 제2 분지를 포함하는 경우, 이미지 획득 프로세스는 제2 조명 조건을 시작점으로 사용하여 반복될 수 있고(예를 들어, 회절 격자의 제2 특정 배향 및 위상 시프트 설정), 이미지 획득 프로세스가 반복될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 5 개의 상이한 위상 시프트된 광 프린지 패턴을 사용하여 회절 격자의 적어도 3 개의 상이한 배향(예를 들어, 서로에 대해 60 도만큼 이격됨)에 대해 이미지가 획득될 수 있다. 회절 격자 또는 위상 시프트된 조명 광 프린지 패턴의 다른 배향을 사용하여 더 이상 이미지가 획득될 수 없는 경우, 이미지 재구성 알고리즘을 사용하여 획득된 이미지를 처리하고 재구성된 초해상도 이미지를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 이미지는 각 배향에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 6 개 초과의 서로 다른 위상 시프트된 광 프린지 패턴을 사용하여 회절 격자의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 6 개 초과의 다른 배향에 대해 획득될 수 있다.
단일 초해상도 이미지를 재구성하는 데 사용하기 위해 복수의 이미지를 획득할 때의 잠재적인 단점은, 투사된 광 프린지 패턴의 배향 및/또는 상대 위상 시프트를 조정하는 데 필요한 시간 및 각 이미지를 획득하는 데 필요한 노출 시간, 그리고 다운스트림 이미지 처리에 필요한 시간이다. 따라서, 고효율 이미지 재구성 알고리즘과 함께, 회절 격자 배향 및 상대 위상을 변경하는 데 필요한 시간을 최소화하는 광학 설계가 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 기존 샘플, 예를 들어, 염색된 조직 샘플의 더 높은 해상도 이미지를 재구성하는 데 일반적으로 필요한 것보다 더 적은 수의 이미지가 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 낮은 비-특이적 결합 표면에 테더링된 증폭된 표적 핵산 시퀀스의 별개의 형광 라벨링된 클러스터를 포함하는 예를 들어 흐름 셀 표면의 초해상도 이미지를 재구성하기 위해 필요할 수 있다.
다시 도 42를 참조하면, 예를 들어 이미지가 타일링되어 전체 흐름 셀 표면의 고 해상도 이미지를 생성하는 경우, 주어진 흐름 셀 표면의 다른 영역에 대해 앞서 언급된 사이클이 반복될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 제2 흐름 셀 표면이 이미징되어야 하는 경우, 이미징 시스템의 초점을 조정한 후 앞서 언급된 사이클이 반복될 수 있다.
다른 초해상도 이미징 기술: 일부 경우에, 개시된 이미징 시스템은 대안적인 초해상도 이미징 기술, 예를 들어, 광활성화 국부화 현미경(photoactivation localization microscopy)(PALM), 형광 광활성화 국부화 현미경(fluorescent photoactivation localization microscopy)(FPALM), 및/또는 확률적 광학 재구성 현미경(stochastic optical reconstruction microscopy)(STORM)의 사용을 포함할 수 있고[예를 들어, Lutz, 등 (2011), "초해상도 광 현미경에 의한 생물학적 이미징", 컴프리헨시브 바이오테크놀로지(2 판), 1 권, 579 내지 589 페이지, 엘제비어], 이는 단일 분자의 점 확산 함수(PSF) 내지 가우스 분포 함수의 이미지들에서 관찰된 강도 분포의 통계적 곡선 피팅을 기초로 한다. 이 경우 가우스 분포 함수를 사용하여 기존 해상도 한계에 의해 허용되는 것보다 훨씬 더 높은 정밀도로 샘플 평면 상에서 분자의 위치를 정의한다. 동일한 접근 방식을 사용하여 예를 들어 샘플 지지체의 낮은 비-특이적 결합 표면 또는 흐름 셀의 내부 표면에 테더링된 표적 핵산 시퀀스의 클론 증폭 클러스터와 같은 형광 라벨링된 분자의 작은 분산 서브 세트를 이미징할 수 있다.
이러한 방법을 사용하여 달성된 공간 정확도 또는 해상도는 광표백되기 전에 분자로부터 수집된 광자의 개수 및 배경 잡음 수준에 따라 다르다[Lutz, 등 (2011), 같은 책]. 배경 잡음이 무시할 수 있고 분자 당 적어도 10,000 개의 광자의 수집이 가능한 경우, 1 내지 2 nm의 위치 정확도가 입증되었다. 일부 경우에, 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 결합활성에 의한 시퀀싱 접근법을 사용하여, 매우 낮은 배경 신호를 보장하기 위해 본 명세서의 다른 곳에 개시된 낮은 비-특이적 결합 표면과 조합하여 선택적으로 사용되어, 높은 광자 카운트를 보장하기 위해 복수의 형광 라벨(예를 들어, 콘쥬게이트당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 개 초과의 라벨)을 포함하는 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는, 유전자 검사 및 시퀀싱 적용을 위한 이러한 초해상도 이미징 기술의 사용을 용이하게 할 수 있다. 수집된 광자의 개수가 감소함에 따라 공간적 정확도 또는 해상도가 감소하지만, 그러나, 적당한 개수의 광자만이 수집되는 경우에도, 위치 결정 정확도 또는 20 nm의 해상도가 가능하다. 일부 경우에, 측면 공간 해상도가 10 배 이상 개선될 수 있다. 일부 경우에, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm, 또는 10 nm보다 우수한 이미지 해상도가 달성될 수 있다.
이러한 이미징 클래스의 기본인 제2 원칙은 샘플 내에서 적은 개수의 공간적으로 분리된 형광 분자가 주어진 시간에 이미징된다는 것이다.
일부 경우에, 샘플 평면에서 작고 분산된 형광 분자 서브 세트의 형광 방출을 제어할 수 있는 능력이 초해상도 이미징을 용이하게 하는 열쇠이다. 형광 광활성화 국부화 현미경(FPALM) 및 광활성화 국부화 현미경(PALM)의 경우, 예를 들어, 광활성화 가능한 녹색 형광 단백질(PA-GFP)을 라벨로 사용하는 것은 PA-GFP를 어둡고 비-형광 상태로부터 488 nm 여기 가능한 형광 상태로 광변환하기 위해 405 nm 광의 짧은 펄스를 사용하여 샘플에서 형광 서브 세트의 제어된 유도를 허용했고, 이에 따라 이미징될 수 있는 형광 분자의 공간적으로 분리된 서브 세트가 생성된다[Lutz, 등 (2011), 같은 책]. 확률적 광학 재구성 현미경(STORM)의 경우, 예를 들어, 시아닌 염료 쌍 Cy5-Cy3의 광전환 특성은 주어진 시간에 샘플의 분자의 작은 서브 세트, 예를 들어 적어도 여러 해상도 단위에 의해 공간적으로 분리된 분자의 작은 서브 세트로부터 Cy5 형광의 확률적 유도를 가능하게 하도록 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 결합활성에 의한 시퀀싱 접근법과 조합될 때, 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는 광활성화 가능한 녹색 형광 단백질(PA-GFP) 또는 서브도메인 또는 그 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는 제1 부분이 예를 들어 Cy3 라벨로 라벨링되고 제2 부분이 예를 들어 Cy5 라벨로 라벨링된 콘쥬게이트의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 중합체 뉴클레오티드 콘쥬게이트는 예를 들어 동일한 콘쥬게이트 내에 Cy3 라벨 및 Cy5 라벨의 혼합물을 포함할 수 있다.
초해상 이미지는 획득된 이미지의 시간 스택에서 이미징된 모든 분자 또는 특징(예를 들어, 라벨링된 핵산 클러스터)으로부터의 가우시안 피트의 합으로 재구성되고[Lutz, 등 (2011), 같은 책], 여기서 강도는 각 분자 또는 분자의 서브 세트의 위치에 대한 위치 불확실성에 해당한다. 이러한 종류의 데이터 세트에 고유한 것은 다른 국부화 정밀도 또는 해상도로 이미지를 렌더링할 수 있는 능력이다. 일부 경우에, 내부 전반사 형광(TIRF) 광학 이미징 설계를 포함하는 이미징 모듈은, 형광의 여기에 사용되는 소멸파가 샘플 지지부 또는 흐름 셀 표면으로부터 축 방향 치수가 200 nm 미만으로 제한되어 이에 따라 배경 형광 신호를 억제하기 때문에, 이러한 초해상도 이미징 기술의 사용을 구현하는 데 유리할 수 있다. 일부 경우에, 이미징 시스템은 여기에 개시된 다른 이미징 모듈 설계에서 사용되는 것보다 더 높은 개구수 대물 렌즈를 포함할 수 있다. 더 높은 개구수 대물 렌즈를 사용하면 소멸파 여기의 구현 및 형광 프로브로부터 광자의 고효율 캡처를 용이하게 할 수 있다. 일부 경우에, 단일 광자에 민감한 EM-CCD 카메라 또는 다른 유형의 이미지 센서를 사용하는 광시야 이미징은 프레임 당 많은 분자 또는 분자의 서브 세트(예를 들어, 핵산 시퀀스 클러스터)의 동시 이미징을 가능하게 할 수 있어, 이에 따라 이미지 획득의 처리량을 개선시킨다.
일부 경우에, 적절한 특징 정의 및 해상도를 위한 충분한 이미지를 획득하는 데 필요한 데이터 획득 시간은 배경을 감소시키거나 또는 제거하면서 신호를 증가시키기 위해 여기에 개시된 결합활성에 의한 시퀀싱 시약 및 낮은 비-특이적 결합 표면의 사용, 및 개선된 이미지 재구성 알고리즘의 사용을 통해, 이미징 시스템의 감도 및 속도의 개선에 의해 단축될 수 있다.
이미지 품질 평가: 본 명세서에 개시된 광학 이미징 설계의 실시예들 중 임의의 것에 대해, 이미징 성능 또는 이미징 품질은 당업자에게 알려진 다양한 성능 메트릭 중 임의의 것을 사용하여 평가될 수 있다. 예들은 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서의 변조 전달 함수(MTF), 디포커스, 구면 수차, 색수차, 코마, 비점 수차, 필드 곡률, 이미지 왜곡, 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들의 임의의 조합의 측정이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
일부 경우에, 양면 이미징을 위한 개시된 광학 설계(예를 들어, 개시된 대물 렌즈 설계, 튜브 렌즈 설계, 대물 렌즈와 조합된 전기 광학 위상판의 사용 등, 단독으로 또는 조합하여)는 흐름 셀의 상부 (가까운) 내부 표면 및 하부 (먼) 내부 표면 모두의 이미지 품질을 크게 향상시킬 수 있어, 흐름 셀의 상부 내부 표면과 하부 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭의 차이는, 개별적으로 또는 조합하여, 위에 나열된 이미징 성능 메트릭들 중 임의의 것에 대해 20 % 미만, 15 % 미만, 10 % 미만, 5 % 미만, 4% 미만, 3 % 미만, 2 % 미만, 또는 1 % 미만이다.
일부 경우에, 양면 이미징을 위한 개시된 광학 설계(예를 들어, 개시된 튜브 렌즈 설계, 대물 렌즈와 조합된 전기 광학 위상판의 사용 등을 포함함)는 이미지 품질을 크게 향상시킬 수 있어, 양면 이미징을 위한 이미지 품질 성능 메트릭은, 개별적으로 또는 조합하여, 위에 나열된 이미징 성능 메트릭 중 임의의 것에 대해 예를 들어 대물 렌즈, 모션 작동 보상기(흐름 셀의 가까운 또는 먼 내부 표면을 이미징할 때 광학 경로의 내부로 또는 외부로 이동됨), 및 이미지 센서를 포함하는 기존 시스템에 비해 양면 이미징에 대한 이미징 성능 메트릭에서 적어도 1 %, 적어도 2 %, 적어도 3 %, 적어도 4 %, 적어도 5 %, 적어도 10 %, 적어도 15 %, 적어도 20 %, 적어도 25 %, 또는 적어도 30 % 개선을 제공한다. 일부 경우에, 개시된 튜브 렌즈 설계 중 하나 이상을 포함하는 형광 이미징 시스템은 대물 렌즈, 모션 작동 보상기 및 이미지 센서를 포함하는 기존 시스템에 비해 양면 이미징에 대한 이미징 성능 메트릭에서 적어도 동등하거나 또는 더 나은 개선을 제공한다. 일부 경우에, 개시된 튜브 렌즈 설계 중 하나 이상을 포함하는 형광 이미징 시스템은 대물 렌즈, 모션 작동 보상기 및 이미지 센서를 포함하는 기존 시스템에 비해 양면 이미징을 위한 이미징 성능 메트릭에서 적어도 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % 또는 50 % 개선을 제공한다.
이미징 모듈 사양:
여기 광 파장(들): 개시된 광학 이미징 모듈 설계 중 임의의 것에서, 개시된 이미징 모듈의 광원(들)은 녹색 광 및/또는 적색 광과 같은 가시광을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 광원(들)은, 단독으로 또는 하나 이상의 광학 구성 요소, 예를 들어 여기 광학 필터 및/또는 다이크로익 빔 스플리터와 조합되어, 약 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 475 nm, 500 nm, 525 nm, 550 m, 575 nm, 600 nm, 625 nm, 650 nm, 675 nm, 700 nm, 725 nm, 750 nm, 775 nm, 800 nm, 825 nm, 850 nm, 875 nm, 또는 900 nm의 여기 광을 생성할 수 있다. 당업자는 여기 파장이 이러한 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 620 nm을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
여기 광 대역폭: 개시된 광학 이미징 모듈 설계 중 임의의 것에서, 광원(들)은, 단독으로 또는 하나 이상의 광학 구성 요소, 예를 들어 여기 광학 필터 및/또는 다이크로익 빔 스플리터와 조합되어, ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm, 또는 그 초과의 대역폭 내의 지정된 여기 파장에서 광을 생성할 수 있다. 당업자는 여기 대역폭이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 ± 18 nm를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
광원 파워 출력: 개시된 광학 이미징 모듈 설계 중 임의의 것에서, 광원(들) 및/또는 이로부터 유도된 여기 광 빔(복합 여기 광 빔을 포함함)의 출력은 약 0.5 W 내지 약 5.0 W 또는 그 초과의 파워 범위일 수 있다(아래에서 더 자세히 논의될 것임). 일부 경우에, 광원의 출력 및/또는 이로부터 유도된 여기 광 빔의 파워는 적어도 0.5 W, 적어도 0.6 W, 적어도 0.7 W, 적어도 0.8 W, 적어도 1 W, 적어도 1.1 W, 적어도 1.2 W, 적어도 1.3 W, 적어도 1.4 W, 적어도 1.5 W, 적어도 1.6 W, 적어도 1.8 W, 적어도 2.0 W, 적어도 2.2 W, 적어도 2.4 W, 적어도 2.6 W, 적어도 2.8 W, 적어도 3.0 W, 적어도 3.5 W, 적어도 4.0 W, 적어도 4.5 W, 또는 적어도 5.0 W일 수 있다. 일부 구현에서, 광원의 출력 및/또는 이로부터 유도된 여기 광 빔(복합 여기 광 빔을 포함함)의 파워는 최대 5.0 W, 최대 4.5 W, 최대 4.0 W, 최대 3.5 W, 3.0 W, 최대 2.8 W, 최대 2.6 W, 최대 2.4 W, 최대 2.2 W, 최대 2.0 W, 최대 1.8 W, 최대 1.6 W, 최대 1.5 W, 최대 1.4 W, 최대 1.3 W, 최대 1.2 W, 최대 1.1 W, 최대 1 W, 최대 0.8 W, 최대 0.7 W, 최대 0.6 W 또는 최대 0.5 W일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 광원의 출력 및/또는 이로부터 유도된 여기 광 빔(복합 여기 광 빔을 포함함)의 파워는 약 0.8 W 내지 약 2.4 W의 범위일 수 있다. 당업자는 광원의 출력 및/또는 이로부터 유도된 여기 광 빔(복합 여기 광 빔을 포함함)의 파워가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 1.28 W를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
광원 출력 파워 및 CNR: 개시된 광학 이미징 모듈 설계의 일부 구현에서, 광원(들)의 출력 파워 및/또는 이로부터 유도된 여기 광 빔(들)(복합 여기 광 빔을 포함함)의 파워는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 또는 적어도 50 또는 그 초과의 조명 및 이미징 모듈에 의해 획득된 이미지의 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들 값들 중 임의의 것에 의해 형성된 임의의 범위 내의 임의의 CNR을, 적절한 샘플과 조합되어, 제공하기에 충분하다.
형광 방출 대역: 일부 경우에, 개시된 형광 광학 이미징 모듈은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 형광단에 의해 생성된 형광 방출을 검출하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 단백질에 대한 콘쥬게이션에 의한) 유전형 분석 및 핵산 시퀀싱 적용에 사용하기에 적합한 형광 염료의 예는 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 쿠마린(coumarin), 시아닌(cyanine), 및 시아닌 유도체 시아닌 염료-3(Cy3), 시아닌 염료-5(Cy5), 시아닌 염료-7(Cy7) 등을 포함하는 이들의 유도체를 포함하지만, 이들에 국한되지는 않는다.
형광 방출 파장: 개시된 광학 이미징 모듈 설계 중 임의의 것에서, 개시된 광학 시스템의 검출 채널 또는 이미징 채널은 약 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 475 nm, 500 nm, 525 nm, 550 m, 575 nm, 600 nm, 625 nm, 650 nm, 675 nm, 700 nm, 725 nm, 750 nm, 775 nm, 800 nm, 825 nm, 850 nm, 875 nm, 또는 900 nm의 방출 광을 수집하도록 구성된 하나 이상의 광학 구성 요소, 예를 들어 방출 광학 필터 및/또는 다이크로익 빔 스플리터를 포함할 수 있다. 당업자는 방출 파장이 이러한 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 825 nm를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
형광 발광 대역폭: 개시된 광학 이미징 모듈 설계 중 임의의 것에서, 검출 채널 또는 이미징 채널은 ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm, 또는 그 초과의 대역폭 내에서 지정된 방출 파장의 광을 수집하도록 구성된 하나 이상의 광학 구성 요소, 예를 들어 방출 광학 필터 및/또는 다이크로익 빔 스플리터를 포함할 수 있다. 당업자는 여기 대역폭이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 ± 18 nm를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
개구수: 일부 경우에, 임의의 개시된 광학 시스템 설계에서 대물 렌즈 및/또는 광학 이미징 모듈(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈를 포함함)의 개구수는 약 0.1 내지 약 1.4의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 개구수는 적어도 0.1, 적어도 0.2, 적어도 0.3, 적어도 0.4, 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.8, 적어도 0.9, 적어도 1.0, 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 또는 적어도 1.4 일 수 있다. 일부 경우에, 개구수는 최대 1.4, 최대 1.3, 최대 1.2, 최대 1.1, 최대 1.0, 최대 0.9, 최대 0.8, 최대 0.7, 최대 0.6, 최대 0.5, 최대 0.4, 최대 0.3, 최대 0.2 또는 최대 0.1 일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 개구수는 약 0.1 내지 약 0.6의 범위일 수 있다. 당업자는 개구수가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.55를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
광학 해상도: 일부 경우에, 대물 렌즈 및/또는 광학 시스템(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈를 포함함)의 개구수에 따라, 임의의 개시된 광학 시스템 설계에 의해 달성된 샘플 평면에서의 최소 분해 가능한 스폿(또는 특징) 분리 거리는 약 0.5 ㎛ 내지 약 2 ㎛의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 평면에서 최소 분해 가능한 스폿 분리 거리는 적어도 0.5 ㎛, 적어도 0.6 ㎛, 적어도 0.7 ㎛, 적어도 0.8 ㎛, 적어도 0.9 ㎛, 적어도 1.0 ㎛, 적어도 1.2 ㎛, 적어도 1.4 ㎛, 적어도 1.6 ㎛, 적어도 1.8 ㎛, 또는 적어도 1.0 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 최소 분해 가능한 스폿 분리 거리는 최대 2.0 ㎛, 최대 1.8 ㎛, 최대 1.6 ㎛, 최대 1.4 ㎛, 최대 1.2 ㎛, 최대 1.0 ㎛, 최대 0.9 ㎛, 최대 0.8 ㎛, 최대 0.7 ㎛, 최대 0.6 ㎛, 또는 최대 0.5 ㎛일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는, 예를 들어, 일부 경우에, 최소 분해 가능한 스폿 분리 거리는 약 0.8 ㎛ 내지 약 1.6 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 최소 분해 가능한 스폿 분리 거리가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 0.95 ㎛를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
서로 다른 깊이에서 제1 및 제2 표면의 광학 해상도: 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 임의의 광학 모듈 또는 시스템에서, 본 명세서에 개시된 신규한 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈 설계의 사용은, 제1 및 제2 표면의 이미지를 획득하는 사이에 리포커싱할 필요가 있거나 또는 없는 상태로 제1 및 제2 표면(예를 들어, 흐름 셀의 상부 및 하부 내부 표면)에 대해 유사한 광학 해상도를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 제1 및 제2 표면에 대해 이와 같이 획득된 이미지들의 광학 해상도는 서로의 20 %, 18 %, 16%, 14 %, 12 %, 10 %, 8 %, 6%, 4 %, 2 %, 또는 1 %, 또는 이 범위 내의 임의의 값 내에 있을 수 있다.
배율: 일부 경우에, 임의의 개시된 광학 구성에서 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈, 및/또는 광학 시스템(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈를 포함함)의 배율은 약 2x 내지 약 20x의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 광학 시스템 배율은 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x, 적어도 5x, 적어도 6x, 적어도 7x, 적어도 8x, 적어도 9x, 적어도 10x, 적어도 15x, 또는 적어도 20x일 수 있다. 일부 경우에, 광학 시스템 배율은 최대 20x, 최대 15x, 최대 10x, 최대 9x, 최대 8x, 최대 7x, 최대 6x, 최대 5x, 최대 4x, 최대 3x 또는 최대 2x일 수 있다. 이 단락에서 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 광학 시스템 배율은 약 3x 내지 약 10x의 범위일 수 있다. 당업자는 광학 시스템 배율이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 7.5x를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
대물 렌즈 초점 거리: 개시된 광학 설계의 일부 구현에서, 대물 렌즈의 초점 거리는 20 mm 내지 40 mm의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 대물 렌즈의 초점 거리는 적어도 20 mm, 적어도 25 mm, 적어도 30 mm, 적어도 35 mm, 또는 적어도 40 mm일 수 있다. 일부 경우에, 대물 렌즈의 초점 거리는 최대 40 mm, 최대 35 mm, 최대 30 mm, 최대 25 mm, 또는 최대 20 mm일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 대물 렌즈의 초점 거리는 25 mm 내지 35 mm의 범위일 수 있다. 당업자는 대물 렌즈의 초점 거리는 예를 들어, 약 37 mm와 같이 위에 명시된 값의 범위 내에서 임의의 값을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
대물 렌즈 작동 거리: 개시된 광학 설계의 일부 구현에서, 대물 렌즈의 작동 거리는 약 100 ㎛ 내지 30 mm의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 작동 거리는 적어도 100 ㎛, 적어도 200 ㎛, 적어도 300 ㎛, 적어도 400 ㎛, 적어도 500 ㎛, 적어도 600 ㎛, 적어도 700 ㎛, 적어도 800 ㎛, 적어도 900 ㎛, 적어도 1 mm, 적어도 2 mm, 적어도 4 mm, 적어도 6 mm, 적어도 8 mm, 적어도 10 mm, 적어도 15 mm, 적어도 20 mm, 적어도 25 mm, 또는 적어도 30 mm일 수 있다. 일부 경우에, 작동 거리는 최대 30 mm, 최대 25 mm, 최대 20 mm, 최대 15 mm, 최대 10 mm, 최대 8 mm, 최대 6 mm, 최대 4 mm, 최대 2 mm, 최대 1 mm, 최대 900 ㎛, 최대 800 ㎛, 최대 700 ㎛, 최대 600 ㎛, 최대 500 ㎛, 최대 400 ㎛, 최대 300 ㎛, 최대 200 ㎛, 최대 100 ㎛일 수 있다. 이 단락에서 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 대물 렌즈의 작동 거리는 500 ㎛ 내지 2 mm 범위일 수 있다. 당업자는 대물 렌즈의 작동 거리가 예를 들어 약 1.25 mm와 같이 위에 명시된 값의 범위 내에서 임의의 값을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
두꺼운 커버슬립을 통한 이미징에 최적화된 대물 렌즈: 개시된 광학 설계의 일부 경우에서, 대물 렌즈의 설계는 흐름 셀 두께의 다른 커버슬립에 대해 개선되거나 또는 최적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 대물 렌즈는 두께가 약 200 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛인 커버슬립에 대한 최적의 광학 성능을 위해 설계될 수 있다. 일부 경우에, 대물 렌즈는 적어도 200 ㎛, 적어도 300 ㎛, 적어도 400 ㎛, 적어도 500 ㎛, 적어도 600 ㎛, 적어도 700 ㎛, 적어도 800 ㎛, 적어도 900 ㎛ 또는 적어도 1,000 ㎛ 두께인 커버슬립으로 최적의 성능을 위해 설계될 수 있다. 일부 경우에, 대물 렌즈는 최대 1,000 ㎛, 최대 900 ㎛, 최대 800 ㎛, 최대 700 ㎛, 최대 600 ㎛, 최대 500 ㎛, 최대 400 ㎛, 최대 300 ㎛ 또는 최대 200 ㎛ 두께인 커버슬립으로 최적의 성능을 위해 설계될 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 대물 렌즈는 약 300 ㎛ 내지 약 900 ㎛ 범위일 수 있는 커버슬립에 대한 최적의 광학 성능을 위해 설계될 수 있다. 당업자는 대물 렌즈가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 725 ㎛를 가질 수 있는 커버슬립에 대한 최적의 광학 성능을 위해 설계될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
피사계 심도 및 초점 심도: 일부 경우에, 임의의 개시된 이미징 모듈(예를 들어, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈를 포함함) 설계에 대한 피사계 심도 및/또는 초점 심도는 약 10 ㎛ 내지 약 800 ㎛, 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 피사계 심도 및/또는 초점 심도는 적어도 10 ㎛, 적어도 20 ㎛, 적어도 30 ㎛, 적어도 40 ㎛, 적어도 50 ㎛, 적어도 75 ㎛, 적어도 100 ㎛, 적어도 125 ㎛, 적어도 150 ㎛, 적어도 175 ㎛, 적어도 200 ㎛, 적어도 250 ㎛, 적어도 300 ㎛, 적어도 300 ㎛, 적어도 400 ㎛, 적어도 500 ㎛, 적어도 600 ㎛, 적어도 700 ㎛, 또는 적어도 800 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 피사계 심도 및/또는 초점 심도 최대 800 ㎛, 최대 700 ㎛, 최대 600 ㎛, 최대 500 ㎛, 최대 400 ㎛, 최대 300 ㎛, 최대 250 ㎛, 최대 200 ㎛, 최대 175 ㎛, 최대 150 ㎛, 최대 125 ㎛, 최대 100 ㎛, 최대 75 ㎛, 최대 50 ㎛, 최대 40 ㎛, 최대 30 ㎛, 최대 20 ㎛, 최대 10 ㎛, 또는 그 미만일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 피사계 심도 및/또는 초점 심도는 약 100 ㎛ 내지 약 175 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 피사계 심도 및/또는 초점 심도가 위에 명시된 값의 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 132 ㎛를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
시야(FOV): 일부 구현에서, 임의의 개시된 이미징 모듈 설계의 FOV(예를 들어, 대물 렌즈와 검출 채널 광학 장치(예를 들어, 튜브 렌즈)의 조합에 의해 제공되는 것)는 예를 들어 약 1 mm 내지 5 mm의 범위일 수 있다(예를 들어, 직경, 폭, 길이 또는 가장 긴 치수). 일부 경우에, FOV는 적어도 1.0 mm, 적어도 1.5 mm, 적어도 2.0 mm, 적어도 2.5 mm, 적어도 3.0 mm, 적어도 3.5 mm, 적어도 4.0 mm, 적어도 4.5 mm, 또는 적어도 5.0 mm일 수 있다(예를 들어, 직경, 폭, 길이 또는 가장 긴 치수). 일부 경우에, FOV는 최대 5.0 mm, 최대 4.5 mm, 최대 4.0 mm, 최대 3.5 mm, 최대 3.0 mm, 최대 2.5 mm, 최대 2.0 mm, 최대 1.5 mm, 또는 최대 1.0 mm일 수 있다(예를 들어, 직경, 폭, 길이 또는 가장 긴 치수). 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, FOV는 약 1.5 mm 내지 약 3.5 mm의 범위일 수 있다(예를 들어, 직경, 폭, 길이 또는 가장 긴 치수). 당업자는 FOV가 예를 들어, 약 3.2 mm와 같이 위에 명시된 값 범위 내의 임의의 값을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다(예를 들어, 직경, 폭, 길이 또는 최장 치수).
시야(FOV) 면적: 개시된 광학 시스템 설계의 일부 경우에, 시야의 면적은 약 2 mm2 내지 약 5 mm2의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 시야는 면적이 적어도 2 mm2, 적어도 3 mm2, 적어도 4 mm2, 또는 적어도 5 mm2일 수 있다. 일부 경우에, 시야는 면적이 최대 5 mm2, 최대 4 mm2, 최대 3 mm2, 또는 최대 2 mm2일 수 있다. 이 단락에서 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 시야는 면적이 약 3 mm2 내지 약 4 mm2의 범위일 수 있다. 당업자는 시야의 면적이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 2.75 mm2를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈 MTF 최적화: 일부 경우에, 개시된 이미징 모듈 및 시스템에서 대물 렌즈 및/또는 적어도 하나의 튜브 렌즈의 설계는 중간 내지 높은 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성된다. 예를 들어, 일부 경우에, 개시된 이미징 모듈 및 시스템에서 대물 렌즈 및/또는 적어도 하나의 튜브 렌즈의 설계는 샘플 평면에서 mm당 500 사이클 내지 mm당 900 사이클, mm당 700 사이클 내지 mm당 1100 사이클, mm당 800 사이클 내지 mm당 1200 사이클 또는 mm당 600 사이클 내지 1000 사이클의 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성된다.
광학 수차 및 회절 제한 이미징 성능: 여기에 개시된 임의의 광학 이미징 모듈 설계의 일부 구현에서, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈는 FOV가 필드의 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %에 걸쳐 0.15 미만의 수차 파동을 갖도록 위에 표시된 바와 같은 시야를 이미징 모듈에 제공하도록 구성될 수 있다. 일부 구현에서, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈는 FOV가 필드의 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %에 걸쳐 0.1 미만의 수차 파동을 갖도록 위에 표시된 바와 같은 시야를 이미징 모듈에 제공하도록 구성될 수 있다. 일부 구현에서, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈는 FOV가 필드의 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %에 걸쳐 0.075 미만의 수차 파동을 갖도록 위에 표시된 바와 같은 시야를 갖는 이미징 모듈을 제공하도록 구성될 수 있다. 일부 구현에서, 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈는 FOV가 필드의 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %에 걸쳐 회절 제한되도록 위에 표시된 바와 같은 시야를 갖는 이미징 모듈을 제공하도록 구성될 수 있다.
다이크로익 반사기, 빔 스플리터, 및 빔 결합기에 대한 광 빔의 입사각: 개시된 광학 설계의 일부 경우에, 다이크로익 반사기, 빔 스플리터, 또는 빔 결합기에 입사하는 광 빔에 대한 입사각은 약 20 도 내지 약 45 도의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 입사각은 적어도 20 도, 적어도 25 도, 적어도 30 도, 적어도 35 도, 적어도 40 도, 또는 적어도 45 도일 수 있다. 일부 경우에, 입사각은 최대 45 도, 최대 40 도, 최대 35 도, 최대 30 도, 최대 25 도 또는 최대 20 도일 수 있다. 이 단락에서 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 입사각은 약 25 도 내지 약 40 도의 범위일 수 있다. 당업자는 입사각이 예를 들어, 약 43도와 같이 위에 명시된 값의 범위 내에서 임의의 값을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
이미지 센서(광검출기 어레이) 크기: 일부 경우에, 개시된 광학 시스템은 약 10 mm 내지 약 30 mm 또는 그 초과의 범위의 대각선을 갖는 활성 영역을 갖는 이미지 센서(들)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이미지 센서는 대각선이 적어도 10 mm, 적어도 12 mm, 적어도 14 mm, 적어도 16 mm, 적어도 18 mm, 적어도 20 mm, 적어도 22 mm, 적어도 24 mm, 적어도 26 mm, 적어도 28 mm, 또는 적어도 30 mm인 활성 영역을 가질 수 있다. 일부 경우에, 이미지 센서는 대각선이 최대 30 mm, 최대 28 mm, 최대 26 mm, 최대 24 mm, 최대 22 mm, 최대 20 mm, 최대 18 mm, 최대 16 mm, 최대 14 mm, 최대 12 mm 또는 최대 10 mm인 활성 영역을 가질 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 이미지 센서(들)는 약 12 mm 내지 약 24 mm 범위의 대각선을 갖는 활성 영역을 가질 수 있다. 당업자는 이미지 센서(들)가 예를 들어, 약 28.5 mm와 같이 위에 명시된 값 범위 내의 임의의 값을 갖는 대각선을 갖는 활성 영역을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
이미지 센서 픽셀 크기 및 피치: 일부 경우에, 개시된 광학 시스템 설계에 사용된 이미지 센서(들)에 대해 선택된 픽셀 크기 및/또는 피치는 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛의 적어도 하나의 치수 범위일 수 있다. 일부 경우에, 픽셀 크기 및/또는 피치는 적어도 1 ㎛, 적어도 2 ㎛, 적어도 3 ㎛, 적어도 4 ㎛, 적어도 5 ㎛, 적어도 6 ㎛, 적어도 7 ㎛, 적어도 8 ㎛, 적어도 9 ㎛, 또는 적어도 10 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 픽셀 크기 및/또는 피치는 최대 10 ㎛, 최대 9 ㎛, 최대 8 ㎛, 최대 7 ㎛, 최대 6 ㎛, 최대 5 ㎛, 최대 4 ㎛, 최대 3 ㎛, 최대 2 ㎛, 또는 최대 1 ㎛일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 픽셀 크기 및/또는 피치는 약 3 ㎛ 내지 약 9 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 픽셀 크기 및/또는 피치가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 1.4 ㎛를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
오버샘플링: 개시된 광학 설계의 일부 경우에, 공간 샘플링 주파수가 광학 해상도 X (lp/mm)의 적어도 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x 또는 10x인 공간 오버샘플링 방식이 사용된다.
최대 병진 스테이지 속도: 개시된 광학 이미징 모듈의 일부 경우에, 임의의 하나의 축에 대한 최대 병진 스테이지 속도는 약 1 mm/초 내지 약 5 mm/초 범위일 수 있다. 일부 경우에, 최대 병진 스테이지 속도는 적어도 1 mm/초, 적어도 2 mm/초, 적어도 3 mm/초, 적어도 4 mm/초, 또는 적어도 5 mm/초일 수 있다. 일부 경우에, 최대 병진 스테이지 속도는 최대 5 mm/초, 최대 4 mm/초, 최대 3 mm/초, 최대 2 mm/초, 또는 최대 1 mm/초일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 최대 병진 스테이지 속도는 약 2 mm/초 내지 약 4 mm/초 범위일 수 있다. 당업자는 최대 병진 스테이지 속도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 2.6 mm/초를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
최대 병진 스테이지 가속도: 개시된 광학 이미징 모듈의 일부 경우에, 임의의 하나의 모션 축에 대한 최대 가속도는 약 2 mm/sec2 내지 약 10 mm/sec2의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 최대 가속도는 적어도 2 mm/sec2, 적어도 3 mm/sec2, 적어도 4 mm/sec2, 적어도 5 mm/sec2, 적어도 6 mm/sec2, 적어도 7 mm/sec2, 적어도 8 mm/sec2, 적어도 9 mm/sec2, 또는 적어도 10 mm/sec2 일 수 있다. 일부 경우에, 최대 가속도는 최대 10 mm/sec2, 최대 9 mm/sec2, 최대 8 mm/sec2, 최대 7 mm/sec2, 최대 6 mm/sec2, 최대 5 mm/sec2, 최대 4 mm/sec2, 최대 3 mm/sec2, 또는 최대 2 mm/sec2 일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 최대 가속도는 약 2 mm/sec2 내지 약 8 mm/sec2 의 범위일 수 있다. 당업자는 최대 가속도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 3.7 mm/sec2를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
병진 스테이지 위치 결정 반복성: 개시된 광학 이미징 모듈의 일부 경우에, 임의의 하나의 축에 대한 위치 결정의 반복성은 약 0.1 ㎛ 내지 약 2 ㎛의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 위치 결정의 반복성은 적어도 0.1 ㎛, 적어도 0.2 ㎛, 적어도 0.3 ㎛, 적어도 0.4 ㎛, 적어도 0.5 ㎛, 적어도 0.6 ㎛, 적어도 0.7 ㎛, 적어도 0.8 ㎛, 적어도 0.9 ㎛, 적어도 1.0 ㎛, 적어도 1.2 ㎛, 적어도 1.4 ㎛, 적어도 1.6 ㎛, 적어도 1.8 ㎛, 또는 적어도 2.0 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 위치 결정의 반복성은 최대 2.0 ㎛, 최대 1.8 ㎛, 최대 1.6 ㎛, 최대 1.4 ㎛, 최대 1.2 ㎛, 최대 1.0 ㎛, 최대 0.9 ㎛, 최대 0.8 ㎛, 최대 0.7 ㎛, 최대 0.6 ㎛, 최대 0.5 ㎛, 최대 0.4 ㎛, 최대 0.3 ㎛, 최대 0.2 ㎛, 또는 최대 0.1 ㎛일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 위치 결정의 반복성은 약 0.3 ㎛ 내지 약 1.2 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 위치 결정의 반복성이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.47 ㎛를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
FOV 재-위치 결정 시간: 개시된 광학 이미징 모듈의 일부 경우에, 광학 장치에 대해 샘플 평면(시야)을 재-위치 결정하는 데 필요한 최대 시간은 약 0.1 초 내지 약 0.5 초 범위일 수 있다. 일부 경우에, 최대 재-위치 결정 시간(즉, 스캔 스테이지 단계 및 정착 시간)은 적어도 0.1 초, 적어도 0.2 초, 적어도 0.3 초, 적어도 0.4 초, 또는 적어도 0.5 초일 수 있다. 일부 경우에, 최대 재-위치 결정 시간은 최대 0.5 초, 최대 0.4 초, 최대 0.3 초, 최대 0.2 초, 또는 최대 0.1 초일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 최대 재-위치 결정 시간은 약 0.2 초 내지 약 0.4 초의 범위일 수 있다. 당업자는 최대 재-위치 결정 시간이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.45 초를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
오토 포커스 보정을 위한 오류 임계값: 개시된 광학 이미징 모듈의 일부 경우에, 오토 포커스 보정을 트리거하기 위한 지정된 오류 임계값은 약 50 nm 내지 약 200 nm 범위일 수 있다. 일부 경우에, 오류 임계값은 적어도 50 nm, 적어도 75 nm, 적어도 100 nm, 적어도 125 nm, 적어도 150 nm, 적어도 175 nm, 또는 적어도 200 nm일 수 있다. 일부 경우에, 오류 임계값은 최대 200 nm, 최대 175 nm, 최대 150 nm, 최대 125 nm, 최대 100 nm, 최대 75 nm, 또는 최대 50 nm일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 오류 임계값은 약 75 nm 내지 약 150 nm의 범위일 수 있다. 당업자는 오류 임계값이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 105 nm을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
이미지 획득 시간: 개시된 광학 이미징 모듈의 일부 경우에, 이미지 획득 시간은 약 0.001 초 내지 약 1 초 범위일 수 있다. 일부 경우에, 이미지 획득 시간은 적어도 0.001 초, 적어도 0.01 초, 적어도 0.1 초, 또는 적어도 1 초일 수 있다. 일부 경우에, 이미지 획득 시간은 최대 1 초, 최대 0.1 초, 최대 0.01 초, 또는 최대 0.001 초일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 이미지 획득 시간은 약 0.01 초 내지 약 0.1 초 범위일 수 있다. 당업자는 이미지 획득 시간이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.250 초를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
FOV 당 이미징 시간: 일부 경우에, 이미징 시간은 시야 당 약 0.5 초 내지 약 3 초 범위일 수 있다. 일부 경우에, 이미징 시간은 FOV 당 적어도 0.5 초, 적어도 1 초, 적어도 1.5 초, 적어도 2 초, 적어도 2.5 초, 또는 적어도 3 초일 수 있다. 일부 경우에, 이미징 시간은 FOV 당 최대 3 초, 최대 2.5 초, 최대 2 초, 최대 1.5 초, 최대 1 초 또는 최대 0.5 초일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에 이미징 시간은 약 1 초 내지 약 2.5 초의 범위일 수 있다. 당업자는 이미징 시간이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 1.85 초를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
필드의 평탄도: 일부 경우에, 시야의 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 100 %에 걸친 이미지들은 각 형광(또는 다른 이미징 모드) 검출 채널에 대한 최상의 초점면에 대해 ± 200 nm, ± 175 nm, ± 150 nm, ± 125 nm, ± 100 nm, ± 75 nm, 또는 ± 50 nm 내에서 획득된다.
