KR20190082252A - 다중화 스캐닝 시간 포커싱을 이용한 고속 심부조직 촬영 시스템 - Google Patents

다중화 스캐닝 시간 포커싱을 이용한 고속 심부조직 촬영 시스템 Download PDF

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유니버시티 오브 비엔나
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Abstract

조직 촬영 시스템은, 레이저 펄스를 출력하는 레이저 모듈, 상기 레이저 모듈로부터 수신된 레이저 펄스를 복수의 시간 지연 서브 펄스로 분할하도록 구성된 광 지연 모듈, 상기 광 지연 모듈로부터 목표 용적으로 상기 서브 펄스를 전달하는 망원경, 및 상기 제1 및 제2 서브 펄스에 의한 상기 목표 용적의 여기에 응답하여 상기 목표 용적 내에 생성된 광자를 수집하도록 구성된 광 검출기를 포함한다. 상기 시스템은, 상기 광 지연 모듈로부터 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 수신하도록 구성되며 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 제1 서브 빔 및 제2 서브 빔을 포함하는 복수의 서브 빔으로 분할하는 공간 다중화 모듈을 더 포함할 수 있고, 상기 제1 서브 빔 및 상기 제2 서브 빔은 상기 목표 용적 내에서 제1 깊이에 형성된 제1 상평면 및 상기 목표 용적 내에서 제2 깊이에 형성된 제2 상평면에 대해 공간적으로 분리된다.

Description

다중화 스캐닝 시간 포커싱을 이용한 고속 심부조직 촬영 시스템
본 출원은 2016년 10월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/414,788호에 기초하여 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전체가 모든 목적으로 본 명세서에 포함된다.
현대 신경 과학의 주요 목표는 신경 네트워크가 어떻게 인지적으로 관련된 기능들을 수행하는가를 이해하는 것이다. 이러한 목표를 달성하기 위해서는, 가장 단순한 신경망일지라도, 신경망의 블록들을 구성하는 대형 뉴런들의 활동을 동시에 독립적으로 기록하는 것이 유용하다. 그러나, 이러한 작업은 가용 도구 및 기술의 단점들로 인해 방해되었다.
광학 현미경의 한 유형은 설치류 뇌에서 수만 개의 뉴런으로부터의 활동을 거의 동시에 기록할 수 있게 함으로써 이러한 문제를 해결하며, 이에 따라 인간 뇌의 다양한 건강 및 병리학적 상태를 포함하여 포유류 뇌에서 정보 처리의 기본 원리를 이해하는데 큰 도약을 가능하게 한다.
상기 현미경은 펄스 특성이 최적화된 레이저 시스템과 조합되는 다중화 스캐닝 시간 포커싱(multiplexed scanned temporal focusing; MuST) 전략을 사용한다. MuST는 국부적인 마이크로 회로를 완전한 대뇌 피질 네트워크의 수준으로 가교하는 변형 기술이다. 그러나, 단일 세포 해상도 및 생리적 시간 스케일(예컨대, 5 Hz보다 빠른 것)을 갖는, 예컨대, 500×500×500 마이크로미터(μm)보다 큰 대형 대뇌 피질 용적의 비편향 기능적 촬영을 수행하는 것은 여전히 과제로 남아있다.
포유류 피질의 뉴런 네트워크 활동은, 감각 지각, 운동 행동의 생성, 또는 기억 형성과 같은 복잡한 뇌 기능을 지원한다. 이 과정을 이해하기 위해서는, 이상적으로는 기능적 대뇌 피질 네트워크를 포함하는 대형 대뇌 피질 용적 내의 모든 뉴런에서 높은 시공간 해상도로 기록할 필요가 있다. 지난 10년 동안, 2-광자 주사 현미경 검사법(two-photon scanning microscopy; 2PM) 및 유전자 재조합 칼슘 센서(genetically encoded calcium indicator; GECI)의 조합이 뉴런 활동의 광학 판독을 위한 필수 도구로 떠올랐다. GCaMP와 같은 GECI의 변형은, 뉴런의 효율적이고 세포형 특이적인 라벨링 및 뉴런 활동의 대용인 세포 내 칼슘 수준의 변화에 대한 민감한 광학 기록에 널리 사용된다. 그러나, 종래의 2-광자 주사 현미경 검사법의 기계적 및 광학적 제약은, 유효 용적 측정 시야(volumetric field-of-view; V-FOV) 및 뉴런 네트워크 역학이 포착될 수 있는 시간 해상도를 심각하게 제한한다.
2-광자 주사 현미경 검사법은 거의 회절 한계 광학 해상도, 우수한 신호 대 잡음비를 특징으로 하며, 중요하게는, 1-광자 여기(one-photon excitation)를 기반으로 하는 다른 고속 용적 촬영 접근법과는 달리, 개선된 깊이 침투를 특징으로 한다. 그러나, 이러한 이점들은 용적 측정 이미지를 포착하기 위해 회절 한계 여기점(diffraction limited excitation spot)이 측방향 평면에서 축방향을 따라 스캐닝되어야 하는 것으로 달성되며, 이는 낮은 시간 해상도를 야기한다. 공지된 회절 한계 2-광자 주사 접근법은 다양한 성능을 갖는다. 구체적으로, 일반적인 350×350 μm 또는 512×512 픽셀 평면을 가정하면, 스캐닝 주파수가 1 kHz(킬로헤르츠)인 표준 검류계 포인트 스캐닝(galvanometric point-scanning)은 양방향 스캐닝을 위해 약 4 Hz(헤르츠)의 프레임률(촬영 시스템의 "시간 해상도"라고도 함)을 산출한다.
이러한 속도 제한을 극복하기 위한 전략에는 음향 광학 편향기(acousto-optical deflector; AOD)를 사용하는 랜덤 액세스 스캐닝이 포함되며, 이는 최대 약 50kHz/N의 속도로 촬영하도록 설계된 방법이고, 여기서 N은 포인트의 개수이다. 두 번째 가능성으로는, AOD 또는 공진 스캐너를 사용하는 고속 평면 스캐닝이 프레임률을 현저하게 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일반적인 8 kHz 공진 스캐너는 상술한 350×350 μm(512×512 픽셀) 이미지의 양방향 스캐닝 모드에서 "비디오율"(예컨대, 30 Hz)을 달성하는 데 효과적일 수 있지만, 30Hz 프레임률에서 약 5 내지 10 개의 개별 z-평면 또는 축방향으로 초당 50 μm만 커버할 수 있다. 향후 기계적 스캐닝 속도가 향상되더라도, 형광 포화는 결과적으로 전체 스캔 속도에 제한을 가할 가능성이 있는데, 이는 스캔 속도의 증가가 유용한 신호 대 잡음 수준을 유지하기 위한 조도(illumination intensity)의 증가를 동반해야 하기 때문이다. 포인트형 2-광자 레이저 스캐닝(point-like two-photon laser scanning)에 의존하지 않는 다른 3 차원(3D) 촬영 접근법이 존재하지만, 대부분의 경우 여전히 작은 V-FOV만을 제공하거나, 세포 단위의 촬영 해상도를 달성하지 못하거나, 또는 산란에 대한 민감성 때문에 전술한 성능 목표에 훨씬 미치지 못한다. 목표 위치로 스캐닝을 제한하여 프레임률을 증가시킬 수 있는 랜덤 액세스 스캐닝 접근법은 뉴런의 위치에 대한 사전 지식이 필요하며, 따라서 뉴런이 프레임 단위로 이동하므로 깨어있는 동물을 대상으로 하는 응용은 어렵다.
본 발명의 일 양태에 따른 조직 촬영 시스템은, 레이저 펄스를 출력하는 레이저 모듈, 상기 레이저 모듈로부터 수신된 레이저 펄스를 복수의 시간 지연 서브 펄스로 분할하도록 구성된 광 지연 모듈, 상기 광 지연 모듈로부터 목표 용적으로 상기 서브 펄스를 전달하는 망원경, 및 상기 제1 및 제2 서브 펄스에 의한 상기 목표 용적의 여기(excitation)에 응답하여 상기 목표 용적 내에 생성된 광자를 수집하도록 구성된 광 검출기를 포함한다. 상기 서브 펄스는 제1 서브 펄스 및 제2 서브 펄스를 포함하며, 상기 제2 서브 펄스는 상기 제1 서브 펄스에 대하여 3을 초과하여 지연된다. 상기 제1 서브 펄스는 상기 목표 용적 내의 제1 깊이에 포커싱될 수 있고, 상기 제2 서브 펄스는 상기 목표 용적 내의 제2 깊이에 포커싱될 수 있으며, 상기 제2 깊이는 상기 제1 깊이와 상이하다. 또는, 상기 제1 및 제2 서브 펄스는 상기 목표 용적 내에서 동일한 깊이로 포커싱되면서 인접한 평면들에 지향될 수 있다.
바람직하게는, 상기 광 지연 모듈은, 상기 레이저 펄스를 상기 복수의 서브 펄스로 분할하도록 구성된 빔 분할기, 상기 제1 서브 펄스 및 상기 제2 서브 펄스 사이에 상기 시간 지연을 도입하는 적어도 2 개의 광 경로, 및 상기 제1 및 제2 서브 펄스를 조합하여 상기 제1 및 제2 서브 펄스를 포함하는 시간 다중화 레이저 펄스를 형성하는 광 결합기를 포함하며, 상기 망원경은 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 상기 목표 용적으로 전달한다. 상기 광 경로는 자유 공간 전파 또는 광섬유를 통해 상기 시간 지연을 도입할 수 있다. 바람직하게는, 상기 광 지연 모듈은, 상기 빔 스플리터로부터 수신된 상기 제1 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 제1 깊이로 포커싱하는 제1 발산을 갖는 제1 포커싱 렌즈, 및 상기 빔 스플리터로부터 수신된 상기 제2 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 제2 깊이로 포커싱하는 제2 발산을 갖는 제2 포커싱 렌즈를 더 포함할 수 있다.
상기 조직 촬영 시스템은, 상기 광 지연 모듈로부터 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 수신하도록 구성되는 공간 다중화 모듈을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 공간 다중화 모듈은, 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 제1 서브 빔 및 제2 서브 빔을 포함하는 복수의 서브 빔으로 분할하는 빔 스플리터를 포함한다. 상기 제1 서브 빔 및 상기 제2 서브 빔은 상기 목표 용적 내에서 상기 제1 깊이에 형성된 제1 상평면(image plane) 및 상기 목표 용적 내에서 상기 제2 깊이에 형성된 제2 상평면에 대해 공간적으로 분리된다.
