CN110168351A - 使用多路复用的扫描时间聚焦的高速深部组织成像系统 - Google Patents

Abstract

一种组织成像系统，包括：用于输出激光脉冲的激光模块、配置为将从激光模块接收的激光脉冲分成多个时间延迟的子脉冲的光学延迟模块、用于将子脉冲从光学延迟模块传送到目标体积的望远镜、和配置为响应于由第一子脉冲和第二子脉冲激发目标体积而收集在目标体积内产生的光子的光电探测器。所述系统还可以包括空间多路复用模块，空间多路复用模块配置为从光学延迟模块接收时间多路复用的激光脉冲，并将时间多路复用的激光脉冲分成包括第一子光束和第二子光束的多个子光束，其中，第一子光束和第二子光束相对于在目标体积内的第一深度处形成的第一图像平面在空间上分离，以及相对于在目标体积内的第二深度处形成的第二图像平面在空间上分离。

Description

使用多路复用的扫描时间聚焦的高速深部组织成像系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年10月30日递交的美国临时申请No.62/414,788的优先权，出于所有的目的，将上述申请的说明书以其整体并入本文。

背景技术

现代神经科学的主要目标是了解神经网络如何执行认知相关的功能。为了实现该目标，同时和独立地记录(为甚至最简单的神经网络的构成块的)大神经元的活动是有用的。然而，由于可用的工具和技术的缺点，这项任务受到了阻碍。

一种光学显微镜通过几乎同时记录啮齿类动物大脑中成千上万个神经元的活动来解决这个问题，从而在理解哺乳类动物大脑中信息处理(包括在人脑的各种健康状态和病理状态期间的信息处理)的基本原理上取得重大飞跃。

所述显微镜使用了多路复用的扫描时间聚焦(Multiplexed Scanned TemporalFocusing，MuST)策略与具有优化脉冲特性的激光系统相结合。MuST是变革性的技术，其将局部微电路桥接到完整皮层网络的水平。然而，对于大皮层体积执行无偏差功能成像仍然是一个挑战，所述大皮层体积例如大于500(微米(μm))×500μm×500μm、具有单细胞分辨率和生理的时间尺度(例如，快于5Hz)。

哺乳类动物皮层中的神经网络活动支持复杂的脑功能(诸如感官知觉、运动行为的产生或记忆形成)。为了理解该过程，有必要以高时空分辨率记录理想地包括功能皮层网络的大皮层体积内的所有神经元。在过去的十年中，双光子显微镜(two-photon scanningmicroscopy，2PM)和基因编码的钙指示剂(genetically encoded calcium indicators，GECI)的组合已出现作为神经元活动的光学读数不可或缺的工具。GECI的变型(诸如GCaMP)广泛用于有效且细胞类型特定的神经元的标记以及细胞内钙水平(神经活动的代表)变化的敏感光学记录。然而，传统的双光子扫描显微镜中的机械和光学约束已严重限制了可以捕获神经网络动态的有效体积视场(volumetric field-of-view，V-FOV)和时间分辨率。

双光子扫描显微镜具有几乎衍射极限的光学分辨率、极好的信噪比，并且重要的是，与基于单光子激发的其它高速体积成像方法相比，提高了深度穿透。然而，这些优点的代价是衍射极限激发光斑必须在侧向平面中并沿着轴向方向扫描，以便捕获体积图像，从而导致低的时间分辨率。已知的衍射极限双光子扫描方法具有不同的性能。具体地，假设一典型的350μm×350μm或512像素×512像素的平面，具有1kHz(kilohertz，千赫兹)的扫描频率的标准检流计点扫描(galvanometric point-scanning)产生用于双向扫描的大约4Hz(Hertz，赫兹)的帧速率(也可以称为成像系统的“时间分辨率”)。

克服该速度限制的策略包括使用声光偏转器(acousto-optical deflector，AOD)进行随机访问扫描，这是一种设计用于以高达约50kHz/N的速率成像的方法，其中N为点的数量。作为第二种可能性，使用AOD或共振扫描器的快速平面扫描可以显著提高帧速率。例如，典型的8kHz的共振扫描器对于上述350μm×350μm(512像素×512像素)的图像的双向扫描模式将有效实现“视频速率”(例如，30Hz)，但是只能以30Hz的帧速率覆盖大约5到10个单独的z-平面或轴向地每秒覆盖大约50μm。即使未来机器扫描速度有所提高，荧光饱和度也可能最终对整体扫描速度施加限制，因为扫描速度的这种提高必须伴随着照明强度的提高，以便维持有用的信噪比水平。尽管存在不依赖点状双光子激光扫描的其它三维(threedimensional，3D)成像方法，但是大多数方法要么仅通过提供小的V-FOV而不是实现细胞级成像分辨率，要么由于它们易于散射而仍旧远远不能达到上述性能目标。可以通过限制对目标位置的扫描来提高帧速率的随机访问扫描方法需要关于神经元位置的先验知识，并因此难以应用于清醒的动物，因为神经元逐帧移动。

发明内容

根据本发明的一方面的组织成像系统包括：激光模块，所述激光模块用于输出激光脉冲；光学延迟模块，所述光学延迟模块被配置为将从所述激光模块接收的激光脉冲分成多个时间延迟的子脉冲；望远镜，所述望远镜用于将所述子脉冲从所述光学延迟模块传送到目标体积；以及光电探测器，所述光电探测器被配置为响应于由第一子脉冲和第二子脉冲激发所述目标体积而收集在所述目标体积内产生的光子。所述子脉冲包括第一子脉冲和第二子脉冲，其中，所述第二子脉冲相对于所述第一子脉冲延迟多于3。所述第一子脉冲可以聚焦在所述目标体积内的第一深度处并且所述第二子脉冲可以聚焦在所述目标体积内的第二深度处，其中，所述第二深度不同于所述第一深度。可替选地，所述第一子脉冲和所述第二子脉冲可以聚焦在所述目标体积内的同一深度处，但是指向相邻的平面。

所述光学延迟模块优选地包括分束器、至少两个光学路径、以及光学组合器，所述分束器被配置为将所述激光脉冲分成所述多个子脉冲；所述至少两个光学路径用于在所述第一子脉冲和所述第二子脉冲之间引入时间延迟；所述光学组合器用于组合所述第一子脉冲和所述第二子脉冲以形成包括所述第一子脉冲和所述第二子脉冲的时间多路复用的激光脉冲(temporally multiplexed laser pulse)；其中，所述望远镜将所述时间多路复用的激光脉冲传送到所述目标体积。所述光学路径可以通过自由空间传播或通过光纤引入所述时间延迟。所述光学延迟模块还优选地包括具有第一发散度的第一聚焦透镜以及具有第二发散度的第二聚焦透镜，所述第一聚焦透镜用于将从所述分束器接收的所述第一子脉冲聚焦到所述目标体积内的所述第一深度，所述第二聚焦透镜用于将从所述分束器接收的所述第二子脉冲聚焦到所述目标体积内的所述第二深度。

所述组织成像系统还优选地包括空间多路复用模块，所述空间多路复用模块被配置为从所述光学延迟模块接收所述时间多路复用的激光脉冲。所述空间多路复用模块包括分束器，所述分束器用于将所述时间多路复用的激光脉冲分成包括第一子光束和第二子光束的多个子光束。所述第一子光束和所述第二子光束相对于在所述目标体积内的所述第一深度处形成的第一图像平面在空间上分离以及相对于在所述目标体积内的所述第二深度处形成的第二图像平面在空间上分离。

所述空间多路复用模块还优选地包括扫描器，所述扫描器用于对所述第一子光束和所述第二子光束进行角度偏转，从而所述第一子光束和所述第二子光束分别在所述第一图像平面的第一聚焦区域和所述第二图像平面的第二聚焦区域上扫描。在该方面中，所述激光模块被配置为输出包括以第一重复率发射的光脉冲的激光束，其中，所述第一重复率至少为1MHz且每个脉冲的持续时间小于10ps。所述空间多路复用模块还优选地包括控制器，所述控制器被配置为以基于所述第一重复率的速率移动所述扫描器，使得由所述激光模块输出的光在所述目标体积内的聚焦光斑在第一方向上偏转大约如下宽度：在所述第一方向上在所述激光模块发射的连续脉冲之间聚焦光斑的宽度。