게놈학 및 다른 적용 분야를 위한 시스템 및 시스템 구성 요소: 위에서 언급된 바와 같이, 일부 구현에서, 개시된 광학 이미징 모듈은 예를 들어, 게놈학 적용(예를 들어, 유전자 검사 및/또는 핵산 시퀀싱 적용) 또는 다른 화학 분석, 생화학적 분석, 핵산 분석, 세포 분석 또는 조직 분석 적용을 수행하도록 구성된 더 큰 시스템의 모듈, 구성 요소, 서브 조립체 또는 서브 시스템으로 기능할 수 있다. 도 39는 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 시퀀싱 시스템에 대한 블록도의 비-제한적인 예를 제공한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 4 개 초과의 이미징 모듈(이들 각각은 하나 이상의 조명 광학 경로 및/또는 하나 이상의 검출 광학 경로(예를 들어, 특정 파장 범위 내의 형광 방출을 이미지 센서로 이미징하도록 구성된 하나 이상의 검출 채널)를 포함할 수 있음) 외에도, 이러한 시스템은 하나 이상의 X-Y 병진 스테이지, 하나 이상의 X-Y-Z 병진 스테이지, 흐름 셀 또는 카트리지, 유체학 시스템 및 유체 흐름 제어 모듈, 시약 카트리지, 온도 제어 모듈, 유체 분배 로봇, 카트리지 및/또는 마이크로 플레이트 취급(픽 앤 플레이스) 로봇, 차광 하우징 및/또는 환경 제어 챔버, 하나 이상의 프로세서 또는 컴퓨터, 데이터 저장 모듈, 데이터 통신 모듈(예를 들어, 블루투스, WiFi, 인트라넷, 또는 인터넷 통신 하드웨어 및 관련 소프트웨어), 디스플레이 모듈, 하나 이상의 로컬 및/또는 클라우드 기반 소프트웨어 패키지(예를 들어, 기기/시스템 제어 소프트웨어 패키지, 이미지 처리 소프트웨어 패키지, 데이터 분석 소프트웨어 패키지) 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
병진 스테이지: 본 명세서에 개시된 이미징 및 분석 시스템(예를 들어, 핵산 시퀀싱 시스템)의 일부 구현에서, 이 시스템은 예를 들어, 각각이 이미징 모듈의 시야에 해당하는 하나 이상의 이미지를 타일링하여 전체 흐름 셀 표면의 합성 이미지(들)를 재구성하기 위해, 하나 이상의 이미징 모듈에 대해 하나 이상의 샘플 지지 구조(들)(예를 들어, 흐름 셀(들))를 재-위치 결정하기 위한 하나 이상의(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 4 개 초과의) 고 정밀 X-Y(또는 일부 경우에, X-Y-Z) 병진 스테이지(들)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 이미징 시스템 및 게놈 분석 시스템(예를 들어, 핵산 시퀀싱 시스템)의 일부 구현에서, 이 시스템은 예를 들어, 각각이 이미징 모듈의 시야에 해당하는 하나 이상의 이미지를 타일링하여 전체 흐름 셀 표면의 합성 이미지(들)를 재구성하기 위해, 하나 이상의 샘플 지지 구조(들)(예를 들어, 흐름 셀)에 대해 하나 이상의 이미징 모듈을 재-위치 결정하기 위한 하나 이상의(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 4 개 초과의) 고 정밀 X-Y(또는 일부 경우에 X-Y-Z) 병진 스테이지(들)를 포함할 수 있다.
적절한 병진 스테이지는 파커 하니핀(Parker Hannifin)과 같은 다양한 공급업체에서 상업적으로 사용할 수 있다. 정밀 병진 스테이지 시스템은 일반적으로 선형 액추에이터, 광학 인코더, 서보 및/또는 스테퍼 모터, 및 모터 제어기 또는 드라이브 유닛을 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 구성 요소의 조합을 포함한다. 예를 들어, 시약 전달 및 광학 검출의 반복된 단계를 산재시킬 때 예를 들어 형광 신호의 정확하고 재현 가능한 위치 결정 및 이미징을 보장하기 위해 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에 대해 스테이지 이동의 고 정밀 및 반복성이 필요하다.
결과적으로, 본 명세서에 개시된 시스템은 병진 스테이지가 조명 및/또는 이미징 광학 장치에 대해 샘플 지지 구조를 위치시키도록(혹은 그 반대로) 구성되는 정밀도를 지정하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시의 일 양태에서, 하나 이상의 병진 스테이지의 정밀도는 약 0.1 ㎛ 내지 약 10 ㎛이다. 다른 양태에서, 병진 스테이지의 정밀도는 약 10 ㎛ 이하, 약 9 ㎛ 이하, 약 8 ㎛ 이하, 약 7 ㎛ 이하, 약 6 ㎛ 이하, 약 5 ㎛ 이하, 약 4 ㎛ 이하, 약 3 ㎛ 이하, 약 2 ㎛ 이하, 약 1 ㎛ 이하, 약 0.9 ㎛ 이하, 약 0.8 ㎛ 이하, 약 0.7 ㎛ 이하, 약 0.6 ㎛ 이하, 약 0.5 ㎛ 이하, 약 0.4 ㎛ 이하, 약 0.3 ㎛ 이하, 약 0.2 ㎛ 이하, 또는 약 0.1 ㎛ 이하이다. 당업자는, 일부 경우에, 병진 스테이지의 위치 결정 정밀도가 이들 값 중 임의의 2 개의 값에 의해 경계를 이루는 임의의 범위(예를 들어, 약 0.5 ㎛ 내지 약 1.5 ㎛) 내에 속할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 경우에, 병진 스테이지의 위치 결정 정밀도는 이 단락에 포함된 값들의 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 0.12 ㎛를 가질 수 있다.
흐름 셀, 미세 유체 장치, 및 카트리지: 본 명세서에 개시된 흐름 셀 장치 및 흐름 셀 카트리지는 다양한 화학 분석, 생화학적 분석, 핵산 분석, 세포 분석, 또는 조직 분석 적용을 위해 설계된 시스템의 구성 요소들로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 시스템은 개시된 단일 모세관 흐름 셀 장치, 다중 모세관 흐름 셀 장치, 모세관 흐름 셀 카트리지, 및/또는 여기에 설명된 미세 유체 장치 및 카트리지 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 개시된 흐름 셀 장치 및 카트리지에 대한 추가 설명은 PCT 특허 출원 공개 WO 2020/118255에서 발견될 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로 여기에 통합된다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 시스템은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 또는 10 개 초과의 단일 모세관 흐름 셀 장치, 다중 모세관 흐름 셀 장치, 모세관 흐름 셀 카트리지, 및/또는 미세 유체 장치 및 카트리지를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단일 모세관 흐름 셀 장치, 다중 모세관 흐름 셀 장치, 및/또는 미세 유체 장치 및 카트리지는 개시된 시스템의 고정된 구성 요소일 수 있다. 일부 경우에, 단일 모세관 흐름 셀 장치, 다중 모세관 흐름 셀 장치, 및/또는 미세 유체 장치 및 카트리지는 개시된 시스템의 제거 가능하고 교환 가능한 구성 요소일 수 있다. 일부 경우에, 단일 모세관 흐름 셀 장치, 다중 모세관 흐름 셀 장치, 및/또는 미세 유체 장치 및 카트리지는 개시된 시스템의 일회용 또는 소모성 구성 요소일 수 있다.
일부 구현에서, 개시된 단일 모세관 흐름 셀 장치(또는 단일 모세관 흐름 셀 카트리지)는 단일 모세관, 예를 들어 유리 또는 용융 실리카 모세관을 포함하고, 그 루멘은 시약 또는 용액이 흐를 수 있는 유체 흐름 경로를 형성하고, 그 내부 표면은 관심 샘플이 결합되거나 또는 테더링되는 샘플 지지 구조를 형성할 수 있다. 일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 다중 모세관 흐름 셀 장치(또는 다중 모세관 흐름 셀 카트리지)는 검출 방법으로서 이미징을 추가로 포함하는 분석 기술을 수행하도록 구성된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 20 개 초과의 모세관을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 모세관은, 취급 용이성을 용이하게 하고, 외부 유체 연결을 형성하기 위한 어댑터 또는 커넥터를 통합하고, 시약 저장소, 폐기물 저장소, 밸브(예를 들어, 마이크로 밸브), 펌프(예를 들어, 마이크로 펌프) 등, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 추가 통합된 기능을 선택적으로 포함할 수 있는 카트리지를 형성하기 위해 섀시 내에 패키징될 수 있다.
도 29는 외부 유체 흐름 제어 시스템과 편리하고 교환 가능한 유체 연결을 제공하기 위해 표준 OD 유체 튜브와 정합하도록 설계되는 2 개의 유체 어댑터 - 유리 모세관의 피스의 각 단부에 하나씩 부착됨 - 를 포함하는 단일 유리 모세관 흐름 셀 장치의 하나의 비-제한적인 예를 도시한다. 유체 어댑터는 압입, 접착, 접합, 용매 접합, 레이저 용접 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 다양한 기술들 중 임의의 것을 사용하여 모세관에 부착될 수 있다.
일반적으로, 개시된 모세관 흐름 셀 장치 및 모세관 흐름 셀 카트리지에 사용되는 모세관은 모세관의 전체 길이에 걸쳐 진행하는 적어도 하나의 내부 축 방향 정렬된 유체 흐름 채널(또는 "루멘")을 가질 것이다. 일부 경우에, 모세관은 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 5 개 초과의 내부 축 방향 정렬된 유체 흐름 채널(또는 "루멘")을 가질 수 있다.
적합한 모세관(또는 그 루멘)에 대해 지정된 많은 단면 기하학적 구조는 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 둥근 정사각형, 둥근 직사각형, 또는 둥근 삼각형 단면 기하학적 구조를 포함하지만 이에 국한되지 않는 본 명세서의 개시 내용과 일치한다. 일부 경우에, 모세관(또는 그 루멘)은 임의의 지정된 단면 치수 또는 치수 세트를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 모세관 루멘의 최대 단면 치수(예를 들어, 루멘의 형상이 원형인 경우 직경, 또는 루멘의 형상이 정사각형 또는 직사각형인 경우 대각선)는 약 10 ㎛ 내지 약 10 mm 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 모세관 루멘의 최대 단면 치수는 적어도 10 ㎛, 적어도 25 ㎛, 적어도 50 ㎛, 적어도 75 ㎛, 적어도 100 ㎛, 적어도 200 ㎛, 적어도 300 ㎛, 적어도 400 ㎛, 적어도 500 ㎛, 적어도 600 ㎛, 적어도 700 ㎛, 적어도 800 ㎛, 적어도 900 ㎛, 적어도 1 mm, 적어도 2 mm, 적어도 3 mm, 적어도 4 mm, 적어도 5 mm, 적어도 6 mm, 적어도 7 mm, 적어도 8 mm, 적어도 9 mm, 또는 적어도 10 mm일 수 있다. 일부 양태에서, 모세관 루멘의 최대 단면 치수는 최대 10 mm, 최대 9 mm, 최대 8 mm, 최대 7 mm, 최대 6 mm, 최대 5 mm, 최대 4 mm, 최대 3 mm, 최대 2 mm, 최대 1 mm, 최대 900 ㎛, 최대 800 ㎛, 최대 700 ㎛, 최대 600 ㎛, 최대 500 ㎛, 최대 400 ㎛, 최대 300 ㎛, 최대 200 ㎛, 최대 100 ㎛, 최대 75 ㎛, 최대 50 ㎛, 최대 25 ㎛, 최대 10 ㎛일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 모세관 루멘의 최대 단면 치수는 약 100 ㎛ 내지 약 500 ㎛ 범위일 수 있다. 당업자는 모세관 루멘의 최대 단면 치수가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 124 ㎛를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
예를 들어 흐름 셀 장치 또는 카트리지에서 하나 이상의 모세관의 루멘은 정사각형 또는 직사각형 단면을 갖는 일부 경우에, 유체 흐름 채널의 갭 높이 또는 두께를 정의하는 제1 내부 표면(예를 들어, 상단 또는 상부 표면)과 제2 내부 표면(예를 들어, 하단 또는 하부 표면) 사이의 거리는 약 10 ㎛ 내지 약 500 ㎛ 범위일 수 있다. 일부 경우에, 갭 높이는 적어도 10 ㎛, 적어도 20 ㎛, 적어도 30 ㎛, 적어도 40 ㎛, 적어도 50 ㎛, 적어도 60 ㎛, 적어도 70 ㎛, 적어도 80 ㎛, 적어도 90 ㎛, 적어도 100 ㎛, 적어도 125 ㎛, 적어도 150 ㎛, 적어도 175 ㎛, 적어도 200 ㎛, 적어도 225 ㎛, 적어도 250 ㎛, 적어도 275 ㎛, 적어도 300 ㎛, 적어도 325 ㎛, 적어도 350 ㎛, 적어도 375 ㎛, 적어도 400 ㎛, 적어도 425 ㎛, 적어도 450 ㎛, 적어도 475 ㎛, 또는 적어도 500 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 갭 높이는 최대 500 ㎛, 최대 475 ㎛, 최대 450 ㎛, 최대 425 ㎛, 최대 400 ㎛, 최대 375 ㎛, 최대 350 ㎛, 최대 325 ㎛, 최대 300 ㎛, 최대 275 ㎛, 최대 250 ㎛, 최대 225 ㎛, 최대 200 ㎛, 최대 175 ㎛, 최대 150 ㎛, 최대 125 ㎛, 최대 100 ㎛, 최대 90 ㎛, 최대 80 ㎛, 최대 70 ㎛, 최대 60 ㎛, 최대 50 ㎛, 최대 40 ㎛, 최대 30 ㎛, 최대 20 ㎛, 최대 10 ㎛일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어 일부 경우에, 갭 높이는 약 40 ㎛ 내지 약 125 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 갭 높이가 이 단락의 값 범위 내에서 임의의 값, 예를 들어 약 122 ㎛를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 모세관 흐름 셀 장치 또는 흐름 셀 카트리지를 제조하는 데 사용되는 하나 이상의 모세관의 길이는 약 5 mm 내지 약 5 cm 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 모세관의 길이는 5 mm 미만, 적어도 5 mm, 적어도 1 cm, 적어도 1.5 cm, 적어도 2 cm, 적어도 2.5 cm, 적어도 3 cm, 적어도 3.5 cm, 적어도 4 cm, 적어도 4.5 cm, 또는 적어도 5 cm일 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 모세관의 길이는 최대 5 cm, 최대 4.5 cm, 최대 4 cm, 최대 3.5 cm, 최대 3 cm, 최대 2.5 cm, 최대 2 cm, 최대 1.5 cm, 최대 1 cm, 또는 최대 5 mm일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 모세관의 길이는 약 1.5 cm 내지 약 2.5 cm 범위일 수 있다. 당업자는 하나 이상의 모세관의 길이가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 1.85 cm를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 경우에, 장치 또는 카트리지는 길이가 동일한 복수의 2 개 이상의 모세관을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 장치 또는 카트리지는 길이가 다른 복수의 2 개 이상의 모세관을 포함할 수 있다.
개시된 모세관 흐름 셀 장치 또는 모세관 흐름 셀 카트리지를 구성하는 데 사용되는 모세관은 유리(예를 들어, 붕규산 유리, 소다 석회 유리 등), 용융 실리카(석영), 중합체(예를 들어, 폴리스티렌(PS), 거대 다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PmmA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 환상 올레핀 중합체(COP), 환상 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리디메틸실록산(PDMS) 등), 보다 화학적으로 불활성인 대안으로서 폴리에테르이미드(PEI) 및 퍼플루오로엘라스토머(FFKM), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않는 당업자에게 알려진 다양한 재료 중 하나로 제작될 수 있다. PEI는 비용 및 화학적 호환성 측면에서 다소 폴리카보네이트와 PEEK 사이에 있다. FFKM은 또한 칼레즈(Kalrez)라고도 한다.
모세관을 제작하는 데 사용되는 하나 이상의 재료는 종종 광학적으로 투명하여 분광 또는 이미징 기반 검출 기술과 함께 사용되는 것을 용이하게 한다. 일부 경우에, 전체 모세관이 광학적으로 투명할 것이다. 대안적으로, 일부 경우에, 모세관의 일부(예를 들어, 광학적으로 투명한 "창")만이 광학적으로 투명할 것이다.
개시된 모세관 흐름 셀 장치 및 모세관 흐름 셀 카트리지를 구성하는 데 사용되는 모세관은 당업자에게 공지된 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있고, 여기서 제조 기술의 선택은 종종 사용된 재료의 선택에 따라 달라지며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 적합한 모세관 제조 기술의 예는 압출, 드로잉, 정밀 컴퓨터 수치 제어(CNC) 기계 가공 및 보링, 레이저 포토 어블레이션(laser photoablation) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현에서, 개시된 모세관 흐름 셀 장치 및 카트리지에 사용된 모세관은 기성품으로 상업적으로 입수 가능한 제품일 수 있다. 정밀 모세관 튜빙을 제공하는 상업적 공급업체의 예는 Accu-Glass(미주리주 세인트루이스; 정밀 유리 모세관 튜빙), Polymicro Technologies(애리조나주 피닉스; 정밀 유리 및 용융 실리카 모세관 튜빙), Friedrich & Dimmock, Inc.(뉴저지주, 밀빌; 맞춤형 정밀 유리 모세관 튜빙), 및 Drummond Scientific(펜실베이니아주, 브루몰; OEM 유리 및 플라스틱 모세관 튜빙)을 포함한다.
본 명세서에 개시된 모세관 흐름 셀 장치 및 카트리지의 모세관에 부착되는 유체 어댑터, 및 모세관 흐름 셀 장치 또는 카트리지의 다른 구성 요소는, 다양한 적절한 기술(예를 들어, 압출 성형, 사출 성형, 압축 성형, 정밀 CNC 기계 가공 등) 및 재료(예를 들어, 유리, 용융 실리카, 세라믹, 금속, 폴리디메틸실록산, 폴리스티렌(PS), 거대 다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PmmA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 환상 올레핀 중합체(COP), 환상 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 등)를 사용하여 제작될 수 있고, 여기서 다시 제조 기술의 선택은 종종 사용된 재료의 선택에 따라 달라지며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
도 30은 2 개의 유리 모세관, 유체 어댑터(이 예에서는 모세관 당 2 개), 및 모세관이 카트리지에 대해 고정된 배향으로 유지되도록 모세관 및/또는 유체 어댑터와 정합하는 카트리지 섀시를 포함하는 모세관 흐름 셀 카트리지의 비-제한적인 예를 제공한다. 일부 경우에, 유체 어댑터는 카트리지 섀시와 통합될 수 있다. 일부 경우에, 카트리지는 모세관 및/또는 모세관 유체 어댑터와 정합되는 추가 어댑터를 포함할 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 일부 경우에, 카트리지는 추가 기능 구성 요소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 모세관은 카트리지에 영구적으로 장착된다. 일부 경우에, 카트리지 섀시는 흐름 셀 카트리지의 하나 이상의 모세관이 교환 가능하게 제거 및 교체될 수 있도록 설계된다. 예를 들어, 일부 경우에, 카트리지 섀시는 하나 이상의 모세관이 제거 및 교체될 수 있도록 개방될 수 있게 하는 힌지형 "클램쉘(clamshell)" 구성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 카트리지 섀시는 예를 들어 형광 현미경의 스테이지 상에 또는 본 개시의 형광 이미징 모듈 또는 기구 시스템의 카트리지 홀더 내에 장착되도록 구성된다.
일부 경우에, 개시된 흐름 셀 장치는 미세 유체 장치(또는 "미세 유체 칩") 및 카트리지를 포함할 수 있으며, 여기서 미세 유체 장치는 적합한 재료의 하나 이상의 층에 유체 채널을 형성함으로써 제조되고, 검출 방법으로서 이미징을 추가로 포함하는 분석 기술을 수행하도록 구성된 하나 이상의 유체 채널(예를 들어, "분석" 채널)을 포함한다. 일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 미세 유체 장치 또는 카트리지는 검출 방법으로서 이미징을 추가로 포함하는 분석 기술을 수행하도록 구성된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 또는 20 개 초과의 유체 채널(예를 들어, "분석" 유체 채널)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 미세 유체 장치는 통합된 "랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)" 기능을 장치 내에 제공하기 위해 (예를 들어, 시약의 희석 또는 혼합을 위한) 추가 유체 채널, 시약 저장소, 폐기물 저장소, 외부 유체 연결을 형성하기 위한 어댑터 등을 추가로 포함할 수 있다.
미세 유체 흐름 셀 카트리지의 비-제한적인 예는 칩 상에 형성된 2 개 이상의 평행한 유리 채널을 갖는 칩, 칩에 커플링된 유체 어댑터, 및 칩이 카트리지에 대해 고정된 배향으로 위치되도록 칩 및/또는 유체 어댑터와 정합되는 카트리지 섀시를 포함한다. 일부 경우에, 유체 어댑터는 카트리지 섀시와 통합될 수 있다. 일부 경우에, 카트리지는 칩 및/또는 유체 어댑터와 정합되는 추가 어댑터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 칩은 카트리지에 영구적으로 장착된다. 일부 경우에, 카트리지 섀시는 흐름 셀 카트리지의 하나 이상의 칩이 교환 가능하게 제거 및 교체될 수 있도록 설계된다. 예를 들어, 일부 경우에, 카트리지 섀시는 하나 이상의 칩이 제거 및 교체될 수 있도록 개방될 수 있게 하는 힌지형 "클램쉘" 구성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 카트리지 섀시는 예를 들어 현미경 시스템의 스테이지 상에 또는 이미징 시스템의 카트리지 홀더 내에 장착되도록 구성된다. 비-제한적인 예에서는 단지 하나의 칩만이 설명되지만, 하나 초과의 칩이 미세 유체 흐름 셀 카트리지에 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 개시의 흐름 셀 카트리지는 단일 미세 유체 칩 또는 복수의 미세 유체 칩을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시의 흐름 셀 카트리지는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 또는 20 개 초과의 미세 유체 칩을 포함할 수 있다. 카트리지 내의 하나 이상의 미세 유체 장치의 패키징은 광학 이미징 시스템 내에서 장치의 취급 용이성 및 정확한 위치 결정을 용이하게 할 수 있다.
개시된 미세 유체 장치 및 카트리지 내의 유체 채널은 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 둥근 정사각형, 둥근 직사각형, 또는 둥근 삼각형 단면을 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 단면 기하학적 구조를 가질 수 있다. 일부 경우에, 유체 채널은 임의의 지정된 단면 치수 또는 치수 세트를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 유체 채널의 높이(예를 들어, 갭 높이), 폭, 또는 최대 단면 치수(예를 들어, 유체 채널이 정사각형, 둥근 정사각형, 직사각형, 또는 둥근 직사각형 단면을 갖는 경우 대각선)는 약 10 ㎛ 내지 약 10 mm의 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 유체 채널의 높이(예를 들어, 갭 높이), 폭, 또는 최대 단면 치수는 적어도 10 ㎛, 적어도 25 ㎛, 적어도 50 ㎛, 적어도 75 ㎛, 적어도 100 ㎛, 적어도 200 ㎛, 적어도 300 ㎛, 적어도 400 ㎛, 적어도 500 ㎛, 적어도 600 ㎛, 적어도 700 ㎛, 적어도 800 ㎛, 적어도 900 ㎛, 적어도 1 mm, 적어도 2 mm, 적어도 3 mm, 적어도 4 mm, 적어도 5 mm, 적어도 6 mm, 적어도 7 mm, 적어도 8 mm, 적어도 9 mm, 또는 적어도 10 mm일 수 있다. 일부 양태에서, 유체 채널의 높이(예를 들어, 갭 높이), 폭, 또는 최대 단면 치수는 최대 10 mm, 최대 9 mm, 최대 8 mm, 최대 7 mm, 최대 6 mm, 최대 5 mm, 최대 4 mm, 최대 3 mm, 최대 2 mm, 최대 1 mm, 최대 900 ㎛, 최대 800 ㎛, 최대 700 ㎛, 최대 600 ㎛, 최대 500 ㎛, 최대 400 ㎛, 최대 300 ㎛, 최대 200 ㎛, 최대 100 ㎛, 최대 75 ㎛, 최대 50 ㎛, 최대 25 ㎛, 최대 10 ㎛일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 유체 채널의 높이(예를 들어, 갭 높이), 폭, 또는 최대 단면 치수는 약 20 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 범위일 수 있다. 당업자는 유체 채널의 높이(예를 들어, 갭 높이), 폭, 또는 최대 단면 치수가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 122 ㎛를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 미세 유체 장치 및 카트리지의 유체 채널의 길이는 약 5 mm 내지 약 10 cm 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 유체 채널의 길이는 5 mm 미만, 적어도 5 mm, 적어도 1 cm, 적어도 1.5 cm, 적어도 2 cm, 적어도 2.5 cm, 적어도 3 cm, 적어도 3.5 cm, 적어도 4 cm, 적어도 4.5 cm, 적어도 5 cm, 적어도 6 cm, 적어도 7 cm, 적어도 8 cm, 적어도 9 cm, 또는 적어도 10 cm일 수 있다. 일부 경우에, 유체 채널의 길이는 최대 10 cm, 최대 9 cm, 최대 8 cm, 최대 7 cm, 최대 6 cm, 최대 5 cm, 최대 4.5 cm, 최대 4 cm, 최대 3.5 cm, 최대 3 cm, 최대 2.5 cm, 최대 2 cm, 최대 1.5 cm, 최대 1 cm, 또는 최대 5 mm일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 유체 채널의 길이는 약 1.5 cm 내지 약 2.5 cm일 수 있다. 당업자는 유체 채널의 길이가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 1.35 cm를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 경우에, 미세 유체 장치 또는 카트리지는 길이가 동일한 복수의 유체 채널을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 장치 또는 카트리지는 길이가 다른 복수의 유체 채널을 포함할 수 있다.
개시된 미세 유체 장치는 내부에 형성된 하나 이상의 유체 채널을 갖는 적어도 하나의 재료 층을 포함할 것이다. 일부 경우에, 미세 유체 칩은 하나 이상의 유체 채널을 형성하기 위해 함께 접합된 2 개의 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 칩은 하나 이상의 유체 채널을 형성하기 위해 함께 접합된 3 개 이상의 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 유체 채널은 개방된 상단을 가질 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 유체 채널은 예를 들어 하단 층의 상단 표면과 같은 하나의 층 내에서 제조될 수 있고, 하단 층의 상단 표면을 재료의 상단 층의 하단 표면에 접합함으로써 밀봉될 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 채널은 예를 들어, 그 깊이가 층의 전체 두께를 통해 연장되고 그런 다음 유체 채널을 밀봉하기 위해 2 개의 패터닝되지 않은 층 사이에 끼워지고 이들 2 개의 패터닝되지 않은 층에 접합된 패터닝된 채널로서, 하나의 층 내에서 제작될 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 채널은 기판의 표면 상의 희생 층을 제거하여 제작된다. 이 방법은 에칭 제거를 위해 벌크 기판(예를 들어, 유리 또는 실리콘 웨이퍼)을 필요로 하지 않는다. 그 대신에, 유체 채널은 기판의 표면 상에 위치된다. 일부 경우에, 미세 유체 채널은 기판 내에 또는 기판의 표면 상에 제작된 다음, 기판의 표면에 컨포멀 필름 또는 층의 침착에 의해 밀봉되어, 칩의 표면 아래의 또는 매립된 유체 채널을 생성할 수 있다.
미세 유체 칩은 미세 제조 공정의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 장치가 미세 제조되기 때문에, 기판 재료는 일반적으로 예를 들어 포토리소그래피, 습식 화학 에칭, 레이저 어블레이션(laser ablation), 레이저 조사(laser irradiation), 공기 연마 기술, 사출 성형, 엠보싱, 및 다른 기술과 같은 알려진 미세 제조 기술과의 호환성을 기반으로 선택된다. 기판 재료는 또한 일반적으로 극단적인 pH, 온도, 염 농도, 및 전자기(예를 들어, 광) 또는 전기장의 인가를 포함하여, 미세 유체 장치가 노출될 수 있는 전체 범위의 조건과의 호환성을 위해 선택된다.
개시된 미세 유체 칩은 유리(예를 들어, 붕규산 유리, 소다 석회 유리 등), 용융 실리카(석영), 실리콘, 중합체(예를 들어, 폴리스티렌(PS), 거대 다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PmmA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 환상 올레핀 중합체(COP), 환상 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리디메틸실록산(PDMS) 등), 폴리에테르이미드(PEI) 및 퍼플루오로엘라스토머(FFKM)(보다 화학적으로 불활성인 대안으로서), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않는 당업자에게 공지된 다양한 재료들 중 임의의 것으로 제조될 수 있다. 일부 바람직한 경우에, 기판 재료(들)는 붕규산 유리 및 석영뿐만 아니라 다른 기판 재료와 같은 실리카 기반 기판을 포함할 수 있다.
개시된 미세 유체 장치는 당업자에게 공지된 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 제조 기술의 선택은 종종 사용되는 재료의 선택에 따라 달라지고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 칩의 미세 유체 채널은 기판의 표면에 미세 구조 또는 미세 패턴을 형성하는 데 적합한 기술을 사용하여 구성될 수 있다. 일부 경우에, 유체 채널은 레이저 조사에 의해 형성된다. 일부 경우에, 미세 유체 채널은 포커싱된 펨토초 레이저 방사선에 의해 형성된다. 일부 경우에, 미세 유체 채널은 화학적 에칭, 플라즈마 에칭, 또는 깊은 반응성 이온 에칭을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포토리소그래피 및 에칭에 의해 형성된다. 일부 경우에, 미세 유체 채널은 레이저 에칭을 사용하여 형성된다. 일부 경우에, 미세 유체 채널은 직접 쓰기 리소그래피 기술(direct-write lithography technique)을 사용하여 형성된다. 직접 쓰기 리소그래피의 예에는 전자빔 직접 쓰기 및 포커싱된 이온 빔 밀링이 포함된다.
추가적인 바람직한 경우에, 기판 재료(들)는 중합체 재료, 예를 들어 플라스틱, 예를 들어 폴리메틸메타크릴레이트(PmmA), 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌(TEFLON™), 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리설폰 등을 포함할 수 있다. 이러한 중합체 기판은 상기 설명된 것들과 같은 이용 가능한 미세 제조 기술을 사용하여 용이하게 패터닝되거나 또는 미세 기계 가공될 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 칩은 사출 성형, 엠보싱, 스탬핑과 같은 잘 알려진 성형 기술을 사용하거나, 또는 몰드 내에서 중합체 전구체 재료를 중합함으로써, 중합체 재료, 예를 들어 미세 제조된 마스터(masters)로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,512,131 참조). 일부 경우에, 이러한 중합체 기판 재료는 제조 용이성, 저렴한 비용, 및 처분 가능성, 뿐만 아니라 가장 극한의 반응 조건에 대한 일반적인 불활성으로 인해 바람직하다. 예를 들어 유리와 같은 다른 재료로 제작된 흐름 셀 장치와 마찬가지로, 이들 중합체 재료로부터 제조된 흐름 셀 장치는 처리된 표면, 예를 들어, 유도된 또는 코팅된 표면을 포함하여, 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 미세 유체 시스템에서의 유용성을 향상시킬 수 있다.
미세 유체 장치의 유체 채널 및/또는 유체 챔버는 일반적으로 전술한 미세 제조 기술을 사용하여 미세 규모 채널(예를 들어, 홈, 만입부 등)로서 제1 기판의 상부 표면으로 제조된다. 제1 기판은 제1 평면 표면을 갖는 상단 측면 및 하단 측면을 포함한다. 본 명세서에 설명된 방법에 따라 제조된 미세 유체 장치에서, 복수의 유체 채널(예를 들어, 홈 및/또는 만입부)은 제1 평면 표면 상에 형성된다. 일부 경우에, (제2 기판에 접합하기 전에) 제1 평면 표면에 형성된 유체 채널(예를 들어, 홈 및/또는 만입부)은 하단 벽 및 측벽을 가지며, 상단은 개방된 상태로 유지된다. 일부 경우에, (제2 기판에 접합하기 전에) 제1 평면 표면에 형성된 유체 채널(예를 들어, 홈 및/또는 만입부)은 하단 벽 및 측벽을 가지며, 상단은 폐쇄된 상태로 유지된다. 일부 경우에, (제2 기판에 접합하기 전에) 제1 평면 표면에 형성된 유체 채널(예를 들어, 홈 및/또는 만입부)은 측벽만을 가지며, 상단 또는 하단 표면은 없다(즉, 유체 채널은 제1 기판의 전체 두께에 걸쳐 있다).
유체 채널 및 챔버는 장치의 채널 및/또는 챔버(예를 들어, 내부 부분)를 이들 2 개의 구성 요소의 인터페이스에서 형성하기 위해 제1 기판의 제1 평면 표면을 제2 기판의 평면 표면과 접촉하여 배치시켜 접합함으로써 밀봉될 수 있다. 일부 경우에, 제1 기판이 제2 기판에 접합된 후, 구조는 추가로 제3 기판과 접촉하여 배치되고 접합될 수 있다. 일부 경우에, 제3 기판은 제2 기판과 접촉하지 않는 제1 기판의 측면과 접촉하여 배치될 수 있다. 일부 경우에, 제1 기판은 제2 기판과 제3 기판 사이에 배치된다. 일부 경우에, 제2 기판 및 제3 기판은 제1 기판 상에 형성된 홈, 만입부, 또는 애퍼처를 덮고 및/또는 밀봉하여, 이러한 구성 요소의 인터페이스에서 장치의 채널 및/또는 챔버(예를 들어, 내부 부분)를 형성할 수 있다.
장치는 장치의 내부 부분에 형성된 유체 채널 및/또는 유체 챔버 중 적어도 하나와 유체 연통하여, 이에 따라 유체 입구 및/또는 유체 출구를 형성하도록 배향된 개구를 가질 수 있다. 일부 경우에, 개구는 제1 기판 상에 형성된다. 일부 경우에, 개구는 제1 및 제2 기판 상에 형성된다. 일부 경우에, 개구는 제1, 제2 및 제3 기판 상에 형성된다. 일부 경우에, 개구는 장치의 상단 측면에 위치된다. 일부 경우에, 개구는 장치의 하단 측면에 위치된다. 일부 경우에, 개구는 장치의 제1 및/또는 제2 단부에 위치되고, 채널은 제1 단부로부터 제2 단부로의 방향을 따라 이어진다.
기판들이 함께 접합될 수 있는 조건은 일반적으로 당업자에 의해 널리 이해되고, 기판의 이러한 접합은 일반적으로 임의의 다양한 방법에 의해 수행되며, 이에 대한 선택은 사용되는 기판 재료의 특성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 기판들의 열 결합은 예를 들어 유리 또는 실리카 기반 기판뿐만 아니라, 일부 중합체 기반 기판을 포함하는 다수의 기판 재료에 적용될 수 있다. 이러한 열 접합 기술은 일반적으로 상승된 온도의 조건 및, 일부 경우에는, 외부 압력의 인가 조건에서 접합되는 기판 표면을 정합시키는 것을 포함한다. 사용되는 정확한 온도 및 압력은 일반적으로 사용되는 기판 재료의 특성에 따라 달라질 것이다.
예를 들어, 유리(붕규산 유리, Pyrex™, 소다 석회 유리 등), 용융 실리카(석영) 등과 같은 실리카 기반 기판 재료의 경우, 기판의 열 접합은 일반적으로 약 500 ℃ 내지 약 1400 ℃, 바람직하게는 약 500 ℃ 내지 약 1200 ℃ 범위의 온도에서 수행된다. 예를 들어, 소다 석회 유리는 일반적으로 약 550 ℃의 온도에서 접합되는 반면, 붕규산 유리는 일반적으로 800 ℃ 또는 그 근처에서 열 접합된다. 반면에, 석영 기판은 일반적으로 1200 ℃ 또는 그 근처의 온도에서 열 결합된다. 이러한 접합 온도는 일반적으로 접합될 기판들을 고온 어닐링 오븐 내로 배치함으로써 달성된다.
반면에, 열적으로 결합되는 중합체 기판들은 기판의 과도한 용융 및/또는 뒤틀림, 예를 들어, 장치의 내부 부분(즉, 유체 채널 또는 챔버)의 평탄화를 방지하기 위해 일반적으로 실리카 기반 기판보다 더 낮은 온도 및/또는 압력을 사용한다. 일반적으로, 중합체 기판을 접합하기 위한 이러한 상승된 온도는 사용된 중합체 재료에 따라 약 80 ℃ 내지 약 200 ℃로 변할 것이고, 바람직하게는 약 90 ℃ 내지 약 150 ℃ 일 것이다. 중합체 기판을 접합하는 데 필요한 상당히 감소된 온도 때문에, 이러한 접합은 일반적으로 실리카 기반 기판의 접합에 사용되는 고온 오븐에 대한 필요 없이 수행될 수 있다. 이는 아래에서 더 자세히 설명되는 바와 같이 단일 통합 접합 시스템 내에서 열원의 통합을 허용한다.