상기 공간 다중화 모듈은, 상기 제1 및 제2 서브 빔을 각도 편향시킴으로써 상기 제1 및 제2 서브 빔이 상기 제1 및 제2 상평면의 제1 및 제2 포커싱 영역에서 각각 스캐닝되도록 하는 스캐너를 더 포함하는 것이 바람직하다. 이 양태에서, 상기 레이저 모듈은 제1 반복률로 방출되는 광 펄스를 포함하는 레이저 빔을 출력하도록 구성되며, 상기 제1 반복률은 적어도 1 MHz이고, 각 펄스는 10 ps 미만의 지속 시간을 갖는다. 상기 공간 다중화 모듈은, 상기 레이저 모듈에 의한 광 출력에 대한 상기 목표 용적 내의 초점 스폿이 상기 레이저 모듈에 의해 연속적으로 펄스들이 방출되는 사이에 대략 상기 초점 스폿의 제1 방향의 폭만큼 상기 제1 방향으로 편향되도록, 상기 제1 반복률에 기초한 속도로 상기 스캐너를 이동시키도록 구성된 제어기를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기 시스템은, 상기 스캐너로부터 상기 각도 편향된 제1 및 제2 서브 빔을 수신하고 상기 각도 편향된 제1 및 제2 서브 빔의 광 펄스를 각각의 스펙트럼 성분으로 분산시키는 시간 포커싱 격자를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 제1 및 제2 서브 펄스가 상기 목표 용적 내의 동일한 깊이에서 인접한 평면들에 지향되는 실시예에서, 다수의 시간 포커싱 격자가 사용된다.
또한, 상기 광 검출기는, 광전자 증배관, 및 상기 목표 용적 내에 생성된 상기 광자를 포커싱하는 마이크로렌즈 어레이를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 본 조직 촬영 시스템이 상기 공간 다중화 모듈만을 구비하는 것이 고려될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법이 제공된다. 상기 방법은, 지속시간이 각각 10 ps 미만인 펄스를 포함하는 펄스형 레이저 빔을 제공하는 단계, 상기 펄스형 레이저 빔의 펄스를 제1 서브 펄스 및 제2 서브 펄스를 포함하는 복수의 서브 펄스로 분할하는 단계, 상기 목표 용적에 진입하는 상기 제1 서브 펄스 및 상기 목표 용적에 진입하는 상기 제2 서브 펄스 사이에 적어도 3 ns의 시간 지연을 도입하는 단계, 및 상기 제1 및 제2 서브 펄스에 의한 상기 목표 용적의 여기(excitation)에 응답하여 상기 목표 용적 내에 생성된 광자를 수집하는 단계를 포함한다. 상기 방법은, 상기 제1 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 제1 깊이에 포커싱하는 단계, 및 상기 제2 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 제2 깊이에 포커싱하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 제2 깊이는 상기 제1 깊이와 상이하다.
상기 방법에 따른 상기 제1 및 제2 서브 펄스에 의한 상기 목표 용적의 상기 여기는, 2-광자 여기 방식(two-photon excitation scheme), 3-광자 여기 방식(three-photon excitation scheme), 또는 이들의 조합에 의한 상기 목표 용적 내의 형광체의 여기를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 바람직하게는, 상기 방법은, 상기 제1 및 제2 펄스를 조합하여 상기 제1 및 제2 서브 펄스를 포함하는 시간 다중화 레이저 펄스를 형성하는 단계, 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 제1 서브 빔 및 제2 서브 빔을 포함하는 복수의 서브 빔으로 공간적으로 분리하는 단계, 및 상기 공간적으로 분리된 시간 다중화 레이저 펄스를 상기 목표 용적으로 전달하는 단계를 더 포함하며, 상기 제1 서브 빔 및 상기 제2 서브 빔은 상기 목표 용적 내에서 상기 제1 깊이에 형성된 제1 상평면 및 상기 목표 용적 내에서 상기 제2 깊이에 형성된 제2 상평면에 대해 공간적으로 분리된다.
상기 방법은, 상기 제1 및 제2 서브 빔을 스캐너로 각도 편향시키는 단계로서, 상기 제1 및 제2 서브 빔이 상기 제1 및 제2 상평면의 제1 및 제2 포커싱 영역에서 각각 스캐닝되도록 하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 레이저 모듈에 의한 광 출력에 대한 상기 목표 용적 내의 초점 스폿이 상기 펄스형 레이저 빔의 펄스들이 연속적으로 방출되는 사이에 대략 상기 초점 스폿의 제1 방향의 폭만큼 상기 제1 방향으로 편향되도록, 상기 스캐너는 상기 펄스형 레이저 빔의 반복률에 기초한 속도로 이동되는 것이 바람직하다.
여기에서도, 상기 방법이 상기 빔을 공간적으로 다중화하는 단계만을 포함하는 방법이 고려될 수 있다.
도면은 본 발명의 교시에 따른 하나 이상의 구현예를 단지 예시로서 나타내며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 도면에서, 동일한 참조 부호는 동일하거나 유사한 구성 요소를 지칭한다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 예시적인 촬영 시스템의 개략도이다.
도 2는 도 1에 도시된 시간 포커싱 레이저 빔렛의 공간 다중화를 도시한 확대도이다.
도 3은 일 구현예에 따른, 공간 다중화 샘플의 스캐닝을 도시한다.
도 4a 내지 도 4d는 일 구현예에 따른, 촬영 시스템에 의한 샘플의 스캐닝의 단계를 도시한다.
도 5는 일 구현예에 따른, 시간 다중화 모듈의 개략도이다.
도 6a는 일 구현예에 따른, 샘플에 침투하는 시간 다중화 서브 펄스를 도시한다.
도 6b는 또 다른 구현예에 따른, 샘플에 침투하는 시간 다중화 서브 펄스를 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 방법의 제1 시퀀스에 따른, 샘플에 침투하는 시간 및 공간 다중화 빔의 개략도이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 방법의 제2 시퀀스에 따른, 샘플에 침투하는 시간 및 공간 다중화 빔의 개략도이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 방법의 제3 시퀀스에 따른, 샘플에 침투하는 시간 및 공간 다중화 빔의 개략도이다.
도 10a 및 도 10b는 일 구현예에 따른, (시간 다중화 서브 펄스이거나 시간 다중화 서브 펄스가 아닌) 광 펄스에 대한 포커싱 스폿을 스캐닝하는 것을 도시한다.
도 11은 일 구현예에 따른, 핵 한정 적색 형광 단백질을 발현하는 쥐의 청각 피질에서 생체 내 용적 스택 획득을 도시한다.
도 12는 본 발명의 양태들이 구현될 수 있는 컴퓨터 시스템을 나타내는 블록도이다.
도 13은 다중 시간 포커싱 격자를 지지하기 위한 격자 조립체를 도시한다.
다중화 스캐닝 시간 포커싱(multiplexed scanned temporal focusing; MuST)에 대한 두 가지 기술이 본 명세서에 개시되어 있다. 이 두 기술은 2-광자 주사 현미경 검사법(two-photon scanning microscopy; 2PM) 및 3-광자 주사 현미경 검사법(three-photon scanning microscopy)을 포함한다. 개시된 두 가지 MuST 기술(2 광자 및 3 광자)은 공지된 기술에 비해 높은 프레임률에서 용적 측정 칼슘 촬영을 위한 우수한 성능을 제공한다.
도 1은 예시적인 촬영 시스템(100)을 도시한 개략도이다. 상기 촬영 시스템(100)은, 반복적인 초단파 광 펄스("레이저 펄스"라고도 함)를 포함하는 펄스형 메인 레이저 빔(109)을 출력(또는 방출)하는 펄스형 출력 레이저 모듈(139)을 포함한다. 예를 들어, 레이저 모듈(139)은, 예컨대, 상업적으로 이용 가능한 또는 맞춤형으로 제조된 섬유-기반 처프 펄스 증폭기(fiber-based chirped pulse amplifier; FCPA)를 사용하여 구현될 수 있다. 레이저 모듈(139)은, 예컨대, 1 내지 5 MHz의 반복률로 광 펄스를 출력할 수 있다. 각각의 광 펄스의 시간적 지속시간은 각각, 예컨대, 100 ps(피코초) 미만, 50 ps 미만, 20 ps 미만, 10 ps 미만, 5 ps 미만, 1 ps 미만, 100 fs(펨토초) 미만, 50 fs 미만, 또는 20 fs 미만이다. 레이저 모듈(139)의 일부 구현예는 "펨토초 레이저(femtosecond laser)"로 지칭될 수 있다. 각각의 광 펄스는 단일 광 펄스에서 샘플(119)의 여기 용적을 여기(excitation)시키는데 효과적인 레이저 전력을 전달한다. 예를 들어, 레이저 모듈은, 샘플(119) 내의 목표 위치에서 각각 약 100 nJ(나노주울)의 전력을 전달하는, 1 MHz 반복률 및 1040 nm 파장의 광 펄스를 출력할 수 있다.
도 1에 도시된 예에서, 레이저 모듈(139)에 의해 출력된 메인 빔은 수신된 메인 빔을 다수의 서브 빔("빔렛(beamlet)"이라고도 함)으로 분할하는 빔 스플리터(107)("공간 구분기"라고도 함)를 포함하는 공간 다중화 모듈(110)에 제공된다. 상기 빔 스플리터(107)에 의해 출력된 다수의 서브 빔은 전체로서 "빔(109)"으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 빔 스플리터(107)는 수신된 입사 빔을 서로 동일한 세기 및 동일한 각도로 특정화될 수 있는 다수의 서브 빔으로 분할하는 다중 스폿 회절 광학 소자(diffractive optical element; DOE)를 포함할 수 있다. 1 차원 및 2 차원(1D/2D) 다중 스폿 회절 광학 소자가 존재한다. 1D 소자는 직선을 따라 빔을 분할하지만, 2D 소자는, 예컨대, 2×2 또는 3×3 스폿들의 행렬로 배열된 빔을 생성한다. 일부 예에서, 빔 스플리터(107)는 레이저 모듈(139)로부터 수신된 메인 빔을 4 개의 서브 빔으로 분할하여 (도 2의 초점 스폿들(201, 203, 205, 207)로 도시된 바와 같이, 예컨대, 샘플(119)과 같은) 목표 상에 2×2 행렬의 초점 스폿을 생성한다. 레이저 모듈(139)에 의해 메인 빔 출력을 다수의 서브 빔으로 분할하고, 상기 서브 빔을 촬영 평면의 상이한 위치에 포커싱하는 것(예컨대, 도 2의 초점 스폿들(201, 203, 205, 207)의 위치 설정 참조)을 "공간 다중화(spatial multiplexing)"이라고 지칭할 수 있다.
빔(109)에 포함된 다수의 서브 빔은 확장되어 스캐너(111)에 지향될 수 있으며, 상기 스캐너(111)는 빔(109)의 각도 편향을 (예컨대, 컴퓨팅 장치(131) 또는 촬영 시스템(100)의 다른 요소에 의해) 가변 선택적 제어 방식으로 수행하여, 샘플(119) 내의 초점 스폿들의 위치 설정을 제어한다. 일부 예에서, 스캐너(111)는 직선을 따라 빔(109)의 편향을 수행하는 1D 스캐너일 수 있다. 일부 예에서, 도 3 및 도 10a의 예에 의해 도시된 바와 같이, 스캐너(111)는 2 개의 축에 대하여 각도 편향을 수행하는 2D 스캐너일 수 있다. 스캐너(111)는, 예컨대, 빔(109)의 각도 편향의 양을 제어 가능하게 변화시키기 위해 하나 이상의 검류계 거울(galvanometric mirror), 스캐닝 굴절 광학 장치(scanning refractive optics), 하나 이상의 음향 광학 편향기(acousto-optic deflector) 및/또는 하나 이상의 전기 광학 편향기를 포함할 수 있다.