所述系统还优选地包括时间聚焦光栅，所述时间聚焦光栅用于从所述扫描器接收角度偏转的第一子光束和第二子光束，并用于将角度偏转的所述第一子光束和所述第二子光束中的光脉冲分散成它们各自的光谱分量。在第一时间子脉冲和第二时间子脉冲指向所述目标体积的同一深度处的相邻平面的实施方式中使用多个时间聚焦光栅。

此外，光电探测器优选地包括光电倍增管以及用于聚焦在所述目标体积内产生的所述光子的微透镜阵列。还可以想到提供的该组织成像系统仅具有空间多路复用模块。

在本发明的另一方面中，提供了一种用于在在目标体积内进行荧光分子的高速成像的方法。所述方法包括提供脉冲激光束，所述脉冲激光束包括持续时间均小于10ps的脉冲；将所述脉冲激光束的脉冲分成包括第一子脉冲和第二子脉冲的多个子脉冲；在进入所述目标体积的所述第一子脉冲和进入所述目标体积的所述第二子脉冲之间引入时间延迟，所述时间延迟为至少3ns；以及响应于由所述第一子脉冲和所述第二子脉冲激发所述目标体积，收集在所述目标体积内产生的光子。所述方法还可以包括将所述第一子脉冲聚焦在所述目标体积内的第一深度处以及将所述第二子脉冲聚焦在所述目标体积内的第二深度处，其中，所述第二深度不同于所述第一深度。

根据所述方法的由所述第一子脉冲和所述第二子脉冲激发所述目标体积包括使用双光子激发方案、三光子激发方案、或所述双光子激发方案与所述三光子激发方案的组合激发所述目标体积内的荧光分子。

此外，所述方法还优选地包括：将所述第一脉冲和所述第二脉冲组合以形成包括所述第一子脉冲和所述第二子脉冲的时间多路复用的激光脉冲；将所述时间多路复用的激光脉冲空间地分离成包括第一子光束和第二子光束的多个子光束；以及将所述空间分离且时间多路复用的激光脉冲传送到所述目标体积，其中，所述第一子光束和所述第二子光束相对于在所述目标体积内的所述第一深度处形成的第一图像平面在空间上分离，以及相对于在所述目标体积内的所述第二深度处形成的第二图像平面在空间上分离。

所述方法还优选地包括使用扫描器对所述第一子光束和所述第二子光束进行角度偏转，从而所述第一子光束和所述第二子光束分别在所述第一图像平面的第一聚焦区域和所述第二图像平面的第二聚焦区域上扫描。此外，所述扫描器优选地以基于所述脉冲激光束的重复率的速率进行移动，使得由所述激光模块输出的光在所述目标体积内的聚焦光斑在第一方向上偏转大约如下宽度：所述第一方向上在发射的所述脉冲激光束的连续脉冲之间聚焦光斑的宽度。

这里也可以想到所述方法仅包括空间地多路复用光束的步骤。

附图说明

附图仅以示例性的方式而不是限制的方式描绘了根据本教导的一个或多个实施方式。在附图中，相同的附图标记表示相同或相似的元件。

图1为根据本发明的一方面的示例性成像系统的示意图。

图2为图1中示出的时间聚焦激光子束(beamlet)的空间多路复用的放大视图。

图3示出了根据一实施方式的空间多路复用样本的扫描。

图4A至图4D示出了根据一实施方式的通过成像系统扫描样本的各阶段。

图5为根据一实施方式的时间多路复用模块的示意图。

图6A示出了根据一实施方式的穿透样本的时间多路复用的子脉冲。

图6B示出了根据另一实施方式的穿透样本的时间多路复用的子脉冲。

图7为根据本发明的方法的一实施方式的第一序列的、穿透样本的时间和空间多路复用的光束的示意图。

图8为根据本发明的方法的一实施方式的第二序列的、穿透样本的时间和空间多路复用的光束的示意图。

图9为根据本发明的方法的一实施方式的第三序列的、穿透样本的时间和空间多路复用的光束的示意图。

图10A至图10B示出了根据一实施方式的扫描光脉冲(无论是否是时间多路复用的子脉冲)的聚焦光斑。

图11示出了根据一实施方式的小鼠的表达核限制的红色荧光蛋白(nuclear-confined red fluorescent protein)的听觉皮层中的活体体积堆叠采集(vivo volumestack acquisition)。

图12为示出可以在其上实现本发明的各方面的计算机系统的框图。

图13示出了用于支撑多个时间聚焦光栅的光栅组件。

具体实施方式

本文中公开了用于多路复用的扫描时间聚焦(MuST)的两种技术。这两种技术包括双光子扫描显微镜检查和三光子扫描显微镜检查。与已知的技术相比，公开的两种MuST技术(双光子和三光子)都以高帧速率为体积钙成像提供了优异的性能。

图1示出了示例性成像系统100的示意图。成像系统100包括脉冲输出激光模块139，脉冲输出激光模块139输出(或发射)脉冲主激光束109，脉冲主激光束109包括重复的超短光脉冲(可称为“激光脉冲”)。例如，激光模块139可以使用例如市售或定制的基于光纤的啁啾脉冲放大器(FCPA)来实现。激光模块139可以以例如1兆赫兹(MHz)至5兆赫兹的重复率输出光脉冲。每个光脉冲的持续时间例如均可以小于100皮秒(picosecond，ps)、小于50皮秒、小于20皮秒、小于10皮秒、小于5皮秒、小于1皮秒、小于100飞秒(femtosecond，fs)、小于50飞秒或小于20飞秒。激光模块139的一些实施方式可以称为“飞秒激光器”。每个光脉冲传递对以单个光脉冲激发样本119的激发体积有效的激光功率。例如，激光模块可以输出1040纳米(nm)波长的光脉冲，重复率为1Mhz，每个脉冲在样本119内的目标位置传递大于100纳焦耳(nanojoules，nJ)的功率。

在图1所示的示例中，将激光模块139输出的主光束提供给空间多路复用模块110，空间多路复用模块110包括分束器107(也可以称为“空间分离器”)，分束器107将接收的主光束分成多个子光束(也可以称为“子束”)。由分束器107输出的多个子光束可以统称为“光束109”。在一些实施方式中，分束器107可以包括多点衍射光学元件(DOE)，该多点衍射光学元件将接收的入射光束分成多个子光束，这些子光束的特征是具有彼此相等的强度和相等的角度。存在一维和二维(1D/2D)多点衍射光学元件两者。一维元件沿直线分离光束，而二维元件产生以矩阵(例如，2×2或3×3个点)排列的光束。在一些示例中，分束器107将从激光模块139接收的主光束分成四个子光束，从而在目标(诸如，样本119，如由图2中的聚焦光斑201、203、205和207所示)上产生2×2的聚焦光斑矩阵。将激光模块输出的主光束分成多个子光束并将子光束聚焦在成像平面中的不同位置(参见例如图2中的聚焦光斑201、203、205和207的位置)可以称为“空间多路复用(spatial multiplexing)”。

包括在光束109中的多个子光束可以被扩展并指向扫描器111，扫描器111对光束109执行变化的、选择性的和受控的(例如，通过成像系统100的计算设备131或另一个元件控制)角度偏转，从而在控制样本119中产生受控的聚焦光斑定位。在一些示例中，扫描器111可以为一维(1D)扫描器，该一维扫描器执行光束109的沿着直线的偏转。在一些示例中，如图3和图10A中的示例所示，扫描器111可以为二维(2D)扫描器，该二维扫描器执行关于两个轴线的角度偏转。扫描器111可以包括例如一个或多个检流计镜(galvanometricmirror)、扫描折射光学器件、一个或多个声光偏转器、和/或一个或多个电光偏转器，以可控制地改变光束109的角度偏转量。