접착제는 또한 일반적으로 접합될 기판들 사이에 접착제 층을 도포하고 접착제가 굳을 때까지 함께 가압하는 단계를 포함하는 공지된 방법에 따라 기판들을 함께 접합하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 UV 경화성 접착제를 포함하여, 다양한 접착제가 이러한 방법에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합체 부품의 음향 또는 초음파 용접 및/또는 용매 용접을 포함하는 대안적인 방법들이 또한 본 발명에 따라 기판들을 함께 접합하기 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, 설명된 다수의 미세 유체 칩 또는 장치는 예를 들어 "웨이퍼 스케일" 제조를 사용하여 동시에 제조될 것이다. 예를 들어, 중합체 기판은 큰 분리 가능한 시트로 스탬핑되거나 또는 성형될 수 있으며, 이는 그 후 함께 정합되고 접합될 수 있다. 그런 다음, 개별 장치 또는 접합된 기판은 절단 또는 다이싱(dicing)에 의해 더 큰 시트로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 실리카 기반 기판의 경우, 더 큰 기판 웨이퍼 또는 플레이트로부터 개별 장치가 제작될 수 있으므로, 제조 공정의 처리량이 더 높아질 수 있다. 구체적으로, 복수의 유체 채널 구조는 제1 기판 웨이퍼 또는 플레이트 상에 제조될 수 있고, 그 다음 이것은 제2 기판 웨이퍼 또는 플레이트와 오버레이되어 접합되며, 선택적으로 제3 기판 웨이퍼 또는 플레이트와 추가로 오버레이되어 접합된다. 그런 다음, 개별 장치는 톱질, 스크라이빙(scribing) 및 브레이킹(breaking) 등과 같은 알려진 방법을 사용하여 더 큰 기판으로부터 분할된다.
위에서 언급한 바와 같이, 상단 또는 제2 기판은 다양한 채널 및 챔버를 밀봉하기 위해 하단 또는 제1 기판 상에 오버레이된다. 본 개시의 방법에 따른 접합 공정을 수행함에 있어서, 제1 및 제2 기판의 접합은 진공 및/또는 압력을 사용하여 수행되어 2 개의 기판 표면이 최적의 접촉을 유지하도록 할 수 있다. 특히, 하단 기판은, 예를 들어 하단 기판의 평면 표면을 상단 기판의 평면 표면과 정합시키고 상단 기판을 통해 배치된 진공 관통 구멍을 적용함으로써 상단 기판과 최적의 접촉으로 유지될 수 있다. 일반적으로, 상단 기판의 구멍에 진공을 적용하는 것은, 일반적으로 장착 테이블 또는 표면을 포함하고 통합된 진공 소스를 갖는 진공 척(vacuum chuck) 상에 상단 기판을 배치함으로써 수행된다. 실리카 기반 기판의 경우, 접합된 기판은 초기 접합을 생성하기 위해 상승된 온도에 노출되어, 접합된 기판은 그 후 서로에 대한 임의의 시프팅 없이 어닐링 오븐으로 이송될 수 있다.
본 명세서에 설명된 장치와 통합하기 위한 대안적인 접합 시스템은, 예를 들어, 기판의 2 개의 평면 표면 사이에 접착제 층을 도포하기 위한 접착제 분배 시스템을 포함한다. 이것은 기판들을 정합하기 전에 접착제 층을 도포함으로써, 또는 인접한 기판의 하나의 에지에 일정량의 접착제를 배치하고 2 개의 정합되는 기판의 위킹(wicking) 작용을 허용하여 2 개의 기판 사이의 공간을 가로질러 접착제를 드로잉함으로써 수행될 수 있다.
특정 경우에, 전체 접합 시스템은 상단 및 하단 기판을 장착 표면 상에 배치하고 이들을 후속 접합을 위해 정렬하기 위한 자동화 가능한 시스템을 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 시스템은 서로에 대해 장착 표면 또는 상단 및 하단 기판 중 하나 이상을 이동시키기 위한 병진 시스템을 포함한다. 예를 들어, 로봇 시스템은 각각의 상단 및 하단 기판을 들어 올리고, 병진시키고, 장착 테이블 상에 그리고 정렬 구조 내에 차례로 배치하는 데 사용될 수 있다. 접합 공정에 이어, 이러한 시스템은 또한 장착 표면으로부터 완성된 생성물을 제거하고, 접합을 위해 추가 기판을 그 위에 배치하기 전에, 이러한 정합된 기판을 후속 작업, 예를 들어 분리 또는 다이싱 작업, 실리카 기반 기판을 위한 어닐링 오븐 등과 같은 후속 작업으로 이송할 수 있다.
일부 경우에, 미세 유체 칩의 제조는 칩을 생산하기 위해 2 개 이상의 기판 층, 예를 들어 패터닝된 중합체 시트 및 비-패터닝된 중합체 시트의 적층 또는 라미네이팅을 포함한다. 예를 들어, 미세 유체 장치에서, 장치의 미세 유체 특징부는 일반적으로 레이저 조사, 에칭, 또는 달리 제1 층의 표면에 특징부를 제조함으로써 생성된다. 그런 다음, 제2 층이 제1 층의 표면에 라미네이팅되거나 또는 접합되어, 이러한 특징부를 밀봉하고 장치의 유체 요소, 예를 들어, 유체 채널을 제공한다.
위에서 언급된 바와 같이, 일부 경우에, 하나 이상의 모세관 흐름 셀 장치 또는 미세 유체 칩이 카트리지 섀시에 장착되어 모세관 흐름 셀 카트리지 또는 미세 유체 카트리지를 형성할 수 있다. 일부 경우에, 모세관 흐름 셀 카트리지 또는 미세 유체 카트리지는 특정 적용 분야에 향상된 성능을 제공하기 위해 카트리지와 통합되는 추가 구성 요소를 추가로 포함할 수 있다. 카트리지에 통합될 수 있는 추가 구성 요소의 예에는, 시스템의 다른 구성 요소에 유체 연결을 형성하기 위한 어댑터 또는 커넥터, 유체 흐름 제어 구성 요소(예를 들어, 미니어처 밸브, 미니어처 펌프, 혼합 매니폴드 등), 온도 제어 구성 요소(예를 들어, 저항 가열 요소, 열원 또는 싱크로서 역할을 하는 금속 플레이트, 가열 또는 냉각을 위한 압전 (펠티에(Peltier)) 장치, 온도 센서), 또는 광학 구성 요소(예를 들어, 광학 렌즈, 창, 필터, 미러, 프리즘, 광섬유, 및/또는 하나 이상의 모세관 또는 유체 흐름 채널의 분광 측정 및/또는 이미징을 용이하게 하기 위해 집합적으로 사용될 수 있는 발광 다이오드(LED) 또는 다른 미니어처 광원이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
유체 어댑터, 카트리지 섀시, 및 다른 카트리지 구성 요소는 압입, 접착 접합, 용매 접합, 레이저 용접 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 모세관, 모세관 흐름 셀 장치(들), 미세 유체 칩(들)(또는 칩 내의 유체 채널)에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 칩의 미세 유체 채널의 입구(들) 및/또는 출구(들)는 칩의 상단 표면에 있는 애퍼처이고, 유체 어댑터는 칩 내의 미세 유체 채널의 입구(들) 및/또는 출구(들)에 부착되거나 또는 커플링될 수 있다. 일부 경우에, 카트리지는 칩 및/또는 유체 어댑터와 정합되고 카트리지 내에 칩을 위치시키는 데 도움이 되는 (즉, 유체 어댑터에 추가하여) 추가 어댑터를 포함할 수 있다. 이러한 어댑터는 유체 어댑터에 대해 위에서 설명한 것들과 동일한 제조 기술 및 재료를 사용하여 구성될 수 있다.
카트리지 섀시(또는 "하우징")는 알루미늄, 양극 산화 처리된 알루미늄, 폴리카보네이트(PC), 아크릴(PmmA), 또는 Ultem(PEI)과 같은 금속 및/또는 중합체 재료로 제작될 수 있고, 다른 재료도 본 개시에 또한 부합된다. 하우징은 CNC 기계 가공 및/또는 성형 기술을 사용하여 제작될 수 있으며, 하나, 2 개 또는 2 개 초과의 모세관 또는 미세 유체 칩이 섀시에 의해 고정된 배향으로 구속되어 하나 이상의 독립적인 흐름 채널을 생성하도록 설계될 수 있다. 모세관 또는 칩은 예를 들어 압축 맞춤 설계를 사용하거나, 또는 실리콘 또는 플루오로엘라스토머로 이루어진 압축성 어댑터와 정합됨으로써 섀시에 장착될 수 있다. 일부 경우에, 카트리지 섀시의 2 개 이상의 구성 요소(예를 들어, 상반부 및 하반부)는 예를 들어 나사, 클립, 클램프, 또는 다른 패스너를 사용하여 조립되어 2 개의 반부가 분리될 수 있다. 일부 경우에, 카트리지 섀시의 2 개 이상의 구성 요소는 예를 들어 접착제, 용매 접합, 또는 레이저 용접을 사용하여 조립되어 2 개 이상의 구성 요소가 영구적으로 부착된다.
흐름 셀 표면 코팅: 일부 경우에, 개시된 흐름 셀 장치의 모세관 루멘 또는 미세 유체 채널의 하나 이상의 내부 표면은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 표면 변형 기술 또는 중합체 코팅을 사용하여 코팅될 수 있다. 일부 경우에, 코팅은 하나 이상의 내부 표면에서 이용 가능한 결합 부위(예를 들어, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머 시퀀스)의 개수를 증가시키거나 또는 최대화하도록 제형화될 수 있어 전경 신호, 예를 들어 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머 시퀀스에 혼성화된 라벨링된 핵산 분자로부터 발생하는 형광 신호를 증가시키거나 또는 최대화할 수 있다. 일부 경우에, 코팅은 형광단 및 다른 소 분자, 또는 라벨링된 또는 라벨링되지 않은 뉴클레오티드, 단백질, 효소, 항체, 올리고뉴클레오티드, 또는 핵산 분자(예를 들어, DNA, RNA 등)의 비-특이적 결합을 감소시키거나 또는 최소화하도록 제형화될 수 있어, 배경 신호, 예를 들어 라벨링된 생체 분자의 비-특이적 결합 또는 샘플 지지 구조의 자가 형광에서 발생하는 배경 형광을 감소시키거나 또는 최소화할 수 있다. 일부 경우에 개시된 코팅의 사용을 통해 달성될 수 있는 증가된 전경 신호 및 감소된 배경 신호의 조합은 이에 따라 분광 측정에서 개선된 신호 대 잡음비(SNR)를 제공하거나 또는 이미징 방법에서 개선된 CNR(대조 대 잡음비)을 제공할 수 있다.
아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 개선된 혼성화 및/또는 증폭 프로토콜과 조합되어 선택적으로 사용되는 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치는 다음을 나타내는 고체상 바이오 어세이 반응을 생성한다: (i) 무시할 수 있는 단백질 및 다른 반응 성분의 비-특이적 결합(따라서 기판 배경을 감소시키거나 또는 최소화함), (ii) 무시할 수 있는 비-특이적 핵산 증폭 생성물, 및 (iii) 튜닝 가능한 핵산 증폭 반응의 제공. 본 명세서에서 주로 핵산 혼성화, 증폭, 및 시퀀싱 어세이의 맥락에서 설명되지만, 개시된 저 결합 지지체는 샌드위치 면역 분석(sandwich immunoassays), 효소 결합 면역 흡착 어세이(ELISA) 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 다양한 다른 바이오 어세이 형식으로 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
바람직한 양태에서, 코팅 재료의 하나 이상의 층이 내부 흐름 셀 장치 표면에 도포될 수 있으며, 여기서 층의 개수 및/또는 각 층의 재료 조성은 미국 특허 출원 번호 16/363,842에 명시된 바와 같이 내부 흐름 셀 장치 표면의 하나 이상의 표면 특성을 조정하도록 선택된다. 조정될 수 있는 표면 특성의 예에는 표면 친수성/소수성, 전체 코팅 두께, 화학적 반응성 작용기의 표면 밀도, 그래프팅된 링커 분자(grafted linker molecules) 또는 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머의 표면 밀도 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 바람직한 적용에서, 모세관 또는 채널 루멘의 하나 이상의 표면 특성은 예를 들어 (i) 고체상 핵산 증폭 및/또는 시퀀싱 적용을 포함하는 화학적 또는 생물학적 분석 적용의 단백질, 올리고뉴클레오티드, 형광단, 및 다른 분자 성분의 매우 낮은 비-특이적 결합을 제공하도록, (ii) 개선된 고체상 핵산 혼성화 특이성 및 효율성을 제공하도록, 그리고 (iii) 개선된 고체상 핵산 증폭 속도, 특이성, 및 효율성을 제공하도록 조정된다.
실란, 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 다른 단량체 또는 중합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 다양한 분자들 중 임의의 것은 내부 흐름 셀 장치 표면에 하나 이상의 화학적으로 개질된 층을 생성하는 데 사용될 수 있고, 여기서 사용되는 성분의 선택은 지지 표면의 하나 이상의 특성, 예를 들어 작용기 및/또는 테더링된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도, 지지 표면의 친수성/소수성, 또는 지지 표면의 3 차원 특성(즉, "두께")을 변경하기 위해 다양할 수 있다.
화학적으로 개질된 제1 층을 흐름 셀의 내부 표면(모세관 또는 채널)에 그래프팅하는 데 사용되는 부착 화학 물질은 일반적으로 흐름 셀 장치가 제조되는 재료 및 층의 화학적 특성에 따라 달라진다. 일부 경우에, 제1 층은 내부 흐름 셀 장치 표면에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 경우에, 제1 층은 비-공유적으로 부착될 수 있는데, 예를 들어 정전기 상호 작용, 수소 결합, 또는 표면과 제1 층의 분자 성분 사이의 반 데르 발스 상호 작용(van der Waals interactions)과 같은 비-공유 상호 작용을 통해 표면에 흡착될 수 있다. 어느 경우든, 기판 표면은 제1 층의 부착 또는 침착 전에 처리될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 다양한 표면 준비 기술을 사용하여 지지 표면을 세척하거나 또는 처리할 수 있다. 예를 들어, 유리 또는 실리콘 표면은 피라냐 용액(Piranha solution)(황산(H2SO4)과 과산화수소(H2O2)의 혼합물)을 사용하여 산 세척되고 및/또는 산소 플라즈마 처리 방법을 사용하여 세척될 수 있다.
실란의 화학적 성질은, 이 경우 링커 분자(예를 들어, C6, C12, C18 탄화수소 또는 선형 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자와 같은 다양한 길이의 선형 탄화수소 분자) 또는 층 분자(예를 들어, 분지형 PEG 분자 또는 다른 중합체)를 표면에 커플링하는 데 사용될 수 있는 더 많은 반응성 작용기(예를 들어, 아민 또는 카르복실기)를 부착하기 위해 유리 또는 실리콘 표면의 실라놀기(silanol groups)를 공유적으로 변형하기 위한 하나의 비-제한적인 접근 방식을 구성한다. 개시된 저 결합 지지 표면 중 임의의 것을 생성하는 데 사용될 수 있는 적합한 실란의 예는 (3-아미노프로필)트리메톡시실란(APTMS), (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES), 다양한 PEG-실란 중 임의의 것(예를 들어, 1K, 2K, 5K, 10K, 20K 등의 분자량을 포함함), 아미노-PEG 실란(즉, 유리 아미노 작용기를 포함함), 말레이미드-PEG 실란, 비오틴-PEG 실란 등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
개시된 지지 표면 중 임의의 것에서 낮은 비-특이적 결합 재료의 하나 이상의 층을 생성하는 데 사용될 수 있는 바람직한 중합체의 예는, 다양한 분자량 및 분지 구조의 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 스트렙타비딘, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 덱스트란, 폴리-리신, 및 폴리-리신 공중합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 하나 이상의 재료 층(예를 들어, 중합체 층)을 지지 표면에 그래프팅하고 및/또는 층을 서로 교차 연결하는 데 사용할 수 있는 콘쥬게이션 화학의 예는, 비오틴-스트렙타비딘 상호 작용(또는 그 변형), His 태그 - Ni/NTA 콘쥬게이션 화학, 메톡시 에테르 콘쥬게이션 화학, 카르복실레이트 콘쥬게이션 화학, 아민 콘쥬게이션 화학, NHS 에스테르, 말레이미드, 티올, 에폭시, 아지드, 히드라지드, 알킨, 이소시아네이트, 및 실란을 포함하지만, 이들에 국한되지는 않는다.
일부 경우에, 내부 흐름 셀 장치 표면 상의 중합체의 층 또는 다른 화학 층의 개수는 1 내지 약 10, 또는 10 초과 범위일 수 있다. 일부 경우에, 층의 개수는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 이다. 일부 경우에, 층의 개수는 최대 10, 최대 9, 최대 8, 최대 7, 최대 6, 최대 5, 최대 4, 최대 3, 최대 2 또는 최대 1 일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시 내에 포함된 범위를 형성할 수 있는, 예를 들어, 일부 경우에, 층의 개수는 약 2 내지 약 4의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 층은 모두 동일한 재료를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각 층은 상이한 재료를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 복수의 층은 복수의 재료를 포함할 수 있다.
다층 표면의 하나 이상의 층은 분지형 중합체를 포함할 수 있거나 또는 선형일 수 있다. 적합한 분지형 중합체의 예는, 분지형 PEG, 분지형 폴리(비닐 알코올)(분지형 PVA), 분지형 폴리(비닐 피리딘), 분지형 폴리(비닐 피롤리돈)(분지형 PVP), 분지형), 폴리(아크릴산)(분지형 PAA), 분지형 폴리아크릴아미드, 분지형 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(분지형 PNIPAM), 분지형 폴리(메틸) 메타크릴레이트)(분지형 PMA), 분지형 폴리(2-히드록실에틸 메타크릴레이트)(분지형 PHEMA), 분지형 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트)(분지형 POEGMA), 분지형 폴리글루탐산(분지형 PGA), 분지형 폴리-리신, 분지형 폴리-글루코사이드, 및 덱스트란을 포함하지만, 이들에 국한되지는 않는다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하기 위해 사용된 분지형 중합체는 적어도 4 개의 분지, 적어도 5 개의 분지, 적어도 6 개의 분지, 적어도 7 개의 분지, 적어도 8 개의 분지, 적어도 9 개의 분지, 적어도 10 개의 분지, 적어도 12 개의 분지, 적어도 14 개의 분지, 적어도 16 개의 분지, 적어도 18 개의 분지, 적어도 20 개의 분지, 적어도 22 개의 분지, 적어도 24 개의 분지, 적어도 26 개의 분지, 적어도 28 개의 분지, 적어도 30 개의 분지, 적어도 32 개의 분지, 적어도 34 개의 분지, 적어도 36 개의 분지, 적어도 38 개의 분지, 또는 적어도 40 개의 분지를 포함할 수 있다. 분자는 종종 2, 4, 8, 16, 32, 64 또는 128 개의 분지와 같이 '2 거듭제곱의' 분지 개수를 나타낸다.
일부 경우에, 하나 이상의 층, 예를 들어 중합체 층의 침착 후에 표면으로부터 원위의 생성된 작용성 말단기는 비오틴, 메톡시 에테르, 카르복실레이트, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드, 및 비스-실란을 포함할 수 있지만, 이들에 국한되지는 않는다.
본 명세서에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하는 데 사용되는 선형, 분지형, 또는 다중 분지형 중합체는 적어도 500 달톤, 적어도 1,000 달톤, 적어도 1,500 달톤, 적어도 2,000 달톤, 적어도 2,500 달톤, 적어도 3,000 달톤, 적어도 3,500 달톤, 적어도 4,000 달톤, 적어도 4,500 달톤, 적어도 5,000 달톤, 적어도 7,500 달톤, 적어도 10,000 달톤, 적어도 12,500 달톤, 적어도 15,000 달톤, 적어도 17,500 달톤, 적어도 20,000 달톤, 적어도 25,000 달톤, 적어도 30,000 달톤, 적어도 35,000 달톤, 적어도 40,000 달톤, 적어도 45,000 달톤, 또는 적어도 50,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하기 위해 사용되는 선형, 분지형 또는 다중 분지형 중합체는 최대 50,000 달톤, 최대 45,000 달톤, 최대 40,000 달톤, 최대 35,000 달톤, 최대 30,000 달톤, 최대 25,000 달톤, 최대 20,000 달톤, 최대 17,500 달톤, 최대 15,000 달톤, 최대 12,500 달톤, 최대 10,000 달톤, 최대 7,500 달톤, 최대 5,000 달톤, 최대 4,500 달톤, 최대 4,000 달톤, 최대 3,500 달톤, 최대 3,000 달톤, 최대 2,500 달톤, 최대 2,000 달톤, 최대 1,500 달톤, 최대 1,000 달톤, 또는 최대 500 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하기 위해 사용되는 선형, 분지형 또는 다중 분지형 중합체의 분자량은 약 1,500 달톤 내지 약 20,000 달톤의 범위일 수 있다. 당업자는 본 명세서에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하는 데 사용되는 선형, 분지형 또는 다중 분지형 중합체의 분자량이 예를 들어, 약 1,260 달톤과 같이 이 범위 내의 임의의 값을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 경우에, 2 개 이상의 층이 서로 공유 결합되거나 또는 내부적으로 가교 결합되어 결과적인 표면의 안정성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어 다층 표면의 적어도 하나의 층이 분지형 중합체를 포함하는 일부 경우에, 침착되는 층의 분지형 중합체 분자와 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수는 분자 당 약 1 개의 공유 결합 내지 분자 당 약 32 개의 공유 결합 범위일 수 있다. 일부 경우에, 새로운 층의 분지형 중합체 분자와 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수는 분자 당 적어도 1 개, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 7 개, 적어도 8 개, 적어도 9 개, 적어도 10 개, 적어도 12 개, 적어도 14 개, 적어도 16 개, 적어도 18 개, 적어도 20 개, 적어도 22 개, 적어도 24 개, 적어도 26 개, 적어도 28 개, 적어도 30 개, 또는 적어도 32 개, 또는 32 개 초과의 공유 결합일 수 있다. 일부 경우에, 새로운 층의 분지형 중합체 분자와 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수는 최대 32 개, 최대 30 개, 최대 28 개, 최대 26 개, 최대 24 개, 최대 22 개, 최대 20 개, 최대 18 개, 최대 16 개, 최대 14 개, 최대 12 개, 최대 10 개, 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 최대 5 개, 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 새로운 층의 분지형 중합체 분자와 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수는 약 4 개 내지 약 16 개의 범위일 수 있다. 당업자는 새로운 층의 분지형 중합체 분자와 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 일부 경우에 약 11 개 또는 다른 경우에 약 4.6 개의 평균 개수를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
내부 흐름 셀 장치 표면에 재료 층을 커플링한 후 남아 있는 임의의 반응성 작용기는 고 수율 커플링 화학을 사용하여 작은 불활성 분자를 커플링함으로써 선택적으로 차단될 수 있다. 예를 들어, 아민 커플링 화학이 이전 층에 새로운 재료 층을 부착하는 데 사용되는 경우, 임의의 잔여 아민기는 이후에 글리신과 같은 작은 아미노산과 커플링함으로써 아세틸화되거나 또는 비활성화될 수 있다.
결합 부위 표면 밀도, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머 표면 밀도를 스케일링하고, 친수성 또는 양쪽성 표면에 추가적인 차원을 추가하기 위해, PEG 및 다른 친수성 중합체의 다층 코팅을 포함하는 기판이 개발되었다. 아래에 설명된 중합체/공중합체 재료를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 친수성 및 양쪽성 표면 적층 접근 방식을 사용하여, 표면의 어댑터/프라이머 로딩 밀도를 상당히 증가시킬 수 있다. 전통적인 PEG 코팅 접근 방식은, 단일 분자 시퀀싱 적용에 대해 테스트 및 보고되었지만 핵산 증폭 적용에 대해 높은 카피 개수를 산출하지 않는 단층 프라이머 침착을 사용한다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, "적층"은 2 개 이상의 고도로 가교 결합된 층을 포함하는 표면이 순차적으로 구축될 수 있도록 임의의 호환성 중합체 또는 단량체 하위 단위와 함께 전통적인 가교 결합 접근 방식을 사용하여 달성될 수 있다. 적합한 중합체의 예는 스트렙타비딘, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 덱스트란, 폴리-리신, 및 폴리-리신과 PEG의 공중합체를 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 일부 경우에, 서로 다른 층들은 비오틴-스트렙타비딘 결합, 아지드-알킨 클릭 반응, 아민-NHS 에스테르 반응, 티올-말레이미드 반응, 및 양전하 중합체와 음전하 중합체 간의 이온 상호 작용을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 다양한 콘쥬게이션 반응 중 임의의 것을 통해 서로 가교 결합될 수 있다. 일부 경우에, 높은 어댑터/프라이머 밀도 재료는 용액으로 구성될 수 있으며, 후속적으로 다중 단계로 표면 상에 적층될 수 있다.
예시적인 PEG 다층은 PEG-아민-APTES 상의 PEG(8 개의 아암, 16 개의 아암, 8 개의 아암)를 포함한다. 8 uM 프라이머에 노출된 PEG-아민-APTES의 3층 다중 아암 PEG(8 아암, 16 아암, 8 아암), 및 별 형상의 PEG-아민을 사용하여 16 아암 및 64 아암을 대체하는 3층 다중 아암 PEG(8 아암, 8 아암, 8 아암)에 대해 유사한 농도가 관찰되었다. 필적하는 제1, 제2 및 제3 PEG 층을 갖는 PEG 다층이 또한 고려된다.
일부 경우에, 내부 흐름 셀 장치 표면 상의 결합 부위의 결과적인 표면 밀도, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머 표면 밀도는 ㎛2당 약 100 개의 프라이머 분자 내지 ㎛2당 약 1,000,000 개의 프라이머 분자 범위일 수 있다. 일부 경우에, 결합 부위의 표면 밀도는 ㎛2당 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 적어도 2,000, 적어도 2,500, 적어도 3,000, 적어도 3,500, 적어도 4,000, 적어도 4,500, 적어도 5,000, 적어도 5,500, 적어도 6,000, 적어도 6,500, 적어도 7,000, 적어도 7,500, 적어도 8,000, 적어도 8,500, 적어도 9,000, 적어도 9,500, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 또는 적어도 1,000,000 개의 분자일 수 있다. 일부 경우에, 결합 부위의 표면 밀도는 ㎛2당 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 9,500, 최대 9,000, 최대 8,500, 최대 8,000, 최대 7,500, 최대 7,000, 최대 6,500, 최대 6,000, 최대 5,500, 최대 5,000, 최대 4,500, 최대 4,000, 최대 3,500, 최대 3,000, 최대 2,500, 최대 2,000, 최대 1,500, 최대 1,000, 최대 900, 최대 800, 최대 700, 최대 600, 최대 500, 최대 400, 최대 300, 최대 200, or 최대 100 개의 분자일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 결합 부위의 표면 밀도는 ㎛2당 약 10,000 개의 분자 내지 ㎛2당 약 100,000 개의 분자의 범위일 수 있다. 당업자는 결합 부위의 표면 밀도가 이 범위 내의 임의의 값을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이며, 예를 들어 일부 경우에 ㎛2당 약 3,800 개의 분자, 또는 다른 경우에는 ㎛2당 약 455,000 개의 분자를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일부 경우에, 핵산 시퀀싱 적용에 대해 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 내부 흐름 셀 장치 표면에 테더링된 어댑터 또는 프라이머 시퀀스에 초기에 혼성화된 템플릿 라이브러리(template library) 핵산 시퀀스(예를 들어, 샘플 DNA 분자)의 표면 밀도는 결합 부위의 표면 밀도에 대해 표시된 것보다 작거나 같을 수 있다. 일부 경우에, 아래에서 더 자세히 설명되는 바와 같이, 내부 흐름 셀 장치 표면의 어댑터 또는 프라이머 시퀀스에 혼성화된 클론 증폭된 템플릿 라이브러리 핵산 시퀀스의 표면 밀도는 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도에 대해 표시된 것과 동일한 범위 또는 다른 범위에 걸쳐 있을 수 있다.
위에 나열된 바와 같은 내부 흐름 셀 장치 표면의 결합 부위의 국부적 표면 밀도는 표면 전반에 걸친 밀도의 변화를 배제하지 않으므로, 표면이 예를 들어 500,000/㎛2의 결합 부위 밀도를 갖는 구역을 포함할 수 있고, 또한 실질적으로 상이한 국부적 표면 밀도를 갖는 적어도 제2 구역을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 캡처 프로브, 예를 들어, 상이한 염기 시퀀스 및 염기 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머(또는 다른 생체분자, 예를 들어, 효소 또는 항체)는 다양한 표면 밀도에서 생성된 표면의 하나 이상의 층에 테더링될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 커플링에 사용되는 표면 작용기 밀도 및 캡처 프로브 농도는 둘 모두 특정 캡처 프로브 표면 밀도 범위를 목표로 하도록 변경될 수 있다. 추가적으로, 캡처 프로브 표면 밀도는 캡처 프로브를 표면에 커플링하기 위한 동일한 반응성 작용기를 운반하는 다른 "비활성" 분자로 희석함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 아민-라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브는 NHS-에스테르 코팅된 표면과의 반응에서 아민-라벨링된 폴리에틸렌 글리콜로 희석되어 최종 프라이머 밀도를 감소시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머의 경우, 혼성화 구역과 표면 부착 작용기 사이에 링커의 길이가 다른 프로브 시퀀스를 또한 적용하여 표면 밀도를 변경할 수도 있다. 적합한 링커의 예에는 프라이머의 5' 말단에 있는 폴리-T 및 폴리-A 가닥(예를 들어, 0 내지 20 개의 염기), PEG 링커(예를 들어, 3 내지 20 개의 단량체 단위), 및 탄소 사슬(예를 들어, C6, C12, C18 등)이 포함된다. 캡처 프로브 표면 밀도를 측정하거나 또는 추정하기 위해, 형광 라벨링된 캡처 프로브를 표면에 테더링하고, 그 다음 형광 판독값을 알려진 농도의 형광단을 포함하는 교정 용액에 대한 것과 비교할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 지지 표면, 예를 들어 내부 흐름 셀 장치 표면의 친수성(또는 수용액에 대한 "습윤성")의 정도는, 예를 들어, 작은 물방울이 표면 상에 배치되고 표면과의 접촉각이 예를 들어 광학 장력계를 사용하여 측정되는 물 접촉각의 측정을 통해 평가될 수 있다. 일부 경우에, 정적 접촉각이 결정될 수 있다. 일부 경우에, 전진 또는 후진 접촉각이 결정될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 친수성, 저 결합 지지 표면에 대한 물 접촉각은 약 0 도 내지 약 50 도 범위일 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 친수성, 저 결합 지지 표면에 대한 물 접촉각은 50 도, 45 도, 40 도, 35 도, 30 도, 25 도, 20 도, 18 도, 16 도, 14 도, 12 도, 10 도, 8 도, 6 도, 4 도, 2 도, 또는 1 도 이하일 수 있다. 많은 경우에, 접촉각은 이 범위 내의 임의의 값 이하, 예를 들어, 40 도 이하이다. 당업자는 본 개시의 주어진 친수성, 저 결합 지지 표면이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 27도를 갖는 물 접촉각을 나타낼 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 경우에, 개시된 낮은 비-특이적 결합 표면은 45 도 미만의 물 접촉각을 갖는다. 일부 경우에, 개시된 낮은 비-특이적 결합 표면은 35 도 미만의 물 접촉각을 갖는다.
언급된 바와 같이, 본 개시의 친수성 코팅된 내부 흐름 셀 장치 표면은 단백질, 핵산, 형광단, 및 생물학적 및 생화학적 어세이 방법의 다른 성분의 감소된 비-특이적 결합을 나타낸다. 주어진 지지 표면, 예를 들어, 내부 흐름 셀 장치 표면에 의해 나타나는 비-특이적 결합의 정도는 정성적으로 또는 정량적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 표준화된 조건 세트 하에서 형광 염료(예를 들어, 사아닌 염료 3(Cy3), 시아닌 염료 5(Cy5) 등), 형광 라벨링된 뉴클레오티드, 형광 라벨링된 올리고뉴클레오티드, 및/또는 형광 라벨링된 단백질(예를 들어, 중합효소)에 대한 표면의 노출, 그 후 뒤따르는 지정된 헹굼 프로토콜 및 형광 이미징이 다른 표면 제형을 포함하는 지지체에 대한 비-특이적 결합을 비교하기 위한 정성적 도구로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 표준화된 조건 세트 하에서 형광 염료, 형광 라벨링된 뉴클레오티드, 형광 라벨링된 올리고뉴클레오티드, 및/또는 형광 라벨링된 단백질(예를 들어, 폴리머라제)에 대한 표면의 노출, 그 후 뒤따르는 지정된 헹굼 프로토콜 및 형광 이미징이 다른 표면 제형을 포함하는 지지체에 대한 비-특이적 결합을 비교하기 위한 정량적 도구로서 사용될 수 있다 - 형광 신호가 지지 표면 상의 형광단의 개수에 선형으로 관련되는 (또는 예측 가능한 방식으로 관련되는) 조건 하에서 (예를 들어, 형광단의 신호 포화 및/또는 자기 소광이 문제가 되지 않는 조건 하에서) 형광 이미징이 수행되고 적절한 교정 표준이 사용되는 것을 보장하기 위해 주의를 기울인 경우. 일부 경우에, 당업자에게 공지된 다른 기술들, 예를 들어 방사성 동위 원소 라벨링 및 카운팅 방법이, 비-특이적 결합이 본 개시의 상이한 지지 표면 제형에 의해 나타나는 정도의 정량적 평가를 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 개시된 낮은 비-특이적 결합 지지 표면에 의해 나타나는 비-특이적 결합의 정도는, 인큐베이션 및 헹굼 조건의 표준화된 세트 하에서, 표면을 라벨링된 단백질(예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA), 스트렙타비딘, DNA 폴리머라제, 역전사 효소, 헬리카제, 단일 가닥 결합 단백질(SSB) 등, 또는 이들의 임의의 조합), 라벨링된 뉴클레오티드, 라벨링된 올리고뉴클레오티드 등과 접촉시키기 위한 표준화된 프로토콜을 사용하여 평가될 수 있고, 그 다음에는 표면에 남아 있는 라벨의 양을 검출하고, 그로 인한 신호를 적절한 교정 표준과 비교를 수행할 수 있다. 일부 경우에, 라벨은 형광 라벨을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 라벨은 방사성 동위 원소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 라벨은 당업자에게 공지된 임의의 다른 검출 가능한 라벨을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 주어진 지지 표면 제형에 의해 나타나는 비-특이적 결합의 정도는 따라서 단위 면적당 비-특이적으로 결합된 단백질 분자(또는 다른 분자)의 개수로 평가될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시의 낮은 비-특이적 결합 지지체는 비-특이적 단백질 결합 또는 다른 특정 분자들의 비-특이적 결합을 나타낼 수 있는데, 예를 들어, 시아닌 염료 3(Cy3) ㎛2당 0.001 분자 미만, ㎛2당 0.01 분자 미만, ㎛2당 0.1 분자 미만, ㎛2당 0.25 분자 미만, ㎛2당 0.5 분자 미만, ㎛2당 1 분자 미만, ㎛2당 10 분자 미만, ㎛2당 100 분자 미만, 또는 ㎛2당 1,000 분자 미만에 대해 비-특이적 결합을 나타낼 수 있다. 당업자는 본 개시의 주어진 지지 표면이 이 범위 내의 임의의 범위에 속하는, 예를 들어 ㎛2당 86 개 미만의 분자의 비-특이적 결합을 나타낼 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 일부 변형된 표면은 인산 완충 식염수(PBS) 완충제에서 Cy3 라벨링된 스트렙타비딘(GE Amersham)의 1 uM 용액과 15 분 동안 접촉한 후, 탈이온수로 3 회 헹군 후 0.5 분자/㎛2 미만의 비-특이적 단백질 결합을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 일부 변형된 표면은 ㎛2당 0.25 분자 미만의 Cy3 염료 분자의 비-특이적 결합을 나타낸다. 독립적인 비-특이적 결합 어세이에서, 1 uM 라벨링된 Cy3 SA (ThermoFisher), 1 uM Cy5 SA 염료 (ThermoFisher), 10 uM 아미노알릴-dUTP-ATTO-647N (Jena Biosciences), 10 uM 아미노알릴-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 uM 아미노알릴-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 uM 7-프로파르길아미노-7-deaza-dGTP-Cy5 (Jena Biosciences), 및 10 uM 7-프로파르길아미노-7-deaza-dGTP-Cy3 (Jena Biosciences)가 384 웰 플레이트 형식으로 37 ℃에서 15 분 동안 낮은 비-특이적 결합 기판 상에서 배양되었다. 각 웰은 50 ul 탈이온화된 RNase/DNase 유리수로 2 내지 3 회 그리고 25 mM ACES 완충제(pH 7.4)으로 2 내지 3 회 헹구어졌다. 384 웰 플레이트는 800의 PMT 게인 설정 및 50 내지 100 ㎛의 해상도에서 제조업체에 의해 지정된 Cy3, AF555 또는 Cy5 필터 세트(수행된 염색 테스트에 따름)를 사용하여 GE Typhoon(GE Healthcare Lifesciences, 펜실베이니아주, 피츠버그) 기기에서 이미징되었다. 고 해상도 이미징의 경우, 내부 전반사 형광(TIRF) 대물 렌즈(20x, 0.75 NA 또는 100X, 1.5 NA, Olympus)를 갖는 Olympus IX83 현미경(Olympus Corp., 펜실베이니아주, 센터 밸리), sCMOS Andor 카메라(Zyla 4.2. 다이크로익 미러는 Semrock(IDEX Health & Science, LLC, 뉴욕주, 로체스터)으로부터 구입했고, 예를 들어 405, 488, 532 또는 633 nm 다이크로익 반사기/빔 스플리터, 및 대역 통과 필터는 적절한 여기 파장과 일치하는 532 LP 또는 645 LP로 선택됨)에서 이미지들이 수집되었다. 본 명세서에 개시된 일부 변형된 표면은 ㎛2당 0.25 분자 미만의 염료 분자의 비-특이적 결합을 나타낸다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 코팅된 흐름 셀 장치 표면은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 100 초과, 또는 본 명세서의 범위에 걸쳐 있는 임의의 중간 값의 Cy3와 같은 형광단의 비-특이적 결합에 대한 특이적 결합의 비율을 나타낼 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 표면 변형 및/또는 중합체 층이 화학 기상 증착(CVD)과 같은 기술을 사용하여 내부 흐름 셀 장치 표면에 도포될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 표면 변형 및/또는 중합체 층이 의도된 적용을 위해 사용하기 전에 모세관 또는 유체 채널을 통해 하나 이상의 적절한 화학적 커플링 또는 코팅 시약을 흐르게 함으로써 내부 흐름 셀 장치 표면에 도포될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 코팅 시약이 사용되는 완충제, 예를 들어 핵산 혼성화, 증폭 반응 및/또는 시퀀싱 반응 완충제에 첨가되어 내부 흐름 셀 장치 표면의 동적 코팅을 제공할 수 있다.