스캐너(111)에 의해 편향이 부여된 후, 상기 빔(109)은 구형 스캔 렌즈(113)에 의해 병진 이동되어 빔(109)에 포함된 서브 빔을 포커싱함으로써 시간 포커싱 격자와 같은 스펙트럼 분산 소자(115) 상에 초점을 형성할 수 있다. 스펙트럼 분산 소자(115)는, 빔(109)에 포함된 광 펄스를 그 스펙트럼 성분들로 분산시키며, 이는 시간 포커싱 렌즈(temporal focusing lens; TF-렌즈)(137) 및 대물 렌즈(133)를 포함하는 망원경(117)에 의해 시간 및 공간적으로 재차 포커싱되고, 상기 샘플(119) 내의 상평면에 결상된다. 예를 들어, 4×4 또는 4×2 공간 및 시간 다중화는 촬영 시스템(100)의 다른 요소와 관련하여 망원경(117)에 의해 제공될 수 있다. 공간 다중화의 예는 도 2 및 도 3에 도시되어 있으며 이와 관련하여 설명되고; 시간 다중화의 예는 도 5, 도 6a 및 도 6b에 도시되어 있으며 이와 관련하여 설명되며; 4×3 공간 및 시간 다중화의 예는 도 7 내지 도 9에 도시되어 있으며 이와 관련하여 설명된다.
유전자 재조합 칼슘 센서(genetically encoded calcium indicator; GECI)와 같은 (그러나 이에 한정되지는 않는) 형광체("형광 색소"라고도 함)는, 여기된 복셀(voxel)에 존재하는 형광체의 양에 대응하는 세기(또는 광자량)로 빔(109)에 의한 여기시 광을 재방출한다. 지연 경로 내의 마이크로렌즈 어레이(ML; 125)는 빔(109)에 포함된 각각의 서브 빔으로부터 생성된 형광을 다중양극 광전자 증배관(multi-anode photon multiplier tube; MA-PMT)(127)의 각각의 양극과 같은 각각의 광 검출기 상에 포커싱하기 위해 포함될 수 있다. 색선별 거울(dichroic mirror; 141) 또는 유사한 광학 요소가 상기 광 검출기에 도달하는 비형광 광량을 감소시키기 위해 포함될 수 있다. 다중 채널 카운팅 카드(dmCC; 129)는 시간 도메인에서 역다중화를 수행하여 각 복셀에 대한 형광 세기를 결정할 수 있다. 상기 역다중화 세기는 컴퓨팅 장치(131)(촬영 시스템(100)의 다양한 양상을 제어하도록 더 구성될 수 있음)에 의해 수집될 수 있으며, 추가적인 액세스 및 분석을 위해 로컬 또는 글로벌 메모리에 더 처리, 표시, 또는 저장될 수 있다.
상기 촬영 시스템(100)은 획득 용적 및 속도를 현저하게 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 레이저 모듈(139)에 의해 출력된 메인 레이저 빔의 광 펄스의 4×4 공간 및 시간 다중화의 결과로서, 최대 1×1 mm의 FOV는 16 배 대물 렌즈를 사용하여 달성될 수 있다. 2-광자 현미경 검사법에서, 예상되는 형광 신호를 결정하는 파라미터는 수학식(1)을 사용하여 평가할 수 있다. 형광체당 흡수된 광자의 개수인 Na, 그리고 이에 따른 펄스형 레이저 소스를 통한 2-광자 여기에서의 형광 신호는 다음에 비례한다:
Figure pct00001
수학식(1)에서, P0는 샘플 평면(예컨대, 샘플(119)의 상부면)에서의 평균 레이저 전력이고, f는 레이저의 펄스 반복률이며, τ는 펄스 길이이고, λ는 중심 파장이며, A는 샘플에서의 여기 영역(예컨대, 표준 2-광자 주사 현미경 검사법의 경우 레이저 초점의 회절 한계 영역)이고, Δt는 체류 시간(dwell time)(또는 노광 시간)이다. 수학식(1)의 주요 요소는 흡수된 광자의 개수 Na의 A에 대한 이차 의존성 및 Δt에 대한 선형 의존성이다. 예로서, 면적 요소 A가 10 배만큼 감소되면, 주어진 위치에서의 체류 시간 Δt는 동일한 촬영 프레임률을 유지하기 위해 동일한 배수로 감소될 필요가 있다. 그러나, Na~Δt/A2이기 때문에, 형광 수율은 본 예에서 10 배로 증가하여, 체류 시간을 더욱 감소시키고 이에 따라 프레임률을 증가시킬 수 있다.
따라서, 주어진 V-FOV 및 해상도에 대해, 여기된 영역, 예컨대 샘플(119)의 레이저 초점 스폿의 크기를 대략적으로 원하는 해상도로 설정하면 주어진 평균 레이저 전력에서 촬영 속도를 최적화할 수 있다. 또한, V-FOV, 해상도 및 원하는 시간 해상도는 복셀 촬영률, 예컨대, 초당 촬영될 복셀의 개수를 결정한다. 수학식(1)은, 주어진 평균 레이저 전력에 대해 펄스 에너지가 최대화(단일 펄스로 여기)되도록 하므로, 반복률 f가 상기 복셀 촬영률과 동일하게 설정될 때 형광 수율이 최적화될 수 있다는 개념을 지지한다.
상기 빔(109)의 시간 포커싱(temporal focusing; TeFo)은 수학식(1)에 나타난 바와 같이 측방향 및 축방향 빔 파라미터 사이의 연결로 인한 한계를 회피한다. TeFo에서, 펨토초 펄스형 레이저의 스펙트럼은 스펙트럼 분산 소자(115)에 의해 공간적으로 분산되고, TF-렌즈(137) 및 대물 렌즈(133)를 포함하는 망원경(117)에 의해 샘플 상에 결상된다. 따라서, 빔(109) 내의 펄스의 주파수 성분은 도처에, 그러나 상기 대물 렌즈(137)의 초점에 기하학적으로 분산된다. 이는 피크 펄스 세기가 효과적으로 감소되도록 하며, 이에 따라 초점 영역 외부의 2-광자 여기 가능성을 낮춘다. 축방향 여기 위치는 샘플에서의 펄스의 분산을 제어함으로써 설정될 수 있으며, 측방향 여기 패턴은 렌즈 및 대물 렌즈의 선택에 의해 독립적으로 설정될 수 있다.
일 구현예에서, 칼슘 촬영은 (쥐의 신피질의 대뇌 피질 원주(cortical column)의 크기에 필적하는) 약 500×500×500 μm 또는 1000×1000×700 μm의 3D 용적에서 대다수의 뉴런으로부터 단일 세포 해상도로 기록할 수 있는 촬영 시스템을 구현함으로써 개선될 수 있으며, 여기서 시간 해상도는 각각 20 Hz 보다 크고 3 Hz 보다 크다.
일부 구현예에서, 시스템(100)의 심부조직 촬영 성능은 3-광자 여기를 포함함으로써 최적화될 수 있다. 일반적으로, 종래의 2-광자 현미경 검사법의 해마 촬영 실험은, 피질을 제거하고 약 1.5 mm 깊이의 촬영 캐뉼라 윈도우를 이식하는 침습 수술을 수반한다. 그러나, 그러한 수술 후에도 표피상의 해마 CA1 영역에만 접근할 수 있다. 대조적으로, 개시된 3-광자 MuST 촬영 접근법은, 대뇌 피질 흡인을 필요로 하지 않고 뇌 표면 아래 약 1.1 mm에서 CAl 세포체 층을 촬영할 수 있기 때문에 상당히 덜 침습적일 수 있다. 또한, 상기 개시된 접근법은 대뇌 피질 수술 후 해마 심부 영역(예컨대, CA3 및 DG)의 촬영을 가능하게 하며, 즉, 해마 CA1 및 전체 해마 회로를 손상하지 않는다(예컨대, 해마 등쪽면 아래 약 1 mm).
또한, 2-광자 현미경 검사법은 이미지 깊이에 따라 여기 가능성을 지수적으로 감소시키는 입사 레이저 펄스의 산란으로 인해 1 mm 깊이 미만의 촬영에 적합하지 않을 수 있다. 대조적으로, 약 1700 nm에서의 여기(excitation)와 3-광자 현미경 검사법은 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP)과 같은 적색 비기능성 형광 단백질의 형광 촬영을 위해 실행 가능하다. 또한, 산란 및 수분 흡수에 의한 조합된 감쇠 길이가 심부조직 촬영에 바람직할 수 있는 약 1300 내지 1400 nm에는 다른 스펙트럼 윈도우가 존재할 수 있다. 이러한 파장 영역은 GCaMP와 같은 녹색 칼슘 센서(calcium indicator)의 3-광자 여기에 대응한다. 상술한 바와 같이, 레이저 모듈(139)은 3-광자 현미경 검사에 특히 바람직한 초단파 광 펄스를 출력하는데, 이는 3-광자 현미경 검사법(three-photon microscopy; S3P)으로 인한 형광 신호의 세기가, 예컨대, S3P~T-2와 같은 펄스 길이(T)의 제곱에 반비례하기 때문이다.
상기 개시된 접근법과 관련된 이론적인 계산에 기초하여, 일반적인 3-광자 현미경 검사법에서는, 흡수 단면적이 약 10-82 cm2(s/photon)2으로 계산될 수 있다. 또한, GCaMP의 농도식은 약 20 μm로 계산될 수 있다. 계산 결과에 따르면, 개시된 MuST 접근법과 3-광자 여기의 조합은 500Х500 μm의 FOV에서 1 mm를 초과하는 깊이의 생체 내 촬영을 위한 높은 프레임률(예컨대, 초당 10 프레임 이상)을 용이하게 하기에 충분한 신호를 제공할 수 있다.
상기 개시된 촬영 시스템(100)은 다중 헤르츠 시간 해상도에서 신뢰할 수 있는 단일 세포 해상도를 갖는 전례 없이 큰 V-FOV(예컨대, 20 ㎐에서 500×500×500 μm, 또는 3 Hz에서 1×1×0.7 mm)의 비편향 칼슘 촬영을 제공할 수 있다. 이러한 촬영 시스템은 거의 동시에 수만 개의 뉴런의 네트워크 활동의 역학을 모니터링하는 기능을 제공한다. 포유류 피질에서, 이러한 기능은 대뇌 피질 층을 가로지르는 네트워크 활동의 역학을 포착하고 상호 연관시키므로 정보 처리의 컴퓨팅 원리를 이해할 수 있는 기회를 제공한다.
또한, 상기 개시된 접근법은, 초파리(drosophila) 또는 제브라피시(zebrafish)와 같은 소형 모델 유기체에서 전체 뇌 촬영을 가능하게 하며, 3-광자 촬영으로의 확장으로 인해 이전에는 이용할 수 없었던 조직 깊이(예컨대, 1 mm보다 깊은 심부 대뇌 피질 영역)에서의 비침습적 세포 해상도 촬영을 가능하게 한다.