在由扫描器111施加偏转之后，光束109可以通过球形扫描透镜113平移，以使包括在光束109中的子光束在光谱色散元件115(诸如时间聚焦光栅)上形成聚焦光斑。光谱色散元件115将包括在光束109中的光脉冲分散成它们的光谱分量，该光谱分量通过包括时间聚焦透镜(TF透镜)137和物镜133的望远镜117在时间和空间上重新聚焦，并在样本119中的成像平面处成像。例如，可以通过望远镜117结合成像系统100的其它元件提供4×4或4×2的空间和时间多路复用。结合图2和图3示出并讨论了空间多路复用的示例，结合图5、图6A和图6B示出并讨论了时间多路复用的示例，以及结合图7至图9示出并讨论了4×3的空间和时间多路复用的示例。

荧光分子(也可称为“荧光染料”，诸如但不限于基因编码的钙指示剂)在被光束109激发时重新发射光，其强度(或光子的量)对应于存在于激发的体素中的荧光分子的量。可以包括在延迟路径中的微透镜阵列(ML)125，以将从包括在光束109中的每个子光束产生的荧光聚焦到相应的光电探测器上(诸如多阳极光子倍增管(MA-PAT)127的相应的阳极)。可以包括二向色镜141或类似的光学元件，以减少到达光电探测器的非荧光的量。多通道计数卡(dmCC)129可以在时域中执行解多路复用(demultiplex)以确定每个体素的荧光强度。解多路复用后的强度可以由计算设备131(该计算设备可以进一步被配置为控制成像系统100的各个方面)收集并进一步处理、显示或存储在本地或全局存储器中，以用于进一步访问和分析。

成像系统100可以显著增加采集量和速度。在一些实施方式中，由于激光模块139输出的主激光束中的光脉冲的4×4的空间和时间多路复用，因此可以使用16倍物镜实现高达1mm×1mm(毫米)的FOV。确定双光子显微镜中的预期的荧光信号的参数可以使用公式(1)来评估。每个荧光分子吸收的光子数Na、并因此通过脉冲激光源在双光子激发中的荧光信号与以下成比例，即：

在公式(1)中，P₀为样本平面(例如，样本119的顶表面)处的平均激光功率，f为激光的脉冲重复率，τ为脉冲长度，λ为中心波长，A为样本的激发面积(例如，在标准双光子扫描显微镜的情况下激光聚焦光斑的衍射极限面积)，以及Δt为停歇(dwell)(或曝光)时间。公式(1)的一个关键方面是吸收的光子数N_a与A的二次相关性以及与Δt的线性相关性。作为示例，如果面积元素A减少了10倍，则给定位置上的停歇时间Δt需要减少相同的倍数，以保持相同的成像帧速率。然而，由于N_a～Δt/A²，在该示例中荧光产量将增加10倍，从而允许进一步减少停歇时间并因此提高帧速率。

因此，对于给定的V-FOV和分辨率，将激发面积(例如，样本119中激光聚焦光斑的大小)设置为接近期望的分辨率可以使得在给定的平均激光功率下优化成像速度。此外，V-FOV、分辨率和期望的时间分辨率确定体素成像速率，例如，每秒要成像的体素数量。公式(1)支持这样的概念：当将重复率f设置为等于体素成像速率时，可以优化荧光产量，因为对于给定的平均激光功率，允许脉冲能量最大化(用单个脉冲激发)。

光束109的时间聚焦(TeFo)避免由于侧向光束参数和轴向光束参数之间的耦合所导致的限制，如公式(1)中所示。在TeFo中，飞秒脉冲激光的光谱通过光谱色散元件115在空间上分散，并通过包括TF透镜137和物镜133的望远镜117成像到样本上。因此，光束109中的脉冲的频率分量几何分散在除物镜137外的任何位置。这导致峰值脉冲强度的有效降低，从而降低了聚焦区域外的双光子激发概率。轴向定位的激发可以通过控制样本中脉冲的分散来实现，而侧向激发模式可以通过选择透镜和物镜来独立地设置。

在一个实施方式中，可以通过实现如下成像系统来改善钙成像，该成像系统能够利用分别大于20赫兹和大于3赫兹的时间分辨率，以单细胞分辨率记录来自约500μm×500μm×500μm或1000μm×1000μm×700μm(相当于小鼠新皮层中皮质柱的大小)的3D体积中的大多数神经元。

在一些实施方式中，通过结合三光子激发可以优化系统100的深部组织成像性能。通常，传统的双光子显微镜海马成像实验涉及侵入性手术，在此期间移除皮层并植入约1.5毫米深的成像插管窗。然而，即使在这样的手术之后，只有浅表海马CA1区域变得可接近。相反，所公开的三光子MuST成像方法可以显著减少侵入性，因为三光子MuST成像方法使得能够在大脑表面下方约1.1毫米处对CA1细胞体层成像而无需皮质抽吸。所公开的方法还能够在皮层手术后对深海马区域(例如，CA3、DG)进行成像(例如，海马背表面下约1毫米)，即，使海马CA1和整个海马电路保持完整。

此外，由于入射激光脉冲的散射，双光子显微镜可能不能很好地适合于1毫米深度以下的成像，这会随着图像深度指数地减小激发概率。相反，利用以约1700纳米激发的三光子显微镜可以用于红色的、非功能性荧光蛋白(诸如红色荧光蛋白(RFP))的荧光成像。此外，另一光谱窗也可以存在于大约1300至1400纳米处，其中由于散射和水吸收引起的组合衰减长度对于深部组织成像可以是有利的。该波长区域将对应于绿色钙指示剂(诸如GCaMP)的三光子激发。如上所述，激光模块139输出超短脉冲的光，这对三光子显微镜特别有利，因为由三光子显微镜(S3P)产生的荧光信号的强度与脉冲长度(T)的平方成反比，例如，S_3P～T²。

基于与所公开方法相关的理论计算，在典型的三光子显微镜中，吸收截面可以计算为大约10^-82平方厘米(s/光子)²。此外，GCaMP的浓度表达可以计算为约20μm。计算结果确定了所公开的MuST方法与三光子激发的组合可以提供足够的信号以促进高帧速率(例如，每秒10帧或更多)，从而用于在500μm×500μm的FOV上的超过1毫米深度的活体成像。

所公开的成像系统100可以在多赫兹时间分辨率下以可靠的单细胞分辨率提供前所未有的大V-FOV(例如，在20Hz下500μm×500μm×500μm，或在3Hz下1mm×1mm×0.7mm)的无偏差的钙成像。这种成像系统提供了近乎同时监测成千上万个神经元的网络活动的动态的能力。在哺乳类动物的皮层中，这种能力提供了获取深入了解用于信息处理的计算原理的机会，因为这种能力将允许捕获和关联皮层上的网络活动的动态。

此外，所公开的方法允许在较小型的生物(诸如果蝇或斑马鱼)中进行全脑成像，并且随着其扩展到三光子成像而允许用于在以前不可到达的组织深度处(例如，大于1毫米的深皮层区域)进行非侵入性细胞分辨率成像。

考虑到哺乳类动物皮层中神经元的平均大小(直径约10μm)，空间分辨率可以各向同性地降低到大约5μm，同时仍然允许可靠的单细胞分辨率。当使用核局部钙指示剂时特别是这种情况，即使在致密的皮层区域也是如此。然而，来自光学器件的根本约束不允许使激光光斑尺寸任意成形为这样的聚焦光斑尺寸，因为侧向定位的激发(w)和轴向定位的激发(z)由于z～2w²内在地耦合。因此，生成侧向5μm宽的激光焦点，相同的焦点将轴向延伸超过约40μm，因此不会为单神经元分辨率(single-neuron resolution)提供足够的光学切片。如上所述，时间聚焦(TeFo)避免了侧向光束参数和轴向光束参数之间的耦合的上述限制。

在各种情况下，可能需要以4MHz的重复率在最多约100nJ的激光脉冲能量下，通过成像系统100以3Hz的体积速率在500μm×500μm×500μm的预想体积上，实现高速单细胞分辨率钙成像。计算出的激光功率可以进一步设想具有12kHz且具有覆盖5μm×5μm×5μm体积的激发点的双向共振激光扫描。