일부 경우에, 화학적 개질 층은 기판 또는 지지 구조의 표면에 걸쳐 균일하게 도포될 수 있다. 대안적으로, 기판 또는 지지 구조의 표면은 불균일하게 분포되거나 또는 패터닝되어, 화학적 개질 층은 기판의 하나 이상의 개별 구역에 국한될 수 있다. 예를 들어, 기판 표면은 표면 상에 화학적으로 개질된 구역의 정렬된 어레이 또는 랜덤 패턴을 생성하기 위해 포토리소그래피 기술을 사용하여 패터닝될 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 기판 표면은 예를 들어 접촉 인쇄 및/또는 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 패터닝될 수 있다. 일부 경우에, 화학적으로 개질된 개별 구역의 정렬된 어레이 또는 랜덤 패턴은 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10,000 개 또는 그 초과의 개별 구역, 또는 본 명세서의 범위에 걸쳐 있는 임의의 중간 개수의 개별 구역을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 예를 들어, 혼성화 또는 클론 증폭된 핵산 분자의 클러스터(예를 들어, 형광단으로 직접 또는 간접적으로 라벨링된 "개별 구역")를 생성하기 위한 핵산 혼성화 또는 증폭 적용에서 사용될 때 개시된 낮은 비-특이적 결합 표면의 형광 이미지는, 핵산 분자가 Cy3로 라벨링되고 20x, 0.75 NA 대물 렌즈, 532 nm 광원, 532 nm 장역 통과 여기 및 Cy3 형광 방출 필터에 맞게 조정되거나 또는 최적화된 대역 통과 및 다이크로익 미러 필터 세트가 장착된 Olympus IX83 도립 형광 현미경, Semrock 532 nm 다이크로익 반사기, 및 카메라(Andor sCMOS, Zyla 4.2)를 사용하여 이미지가 획득될 때, 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 또는 250 초과의 대조 대 잡음비(CNR)를 나타내고, 여기서 여기 광 강도는 신호 포화를 회피하도록 조정되고, 이미지를 획득하는 동안 표면은 완충제(예를 들어, 25 mM ACES, pH 7.4 완충제)에 담근다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 대조 대 잡음비(CNR)는 다음과 같이 계산된다:
CNR = (S - B) / 잡음
여기서 S = 전경 신호 (예를 들어, 샘플 지지 표면 상의 라벨링된 핵산 콜로니 또는 클러스터에서 발생하는 이미지에서 측정된 형광 신호), B = 배경 신호 (여기서 B = Binter + Bintra), Binter = 라벨링된 핵산 콜로니 또는 클러스터 사이에 있는 샘플 지지 표면 상의 위치에서 측정된 배경 신호, Bintra = 핵산 콜로니 또는 클러스터의 위치에서 측정된 배경 신호 (예를 들어, 샘플 지지 표면을 라벨링된 비-상보적 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고 생성된 형광을 측정함으로써 결정됨), 및 잡음 = 신호 잡음 이다. 예를 들어, 시퀀싱 표면의 이미지의 대조 대 잡음비(CNR)는 지지체에 대한 핵산 증폭 특이성 및 비-특이적 결합을 평가하는 핵심 메트릭을 제공한다. 신호 대 잡음비(SNR)는 종종 전체 신호 품질의 벤치마크로 간주되지만, 개선된 CNR은 빠른 이미지 캡처가 필요한 이미징 적용(예를 들어, 사이클 시간이 최소화되어야 하는 핵산 시퀀싱 적용)에서 신호 품질에 대한 벤치마크로서 SNR에 비해 상당한 이점을 제공할 수 있다는 것을 보여줄 수 있다.
일부 경우에, 중합체 코팅된 샘플 지지 구조, 예를 들어 개시된 친수성 중합체 코팅을 포함하는 내부 흐름 셀 장치 표면은 용매에 대한 반복적인 노출, 온도 변화, pH 변화, 또는 장기 보관에 대해 개선된 안정성을 나타낼 수 있다.
유체학 시스템 및 유체 흐름 제어 모듈: 일부 구현에서, 개시된 이미징 및/또는 분석 시스템은 시스템에 연결된 하나 이상의 흐름 셀 장치 또는 흐름 셀 카트리지(예를 들어, 단일 모세관 흐름 셀 장치 또는 미세 유체 채널 흐름 셀 장치)에 샘플 또는 시약을 전달하기 위한 유체 흐름 제어 기능을 제공할 수 있다. 시약 및 완충제는 병, 시약 및 완충제 카트리지, 또는 튜빙 및 밸브 매니폴드를 통해 흐름 셀 입구에 연결된 다른 적절한 용기에 저장될 수 있다. 개시된 시스템은 또한 모세관 흐름 셀 장치 또는 모세관 흐름 셀 카트리지의 하류에서 유체를 수집하기 위한 병, 카트리지, 또는 다른 적절한 용기 형태의 처리된 샘플 및 폐기물 저장소를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 유체 흐름(또는 "유체학") 제어 모듈은 서로 다른 소스들, 예를 들어 기기 내에 위치된 샘플 또는 시약 저장소 또는 병, 그리고 중앙 구역(예를 들어, 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치, 또는 미세 유체 장치 내의 대형 유체 챔버와 같은 대형 유체 챔버)에 대한 입구(들) 사이의 프로그래밍 가능한 흐름 전환을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 유체 흐름 제어 모듈은 중앙 구역(예를 들어, 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치)으로부터의 출구(들)와, 시스템에 연결된 다른 수집 지점, 예를 들어, 처리된 샘플 저장소, 폐기물 저장소 등 사이의 프로그래밍 가능한 흐름 전환을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 샘플, 시약, 및/또는 완충제는 흐름 셀 카트리지 또는 미세 유체 카트리지 자체에 통합된 저장소 내에 저장될 수 있다. 일부 경우에, 처리된 샘플, 소비된 시약, 및/또는 사용된 완충제는 흐름 셀 카트리지 또는 미세 유체 장치 카트리지 자체에 통합된 저장소 내에 저장될 수 있다.
일부 구현에서, 하나 이상의 유체 흐름 제어 모듈은 하나 이상의 모세관 흐름 셀, 모세관 흐름 셀 카트리지, 미세 유체 장치, 미세 유체 카트리지, 또는 이들의 임의의 조합으로의 유체의 전달을 제어하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 유체학 제어기는 하나 이상의 유체 또는 시약에 대한 체적 흐름 속도, 하나 이상의 유체 또는 시약에 대한 선형 흐름 속도, 하나 이상의 유체 또는 시약에 대한 혼합 비율, 또는 이들의 임의의 조합을 제어하도록 구성될 수 있다. 개시된 시스템을 통한 유체 흐름의 제어는 일반적으로 펌프(또는 다른 유체 작동 기구) 및 밸브(예를 들어, 프로그래밍 가능한 펌프 및 밸브)를 사용하여 수행된다. 적합한 펌프의 예는 시린지 펌프, 프로그래밍 가능한 시린지 펌프, 연동 펌프, 다이어프램 펌프 등을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다. 적합한 밸브의 예는 체크 밸브, 전기 기계식 2 방향 또는 3 방향 밸브, 공압식 2 방향 및 3 방향 밸브 등을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 시스템을 통한 유체 흐름은 시약 및 완충제 용기의 하나 이상의 입구, 또는 흐름 셀 카트리지(들)(예를 들어, 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 카트리지)에 통합된 입구에 양의 공기압을 인가하여 제어될 수 있다. 일부 실시예에서, 시스템을 통한 유체 흐름은 폐기물 저장소(들)의 하나 이상의 출구에서, 또는 흐름 셀 카트리지(들)(예를 들어, 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 카트리지)에 통합된 하나 이상의 출구에서 진공을 끌어냄으로써 제어될 수 있다.
일부 경우에, 어세이 또는 분석 절차의 상이한 포인트에서 상이한 유체 흐름 제어 모드가 사용되는데, 예를 들어 (주어진 모세관 흐름 셀 장치의 입구 및 출구에 대해) 정방향 흐름, 역방향 흐름, 진동 또는 맥동 흐름, 또는 이들의 임의의 조합이 사용된다. 일부 적용에서, 진동 또는 맥동 흐름은 예를 들어 하나 이상의 흐름 셀 장치 또는 흐름 셀 카트리지(예를 들어, 모세관 흐름 셀 장치 또는 카트리지, 미세 유체 장치 또는 카트리지) 내에서 유체의 완전하고 효율적인 교환을 촉진하기 위해 어세이 세척/헹굼 단계 동안 적용될 수 있다.
마찬가지로 일부 경우에, 흐름 셀 장치 내의 상이한 위치에서 또는 어세이 또는 분석 절차 워크플로의 상이한 포인트에서 상이한 유체 흐름 속도가 사용될 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 체적 흐름 속도는 -100 ml/sec 내지 +100 ml/sec 다양할 수 있다. 일부 실시예에서, 체적 흐름 속도의 절대값은 적어도 0.001 ml/sec, 적어도 0.01 ml/sec, 적어도 0.1 ml/sec, 적어도 1 ml/sec, 적어도 10 ml/sec, 또는 적어도 100 ml/sec일 수 있다. 일부 실시예에서, 체적 흐름 속도의 절대값은 최대 100 ml/sec, 최대 10 ml/sec, 최대 1 ml/sec, 최대 0.1 ml/sec, 최대 0.01 ml/sec 또는 최대 0.001 ml/sec일 수 있다. 흐름 셀 장치를 사용하여 주어진 위치에서 또는 주어진 시점에서 체적 흐름 속도는 이 범위 내에서 임의의 값을 가질 수 있는데, 예를 들어 2.5 ml/sec의 정방향 흐름 속도, -0.05 ml/sec의 역방향 흐름 속도, 또는 0 ml/sec(즉, 정지된 흐름)의 값을 가질 수 있다
일부 구현에서, 유체학 시스템은 예를 들어 게놈 분석 적용을 수행하는 데 필요한 주요 시약(예를 들어, 고가의 시약)의 소비를 최소화하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현에서, 개시된 유체학 시스템은 제1 시약 또는 용액을 수용하는 제1 저장소, 제2 시약 또는 용액을 수용하는 제2 저장소, 및 중앙 구역, 예를 들어 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치를 포함할 수 있고, 여기서 제1 저장소로부터의 출구 및 제2 저장소로부터의 출구는 적어도 하나의 밸브를 통해 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치의 입구에 유체적으로 커플링되어, 단위 시간당 제1 저장소의 출구로부터 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치의 입구로 흐르는 제1 시약 또는 용액의 체적은 단위 시간당 제2 저장소의 출구로부터 중앙 구역의 입구로 흐르는 제2 시약 또는 용액의 체적보다 적다. 일부 구현에서, 제1 저장소 및 제2 저장소는 모세관 흐름 셀 카트리지 또는 미세 유체 카트리지에 통합될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 밸브는 또한 모세관 흐름 셀 카트리지 또는 미세 유체 카트리지에 통합될 수 있다.
일부 경우에, 제1 저장소는 제1 밸브를 통해 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치에 유체적으로 커플링되고, 제2 저장소는 제2 밸브를 통해 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치에 유체적으로 커플링된다. 일부 경우에, 제1 및/또는 제2 밸브는 예를 들어 다이어프램 밸브, 핀치 밸브, 게이트 밸브, 또는 다른 적절한 밸브일 수 있다. 일부 경우에, 제1 저장소는 제1 시약 용액의 전달을 위한 사체적을 감소시키기 위해 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치의 입구에 매우 근접하게 위치된다. 일부 경우에, 제1 저장소는 제2 저장소보다 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치의 입구에 더 근접하게 배치된다. 일부 경우에, 제1 저장소는 제2 밸브에 매우 근접하게 위치되어, 복수의 "제2" 저장소(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개 또는 그 초과의 "제2" 저장소)로부터 복수의 "제2" 시약(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 또는 그 초과의 "제2" 시약)의 전달에 대한 사체적에 비해 제1 시약 전달에 대한 사체적을 감소시킨다.
위에서 설명한 제1 및 제2 저장소는 동일한 또는 다른 시약 또는 용액을 수용하도록 사용될 수 있다. 일부 경우에, 제1 저장소에 수용된 제1 시약은 제2 저장소에 수용된 제2 시약과 상이하고, 제2 시약은 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치에서 발생하는 복수의 반응에 공통으로 사용되는 적어도 하나의 시약을 포함한다. 일부 경우에, 예를 들어, 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치 내에서 핵산 시퀀싱 화학을 수행하도록 구성된 유체학 시스템에서, 제1 시약은 폴리머라제, 뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약을 포함한다. 일부 경우에, 제2 시약은 저렴한 시약, 예를 들어 용매를 포함한다.
일부 경우에, 중앙 구역, 예를 들어 중앙 모세관 흐름 셀 카트리지, 또는 하나 이상의 유체 채널 또는 유체 챔버를 포함하는 미세 유체 장치의 내부 체적은 수행될 특정 적용, 예를 들어 핵산 시퀀싱을 기초로 하여 조정될 수 있다. 일부 실시예에서, 중앙 구역은 진핵 생물 게놈의 시퀀싱에 적합한 내부 체적을 포함한다. 일부 실시예에서, 중앙 구역은 원핵 생물 게놈의 시퀀싱에 적합한 내부 체적을 포함한다. 일부 실시예에서, 중앙 구역은 바이러스 게놈의 시퀀싱에 적합한 내부 체적을 포함한다. 일부 실시예에서, 중앙 구역은 전사체를 시퀀싱하기에 적합한 내부 체적을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 중앙 구역의 내부 체적은 0.05 μl 미만, 0.05 μl 내지 0.1 μl, 0.05 μl 내지 0.2 μl, 0.05 μl 내지 0.5 μl, 0.05 μl 내지 0.8 μl, 0.05 μl 내지 1 μl, 0.05 μl 내지 1.2 μl, 0.05 μl 내지 1.5 μl, 0.1 μl 내지 1.5 μl, 0.2 μl 내지 1.5 μl, 0.5 μl 내지 1.5 μl, 0.8 μl 내지 1.5 μl, 1 μl 내지 1.5 μl, 1.2 μl 내지 1.5 μl, 또는 1.5 μl 초과, 또는 상기 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위의 체적을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 중앙 구역의 내부 체적은 0.5 μl 미만, 0.5 μl 내지 1 μl, 0.5 μl 내지 2 μl, 0.5 μl 내지 5 μl, 0.5 μl 내지 8 μl, 0.5 μl 내지 10 μl, 0.5 μl 내지 12 μl, 0.5 μl 내지 15 μl, 1 μl 내지 15 μl, 2 μl 내지 15 μl, 5 μl 내지 15 μl, 8 μl 내지 15 μl, 10 μl 내지 15 μl, 12 μl 내지 15 μl, 또는 15 μl 초과, 또는 상기 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위의 체적을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 중앙 구역의 내부 체적은 5 μl 미만, 5 μl 내지 10 μl, 5 μl 내지 20 μl, 5 μl 내지 500 μl, 5 μl 내지 80 μl, 5 μl 내지 100 μl, 5 μl 내지 120 μl, 5 μl 내지 150 μl, 10 μl 내지 150 μl, 20 μl 내지 150 μl, 50 μl 내지 150 μl, 80 μl 내지 150 μl, 100 μl 내지 150 μl, 120 μl 내지 150 μl, 또는 150 μl 초과, 또는 상기 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위의 체적을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 중앙 구역의 내부 체적은 50 μl 미만, 50 μl 내지 100 μl, 50 μl 내지 200 μl, 50 μl 내지 500 μl, 50 μl 내지 800 μl, 50 μl 내지 1000 μl, 50 μl 내지 1200 μl, 50 μl 내지 1500 μl, 100 μl 내지 1500 μl, 200 μl 내지 1500 μl, 500 μl 내지 1500 μl, 800 μl 내지 1500 μl, 1000 μl 내지 1500 μl, 1200 μl 내지 1500 μl, 또는 1500 μl 초과, 또는 상기 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위의 체적을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 중앙 구역의 내부 체적은 500 μl 미만, 500 μl 내지 1000 μl, 500 μl 내지 2000 μl, 500 μl 내지 5 ml, 500 μl 내지 8 ml, 500 μl 내지 10 ml, 500 μl 내지 12 ml, 500 μl 내지 15 ml, 1 ml 내지 15 ml, 2 ml 내지 15 ml, 5 ml 내지 15 ml, 8 ml 내지 15 ml, 10 ml 내지 15 ml, 12 ml 내지 15 ml, 또는 15 ml 초과, 또는 상기 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위의 체적을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 중앙 구역의 내부 체적은 5 ml 미만, 5 ml 내지 10 ml, 5 ml 내지 20 ml, 5 ml 내지 50 ml, 5 ml 내지 80 ml, 5 ml 내지 100 ml, 5 ml 내지 120 ml, 5 ml 내지 150 ml, 10 ml 내지 150 ml, 20 ml 내지 150 ml, 50 ml 내지 150 ml, 80 ml 내지 150 ml, 100 ml 내지 150 ml, 120 ml 내지 150 ml, 또는 150 ml 초과, 또는 상기 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위의 체적을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 시스템은 복수의 개별 모세관, 미세 유체 채널, 유체 채널, 챔버, 또는 루멘 구역을 포함하는 흐름 셀 장치 또는 시스템의 어레이 또는 집합을 포함하고, 여기서 결합된 내부 체적은 본 명세서에 개시된 범위 내의 값들 중 하나 이상이거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들을 포함한다.
일부 경우에, 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치로의 제1 시약의 전달을 위한 체적 흐름 속도 대 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치로의 제2 시약의 전달을 위한 체적 흐름 속도의 비율은 1:20 미만, 1:16 미만, 1:12 미만, 1:10 미만, 1:8 미만, 1:6 미만 또는 1:2 미만일 수 있다. 일부 경우에, 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치로의 제1 시약의 전달을 위한 체적 흐름 속도 대 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치로의 제2 시약의 전달을 위한 체적 흐름 속도의 비율은 예를 들어 1:15 미만과 같이 이러한 값들이 걸쳐있는 범위의 임의의 값을 가질 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 흐름 셀 장치 및/또는 유체학 시스템은 특히 다양한 시퀀싱 화학 단계들에서 사용되는 값비싼 시약들에 대해, 예를 들어 다른 시퀀싱 장치 및 시스템에 의해 달성되는 것보다 더 효율적인 시약의 사용을 달성하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 제1 시약은 제2 시약보다 더 비싼 시약을 포함한다. 일부 경우에, 제1 시약은 반응 특이적 시약을 포함하고, 제2 시약은 중앙 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치 구역에서 수행되는 모든 반응에 공통인 비-특이적 시약을 포함하며, 여기서 반응 특이적 시약은 비-특이적 시약보다 더 비싸다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 흐름 셀 장치 및/또는 유체 시스템의 사용은 값비싼 시약의 소비 감소의 측면에서 이점을 전달할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 흐름 셀 장치 및/또는 유체 시스템의 사용은 예를 들어 현재 상업적으로 이용 가능한 핵산 시퀀싱 시스템을 작동할 때 직면하는 시약 소비와 비교할 때 적어도 5 %, 적어도 7.5 %, 적어도 10 %, 적어도 12.5 %, 적어도 15 %, 적어도 17.5 %, 적어도 20 %, 적어도 22.5 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 35 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 또는 적어도 50 %의 시약 소비 감소를 발생시킬 수 있다.
도 31은 다양한 유체 흐름 제어 구성 요소에 연결된 단일 모세관 흐름 셀을 포함하는 간단한 유체학 시스템의 비-제한적인 예를 도시하고, 여기서 단일 모세관은 광학적으로 접근 가능하며 다양한 이미징 적용 분야에서 사용하기 위해 현미경 스테이지 또는 맞춤형 이미징 기기에 장착되는 것과 호환될 수 있다. 복수의 시약 저장소는 단일 모세관 흐름 셀 장치의 입구 단부와 유체 커플링되고, 여기서 임의의 주어진 시점에서 모세관을 통해 흐르는 시약은 사용자가 시약 흐름의 타이밍 및 지속 시간을 제어할 수 있도록 하는 프로그래밍 가능한 회전 밸브를 통해 제어된다. 이러한 비-제한적인 예에서, 유체 흐름은 체적 유체 흐름 및 유체 흐름 속도의 정확한 제어 및 타이밍을 제공하는 프로그래밍 가능한 시린지 펌프에 의해 제어된다.
도 32는 사체적을 감소시키거나 또는 최소화하고 특정 핵심 시약을 보존하기 위해 통합된 다이어프램 밸브를 갖는 모세관 흐름 셀 카트리지를 포함하는 유체학 시스템의 비-제한적인 예를 도시한다. 미니어처 다이어프램 밸브를 카트리지에 통합하면 밸브를 모세관의 입구에 매우 가깝게 위치시킬 수 있으므로, 이에 따라 장치 내의 사체적을 감소시키거나 또는 최소화하고 값비싼 시약의 소비를 감소시킬 수 있다. 모세관 흐름 셀 카트리지 내에 밸브 및 다른 유체 제어 구성 요소를 통합하면 또한 더 큰 유체 흐름 제어 기능을 카트리지 설계에 통합할 수 있다.
도 33은 현미경 설정과 조합하여 사용되는 모세관 흐름 셀 카트리지 기반 유체학 시스템의 비-제한적인 예를 도시하고, 여기서 카트리지는 카트리지 내의 모세관과 접촉을 형성하고 열원/싱크로서 역할을 하는 금속 플레이트와 같은 온도 제어 구성 요소를 통합하거나 또는 이와 정합된다. 현미경 설정은 조명 시스템(예를 들어, 레이저, LED, 또는 할로겐 램프 등을 광원으로 포함함), 대물 렌즈, 이미징 시스템(예를 들어, CMOS 또는 CCD 카메라), 및 광학 시스템에 대해 카트리지를 이동하는 병진 스테이지로 구성되고, 이는 예를 들어, 스테이지가 이동됨에 따라 모세관 흐름 셀의 상이한 구역들에 대해 형광 및/또는 명시야 이미지가 획득될 수 있게 한다.
온도 제어 모듈: 일부 구현에서, 개시된 시스템은 어세이 또는 분석 결과의 정확성 및 재현성을 용이하게 하기 위한 목적으로 온도 제어 기능을 포함한다. 기기 시스템(또는 모세관 흐름 셀 카트리지) 설계에 통합될 수 있는 온도 제어 구성 요소의 예는 저항 가열 요소, 적외선 광원, 펠티에 가열 또는 냉각 장치, 방열판, 서미스터, 열전대 등을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 일부 경우에, 온도 제어 모듈(또는 "온도 제어기")은 특정 어세이 또는 분석 단계를 수행하기 전에 지정된 조정 가능한 시간에 프로그래밍 가능한 온도 변화를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 온도 제어기는 지정된 시간 간격에 걸쳐 프로그래밍 가능한 온도 변화를 제공할 수 있다. 일부 실시예에서, 온도 제어기는 증폭 반응을 위한 열 사이클링이 수행될 수 있도록 지정된 주파수 및 램프 속도로 2 개 이상의 설정 온도 사이의 온도의 사이클링을 추가로 제공할 수 있다.
도 34는 흐름 셀 카트리지와 접촉하여 배치된 금속 플레이트의 사용을 통한 흐름 셀(예를 들어, 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치 기반 흐름 셀)의 온도 제어를 위한 하나의 비-제한적인 예를 도시한다. 일부 경우에, 금속 플레이트는 카트리지 섀시와 통합될 수 있다. 일부 경우에, 금속 플레이트는 펠티에 또는 저항성 히터를 사용하여 온도 제어될 수 있다.
도 35는 비-접촉 열 제어 기구를 포함하는 흐름 셀(예를 들어, 모세관 또는 미세 유체 채널 흐름 셀)의 온도 제어를 위한 하나의 비-제한적인 접근 방식을 예시한다. 이 접근 방식에서, 온도 제어된 공기의 스트림은 공기 온도 제어 시스템을 사용하여 흐름 셀 카트리지를 통해 (예를 들어, 단일 모세관 흐름 셀 장치 또는 미세 유체 채널 흐름 셀 장치 쪽으로) 지향된다. 공기 온도 제어 시스템은 공기를 가열 및/또는 냉각하고 이를 일정한 사용자 지정 온도로 유지할 수 있는 열 교환기, 예를 들어 저항성 히터 코일, 펠티에 장치에 부착된 핀 등을 포함한다. 공기 온도 제어 시스템은 또한 가열되거나 또는 냉각된 공기의 스트림을 모세관 흐름 셀 카트리지로 지향시키는 팬과 같은 공기 전달 장치를 포함한다. 일부 경우에, 공기 온도 제어 시스템은 일정한 온도(T1)로 설정되어, 공기 스트림, 및 결과적으로 흐름 셀 또는 카트리지(예를 들어, 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 채널 흐름 셀)는 일부 경우에 환경 온도, 공기 흐름 속도 등에 따라 설정 온도(T1)와 상이할 수 있는 일정한 온도(T2)로 유지된다. 일부 경우에, 2 개 이상의 이러한 공기 온도 제어 시스템은 모세관 흐름 셀 장치 또는 흐름 셀 카트리지 주위에 설치되어, 모세관 또는 카트리지는 주어진 시간에서 작동하는 공기 온도 제어 시스템 중 하나를 제어함으로써 여러 다른 온도 사이에서 빠르게 사이클링될 수 있다. 다른 접근 방식에서, 공기 온도 제어 시스템의 온도 설정이 변경될 수 있으므로, 모세관 흐름 셀 또는 카트리지의 온도가 그에 따라 변경될 수 있다.
유체 분배 로봇: 일부 구현에서, 개시된 시스템은 시약 또는 다른 용액을 예를 들어 마이크로 플레이트, 모세관 흐름 셀 장치 및 카트리지, 미세 유체 장치 및 카트리지 등에 분배하는 데 사용하기 위한 자동화된 프로그래밍 가능한 유체 분배 (또는 액체 분배) 시스템을 포함할 수 있다. 적합한 자동화된 프로그래밍 가능한 유체 분배 시스템은 다수의 공급업체, 예를 들어 베크만 쿨터(Beckman Coulter), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 테칸(Tecan), Velocity 11, 및 많은 다른 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다. 개시된 시스템의 바람직한 양태에서, 유체 분배 시스템은 프로그래밍 가능한 체적의 액체(예를 들어, 약 1 마이크로리터 내지 수 밀리리터 범위)를 흐름 셀 카트리지 또는 미세 유체 카트리지의 복수의 웰 또는 위치로 동시에 전달하기 위해 다중 채널 분배 헤드를 추가로 포함하는데, 예를 들어, 4 채널, 8 채널, 16 채널, 96 채널, 또는 384 채널 분배 헤드를 포함한다.
카트리지 및/또는 마이크로 플레이트 취급 (픽 앤 플레이스) 로봇: 일부 구현에서, 개시된 시스템은 광학 이미징 시스템과 관련하여 마이크로 플레이트, 모세관 흐름 셀 카트리지, 또는 미세 유체 장치 카트리지의 자동 교체 및 위치 결정을 위한, 또는 선택적으로 마이크로 플레이트, 모세관 흐름 셀 카트리지, 또는 광학 이미징 시스템과 유체 분배 시스템 사이의 미세 유체 장치 카트리지를 이동하기 위한 카트리지 및/또는 마이크로 플레이트 취급 로봇 시스템을 포함할 수 있다. 적절한 자동화되고 프로그래밍 가능한 마이크로 플레이트 취급 로봇 시스템은 베크만 쿨터, 퍼킨 엘머, 테칸, Velocity 11, 및 많은 다른 공급업체를 포함하는 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다. 개시된 시스템의 바람직한 양태에서, 자동화된 마이크로 플레이트 취급 로봇 시스템은 샘플 및/또는 시약을 포함하는 마이크로웰 플레이트의 집합체를 예를 들어 냉장 보관 유닛으로 또는 냉장 보관 유닛으로부터 이동시키도록 구성된다.
분광기 또는 이미징 모듈: 위에서 지적한 바와 같이, 일부 구현에서 개시된 분석 시스템은 광학 이미징 기능을 포함하고, 다른 분광 측정 기능도 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 이미징 모듈은 명시야, 암시야, 형광, 발광, 또는 인광 이미징을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는 당업자에게 공지된 다양한 이미징 모드 중 임의의 것으로 작동하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 유체학 서브 시스템의 하나 이상의 모세관 흐름 셀 또는 미세 유체 장치는 각각의 흐름 셀 또는 미세 유체 장치에서 하나 이상의 모세관 또는 하나 이상의 유체 채널의 적어도 섹션이 조명되고 이미징될 수 있게 하는 창을 포함한다.
일부 실시예에서, 단일 파장 여기 및 방출 형광 이미징이 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 이중 파장 여기 및 방출(또는 다중 파장 여기 또는 방출) 형광 이미징이 수행될 수 있다. 일부 경우에, 이미징 모듈은 비디오 이미지를 획득하도록 구성된다. 이미징 모드의 선택은 모세관 또는 카트리지의 전체 또는 일부가 관심 스펙트럼 범위에 걸쳐 반드시 광학적으로 투명해야 한다는 점에서 흐름 셀 장치 또는 카트리지의 설계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 경우에, 모세관 흐름 셀 카트리지 내의 복수의 모세관은 단일 이미지 내에서 전체적으로 이미징될 수 있다. 일부 경우에, 모세관 흐름 셀 카트리지 내의 단일 모세관 또는 모세관의 서브 세트만이, 또는 그 일부가, 단일 이미지 내에서 이미징될 수 있다. 일부 경우에, 일련의 이미지가 "타일링"되어 카트리지 내의 1 개, 2 개, 여러 개, 또는 전체 복수의 모세관의 단일 고 해상도 이미지를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 칩 내의 복수의 유체 채널은 단일 이미지 내에서 전체적으로 이미징될 수 있다. 일부 경우에, 미세 유체 칩 내의 단일 유체 채널 또는 유체 채널의 서브 세트만이, 또는 그 일부가, 단일 이미지 내에서 이미징될 수 있다. 일부 경우에, 일련의 이미지가 "타일링"되어 카트리지 내의 1 개, 2 개, 여러 개, 또는 전체 복수의 유체 채널의 단일 고 해상도 이미지를 생성할 수 있다.
분광기 또는 이미징 모듈은 예를 들어 CCD 카메라의 CMOS가 장착된 현미경을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 분광기 또는 이미징 모듈은 예를 들어 관심 특정 분광 또는 이미징 기술을 수행하도록 구성된 본 명세서에 설명된 이미징 모듈 중 하나와 같은 맞춤형 기기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 분광기 또는 이미징 모듈과 관련된 하드웨어에는 광원, 검출기, 및 다른 광학 구성 요소, 그리고 프로세서 또는 컴퓨터가 포함될 수 있다.
광원: 텅스텐 램프, 텅스텐-할로겐 램프, 아크 램프, 레이저, 발광 다이오드(LED), 또는 레이저 다이오드를 포함하지만 이들에 제한되지는 않는 다양한 광원들 중 임의의 것을 사용하여 이미징 또는 여기 광을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 광원과 추가 광학 구성 요소의 조합, 예를 들어 렌즈, 필터, 조리개, 다이어프램, 미러 등은 조명 시스템(또는 서브 시스템)으로 구성될 수 있다.
검출기: 포토다이오드 어레이, 전하 결합 소자(CCD) 카메라, 또는 상보형 금속 산화 반도체(CMOS) 이미지 센서를 포함하지만 이들에 국한되지는 않는 다양한 이미지 센서들 중 임의의 것이 이미징 목적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이미징 센서"는 1 차원(선형) 또는 2 차원 어레이 센서일 수 있다. 많은 경우에, 하나 이상의 이미지 센서와 추가 광학 구성 요소의 조합, 예를 들어 렌즈, 필터, 조리개, 다이어프램, 미러 등은 이미징 시스템(또는 서브 시스템)으로 구성될 수 있다. 예를 들어 이미징이 아닌 분광 측정이 시스템에 의해 수행되는 일부 경우에, 적합한 검출기는 포토다이오드, 애벌랜치 포토다이오드, 및 광전자 증배관을 포함할 수 있지만 이들에 국한되지는 않는다.
다른 광학 구성 요소: 분광 측정 또는 이미징 모듈의 하드웨어 구성 요소는 시스템을 통해 광 빔을 조향하거나, 성형하거나, 필터링하거나, 또는 포커싱하기 위한 다양한 광학 구성 요소를 또한 포함할 수도 있다. 적합한 광학 구성 요소의 예는 렌즈, 미러, 프리즘, 조리개, 회절 격자, 컬러 유리 필터, 장역 통과 필터, 단역 통과 필터, 대역 통과 필터, 협대역 간섭 필터, 광대역 간섭 필터, 다이크로익 반사기, 광섬유, 광 도파관 등을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 일부 경우에, 위에서 언급된 바와 같이, 분광 측정 또는 이미징 모듈은 조명 및/또는 검출/이미징 서브 시스템에 대해 모세관 흐름 셀 장치 및 카트리지를 이동시키기 위한 목적으로 하나 이상의 병진 스테이지 또는 다른 모션 제어 기구를 추가로 포함할 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
내부 전반사: 일부 경우에, 광학 모듈 또는 서브 시스템은 내부 전반사를 통해 여기 광을 모세관 또는 채널 루멘(들)으로 전달하기 위한 도파관으로 흐름 셀 장치 및 카트리지에서 모세관 또는 미세 유체 채널의 광학적으로 투명한 벽의 전부 또는 일부를 사용하도록 설계될 수 있다. 입사 여기 광이 표면에 대한 법선에 대해 (모세관 또는 채널 벽 재료 및 모세관 또는 채널 내의 수성 완충제의 상대 굴절률에 의해 결정되는) 임계각보다 큰 각도로 모세관 또는 채널 루멘의 표면에 부딪힐 때, 내부 전반사는 표면에서 발생하고, 광은 모세관 또는 채널의 길이를 따라 모세관 또는 채널 벽을 통해 전파된다. 내부 전반사는, 매우 짧은 거리 동안 루멘 내부를 관통하고 표면에서 형광단, 예를 들어, 폴리머라제에 의해 고체상 프라이머 연장 반응을 통해 성장하는 올리고뉴클레오티드에 통합된 라벨링된 뉴클레오티드를 선택적으로 여기시키는 데 사용될 수 있는 루멘 표면에서의 소멸파를 생성한다.
차광 하우징 및 환경 제어 챔버: 일부 구현에서, 개시된 시스템은 주변 미광이 눈부심을 생성하고 예를 들어 상대적으로 희미한 형광 신호를 흐리게 하는 것을 방지하기 위해 차광 하우징을 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 개시된 시스템은 시스템이 엄격하게 제어된 온도, 습도 수준 등 하에서 작동할 수 있게 하는 환경 제어 챔버를 포함할 수 있다.
프로세서 및 컴퓨터: 일부 경우에, 개시된 시스템은 하나 이상의 프로세서 또는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 프로세서는 중앙 처리 장치(CPU), 그래픽 처리 장치(GPU), 범용 처리 장치, 또는 컴퓨팅 플랫폼과 같은 하드웨어 프로세서일 수 있다. 프로세서는 다양한 적합한 집적 회로, 마이크로프로세서, 논리 장치, 필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이(FPGA) 등 중 임의의 것으로 구성될 수 있다. 일부 경우에, 프로세서는 단일 코어 또는 다중 코어 프로세서일 수 있거나, 또는 복수의 프로세서가 병렬 처리를 위해 구성될 수 있다. 본 개시는 프로세서를 참조하여 설명되지만, 다른 유형의 집적 회로 및 논리 장치도 또한 적용 가능하다. 프로세서는 임의의 적절한 데이터 작업 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 프로세서는 512 비트, 256 비트, 128 비트, 64 비트, 32 비트, 또는 16 비트 데이터 연산을 수행할 수 있다.
프로세서 또는 CPU는 프로그램 또는 소프트웨어로 구현될 수 있는 일련의 기계 판독 가능 명령어를 실행할 수 있다. 명령어는 메모리 위치에 저장될 수 있다. 명령어는 CPU로 보내질 수 있고, CPU는 예를 들어 본 개시의 시스템 제어 방법을 구현하도록 CPU를 후속적으로 프로그래밍하거나 또는 다르게 구성될 수 있다. CPU에 의해 수행되는 작업의 예에는 가져오기(fetch), 디코딩, 실행, 및 다시 쓰기가 포함될 수 있다.
일부 프로세서는 컴퓨터 시스템의 처리 유닛을 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 클라우드 기반 데이터 저장 및/또는 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있다. 일부 경우에, 컴퓨터 시스템은 통신 인터페이스의 도움으로 컴퓨터 네트워크("네트워크")에 작동 가능하게 커플링될 수 있다. 네트워크는 인터넷, 인트라넷 및/또는 엑스트라넷, 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 LAN(Local Area Network)일 수 있다. 일부 경우에, 네트워크는 전기 통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크는 클라우드 기반 컴퓨팅과 같은 분산 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템은 또한 컴퓨터 메모리 또는 메모리 위치(예를 들어, 랜덤 액세스 메모리, 읽기 전용 메모리, 플래시 메모리), 전자 저장 장치(예를 들어, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스(예를 들어, 네트워크 어댑터), 및 캐시, 다른 메모리 유닛, 데이터 저장 유닛 및/또는 전자 디스플레이 어댑터와 같은 주변 장치를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 통신 인터페이스를 통해 컴퓨터가 하나 이상의 추가 장치와 통신할 수 있다. 컴퓨터는 분석을 위해 커플링된 장치로부터 입력 데이터를 수신할 수 있다. 메모리 유닛, 저장 유닛, 통신 인터페이스, 및 주변 장치는 마더보드에 통합될 수 있는 것과 같이, 통신 버스(실선)를 통해 프로세서 또는 CPU와 통신할 수 있다. 메모리 또는 저장 유닛은 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 유닛(또는 데이터 저장소)일 수 있다. 메모리 또는 저장 유닛은 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램과 같은 파일을 저장할 수 있다. 메모리 또는 저장 유닛은 사용자 데이터, 예를 들어 사용자 선호도 및 사용자 프로그램을 저장할 수 있다.
본 명세서에 설명된 시스템 제어, 이미지 처리, 및/또는 데이터 분석 방법은 예를 들어, 메모리 또는 전자 저장 유닛과 같은 컴퓨터 시스템의 전자 저장 위치에 저장된 기계 실행 가능한 코드를 통해 구현될 수 있다. 기계 실행 가능한 또는 기계 판독 가능한 코드는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 사용하는 동안, 코드는 프로세서에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 코드는 저장 유닛으로부터 검색되고, 프로세서가 즉시 액세스할 수 있도록 메모리에 저장될 수 있다. 일부 경우에, 전자 저장 유닛은 배제될 수 있으며, 기계 실행 가능한 명령어가 메모리에 저장된다.
일부 경우에, 코드는 코드를 실행하도록 구성된 프로세서를 갖는 기계와 함께 사용하기 위해 사전 컴파일링되고(pre-compiled) 구성될 수 있다. 일부 경우에, 실행 시간 중에 코드가 컴파일링될 수 있다. 코드는, 코드가 사전 컴파일링된 또는 컴파일링된 방식으로 실행될 수 있도록 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 제공될 수 있다.