포유류 피질(직경 약 10 μm)의 뉴런의 평균 크기를 고려할 때, 공간 해상도는 단일 세포 해상도의 신뢰성을 여전히 유지하면서 등방적으로 약 5 μm까지 쉽게 감소될 수 있다. 이는 조밀한 대뇌 피질 영역에서도, 핵 위치 설정 칼슘 센서(calcium indicator)가 사용되는 경우에 특히 그러하다. 그러나, 광학 장치의 근본적인 제약으로 인해, 측방향 여기 위치설정(w) 및 축방향 여기 위치설정(z)이 z~2w2을 통해 본질적으로 결합되기 때문에, 레이저 스폿 크기를 임의로 이와 같은 초점 크기로 형성하지 못한다. 따라서, 측방향으로 5 μm 폭의 레이저 초점을 생성하는 경우, 동일한 초점은 축방향으로 약 40 μm 이상 연장되어 단일 뉴런 해상도를 위한 광학적 분할을 충분히 제공하지 못한다. 상술한 바와 같이, 시간 포커싱(temporal focusing; TeFo)은 측방향 및 축방향 빔 파라미터 사이의 연결로 인한 상기 제한 사항을 회피한다.
다양한 경우에, 3 Hz의 용적률로 500×500×500 μm의 계획 용적에서 상기 촬영 시스템(100)으로 고속 단일 세포 해상도 칼슘 촬영을 달성하기 위해서는 4 MHz의 반복률에서 최대 약 100 nJ의 레이저 펄스 에너지가 필요할 수 있다. 계산된 레이저 전력은 5Х5Х5 μm의 용적을 커버하는 여기점(excitation spot)을 갖는, 12 kHz의 양방향 공진 레이저 스캐닝을 가정할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 촬영 시스템(100)은 스캐닝 시간 포커싱에 기초하여 뇌 조직을 산란시키는 기능성 칼슘 촬영에 사용될 수 있다. 특성화 및 테스트 단계에서 상이한 광학 촬영 및 스캐닝 파라미터를 신뢰성 있게 비교하려면, 안정한 형광 특성을 가짐에도 불구하고 살아있는 쥐 두뇌(소위 '팬텀 조직(phantom-tissues)')의 산란 특성을 닮은 표준 비생체 샘플이 사용될 수 있다. 또한, 균일하게 분포된 서브 회절 형광 비드(bead)를 갖는 맞춤형 테스트 샘플은, 개시된 셋업에서 사용된 큰 스캔 각도 및 긴 튜브 렌즈로 인한 수차 및 왜곡의 효과를 측정하고 최적화하는데 사용될 수 있다. 상기 촬영 시스템(100)은 촬영 속도 및 FOV를 향상시킬 수 있다. 스캐닝 시간 포커싱 현미경에 공간 및 시간 다중화 전략을 통합함으로써 촬영 용적, FOV, 및 용적 속도를 개선시킬 수 있다.
공간 다중화에서, 용적 측정 촬영 속도는 스캐너(111)에 사용되는 경우 공진 스캔 거울의 주파수(약 12 kHz)에 의해 대부분 제한될 수 있다. 따라서, 전체 속도를 증가시킬 수 있는 방식은, 여기 레이저 빔(excitation laser beam)이, 예컨대, 4 개의 서브 빔으로 분할된 후 FOV 내의 서브 영역으로 지향되고 병렬로 스캐닝되는 공간 다중화이다. 맞춤형 회절 광학 요소는 마이크로렌즈 어레이를 기반으로 하는 이전 접근법에 비해 효율 및 동질성을 높이기 위해 메인 빔을 분할하는 데 사용될 수 있다. 공간 다중화를 위한 광학 설계는 각 빔렛에 의해 여기된 형광이 별도의 광 검출기 상에 결상될 수 있도록 신중하게 선택되어야 한다. 이를 위해, 다중 양극 광전자 증배관(multi-anode photon multiplier tube; MA-PMT)(127)이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, MA-PMT(127)는 서브 영역으로부터의 형광을 MA-PMT(127)의 검출기 유닛 상에 포커싱하는 검출 경로에서 맞춤형 마이크로렌즈 어레이(125)와 조합되어 사용될 수 있다.
여기 및 검출 경로는, 주어진 촬영 깊이 및 조직 산란에 대한 개별 검출기 요소상의 형광의 누화(crosstalk)를 최소화하면서 동시에 수집 효율을 최적화하도록 컴퓨팅 장치(131)를 사용하는, 예컨대, ZEMAX®와 같은 광학 디자인 소프트웨어를 사용하여 모델링될 수 있다. 이러한 누화는 약 500 μm의 초점 분리 및 700 μm 미만의 깊이에서 최소일 수 있다. 상이한 MA-PMT(127) 픽셀로부터의 신호가 광자 카운팅 모드에서 다중 채널 광자 카운터 카드(129)를 사용하여 동기적으로 수집될 수 있다. 또한, 후 처리(post-processing)에서 디콘볼루션(deconvolution)과 같은 역다중화 접근법은 산란 유발 누화를 더욱 억제할 수 있다.
시간 다중화는, 여기 레이저가 분할될 수 있고 상대적 시간 지연이 개별 빔렛에 도입될 수 있는 공간 다중화의 실행 가능한 대안이며 공간 다중화와 조합되어 강력해진다. 이후, 각각의 빔렛은 이미지 FOV의 또 다른 서브 영역으로 지향되거나 상이한 상평면에 포커싱될 수 있다. 이는 4 MHz의 바람직한 반복률이 펄스들 사이에서 250 ns에 대응하여 빔렛들을 분할하는데 충분한 시간을 제공하므로, 특히 유망한 접근법이다. 촬영 시스템(100)에서, 개별 빔은 GCaMP 형광체의 일반적인 수명(예컨대, 약 3 ns)과 비교하여 충분히 긴 10 ns로 서로에 대해 지연될 수 있다. 이후, 빔렛은 동시 이미지 획득을 위해 상이한 z-평면들(도 7 내지 도 9에 도시됨)에 포커싱될 수 있다. 그 다음, 상기 역다중화는, MA-PMT(127)에서의 도달 시간에 기초하여 광자/신호를 영역/평면에 할당함으로써, 고속 다중 채널 카운터(dmCC)(129)를 사용하는 전자 후 처리에서 수행될 수 있다.
샘플(119)에서 요구되는 평균 레이저 전력(밀리와트, mW)은 촬영 시스템(100)의 광학 해상도와 동일한, 용적 크기(FOV) 및 샘플(119)상의 시간 포커싱 스폿의 직경의 함수로서 도시될 수 있다. 예를 들어, V-FOV가 500×500×500 μm이고, 스폿 크기가 5 μm 넓이이고, 약 150 mW의 전력이 필요하면, 바람직한 상호 절충이 가능하다. 150 mW 전력은 3 MHz 반복률에서 펄스당 50 나노주울(nJ)에 해당할 수 있다.
다른 예로서, 스캔 속도 및 디지털화가 픽셀당 하나의 레이저 펄스만이 효율적으로 존재하도록 설정되면, 충분한 GCaMP 신호가 약 100 nJ의 펄스 에너지로 GCaMP에 대해 준최적인 500 μm의 깊이 및 1040 nm의 레이저 파장에서도 생성될 수 있다.
일 구현예에서, 시간 포커싱 기술(TeFo)은 카메라 기반 검출 방식과 함께 광역 구성에서 사용될 수 있다. 스캐닝 시간 포커싱 방식이 사용될 수 있으며, 이는 산란되기 용이하지 않다. 또한, 산란된 성분을 포함하여 생성된 형광은 광전자 증배관(PMT)(127) 상에 맞춤 설계된 광각 수집 광학 장치에 의해 효율적으로 결합될 수 있으며, 이미지 픽셀에 할당될 수 있다. 5Х5Х5 μm의 증가된 여기 용적이 동일한 규모로 광학 해상도를 자연적으로 감소시킬 수 있지만, "생체 내" 기능적 촬영에서 뉴런 출력 스파이킹(spiking)에 대한 민감하고 가장 일반적으로 사용되는 대리 판독인, 쥐 피질의 개별적인 뉴런 체세포를 식별하는 데는 여전히 충분할 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 깨어있고 행동하는 쥐에 대해 고속 3D 칼슘 촬영이 가능할 수 있다. 예를 들어, 3D 촬영은 500×500×500 μm까지 확정되는 용적 및 3 Hz보다 높은 시간 해상도로 수행될 수 있다. 고속 3D 칼슘 촬영이 가능한 TeFo 기반의 2-광자 현미경 검사법의 설계는 몇몇 특징들을 결합한다. 예를 들어, 여기 용적은 관심 구조의 크기에 따라 '형상화'될 수 있다. 이는 비포화 형광 영역에서의 작동을 용이하게 하면서 복셀당 신호를 증가시킨다. 또한, 개시된 바와 같이, 광섬유 기반 증폭 레이저 소스(fiber-based amplified laser source; FCPA)(130)는, 복셀 촬영률과 일치하는 반복률에서 최대 펄스 에너지를 전달함으로써 신호 대 잡음비를 최적화하도록 설계될 수 있다. 또한, FCPA의 반복률은 용이하게 조정될 수 있으므로, 최적화된 신호 대 잡음 구성을 상이한 용적 측정 촬영 요구에 맞게 유지할 수 있다.
개시된 기술들의 모듈식 설계에서, 예컨대, 4 내지 8 배의 공간 및/또는 시간 다중화는 V-FOV 및/또는 시간 해상도가 동일한 배수로 증가되도록 직접 변화되는 설계에 간단하게 통합된다. 또한, 3-광자 주사 현미경 검사법을 상기 촬영 시스템(100)에 일체화는, 여기 빔(excitation beam)의 깊이 및 산란에서 초점 형광을 크게 감소시킴으로써 심부 뇌 구조의 비침습적 촬영을 가능하게 한다. 이는 FCPA의 방출 파장을 약 1400 nm로 이동시킬 수 있는 광 파라메트릭 증폭기(optical parametric amplifier; OPA)를 통해 이루어질 수 있다.
다양한 구현예에서, 광 조형(light-sculpting) 접근법을 사용함으로써, 여기 영역은 관심 구조(예컨대, 신경 세포체)와 동일한 자릿수로 용적이 형성될 수 있다. 따라서, 형광체의 비포화 여기 레벨을 유지하면서, 촬영 복셀당 훨씬 더 많은 GCaMP 형광을 수집할 수 있다. 라인당 더 적은 포인트, 프레임당 더 적은 라인, 및 용적당 더 적은 상평면을 스캐닝해야 하므로, 공간 해상도의 감소는 결국 더 빠른 용적 촬영률과 교환될 수 있다.