在一示例性实施方式中，基于扫描时间聚焦，成像系统100可以用于散射脑组织中的功能钙成像。为了在表征和测试阶段进行不同的光学成像和扫描参数之间的可靠的比较，可以采用具有稳定荧光特性的标准非生物样本，不过这些样本类似于活体鼠脑的散射特性(所谓的“幻影组织(phantom-tissue)”)。此外，可以使用具有均匀分布的亚衍射荧光珠的定制测试样本来测量和优化由于在所公开的设置中采用的大扫描角度和长筒镜引起的像差和失真的影响。成像系统100可以改善成像速度和FOV。通过将空间多路复用策略和时间多路复用策略结合到扫描时间聚焦显微镜中，可以对成像体积、FOV和体积速度进行改进。

在空间多路复用中，如果共振扫描镜用于扫描器111，则体积成像速度会主要地受共振扫描镜的频率(约12kHz)的限制。因此，提高整体速度的可行途径是空间多路复用，其中，激发激光束可以例如被分成4个子光束，然后将这些子光束引导到FOV内的子区域并且并行扫描。与先前基于微透镜阵列的方法相比，定制衍射光学元件可以用于分开主光束以便提高效率和均匀性。必须仔细选择用于空间多路复用的光学设计，使得每个子束激发的荧光可以成像到单独的光电探测器上。为此，可以使用多阳极PMT(MA-PMT)127。在一个实施方式中，可以将MA-PMT 127与检测路径中的定制微透镜阵列125结合使用，该微透镜阵列将来自子区域的荧光聚焦到MA-PMT 127的探测器单元上。

可以使用计算设备131利用光学设计软件(例如)来模拟激发和检测路径，以使对于给定成像深度和组织散射，在各个探测器元件上的荧光的串扰最小化同时优化收集效率。对于约500μm的焦点分离和小于700μm的深度，该串扰可以是最小的。可以通过使用多通道光子计数器卡129在光子计数模式下同步地收集来自不同MA-PMT 127像素的信号。另外，诸如后处理中的去卷积的解多路复用方法可以进一步抑制散射引起的串扰。

时间多路复用是空间多路复用的可行替选方案，并且强有力的与空间多路复用相结合，其中激发激光可以被分开并且相对时间延迟可以被引入到各个子束。然后，每个子束可以被引导到图像FOV的另一子区域或者聚焦到不同的图像平面。这是一种特别有希望的方法，因为4MHz的示例性重复率对应于脉冲之间的250ns，因此允许有足够的时间来分开子束。在成像系统100中，各个光束可以相对于彼此延迟10ns，这与GCaMP荧光分子的通常寿命(例如，约3ns)相比足够长。然后可以将子束聚焦到不同的z平面(图7至图9所示)以允许同时的图像采集。然后，可以使用快速多通道计数器(dmCC)129通过基于MA-PMT 127处的到达时间将光子/信号分配到区域/平面而在电子后处理中执行解多路复用。

样本119处所需的毫瓦(mW)的平均激光功率可以根据体积大小(FOV)以及样本119上的时间聚焦光斑的直径(该平均激光功率等于成像系统100中的光学分辨率)标绘。例如，可以如下地实现满意的折中，其中，V-FOV为500μm×500μm×500μm，光斑大小为5μm宽，并且需要大约150mW的功率。在3MHz的重复率下，150mW的功率可以相当于每个脉冲50纳焦耳(nJ)。

如另一示例，如果设置扫描速度和数字化使得每个像素实际上只有一个激光脉冲，则即使在500μm深度和1040nm的激光波长下，也可以通过大约100nJ的脉冲能量产生足够的GCaMP信号，这对于GCaMP是次优的。

在一个实施方式中，时间聚焦技术(TeFo)可以与基于摄像机的检测方案一起用于宽视场(wide-field)配置。可以使用扫描时间聚焦方案(scanned temporal focusingscheme)，其不易于散射。此外，产生的荧光，包括散射的分量，可以通过专门设计的广角收集光学器件有效地耦合到光电倍增管(PMT)127上并分配给图像像素。虽然增加的5μm×5μm×5μm的激发体积可能自然地导致光学分辨率降低相同的幅度，但它仍然足以解析小鼠皮层中的单个神经元胞体，这是一种敏感的且最常用的在“活体(in vivo)”功能成像中用于神经元输出尖峰(neuronal output spiking)的替代读出。

在一些示例性实施方式中，可以在唤醒和有行为的小鼠中启用高速3D钙成像。例如，可以在扩展到500μm×500μm×500μm的体积并且高于3Hz的时间分辨率下执行3D成像。实现了高速3D钙成像的基于TeFo的双光子显微镜集合了多种特征。例如，激发体积可以根据感兴趣结构的大小“成形”。这导致每个体素的信号增大，同时促进了在非饱和荧光状况下的操作。此外，如所公开的，基于光纤的放大激光源(FCPA)130可以被设计为以与体素成像速率匹配的重复率传递最大脉冲能量，从而产生优化的信噪比。此外，FCPA的重复率可以很容易地调整，从而可以针对不同的体积成像需求保持最优化的信噪比配置。

所公开的技术的模块化设计允许简单直接地将例如4到8倍的空间和/或时间多路复用结合到设计中，直接转换为相同因数的V-FOV和/或时间分辨率的增加。此外，将三光子显微镜集成到成像系统100中，通过大量减少聚焦荧光的深度和激发光束的散射，能够实现深部脑结构的非侵入性成像。这可以通过光学参数放大器(OPA)来实现，该光学参数放大器可以将FCPA的发射波长转换到大约1400nm。

在各种实施方式中，通过采用光雕刻方法，激发区域可以成形为体积与感兴趣结构(例如，神经元胞体)相同的数量级。每个成像体素可以收集显著更多的GCaMP荧光，同时保持荧光分子的非饱和激发水平。降低的空间分辨率又可以交换更快的体积成像速率，因为需要扫描的每行的点更少、每帧的行更少且每个体积的图像平面更少。

图2示出了根据一实施方式的时间聚焦激光子束的空间多路复用的放大视图。根据样本119处的激光功率的可用性，可以选择空间域中的4倍空间多路复用(例如，2×2)，其中包括在光束109中的子束109a、109b、109c和109d的聚焦光斑例如分开500μm。如图2所示，可以通过将样本119分成4个四分之一Q1、Q2、Q3和Q4并将分散的子束聚焦到这4个四分之一来应用2×2的空间多路复用。时间聚焦光斑201、203、205和207可以被扫描在样本119上，使得每个时间聚焦光斑在一个FOV Q1、Q2、Q3和Q4内被扫描。

如先前关于公式(1)所讨论的，空间多路复用和时间多路复用取决于可用的激光功率，因为每个子束必须保持相同的脉冲能量。定制的抗反射涂层显微物镜133、以及仔细选择的其它时间聚焦光学器件确保了由于光学表面反射造成的损失可以保持最小。

图3示出了根据一实施方式的空间多路复用样本的扫描。附图3的图301、303、305、307、309和311示出了样本119的空间多路复用，其中，样本119被分成4个四分之一Q1、Q2、Q3和Q4。时间上聚焦的激光光斑201、203、205和207分别扫描样本119的所述四分之一Q1、Q2、Q3和Q4内的区域。可以由扫描器111基于蜿蜒的图案313来执行样本的扫描，但是也可以使用其它图案。在蜿蜒扫描期间，每个时间聚焦光斑201-207通过基于蜿蜒图案313在扫描区域内移动来扫描相应的区域Q1至Q4。

图4A至图4D示出了根据一实施方式的通过成像系统来扫描样本119的各个阶段。图4A至图4D是通过成像系统100在样本119上移动子束109a来扫描样本119的简化表示。子束109通过望远镜117(图4A至图4D中未示出)聚焦在样本119上，并且子束109a通过借助包括在扫描器111中的扫描器元件407改变施加到子束109a的角度偏转量来扫描通过样本119。扫描器元件407连续地改变子束109a的偏转角度，如箭头403所示，这导致在图4A到图4D中聚焦光斑201的位置的变化。由于移动子束109a，因此聚焦光斑201可以在样本119上移动并扫描该样本。例如，在图4A中所示的时间t1，聚焦光斑201位于所示的位置。在时间t2(图4B)，聚焦光斑201已经从位置405(聚焦光斑201的位置)移动并且在如409所示的方向上移动。在时间t2，激光模块139不输出光脉冲，尽管图4B示出了如果在时间t2输出脉冲的假设下子束109a将采用的路径。图4C示出了在时间t3(Δt≈t3-t1)处的聚焦光斑201，其中，聚焦光斑在初始位置405和图4C中所示出的位置之间的移动距离显示为Δd。类似地，再经过从t3到图4D中的t4的一段时间Δt之后(Δt≈t4-t3)，聚焦光斑201从位置411(图4C中聚焦光斑201在时间t3时的位置)移动到图4D中所示的位置。因此，扫描器111通过连续移动子束109a来使聚焦光斑201扫描通过样本119，使得样本119上的子束109a的聚焦光斑201每经过时间Δt移动距离Δd。距离Δd约等于聚焦光斑201的宽度，如图4D中所示的初始位置405、位置411以及聚焦光斑201的位置之间的位置差异所示出的。