본 명세서에 제공된 시스템 및 방법의 일부 양태는 소프트웨어로 구현될 수 있다. 기술의 다양한 양태는 일반적으로 기계(또는 프로세서) 실행 가능한 코드 및/또는 일종의 기계 판독 가능한 매체에서 실행되거나 또는 구현되는 관련 데이터 형태의 "제품" 또는 "제조품"으로 간주될 수 있다. 기계 실행 가능한 코드는 메모리(예를 들어, 읽기 전용 메모리, 랜덤 액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크와 같은 전자 저장 유닛에 저장될 수 있다. "저장" 유형 매체는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형 메모리, 또는 그 관련 모듈, 예를 들어 소프트웨어 프로그래밍을 위해 임의의 시간에 비-일시적 저장을 제공할 수 있는 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다른 다양한 전기 통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 예를 들어, 이러한 통신은 하나의 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 컴퓨터 또는 프로세서로, 예를 들어 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터로부터 애플리케이션 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 소프트웨어 요소를 포함할 수 있는 다른 유형의 매체에는 유선 및 광학 지상 통신 네트워크를 통해 그리고 다양한 공중 링크를 통해, 로컬 장치 간의 물리적 인터페이스에 걸쳐 사용되는 것과 같은 광학, 전기 및 전자기파가 포함된다. 유선 또는 무선 링크, 광 링크 등과 같이 이러한 전파를 전달하는 물리적 요소도 또한 소프트웨어를 포함하는 미디어로 간주될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 비-일시적인, 유형의 "저장" 매체로 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능한 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령어를 제공하는 데 참여하는 임의의 매체를 의미한다.
일부 경우에, 본 개시의 시스템 제어, 이미지 처리 및/또는 데이터 분석 방법은 하나 이상의 알고리즘을 통해 구현될 수 있다. 알고리즘은 중앙 처리 장치에 의해 실행될 때 소프트웨어를 통해 구현될 수 있다.
시스템 제어 소프트웨어: 일부 경우에, 시스템은 모든 시스템 기능의 수동, 반자동, 또는 완전 자동 제어, 예를 들어, 유체 흐름 제어 모듈(들), 온도 제어 모듈(들), 및/또는 분광기 또는 이미징 모듈(들)의 제어뿐만 아니라 다른 데이터 분석 및 디스플레이 옵션, 그리고 사용자 인터페이스도 제공하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터(또는 프로세서) 및 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함할 수 있다. 시스템 컴퓨터 또는 프로세서는 시스템의 통합 구성 요소(예를 들어, 기기 내에 매립된 마이크로프로세서 또는 마더 보드)이거나 또는 독립형 모듈, 예를 들어, 메인 프레임 컴퓨터, 개인용 컴퓨터 또는 랩톱 컴퓨터일 수 있다. 시스템 제어 소프트웨어에 의해 제공되는 유체 흐름 제어 기능의 예에는 체적 유체 흐름 속도, 유체 흐름 속도, 샘플 및 시약 추가를 위한 타이밍 및 지속 시간, 완충제 추가, 및 헹굼 단계가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 시스템 제어 소프트웨어에 의해 제공되는 온도 제어 기능의 예에는 온도 설정점 지정(들) 및 온도 변화에 대한 타이밍, 지속 시간, 및 램프 속도의 제어가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 시스템 제어 소프트웨어에 의해 제공되는 분광 측정 또는 이미징 제어 기능의 예에는 오토 포커스 기능, 조명 또는 여기 광 노출 시간 및 강도의 제어, 이미지 획득 속도의 제어, 노출 시간, 및 데이터 저장 옵션이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다.
이미지 처리 소프트웨어: 일부 경우에, 시스템은 이미지 처리 및 분석 기능을 제공하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터(또는 프로세서) 및 컴퓨터 판독 가능 매체를 추가로 포함할 수 있다. 소프트웨어에서 제공할 수 있는 이미지 처리 및 분석 기능의 예는 수동, 반자동, 또는 완전 자동 이미지 노출 조정(예를 들어, 화이트 밸런스, 콘트라스트 조정, 신호 평균 및 다른 잡음 감소 기능 등), 자동화된 에지 검출 및 객체 식별(예를 들어, 모세관 흐름 셀 장치의 루멘 표면에서 형광 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 클론 증폭된 클러스터를 식별하기 위함), 자동화된 통계 분석(예를 들어, 모세관 루멘 표면의 단위 면적당 식별된 올리고뉴클레오티드의 클론 증폭된 클러스터의 개수를 결정하거나, 또는 핵산 시퀀싱 적용에서 자동화된 뉴클레오티드 염기 호출을 위함), 및 수동 측정 기능(예를 들어, 클러스터 또는 다른 객체 간의 거리 측정 등을 위함)을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 선택적으로, 기기 제어 및 이미지 처리/분석 소프트웨어는 별도의 소프트웨어 모듈로 기록될 수 있다. 일부 실시예에서, 기기 제어 및 이미지 처리/분석 소프트웨어는 통합된 패키지에 통합될 수 있다.
당업자에게 공지된 다양한 이미지 처리 방법 중 임의의 것이 이미지 처리/전처리에 사용될 수 있다. 예에는 캐니 에지 검출 방법(Canny edge detection methods), 캐니-드리체 에지 검출 방법(Canny-Deriche edge detection methods), 1 차 기울기 에지 검출 방법(예를 들어, 소벨 오퍼레이터(Sobel operator)), 2 차 미분 에지 검출 방법, 위상 합동(위상 코히어런스(phase coherence)) 에지 검출 방법, 다른 이미지 분할 알고리즘(예를 들어, 강도 임계값, 강도 클러스터링 방법, 강도 히스토그램 기반 방법 등), 특징 및 패턴 인식 알고리즘(예를 들어, 임의의 형상을 검출하기 위한 일반화된 허프 변환(generalized Hough transform), 원형 허프 변환 등), 및 수학적 분석 알고리즘(예를 들어, 푸리에 변환, 고속 푸리에 변환, 웨이블릿 분석(wavelet analysis), 자동-상관 등), 또는 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다.
핵산 시퀀싱 시스템 및 적용: 핵산 시퀀싱은 개시된 흐름 셀 장치(예를 들어, 모세관 흐름 셀 장치 또는 카트리지 및 미세 유체 장치 및 카트리지) 및 이미징 시스템에 대한 적용의 하나의 비-제한적인 예를 제공한다. 많은 "2 세대" 및 "3 세대" 시퀀싱 기술은 대규모 병렬 순환 어레이 접근 방식을 사용하여 뉴클레오티드 통합에 의한 시퀀싱을 수행하고, 여기서 고체 지지체에 테더링된 단일 가닥 템플릿 올리고뉴클레오티드 시퀀스의 정확한 디코딩은 상보적인 올리고뉴클레오티드 가닥에 폴리머라제에 의한 A, G, C, 및 T 뉴클레오티드의 단계적 추가에서 발생하는 신호를 성공적으로 분류하는 것에 의존한다. 이러한 방법들은 일반적으로 고정된 길이의 알려진 어댑터 시퀀스로 변형되는 올리고뉴클레오티드 템플릿을 필요로 하고, 어댑터 시퀀스에 상보적인 알려진 시퀀스의 표면 테더링된 캡처 프로브(여기서 내부 흐름 셀 표면에 테더링된 "어댑터" 또는 "프라이머"라고도 지칭됨)에 혼성화에 의해 무작위 또는 패터닝된 어레이로 고체 지지체(예를 들어, 개시된 모세관 흐름 셀 장치 또는 미세 유체 칩의 루멘 표면(들))에 부착되고, 그 후 예를 들어 형광 라벨링된 뉴클레오티드를 사용하여 템플릿 올리고뉴클레오티드에서 염기의 시퀀스를 식별하는 순환하는 일련의 단일 염기 추가 프라이머 연장 반응을 통해 프로빙된다. 따라서 이러한 프로세스에는 시퀀싱 반응이 수행되는 흐름 셀에 시약을 도입하는 타이밍을 정확하고 재현성 있게 제어하고 값비싼 시약의 소비를 감소시키거나 또는 최소화하기 위해 소량을 제공하는 소형화된 유체학 시스템의 사용이 필요하다.
기존의 상업적으로 이용 가능한 NGS 흐름 셀은 이미징, 냉각, 및/또는 다른 요구 사항에 필요한 엄격한 치수 허용 오차를 충족하기 위해 다른 방법에 의해 에칭되고, 랩핑되고(lapped), 및/또는 처리된 유리 층으로 구성된다. 흐름 셀을 소모품으로 사용하는 경우, 제조에 필요한 값비싼 제조 공정은 시퀀싱 실행 당 비용이 너무 높아, 연구 및 임상 분야의 과학자 및 의료 전문가가 시퀀싱에 일상적으로 액세스할 수 없다.
본 개시는 저비용 유리 또는 중합체 모세관 또는 미세 유체 채널, 유체학 어댑터, 및 카트리지 섀시를 포함하는 저비용 흐름 셀 아키텍처의 예를 제공한다. 최종 단면 기하학적 구조로 압출된 유리 또는 중합체 모세관을 사용하면 복수의 고 정밀 및 값비싼 유리 제조 공정의 필요성을 제거할 수 있다. 모세관 또는 미세 유체 채널의 배향을 강력하게 제한하고 성형 플라스틱 및/또는 엘라스토머 구성 요소를 사용하여 편리한 유체 연결을 제공하면 비용이 더욱 절감된다. 중합체 카트리지 섀시의 구성 요소를 레이저 접합하면 패스너 또는 접착제를 사용하지 않고도 모세관 또는 미세 유체 채널을 밀봉하고 모세관 또는 채널 및 흐름 셀 카트리지를 구조적으로 안정화하는 빠르고 효율적인 수단을 제공한다.
개시된 장치 및 시스템은 다양한 "뉴클레오티드 통합에 의한 시퀀싱", "뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱", "뉴클레오티드 염기 쌍형성에 의한 시퀀싱", 및 "결합활성에 의한 시퀀싱" 시퀀싱 생화학 중 임의의 것을 사용하여 핵산 시퀀싱을 수행하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 배경 신호를 최소화하면서 그 위에 배치된 형광 라벨링된 핵산 클러스터에 대한 전경 신호를 최대화하는 예를 들어 친수성 코팅된 표면을 포함하는 본 명세서에 개시된 흐름 셀 장치 설계의 개선은, 더 큰 피사계 심도 및 더 큰 시야를 제공하는 개선된 대물 렌즈 및/또는 튜브 렌즈 설계를 통해 달성되는 빠른 이중 표면 흐름 셀 이미징(내부 흐름 셀 표면의 동시 또는 거의 동시 이미징을 포함함)을 위한 광학 이미징 시스템 설계의 개선과 조합되어, 염기 호출 목적으로 사용되는 이미지에 대한 CNR을 개선시킬 수 있고, 감소된 시약 소비(개선된 흐름 셀 설계를 통해 달성됨)는 염기 호출 정확도의 극적인 개선, 이미징 사이클 시간 단축, 전체 시퀀싱 반응 사이클 시간 단축, 및 염기 당 비용 절감으로 핵산 시퀀싱 처리량을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 시스템은 다양한 상이한 시퀀싱 화학물질을 사용하여 임의의 다양한 상이한 시퀀싱 방법론을 구현하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 40은 결합활성에 의한 시퀀싱 방법을 구현하기 위한 흐름도의 비-제한적인 예를 제공한다. 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는 지지 표면, 예를 들어, 흐름 셀의 하나 이상의 내부 표면에 테더링된 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스와 함께 다가 결합 복합체를 형성하는 데 사용될 수 있어, 다가 결합 복합체는 단일 뉴클레오티드와 단일 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스 간의 결합 상호 작용에 의해 제공되는 것보다 상당히 더 긴 지속 시간을 나타낸다. 일반적으로 이러한 결합활성에 의한 시퀀싱 접근 방식은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다: 지지 표면에 테더링된 어댑터/프라이머 시퀀스에 대한 표적 핵산 시퀀스의 혼성화 단계; 지지 표면에 증폭된 표적 시퀀스의 클러스터를 생성하기 위한 클론 증폭 단계; 지지 표면을 중합체 코어에 콘쥬게이트된 복수의 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트와 접촉시키는 단계 - 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는 안정한 다가 결합 복합체를 생성하기 위해 하나 이상의 검출 가능한 라벨, 예를 들어 형광단을 추가로 포함할 수 있음 - ; 임의의 과량의 결합되지 않은 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트를 세척하는 단계; 예를 들어 지지 표면의 형광 이미징에 의한 다가 결합 복합체의 검출 단계; 표적 핵산 시퀀스에서 뉴클레오티드의 식별 단계(염기 호출); 예를 들어, 이온 강도, 이온 조성, 및/또는 완충제의 pH를 변경함으로써 다가 결합 복합체의 불안정화 단계; 흐름 셀의 헹굼 단계; 및 식별된 뉴클레오티드에 대한 상보적 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 추가하기 위해 프라이머 연장 반응을 수행하는 단계. 사이클은 시퀀스에서 추가 뉴클레오티드 염기를 식별하기 위해 반복될 수 있으며, 이어서 시퀀스 데이터의 처리 및 조합이 뒤따른다. 일부 경우에, 데이터 처리는 시퀀싱 실행이 수행될 때 실시간으로 또는 실행 후 데이터 처리 단계의 일부로서 Q-점수와 같은 시퀀싱 성능 메트릭의 계산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 광학 이미징 시스템과 조합되어 사용되는 개시된 친수성 중합체 코팅된 흐름 셀 장치는 핵산 시퀀싱 시스템에 대해 다음과 같은 추가 이점들 중 하나 이상을 부여할 수 있다: (i) (감소된 비-특이적 결합, 및 이에 따른 더 빠른 시퀀싱 사이클 시간으로 인해) 감소된 유체 세척 시간, (ii) 이미징 시간 감소(및 이에 따라 어세이 판독 및 시퀀싱 사이클에 대한 더 빠른 총 처리 시간), (iii) (감소된 사이클 시간으로 인한) 감소된 전체 작업 흐름 시간 요구, (iv) (CNR의 개선으로 인한) 검출 기기 비용 감소, (v) (CNR의 개선으로 인한) 개선된 판독(염기 호출) 정확도, (vi) 개선된 시약 안정성 및 감소된 시약 사용 요구(및 이에 따라 시약 비용 감소), 및 (vii) 핵산 증폭 실패로 인한 실행 시간 실패 감소.
핵산 시퀀싱을 수행하기 위한 본 명세서에 개시된 방법, 장치 및 시스템은 다양한 시퀀싱 적용 및 임의의 다양한 샘플 및 소스로부터 유래된 핵산 분자의 시퀀싱에 적합하다. 일부 경우에, 핵산은 다양한 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 샘플, 타액 샘플, 소변 샘플, 세포 샘플, 조직 샘플 등 중 임의의 것으로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 개시된 장치 및 시스템은 당업자에게 공지된 다양한 상이한 세포, 조직, 또는 샘플 유형 중 임의의 것으로부터 유래된 핵산 분자의 분석에 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 진핵 생물(예를 들어, 동물, 식물, 진균, 원생 생물), 고세균, 또는 유박테리아로부터 유래된 세포들, 또는 하나 이상의 유형의 세포들을 포함하는 조직 샘플로부터 추출될 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 부착 또는 비-부착 진핵 세포와 같은 원핵 또는 진핵 세포로부터 추출될 수 있다. 핵산은 예를 들어 1 차 또는 불멸화된 설치류, 돼지, 고양이, 개, 소, 말, 영장류, 또는 인간 세포주로부터 다양하게 추출된다. 핵산은 다양한 상이한 세포, 기관 또는 조직 유형 중 임의의 것으로부터 추출될 수 있다(예를 들어, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 상피 세포, 내피 세포, 뉴런, 신경교 세포, 성상교세포, 섬유아세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 배우체, 또는 심장, 폐, 뇌, 간, 신장, 비장, 췌장, 흉선, 방광, 위, 결장, 또는 소장으로부터의 세포). 핵산은 정상 세포 또는 건강한 세포로부터 추출될 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 산은 암 세포와 같은 병든 세포, 또는 숙주를 감염시키는 병원성 세포로부터 추출된다. 일부 핵산은 별개의 세포 유형 서브 세트로부터 추출될 수 있는데, 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, T 세포, 세포 독성 (킬러) T 세포, 헬퍼 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, T 세포 전구 세포, B 세포, B 세포 전구 세포, 림프 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프구, 과립구, 자연 킬러 세포, 원형질 세포, 기억 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 대식세포, 또는 이들의 임의의 조합), 미분화 인간 줄기 세포, 분화를 유도한 인간 줄기 세포, 희귀 세포(예를 들어, 순환 종양 세포(CTC), 순환 상피 세포, 순환 내피 세포, 순환 자궁 내막 세포, 골수 세포, 전구 세포, 거품 세포, 중간엽 세포, 또는 영양막)가 있다. 다른 세포가 고려되고, 본 명세서의 개시와 일치한다.
핵산은 선택적으로 예를 들어 핵산의 5' 또는 3' 말단과의 공유 또는 비-공유 결합을 통해, 라벨 및 다른 작은 분자, 큰 분자(예를 들어, 단백질, 지질, 당 등), 및 고체 또는 반-고체 지지체와 같은 하나 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티에 부착될 수 있다. 라벨은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 검출 방법 중 임의의 것을 사용하여 검출 가능한 임의의 모이어티를 포함하고, 따라서 부착된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 유사하게 검출될 수 있게 한다. 형광단과 같은 일부 라벨은 광학적으로 검출할 수 있거나 또는 가시적인 전자기 복사선을 방출한다. 대안적으로 또는 조합하여, 일부 라벨은 라벨링된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 질량 스펙트럼 데이터에서 볼 수 있게 하는 질량 태그, 또는 라벨링된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 전류 측정법 또는 전압 측정법에 의해 검출 가능하게 하는 산화 환원 태그를 포함한다. 일부 라벨은 라벨링된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 분리 및/또는 정제를 용이하게 하는 자기 태그를 포함한다. 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 종종 라벨에 부착되지 않고, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 존재를 직접 검출한다.
시퀀싱을 위해 구성된 흐름 셀 장치: 일부 경우에, 본 개시에 따른 하나 이상의 흐름 셀 장치는 핵산 시퀀싱 적용을 위해 구성될 수 있으며, 예를 들어, 여기서 2 개 이상의 내부 흐름 셀 장치 표면은 하나 이상의 캡처 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 어댑터/프라이머 올리고뉴클레오티드, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 다른 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 친수성 중합체 코팅을 포함한다. 일부 경우에, 개시된 흐름 셀 장치의 친수성 중합체 코팅된 표면은 진핵 생물 게놈의 시퀀싱에 사용하기 위해 선택된 이에 테더링된 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 흐름 셀 장치의 친수성 중합체 코팅된 표면은 원핵 생물 게놈 또는 그 일부를 시퀀싱하는 데 사용하도록 선택된 이에 테더링된 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 흐름 셀 장치의 친수성 중합체 코팅된 표면은 바이러스 게놈 또는 그 일부를 시퀀싱하는 데 사용하도록 선택된 이에 테더링된 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 흐름 셀 장치의 친수성 중합체 코팅된 표면은 전사체를 시퀀싱하는 데 사용하도록 선택된 이에 테더링된 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시의 흐름 셀 장치는 일반적으로 흐름 채널의 내부를 향하는 배향의 제1 표면, 일반적으로 흐름 채널의 내부를 향하고 추가로 일반적으로 제1 표면을 향하거나 또는 이에 평행한 배향의 제2 표면, 일반적으로 제2 흐름 채널의 내부를 향하는 제3 표면, 및 일반적으로 제2 흐름 채널의 내부를 향하고 일반적으로 제3 표면에 대향하거나 또는 이에 평행한 제4 표면을 포함할 수 있고; 여기서 상기 제2 및 제3 표면은 반사성, 투명, 또는 반투명 기판일 수 있는 일반적으로 평면인 기판의 대향 측면들 상에 위치되거나 또는 이에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 흐름 셀 내의 이미징 표면 또는 이미징 표면들은 흐름 셀의 중심 내부에 또는 흐름 셀의 2 개의 하위 단위 또는 하위 분할 간의 분할 내부에 또는 일부로서 위치될 수 있고, 여기서 상기 흐름 셀은 상단 표면 및 하단 표면을 포함할 수 있으며, 이들 중 하나 또는 둘 모두는 이용될 수 있는 그러한 검출 모드에 대해 투명할 수 있고; 여기서 하나 이상의 중합체 코팅에 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머를 포함하는 표면은 흐름 셀의 루멘 내부에 배치되거나 또는 삽입될 수 있다. 일부 경우에, 상단 및/또는 하단 표면은 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 상기 상단 및/또는 하단 표면은 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머를 포함한다. 일부 경우에, 상기 상단 또는 상기 하단 표면은 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머를 포함할 수 있다. 흐름 셀의 루멘 내에 배치되거나 또는 삽입된 표면 또는 표면들은 반사, 투명 또는 반투명 기판일 수 있는 일반적으로 평면인 기판의 한 측면, 반대 측면, 또는 양 측면에 위치되거나 또는 이에 부착될 수 있다.
일반적으로, 흐름 셀 장치 표면 상의 낮은 비-특이적 결합 코팅의 하나 이상의 층들 중 적어도 하나의 층은 올리고뉴클레오티드 분자, 예를 들어 어댑터 또는 프라이머 시퀀스를 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착하기 위한 작용기를 포함할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 층은 지지 표면 상에 침착될 때 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 시퀀스를 이미 포함할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 제3 층의 중합체 분자에 테더링된 올리고뉴클레오티드는 층 전체에 걸쳐 복수의 깊이로 분포될 수 있다.
일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자는 용액에서, 즉 표면에 중합체를 커플링 또는 침착시키기 전에, 중합체에 공유 결합된다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자는 표면에 커플링되거나 또는 침착된 후 중합체에 공유 결합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 친수성 중합체 층은 공유 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자를 포함한다. 일부 경우에, 친수성 중합체의 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 또는 적어도 5 개의 층은 복수의 공유 부착된 어댑터 또는 프라이머 분자를 포함한다.
일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 적합한 콘쥬게이션 화학물질을 사용하여 친수성 중합체의 하나 이상의 층에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 시퀀스는 아민기, 카르복실기, 티올기 등과 반응성인 모이어티를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 아민 반응성 콘쥬게이션 화학물질의 예는 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실 아지드, NHS 에스테르, 설포닐 클로라이드, 알데히드, 글리옥살, 에폭사이드, 옥시란, 카보네이트, 아릴 할라이드, 이미도에스테르, 카르보디이미드, 무수물, 및 플루오로페닐 에스테르 기를 포함하는 반응들을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 적합한 카르복실-반응성 콘쥬게이션 화학물질의 예는 카르보디이미드 화합물, 예를 들어 수용성 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·HCL)를 포함하는 반응들을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 적합한 설피드릴-반응성 콘쥬게이션 화학물질의 예는 말레이미드, 할로아세틸 및 피리딜 이황화물을 포함한다.
하나 이상의 유형의 올리고뉴클레오티드 분자가 지지 표면에 부착되거나 또는 테더링될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 유형의 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머는 스페이서 시퀀스, 어댑터-리게이팅된(ligated) 템플릿 라이브러리 핵산 시퀀스에 혼성화되기 위한 어댑터 시퀀스, 정방향 증폭 프라이머, 역방향 증폭 프라이머, 시퀀싱 프라이머, 및/또는 분자 바코딩 시퀀스, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 1 개의 프라이머 또는 어댑터 시퀀스가 표면의 적어도 하나의 층에 테더링될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 개 초과의 상이한 프라이머 또는 어댑터 시퀀스가 표면의 적어도 하나의 층에 테더링될 수 있다.
일부 경우에, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 시퀀스는 길이가 약 10 개의 뉴클레오티드 내지 약 100 개의 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 일부 경우에, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 시퀀스는 길이가 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 경우에, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 시퀀스는 길이가 최대 100, 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 또는 최대 10 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 시퀀스의 길이는 약 20 개의 뉴클레오티드 내지 약 80 개의 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 당업자는 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 시퀀스의 길이가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 24 개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 경우에, 코팅 층의 개수 및/또는 각 층의 재료 조성은 코팅된 내부 흐름 셀 표면 상의 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머(또는 다른 부착된 분자)의 결과적인 표면 밀도를 조정하도록 선택된다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 어댑터/프라이머의 표면 밀도는 ㎛2당 약 1,000 개의 프라이머 분자 내지 ㎛2당 약 1,000,000 개의 프라이머 분자 범위일 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도는 ㎛2당 적어도 1,000 개, 적어도 10,000 개, 적어도 100,000 개, 또는 적어도 1,000,000 개의 분자일 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도는 ㎛2당 최대 1,000,000, 최대 100,000, 최대 10,000 또는 최대 1,000 개의 분자일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 프라이머의 표면 밀도는 ㎛2당 약 10,000 개의 분자 내지 ㎛2당 약 100,000 개의 분자의 범위일 수 있다. 당업자는 프라이머 분자의 표면 밀도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 ㎛2당 약 455,000 개의 분자를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 경우에, 테더링된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도를 포함하여, 모세관 또는 채널 루멘 코팅의 표면 특성은 예를 들어, 고체상 핵산 혼성화 특이성 및 효율성, 및/또는 고체상 핵산 증폭 속도, 특이성, 및 효율성을 개선하거나 또는 최적화하도록 조정될 수 있다.
일부 경우에, 테더링된 어댑터 또는 프라이머 시퀀스는 저 결합 지지체 상에서 수행되는 바와 같은 핵산 증폭의 특이성 및 효율성을 촉진하도록 설계된 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 프라이머는 폴리머라제 정지점을 포함할 수 있어, 표면 콘쥬게이션 지점과 변형 부위 사이의 프라이머 시퀀스의 스트레치(stretch)는 항상 단일 가닥 형태이며 일부 헬리카제 의존적 등온 증폭 방법에서 5' 내지 3' 헬리카제에 대한 로딩 부위로 기능한다. 폴리머라제 정지점을 생성하는 데 사용될 수 있는 프라이머 변형의 다른 예에는 5' 말단을 향한 2 개의 뉴클레오티드 사이의 프라이머의 백본(backbone) 내로 PEG 사슬의 삽입, 무염기성 뉴클레오티드(즉, 퓨린 또는 피리미딘 염기를 갖지 않는 뉴클레오티드)의 삽입, 또는 헬리카제에 의해 우회될 수 있는 병변 부위가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다.
핵산 혼성화: 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 친수성 중합체 코팅된 흐름 셀 장치 표면은 단독으로 또는 유전형 분석 또는 핵산 시퀀싱 적용의 일부로서 고체상 핵산 혼성화 및/또는 고체상 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 개선된 완충제 제형과 조합되어 사용되는 경우 이점들을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 중합체 코팅된 흐름 셀 장치는 개선된 핵산 혼성화 속도 및 특이성, 및 본 개시의 다음의 추가적인 양태들 중 하나 이상을 통해 달성될 수 있는 개선된 핵산 증폭 속도 및 특이성 측면에서 이점들을 제공할 수 있다: (i) 프라이머 설계(예를 들어, 시퀀스 및/또는 변형), (ii) 고체 지지체 상의 테더링된 프라이머 밀도의 제어, (iii) 고체 지지체의 표면 조성, (iv) 고체 지지체의 표면 중합체 밀도, (v) 증폭 전에 및 증폭 동안 개선된 혼성화 조건의 사용, 및/또는 (vi) 비-특이적 프라이머 증폭을 감소시키거나 또는 템플릿 증폭 효율을 증가시키는 개선된 증폭 제형의 사용.
일부 경우에, 예를 들어 주어진 증폭 방법을 사용할 때 최적의 성능을 위한 지지를 "튜닝"하기 위해, (예를 들어, 어댑터 또는 프라이머를 표면에 테더링하는 데 사용되는 링커 분자의 길이를 변경함으로써) 코팅된 흐름 셀 표면 상의 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도 및/또는 코팅된 흐름 셀 표면으로부터 떨어진 테더링된 어댑터 또는 프라이머의 간격을 변경하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도를 조정하면 선택된 증폭 방법에 따라 달라지는 방식으로 표면 상에서 관찰되는 특이적 및/또는 비-특이적 증폭의 수준에 영향을 미칠 수 있다. 일부 경우에, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도는 지지 표면을 생성하는 데 사용되는 분자 성분의 비율을 조정함으로써 달라질 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프라이머 - PEG 콘쥬게이트가 저 결합 지지체의 최종 층을 생성하는 데 사용되는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머 - PEG 콘쥬게이트 대 비-콘쥬게이트된 PEG 분자의 비율은 다양할 수 있다. 이 경우, 테더링된 프라이머 분자의 생성된 표면 밀도는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기술들 중 임의의 것을 사용하여 추정되거나 또는 측정될 수 있다. 예에는 방사성 동위 원소 라벨링 및 카운팅 방법의 사용, 정의된 영역의 지지 표면으로부터 절단될 수 있고 고정된 체적의 적절한 용매에 수집되고 그 다음 알려진 광학 태그 농도의 교정 용액에 대한 것과 형광 신호를 비교하여 정량화될 수 있는 광학적으로 검출 가능한 태그(예를 들어, 형광 태그)를 포함하는 절단 가능한 분자의 공유 결합의 사용, 또는 형광 신호가 표면 상의 형광단의 개수와 선형적으로 관련되도록(예를 들어, 표면 상에 형광단의 상당한 자기 소광이 없도록) 보장하기 위해 라벨 반응 조건 및 이미지 획득 설정에 주의를 기울인 경우 형광 이미징 기술의 사용이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 완충제 제형과 조합하여 사용하면, 통상적인 혼성화 프로토콜에 대한 것보다 약 2 배 내지 약 20 배 더 빠른 범위의 상대 혼성화 속도를 획득할 수 있다. 일부 경우에, 상대 혼성화 속도는 기존의 혼성화 프로토콜에 대한 것의 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x, 적어도 5x, 적어도 6x, 적어도 7x, 적어도 8x, 적어도 9x, 적어도 10x, 적어도 12x, 적어도 14x, 적어도 16x, 적어도 18x, 적어도 20x, 적어도 25x, 적어도 30x, 또는 적어도 40x일 수 있다.
일부 경우에, 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 완충제 제형과 조합하여 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 사용하면, 이러한 완료 메트릭 중 임의의 것에 대해 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분, 15 분, 10 분 또는 5 분 미만의 총 혼성화 반응 시간(즉, 혼성화 반응의 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 % 완료에 도달하는 데 필요한 시간)을 생성할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 완충제 제형과 조합하여 사용하면 기존의 혼성화 프로토콜에 대한 것과 비교하여 개선된 혼성화 특이성을 획득할 수 있다. 일부 경우에, 달성될 수 있는 혼성화 특이성은 10 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 20 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 30 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 40 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 50 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 75 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 100 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 200 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 300 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 400 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 500 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 600 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 700 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 800 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 900 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 1,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 2,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 3,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 4,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 5,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 6,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 7,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 8,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 9,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치, 또는 10,000 개의 혼성화 이벤트에서 1 개의 염기 불일치보다 우수하다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 완충제 제형과 조합되어 사용하면 기존의 혼성화 프로토콜에 대한 것과 비교하여 개선된 혼성화 효율(예를 들어, 표적 올리고뉴클레오티드 시퀀스와 성공적으로 혼성화되는 지지 표면 상의 이용 가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 분율)을 획득할 수 있다. 일부 경우에, 달성될 수 있는 혼성화 효율은 하기에 명시된 임의의 입력 표적 올리고뉴클레오티드 농도에 대해 그리고 위에 명시된 임의의 혼성화 반응 시간에서 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 또는 99 %보다 우수하다. 예를 들어 혼성화 효율이 100 % 미만인 일부 경우에, 지지 표면에 혼성화된 표적 핵산 시퀀스의 생성된 표면 밀도는 표면 상의 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 시퀀스의 표면 밀도보다 작을 수 있다.
일부 경우에, 기존의 혼성화(또는 증폭) 프로토콜, 또는 개선되거나 또는 최적화된 혼성화(또는 증폭) 프로토콜을 사용하는 핵산 혼성화(또는 핵산 증폭) 적용을 위한 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치의 사용은, 지지 표면과 접촉하는 표적 (또는 샘플) 핵산 분자의 입력 농도에 대한 요구 사항이 감소될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 표적 (또는 샘플) 핵산 분자는 (즉, 어닐링 또는 증폭 전에) 약 10 pM 내지 약 1 μM 범위의 농도에서 지지 표면과 접촉될 수 있다. 일부 경우에, 표적 (또는 샘플) 핵산 분자는 적어도 10 pM, 적어도 20 pM, 적어도 30 pM, 적어도 40 pM, 적어도 50 pM, 적어도 100 pM, 적어도 200 pM, 적어도 300 pM, 적어도 400 pM, 적어도 500 pM, 적어도 600 pM, 적어도 700 pM, 적어도 800 pM, 적어도 900 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 20 nM, 적어도 30 nM, 적어도 40 nM, 적어도 50 nM, 적어도 60 nM, 적어도 70 nM, 적어도 80 nM, 적어도 90 nM, 적어도 100 nM, 적어도 200 nM, 적어도 300 nM, 적어도 400 nM, 적어도 500 nM, 적어도 600 nM, 적어도 700 nM, 적어도 800 nM, 적어도 900 nM, 또는 적어도 1 μM의 농도로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 표적 (또는 샘플) 핵산 분자는 최대 1 μM, 최대 900 nM, 최대 800 nM, 최대 700 nM, 최대 600 nM, 최대 500 nM, 최대 400 nM, 최대 300 nM, 최대 200 nM, 최대 100 nM, 최대 90 nM, 최대 80 nM, 최대 70 nM, 최대 60 nM, 최대 50 nM, 최대 40 nM, 최대 30 nM, 최대 20 nM, 최대 10 nM, 최대 1 nM, 최대 900 pM, 최대 800 pM, 최대 700 pM, 최대 600 pM, 최대 500 pM, 최대 400 pM, 최대 300 pM, 최대 200 pM, 최대 100 pM, 최대 90 pM, 최대 80 pM, 최대 70 pM, 최대 60 pM, 최대 50 pM, 최대 40 pM, 최대 30 pM, 최대 20 pM, 또는 최대 10 pM의 농도로 투여될 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 표적 (또는 샘플) 핵산 분자는 약 90 pM 내지 약 200 nM 범위의 농도로 투여될 수 있다. 당업자는 표적 (또는 샘플) 핵산 분자가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 855 nM을 갖는 농도로 투여될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 경우에, 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 혼성화 완충제 제형과 조합하여 개시된 친수성, 중합체-코팅된 흐름 셀 장치의 사용은, ㎛2당 약 0.0001 표적 올리고뉴클레오티드 분자 내지 ㎛2당 약 1,000,000 표적 올리고뉴클레오티드 분자 범위의 (즉, 임의의 후속하는 고체상 또는 클론 증폭 반응을 수행하기 전에) 혼성화된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도를 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 ㎛2당 적어도 0.0001, 적어도 0.0005, 적어도 0.001, 적어도 0.005, 적어도 0.01, 적어도 0.05, 적어도 0.1, 적어도 0.5, 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 적어도 2,000, 적어도 2,500, 적어도 3,000, 적어도 3,500, 적어도 4,000, 적어도 4,500, 적어도 5,000, 적어도 5,500, 적어도 6,000, 적어도 6,500, 적어도 7,000, 적어도 7,500, 적어도 8,000, 적어도 8,500, 적어도 9,000, 적어도 9,500, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 또는 적어도 1,000,000 개의 분자일 수 있다. 일부 경우에, 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 ㎛2당 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 9,500, 최대 9,000, 최대 8,500, 최대 8,000, 최대 7,500, 최대 7,000, 최대 6,500, 최대 6,000, 최대 5,500, 최대 5,000, 최대 4,500, 최대 4,000, 최대 3,500, 최대 3,000, 최대 2,500, 최대 2,000, 최대 1,500, 최대 1,000, 최대 900, 최대 800, 최대 700, 최대 600, 최대 500, 최대 400, 최대 300, 최대 200, 최대 100, 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 최대 10, 최대 5, 최대 1, 최대 0.5, 최대 0.1, 최대 0.05, 최대 0.01, 최대 0.005, 최대 0.001, 최대 0.0005, 또는 최대 0.0001 개의 분자일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 ㎛2당 약 3,000 개의 분자 내지 ㎛2당 약 20,000 개의 분자의 범위일 수 있다. 당업자는 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 ㎛2당 약 2,700 개의 분자를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
다르게 말하면, 일부 경우에, 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 혼성화 완충제 제형과 조합하여 개시된 저 결합 지지체의 사용은, mm2당 약 100 개의 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자 내지 mm2당 약 1 x 1012 개의 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자 범위의 (즉, 임의의 후속하는 고체상 또는 클론 증폭 반응을 수행하기 전에) 혼성화된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도를 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 mm2당 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 4,000, 적어도 5,000, 적어도 6,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 1 x 107, 적어도 5 x 107, 적어도 1 x 108, 적어도 5 x 108, 적어도 1 x 109, 적어도 5 x 109, 적어도 1 x 1010, 적어도 5 x 1010, 적어도 1 x 1011, 적어도 5 x 1011, 또는 적어도 1 x 1012 개의 분자일 수 있다. 일부 경우에, 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 mm2당 최대 1 x 1012, 최대 5 x 1011, 최대 1 x 1011, 최대 5 x 1010, 최대 1 x 1010, 최대 5 x 109, 최대 1 x 109, 최대 5 x 108, 최대 1 x 108, 최대 5 x 107, 최대 1 x 107, 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,000, 최대 500, 또는 최대 100 개의 분자일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 mm2당 약 5,000 개의 분자 내지 mm2당 약 50,000 개의 분자의 범위일 수 있다. 당업자는 혼성화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 mm2당 약 50,700 개의 분자를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 경우에, 저 결합 지지 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자에 혼성화된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 핵산 분자)는 길이가 약 0.02 킬로베이스(kb) 내지 약 20 kb 또는 약 0.1 킬로베이스(kb) 내지 약 20 kb 범위일 수 있다. 일부 경우에, 표적 올리고뉴클레오티드 분자는 적어도 0.001 kb, 적어도 0.005 kb, 적어도 0.01 kb, 적어도 0.02 kb, 적어도 0.05 kb, 적어도 0.1 kb 길이, 적어도 0.2 kb 길이, 적어도 0.3 kb 길이, 적어도 0.4 kb 길이, 적어도 0.5 kb 길이, 적어도 0.6 kb 길이, 적어도 0.7 kb 길이, 적어도 0.8 kb 길이, 적어도 0.9 kb 길이, 적어도 1 kb 길이, 적어도 2 kb 길이, 적어도 3 kb 길이, 적어도 4 kb 길이, 적어도 5 kb 길이, 적어도 6 kb 길이, 적어도 7 kb 길이, 적어도 8 kb 길이, 적어도 9 kb 길이, 적어도 10 kb 길이, 적어도 15 kb 길이, 적어도 20 kb 길이, 적어도 30 kb 길이, 또는 적어도 40 kb 길이, 또는 여기에 설명된 범위에 걸쳐 있는 임의의 중간 값, 예를 들어, 적어도 0.85 kb 길이일 수 있다.