도 2는 일 구현예에 따른, 시간 포커싱 레이저 빔렛의 공간 다중화를 도시한 확대도이다. 샘플(119)에서의 레이저 전력의 가용성에 따라, 빔(109)에 포함된 빔렛들(109a, 109b, 109c, 109d)에 대한 초점 스폿들이, 예컨대, 500 μm로 분리되도록 공간 도메인에서 4 배 공간 다중화(예컨대, 2Х2)가 선택될 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 2Х2 공간 다중화는, 샘플(119)을 4 개의 쿼터들(Q1, Q2, Q3, Q4)로 나누고 분산된 빔렛을 상기 4 개의 쿼터로 포커싱하여 적용될 수 있다. 시간 포커싱 스폿들(201, 203, 205, 207)은, 각각의 시간 포커싱 스폿이 하나의 FOV(Q1, Q2, Q3, 또는 Q4) 내에서 스캐닝되도록 샘플(119)에서 스캐닝될 수 있다.
수학식(1)과 관련하여 전술한 바와 같이, 공간 및 시간 다중화는 가용 레이저 전력에 의존하는데, 이는 각각의 빔렛이 동일한 펄스 에너지를 유지해야 하기 때문이다. 신중하게 선택된 다른 시간 포커싱 광학 장치뿐만 아니라 맞춤형 반사 방지 코팅된 현미경 대물 렌즈(133)는 광학 표면 반사로 인한 손실이 최소로 유지될 수 있도록 한다.
도 3은 일 구현예에 따른, 공간 다중화 샘플의 스캐닝을 도시한다. 도 3의 다이어그램(301, 303, 305, 307, 309, 311)은 샘플(119)이 4 개의 쿼터들(Q1, Q2, Q3, Q4)로 분할되는 샘플(119)의 공간 다중화를 도시한다. 시간 포커싱 레이저 스폿들(201, 203, 205 및 207)은 쿼터들(Q1, Q2, Q3, Q4) 내의 샘플(119)의 영역을 각각 스캐닝한다. 상기 샘플의 스캐닝은 곡류 패턴(sinuous pattern)(313)에 기초하여 스캐너(111)에 의해 수행될 수 있지만, 다른 패턴들이 사용될 수 있다. 곡류 스캔(sinuous scan)이 수행되는 동안, 시간 포커싱 스폿들(201 내지 207) 각각은 상기 곡류 패턴(313)에 기초하여 스캔 영역 내에서 이동함으로써 각각의 영역(Q1 내지 Q4)을 스캐닝한다.
도 4a 내지 도 4d는 일 구현예에 따른, 촬영 시스템에 의한 샘플(119)의 스캐닝의 단계를 도시한다. 도 4a 내지 도 4d는 샘플(119)을 스캐닝하기 위해 상기 촬영 시스템(100)에 의해 샘플(119) 상에 빔렛(109a)을 이동시키는 것을 단순화하여 나타낸 도면들이다. 상기 빔렛(109)은 망원경(117)(도 4a 내지 도 4d에 미도시)에 의해 샘플(119)에 포커싱되고, 상기 빔렛(109a)은 스캐너(111)에 포함된 스캐너 요소(407)에 의해 빔렛(109a)에 인가되는 각도 편향의 양의 변화에 따라 샘플(119)을 통해 스캐닝된다. 상기 스캐너 요소(407)는 화살표(403)로 도시된 바와 같이 빔렛(109a)의 편향 각도를 연속적으로 변화시키고, 이에 따라 초점 스폿(201)의 위치가 도 4a 내지 도 4d 사이에서 변경된다. 빔렛(109a)의 이동에 의해, 포커싱 스폿(201)은 샘플(119) 상으로 이동하면서 상기 샘플을 스캐닝할 수 있다. 예를 들면, 도 4a에 도시된 시각 t1에서, 상기 포커싱 스폿(201)은 도시 된 위치(405)에 존재한다. 시간 t2(도 4b)에서, 포커싱 스폿(201)은 위치(405)(포커싱 스폿(201)의 위치)로부터 이동하여 409로 도시된 방향으로 이동한다. 시간 t2에서, 레이저 모듈(139)은 광 펄스를 출력하지 않지만, 도 4b는 시간 t2에서 펄스가 출력되었다면 가상의 빔렛(109a)이 취할 경로를 도시한다. 도 4c는 시각 t3(Δt
Figure pct00002
t3-t1)에서의 포커싱 스폿(201)을 도시하며, 여기서 초기 위치(405) 및 도 4c에 도시된 위치 사이의 포커싱 스폿(201)의 변위 거리는 Δd로 도시된다. 이와 유사하게, 도 4d에 도시된 t3에서 t4까지의 또 다른 시간 경과 t 이후(Δt
Figure pct00003
t4-t3), 포커싱 스폿(201)은 위치(411)(시간 t3에서 도 4c의 포커싱 스폿(201)의 위치)에서 도 4d에 도시된 위치로 이동한다. 결과적으로, 스캐너(111)는 샘플(119) 상의 빔렛(109a)의 포커싱 스폿(201)이 각 시간 경과(Δt)마다 거리(Δd)만큼 이동하도록 빔렛(109a)을 연속적으로 이동시킴으로써 샘플(119)을 통해 포커싱 스폿(201)을 스캐닝한다. 거리(Δd)는 도 4d의 초기 위치(405), 위치(411), 및 초점 스폿(201)의 위치 사이의 위치 차이에 의해 도시된 바와 같이, 초점 스폿(201)의 폭과 대략적으로 동일하다.
도 5는 일 구현예에 따른, 시간 다중화를 가시화하여 도시한다. 레이저 모듈(139)은, 광 펄스를 다수의 서브 펄스로 분할하고 개별 서브 펄스들 사이에 상대적 시간 지연을 도입하도록 구성된 광 지연 모듈(500), 또는 서브 펄스들 사이에 시간 지연을 도입하는 대안적인 수단을 포함할 수 있다. 도 5에 도시된 예에서, 광 지연 모듈(500)은 레이저 모듈(139)에 의해 생성된 메인 광 펄스(501)를 3 개의 서브 펄스들(503, 505, 507)로 분할하는 3-방향 빔 스플리터(520)를 포함한다. 상기 3 개의 서브 펄스들(503, 505, 507)은 각각의 광 경로들(514, 516, 520)을 통해 3-방향 빔 스플리터(520)로부터 광 결합기(530)로 이동한다. 상기 광 경로들(514, 516, 518)은 단순히 자유 공간 전파를 위한 도관이거나, 광섬유의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 각각의 경우에, 상기 광 경로들의 경로 길이에는 차이가 있으므로, 각각의 서브 펄스들(503, 505, 507)이 각각의 경로를 이동하는 데 소요되는 시간은 상이하다.
따라서, 제2 서브 펄스(505)에 대한 제2 광 경로(516)의 길이는 제1 서브 펄스(503)에 대한 제1 광 경로(514)의 길이와 상이하도록 선택될 수 있으므로, 서브 펄스(503)에 비해 약 10 ns(나노초)의 제1 시간 지연이 서브 펄스(505)에 도입된다. 이와 유사하게, 제3 광 경로(518)를 상기 제1 및 제2 광 경로에 대하여 적절한 길이로 제공함으로써, 서브 펄스(503)에 비해 약 20 ns(그리고 서브 펄스(505)에 비해 10 ns)의 제2 시간 지연이 제3 서브 펄스(507)에 도입된다
상기 다수의 서브 펄스들(503, 505, 507)은 광 결합기에 의해 메인 빔 출력으로 재결합되거나, 레이저 모듈(139)에 의해 매우 근접한 다수의 출력들로 재결합된다. 상기 광 결합기는 서브 펄스들을 동일한 방향으로 재지향시키는 방식으로 배열된 거울 및/또는 투과 요소 또는 다른 요소들의 조합 일 수 있다. 특히, 상기 광 결합기는 편광 또는 비편광 광학 빔 스플리터의 형태를 취할 수 있다. 설명의 편의상, 상기 결합된 서브 펄스는 전체로서 "광 펄스(515)" 또는 "서브 펄스들의 세트"로 지칭될 수 있다.
또한, 광 지연 모듈(500)은 3-방향 빔 스플리터(520) 및 광 결합기(530) 사이에 배치된 포커싱 렌즈들(509, 511, 513)의 배열을 포함하는 것이 바람직하다. 서브 펄스(503)는 샘플(119)의 제1 z-평면에 포커싱하는 제1 발산을 갖는 렌즈(509)에 의해 포커싱될 수 있다. 서브 펄스(505)는 샘플(119)의 상기 제1 z-평면과 상이한 제2 z-평면에 포커싱하는 제2 발산을 갖는 렌즈(511)에 의해 포커싱된다. 서브 펄스(507)는 샘플(119)의 상기 제1 및 제2 z-평면과 상이한 제3 z-평면에 포커싱하는 제3 발산을 갖는 렌즈(513)에 의해 포커싱된다. 특히, 이들 포커싱 렌즈 및 다른 광학 요소들의 대응하는 각도 및 위치는, 도 6b와 관련하여 이하에서 더 설명될 바와 같이, 모든 펄스가 목표 용적 내에서 동일한 깊이로 포커싱되면서 인접한 평면들에 지향되도록 배열 및 선택될 수 있다.
일부 예에서, 광 펄스(515)는 도 1에 도시된 빔 스플리터(107)와 같은 빔 스플리터에 전송되어 다수의 서브 펄스를 포함하는 광 펄스(515)와 같은 광 펄스들을 각각 포함하는 다수의 서브 빔을 사용하여 공간 및 시간 다중화를 수행할 수 있다. 일부 예에서, 촬영 장치는 공간 다중화와 함께 시간 다중화를 사용할 수 있으며, 메인 광 펄스(501)를 일련의 시간 지연 서브 펄스들로 분할한 후에 빔 분할을 수행하지 않을 수 있다. 본 발명의 예에서는 시간 다중화를 위해 메인 광 펄스를 3 개의 서브 펄스들로 분할하지만, 일부 예에서, 메인 광 펄스는 대신에 상기 서브 펄스들 사이에 상대적 시간 지연을 갖는 2 개의 서브 펄스들로 분할되거나, 4 개 이상의 서브 펄스들로 분할될 수 있다.
본 발명의 예에서는 광 펄스(515)에 포함된 서브 펄스들(503, 505, 507) 사이의 약 10 ns의 상대적 시간 지연을 사용하지만, 다른 양의 시간 지연을 사용할 수 있다. 예를 들어, 메인 광 펄스(510)에 대해 연속적인 펄스들 사이의 250 ns에 대응하는 4 MHz의 반복률이 제공되는 경우, 3 개의 서브 펄스들에 대해, 최대 250 ns/3 또는 대략 80 ns의 상대적 시간 지연이 서브 펄스들 사이에서 사용될 수 있다. 상기 상대적 시간 지연은 GCaMP 형광체의 경우 약 3 ns인 예상 형광 감쇠 시간보다 길어야 하며, 이에 따라 약 3 ns보다 긴 상대적 시간 지연이 이러한 응용에 바람직하다. 일부 예에서, 상기 상대적 시간 지연은 100 ns 이상, 50 ns 이상, 20 ns 이상, 10 ns 이상, 5 ns 이상, 2 ns 이상, 또는 1 ns 이상일 수 있다.