图5示出了根据一实施方式的时间多路复用的可视化。激光模块139可以包括光学延迟模块500，该光学延迟模块被配置为将光学脉冲分成多个子脉冲并在各个子脉冲之间引入相对时间延迟或者在子脉冲之间引入时间延迟的替选方式。在图5示出的示例中，光学延迟模块500包括三路分束器(three-way beam splitter)520，该三路分束器将激光模块139产生的主光脉冲501分成三个子脉冲503、505和507。这三个子脉冲503、505和507经由各自的光学路径514、516和520从三路分束器520行进到光组合器530。光学路径514、516和518可以只是用于自由空间传播的导管，或者这些光学路径可以采用光纤的形式。然而，在每种情况下，光学路径的路径长度是不同的，使得每个子脉冲503、505和507通过它们各自的路径所需的时间是不同的。

因此，第二子脉冲505的第二光学路径516的长度可以选择为相对于第一子脉冲503的第一光学路径514的长度不同，使得将相对于子脉冲503的大约10ns(纳秒)的第一时间延迟引入到子脉冲505中。类似地，通过提供相对于第一光学路径和第二光学路径具有适当长度的第三光学路径518，将相对于子脉冲503的大约20ns(且相对于子脉冲505的大约10ns)的第二时间延迟引入到第三子脉冲507中。

多个子脉冲503、505和507由光学组合器重新组合成主光束输出、或者激光模块139紧邻的多个输出。光学组合器可以是镜和/或透射元件或以将子脉冲在相同方向上重新定向的方式布置的其它元件的组合。特别地，光学组合器可以采用偏振或非偏振光学分束器的形式。为了便于讨论，组合的子脉冲可以统称为“光脉冲515”或“子脉冲集合”。

光学延迟模块500还优选地包括设置在三路分束器520和光学组合器530之间的聚焦透镜509、511和513的布置。子脉冲503可以由具有第一发散度的透镜509聚焦，从而使子脉冲503聚焦到样本119中的第一z平面。子脉冲505由具有第二发散度的透镜511聚焦，从而使子脉冲505聚焦到样本119中的不同于第一z平面的第二z平面。子脉冲507由具有第三发散度的透镜513聚焦，从而使子脉冲507聚焦到样本119中的不同于第一z平面和第二z平面的第三z平面。特别地，可以布置和选择这些聚焦透镜以及其它光学元件的相应角度和位置，使得所有脉冲聚焦在目标体积内的相同深度处，但是指向相邻的多个平面，如将在下面参考图6B进一步讨论的。

在一些示例中，可以将光脉冲515发送到分束器(诸如图1中所示的分束器107)，以使用多个子光束执行空间多路复用和时间多路复用两者，其中，每个子光束包括包含多个子脉冲的光脉冲(诸如光脉冲515)。在一些示例中，成像设备可以使用时间多路复用与空间多路复用，并且在将主光脉冲501分为一系列时间延迟的子脉冲之后不执行该分束。尽管本发明中示出的示例将主光脉冲划分为用于时间多路复用的三个子脉冲，但是在一些示例中，可以替代地将主光脉冲分为两个子脉冲，或者将主光脉冲分为4个或更多个子脉冲，其中，这些子脉冲之间具有相对的时间延迟。

尽管本发明示出的示例在包含在光脉冲515中的子脉冲503、505和507之间使用大约10ns的相对时间延迟，但是也可以使用其它的时间延迟量。例如，在主光脉冲510具有4MHz(对应于连续脉冲之间的250ns)的重复率的情况下，对于三个子脉冲，可以在子脉冲之间使用高达250ns/3或大约80ns的相对时间延迟。该相对时间延迟应该比预期的荧光衰减时间长，预期的荧光衰减时间对于GCaMP荧光分子来说约为3ns；因此，对于这种应用来说，长于约3ns的相对时间延迟是优选的。在一些示例中，相对时间延迟可以为100ns或更长、50ns或更长、20ns或更长、10ns或更长、5ns或更长、2ns或更长、或者1ns或更长。

根据样本119处期望的激光功率量，在一些示例中，可以选择空间域中的4倍多路复用((例如，2×2)，其中各焦点109分开500μm)结合在时域中的高达4倍的多路复用，以同时在多个z平面成像(类似于图6至图9中所示的4×3空间和时间多路复用)。利用这些改进，可以以至少3Hz的帧速率实现1mm×1mm×0.7mm的V-FOV。可替选地，可以采用时间多路复用而不采用空间多路复用来以至少12Hz的帧速率成像500μm×500μm×500μm的V-FOV。应注意，即使由于使用单个光脉冲对每个体素成像而处于较高脉冲能量下，预计生物损伤也不会成为限制因素。这是因为功率分布在大约5μm×5μm×5μm的体积上，这比标准双光子显微镜中常规使用的衍射极限体积大了约1000倍。

图6A示出了根据一实施方式的穿透样本的时间多路复用的子脉冲。如图1中示出的子光束路径所示出的，将图5的时间多路复用的子脉冲503、505和507重新组合成的光脉冲515发送到样本119。由于将不同的发散度应用到各个子脉冲503、505和507，因此将各个子脉冲503、505和507聚焦到样本119中不同的各自的z平面。在图6A所示出的示例中，子脉冲503被聚焦到深度Z1处的第一z平面并在第一z平面上产生用于激发样本119的相应聚焦光斑；子脉冲505(相对于子脉冲503具有10ns的时间延迟)被聚焦到深度Z2处的第二z平面并在第二z平面上产生用于激发样本119的相应聚焦光斑，其中，深度Z2不同于且大于深度Z1；以及子脉冲507(相对于子脉冲503具有20ns的时间延迟且相对于子脉冲505具有10ns的时间延迟)被聚焦到深度Z3处的第三z平面并在第三z平面上产生用于激发样本119的相应聚焦光斑，其中，深度Z3不同于且大于深度Z1和深度Z2。为了便于讨论，这也可以描述为穿透深度Z1的子脉冲503、穿透深度Z2的子脉冲505以及穿透深度Z3的子脉冲507。

为了实现在不同深度处的聚焦，如图6A所示，需要沿光束传播在略微不同的轴向位置布置多个时间聚焦光栅115’。实现这一点的特定方式是使用支撑这多个时间聚焦光栅115’的多元件光栅组件1300，如图13所示。组件1300通常包括底座1302，底座1302形成有从底座向上延伸的多个支腿1304，在每个支腿的末端支撑有时间聚焦光栅115’。支腿1304相对于底座1302具有不同的各自的高度，使得时间聚焦光栅115’将沿着光束路径1306定位在不同的轴向位置处(当组件1300安装在系统中时，支腿1304将垂直于底座1302)。

图6B示出了根据一实施方式的使用单个光栅115(如图1所示)穿透样本的时间多路复用的子脉冲。将图5的时间多路复用的子脉冲503、505和507发送到样本119，使得子脉冲被聚焦在样本的相同深度处，但是指向相邻的平面。在图6B所示出的示例中，子脉冲503被聚焦到深度Z1处的第一平面区域并在第一平面区域上产生用于激发样本119的相应聚焦光斑；子脉冲505(相对于子脉冲503具有10ns的时间延迟)被聚焦到同一深度Z1处的第二平面区域并在第二平面区域上产生用于激发样本119的相应聚焦光斑；以及子脉冲507(相对于子脉冲503具有20ns的时间延迟且相对于子脉冲505具有10ns的时间延迟)被聚焦到与第一平面区域和第二平面区域同一深度Z1处的第三平面区域并在第三平面区域上产生用于激发样本119的相应聚焦光斑。