일부 경우에, 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 핵산 분자)는 규칙적으로 발생하는 단량체 단위의 반복을 추가로 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 다량체 핵산 분자(예를 들어, 연쇄체)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 다량체 핵산 분자는 적어도 0.001 kb, 적어도 0.005 kb, 적어도 0.01 kb, 적어도 0.02 kb, 적어도 0.05 kb, 적어도 0.1 kb 길이, 적어도 0.2 kb 길이, 적어도 0.3 kb 길이, 적어도 0.4 kb 길이, 적어도 0.5 kb 길이, 적어도 1 kb 길이, 적어도 2 kb 길이, 적어도 3 kb 길이, 적어도 4 kb 길이, 적어도 5 kb 길이, 적어도 6 kb 길이, 적어도 7 kb 길이, 적어도 8 kb 길이, 적어도 9 kb 길이, 적어도 10 kb 길이, 적어도 15 kb 길이, 또는 적어도 20 kb 길이, 적어도 30 kb 길이, 또는 적어도 40 kb 길이, 또는 여기에 설명된 범위에 걸쳐 있는 임의의 중간 값, 예를 들어, 약 2.45 kb 길이일 수 있다.
일부 경우에, 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 핵산 분자)는 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 약 2 내지 약 100 개의 카피를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 다량체 핵산 분자(예를 들어, 연쇄체)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 카피의 개수는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 및 적어도 100 개일 수 있다. 일부 경우에, 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 카피의 개수는 최대 100, 최대 95, 최대 90, 최대 85, 최대 80, 최대 75, 최대 70, 최대 65, 최대 60, 최대 55, 최대 50, 최대 45, 최대 40, 최대 35, 최대 30, 최대 25, 최대 20, 최대 15, 최대 10, 최대 5, 최대 4, 최대 3, 또는 최대 2 개일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 카피의 개수는 약 4 내지 약 60 개의 범위일 수 있다. 당업자는 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 카피의 개수가 이 범위 내에서 임의의 값, 예를 들어 약 17 개를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 일부 경우에, 지지 표면의 단위 면적당 표적 시퀀스의 카피의 개수에 대한 혼성화된 표적 시퀀스의 표면 밀도는 혼성화 효율이 100 % 미만인 경우에도 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도를 초과할 수 있다.
핵산 표면 증폭(Nucleic acid surface amplification)(NASA): 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "핵산 표면 증폭"(NASA)이라는 문구는 "고체상 핵산 증폭"(또는 단순히 "고체상 증폭")이라는 문구와 상호 교환적으로 사용된다. 본 개시의 일부 양태에서, 개시된 친수성 중합체 코팅된 흐름 셀 장치와 조합하여, 개선된 증폭 속도, 증폭 특이성, 및 증폭 효율을 제공하는 핵산 증폭 제형이 설명된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 특이적 증폭은 공유적으로 또는 비-공유적으로 고체 지지체에 테더링된 템플릿 라이브러리 올리고뉴클레오티드 가닥의 증폭을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 비-특이적 증폭은 프라이머-이량체 또는 다른 비-템플릿 핵산의 증폭을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 증폭 효율은 주어진 증폭 사이클 또는 증폭 반응 동안 성공적으로 증폭되는 지지 표면 상의 테더링된 올리고뉴클레오티드의 백분율의 양이다. 본 명세서에 개시된 표면 상에서 수행된 핵산 증폭은 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 또는 98 % 또는 99 %와 같이 95 % 초과의 증폭 효율을 획득할 수 있다.
다양한 열 사이클링 또는 등온 핵산 증폭 방식 중 임의의 것이 개시된 저 결합 지지체와 함께 사용될 수 있다. 개시된 저 결합 지지체와 함께 사용될 수 있는 핵산 증폭 방법의 예는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 다중 이동 증폭(multiple displacement amplification)(MDA), 전사 매개 증폭(TMA), 핵산 시퀀스 기반 증폭(NASBA), 가닥 이동 증폭(SDA), 실시간 SDA, 브리지 증폭, 등온 브리지 증폭, 롤링 서클 증폭, 서클-대-서클 증폭, 헬리카제 의존성 증폭, 재조합효소 의존성 증폭, 또는 단일 가닥 결합(SSB) 단백질 의존성 증폭을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다.
일부 경우에, 증폭 속도, 증폭 특이성, 및 증폭 효율의 개선은, 단독으로 또는 증폭 반응 성분의 제형과 조합하여, 개시된 친수성 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 사용하여 달성될 수 있다. 뉴클레오티드를 포함하는 것 외에도, 하나 이상의 폴리머라제, 헬리카제, 단일 가닥 결합 단백질 등(또는 이들의 임의의 조합), 증폭 반응 혼합물은 완충제 유형의 선택, 완충제 pH, 유기 용매 혼합물, 완충제 점도, 세제 및 쌍성 이온성 성분, 이온 강도(1 가 및 2 가 이온 농도의 조정을 포함함), 항산화제 및 환원제, 탄수화물, BSA, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 설페이트, 베타인, 다른 첨가제 등을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 개선된 성능을 달성하기 위해 다양한 방식으로 조정될 수 있다.
개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 반응 제형과 조합하여 사용하면, 기존의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 획득된 것들에 비해 증폭 속도가 증가할 수 있다. 일부 경우에, 달성될 수 있는 상대 증폭 속도는 위에서 설명한 임의의 증폭 방법에 대한 기존의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하기 위한 것의 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 6 배, 적어도 7 배, 적어도 8 배, 적어도 9 배, 적어도 10 배, 적어도 12 배, 적어도 14 배, 적어도 16 배, 적어도 18 배, 또는 적어도 20 배일 수 있다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 완충제 제형과 조합하여 사용하면, 이러한 완료 메트릭에 대해 180 분, 120 분, 90 분, 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분, 15 분, 10 분, 5 분, 3 분, 1 분, 50 초, 40 초, 30 초, 20 초, 또는 10 초 미만의 총 증폭 반응 시간(즉, 증폭 반응의 90 %, 95 %, 98 %, 또는 99 % 완료에 도달하는 데 필요한 시간)을 획득할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 저 결합 지지체를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 완충제 제형과 조합하여 사용하면, 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분 또는 10 분 이하의 더 빠른 증폭 반응 시간(즉, 증폭 반응의 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 % 완료에 도달하는 데 필요한 시간)을 가능하게 할 수 있다. 유사하게, 개시된 저 결합 지지체를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 완충제 제형과 조합하여 사용하면, 증폭 반응이 일부 경우에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 이하의 또는 30 이하의 사이클로 완료될 수 있게 할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 반응 제형과 조합하여 사용하면, 기존의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 획득된 것과 비교하여 증가된 특이적 증폭 및/또는 감소된 비-특이적 증폭을 획득할 수 있다. 일부 경우에, 달성될 수 있는 특이적 증폭 대 비-특이적 증폭의 결과적인 비율은 적어도 4:1 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1 또는 1,000 :1 이다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 반응 제형과 조합하여 사용하면, 기존의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 획득된 것과 비교하여 증폭 효율이 증가할 수 있다. 일부 경우에, 달성될 수 있는 증폭 효율은 위에 명시된 증폭 반응 시간들 중 임의의 것에서 50 %, 60 %, 70 % 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 또는 99 %보다 우수하다.
일부 경우에, 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자에 혼성화된 클론 증폭된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 핵산 분자)는 길이가 약 0.02 킬로베이스(kb) 내지 약 20 kb 또는 약 0.1 킬로베이스(kb) 내지 약 20 kb의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 클론 증폭된 표적 올리고뉴클레오티드 분자는 적어도 0.001 kb, 적어도 0.005 kb, 적어도 0.01 kb, 적어도 0.02 kb, 적어도 0.05 kb, 적어도 0.1 kb 길이, 적어도 0.2 kb 길이, 적어도 0.3 kb 길이, 적어도 0.4 kb 길이, 적어도 0.5 kb 길이, 적어도 1 kb 길이, 적어도 2 kb 길이, 적어도 3 kb 길이, 적어도 4 kb 길이, 적어도 5 kb 길이, 적어도 6 kb 길이, 적어도 7 kb 길이, 적어도 8 kb 길이, 적어도 9 kb 길이, 적어도 10 kb 길이, 적어도 15 kb 길이, 또는 적어도 20 kb 길이, 또는 여기에 설명된 범위에 걸쳐 있는 임의의 중간 값, 예를 들어, 적어도 0.85 kb 길이일 수 있다.
일부 경우에, 클론 증폭된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 핵산 분자)는 규칙적으로 발생하는 단량체 단위의 반복을 추가로 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 다량체 핵산 분자(예를 들어, 연쇄체)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 클론 증폭된 단일 가닥 또는 이중 가닥, 다량체 핵산 분자는 적어도 0.1 kb 길이, 적어도 0.2 kb 길이, 적어도 0.3 kb 길이, 적어도 0.4 kb 길이, 적어도 0.5 kb 길이, 적어도 1 kb 길이, 적어도 2 kb 길이, 적어도 3 kb 길이, 적어도 4 kb 길이, 적어도 5 kb 길이, 적어도 6 kb 길이, 적어도 7 kb 길이, 적어도 8 kb, 적어도 9 kb 길이, 적어도 10 kb 길이, 적어도 15 kb 길이, 또는 적어도 20 kb 길이, 또는 여기에 설명된 범위에 걸쳐 있는 임의의 중간 값, 예를 들어, 약 2.45 kb 길이일 수 있다.
일부 경우에, 클론 증폭된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 핵산 분자)는 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 약 2 내지 약 100 개의 카피를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 다량체 핵산(예를 들어, 연쇄체) 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 카피의 개수는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 및 적어도 100 일 수 있다. 일부 경우에, 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 카피의 개수는 최대 100, 최대 95, 최대 90, 최대 85, 최대 80, 최대 75, 최대 70, 최대 65, 최대 60, 최대 55, 최대 50, 최대 45, 최대 40, 최대 35, 최대 30, 최대 25, 최대 20, 최대 15, 최대 10, 최대 5, 최대 4, 최대 3 또는 최대 2 일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 카피의 개수는 약 4 내지 약 60의 범위일 수 있다. 당업자는 규칙적으로 반복되는 단량체 단위의 카피의 개수가 이 범위 내에서 임의의 값, 예를 들어 약 12를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 일부 경우에, 지지 표면의 단위 면적 당 표적 시퀀스의 카피의 개수에 대해 클론 증폭된 표적 시퀀스의 표면 밀도는 혼성화 및/또는 증폭 효율이 100 % 미만인 경우에도 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도를 초과할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 반응 제형과 조합하여 사용하면, 기존의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 획득된 것과 비교하여 증가된 클론 카피의 개수를 생성할 수 있다. 예를 들어, 클론 증폭된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자가 단량체 표적 시퀀스의 연쇄된 다량체 반복을 포함하는 일부 경우에, 클론 카피의 개수는 기존의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 획득된 것보다 실질적으로 더 작을 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 클론 카피의 개수는 증폭된 콜로니 당 약 1 개의 분자 내지 약 100,000 개의 분자(예를 들어, 표적 시퀀스 분자)의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 클론 카피의 개수는 증폭된 콜로니 당 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 3,000, 적어도 4,000, 적어도 5,000, 적어도 6,000, 적어도 7,000, 적어도 8,000, 적어도 9,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 또는 적어도 100,000 개의 분자일 수 있다. 일부 경우에, 클론 카피의 개수는 증폭된 콜로니 당 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 9,000, 최대 8,000, 최대 7,000, 최대 6,000, 최대 5,000, 최대 4,000, 최대 3,000, 최대 2,000, 최대 1,000, 최대 500, 최대 100, 최대 50, 최대 10, 최대 5, 또는 최대 1 개의 분자일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 클론 카피의 개수는 약 2,000 개의 분자 내지 약 9,000 개의 분자의 범위일 수 있다. 당업자는 클론 카피의 개수가 이 범위 내에서 임의의 값, 예를 들어 일부 경우에 약 2,220 개의 분자, 또는 다른 경우에 약 2 개의 분자를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
위에서 언급된 바와 같이, 일부 경우에, 증폭된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 핵산 분자)는 단량체 표적 시퀀스의 연쇄된 다량체 반복을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 증폭된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 핵산 분자)는 각각 단일 단량체 표적 시퀀스를 포함하는 복수의 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 반응 제형과 조합하여 개시된 친수성, 중합체-코팅된 흐름 셀 장치를 사용하면, mm2당 약 100 개의 표적 시퀀스 카피 내지 mm2당 약 1 x 1012 개의 표적 시퀀스 카피 범위의 표적 시퀀스 카피의 표면 밀도를 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 표적 시퀀스 카피의 표면 밀도는 mm2당 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 1 x 107, 적어도 5 x 107, 적어도 1 x 108, 적어도 5 x 108, 적어도 1 x 109, 적어도 5 x 109, 적어도 1 x 1010, 적어도 5 x 1010, 적어도 1 x 1011, 적어도 5 x 1011, 또는 적어도 1 x 1012 개의 클론 증폭된 표적 시퀀스 분자일 수 있다. 일부 경우에, 표적 시퀀스 카피의 표면 밀도는 mm2당 최대 1 x 1012, 최대 5 x 1011, 최대 1 x 1011, 최대 5 x 1010, 최대 1 x 1010, 최대 5 x 109, 최대 1 x 109, 최대 5 x 108, 최대 1 x 108, 최대 5 x 107, 최대 1 x 107, 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,000, 최대 500, 또는 최대 100 개의 표적 시퀀스 카피일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 표적 시퀀스 카피의 표면 밀도는 mm2당 약 1,000 개의 표적 시퀀스 카피 내지 mm2당 약 65,000 개의 표적 시퀀스 카피의 범위일 수 있다. 당업자는 표적 시퀀스 카피의 표면 밀도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 mm2당 약 49,600 개의 표적 시퀀스 카피를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 저 결합 지지체를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 완충제 제형과 조합하여 사용하면, mm2당 약 100 개의 분자 내지 mm2당 약 1 x 1012 개의 콜로니 범위의 클론 증폭된 표적 (또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자 (또는 클러스터)의 표면 밀도를 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 클론 증폭 분자의 표면 밀도는 mm2당 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 1 x 107, 적어도 5 x 107, 적어도 1 x 108, 적어도 5 x 108,적어도 1 x 109, 적어도 5 x 109, 적어도 1 x 1010, 적어도 5 x 1010, 적어도 1 x 1011, 적어도 5 x 1011, 또는 적어도 1 x 1012 개의 분자일 수 있다. 일부 경우에, 클론 증폭 분자의 표면 밀도는 mm2당 최대 1 x 1012, 최대 5 x 1011, 최대 1 x 1011, 최대 5 x 1010, 최대 1 x 1010, 최대 5 x 109, 최대 1 x 109, 최대 5 x 108, 최대 1 x 108, 최대 5 x 107, 최대 1 x 107, 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,000, 최대 500, 또는 최대 100 개의 분자일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 클론 증폭 분자의 표면 밀도는 mm2당 약 5,000 개의 분자 내지 mm2당 약 50,000 개의 분자의 범위일 수 있다. 당업자는 클론 증폭된 콜로니의 표면 밀도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 mm2당 약 48,800 개의 분자를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 반응 제형과 조합하여 사용하면, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 또는 5 % 미만과 같이, 분산 계수가 50 % 이하인 증폭된 및 라벨링된 핵산 집단으로부터의 신호(예를 들어, 형광 신호)를 생성할 수 있다.
유사하게, 일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 단독으로 또는 개선되거나 또는 최적화된 증폭 반응 제형과 조합하여 사용하면, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 또는 5 % 미만과 같이, 분산 계수가 50 % 이하인 증폭된 및 비-라벨링된 핵산 집단으로부터의 신호를 생성할 수 있다.
친수성 중합체 코팅된 흐름 셀 장치 표면의 형광 이미징: 예를 들어, 그 위에 배치된, 라벨링된 표적 핵산 분자의 클론 클러스터를 포함하는 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치는 다양한 핵산 분석 적용들, 예를 들어, 핵산 염기 식별, 핵산 염기 분류, 핵산 염기 호출, 핵산 검출 적용, 핵산 시퀀싱 적용, 및 핵산 기반 (유전 및 게놈) 진단 적용 중 임의의 것에 사용될 수 있다. 이러한 많은 적용 분야에서, 형광 이미징 기술을 사용하여 저 결합 지지체 상에서 수행되는 혼성화, 증폭, 및/또는 시퀀싱 반응을 모니터링할 수 있다. 형광 이미징은 본 명세서에 개시된 광학 이미징 모듈 중 임의의 것, 뿐만 아니라 다양한 형광단, 형광 이미징 기술, 및 당업자에게 공지된 다른 형광 이미징 기기를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 경우에, 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치 및 반응 완충제 제형을 사용한 핵산 혼성화 및/또는 증폭 반응의 성능은 형광 이미징 기술을 사용하여 평가될 수 있으며, 여기서 이미지의 대조 대 잡음비(CNR)는 지지체에 대한 증폭 특이성 및 비-특이적 결합을 평가하는 데 핵심 메트릭을 제공한다. CNR은 일반적으로 다음과 같이 정의된다: CNR = (신호 - 배경) / 잡음. 배경이라는 용어는 일반적으로 특정 관심 구역(ROI)에서 특정 특징(회절 제한된 스폿)(diffraction limited spot)(DLS)을 둘러싸는 틈새 구역(interstitial regions)에 대해 측정된 신호로 간주된다. 위에서 언급된 바와 같이, 신호 대 잡음비(SNR)는 종종 전체 신호 품질의 벤치마크로 간주되지만, 개선된 CNR은 빠른 이미지 캡처가 필요한 적용들(예를 들어, 사이클 시간이 감소되거나 또는 최소화되어야 하는 시퀀싱 적용들)에서 신호 품질에 대한 벤치마크로서 SNR보다 상당한 이점을 제공할 수 있다는 것을 보여줄 수 있다. 높은 CNR에서는, CNR이 약간 개선되는 경우에도, 정확한 신호 식별(및 이에 따라 시퀀싱 적용의 경우 정확한 염기 호출)에 도달하는 데 필요한 이미징 시간이 극적으로 감소될 수 있다.
대부분의 앙상블 기반 시퀀싱 접근 방식에서, 배경이라는 용어는 일반적으로 '틈새' 구역과 관련된 신호로 측정된다. "틈새" 배경(Binter) 외에도, "내부" 배경(Bintra)이 증폭된 DNA 콜로니에 의해 점유되는 개별 구역 내에 존재한다. 이러한 2 개의 배경 신호 용어의 조합은 이미지에서 달성 가능한 CNR을 결정하고, 이후에 광학 기기 요구 사항, 아키텍처 비용, 시약 비용, 실행 시간, 비용/게놈, 및 궁극적으로 순환 어레이 기반 시퀀싱 적용의 정확도 및 데이터 품질에 직접적인 영향을 미친다. Binter 배경 신호는 다양한 소스로부터 발생한다: 몇 가지 예에는 소모품 흐름 셀로부터의 자동 형광, ROI로부터의 전경 신호를 흐리게 할 수 있는 거짓 형광 신호를 생성하는 검출 분자의 비-특이적 흡착, 및 비-특이적 DNA 증폭 생성물의 존재(예를 들어, 프라이머 이량체에서 발생하는 것들) 등이 포함된다. 일반적인 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)(NGS) 적용에서, 현재 FOV(시야각)에서의 이러한 배경 신호는 시간이 지남에 따라 평균화되고 차감된다. 개별 DNA 콜로니에서 발생하는 신호(즉, FOV에서 (S) - Binter)는 분류될 수 있는 식별 가능한 특징을 생성한다. 일부 경우에, 내부 배경(Bintra)은, 관심 표적에 특이적이지 않지만 동일한 ROI에 존재하는 교란 형광 신호에 기여할 수 있으므로, 이에 따라 평균화 및 차감하기가 훨씬 더 어렵게 된다.
본 개시의 친수성, 중합체 코팅된 기판 표면 상에 핵산 증폭의 구현은 비-특이적 결합을 감소시킴으로써 Binter 배경 신호를 감소시킬 수 있고, 특정 핵산 증폭의 개선으로 이어질 수 있으며, 틈새 및 내부 구역 모두에서 발생하는 배경 신호에 영향을 줄 수 있는 비-특이적 증폭의 감소로 이어질 수 있다. 일부 경우에, 개선된 혼성화 및/또는 증폭 반응 완충제 제형과 조합하여 선택적으로 사용되는 개시된 낮은 비-특이적 결합 지지 표면은, 기존의 지지체 및 혼성화, 증폭, 및/또는 시퀀싱 프로토콜을 사용하여 달성되는 것들보다 2, 5, 10, 100, 200, 500, 또는 1000 배의 CNR 개선으로 이어질 수 있다. 판독 또는 검출 모드로서 형광 이미징을 사용하는 맥락에서 여기에 설명되어 있지만, 동일한 원리가 광학 및 비-광학 검출 모드를 모두 포함하는 다른 검출 모드에 대해 개시된 낮은 비-특이적 결합 지지체 및 핵산 혼성화 및 증폭 제형을 사용하는 것에도 또한 적용된다.
대안적인 시퀀싱 생화학: 위에서 설명한 뉴클레오티드 통합 방식에 의한 시퀀싱 외에도, 개시된 흐름 셀 장치 및 광학 이미징 시스템은 다른 새로운 핵산 시퀀싱 생화학과도 또한 호환 가능하다. 예에는 미국 특허 번호 10,655,176 B2에 설명된 "뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱" 접근 방식 및 미국 특허 번호 10,768,173 B2에 설명된 "결합활성에 의한 시퀀싱" 접근 방식이 포함된다.
옴니옴, 인크.(Omniome, Inc.)(캘리포니아주, 샌디에이고)에서 현재 개발 중인 "뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱" 접근 방식은, 프라이머에 동족 뉴클레오티드의 공유 결합을 방지하는 조건 하에서 템플릿을 따라 각각의 위치에서 형성되는 안정화된 복합체(예를 들어, 프라이밍된 템플릿(샘플 지지 구조에 테더링됨), 폴리머라제, 및 위치에 대한 동족 뉴클레오티드를 포함하는 삼원 복합체)를 검출하고, 그런 다음 템플릿을 따라 다음 위치를 검출할 수 있도록 프라이머를 연장시키는 반복적인 사이클을 수행하는 것을 기반으로 한다. 결합에 의한 시퀀싱 접근 방식에서는, 프라이머를 다음 위치로 연장하기 전에 템플릿의 각 위치에서 뉴클레오티드의 검출이 이루어진다. 일반적으로, 이 방법론은 각 유형의 삼원 복합체(즉, 포함되는 뉴클레오티드의 유형이 다른 다양한 유형의 삼원 복합체)를 고유하게 라벨링함으로써 또는 각 유형의 삼원 복합체를 형성하는 데 필요한 시약을 별도로 전달함으로써, 핵산 템플릿을 따라 위치들에 존재할 수 있는 4 개의 다른 뉴클레오티드 유형을 구별하는 데 사용된다. 일부 경우에, 라벨은 예를 들어, 삼원 복합체에 참여하는 동족 뉴클레오티드 또는 폴리머라제의 형광 라벨을 포함할 수 있다. 따라서, 이 접근 방식은 개시된 흐름 셀 장치 및 이미징 시스템과 호환 가능하다.
엘리먼트 바이오사이언스, 인크.(Element Biosciences, Inc.)(캘리포니아주, 샌디에이고)에서 현재 개발 중인 "결합활성에 의한 시퀀싱" 접근 방식은, 복수의 개별 비-공유 결합 상호 작용을 포함하는 복합체를 형성하는 것으로부터 유도된 증가된 결합활성(avidity)(또는 "기능적 친화성(functional affinity)")에 의존한다. 엘리먼트의 접근 방식은 형광 라벨링된 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트, 폴리머라제, 및 샘플 지지 구조에 테더링된 복수의 프라이밍된 표적 핵산 분자 사이에 형성된 다가 결합 복합체의 검출을 기반으로 하고, 이는 검출/염기 호출 단계가 뉴클레오티드 통합 단계로부터 분리될 수 있게 한다. 형광 이미징을 사용하여 결합된 복합체를 검출함으로써 이에 따라 표적 핵산 시퀀스에서 N+1 개의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정한다(여기서 프라이머 연장 가닥의 길이는 N 개의 뉴클레오티드임). 이미징 단계에 이어, 다가 결합 복합체가 파괴되고 세척되며, 올바른 차단된 뉴클레오티드가 프라이머 연장 가닥에 통합되고, 사이클이 반복된다.
일부 경우에, 본 개시의 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는, 직접적으로 또는 링커를 통해, 예를 들어 뉴클레오티드의 5' 말단을 통해, 중합체 코어에 콘쥬게이트된 복수의 뉴클레오티드 모이어티 또는 뉴클레오티드 유사체 모이어티를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 뉴클레오티드 모이어티는 리보뉴클레오티드 모이어티, 리보뉴클레오티드 유사체 모이어티, 데옥시리보뉴클레오티드 모이어티, 데옥시리보뉴클레오티드 유사체 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시우리딘, 데옥시시티딘, 아데노신, 구아노신, 5-메틸-우리딘, 및/또는 시티딘을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 모이어티는 폴리머라제 반응 또는 시퀀싱 반응 동안 신장을 억제하도록 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 예를 들어 여기서 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 3' 히드록실기가 없는 뉴클레오티드; 3' 위치에 차단기를 포함하도록 변형된 뉴클레오티드; 및/또는 3'-O-아지도기, 3'-O-아지도메틸기, 3'-O-알킬 히드록실아미노기, 3'-포스포로티오에이트기, 3'-O-말로닐기, 또는 3'-O-벤질기로 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 경우에, 중합체 코어는 선형 또는 분지형 중합체를 포함할 수 있는데, 예를 들어, 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리-글리신, 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란, 단백질, 또는 다른 이러한 중합체, 또는 전술한 것 중 임의의 2 개 이상을 포함하는 공중합체, 또는 당업계에 공지된 다른 중합체를 포함하는 공중합체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 중합체는 PEG이다. 일부 경우에, 중합체는 분지형 PEG이다. 일부 경우에, 분지형 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 개 또는 그 초과의 분지 또는 아암, 또는 2, 4, 8, 16, 32, 64 개 또는 그 초과의 분지 또는 아암을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 분지 또는 아암은 중심 모이어티에서 방출될 수 있다.
일부 경우에, 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는 하나 이상의 검출 가능한 라벨들, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 20 개 초과의 검출 가능한 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 검출 가능한 라벨은 하나 이상의 형광단(예를 들어, 시아닌 염료 3(Cy3), 시아닌 염료 5(Cy5) 등), 하나 이상의 양자점, 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer)(FRET) 공여체, 및/또는 FRET 수용체를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는 중합체 코어의 각 분지 또는 분지의 서브 세트에 부착된 결합 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 결합 모이어티의 예는 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 등, 폴리히스티딘 도메인, 상보적 쌍을 이루는 핵산 도메인, G-쿼텟 형성 핵산 도메인, 칼모듈린, 말토스 결합 단백질, 셀룰라제, 말토스, 수크로스, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 글루타티온, 0-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 벤질구아닌 및 그의 유도체, 벤질시스테인 및 그의 유도체, 항체, 에피토프, 단백질 A, 또는 단백질 G를 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 결합 모이어티는 단백질들 사이, 단백질과 리간드 사이, 단백질과 핵산 사이, 핵산들 사이, 또는 작은 분자 상호 작용 도메인들 또는 모이어티들 사이에 결합을 형성하거나 또는 상호 작용을 촉진하도록 당업계에 공지된 임의의 상호 작용 분자 또는 그 단편일 수 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 결합활성에 의한 시퀀싱 접근 방식에서, 다가 결합 복합체는 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트의 뉴클레오티드 모이어티가 표적 시퀀스의 뉴클레오티드 잔기에 상보적일 때 예를 들어 형광 라벨링된 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트, 폴리머라제, 및 샘플 지지 구조(예를 들어, 흐름 셀 표면)에 테더링된 복수의 프라이밍된 표적 핵산 분자 사이에 형성된다. 이와 같이 형성된 다가 결합 복합체의 안정성은 시퀀싱 반응 사이클에서 검출/염기 호출 단계가 뉴클레오티드 통합 단계로부터 분리될 수 있게 한다.
다가 결합 복합체 - 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트의 2 개 이상의 뉴클레오티드 모이어티, 2 개 이상의 폴리머라제 분자, 및 2 개 이상의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스 사이에 형성된 삼원 복합체 - 의 안정성은 복합체의 연장된 지속 시간에 의해 입증된다. 예를 들어, 일부 경우에, 상기 다가 결합 복합체(삼원 복합체)는 0.5 초 미만, 1 초 미만, 1 초 초과, 2 초 초과, 3 초 초과, 4 초 초과, 5 초 초과, 10 초 초과, 15 초 초과, 20 초 초과, 30 초 초과, 60 초 초과, 120 초 초과, 360 초 이상, 720 초 초과, 1,440 초 초과, 3,600 초 초과, 또는 그 이상, 또는 이들 값들 중 임의의 2 개 이상에 의해 정의된 범위 내의 시간 동안의 지속 시간을 가질 수 있다.
폴리머라제 및 프라이밍된 표적 핵산과 다가 결합 복합체를 형성하기 위해 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트의 사용은, 단일 비-콘쥬게이트된 또는 비-테더링된 뉴클레오티드를 사용하여 달성될 평균 뉴클레오티드 농도에 비해 수배 증가된 뉴클레오티드의 유효 국부 농도를 발생시키고, 이는 차례로 복합체의 안정성을 향상시키고 세척 단계에 이후에 신호 강도를 증가시킨다. 높은 신호 강도는 결합, 세척, 및 이미징 단계 전반에 걸쳐 지속되며, 이미지 획득 시간을 단축하는 데 기여한다. 이미징 단계 후, 다가 결합 복합체는 예를 들어 이온 조성, 이온 강도, 및/또는 완충제의 pH를 변경함으로써 불안정화되고, 세척될 수 있다. 그런 다음 프라이머 연장 반응이 수행되어 상보적 가닥을 하나의 염기만큼 연장시킬 수 있다.
핵산 시퀀싱 시스템 성능: 일부 경우에, 개시된 광학 이미징 시스템 중 하나 이상과 조합하여 사용되는 개시된 흐름 셀 장치 중 하나 이상을 포함하고 선택적으로 위에서 설명된 "트래핑에 의한 시퀀싱(sequencing-by-trapping)" (또는 "결합활성에 의한 시퀀싱") 접근 방식과 같은 새로운 시퀀싱 생화학 중 하나를 사용하는 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은, 예를 들어, 샘플 입력 요구 사항 감소, 이미지 획득 사이클 시간 감소, 시퀀싱 반응 사이클 시간 단축, 시퀀싱 실행 시간 단축, 염기 호출 정확도 개선, 시약 소비 및 비용 감소, 시퀀싱 처리량 증가, 및 시퀀싱 비용 감소의 측면에서 개선된 핵산 시퀀싱 성능을 제공할 수 있다.
핵산 샘플 입력(pM): 일부 경우에, 개시된 시스템에 대한 샘플 입력 요구는 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치 및 이미징 시스템을 사용하여, 달성될 수 있는 개선된 혼성화 및 증폭 효율, 및 염기 호출을 위해 획득될 수 있는 높은 CNR 이미지로 인해 상당히 감소될 수 있다. 일부 경우에, 개시된 시스템에 대한 핵산 샘플 입력 요구는 약 1 pM 내지 약 10,000 pM 범위일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 샘플 입력 요구는 적어도 1 pM, 적어도 2 pM, 적어도 5 pM, 적어도 10 pM, 적어도 20 pM, 적어도 50 pM, 적어도 100 pM, 적어도 200 pM, 적어도 500 pM, 적어도 1,000 pM, 적어도 2,000 pM, 적어도 5,000 pM, 적어도 10,000 pM일 수 있다. 일부 경우에, 개시된 시스템에 대한 핵산 샘플 입력 요구는 최대 10,000 pM, 최대 5,000 pM, 최대 2,000 pM, 최대 1,000 pM, 최대 500 pM, 최대 200 pM, 최대 100 pM, 최대 50 pM, 최대 20 pM, 최대 10 pM, 최대 5 pM, 최대 2 pM, 또는 최대 1 pM일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 개시된 시스템에 대한 핵산 샘플 입력 요구는 약 5 pM 내지 약 500 pM 범위일 수 있다. 당업자는 핵산 샘플 입력 요구가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 132 pM을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하나의 예시적인 예에서, 약 100 pM의 핵산 샘플 입력은 신뢰할 수 있는 염기 호출을 위한 신호를 생성하기에 충분하다.
핵산 샘플 입력(나노그램): 일부 경우에, 개시된 시스템에 대한 핵산 샘플 입력 요구는 약 0.05 나노그램 내지 약 1,000 나노그램 범위일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 샘플 입력 요구는 적어도 0.05 나노그램, 적어도 0.1 나노그램, 적어도 0.2 나노그램, 적어도 0.4 나노그램, 적어도 0.6 나노그램, 적어도 0.8 나노그램, 적어도 1.0 나노그램, 적어도 2 나노그램, 적어도 4 나노그램, 적어도 6 나노그램, 적어도 8 나노그램, 적어도 10 나노그램, 적어도 20 나노그램, 적어도 40 나노그램, 적어도 60 나노그램, 적어도 80 나노그램, 적어도 100 나노그램, 적어도 200 나노그램, 적어도 400 나노그램, 적어도 600 나노그램, 적어도 800 나노그램, 또는 적어도 1,000 나노그램일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 샘플 입력 요구는 최대 1,000 나노그램, 최대 800 나노그램, 최대 600 나노그램, 최대 400 나노그램, 최대 200 나노그램, 최대 100 나노그램, 최대 80 나노그램, 최대 60 나노그램, 최대 40 나노그램, 최대 20 나노그램, 최대 10 나노그램, 최대 8 나노그램, 최대 6 나노그램, 최대 4 나노그램, 최대 2 나노그램, 최대 1 나노그램, 최대 0.8 나노그램, 최대 0.6 나노그램, 최대 0.4 나노그램, 최대 0.2 나노그램, 최대 0.1 나노그램, 또는 최대 0.05 나노그램일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 개시된 시스템에 대한 핵산 샘플 입력 요구는 약 0.6 나노그램 내지 약 400 나노그램 범위일 수 있다. 당업자는 핵산 샘플 입력 요구가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 2.65 나노그램을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
흐름 셀을 타일링하는 데 필요한 FOV 이미지의 개수 : 일부 경우에, 개시된 광학 이미징 모듈의 시야(FOV)는 본 개시의 다중 채널(또는 다중 레인) 흐름 셀(즉, 그 유체 채널 부분)이 약 10 개의 FOV 이미지(또는 "프레임") 내지 약 1,000 개의 FOV 이미지(또는 "프레임")를 타일링함으로써 이미징될 수 있을 만큼 충분히 크다. 일부 경우에, 전체 다중 채널 흐름 셀의 이미지는 적어도 10 개, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850, 적어도 900, 적어도 950, 또는 적어도 1,000 개의 FOV 이미지(또는 "프레임")를 타일링하는 것을 필요로 할 수 있다. 일부 경우에, 전체 다중 채널 흐름 셀의 이미지는 최대 1,000, 최대 950, 최대 900, 최대 850, 최대 800, 최대 750, 최대 700, 최대 650, 최대 600, 최대 550, 최대 500, 최대 450, 최대 400, 최대 350, 최대 300, 최대 250, 최대 200, 최대 150, 최대 100, 최대 90, 최대 80, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 또는 최대 10 개의 FOV 이미지(또는 "프레임")를 타일링하는 것을 필요로 할 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 전체 다중 채널 흐름 셀의 이미지는 약 30 내지 100 개의 FOV 이미지를 타일링하는 것을 필요로 할 수 있다. 당업자는 일부 경우에 필요한 FOV 이미지의 개수가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 54 개의 FOV 이미지를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
이미징 사이클 시간: 일부 경우에, 큰 FOV, 이미지 센서 응답 감도, 및/또는 빠른 FOV 변환 시간의 조합으로 이미징 사이클 시간(즉, 전체 다중 채널 흐름 셀(또는 그 유체 채널 부분)을 타일링하기 위해 충분한 개수의 FOV 이미지를 획득하는 데 필요한 시간)을 단축할 수 있다. 일부 경우에, 이미징 사이클 시간은 약 10 초 내지 약 10 분의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 이미징 사이클 시간은 적어도 10 초, 적어도 20 초, 적어도 30 초, 적어도 40 초, 적어도 50 초, 적어도 1 분, 적어도 2 분, 적어도 3 분, 적어도 4 분, 적어도 5 분, 적어도 6 분, 적어도 7 분, 적어도 8 분, 적어도 9 분, 또는 적어도 10 분일 수 있다. 일부 경우에, 이미징 사이클 시간은 최대 10 분, 최대 9 분, 최대 8 분, 최대 7 분, 최대 6 분, 최대 5 분, 최대 4 분, 최대 3 분, 최대 2 분, 최대 1 분, 최대 50 초, 최대 40 초, 최대 30 초, 최대 20 초 또는 최대 10 초일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 이미징 사이클 시간은 약 20 초 내지 약 1 분의 범위일 수 있다. 당업자는 일부 경우에 이미징 사이클 시간이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 57 초를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
시퀀싱 사이클 시간: 일부 경우에, 예를 들어, 개시된 친수성 중합체 코팅된 흐름 셀에 대한 감소된 세척 시간 요구로 인해 시퀀싱 반응 단계가 단축되면, 전체 시퀀싱 사이클 시간이 단축될 수 있다. 일부 경우에, 개시된 시스템에 대한 시퀀싱 사이클 시간은 약 1 분 내지 약 60 분의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 시퀀싱 사이클 시간은 적어도 1 분, 적어도 2 분, 적어도 3 분, 적어도 4 분, 적어도 5 분, 적어도 6 분, 적어도 7 분, 적어도 8 분, 적어도 9 분, 적어도 10 분, 적어도 15 분, 적어도 20 분, 적어도 25 분, 적어도 30 분, 적어도 35 분, 적어도 40 분, 적어도 45 분, 적어도 50 분, 적어도 55 분, 또는 적어도 60 분일 수 있다. 일부 경우에, 시퀀싱 반응 사이클 시간은 최대 60 분, 최대 55 분, 최대 50 분, 최대 45 분, 최대 40 분, 최대 35 분, 최대 30 분, 최대 25 분, 최대 20 분, 최대 15 분, 최대 10 분, 최대 9 분, 최대 8 분, 최대 7 분, 최대 6 분, 최대 5 분, 최대 4 분, 최대 3 분, 최대 2 분, 또는 최대 1 분일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 시퀀싱 사이클 시간은 약 2 분 내지 약 15 분의 범위일 수 있다. 당업자는 일부 경우에 시퀀싱 사이클 시간이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 1 분, 12 초를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
시퀀싱 판독 길이: 일부 경우에, 개시된 이미징 시스템과 조합된 개시된 친수성, 중합체 코팅된 흐름 셀 장치를 사용하여 달성될 수 있는 향상된 CNR 이미지, 및 일부 경우에는 보다 약한 시퀀싱 생화학의 사용은 개시된 시스템에 대해 더 긴 시퀀싱 판독 길이를 가능하게 할 수 있다. 일부 경우에, 최대 (단일 판독) 판독 길이는 약 50 bp 내지 약 500 bp 범위일 수 있다. 일부 경우에, 최대 (단일 판독) 판독 길이는 적어도 50 bp, 적어도 100 bp, 적어도 150 bp, 적어도 200 bp, 적어도 250 bp, 적어도 300 bp, 적어도 350 bp, 적어도 400 bp, 적어도 450 bp, 또는 적어도 500 bp일 수 있다. 일부 경우에, 최대 (단일 판독) 판독 길이는 최대 500 bp, 최대 450 bp, 최대 400 bp, 최대 350 bp, 최대 300 bp, 최대 250 bp, 최대 200 bp, 최대 150 bp, at 최대 100 bp 또는 최대 50 bp일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에 최대 (단일 판독) 판독 길이는 약 100 bp 내지 약 450 bp 범위일 수 있다. 당업자는 일부 경우에 최대 (단일 판독) 판독 길이가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 380 bp를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
시퀀싱 실행 시간: 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템에 대한 시퀀싱 실행 시간은 약 8 시간 내지 약 20 시간의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 시퀀싱 실행 시간은 적어도 8 시간, 적어도 9 시간, 적어도 10 시간, 적어도 12 시간, 적어도 14 시간, 적어도 16 시간, 적어도 18 시간, 또는 적어도 20 시간이다. 일부 경우에, 시퀀싱 실행 시간은 최대 20 시간, 최대 18 시간, 최대 16 시간, 최대 14 시간, 최대 12 시간, 최대 10 시간, 최대 9 시간 또는 최대 8 시간이다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 시퀀싱 실행 시간은 약 10 시간 내지 약 16 시간의 범위일 수 있다. 당업자는 일부 경우에 시퀀싱 실행 시간이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 7 시간, 35 분을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
평균 염기 호출 정확도: 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 시퀀싱 실행 과정에 걸쳐 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 92 %, 적어도 94 %, 적어도 96%, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 %, 또는 적어도 99.9 % 정확한 평균 염기 호출 정확도를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 호출된 1,000 개의 염기, 10,0000 개의 염기, 25,000 개의 염기, 50,000 개의 염기, 75,000 개의 염기, 또는 100,000 개의 염기마다 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 92 %, 적어도 94 %, 적어도 96 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 %, 또는 적어도 99.9 % 정확한 평균 염기 호출 정확도를 제공할 수 있다.