샘플(119)에서 원하는 레이저 전력량에 따라, 일부 예에서, 공간 도메인의 4 배 다중화(예컨대, 2×2)는 500 μm로 분리된 초점(109)을 가지며 시간 도메인의 최대 4 배 다중화와 조합되도록 선택되어, 동시에 몇몇 z-평면을 촬영할 수 있다(도 6 내지 도 9에 도시된 4Х3 공간 및 시간 다중화와 유사함). 이러한 개선 사항을 통해, 1×1×0.7 mm의 V-FOV가 적어도 3 Hz의 프레임률로 달성될 수 있다. 또는, 시간 다중화는 공간 다중화 없이 적어도 12 Hz의 프레임률로 500×500×500 μm의 V-FOV를 촬영하기 위해 사용될 수 있다. 각 복셀을 촬영하기 위한 단일 광 펄스의 사용으로 인한 더 높은 펄스 에너지에서도, 생체 손상이 제한 요인으로 예견되지는 않는다는 것을 주목해야 한다. 이는 전력이 약 5×5×5 μm의 용적에 걸쳐 분포되어 있기 때문이며, 상기 용적은 표준 2-광자 현미경 검사법에서 종래에 사용되는 회절 제한 용적보다 약 1000 배만큼 크다.
도 6a는 일 구현예에 따른, 샘플에 침투하는 시간 다중화 서브 펄스를 도시한다. 도 1에 도시된 서브 빔 경로들에 의해 예시되었지만, 광 펄스(515)로 재결합된 도 5의 시간 다중화 서브 펄스들(503, 505, 507)은 샘플(119)로 전송된다. 각각의 서브 펄스들(503, 505, 507)에 적용된 상이한 발산으로 인해, 각각의 서브 펄스들(503, 505, 507)은 샘플(119)의 각각의 상이한 z-평면들에 포커싱된다. 도 6a에 도시된 예에서, 서브 펄스(503)는 포커싱되어 제1 z-평면 상의 깊이(Z1)에 샘플(119)을 여기시키기 위한 각각의 초점 스폿을 생성하고; (서브 펄스(503)에 비해 10 ns의 시간 지연을 갖는) 서브 펄스(505)는 포커싱되어 제2 z-평면 상의 상기 깊이(Z1)보다 크고 상이한 깊이(Z2)에 샘플(119)을 여기시키기 위한 각각의 초점 스폿을 생성하며; (서브 펄스(503)에 비해 20 ns의 시간 지연을 갖고 서브 펄스(505)에 비해 10 ns의 시간 지연을 갖는) 서브 펄스(507)는 포커싱되어 제3 z-평면 상의 상기 깊이들(Z1, Z2)보다 크고 상이한 깊이(Z3)에 샘플(119)을 여기시키기 위한 각각의 초점 스폿을 생성한다. 또한, 설명의 편의상, 이는 깊이(Z1)만큼 침투하는 서브 펄스(503), 깊이(Z2)만큼 침투하는 서브 펄스(505), 및 깊이(Z3)만큼 침투하는 서브 펄스(507)로 기술될 수 있다.
상이한 깊이에서의 포커싱을 위해, 도 6a에 도시된 바와 같이, 빔 전파를 따라 약간 상이한 축방향 위치에 배치되는 다수의 시간 포커싱 격자(115')가 필요하다. 이것을 달성하는 특별한 방식은, 도 13에 도시된 바와 같은 이러한 다수의 시간 포커싱 격자(115')를 지지하는 다중 요소 격자 조립체(1300)를 사용하는 것이다. 상기 조립체(1300)는 일반적으로, 베이스로부터 상방으로 연장되는 수 개의 레그(1304)가 형성된 베이스(1302) 및 각 레그의 단부에 지지되는 시간 포커싱 격자(115')를 포함한다. 상기 레그(1304)는 시간 포커싱 격자(115')가 (조립체(1300)가 시스템에 설치될 때 베이스(1302)에 수직이 되는) 빔 경로(1306)를 따라 상이한 축방향 위치에 위치되도록 상기 베이스(1302)에 대해 각각 상이한 높이를 갖는다.
도 6b는 도 1에 도시된 바와 같이, 단일 격자(115)를 사용하는 구현예에 따른, 샘플에 침투하는 시간 다중화 서브 펄스를 도시한다. 도 5의 시간 다중화 서브 펄스들(503, 505, 507)은 상기 서브 펄스들이 샘플의 동일한 깊이에 포커싱되면서 인접한 평면들에 지향되도록 샘플(119)에 전송된다. 도 6b에 도시된 예에서, 서브 펄스(503)는 포커싱되어 제1 평면 영역 상의 깊이(Z1)에 샘플(119)을 여기시키기 위한 각각의 초점 스폿을 생성하고; (서브 펄스(503)에 비해 10 ns의 시간 지연을 갖는) 서브 펄스(505)는 포커싱되어 제2 평면 영역 상의 동일한 깊이(Z1)에 샘플(119)을 여기시키기 위한 각각의 초점 스폿을 생성하며; (서브 펄스(503)에 비해 20 ns의 시간 지연을 갖고 서브 펄스(505)에 비해 10 ns의 시간 지연을 갖는) 서브 펄스(507)는 포커싱되어 제3 평면 영역 상의 동일한 깊이(Z1)에 상기 제1 및 제2 평면 영역과 같이 샘플(119)을 여기시키기 위한 각각의 초점 스폿을 생성한다.
3 개의 시간 다중화 서브 펄스만이 도 6a 및 도 6b에 도시되어 있지만, 시간 다중화 서브 펄스의 개수는 3 개로 제한되지 않으며; 예컨대, 각각의 지연 및 포커싱 깊이/평면 영역을 갖는 4 개 이상의 서브 펄스들이 사용될 수 있다. 도 6a는 서브 펄스들이 증가하는 시간 지연과 관련하여 증가하는 깊이에 포커싱되는 예를 도시하지만, 일부 예에서는 포커싱 깊이 및 시간 지연이 이러한 방식으로 관련되지 않을 수도 있다.
도 7, 도 8, 및 도 9는 일 구현예에 따른, 샘플에 침투하는 다수의 서브 펄스를 각각 포함하는 광 펄스들을 각각 전달하는 다수의 서브 빔을 포함하는 시간 및 공간 다중화 빔을 가시화하여 도시한다. 특히, 이러한 가시화는, 각 부분(이 예시들에서는 각 사분면(Q1 내지 Q4))에 각각 지향되며 상대적으로 시간 지연되고 (각각의 z-평면에서) 각각의 상이한 깊이에 포커싱되는 3 개의 서브 펄스들의 세트들을 각각 반복적으로 전달하는 4 개의 서브 빔들(515a, 515b, 515c, 515d)을 갖는 4×3 공간 및 시간 다중화를 사용하는 촬영 시스템과 관련이 있다. 상기 4 개의 서브 빔들(515a, 515b, 515c, 515d)을 생성하는 공간 다중화는, 예컨대, 도 1 내지 도 3에 대해 상술한 바와 같이 수행될 수 있으며, 3 개의 서브 펄스들의 세트들을 각각 포함하는 광 펄스들을 생성하는 시간 다중화는, 예컨대, 도 5 및 도 6에 대해 상술한 바와 같이 수행될 수 있다. 샘플(119)의 각각의 부분들 내에 복셀을 스캐닝하기 위한 서브 빔들(515a, 515b, 515c, 515d)의 편향은 도 1, 도 3, 및 도 4에 대해 상술한 바와 같이 수행될 수 있다. 4 개의 공간 다중화 서브 빔들(515a, 515b, 515c, 515d)만이 도시되었지만, 공간 다중화 서브 빔의 개수는 4 개로 제한되지 않는다. 샘플(119)은 서브 빔의 개수의 증가에 대응하여 4 개 초과의 부분들로 분할될 수 있다. 마찬가지로, 3 개 초과의 서브 펄스는 z-평면의 개수의 증가에 대응하여 서브 펄스들의 각 세트에 포함될 수 있다.
각각의 서브 빔들(515a 내지 515d)은, 도 4 및 도 5에 도시된 광 펄스(515)에 포함된 시간 다중화 서브 펄스들(503, 505, 507)과 같은 다수의 서브 펄스를 각각 포함하는 시간 다중화 광 펄스를 포함하고 반복적으로 전달하며, 상기 서브 펄스들은 샘플(119)의 각각의 깊이 Z1(z-평면 #1에 해당), Z2(z-평면 #2에 해당), 및 Z3(z-평면 #3에 해당)에 침투한다. 또한, 각각의 서브 빔들(515a 내지 515d)은 샘플(119)의 하나의 개별 부분 또는 분할부(예컨대, 쿼터(Q1, Q2, Q3, Q4))를 스캐닝하는데 사용된다. 결과적으로, 샘플의 3 차원 스캐닝이 제공될 수 있으며, 여기서 (예컨대, 도 3에 도시된 곡류 패턴(313) 중 하나의 진로를 수행하는, 도 1과 관련하여 설명된 스캐너(111)와 같은) 광 스캐너에 의해 수행되는 완전 2D 스캐닝 시퀀스는, 샘플(119)이 Z-평면 #1, Z-평면 #2, 및 Z-평면 #3으로 도시된 3 개의 상이한 깊이에서 상평면을 통해 12 개의 초점 포인트를 스캐닝함으로써 스캐닝되도록 한다.
도 8에서, z-평면 #1, z-평면 #2, 및 z-평면 #3의 3 개의 평면들의 제1 세트를 촬영한 후, 서브 빔들(515a 내지 515d)에 대한 초점 스폿들은, Z-평면들이 z 방향으로 이동하고, 예컨대, Z-평면 #1이 이전 위치에서 새로운 위치인 Z-평면 #4로 이동하도록 계속해서 샘플(119) 내로 침투한다. 이와 유사하게, Z-평면 #2 및 Z-평면 #3은 각각 새로운 위치인 Z-평면 #5 및 Z-평면 #6으로 이동한다. 이러한 위치 변화는 z-평면 #1 및 z-평면 #2 사이의 복셀들이 모두 스캐닝되도록 계속될 수 있다.
도 9에서, 평면을 이동시키는 또 다른 예가 도시된다. z-평면 #1을 z-평면 #1 및 z-평면 #2 사이의 새로운 위치로 이동시키는 대신, z-평면 #1은 z-평면 #3보다 큰 깊이에서 z-평면 #7로 이동된다.