尽管在图6A和图6B中仅示出了三个时间多路复用的子脉冲，但是时间多路复用的子脉冲的数量并不限于三个，例如，可以使用具有相应延迟和聚焦深度/平面区域的四个或更多个子脉冲。尽管图6A示出了其中子脉冲被聚焦到与增加的时间延迟相关的增大深度的示例，但是在一些示例中聚焦深度和时间延迟可以不以这种方式相关。

图7、图8以及图9示出了根据一实施方式的时间和空间多路复用的穿透样本的光束的可视化，该时间和空间多路复用的光束包括多个子光束，每个子光束传送光脉冲，每个光脉冲包括多个子脉冲。具体地，这些可视化涉及使用4×3空间和时间多路复用的成像系统，其中4个子光束515a、515b、515c和515d各自指向相应部分(在这些示例中，相应的四分之一Q1-Q4)并且每个子光束重复地传送3个子脉冲的集合，这3个子脉冲是相对时间延迟的并且聚焦在相应的且不同的深度(在相应的z平面中)处。可以如上所述(诸如参考图1至图3)执行产生四个子光束515a、515b、515c和515d的空间多路复用，并且可以如上所述(诸如参考图5和图6)执行产生均包括三个子脉冲集合的光脉冲的时间多路复用。可以如上所述(诸如参考图1、图3和图4)执行子光束515a、515b、515c和515d的偏转以扫描样本119的在它们的相应部分内的体素。尽管仅示出了四个空间多路复用的子光束515a、515b、515c和515d，但是空间多路复用的子光束的数量并不限于四个。可以将样本119划分为多于四个部分，伴随的是子光束的数量相应的增加。类似地，每个子脉冲集合中可以包括多于三个子脉冲，并且z平面的数量相应的增加。

每个子光束515a至515d都包括并重复传送时间上多路复用的光脉冲，每个时间上多路复用的光脉冲都包括多个子脉冲(诸如图5和图6所示的包括在光脉冲515中的时间上多路复用的子脉冲503、505和507)，并且这些子脉冲以各自的深度Z1(对应于z-平面#1)、Z2(对应于z-平面#2)、以及Z3(对应于z-平面#3)穿透到样本119中。此外，每个子光束515a-515d用于扫描样本119的一个相应部分或分区(例如，四分之一Q1、Q2、Q3和Q4)。因此，可以提供样本的三维扫描，其中，由光学扫描器(诸如结合图1所讨论的执行图3中示出的蜿蜒图案313的一次经过的扫描器111)执行的完整2D扫描序列导致在三个不同深度处穿过成像平面(如示出的Z-平面#1、Z-平面#2以及Z-平面#3)扫描12个焦点来扫描样本119。

在图8中，在对第一组的三个平面z-平面#1、z-平面#2以及z-平面#3成像之后，子光束515a-515d的聚焦光斑继续穿透到样本119中，使得Z-平面在z方向上移动，例如，Z-平面#1从其先前位置移动到新位置Z-平面#4。类似地，Z-平面#2和Z-平面#3分别移动到新位置Z-平面#5和Z-平面#6。可以继续这种位置变化，使得z-平面#1和z-平面#2之间的体素全部被扫描。

在图9中，示出了另一种平面移动。不是将z-平面#1移动到z-平面#1和z-平面#2之间的新位置，而是将z-平面#1移动到大于z-平面#3深度处的z-平面#7。

图10A至图10B示出了根据一实施方式的扫描光脉冲(无论是否是时间多路复用的子脉冲)的聚焦光斑。可以在成像视场(FOV)1023上扫描小尺寸的时间聚焦光斑1021。FOV1023可以为样本119的切片，该切片的图像由图像系统100捕捉。光脉冲(无论是否是时间上多路复用的子脉冲)穿透进入样本119的深度可以扫描样本119的切片的堆叠1031。每个切片1023类似于图7至图9中的Z-平面。聚焦光斑1021可以类似于图2和图7中所示的光斑201、203、205和207。例如，时间聚焦光斑1021的大小可以是大约5μm×5μm×5μm。由于光雕刻，样本119的激发可以被各向同性地限制，因此在轴向方向x、y或z上(如坐标系1025、1027和1029所示出的)提供单个神经元光学切片能力。可以通过样本119的轴向扫描来执行体积采集。该轴向扫描可以使得通过光电倍增管(PMT)127(如图1所示)来检测激发的荧光。如之前在图3中所示出的，通过时间聚焦光斑1021来扫描样本119的切片1023可以使用蜿蜒图案1033执行。

在一些实施方式中，可以建立基于显微镜的宽视场时间聚焦的各种模态。本文描述了时间聚焦的扫描变型，该变型被适当地命名为扫描时间聚焦。扫描时间聚焦可以与最新的最先进的基于光纤的激光放大器以及空间和时间多路复用相结合，以规避和优化双光子激光扫描显微镜的设计。例如，通过对5μm×5μm×5μm的激发体积进行光雕刻并快速扫描图像FOV上的激发体积，可以显著提高平面采集速度，而不会牺牲单神经元分辨率。将重复率(例如，每秒的激光脉冲)与每秒采集的体素的数量相匹配进一步提供了最佳的信噪比，因为在图像像素采集期间仅可以使用单个激光脉冲来激发样本，如公式(1)所示，从而散射噪声进一步最小化。

图11示出了根据一实施方式的小鼠的表达核限制的红色荧光蛋白的听觉皮层中的活体体积堆叠采集。可以使用5μm的光斑扫描时间聚焦配置和如图1中所示的扫描器11(例如，检流计镜)来采集堆叠1101。激光模块139的平均功率可以根据深度而在25mW和50mW之间。标尺1103显示了从100μm到600μm的深度。图像1105a、1105b、1105c和1105d是堆叠1101的放大图像。即使在超过500μm的深度，神经元核也能被清晰地分辨出来，如图像1105d所示。

图12为示出可以在其上实施本发明的各方面的计算机系统1200的框图，该计算机系统诸如但不限于多通道计数卡(dmCC)129和计算设备131。计算机系统1200包括总线1202或用于传递信息的其它通信机制、以及与总线1202联接的用于处理信息的处理器1204。计算机系统1200还包括主存储器1206(诸如随机存取存储器(RAM)或其它动态存储设备)，该主存储器联接到总线1202且用于存储信息和待由处理器1204执行的指令。主存储器1206还可以用于在执行待由处理器1204执行的指令期间存储临时变量或其它中间信息。计算机系统1200还包括联接到总线1202且用于存储静态信息和用于处理器1204的指令的只读存储器(ROM)1208或其它存储设备。提供了用于存储信息和指令的存储设备1210(诸如磁盘或光盘)并将存储设备1210联接到总线1202。

可以响应于识别WLAN问题而执行各种其它动作。在一些情况下，可以响应于检测到不良的无限路由器而自动将替换的无线路由器分派给客户。在一些情况下，可以自动通知客户(例如，通过电子邮件和弹出窗口)关于可能影响客户位置处的服务质量的潜在的WLAN问题或潜在有问题的设备。在一些情况下，系统可以自动推荐WLAN更改，诸如升级无线路由器、升级客户端设备、建议移动或放置无线路由器或客户端设备、以及建议使用无线网络中继器。在一些情况下，可以将关于WLAN状况的信息自动包含在月度账单或在线账户网页中。在一些情况下，可以将联系客户支持(customer support)的客户的网络状况收集在数据库中，并将该网络状态用于动态和/或自动识别客户不满意的原因，例如，可以识别和评估无线路由器模型以与其它网络硬件和客户端设备兼容，并且可以收集关于CPE 132(其包括集成的无线路由器)的信息以随时间改善质量。

计算机系统1200可以通过总线1202联接到显示器1212(诸如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD))，以用于向计算机用户显示信息。将包括字母数字键和其它键的输入设备1214联接到总线1202，以用于将信息和命令选择传送到处理器1204。另一类型的用户输入设备是光标控制1216(诸如鼠标、追踪球、或光标方向键)，以用于将方向信息和命令选择传送到处理器1204并且用于控制显示器1212上的光标移动。该输入设备通常在允许设备指定平面中的位置的两个轴线(第一轴线(例如，x)和第二轴线(例如，y))上具有两个自由度。另一类型的用户输入设备为触摸屏，该触摸屏通常将显示器1212与记录显示器1212上的触摸的硬件组合。