평균 Q-점수: 일부 경우에, 시퀀싱 실행의 품질 또는 정확도는 프레드 품질 점수(Phred quality score)(품질 점수 또는 "Q-점수"라고도 함)를 계산함으로써 평가될 수 있으며, 이는 주어진 염기가 시퀀싱 시스템에 의해 잘못 호출될 확률을 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 특정 시퀀싱 화학 및/또는 시퀀싱 시스템에 대한 염기 호출 정확도는 알려진 핵산 시퀀스의 라이브러리에서 시퀀싱 실행을 수행하여 유도된 대규모 경험적 데이터 세트에 대해 평가될 수 있다. Q-점수는 이 경우 다음 방정식에 따라 계산될 수 있다:
Q = -10 log10 P
여기서 P는 염기 호출 오류 확률이다. 예를 들어, Q-점수가 30이면, 1000 개의 염기가 호출될 때마다 1의 염기 호출 오류(또는 99.9 %의 염기 호출 정확도)를 만들 확률을 나타낸다.
일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 보다 정확한 염기 판독을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 약 20 내지 약 50 범위의 시퀀싱 실행에 걸쳐 염기 호출 정확도에 대한 Q-점수를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 실행에 대한 평균 Q-점수는 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 또는 적어도 50일 수 있다. 당업자는 평균 Q-점수가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 32를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
Q-점수 대 식별된 % 뉴클레오티드: 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오티드의 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %에 대해 20 초과의 Q-점수를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오티드의 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %에 대해 25 초과의 Q-점수를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오티드의 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %에 대해 30 초과의 Q-점수를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오티드의 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %에 대해 35 초과의 Q-점수를 제공할 수 있다. 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오티드의 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %에 대해 40 초과의 Q-점수를 제공할 수 있다. 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오티드의 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %에 대해 45 초과의 Q-점수를 제공할 수 있다. 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오티드의 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %에 대해 50 초과의 Q-점수를 제공할 수 있다.
시약 소비: 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 예를 들어 유체 채널 체적 및 사체적을 최소화하는 개시된 흐름 셀 장치 및 유체 시스템의 사용으로 인해 더 낮은 시약 소비율 및 비용을 가질 수 있다. 일부 경우에, 따라서 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 Illumina MiSeq 시퀀서에 의해 소비되는 것보다 시퀀싱된 Gbase 당 체적 기준으로 평균 적어도 5 % 더 적은, 적어도 10 % 더 적은, 적어도 15 % 더 적은, 적어도 20 % 더 적은, 적어도 25 % 더 적은, 적어도 30 % 더 적은, 적어도 35 % 더 적은, 적어도 40 % 더 적은, 적어도 45 % 더 적은, 또는 적어도 50 % 더 적은 시약을 필요로 할 수 있다.
시퀀싱 처리량: 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 약 50 Gbase/run 내지 약 200 Gbase/run 범위의 시퀀싱 처리량을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 시퀀싱 처리량은 적어도 50 Gbase/run, 적어도 75 Gbase/run, 적어도 100 Gbase/run, 적어도 125 Gbase/run, 적어도 150 Gbase/run, 적어도 175 Gbase/run, 또는 적어도 200 Gbase/run일 수 있다. 일부 경우에, 시퀀싱 처리량은 최대 200 Gbase/run, 최대 175 Gbase/run, 최대 150 Gbase/run, 최대 125 Gbase/run, 최대 100 Gbase/run, 최대 75 Gbase/run 또는 최대 50 Gbase/run일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 시퀀싱 처리량은 약 75 Gbase/run 내지 약 150 Gbase/run의 범위일 수 있다. 당업자는 일부 경우에 시퀀싱 처리량이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 119 Gbase/run을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
시퀀싱 비용: 일부 경우에, 개시된 핵산 시퀀싱 시스템은 Gbase당 약 $ 5 내지 Gbase당 약 $ 30 범위의 비용으로 핵산 시퀀싱을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 시퀀싱 비용은 Gbase당 적어도 $ 5, Gbase당 적어도 $ 10, Gbase당 적어도 $ 15, Gbase당 적어도 $ 20, Gbase당 적어도 $ 25 또는 Gbase당 적어도 $ 30일 수 있다. 일부 경우에, 시퀀싱 비용은 Gbase당 최대 $ 30, Gbase당 최대 $ 25, Gbase당 최대 $ 20, Gbase당 최대 $ 15, Gbase당 최대 $ 10, 또는 Gbase당 최대 $ 30일 수 있다. 이 단락에 설명된 하한 및 상한 값 중 임의의 값은 조합되어 본 개시에 포함된 범위를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 일부 경우에, 시퀀싱 비용은 Gbase당 약 $ 10 내지 Gbase당 약 $ 15의 범위일 수 있다. 당업자는 일부 경우에 시퀀싱 비용이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 Gbase당 약 $ 7.25를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
예들
이러한 예들은 설명의 목적으로만 제공되며 여기에 제공된 청구 범위를 제한하지 않는다.
예 1 - 게놈학 적용을 위한 형광 이미징 모듈에 대한 설계 사양
본 개시의 형광 이미징 모듈에 대한 설계 사양의 비-제한적인 예가 표 1에 제공된다.
표 1. 게놈학 적용을 위한 형광 이미징 모듈에 대한 설계 사양의 예들.
Figure pct00001
예 2 - 유리 미세 유체 흐름 셀 장치의 제작
흐름 셀로 사용하기 위한 미세 유체 장치의 웨이퍼 스케일 제작은 도 36a 내지 도 36c에 도시된 공정 및 포커싱된 펨토초 레이저 포토 어블레이션 및/또는 레이저 유리 접합과 같은 처리 기술 중 하나를 사용하여, 유리, 예를 들어, 붕규산염 유리, 용융 실리카 유리, 또는 석영으로 이루어진 예를 들어 1 개, 2 개 또는 3 개의 층으로 구성될 수 있다.
도 36a에서, 제1 웨이퍼는 웨이퍼 재료를 어블레이팅하고 패터닝된 표면을 제공하기 위해 (예를 들어, 펨토초 레이저 방사선을 생성하는) 레이저로 처리된다. 패터닝된 웨이퍼 표면은 복수의 미세 유체 장치(예를 들어, 210 mm 직경 웨이퍼당 12 개의 장치)를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 복수의 유체 채널을 포함할 수 있다. 처리된 웨이퍼는 그 다음 예를 들어 필름으로 밀봉함으로써 또는 장치를 다른 지지 표면에 클램핑함으로써 선택적으로 후속적으로 밀봉될 수 있는 개방 유체 채널을 포함하는 개별 미세 유체 칩을 생성하도록 다이싱될(diced) 수 있다.
도 36b에 도시된 바와 같이, 제1 웨이퍼는 패터닝된 표면을 생성하도록 처리되고, 그 후 유체 채널을 밀봉하기 위해 제2 웨이퍼와 접촉하여 배치되고 접합될 수 있다. 예를 들어 유리 웨이퍼, 실리콘 웨이퍼 등과 같이 사용되는 재료에 따라, 예를 들어 열 접합 공정, 양극 접합 공정, 레이저 유리 접합 공정 등을 사용하여 접합이 수행될 수 있다. 제2 웨이퍼는 2 개의 웨이퍼 구성 요소의 인터페이스에서 장치의 유체 채널 및/또는 유체 챔버(예를 들어, 내부 부분)를 형성하기 위해 패터닝된 표면을 갖는 웨이퍼 상의 홈, 만입부, 및/또는 애퍼처를 덮고 및/또는 밀봉한다. 접합된 구조는 그 후 개별 미세 유체 칩, 예를 들어 직경 210 mm 웨이퍼 당 12 개의 미세 유체 칩으로 다이싱될 수 있다.
도 36c에서, 제1 웨이퍼는 웨이퍼의 전체 두께를 통해 절단되거나 또는 에칭되는(즉, 웨이퍼의 어느 한 표면에서 개방되는) 유체 채널의 패턴을 생성하도록 처리된다. 그 다음, 제1 웨이퍼는 일 측면의 제2 웨이퍼와 다른 측면의 제3 웨이퍼 사이에 끼워져 이들에 접합된다. 예를 들어 유리 웨이퍼, 실리콘 웨이퍼 등과 같이 사용되는 재료에 따라, 예를 들어 열 접합 공정, 양극 접합 공정, 레이저 유리 접합 공정 등을 사용하여 접합이 수행될 수 있다. 제2 및 제3 웨이퍼는 장치의 유체 채널 및/또는 유체 챔버(예를 들어, 내부 부분)를 형성하기 위해 제1 웨이퍼의 홈, 만입부, 및/또는 애퍼처를 덮고 및/또는 밀봉한다. 접합된 구조는 그 후 개별 미세 유체 칩, 예를 들어 직경 210 mm 웨이퍼 당 12 개의 미세 유체 칩으로 다이싱될 수 있다.
예 3 - 친수성 중합체 코팅으로 흐름 셀 표면을 코팅
준비된 유리 채널을 KOH로 세척한 후, 에탄올로 헹구고, 그 후 65 ℃에서 30 분 동안 실란 처리를 수행함으로써 유리 흐름 셀 장치가 코팅되었다. 유체 채널 표면은 EDC-NHS로 30 분 동안 활성화되었고, 그 후 활성화된 표면을 5 ㎛ 프라이머로 20 분 동안 배양함으로써 올리고뉴클레오티드 프라이머를 그래프팅한 다음, 30 ㎛의 아미노 말단 폴리에틸렌 글리콜(PEG-NH2)로 패시베이팅된다(passivation).
다층 표면은 설명한 접근 방식에 따라 제조되고, 여기서 PEG-NH2 패시베이션 단계 이후에, 다중 아암 PEG-NHS가 유체 채널을 통해 흐르고, 이어서 PEG-NH2를 또 다시 첨가하고, 그 후 선택적으로 PEG-NHS와 함께 또 다른 배양이 이루어지고, 그 후 선택적으로 다중 아암 PEG-NH2와 함께 또 다른 배양이 이루어진다. 이러한 표면의 경우, 프라이머는 임의의 단계에서, 특히 다중 아암 PEG-NH2를 마지막으로 첨가한 후에 그래프팅될 수 있다.
예 4 - 핵산 시퀀싱을 위한 흐름 셀 장치
도 37a는 1-피스 유리 미세 유체 칩/흐름 셀 설계의 비-제한적인 예를 도시한다. 이 설계에서, 유체 채널 및 입구/출구 구멍은 예를 들어 포커싱된 펨토초 레이저 방사선을 사용하여 제조될 수 있다. 흐름 셀 장치에는 2 개의 유체 채널("레인")이 있으며, 각 유체 채널은 예를 들어 각각 26 개 프레임의 2 행을 포함하여(즉, 여기서 "프레임"이 해당 이미징 모듈에 대한 시야와 동등한 이미지 영역임), 타일링 2 x 26 = 52 이미지로 전체 유체 채널을 이미징하기에 충분하다. 유체 채널은 예를 들어 약 100 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 유체 채널(1)은 입구 구멍(A1) 및 출구 구멍(A2)을 가지며, 유체 채널(2)은 입구 구멍(B1) 및 출구 구멍(B2)을 갖는다. 흐름 셀 장치는 또한 1D 선형, 사람 판독 가능 및/또는 기계 판독 가능 바코드, 및 선택적으로 2D 매트릭스 바코드를 포함할 수 있다.
도 37b는 2-피스 유리 미세 유체 칩/흐름 셀 설계의 비-제한적인 예를 예시한다. 이 설계에서, 유체 채널 및 입구/출구 구멍은 예를 들어 포커싱된 펨토초 레이저 포토 어블레이션 또는 포토리소그래피 및 화학적 에칭 프로세스를 사용하여 제조될 수 있다. 2 개의 피스는 위에서 설명한 바와 같은 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 함께 접합될 수 있다. 입구 및 출구 구멍은 구조의 상단 층에 위치될 수 있고, 장치의 내부 부분에 형성된 유체 채널 및/또는 유체 챔버 중 적어도 하나와 유체 연통하는 방식으로 배향될 수 있다. 흐름 셀 장치에는 2 개의 유체 채널이 있으며, 도 37a에 도시된 장치와 마찬가지로, 각 유체 채널은 예를 들어 각 행에 26 개의 프레임이 있는 2 개의 행을 포함한다. 유체 채널은 예를 들어 약 100 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 유체 채널(1)은 입구 구멍(A1) 및 출구 구멍(A2)을 가지며, 유체 채널(2)은 입구 구멍(B1) 및 출구 구멍(B2)을 갖는다. 흐름 셀 장치는 또한 1D 선형, 사람 판독 가능 및/또는 기계 판독 가능 바코드, 및 선택적으로 2D 매트릭스 바코드를 포함할 수 있다.
도 37c는 3-피스 유리 미세 유체 칩/흐름 셀 설계의 비-제한적인 예를 도시한다. 이 설계에서, 유체 채널 및 입구/출구 구멍은 예를 들어 포커싱된 펨토초 레이저 포토 어블레이션 또는 포토리소그래피 및 화학적 에칭 프로세스를 사용하여 제조될 수 있다. 3 개의 피스는 위에서 설명한 바와 같은 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 함께 접합될 수 있다. 제1 웨이퍼(유체 채널 또는 유체 챔버의 관통 패턴을 포함함)는 일 측면의 제2 웨이퍼와 다른 측면의 제3 웨이퍼 사이에 끼워져 이들에 접합될 수 있다. 입구 및 출구 구멍은 구조의 상단 층에 위치될 수 있고, 장치의 내부 부분에 형성된 유체 채널 및/또는 유체 챔버 중 적어도 하나와 유체 연통하는 방식으로 배향될 수 있다. 흐름 셀 장치에는 2 개의 유체 채널이 있으며, 도 37a 및 도 37b에 도시된 장치와 같이, 각 유체 채널은 각 행에 26 개의 프레임이 있는 2 개의 행을 가지고 있다. 유체 채널은 예를 들어 약 100 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 유체 채널(1)은 입구 구멍(A1) 및 출구 구멍(A2)을 가지며, 유체 채널(2)은 입구 구멍(B1) 및 출구 구멍(B2)을 갖는다. 흐름 셀 장치는 또한 1D 선형, 사람 판독 가능 및/또는 기계 판독 가능 바코드, 및 선택적으로 2D 매트릭스 바코드를 포함할 수 있다.
예 5 - 모세관 흐름 셀에서 핵산 클러스터의 이미징
핵산 클러스터는 모세관 내에 확립되었고, 형광 이미징이 수행되었다. 모세관 튜브를 갖는 흐름 장치가 테스트를 위해 사용되었다. 결과적인 클러스터 이미지의 예가 도 38에 제시되어 있다. 도면은 본 명세서에 개시된 모세관 흐름 셀 장치의 루멘 내에서 증폭에 의해 형성된 핵산 클러스터가 안정적으로 형성되고 시각화될 수 있다는 것을 입증했다.
예 6 - 플라스틱 샘플 지지 구조
일부 경우에, 개시된 샘플 지지 구조는 중합체로 제작될 수 있다. 샘플 지지 구조, 예를 들어 모세관 흐름 셀 장치를 제조할 수 있는 재료의 예들은 폴리스티렌(PS), 거대 다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PmmA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 환형 올레핀 중합체(COP), 환형 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 유리 및 플라스틱 기판 둘 모두를 포함하는 다양한 조성물이 또한 고려된다.
본 명세서에 개시된 표면 코팅 목적을 위한 중합체 표면의 개질은 표면을 아민을 포함하는 다른 화학기(-R)와 반응성으로 만드는 것을 포함한다. 적절한 기판 상에 준비될 때, 이러한 반응성 표면은 예를 들어 일부 경우에 적어도 3 개월 이상 동안 실온에서 장기간 저장될 수 있다. 이러한 표면은 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 핵산의 표면 상의 증폭을 위해 R-PEG 및 R-프라이머 올리고머로 추가로 그래프팅될 수 있다. 환형 올레핀 중합체(COP)와 같은 플라스틱 표면은 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법을 사용하여 개질될 수 있다. 예를 들어, 이들은 Ti:사파이어 레이저 어블레이션, UV 매개 에틸렌 글리콜 메타크릴레이트 광그래프팅, 플라즈마 처리, 또는 기계적 교반(예를 들어, 샌드 블라스팅(sand blasting) 또는 연마 등)으로 처리되어, 아민과 같은 다양한 화학기에 대해 수개월 동안 반응성을 유지할 수 있는 친수성 표면을 생성할 수 있다. 이와 같은 기는 이 경우, 생화학적 활성의 손실 없이, PEG와 같은 패시베이션 중합체 또는 DNA 또는 단백질과 같은 생체 분자의 콘쥬게이션을 허용할 수 있다. 예를 들어, DNA 프라이머 올리고머의 부착은 단백질, 형광단 분자, 또는 다른 소수성 분자의 비-특이적 흡착을 감소시키거나 또는 최소화하면서 패시베이팅된 플라스틱 표면 상에서 DNA 증폭을 허용한다.
또한, 일부 경우에, 표면 변형은 패터닝된 표면을 생성하기 위해 예를 들어 레이저 인쇄 또는 UV 마스킹과 조합될 수 있다. 이것은 DNA 올리고머, 단백질, 또는 다른 모이어티의 패터닝된 부착을 허용하여, 표면 기반 효소 활성, 결합, 검출, 또는 처리를 제공한다. 예를 들어, DNA 올리고머는 패터닝된 특징 내에서만 DNA를 증폭하거나, 또는 패터닝된 방식으로 증폭된 긴 DNA 연쇄체를 캡처하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 효소 섬이 용액 기반 기판과 반응할 수 있는 패터닝된 영역에서 생성될 수 있다. 플라스틱 표면은 이러한 처리 모드에 특히 적합하기 때문에, 여기에서 고려되는 일부 실시예에서, 플라스틱 샘플 지지 표면 또는 흐름 셀 장치가 특히 유리한 것으로 인식될 수 있다.
또한, 플라스틱은 사출 성형되거나, 엠보싱되거나, 스탬핑되거나, 또는 3D 인쇄되어, 유리 기판보다 훨씬 더 쉽게, 미세 유체 장치를 포함하여, 임의의 형상을 형성할 수 있고, 따라서 바이오마커 검출 또는 DNA 시퀀싱을 위한 예를 들어 샘플-대-결과 미세 유체 칩과 같은 다중 구성의 생물학적 샘플의 결합 및 분석을 위한 표면을 생성하는 데 사용할 수 있다.
변형된 플라스틱 표면에서 특이적 및 국부적 DNA 증폭을 수행하여, 형광 라벨로 프로빙될 때 매우 높은 대조 대 잡음비 및 매우 낮은 배경을 갖는 핵산 스폿을 생성할 수 있다.
아민-프라이머 및 아민-PEG가 있는 친수화된 및 아민 반응성 환형 올레핀 중합체 표면이 준비될 수 있고, 롤링 서클 증폭을 지원하는 것으로 입증되었다. 형광단 라벨링된 프라이머로 프로빙될 때, 또는 라벨링된 dNTPs가 폴리머라제에 의해 혼성화된 프라이머에 첨가되었을 때, 고도로 특이적인 증폭을 나타내는, 매우 낮은 배경에서 100 초과의 신호 대 잡음비를 나타내고, 그리고 형광 기반 DNA 시퀀서와 같은 시스템에 필요한 고 정밀 검출의 특징인 매우 낮은 수준의 비-특이적 단백질 및 소수성 형광단 결합을 나타내는 DNA 앰플리콘의 밝은 스폿이 관찰되었다.
예 7 - 시퀀싱을 위한 구조화된 조명 이미징 시스템의 사용에 대한 예언적 예
도 41에 예시된 비-제한적인 예와 같은 구조화된 조명 이미징 시스템(4100)은 핵산 시퀀싱을 수행하기 위해 낮은 비-특이적 결합 표면을 포함하는 흐름 셀(4187)과 조합되어 사용될 수 있다. 표적 핵산 시퀀스는 높은 표면 밀도로 흐름 셀(4187)의 내부의 낮은 비-특이적 결합 표면(4188)에 부착된 어댑터/프라이머 시퀀스에 혼성화되고 특이적 혼성화 및 증폭 속도를 향상시키기 위해 상기 표면을 위해 특별히 제형화된 혼성화 및 증폭 완충제를 사용하여 클론 증폭된다.
흐름 셀(4187)은 구조화된 조명 이미징 시스템(4100)에 장착되며, 예를 들어 상기 설명된 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트 화학 및 도 40에 예시된 워크플로우의 사용을 포함하는 시퀀싱 반응 사이클이 개시된다. 형광 라벨링된 중합체 뉴클레오티드 콘쥬게이트는 흐름 셀(4187)에 도입되고 표면(4188)과 접촉하여, 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트의 뉴클레오티드 모이어티가 표적 시퀀스의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 다가 결합 복합체를 형성한다. 과량의 결합되지 않은 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는 그 후 헹구어진다.
각각의 검출 단계에 대해, 표면(4188)의 일련의 이미지가 조명 광 프린지 패턴을 표면(4188)에 투사하기 위해, 조명 광학 경로의 적어도 하나의 분지 및 광학 위상 변조기(예를 들어, 4140A)의 여러 다른 위치에서 회절 격자(예를 들어, 4130A)의 상이한 배향을 사용하여 캡처된다. 이미지 획득 후, 이미지 재구성 알고리즘을 사용하여 일련의 이미지가 처리되어, 회절 제한 광학 장치만을 사용하여 획득될 수 있는 것보다 더 높은 해상도의 이미지를 생성한다. 프로세스는 내부 흐름 셀 표면의 타일링된 이미지를 생성하기 위해 표면(4188) 상의 여러 위치에 대해 반복될 수 있다. 선택적으로, 초점면이 조정될 수 있고, 제2 내부 흐름 셀 표면(4189)의 고 해상도 이미지를 생성하기 위해 프로세스가 반복될 수 있다.
높은 대조 대 잡음비 이미지(다중 라벨링된 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트 시퀀싱 화학에 의해 개시된 저 결합 표면을 사용하여 달성됨)와, 구조화된 조명 이미징 시스템을 사용하여 획득된 비교적 적은 개수의 이미지를 효율적으로 처리하여 초해상도에서 흐름 셀 표면을 이미징하는 것(이에 따라 표적 시퀀스 클러스터의 더 높은 표면 밀도를 사용할 수 있음)의 조합은 전체 시퀀싱 처리량을 더 높이는 데 기여할 수 있다.
예 8 - 이중 표면 이미징을 위한 다중화된 판독 헤드를 사용하는 것의 예언적 예
도 44a 및 도 44b에 개략적으로 도시된 것과 같은 다중화된 판독 헤드는 이중 표면 이미징을 수행하도록 설계되었다. 판독 헤드는 복수의 마이크로 형광 측정기를 포함하고, 이들은 서로에 대해 고정된 위치에 유지되도록 조립되고, 한 쌍의 대향하는 내부 흐름 셀 표면에 수평한 방향으로 스캐닝되어 각 표면의 스와스(swath)의 이미지를 획득할 수 있다. 도 44a에 도시된 바와 같이, 복수의 마이크로 형광 측정기의 제1 서브 세트는 제1 내부 흐름 셀 표면의 이미지를 획득하도록 구성되고, 복수의 마이크로 형광 측정기의 제2 서브 세트는, 제1 내부 표면을 향하고 개재된 유체 채널의 두께에 의해 이로부터 분리되는 제2 내부 흐름 셀 표면의 이미지를 획득하도록 구성된다.
낮은 비-특이적 결합 표면 코팅을 포함하는 흐름 셀은 핵산 시퀀싱을 수행하는 데 사용된다. 표적 핵산 시퀀스는 흐름 셀의 내부의 낮은 비-특이적 결합 표면에 부착된 어댑터/프라이머 시퀀스에 혼성화되고 특이적 혼성화 및 증폭 속도를 향상시키기 위해 상기 표면에 대해 특별히 제형화된 혼성화 및 증폭 완충제를 사용하여 클론 증폭된다.
흐름 셀은 다중화된 판독 헤드를 포함하는 이미징 시스템에 장착되고, 예를 들어, 상기 설명된 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트 화학 및 도 40에 예시된 워크플로우의 사용을 포함하는 시퀀싱 반응 사이클이 개시된다. 형광 라벨링된 중합체 뉴클레오티드 콘쥬게이트는 흐름 셀에 도입되고 내부 표면과 접촉되어, 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트의 뉴클레오티드 모이어티가 표적 시퀀스의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 다가 결합 복합체를 형성한다. 과량의 결합되지 않은 중합체-뉴클레오티드 콘쥬게이트는 그 후 헹구어진다.
각 검출 단계에 대해, 다중화된 판독 헤드는 흐름 셀의 내부 표면에 평행한 적어도 한 방향으로 스캐닝되고(또는 흐름 셀은 다중화된 판독 헤드에 대해 스캔될 수 있음), 제1 및 제2 내부 흐름 셀 표면 모두의 이미지는 도 44b에 도시된 바와 같이 동시에 획득되고, 오토 포커스 기구는 다중화된 판독 헤드의 대물 렌즈와 내부 흐름 셀 표면 중 적어도 하나 사이에 적절한 작동 거리를 유지한다.
(판독 헤드의 설계에 따라) 흐름 셀의 단일 패스 스캔을 사용하여 두 개의 흐름 셀 표면을 동시에 이미징할 수 있는 능력은 시퀀싱 처리량의 상당한 개선을 제공할 수 있다.
넘버링된 추가 실시예들
1. 핵산 분자를 시퀀싱하기 위한 시스템으로서:
a) 커플링된(coupled) 복수의 프라이밍된(primed) 표적 핵산 시퀀스를 포함하는 내부 표면을 갖는 흐름 셀(flow cell) - 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스 중 하나의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스는 이에 결합된 폴리머라제(polymerase)를 가짐 - ;
b) 상기 흐름 셀의 상기 내부 표면으로 시약의 순차적이고 반복적인 전달을 제어하도록 구성된 유체 흐름 제어기;
c) 이미징 모듈 - 상기 이미징 모듈은:
i) 구조화된 조명 시스템; 및
ii) 상기 흐름 셀의 상기 내부 표면의 이미지를 획득하도록 구성된 이미지 획득 시스템;을 포함함 - ; 및
d) 프로세서 - 상기 프로세서는
i) 상기 흐름 셀의 상기 내부 표면에 커플링된 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스를 뉴클레오티드 조성물과 접촉시켜, 상기 뉴클레오티드 조성물의 뉴클레오티드 모이어티(moiety)가 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 뉴클레오티드에 상보적일 때 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스와 복수의 뉴클레오티드 모이어티 사이에 일시적인 결합 복합체를 형성하는 단계; 및
ii) 상기 일시적인 결합 복합체를 검출하여 이에 따라 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 상기 뉴클레오티드의 아이덴티티(identity)를 결정하기 위해 상기 흐름 셀의 상기 내부 표면을 이미징하는 단계;를 포함하는 반복적인 방법을 수행하도록 상기 시스템에 지시하도록 프로그래밍됨 - ;를 포함하는, 시스템.
2. 제1항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 상기 흐름 셀의 상기 내부 표면 상에 주기적인 광 패턴을 투사하도록 설계된 광학 시스템을 포함하고, 복수의 상기 주기적인 광 패턴의 상대적 배향 또는 위상 시프트(phase shift)는 공지된 방식으로 변경될 수 있는 것인, 시스템.
3. 제1항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 광을 방출하는 제1 광 방출기 및 상기 제1 광 방출기에 의해 방출된 광을 분할하는 제1 빔 스플리터(splitter)를 포함하는 제1 광학 아암(optical arm)을 포함하여 상기 흐름 셀의 상기 내부 표면 상에 제1 복수의 프린지(fringes)를 투사하는 것인, 시스템.
4. 제3항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 광을 방출하는 제2 광 방출기 및 상기 제2 광 방출기에 의해 방출된 광을 분할하는 제2 빔 스플리터를 포함하는 제2 광학 아암을 추가로 포함하여 상기 흐름 셀의 상기 내부 표면 상에 제2 복수의 프린지를 투사하는 것인, 시스템.
5. 제4항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 상기 제1 아암과 상기 제2 아암의 광학 경로를 조합하는 광학 요소를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 제1 빔 스플리터는 제1 투과형 회절 격자를 포함하고, 상기 제2 빔 스플리터는 제2 투과형 회절 격자를 포함하는 것인, 시스템.
7. 제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 제1 및 제2 광 방출기는 편광되지 않은 광을 방출하고, 상기 제1 및 제2 투과형 회절 격자는 상기 제1 및 제2 광 방출기 중 각각의 것에 의해 방출된 편광되지 않은 광을 회절시키기 위한 것인, 시스템.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 제1 복수의 프린지와 상기 제2 복수의 프린지의 광학 경로를 조합하기 위한 상기 광학 요소는 구멍을 갖는 미러를 포함하고, 상기 미러는 상기 제1 투과형 회절 격자에 의해 회절된 광을 반사하도록 배열되고, 상기 구멍은 상기 제2 투과형 회절 격자에 의해 회절된 적어도 1 차의 광을 통과시키도록 배열되는 것인, 시스템.
9. 제8항에 있어서,
상기 제1 복수의 프린지 및 상기 제2 복수의 프린지를 위상 시프트하는 하나 이상의 광학 요소를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
10. 제9항에 있어서,
상기 제1 복수의 프린지 및 상기 제2 복수의 프린지를 위상 시프트하는 상기 하나 이상의 광학 요소는 상기 제1 복수의 프린지를 위상 시프트하는 제1 회전 광학 창 및 상기 제2 복수의 광학 프린지를 위상 시프트하는 제2 회전 광학 창을 포함하는 것인, 시스템.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 제1 복수의 프린지 및 상기 제2 복수의 프린지를 위상 시프트하는 상기 하나 이상의 광학 요소는 상기 제1 회절 격자를 병진시키는 제1 선형 이동 스테이지(linear motion stage) 및 상기 제2 회절 격자를 병진시키는 제2 선형 이동 스테이지를 포함하는 것인, 시스템.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 복수의 프린지 및 상기 제2 복수의 프린지를 위상 시프트하는 상기 하나 이상의 광학 요소는 단일 회전 광학 창을 포함하고, 상기 단일 회전 광학 창은 샘플에 대한 광학 경로에서 구멍을 갖는 상기 미러 이후에 위치되는 것인, 시스템.
13. 제12항에 있어서,
상기 단일 회전 광학 창의 회전 축은 상기 격자 각각의 광축으로부터 약 45 도만큼 오프셋되는(offset) 것인, 시스템.
14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 복수의 프린지는 샘플 평면 상에서 상기 제2 복수의 프린지로부터 약 90 도만큼 각지게 오프셋되는 것인, 시스템.
15. 제14항에 있어서,
상기 샘플은 직사각형 어레이(array) 또는 육각형 어레이로 규칙적으로 패터닝된 복수의 특징부를 포함하는 것인, 시스템.
16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플 상에 상기 제1 복수의 프린지 및 상기 제2 복수의 프린지 각각을 투사하는 대물 렌즈를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 회절 격자 각각에 의해 방출되는 0 차 광을 차단하기 위한 하나 이상의 광학 빔 차단기를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
18. 제17항에 있어서,
상기 하나 이상의 광학 빔 차단기는 브래그 격자(Bragg grating)를 포함하는 것인, 시스템.
19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 아암과 상기 제2 아암의 광학 경로를 조합하는 상기 광학 요소는 편광 빔 스플리터를 포함하고, 상기 제1 회절 격자는 수직으로 편광된 광을 회절하고, 상기 제2 회절 격자는 수평으로 편광된 광을 회절하는 것인, 시스템.
20. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 빔 스플리터는 각각 빔 스플리터 큐브(cube) 또는 플레이트(plate)를 포함하는 것인, 시스템.
21. 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 빔 스플리터는 제1 반사성 회절 격자를 포함하고, 상기 제2 빔 스플리터는 제2 반사성 회절 격자를 포함하는 것인, 시스템.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 복수의 빔 스플리터가 상기 시스템의 광축에 대해 고정된 배향을 갖도록 선형 병진 스테이지에 장착된 상기 복수의 빔 스플리터를 포함하는 다중 빔 스플리터 슬라이드(multiple beam splitter slide)를 포함하는 것인, 시스템.
23. 제22항에 있어서,
상기 복수의 빔 스플리터는 복수의 회절 격자를 포함하는 것인, 시스템.
24. 제23항에 있어서,
상기 복수의 회절 격자는 2 개의 회절 격자를 포함하는 것인, 시스템.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 상기 흐름 셀의 상기 내부 표면에 1 차원 회절 패턴을 투사하기 위해 공간 필터 휠(spatial filter wheel)과 조합되어 사용되는 고정된 2 차원 회절 격자를 포함하는 것인, 시스템.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이미지 획득 시스템은, 대물 렌즈와 조합되어, 실질적으로 동일한 이미지 해상도로 제1 내부 흐름 셀 표면 및 제2 내부 흐름 셀 표면의 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 튜브 렌즈를 포함하는 것인, 시스템.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 조성물은 콘쥬게이트된(conjugated) 중합체-뉴클레오티드 조성물을 포함하는 것인, 시스템.
28. 제27항에 있어서,
상기 콘쥬게이트된 중합체-뉴클레오티드 조성물은 중합체 코어에 콘쥬게이트된 복수의 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 것인, 시스템.
29. 제28항에 있어서,
상기 복수의 뉴클레오티드 모이어티는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 시스템.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
상기 복수의 뉴클레오티드 모이어티는 복수의 동일한 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 것인, 시스템.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 일시적인 결합 복합체를 형성하기 전에, 상기 뉴클레오티드 조성물에는 폴리머라제가 결여되는 것인, 시스템.
32. 핵산 분자를 시퀀싱하기 위한 방법으로서:
a) 표면에 테더링된(tethered) 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스를 제공하는 단계 - 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스 중 하나의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스는 이에 결합된 폴리머라제를 가짐 - ;
b) 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스를 뉴클레오티드 조성물과 접촉시켜, 상기 뉴클레오티드 조성물의 뉴클레오티드 모이어티가 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 뉴클레오티드에 상보적일 때 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스와 복수의 뉴클레오티드 모이어티 사이에 일시적인 결합 복합체를 형성하는 단계; 및
c) 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 상기 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하기 위해 상기 일시적인 결합 복합체를 검출하는 단계;를 포함하고,
상기 검출하는 단계는:
i) 상기 표면 상에 특정 방향으로 배향된 제1 복수의 프린지를 투사하기 위해 제1 조명 조건 세트 하에 구조화된 조명 시스템에 의해 제공되는 광으로 상기 표면을 조명하는 단계;
ii) 상기 표면의 제1 복수의 위상 이미지를 캡처하는 단계 - 상기 제1 복수의 이미지의 캡처 동안, 상기 제1 복수의 프린지의 위치는 상기 표면 상에서 시프트됨 - ;
iii) 상기 표면 상에 제2 복수의 프린지를 투사하기 위해 제2 조명 조건 세트 하에 상기 구조화된 조명 시스템에 의해 제공되는 광으로 상기 표면을 조명하는 단계 - 상기 제2 복수의 프린지는 상기 표면 상에서 상기 제1 복수의 프린지로부터 각지게 오프셋됨 - ; 및
iv) 상기 제2 복수의 프린지로 조명된 상기 표면의 제2 복수의 위상 이미지를 캡처하는 단계 - 상기 제2 복수의 프린지의 캡처 동안, 상기 제2 복수의 프린지의 위치는 상기 표면 상에서 시프트됨 - ;를 포함하는, 방법.
33. 제32항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 광을 방출하는 제1 광 방출기 및 상기 제1 광 방출기에 의해 방출된 광을 회절시키는 제1 회절 격자를 포함하는 제1 광학 아암을 포함하여 상기 표면 상의 특정 방향으로 배향된 상기 제1 복수의 프린지를 투사하는 것인, 방법.
34. 제33항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 광을 방출하는 제2 광 방출기 및 상기 제2 광 방출기에 의해 방출된 광을 회절시키는 제2 회절 격자를 포함하는 제2 광학 아암을 포함하여 상기 표면 상의 상기 제1 복수의 프린지로부터 각지게 오프셋된 상기 제2 복수의 프린지를 투사하는 것인, 방법.
35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 복수의 빔 스플리터가 상기 시스템의 광축에 대해 고정된 배향을 갖도록 선형 병진 스테이지에 장착된 상기 복수의 빔 스플리터를 포함하는 다중 빔 스플리터 슬라이드를 포함하고, 상기 제1 조명 조건 세트는 상기 선형 병진 스테이지의 제1 위치에 대응하고, 상기 제2 조명 조건 세트는 상기 선형 병진 스테이지의 제2 위치에 대응하는 것인, 방법.