도 10a 및 도 10b는 일 구현예에 따른, (시간 다중화 서브 펄스이거나 시간 다중화 서브 펄스가 아닌) 광 펄스에 대한 포커싱 스폿을 스캐닝하는 것을 도시한다. 소형의 시간 포커싱 스폿(1021)은 촬영 시야(field-of-view; FOV)(1023)에 걸쳐 스캐닝될 수 있다. 상기 FOV(1023)는 샘플(119)의 슬라이스(slice)일 수 있으며, 그 이미지는 촬영 시스템(100)에 의해 촬상된다. (시간 다중화 서브 펄스이거나 시간 다중화 서브 펄스가 아닌) 광 펄스가 샘플(119)의 깊이로 침투하여 샘플(119)의 슬라이스들의 스택(1031)을 스캐닝할 수 있다. 각 슬라이스(1023)는 도 7 내지 도 9의 Z-평면과 유사하다. 포커싱 스폿(1021)은 도 2 및 도 7에 도시된 스폿들(201, 203, 205, 207)과 유사할 수 있다. 예를 들어, 시간적 포커싱 스폿(1021)의 크기는 약 5Х5Х5 μm일 수 있다. 광 조형(light sculpting)으로 인해, 샘플(119)의 여기(excitation)는 등방적으로 한정될 수 있으며, 이에 따라 좌표계(1025, 1027, 1029)에 의해 도시된 바와 같은 x, y, 또는 z 축 방향으로 단일 뉴런 광학 분할 기능을 제공한다. 용적은 샘플(119)의 축방향 스캐닝에 의해 획득될 수 있다. 상기 축방향 스캐닝은 여기된 형광이 광전자 증배관(PMT)(127)(도 1에 도시됨)에 의해 검출되게 할 수 있다. 앞서 도 3에 도시된 바와 같이, 샘플(119)의 슬라이스(1023)는 시간 포커싱 스폿(1021)에 의해 곡류 패턴(1033)으로 스캐닝될 수 있다.
일부 구현예에서, 광역 시간 포커싱 기반 현미경 검사법의 다양한 양상들이 설정될 수 있다. 적절하게 명명된 스캐닝 시간 포커싱인 시간 포커싱의 스캐닝의 변형이 본 명세서에서 설명된다. 스캐닝 시간 포커싱은 최신 기술의 광섬유 기반 레이저 증폭기와 아울러 공간 및 시간 다중화와 결합되어, 2-광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법에서 설계를 우회하고 최적화할 수 있다. 예를 들어, 5Х5Х5 μm의 여기 용적을 광 조형하고 이미지 FOV에 걸쳐 여기 용적을 신속하게 스캐닝함으로써, 단일 뉴런 해상도를 희생하지 않고 평면 획득 속도를 현저하게 향상시킬 수 있다. 반복률(예컨대, 초당 레이저 펄스)을 초당 획득된 복셀의 개수에 매칭시키는 것은 추가적으로 신호 대 잡음비를 최적화하며, 수학식(1)에 도시된 바와 같이, 이미지 픽셀이 획득되는 동안, 단일 레이저 펄스만이 샘플을 여기시키기 위해 사용될 수 있으므로, 산탄 잡음(shot-noise)이 추가적으로 최소화된다.
도 11은 일 구현예에 따른, 핵 한정 적색 형광 단백질을 발현하는 쥐의 청각 피질에서 생체 내 용적 스택 획득을 도시한다. 스택(1101)은 5 μm 스폿 스캐닝 시간 포커싱 구성 및 도 1에 도시된 바와 같은 스캐너(111)(예컨대, 검류계 거울)로 획득될 수 있다. 레이저 모듈(139)의 평균 전력은 깊이에 따라 25 내지 50 mW 사이일 수 있다. 스케일(1103)은 100 μm 내지 600 μm의 깊이를 표시한다. 이미지들(1105a, 1105b, 1105c, 1105d)은 스택(1101)의 확대된 이미지이다. 이미지(1105d)에 나타난 바와 같이, 뉴런 핵은 500 um 이상의 깊이에서도 명확하게 구별될 수 있다.
도 12는 다중 채널 카운팅 카드(dmCC)(129) 및 컴퓨팅 장치(131)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 본 발명의 양태가 구현될 수 있는 컴퓨터 시스템(1200)을 도시하는 블록도이다. 컴퓨터 시스템(1200)은 정보를 통신하기 위한 버스(1202) 또는 다른 통신 메커니즘, 및 버스(1202)와 연결되어 정보를 처리하는 프로세서(1204)를 포함한다. 또한, 컴퓨터 시스템(1200)은, 버스(1202)와 연결되어 정보 및 프로세서(1204)에 의해 실행될 명령들을 저장하는, 랜덤 액세스 메모리(RAM) 또는 다른 동적 저장 장치와 같은 메인 메모리(1206)를 포함한다. 또한, 메인 메모리(1206)는 프로세서(1204)에 의해 실행될 명령들이 실행되는 동안 임시 변수들 또는 다른 중간 정보를 저장하기 위해 사용될 수 있다. 컴퓨터 시스템(1200)은, 버스(1202)와 연결되어 정적 정보 및 프로세서(1204)를 위한 명령들을 저장하는 읽기 전용 메모리(ROM)(1208) 또는 다른 정적 저장 장치를 더 포함한다. 자기 디스크 또는 광 디스크와 같은 저장 장치(1210)는 버스(1202)와 연결되어 정보 및 명령들을 저장한다.
WLAN 문제를 식별하는 것에 응답하여 다양한 다른 동작들이 수행될 수 있다. 일부 상황에서, 교체 무선 라우터는 불량 무선 라우터를 감지하는 것에 응답하여 고객에게 자동으로 발송될 수 있다. 일부 상황에서, 고객은 고객 위치에서 서비스 품질에 영향을 줄 수 있는 잠재적인 WLAN 문제 또는 잠재적으로 문제가 있는 장치에 대해 (예컨대, 이메일 및 팝업창을 통해) 자동으로 통보 받을 수 있다. 일부 상황에서, 시스템은 무선 라우터의 업그레이드, 클라이언트 장치의 업그레이드, 무선 라우터 또는 클라이언트 장치의 이동 또는 배치 제안, 그리고 무선 네트워크 중계기의 사용 제안 등 WLAN 변경 사항을 자동으로 권장할 수 있다. 일부 상황에서, WLAN 상태에 대한 정보가 월별 청구서 또는 온라인 계정 웹 페이지에 자동으로 포함될 수 있다. 일부 상황에서, 고객 지원부에 연락하는 고객의 네트워크 상태가 데이터베이스에 수집되어 고객 불만의 원인을 동적으로 및/또는 자동으로 식별하는 데 사용된다; 예를 들어, 무선 라우터 모델은 다른 네트워크 하드웨어 및 클라이언트 장치와의 호환성을 위해 식별 및 평가될 수 있으며, (일체형 무선 라우터를 포함하는) CPE(132)에 관한 정보가 시간에 따라 품질을 개선하기 위해 수집될 수 있다.
컴퓨터 시스템(1200)은, 정보를 컴퓨터 사용자에게 표시하기 위해 음극선관(CRT) 또는 액정 디스플레이(LCD)와 같은 디스플레이(1212)에 버스(1202)를 통해 연결될 수 있다. 영숫자 및 다른 키들을 포함하는 입력 장치(1214)는 버스(1202)에 연결되어 정보 및 명령 선택들을 프로세서(1204)에 통신한다. 다른 유형의 사용자 입력 장치는, 방향 정보 및 명령 선택들을 프로세서(1204)에 전달하고 디스플레이(1212)상의 커서 이동을 제어하는 마우스, 트랙볼, 또는 커서 방향키와 같은 커서 제어(1216)이다. 이러한 입력 장치는 일반적으로 장치가 평면 내의 위치를 특정하도록 하는 제1 축(예컨대, x) 및 제2 축(예컨대, y)의 2 개의 축으로 2의 자유도를 갖는다. 다른 유형의 사용자 입력 장치는 일반적으로 디스플레이(1212)를 디스플레이(1212) 상의 터치를 입력 받는 하드웨어와 결합한 터치 스크린이다.
본 발명은 이 명세서에 설명된 기술을 구현하기 위한 컴퓨터 시스템(1200)과 같은 컴퓨터 시스템의 사용에 관련된다. 일부 예에서, 이들 기술은 프로세서(1204)가 메인 메모리(1206)에 포함된 하나 이상의 명령들의 하나 이상의 시퀀스들을 실행하는 것에 응답하여 컴퓨터 시스템(1200)에 의해 수행된다. 이러한 명령들은 저장 장치(1210)와 같은 다른 기계 판독 가능 매체로부터 메인 메모리(1206)로 판독될 수 있다. 메인 메모리(1206)에 포함된 명령들의 시퀀스들을 실행함으로써 프로세서(1204)는 본 명세서에 설명된 프로세스 단계들을 수행한다. 일부 예에서, 하드 와이어드 회로(hard-wired circuitry)는 본 발명의 다양한 양태들을 구현하기 위해 소프트웨어 명령들과 조합하여 또는 대용으로 사용될 수 있다. 따라서, 구현은 하드웨어 회로 및 소프트웨어의 특정 조합으로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기계 판독 가능 매체"라는 용어는 기계가 특정 방식으로 작동하게 하는 데이터 제공에 관여하는 임의의 매체를 지칭한다. 컴퓨터 시스템(1200)을 사용하여 구현되는 일부 예에서, 다양한 기계 판독 가능 매체가, 예컨대, 실행을 위해 프로세서(1204)에 명령들을 제공하는 것에 관여한다. 이러한 매체는, 비휘발성 매체, 휘발성 매체, 및 전송 매체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 형태를 취할 수 있다. 비휘발성 매체는, 예컨대, 저장 장치(1210)와 같은 광학 또는 자기 디스크를 포함한다. 휘발성 매체는 메인 메모리(1206)와 같은 동적 메모리를 포함한다. 전송 매체는 버스(1202)를 포함하는 와이어를 포함하는 동축 케이블, 구리선, 및 광섬유를 포함한다. 또한, 전송 매체는 전파(radio-wave) 및 적외선 데이터 통신 중에 생성되는 것과 같은 음파 또는 광파의 형태를 취할 수 있다. 이러한 모든 매체는 매체에 의해 운반되는 명령들을 기계 내부로 판독하는 물리적 메커니즘에 의해 검출할 수 있도록 실체적(tangible)이어야 한다.
일반적인 형태의 기계 판독 가능 매체는, 예컨대, 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 또는 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, 임의의 다른 광 매체, 펀치 카드, 종이 테이프, 홀 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 매체, RAM, PROM, EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 이하에 설명되는 바와 같은 반송파, 또는 컴퓨터가 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다.
다양한 형태의 기계 판독 가능 매체가 실행을 위해 프로세서(1204)에 하나 이상의 명령들의 하나 이상의 시퀀스들을 운반하는 것에 관여할 수 있다. 예를 들어, 명령들은 초기에 원격 컴퓨터의 자기 디스크에서 운반될 수 있다. 원격 컴퓨터는 명령들을 그 동적 메모리에 로딩하고, 모뎀을 이용하여 전화선을 거쳐 송신할 수 있다. 컴퓨터 시스템(1200)에 대해 국부적인 모뎀은 전화선 상의 데이터를 수신하고 적외선 송신기를 이용하여 데이터를 적외선 신호로 변환한다. 적외선 검출기가 적외선 신호로 운반된 데이터를 수신하며, 적절한 회로가 상기 데이터를 버스(1202)에 배치한다. 버스(1202)는 데이터를 메인 메모리(1206)로 운반하고, 프로세서(304)는 메인 메모리(1206)부터 명령들을 검색하고 실행한다. 메인 메모리(1206)에 의해 수신된 명령들은 프로세서(1204)에 의한 실행의 전 또는 후에 기억 장치(1210)에 선택적으로 저장될 수 있다.