本发明涉及计算机系统(诸如计算机系统1200)的用于实现本文描述的技术的使用。在一些示例中，这些技术由计算机系统1200响应于处理器1204执行包含在主存储器1206中的一个或多个指令的一个或多个序列来执行。这些指令可以从另一个机器可读介质(诸如存储设备1210)读入主存储器1206。包含在主存储器1206中的指令序列的执行使得处理器1204执行本文描述的处理步骤。在一些示例中，可以使用硬连线电路代替软件指令或与软件指令组合来实现本发明的各个方面。因此，实现方式并不限于硬件电路和软件的任何特定组合。

本文中使用的术语“机器可读介质”是指参与提供使机器以特定方式操作的数据的任何介质。在使用计算机系统1200实现的一些示例中，各种机器可读介质涉及例如向处理器1204提供用于执行的指令。这种介质可以采用许多形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质例如包括光盘或磁盘(诸如存储设备1210)。易失性介质包括动态存储器(诸如主存储器1206)。传输介质包括同轴线缆、铜线和光纤，包括包含总线1202的线。传输介质还可以采用声波或光波(诸如在无线电波和红外数据通信期间所产生的声波或光波)的形式。所有的这些介质都必须是有形的，以使由这些介质所承载的指令能够通过将指令读入机器的物理机制来检测。

常见形式的机器可读介质例如包括软盘、软磁盘、硬盘、磁带或任何其它磁介质、CD-ROM、任何其它光介质、穿孔卡、纸带、任何其它具有孔图案的物理介质、RAM、PROM以及EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或存储盒、如下所述的载波、或计算机可以从中读取的任何其它介质。

各种形式的机器可读介质可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器1204以供执行。例如，这些指令最初可以承载在远程计算机的磁盘上。远程计算机可以将这些指令加载到其动态存储器中，并使用调制解调器通过电话线发送这些指令。计算机系统1200本地的调制解调器可以在电话线上接收数据并使用红外发射器将数据转换成红外信号。红外探测器可以接收红外信号中承载的数据，并且适当的电路可以将数据置于总线1202上。总线1202将数据传送到主存储器1206，处理器1204从主存储器1206中检索并执行指令。由主存储器1206接收的指令可以可选地在由处理器1204执行之前或之后存储在存储设备1210上。

计算机系统1200还包括联接到总线1202的通信接口1218。通信接口1218提供联接到网络链路1220的双向数据通信，网络链路1220连接到本地网络1222。例如，通信接口1218可以为用于提供与相应类型的电话线的数据通信连接的综合业务数据网络(IntegratedServices Digital Network，ISDN)卡或调制解调器。作为另一示例，通信接口1218可以为用于提供与兼容LAN的数据通信连接的局域网(Local Area Network，LAN)卡。还可以实现无线链路。在任何这样的实现中，通信接口1218发送和接收承载表示各种类型信息的数字数据流的电信号、电磁信号或光信号。

网络链路1220通过一个或多个网络提供与其它设备的数据通信。例如，网络链路1220可以通过本地网络1222提供与主计算机1220或者与由因特网服务提供商(InternetService Provider，ISP)操作的数据设备的连接。ISP 1226又通过现在通常称为“因特网”1228的全球分组数据通信网络提供数据通信服务。本地网络1222和因特网1228都使用承载数字数据流的电信号、电磁信号或光信号。通过各种网络的信号和网络链路1220上的信号以及通过通信接口1218的信号(其将数字数据传送到计算机系统1200并从计算机系统1200传送数字数据)是传输信息的载波的示例性形式。

计算机系统1200可以通过(一个或多个)网络、网络链路1220以及通信接口1218发送消息并接收数据(包括程序代码)。在因特网示例中，服务器1230可以通过因特网1228、ISP 1226、本地网络1222以及通信接口1218发送用于应用程序的所请求的代码。

所接收的代码可以在其被接收时由处理器1204执行，和/或将所接收的代码存储在存储设备1210中或者存储在非易失性存储器中以供以后执行。以这种方式，计算机系统1200可以获取以载波的形式的应用程序代码。

上述示例中各种部件的分离不应理解为在所有示例中都需要这种分离，而应理解为所描述的部件和系统可以通常一起集成在单个包装中或者集成到多个系统中。

虽然上文已经描述了被认为的最佳模式和/或其它示例，但是应当理解，可以在其中进行各种修改，并且本文所公开的主题可以以各种形式和示例实现，并且这些教导可以应用于许多应用中，而本文仅描述了其中的一些应用。所附权利要求旨在要求保护落入本教导的真实范围内的任何和所有的应用、修改和变型。

除非另有说明，否则在本说明书中阐述的所有测量值、值、额定值、位置、量级、尺寸和其它规格，包括在所附的权利要求中阐述的所有测量值、值、额定值、位置、量级、尺寸和其它规格，都是近似的，而不是精确的。它们旨在具有合理的与它们所涉及的功能一致以及与它们所属的技术的惯例一致的范围。

除非上文所述，否则任何已经陈述的或示出的内容，无论是否在权利要求中阐述，均不旨在或不应被解释为使得任何部件、步骤、特征、对象、益处、优势的奉献或等同于公众。

应当理解，除非本文另有阐述的具体含义，否者本文中使用的术语和表达具有与其相应的各自的研究和探究领域相关的这些术语和表达一致的普通含义。诸如第一和第二等的关系术语可以仅用于将一个实体或动作与另一实体或动作区分开，而不必要求或暗示这种实体或动作之间的任何这种实际的关系或顺序。术语“包括”、“包含”或其任何其它变型旨在涵盖非排他性包含，使得包括元件列表的过程、方法、物品或装置不仅包括那些元件，而且可以包括未明确列出的或者这种过程、方法、物品或装置所固有的其它元件。在没有进一步限制的情况下，由“一个”或“一种”开头的元件不排除包括该元件的所述过程、方法、物品或装置中的其它相同的元件的存在。

在上述实施方式收集、存储或使用由个人提供的个人信息的范围内，应该理解，这些信息应根据有关个人信息保护所适用的所有法律来使用。此外，这这类信息的收集、存储和使用可能需要得到个人对于这类活动的同意，例如，通过公知的如对于情况和信息类型可能适合的“选择加入(opt-in)”或者“选择退出(opt-out)”过程。个人信息的存储和使用可以以适当且安全的方式反映信息的类型，例如，通过针对特别敏感信息的各种加密和匿名化技术。

在上文详细的描述中，可以看出，出于简化本发明的目的，在各种示例中将各种特征组合在一起。本发明的方法不应被解释为反映权利要求需要比每项权利要求所明确阐述的更多的特征的意图。而是如所附的权利要求所反映的，发明主题在于少于单个公开示例的所有特征。因此，将所附加的权利要求并入到详细的描述中，其中，每一项权利要求以其自身作为单独要求保护的主题。

Claims (25)

1.一种成像系统，包括：

激光模块，所述激光模块用于输出激光脉冲；

光学延迟模块，所述光学延迟模块被配置为将从所述激光模块接收的激光脉冲分成包括第一子脉冲和第二子脉冲的多个子脉冲，并且在所述第一子脉冲和所述第二子脉冲之间引入时间延迟；

望远镜，所述望远镜用于将所述子脉冲从所述光学延迟模块传送到目标体积；以及

光电探测器，所述光电探测器被配置为响应于由所述第一子脉冲和所述第二子脉冲激发所述目标体积而收集在所述目标体积内产生的光子。

2.如权利要求1所述的成像系统，其中，所述光学延迟模块包括：

分束器，所述分束器被配置为将所述激光脉冲分成所述多个子脉冲；以及

光学组合器，所述光学组合器用于组合所述第一子脉冲和所述第二子脉冲以形成包括所述第一子脉冲和所述第二子脉冲的时间多路复用的激光脉冲；

其中，所述望远镜将所述时间多路复用的激光脉冲传送到所述目标体积。

3.如权利要求2所述的成像系统，其中，所述光学延迟模块还包括至少两个光学路径，所述至少两个光学路径用于通过自由空间传播或通过光纤在所述第一子脉冲和所述第二子脉冲之间引入所述时间延迟。