36. 제35항에 있어서,
상기 복수의 빔 스플리터는 복수의 회절 격자를 포함하는 것인, 방법.
37. 제36항에 있어서,
상기 복수의 회절 격자는 2 개의 회절 격자를 포함하는 것인, 방법.
38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구조화된 조명 시스템은 상기 표면 상에 1 차원 회절 패턴을 투사하기 위해 공간 필터 휠과 조합되어 사용되는 고정된 2 차원 회절 격자를 포함하고, 상기 제1 조명 조건 세트는 상기 공간 필터 휠의 제1 위치에 대응하고, 상기 제2 조명 조건 세트는 상기 공간 필터 휠의 제2 위치에 대응하는 것인, 방법.
39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 회절 격자 및 상기 제2 회절 격자는 투과형 회절 격자이고, 상기 구조화된 조명 시스템은, 상기 제1 회절 격자에 의해 회절된 광을 반사하고 상기 제2 회절 격자에 의해 회절된 적어도 1 차 광을 통과시키기 위한 구멍을 갖는 미러를 포함하는 것인, 방법.
40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 복수의 캡처된 위상 이미지 각각보다 더 높은 해상도를 갖는 하나 이상의 이미지를 계산적으로 재구성하기 위해 적어도 상기 제1 복수의 캡처된 위상 이미지 및 상기 제2 복수의 캡처된 위상 이미지를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
41. 제40항에 있어서,
상기 제1 복수의 프린지는 상기 표면 상에서 상기 제2 복수의 프린지로부터 약 90 도만큼 각지게 오프셋되는 것인, 방법.
42. 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표면은 직사각형 어레이 또는 육각형 어레이로 규칙적으로 패터닝된 복수의 특징부를 포함하는 것인, 방법.
43. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 복수의 프린지 및 상기 제2 복수의 프린지는 상기 표면과 상기 제1 및 제2 회절 격자 각각 사이의 광학 경로에 위치된 단일 광학 창을 회전시킴으로써 위상 시프트되고, 상기 단일 회전 광학 창의 회전 축은 상기 회절 격자 각각의 광축으로부터 오프셋되는 것인, 방법.
44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 복수의 위상 이미지를 캡처한 후에, 상기 구조화된 조명 시스템의 상기 제1 광학 아암은 턴오프되고 상기 제2 광학 아암은 턴온되는 것인, 방법.
45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 회절 격자 및 상기 제2 회절 격자는 이미지 캡처 동안 기계적으로 고정되는 것인, 방법.
46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 조성물은 콘쥬게이트된 중합체-뉴클레오티드 조성물을 포함하는 것인, 방법.
47. 제46항에 있어서,
상기 콘쥬게이트된 중합체-뉴클레오티드 조성물은 중합체 코어에 콘쥬게이트된 복수의 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 것인, 방법.
48. 제47항에 있어서,
상기 복수의 뉴클레오티드 모이어티는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 방법.
49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
상기 복수의 뉴클레오티드 모이어티는 복수의 동일한 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 것인, 방법.
50. 제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 프라이머 가닥의 N+1 또는 말단 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하는 데 사용되는 것인, 방법.
51. 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 일시적인 결합 복합체를 형성하기 전에, 상기 뉴클레오티드 조성물에는 폴리머라제가 결여되는 것인, 방법.
52. 검출 장치로서,
a) 복수의 마이크로 형광 측정기를 포함하는 판독 헤드 조립체를 포함하고,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기는 다중화된 판독 헤드를 형성하도록 서로에 대해 고정된 위치에 유지되고,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제1 서브 세트 중 적어도 하나는 제1 샘플 평면의 상이한 영역의 광시야 이미지를 획득하도록 구성되고,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제2 서브 세트 중 적어도 하나는 제2 샘플 평면의 상이한 영역의 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는, 검출 장치.
53. 제52항에 있어서,
상기 제1 및 제2 샘플 평면에 평행한 적어도 하나의 방향으로 상기 판독 헤드 조립체를 이동시키도록 구성된 병진 스테이지를 추가로 포함하는 것인, 검출 장치.
54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
제1 내부 표면이 상기 제1 샘플 평면에 유지되고 제2 내부 표면이 상기 제2 샘플 평면에 유지되도록 상기 제1 및 제2 내부 표면을 포함하는 흐름 셀을 유지하도록 구성된 샘플 스테이지를 추가로 포함하는 것인, 검출 장치.
55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 적어도 하나의 마이크로 형광 측정기는 적어도 1 mm의 시야를 갖는 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 검출 장치.
56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 적어도 하나의 마이크로 형광 측정기는 적어도 1.5 mm의 시야를 갖는 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 검출 장치.
57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 마이크로 형광 측정기 중 적어도 하나는 전용 오토 포커스 기구(autofocus mechanism)를 추가로 포함하는 것인, 검출 장치.
58. 제57항에 있어서,
제1 마이크로 형광 측정기에 대한 상기 오토 포커스 기구는 제2 마이크로 형광 측정기에 대한 오토 포커스 기구로부터의 데이터를 통합하도록 구성되고, 이에 의해 상기 제1 마이크로 형광 측정기에 대한 상기 오토 포커스 기구는 상기 제1 마이크로 형광 측정기의 초점 위치 및 상기 제2 마이크로 형광 측정기의 초점 위치에 기초하여 상기 제1 마이크로 형광 측정기의 초점을 변경하는 것인, 검출 장치.
59. 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
개별 마이크로 형광 측정기는 대물 렌즈, 빔 스플리터 및 검출기를 추가로 포함하고, 상기 빔 스플리터는 여기 방사선 소스로부터의 여기 방사선을 상기 대물 렌즈로 지향시키고 방출 방사선을 상기 대물 렌즈로부터 상기 검출기로 지향시키도록 위치되는 것인, 검출 장치.
60. 제59항에 있어서,
적어도 하나의 개별 마이크로 형광 측정기는 개별 여기 방사선 소스를 추가로 포함하는 것인, 검출 장치.
61. 제59항 또는 제60항에 있어서,
상기 여기 방사선 소스는 2 개 이상의 개별 마이크로 형광 측정기가 상기 여기 방사선 소스를 공유하도록 상기 여기 방사선을 상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 상기 2 개 이상의 개별 마이크로 형광 측정기의 상기 대물 렌즈로 지향시키는 것인, 검출 장치.
62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 2 개 이상의 개별 마이크로 형광 측정기는 적어도 2 개의 여기 방사선 소스를 추가로 포함하거나 또는 공유하는 것인, 검출 장치.
63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 상기 개별 마이크로 형광 측정기의 상기 대물 렌즈는 0.2 내지 0.5의 개구수를 갖는 것인, 검출 장치.
64. 제52항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기는 50 미크론 미만 떨어져 있는 특징부를 구별하기에 충분한 해상도로 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 검출 장치.
65. 제52항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기는 상기 흐름 셀의 상기 제1 내부 표면과 상기 제2 내부 표면 사이의 분리 거리보다 작은 피사계 심도(depth-of-field)를 갖도록 구성되는 것인, 검출 장치.
66. 제52항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제1 서브 세트는 제1 형광 방출 파장에서 광시야 이미지를 획득하도록 구성되고, 상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제2 서브 세트는 제2 형광 방출 파장에서 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 검출 장치.
67. 표적 핵산 시퀀스에서 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하는 방법으로서,
a) 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스를 제공하는 단계 - 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스 중 하나의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스는 이에 결합된 폴리머라제를 가짐 - ;
b) 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스를 뉴클레오티드 조성물과 접촉시켜, 상기 뉴클레오티드 조성물의 뉴클레오티드 모이어티가 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 뉴클레오티드에 상보적일 때 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스와 복수의 뉴클레오티드 모이어티 사이에 일시적인 결합 복합체를 형성하는 단계; 및
c) 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 상기 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하기 위해 상기 일시적인 결합 복합체를 검출하는 단계;를 포함하고,
상기 검출하는 단계는:
상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스가 테더링된 표면에 평행한 적어도 하나의 방향으로 다중화된 판독 헤드를 병진시키는 단계를 포함하고,
상기 다중화된 판독 헤드는 서로에 대해 고정된 위치에 유지되는 복수의 마이크로 형광 측정기를 포함하고,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 적어도 하나의 마이크로 형광 측정기는 상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 다른 마이크로 형광 측정기와 다른 표면 영역의 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는, 방법.
68. 제67항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 조성물은 콘쥬게이트된 중합체-뉴클레오티드 조성물을 포함하는 것인, 방법.
69. 제68항에 있어서,
상기 콘쥬게이트된 중합체-뉴클레오티드 조성물은 중합체 코어에 콘쥬게이트된 복수의 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 것인, 방법.
70. 제69항에 있어서,
상기 복수의 뉴클레오티드 모이어티는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 방법.
71. 제69항 또는 제70항에 있어서,
상기 복수의 뉴클레오티드 모이어티는 복수의 동일한 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 것인, 방법.
72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 프라이머 가닥의 N+1 또는 말단 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하는 데 사용되는 것인, 방법.
73. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 일시적인 결합 복합체를 형성하기 전에, 상기 뉴클레오티드 조성물에는 폴리머라제가 결여되는 것인, 방법.
74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면에 테더링되고, 상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제1 서브 세트는 상기 흐름 셀의 상기 제1 내부 표면의 상이한 영역의 광시야 이미지를 획득하도록 구성되고, 상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제2 서브 세트는 상기 흐름 셀의 상기 제2 내부 표면의 상이한 영역의 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 방법.
75. 핵산 분자를 시퀀싱하기 위한 시스템으로서:
a) 커플링된 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스를 포함하는 적어도 하나의 내부 표면을 갖는 흐름 셀 - 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스 중 하나의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스는 이에 결합된 폴리머라제를 가짐 - ;
b) 상기 흐름 셀의 적어도 하나의 내부 표면으로의 시약의 순차적이고 반복적인 전달을 제어하도록 구성된 유체 흐름 제어기;
c) 상기 흐름 셀의 상기 적어도 하나의 내부 표면을 이미징하도록 구성된 이미징 모듈 - 상기 이미징 모듈은:
서로에 대해 고정된 위치에 유지되는 복수의 마이크로 형광 측정기를 포함하는 다중화된 판독 헤드 조립체를 포함하고,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 적어도 하나의 마이크로 형광 측정기는 상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 다른 마이크로 형광 측정기와 다른 적어도 하나의 표면 영역의 광시야 이미지를 획득하도록 구성됨 - ; 및
d) 프로세서 - 상기 프로세서는:
i) 상기 흐름 셀의 상기 적어도 하나의 내부 표면에 커플링된 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스를 뉴클레오티드 조성물과 접촉시켜, 상기 뉴클레오티드 조성물의 뉴클레오티드 모이어티가 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 뉴클레오티드에 상보적일 때 상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스와 복수의 뉴클레오티드 모이어티 사이에 일시적인 결합 복합체를 형성하는 단계; 및
ii) 상기 다중화된 판독 헤드를 사용하여 상기 흐름 셀의 상기 적어도 하나의 내부 표면을 이미징하여, 상기 일시적인 결합 복합체를 검출하고 이에 의해 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 상기 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하는 단계;를 포함하는 반복적인 방법을 수행하도록 상기 시스템에 지시하도록 프로그래밍됨 - ;를 포함하는, 시스템.
76. 제75항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 조성물은 콘쥬게이트된 중합체-뉴클레오티드 조성물을 포함하는 것인, 시스템.
77. 제76항에 있어서,
상기 콘쥬게이트된 중합체-뉴클레오티드 조성물은 중합체 코어에 콘쥬게이트된 복수의 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 것인, 시스템.
78. 제77항에 있어서,
상기 복수의 뉴클레오티드 모이어티는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 시스템.
79. 제77항 또는 제78항에 있어서,
상기 복수의 뉴클레오티드 모이어티는 복수의 동일한 뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 것인, 시스템.
80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스의 프라이머 가닥의 N+1 또는 말단 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하는 데 사용되는 것인, 시스템.
81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 일시적인 결합 복합체를 형성하기 전에, 상기 뉴클레오티드 조성물에는 폴리머라제가 결여되는 것인, 시스템.
82. 제75항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 프라이밍된 표적 핵산 시퀀스는 상기 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면에 테더링되고, 상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제1 서브 세트는 상기 흐름 셀의 상기 제1 내부 표면의 상이한 영역의 광시야 이미지를 획득하도록 구성되고, 상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제2 서브 세트는 상기 흐름 셀의 상기 제2 내부 표면의 상이한 영역의 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 시스템.
83. 제75항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다중화된 판독 헤드 조립체를 상기 제1 및 제2 샘플 평면에 평행한 적어도 하나의 방향으로 이동시키도록 구성된 병진 스테이지를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
84. 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 적어도 하나의 마이크로 형광 측정기는 적어도 1 mm의 시야를 갖는 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 시스템.
85. 제75항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 적어도 하나의 마이크로 형광 측정기는 적어도 1.5 mm의 시야를 갖는 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 시스템.
86. 제74항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 마이크로 형광 측정기 중 적어도 하나는 전용 오토 포커스 기구를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
87. 제86항에 있어서,
제1 마이크로 형광 측정기에 대한 상기 오토 포커스 기구는 제2 마이크로 형광 측정기에 대한 오토 포커스 기구로부터의 데이터를 통합하도록 구성되고, 이에 의해 상기 제1 마이크로 형광 측정기에 대한 상기 오토 포커스 기구는 상기 제1 마이크로 형광 측정기의 초점 위치 및 상기 제2 마이크로 형광 측정기의 초점 위치에 기초하여 상기 제1 마이크로 형광 측정기의 초점을 변경하는 것인, 시스템.
88. 제75항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 개별 마이크로 형광 측정기는 대물 렌즈, 빔 스플리터 및 검출기를 추가로 포함하고, 상기 빔 스플리터는 여기 방사선 소스로부터의 여기 방사선을 상기 대물 렌즈로 지향시키고 방출 방사선을 상기 대물 렌즈로부터 상기 검출기로 지향시키도록 위치되는 것인, 시스템.
89. 제88항에 있어서,
적어도 하나의 개별 마이크로 형광 측정기는 개별 여기 방사선 소스를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
90. 제89항에 있어서,
상기 여기 방사선 소스는 2 개 이상의 개별 마이크로 형광 측정기가 상기 여기 방사선 소스를 공유하도록 상기 여기 방사선을 상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 상기 2 개 이상의 개별 마이크로 형광 측정기의 상기 대물 렌즈로 지향시키는 것인, 시스템.
91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 2 개 이상의 개별 마이크로 형광 측정기는 적어도 2 개의 여기 방사선 소스를 추가로 포함하거나 또는 공유하는 것인, 시스템.
92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기 중 상기 개별 마이크로 형광 측정기의 상기 대물 렌즈는 0.2 내지 0.5 의 개구수를 갖는 것인, 시스템.
93. 제75항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기는 50 미크론 미만 떨어져 있는 특징부를 구별하기에 충분한 해상도로 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 시스템.
94. 제82항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기는 상기 흐름 셀의 상기 제1 내부 표면과 상기 제2 내부 표면 사이의 분리 거리보다 작은 피사계 심도를 갖도록 구성되는 것인, 시스템.
95. 제82항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제1 서브 세트는 제1 형광 방출 파장에서 광시야 이미지를 획득하도록 구성되고, 상기 복수의 마이크로 형광 측정기의 제2 서브 세트는 제2 형광 방출 파장에서 광시야 이미지를 획득하도록 구성되는 것인, 시스템.
96. 핵산 분자를 시퀀싱하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 표면을 제공하는 단계 - 상기 표면은:
i) 기판;
ii) 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅 층;
iii) 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅 층에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드 분자; 및
iv) 상기 복수의 부착된 올리고뉴클레오티드 분자에 고정화된 복수의 클론 증폭된 샘플 핵산 분자를 포함하는 상기 표면의 적어도 하나의 개별 구역 - 상기 복수의 고정화된 클론 증폭된 샘플 핵산 분자는 λ/(2*NA) 미만의 거리에 존재하고, 여기서 λ는 여기 에너지 소스의 중심 파장이고, NA는 이미징 시스템의 개구수임 - ;을 포함함 - ;
b) 상기 복수의 클론 증폭된 샘플 핵산 분자에 동시에 확률적 광전환 화학(stochastic photo-switching chemistry)을 적용하여, 상기 복수의 클론 증폭된 샘플 핵산 분자가 확률적 광전환에 의해 최대 4 개의 상이한 컬러로 온 및 오프 이벤트(on and off events)로 형광을 발하는 단계; 및
c) 상기 복수의 클론 증폭된 샘플 핵산 분자에 대해 상기 온 및 오프 이벤트가 발생함에 따라 각 컬러에 대한 컬러 채널(color channel)에서 상기 온 및 오프 이벤트를 실시간으로 검출하여, 상기 클론 증폭된 샘플 핵산 분자의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하는 단계;를 포함하는, 방법.
97. 제96항에 있어서,
상기 확률적 광전환을 위한 시약의 농도는, 상기 복수의 클론 증폭된 샘플 핵산 분자 중 주어진 클론 증폭된 샘플 핵산 분자에 대한 주어진 뉴클레오티드에 대한 온 이벤트가 상기 주어진 클론 증폭된 샘플 핵산 분자에 인접한 클론 증폭된 샘플 핵산 분자의 주어진 뉴클레오티드에 대한 온 이벤트와 동시에 발생할 확률이 약 0.5 % 미만이 되기에 충분한 것인, 방법.
98. 제96항에 있어서,
주어진 클론 증폭된 샘플 핵산 분자에 대한 주어진 뉴클레오티드에 대한 온 이벤트가 상기 주어진 클론 증폭된 샘플 핵산 분자에 인접한 클론 증폭된 샘플 핵산 분자의 뉴클레오티드에 대한 온 이벤트와 동시에 발생할 확률을 제어하기 위해, 상기 온 및 오프 이벤트가 발생하는 속도를 제어하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
99. 제98항에 있어서,
상기 온 및 오프 이벤트가 발생하는 상기 속도를 제어하는 단계는 상기 확률적 광전환 화학에서 뉴클레오티드 및 효소의 농도를 조정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
100. 제96항에 있어서,
상기 컬러 채널에서 검출 이벤트의 조도(illumination intensity)가 미리 결정된 임계값보다 큰지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
101. 제96항에 있어서,
컬러 채널에서 검출 이벤트의 스폿 크기가 미리 결정된 임계값보다 큰지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
102. 제96항에 있어서,
상기 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅 층은 PEG를 포함하는 것인, 방법.
103. 제96항에 있어서,
검출하는 단계는 상기 표면의 이미지를 획득하는 단계를 포함하고, 상기 이미지는 적어도 40의 대조 대 잡음비(CNR)를 나타내는 것인, 방법.
104. 제96항에 있어서,
검출하는 단계는 상기 표면의 이미지를 획득하는 단계를 포함하고, 상기 이미지는 적어도 60의 대조 대 잡음비(CNR)를 나타내는 것인, 방법.
105. 제96항에 있어서,
상기 기판은 유리를 포함하는 것인, 방법.
106. 제96항에 있어서,
상기 기판은 플라스틱을 포함하는 것인, 방법.
107. 제96항에 있어서,
상기 표면은 흐름 채널의 내부에 위치되는 것인, 방법.
108. 제96항에 있어서,
상기 적어도 하나의 친수성 중합체 층은 적어도 8 개의 분지를 갖는 분지형 친수성 중합체를 포함하는 것인, 방법.
109. 제96항에 있어서,
상기 적어도 하나의 개별 구역으로부터 측면 방향으로 변위된 상기 표면의 구역에서 측정된 배경 형광 강도는 상기 클론 증폭 전에 상기 적어도 하나의 개별 구역에서 측정된 강도의 2 배 이하인 것인, 방법.
110. 제96항에 있어서,
상기 샘플 핵산 분자는 규칙적으로 발생하는 단량체 단위의 반복을 포함하는 단일 가닥 다량체(multimeric) 핵산 분자를 포함하는 것인, 방법.
111. 제110항에 있어서,
상기 단일 가닥 다량체 핵산 분자는 길이가 적어도 10 kb인 것인, 방법.
112. 제110항에 있어서,
상기 규칙적으로 발생하는 단량체 단위의 이중 가닥 단량체 카피(copies)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
113. 제96항에 있어서,
상기 표면은 상기 기판의 표면에 테더링된 중합체 분자의 단층을 포함하는 제1 층; 상기 제1 층의 상기 중합체 분자에 테더링된 중합체 분자를 포함하는 제2 층; 및 상기 제2 층의 상기 중합체 분자에 테더링된 중합체 분자를 포함하는 제3 층;을 포함하고, 적어도 하나의 층은 분지형 중합체 분자를 포함하는 것인, 방법.
114. 제113항에 있어서,
상기 제3 층은 상기 제3 층의 상기 중합체 분자에 테더링된 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인, 방법.
115. 제114항에 있어서,
상기 제3 층의 상기 중합체 분자에 테더링된 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 제3 층 전체에 걸쳐 복수의 깊이로 분포되는 것인, 방법.
116. 제113항에 있어서,
상기 제3 층의 상기 중합체 분자에 테더링된 분지형 중합체 분자를 포함하는 제4 층, 및 상기 제4 층의 상기 분지형 중합체 분자에 테더링된 중합체 분자를 포함하는 제5 층을 추가로 포함하는 것인, 방법.
117. 제116항에 있어서,
상기 제5 층의 상기 중합체 분자는 상기 제5 층의 상기 중합체 분자에 테더링된 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인, 방법.
118. 제117항에 있어서,
상기 제5 층의 상기 중합체 분자에 테더링된 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 제5 층 전체에 걸쳐 복수의 깊이로 분포되는 것인, 방법.
119. 제96항에 있어서,
상기 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅 층은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMA), 폴리(2-히드록실에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트)(POEGMA), 폴리글루탐산(PGA), 폴리-리신, 폴리-글루코시드, 스트렙타비딘, 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 것인, 방법.
본 발명의 바람직한 실시예들이 여기에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시예들은 단지 예로서만 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변형들, 변경들, 및 치환들이 이제 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 발생할 것이다. 본 명세서에 설명된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안들이 본 발명을 실시함에 있어서 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위 및 그 균등물의 범위 내의 방법들 및 구조들이 이에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

Claims (80)

  1. 핵산 분자를 시퀀싱(sequencing)하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    a) 대물 렌즈 및 적어도 하나의 이미지 센서를 포함하는 광학 시스템을 사용하여 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면을 이미징(imaging)하는 단계로서, 상기 광학 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA; numerical aperture) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV; field-of-view)를 가지며, 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖는, 상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지들은 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고서 획득되는 것인 단계;
    b) 상기 제1 표면 또는 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 상에 배치된 상기 핵산 분자, 또는 그 보체(complement)를 포함하는 형광 라벨링된 조성물을 검출하여, 상기 핵산 분자 내의 뉴클레오티드(nucleotide)의 아이덴티티(identity)를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지를 획득하는 사이에 상기 광학 시스템을 리포커싱(refocusing)하기 위해 포커싱 기구(focusing mechanism)가 사용되는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 표면 또는 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상의 2 개 이상의 시야를 이미징하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면은 흐름 셀(flow cell)의 2 개의 표면을 포함하는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 흐름 셀의 상기 2 개의 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅되는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 친수성 코팅 층 위에 배치된, 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 광학 시스템을 사용하여 획득된, 상기 2 개의 표면 중 하나의 표면의 이미지는, 상기 핵산 콜로니가 시아닌 염료 3(cyanine dye 3)(Cy3)으로 라벨링될 때 적어도 5의 대조 대 잡음비(contrast to noise ratio)(CNR)를 나타내고, 상기 광학 시스템은 Cy3 방출에 최적화된 다이크로익 미러(dichroic mirror) 및 대역 통과 필터 세트를 포함하며, 상기 이미지는 상기 표면이 25 mM ACES, pH 7.4 완충제에 잠겨 있는 동안 비-신호 포화 조건(no-signal saturating condition) 하에서 획득되는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 별개의 검출 가능한 라벨로 라벨링된, 상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널(imaging channels)을 포함하는 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이미지 센서는 상기 광학 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수(spatial sampling frequency)가 상기 광학 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈(tube lens)를 포함하고, 상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 상기 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭(imaging performance metric)을 보정(correct)하도록 구성되는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의, 상기 제1 내부 표면과 상기 제2 내부 표면 사이의 갭(gap)을 갖는 것인, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는 비대칭 볼록-볼록 렌즈, 볼록-평면 렌즈(convex-plano lens), 비대칭 오목-오목 렌즈, 및 비대칭 볼록-오목 렌즈를 순서대로 포함하는 것인, 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함하는 것인, 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    대물 렌즈와 튜브 렌즈의 조합은 중간 공간 주파수 범위 내지 높은 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성되는 것인, 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 이미징 성능 메트릭은 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서의 변조 전달 함수(MTF), 디포커스(defocus), 구면 수차, 색수차, 코마(coma), 비점 수차, 필드 곡률(field curvature), 이미지 왜곡, 이미지 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들의 임의의 조합의 측정을 포함하는 것인, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지의 상기 광학 해상도는 전체 시야(FOV)에 걸쳐 회절 제한(diffraction-limited)되는 것인, 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 분자의 상기 시퀀싱은,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상에서 결합활성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-avidity), 뉴클레오티드 염기 쌍형성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-nucleotide base-pairing), 뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱(sequencing-by-nucleotide binding), 또는 뉴클레오티드 통합 반응에 의한 시퀀싱(sequencing-by-nucleotide incorporation reaction)을 수행하는 단계;
    결합된 또는 통합된 뉴클레오티드 염기를 검출하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    샘플의 유전자형을 결정하는 단계
    를 추가로 포함하고, 상기 샘플의 유전자형을 결정하는 단계는,
    시퀀싱을 위해 상기 핵산 분자를 준비하는 단계;
    그 후 상기 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  19. 축 방향으로 변위된 2 개의 별개의 표면을 이미징하도록 구성된 이미징 시스템으로서,
    상기 이미징 시스템은 대물 렌즈 및 적어도 하나의 이미지 센서를 포함하고, 상기 이미징 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV)를 가지며, 상기 이미징 시스템은, 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고서 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖는, 상기 축 방향으로 변위된 2 개의 별개의 표면의 이미지를 획득할 수 있는 것인, 이미징 시스템.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 0.3 초과의 개구수를 갖는 것인, 이미징 시스템.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 축 방향으로 변위된 2 개의 별개의 표면의 이미지를 획득하는 사이에 광학 시스템을 리포커싱하기 위해 사용되는 포커싱 기구
    를 추가로 포함하는, 이미징 시스템.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 상기 축 방향으로 변위된 2 개의 별개의 표면 중 적어도 하나 상의 2 개 이상의 시야를 이미징하도록 구성되는 것인, 이미징 시스템.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 축 방향으로 변위된 2 개의 별개의 표면은 흐름 셀의 2 개의 표면을 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 흐름 셀의 2 개의 별개의 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅되고, 상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 친수성 코팅 층 위에 배치된, 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  25. 제19항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 별개의 검출 가능한 라벨로 라벨링된, 상기 2 개의 별개의 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널을 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  26. 제19항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이미지 센서는, 상기 이미징 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 상기 이미징 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  27. 제19항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈를 포함하고, 상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 상기 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성되는 것인, 이미징 시스템.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의, 상기 제1 내부 표면과 상기 제2 내부 표면 사이의 갭을 갖는 것인, 이미징 시스템.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  30. 제19항에 있어서,
    상기 축 방향으로 변위된 2 개의 별개의 표면의 이미지의 상기 광학 해상도는 전체 시야(FOV)에 걸쳐 회절 제한되는 것인, 이미징 시스템.
  31. 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 제2 내부 표면을 이미징하도록 구성된 이미징 시스템으로서,
    상기 이미징 시스템은,
    a) 대물 렌즈;
    b) 적어도 하나의 이미지 센서;
    c) 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로에 배치된 적어도 하나의 튜브 렌즈
    를 포함하고,
    광학 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV)를 가지며,
    상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는 상기 흐름 셀의 상기 제1 내부 표면 및 상기 흐름 셀의 상기 제2 내부 표면의 이미지가 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖도록 이미징 성능을 보정하도록 구성되는 것인, 이미징 시스템.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의, 상기 제1 내부 표면과 상기 제2 내부 표면 사이의 유체로 채워진 갭을 갖는 것인, 이미징 시스템.
  33. 제31항에 있어서,
    상기 제1 내부 표면 및 상기 제2 내부 표면의 이미지는 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고서 획득되는 것인, 이미징 시스템.
  34. 제31항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA)를 갖는 것인, 이미징 시스템.
  35. 제31항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 0.3 초과의 개구수(NA)를 갖는 것인, 이미징 시스템.
  36. 제31항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 1.5 mm2 초과의 시야(FOV)를 갖는 것인, 이미징 시스템.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 제1 내부 표면 및 상기 제2 내부 표면의 이미지의 상기 광학 해상도는 전체 시야(FOV)에 걸쳐 회절 제한되는 것인, 이미징 시스템.
  38. 제31항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는, 비대칭 볼록-볼록 렌즈, 볼록-평면 렌즈, 비대칭 오목-오목 렌즈, 및 비대칭 볼록-오목 렌즈를 순서대로 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  39. 제31항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은, 2 개 이상의 형광 파장에서 상기 제1 내부 표면 및 상기 제2 내부 표면에 대해 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  40. 제31항에 있어서,
    상기 제1 내부 표면 및 상기 제2 내부 표면의 이미지를 획득하는 사이에 상기 광학 시스템을 리포커싱하도록 구성된 포커싱 기구
    를 추가로 포함하는, 이미징 시스템.
  41. 제31항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 상기 제1 내부 표면 또는 상기 제2 내부 표면 중 적어도 하나 상의 2 개 이상의 시야를 이미징하도록 구성되는 것인, 이미징 시스템.
  42. 제31항에 있어서,
    상기 흐름 셀의 상기 제1 내부 표면 및 상기 제2 내부 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅되고, 상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 친수성 코팅 층 위에 배치된, 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 이미징 시스템을 사용하여 획득된, 상기 제1 내부 표면 또는 상기 제2 내부 표면의 이미지는, 상기 핵산 콜로니가 시아닌 염료 3(Cy3)으로 라벨링된 경우 적어도 5의 대조 대 잡음비(CNR)를 나타내고, 상기 이미징 시스템은 Cy3 방출에 최적화된 다이크로익 미러 및 대역 통과 필터 세트를 포함하며, 상기 이미지는 상기 표면이 25 mM ACES, pH 7.4 완충제에 잠겨 있는 동안 비-신호 포화 조건 하에서 획득되는 것인, 이미징 시스템.
  44. 제42항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 별개의 검출 가능한 라벨로 라벨링된, 2 개의 별개의 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널을 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  45. 제42항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은, 상기 제1 내부 표면 및 상기 제2 내부 표면 중 적어도 하나 상에서 결합활성에 의한 시퀀싱, 뉴클레오티드 염기 쌍형성에 의한 시퀀싱, 뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱, 또는 뉴클레오티드 통합 반응에 의한 시퀀싱을 모니터링하고, 결합된 또는 통합된 뉴클레오티드 염기를 검출하도록 사용되는 것인, 이미징 시스템.
  46. 제42항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 핵산 시퀀싱을 수행하는 데 사용되는 것인, 이미징 시스템.
  47. 제42항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 샘플의 유전자형을 결정하는 데 사용되고, 상기 샘플의 유전자형을 결정하는 단계는,
    시퀀싱을 위해 상기 샘플로부터 추출된 핵산 분자를 준비하는 단계;
    그 후 상기 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계
    를 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  48. 제31항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이미지 센서는, 상기 이미징 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 상기 이미징 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함하는 것인, 이미징 시스템.
  49. 제31항에 있어서,
    상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 튜브 렌즈의 조합은 샘플 평면에서 mm당 700 사이클 내지 mm당 1100 사이클의 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성되는 것인, 이미징 시스템.
  50. 제31항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는, 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 튜브 렌즈의 조합에 대해, 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서의 변조 전달 함수(MTF), 디포커스, 구면 수차, 색수차, 코마, 비점 수차, 필드 곡률, 이미지 왜곡, 이미지 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들의 임의의 조합을 보정하도록 설계되는 것인, 이미징 시스템.
  51. 핵산 분자를 시퀀싱하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    a) 대물 렌즈 및 적어도 하나의 이미지 센서를 포함하는 무-보상 광학 시스템을 사용하여 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면을 이미징하는 단계로서, 상기 광학 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV)를 갖는 것인 단계;
    b) 상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지들이 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖도록 광학 수차를 보정하기 위해 상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지를 처리하는 단계;
    c) 상기 제1 표면 또는 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 상에 배치된, 상기 핵산 분자, 또는 그 보체를 포함하는 형광 라벨링된 조성물을 검출하여, 상기 핵산 분자 내의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고서 획득되는 것인, 방법.
  53. 제51항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 단지 상기 광학 시스템을 리포커싱함으로써 획득되는 것인, 방법.
  54. 제51항에 있어서,
    상기 제1 표면 또는 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상의 2 개 이상의 시야를 이미징하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제51항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면은 흐름 셀의 2 개의 표면을 포함하는 것인, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 흐름 셀의 상기 2 개의 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅되는 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 친수성 코팅 층 위에 배치된, 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 광학 시스템을 사용하여 획득된, 상기 2 개의 표면 중 하나의 표면의 이미지는, 상기 핵산 콜로니가 시아닌 염료 3(Cy3)으로 라벨링될 때 적어도 5의 대조 대 잡음비(CNR)를 나타내고, 상기 광학 시스템은 Cy3 방출에 최적화된 다이크로익 미러 및 대역 통과 필터 세트를 포함하며, 상기 이미지는 상기 표면이 25 mM ACES, pH 7.4 완충제에 잠겨 있는 동안 비-신호 포화 조건 하에서 획득되는 것인, 방법.
  59. 제51항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 별개의 검출 가능한 라벨로 라벨링된 상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널을 포함하는 것인, 방법.
  60. 제51항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이미지 센서는 상기 광학 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 상기 광학 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함하는 것인, 방법.
  61. 제51항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈를 포함하고, 상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 상기 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성되는 것인, 방법.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의, 상기 제1 내부 표면과 상기 제2 내부 표면 사이의 갭을 갖는 것인, 방법.
  63. 제61항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는, 비대칭 볼록-볼록 렌즈, 볼록-평면 렌즈, 비대칭 오목-오목 렌즈, 및 비대칭 볼록-오목 렌즈를 순서대로 포함하는 것인, 방법.
  64. 제61항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함하는 것인, 방법.
  65. 제61항에 있어서,
    대물 렌즈와 튜브 렌즈의 조합은 중간 공간 주파수 범위 내지 높은 공간 주파수 범위에서 변조 전달 함수를 최적화하도록 구성되는 것인, 방법.
  66. 제61항에 있어서,
    상기 이미징 성능 메트릭은, 하나 이상의 지정된 공간 주파수에서의 변조 전달 함수(MTF), 디포커스, 구면 수차, 색수차, 코마, 비점 수차, 필드 곡률, 이미지 왜곡, 이미지 대조 대 잡음비(CNR), 또는 이들의 임의의 조합의 측정을 포함하는 것인, 방법.
  67. 제51항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지의 광학 해상도는 전체 FOV(시야)에 걸쳐 회절 제한되는 것인, 방법.
  68. 제51항에 있어서,
    상기 핵산 분자의 상기 시퀀싱은, 상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상에서 결합활성에 의한 시퀀싱, 뉴클레오티드 결합에 의한 시퀀싱, 또는 뉴클레오티드 통합 반응에 의한 시퀀싱을 수행하는 단계 및 결합된 또는 통합된 뉴클레오티드 염기를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  69. 제51항에 있어서,
    샘플의 유전자형을 결정하는 단계
    를 추가로 포함하고, 상기 샘플의 유전자형을 결정하는 단계는,
    시퀀싱을 위해 상기 핵산 분자를 준비하는 단계;
    그 후 상기 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  70. 핵산 분자를 시퀀싱하기 위한 시스템으로서,
    a) 대물 렌즈 및 적어도 하나의 이미지 센서를 포함하는 광학 시스템으로서, 상기 광학 시스템은 0.6 미만의 개구수(NA) 및 1.0 mm2 초과의 시야(FOV)를 가지며, 제1 표면 및 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지를 획득하도록 구성되는 것인 광학 시스템;
    b) 프로세서
    를 포함하고,
    상기 프로세서는,
    ⅰ) 상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지들이 실질적으로 동일한 광학 해상도를 갖도록 광학 수차를 보정하기 위해 상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 상기 이미지를 처리하도록, 그리고
    ⅱ) 상기 제1 표면 또는 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 상에 배치된 상기 핵산 분자, 또는 그 보체를 포함하는, 형광 라벨링된 조성물을 검출하여, 상기 핵산 분자 내의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하도록
    프로그래밍되는 것인, 시스템.
  71. 제70항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이의 광학 경로 내로 광학 보상기를 이동시키지 않고서 획득되는 것인, 시스템.
  72. 제70항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면의 이미지는 단지 상기 광학 시스템을 리포커싱함으로써 획득되는 것인, 시스템.
  73. 제70항에 있어서,
    이미징 시스템은 0.3 초과의 개구수를 갖는 것인, 시스템.
  74. 제70항에 있어서,
    상기 제1 표면 및 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면은 흐름 셀의 2 개의 표면을 포함하는 것인, 시스템.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 흐름 셀의 상기 2 개의 표면은 친수성 코팅 층으로 코팅되고, 상기 친수성 코팅 층은 10,000 개 초과의 핵산 콜로니/mm2의 표면 밀도로 친수성 코팅 층 위에 배치된, 라벨링된 핵산 콜로니를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
  76. 제70항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 별개의 검출 가능한 라벨로 라벨링된 상기 제1 표면 또는 상기 축 방향으로 변위된 제2 표면 중 적어도 하나 상에 배치된 핵산 콜로니를 검출하도록 구성된 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 이미징 채널을 포함하는 것인, 시스템.
  77. 제70항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이미지 센서는 상기 광학 시스템에 대한 공간 샘플링 주파수가 상기 광학 시스템의 광학 해상도의 적어도 2 배가 되도록 선택된 픽셀 치수를 갖는 픽셀을 포함하는 것인, 시스템.
  78. 제70항에 있어서,
    상기 시스템은 상기 대물 렌즈와 상기 적어도 하나의 이미지 센서 사이에 위치된 적어도 하나의 튜브 렌즈를 포함하고, 상기 적어도 하나의 튜브 렌즈는 흐름 셀의 제1 내부 표면 및 상기 흐름 셀의 제2 내부 표면을 이미징하기 위한 이미징 성능 메트릭을 보정하도록 구성되는 것인, 시스템.
  79. 제78항에 있어서,
    상기 흐름 셀은 적어도 700 ㎛의 벽 두께 및 적어도 50 ㎛의, 상기 제1 내부 표면과 상기 제2 내부 표면 사이의 갭을 갖는 것인, 시스템.
  80. 제78항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 2 개 이상의 형광 파장에서 최적의 이미징 성능을 제공하도록 설계된 2 개 이상의 튜브 렌즈를 포함하는 것인, 시스템.
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