4.如权利要求2所述的成像系统，其中，所述光学延迟模块还包括：

具有第一发散度的第一聚焦透镜，所述第一聚焦透镜用于将从所述分束器接收的所述第一子脉冲聚焦到所述目标体积内的第一深度；以及

具有第二发散度的第二聚焦透镜，所述第二聚焦透镜用于将从所述分束器接收的所述第二子脉冲聚焦到所述目标体积内的第二深度。

5.如权利要求4所述的成像系统，还包括：空间多路复用模块，所述空间多路复用模块被配置为从所述光学延迟模块接收所述时间多路复用的激光脉冲，所述空间多路复用模块包括用于将所述时间多路复用的激光脉冲分成多个子光束的分束器，所述多个子光束包括第一子光束和第二子光束，所述第一子光束和所述第二子光束相对于在所述目标体积内的所述第一深度处形成的第一图像平面在空间上分离以及相对于在所述目标体积内的所述第二深度处形成的第二图像平面在空间上分离。

6.如权利要求5所述的成像系统，其中，所述空间多路复用模块还包括扫描器，所述扫描器用于对所述第一子光束和所述第二子光束进行角度偏转，从而所述第一子光束和所述第二子光束分别在所述第一图像平面的第一聚焦区域和所述第二图像平面的第二聚焦区域上被扫描。

7.如权利要求6所述的成像系统，其中，所述激光模块被配置为输出包括以第一重复率和持续时间发射的光脉冲的激光束，并且其中，所述空间多路复用模块还包括控制器，所述控制器被配置为以基于所述第一重复率的速率移动所述扫描器，使得在所述激光模块的连续脉冲的发射之间，由所述激光模块输出的光在所述目标体积内的聚焦光斑在第一方向上偏转大约所述聚焦光斑在所述第一方向上的宽度。

8.如权利要求6所述的成像系统，还包括：时间聚焦光栅，所述时间聚焦光栅用于从所述扫描器接收角度偏转的所述第一子光束和所述第二子光束，并且用于将角度偏转的所述第一子光束和所述第二子光束中的光脉冲分散成它们各自的光谱分量。

9.如权利要求1所述的成像系统，其中，所述光电探测器包括：

光电倍增管；以及

用于聚焦在所述目标体积内产生的所述光子的透镜阵列。

10.一种成像系统，包括：

激光模块，所述激光模块用于输出激光脉冲；

空间多路复用模块，所述空间多路复用模块被配置为从所述激光模块接收所述激光脉冲，所述空间多路复用模块包括分束器，所述分束器用于将所述激光脉冲分成包括第一子光束和第二子光束的多个子光束，所述第一子光束和所述第二子光束相对于在目标体积内的第一深度处形成的第一图像平面在空间上分离；

望远镜，所述望远镜用于将所述第一子光束和所述第二子光束从所述空间多路复用模块传送到所述目标体积；以及

光电探测器，所述光电探测器被配置为响应于由所述第一子光束和所述第二子光束激发所述目标体积而收集在所述目标体积内产生的光子。

11.如权利要求10所述的成像系统，其中，所述空间多路复用模块还包括扫描器，所述扫描器用于对所述第一子光束和所述第二子光束进行角度偏转，从而所述第一子光束和所述第二子光束分别在所述第一图像平面的第一聚焦区域和第二聚焦区域上被扫描。

12.如权利要求11所述的成像系统，其中，所述激光模块被配置为输出包括以第一重复率和持续时间发射的光脉冲的激光束，并且其中，所述空间多路复用模块还包括控制器，所述控制器被配置为以基于所述第一重复率的速率移动所述扫描器，使得在所述激光模块的连续脉冲的发射之间，由所述激光模块输出的光在所述目标体积内的聚焦光斑在第一方向上偏转大约所述聚焦光斑在所述第一方向上的宽度。

13.如权利要求11所述的成像系统，其中，所述空间多路复用模块还包括：时间聚焦光栅，所述时间聚焦光栅用于从所述扫描器接收角度偏转的所述第一子光束和所述第二子光束，并且用于将角度偏转的所述第一子光束和所述第二子光束中的光脉冲分散成它们各自的光谱分量。

14.如权利要求10所述的成像系统，其中，所述光电探测器包括：

光电倍增管；以及

用于聚焦在所述目标体积内产生的所述光子的透镜阵列。

15.一种用于在目标体积内进行荧光分子的高速成像的方法，所述方法包括：

提供脉冲激光束，所述脉冲激光束包括持续时间均小于10ps的脉冲；

将所述脉冲激光束的脉冲分成包括第一子脉冲和第二子脉冲的多个子脉冲；

在进入所述目标体积的所述第一子脉冲和进入所述目标体积的所述第二子脉冲之间引入时间延迟；以及

响应于由所述第一子脉冲和所述第二子脉冲激发所述目标体积而收集在所述目标体积内产生的光子。

16.如权利要求15所述的方法，其中，由所述第一子脉冲和所述第二子脉冲激发所述目标体积包括使用双光子激发方案、三光子激发方案、或其组合激发所述目标体积内的荧光分子。

17.如权利要求15所述的方法，其中，通过自由空间传播或通过光纤在所述第一子脉冲和所述第二子脉冲之间引入所述时间延迟。

18.如权利要求15所述的方法，还包括将所述第一子脉冲和所述第二子脉冲聚焦在所述目标体积内的公共平面上。

19.如权利要求15所述的方法，还包括：

将所述第一子脉冲聚焦在所述目标体积内的第一深度处；以及

将所述第二子脉冲聚焦在所述目标体积内的第二深度处，所述第二深度不同于所述第一深度。

20.如权利要求19所述的方法，还包括：

将所述第一脉冲和所述第二脉冲组合以形成包括所述第一子脉冲和所述第二子脉冲的时间多路复用的激光脉冲；

将所述时间多路复用的激光脉冲空间分离成包括第一子光束和第二子光束的多个子光束，所述第一子光束和所述第二子光束相对于在所述目标体积内的所述第一深度处形成的第一图像平面在空间上分离，以及相对于在所述目标体积内的所述第二深度处形成的第二图像平面在空间上分离；以及

将空间分离和时间多路复用的所述激光脉冲传送到所述目标体积。

21.如权利要求20所述的方法，还包括：使用扫描器对所述第一子光束和所述第二子光束进行角度偏转，从而所述第一子光束和所述第二子光束分别在所述第一图像平面的第一聚焦区域和所述第二图像平面的第二聚焦区域上被扫描。

22.如权利要求21所述的方法，还包括：以基于所述脉冲激光束的重复率的速率移动所述扫描器，使得在所述脉冲激光束的连续脉冲的发射之间，由激光模块输出的光在所述目标体积内的聚焦光斑在第一方向上偏转大约所述聚焦光斑在所述第一方向上的宽度。

23.一种用于在目标体积内进行荧光分子的高速成像的方法，所述方法包括：

提供脉冲激光束，所述脉冲激光束包括持续时间均小于10ps的脉冲；

将所述脉冲激光束分成包括第一子光束和第二子光束的多个子光束，所述第一子光束和所述第二子光束相对于在所述目标体积内的第一深度处形成的第一图像平面在空间上分离；

将所述第一子光束和所述第二子光束传送到所述目标体积；以及

响应于由所述第一子脉冲和所述第二子脉冲激发所述目标体积而收集在所述目标体积内产生的光子。

24.如权利要求23所述的方法，还包括：使用扫描器对所述第一子光束和所述第二子光束进行角度偏转，从而所述第一子光束和所述第二子光束分别在所述第一图像平面的第一聚焦区域和第二聚焦区域上被扫描。

25.如权利要求24所述的方法，还包括：以基于所述脉冲激光束的重复率的速率移动所述扫描器，使得在所述脉冲激光束的连续脉冲的发射之间，由激光模块输出的光在所述目标体积内的聚焦光斑在第一方向上偏转大约所述聚焦光斑在所述第一方向上的宽度。