또한, 컴퓨터 시스템(1200)은 버스(1202)에 연결된 통신 인터페이스(1218)를 포함한다. 통신 인터페이스(1218)는 로컬 네트워크(1222)에 연결된 네트워크 링크(1220)에 결합하여 양방향 데이터 통신을 제공한다. 예를 들어, 통신 인터페이스(1218)는 대응하는 타입의 전화선에 데이터 통신 연결을 제공하는 종합 정보 통신망(integrated services digital network; ISDN) 카드 또는 모뎀일 수 있다. 다른 예로서, 통신 인터페이스(1218)는 호환 가능 LAN에 데이터 통신 연결을 제공하는 근거리 통신망(LAN) 카드일 수 있다. 또한, 무선 링크가 구현될 수 있다. 이러한 임의의 구현예에서, 통신 인터페이스(1218)는 다양한 타입의 정보를 나타내는 디지털 데이터 스트림을 운반하는 전기 신호, 전자기 신호, 또는 광 신호를 송수신한다.
네트워크 링크(1220)는 일반적으로 다른 데이터 장치에 하나 이상의 네트워크를 통해 데이터 통신을 제공한다. 예를 들어, 네트워크 링크(1220)는 호스트 컴퓨터(1224)에 또는 인터넷 서비스 제공자(internet service provider; ISP)(1226)에 의해 작동되는 데이터 설비에 로컬 네트워크(1222)를 통해 연결을 제공한다. 결과적으로, ISP(1226)는 이제 일반적으로 "인터넷"(1228)으로 지칭되는 세계적인 패킷 데이터 통신 네트워크를 통해 데이터 통신 서비스를 제공한다. 로컬 네트워크(1222)와 인터넷(1228)은 모두 디지털 데이터 스트림을 운반하는 전기 신호, 전자기 신호, 또는 광 신호를 사용한다. 컴퓨터 시스템(1200)으로 및 그로부터 디지털 데이터를 운반하는, 다양한 네트워크를 통한 신호들 및 네트워크 링크(1220) 상의 그리고 통신 인터페이스(1218)를 통한 신호들은 정보를 운반하는 반송파의 예시적인 형태이다.
컴퓨터 시스템(1200)은 네트워크(들), 네트워크 링크(1220), 및 통신 인터페이스(1218)를 통해 메시지를 송신하고 프로그램 코드를 포함하는 데이터를 수신할 수 있다. 인터넷의 예에서, 서버(1230)는 인터넷(1228), ISP(1226), 로컬 네트워크(1222), 및 통신 인터페이스(1218)를 통해 애플리케이션 프로그램을 위해 요청된 코드를 전송할 수 있다.
수신된 코드는 수신되는 대로 프로세서(1204)에 의해 실행될 수 있으며, 그리고/또는 이후의 실행을 위해 기억 장치(1210) 또는 다른 비휘발성 기억 장치에 저장될 수 있다. 이러한 방식으로, 컴퓨터 시스템(1200)은 반송파의 형태로 애플리케이션 코드를 획득할 수 있다.
전술한 예에서 다양한 구성 요소의 분리는 모든 예에서 이러한 분리를 요구하는 것으로 이해되어서는 안되며, 설명된 구성 요소 및 시스템은 일반적으로 단일 패키지 또는 복수의 시스템으로 일체화될 수 있음을 이해해야 한다.
상기는 최상의 모드(best mode) 및/또는 다른 예들로 간주되는 것을 설명하였지만, 다양한 수정이 이루어질 수 있으며, 본원에서 개시되는 요지는 다양한 형태들 및 예들로 구현될 수 있고, 그 교시는 많은 애플리케이션들에 적용될 수 있으며, 그 중 일부만이 본원에서 설명되었다는 것을 이해할 것이다. 하기의 청구항들은 본 교시의 진정한 범위 내에 있는 임의의 모든 애플리케이션, 수정, 및 변형을 청구하는 것으로 의도된다.
달리 언급되지 않는 한, 하기의 청구항들을 포함하여 본 명세서에 기술된 모든 측정치, 값, 등급(rating), 위치, 크기, 사이즈, 및 기타 사양은 정확한 것이 아니라 대략적인 것이다. 이들은 관련된 기능 및 속하는 기술분야에서 관례적인 기능과 일관성 있는 타당한 범위를 가지도록 의도된다.
본 문단에서 언급된 것을 제외하고, 설명되거나 예시된 어떠한 것도, 청구범위에 인용되었는지 여부에 관계없이, 공중에 대한 임의의 구성요소, 단계, 특징, 목적, 이익, 이점, 또는 균등물의 헌납을 발생시키도록 의도되거나 해석되어서는 안 된다.
특정 의미가 본원에서 달리 명시된 경우를 제외하고, 본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 해당하는 각각의 조사 및 연구 영역에 관한 용어 및 표현에 따라 통상적인 의미를 갖는다는 것이 이해될 것이다. 제1 및 제2 등과 같은 상관적인 용어는 하나의 엔티티 또는 동작을 서로 구별하기 위해서만 사용될 수 있으며, 그러한 엔티티 또는 동작 사이의 임의의 실제적인 관계 또는 순서를 반드시 필요로 하거나 암시하는 것은 아니다. "포함한다", "포함하는"이라는 용어 및 이의 임의의 다른 변형은, 구성 요소의 리스트를 포함하는 프로세스, 방법, 물품, 또는 장치가 오직 그 구성 요소만을 포함하는 것이 아니라 그러한 프로세스, 방법, 물품, 또는 장치에 내재되거나 명백히 리스트되지 않은 다른 구성 요소를 포함할 수 있도록, 비배타적인 포함을 커버하는 것으로 의도된다. 단수로 표현되는 구성 요소는, 추가적인 제한 사항 없이, 그 구성 요소를 포함하는 프로세스, 방법, 물품, 또는 장치에서 동일한 종류의 추가적인 구성 요소의 존재를 배제하지 않는다.
전술한 실시예가 개인이 제공하는 개인 정보를 수집, 저장, 또는 사용하는 범위까지, 이러한 정보가 개인 정보 보호와 관련된 모든 적용 가능한 법률에 따라 사용되어야 함을 이해해야 한다. 또한, 이러한 정보의 수집, 저장, 및 사용은, 예컨대, 상황 및 정보의 유형에 적절할 수 있는 공지된 "옵트 인(opt-in)" 또는 "옵트 아웃(opt-out)" 프로세스를 통해 해당 활동에 대한 개인의 동의를 필요로 할 수 있다. 개인 정보의 보관 및 사용은, 예컨대, 특히 민감한 정보에 대한 다양한 암호화 및 익명화 기술을 통해 정보의 유형을 반영하는 적절하게 안전한 방식으로 이루어질 수 있다.
상기 상세한 설명에서, 개시 내용을 간소화할 목적으로 다양한 예들에 다양한 특징들이 함께 그룹화되는 것을 알 수 있다. 이러한 개시 방법은 청구항들이 각 청구항에서 명시적으로 인용된 것보다 더 많은 특징들을 필요로 하는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 하기의 청구 범위가 반영하는 바와 같이, 발명의 요지는 개시된 단일 예시의 모든 특징들보다 더 적게 존재한다. 따라서, 하기의 청구 범위는 이에 의해 상세한 설명에 포함되며, 각 청구항은 별도로 청구되는 요지로서 독립적이다.

Claims (25)

  1. 레이저 펄스를 출력하는 레이저 모듈;
    상기 레이저 모듈로부터 수신된 레이저 펄스를 제1 서브 펄스 및 제2 서브 펄스를 포함하는 복수의 서브 펄스로 분할하고 상기 제1 서브 펄스 및 상기 제2 서브 펄스 사이에 시간 지연을 도입하도록 구성된 광 지연 모듈;
    상기 광 지연 모듈로부터 목표 용적으로 상기 서브 펄스를 전달하는 망원경; 및
    상기 제1 및 제2 서브 펄스에 의한 상기 목표 용적의 여기(excitation)에 응답하여 상기 목표 용적 내에 생성된 광자를 수집하도록 구성된 광 검출기를 포함하는 촬영 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 광 지연 모듈은,
    상기 레이저 펄스를 상기 복수의 서브 펄스로 분할하도록 구성된 빔 분할기; 및 상기 제1 및 제2 서브 펄스를 조합하여 상기 제1 및 제2 서브 펄스를 포함하는 시간 다중화 레이저 펄스를 형성하는 광 결합기를 포함하며,
    상기 망원경은 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 상기 목표 용적으로 전달하는 촬영 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 광 지연 모듈은, 자유 공간 전파 또는 광섬유를 통해 상기 제1 서브 펄스 및 상기 제2 서브 펄스 사이에 상기 시간 지연을 도입하는 적어도 2 개의 광 경로를 더 포함하는 촬영 시스템.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 광 지연 모듈은,
    상기 빔 스플리터로부터 수신된 상기 제1 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 제1 깊이로 포커싱하는 제1 발산을 갖는 제1 포커싱 렌즈; 및
    상기 빔 스플리터로부터 수신된 상기 제2 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 제2 깊이로 포커싱하는 제2 발산을 갖는 제2 포커싱 렌즈를 더 포함하는 촬영 시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 광 지연 모듈로부터 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 수신하도록 구성되며, 상기 시간 다중화 레이저 펄스를 제1 서브 빔 및 제2 서브 빔을 포함하는 복수의 서브 빔으로 분할하는 빔 스플리터를 포함하고, 상기 제1 서브 빔 및 상기 제2 서브 빔은 상기 목표 용적 내에서 상기 제1 깊이에 형성된 제1 상평면(image plane) 및 상기 목표 용적 내에서 상기 제2 깊이에 형성된 제2 상평면에 대해 공간적으로 분리되는 공간 다중화 모듈을 더 포함하는 촬영 시스템.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 공간 다중화 모듈은, 상기 제1 및 제2 서브 빔을 각도 편향시킴으로써 상기 제1 및 제2 서브 빔이 상기 제1 및 제2 상평면의 제1 및 제2 포커싱 영역에서 각각 스캐닝되도록 하는 스캐너를 더 포함하는 촬영 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 레이저 모듈은 제1 반복률 및 지속시간으로 방출되는 광 펄스를 포함하는 레이저 빔을 출력하도록 구성되며, 상기 공간 다중화 모듈은, 상기 레이저 모듈에 의한 광 출력에 대한 상기 목표 용적 내의 초점 스폿이 상기 레이저 모듈에 의해 연속적으로 펄스들이 방출되는 사이에 대략 상기 초점 스폿의 제1 방향의 폭만큼 상기 제1 방향으로 편향되도록, 상기 제1 반복률에 기초한 속도로 상기 스캐너를 이동시키도록 구성된 제어기를 더 포함하는, 촬영 시스템.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 스캐너로부터 상기 각도 편향된 제1 및 제2 서브 빔을 수신하고 상기 각도 편향된 제1 및 제2 서브 빔의 광 펄스를 각각의 스펙트럼 성분으로 분산시키는 시간 포커싱 격자를 더 포함하는 촬영 시스템.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 광 검출기는, 광전자 증배관; 및
    상기 목표 용적 내에 생성된 상기 광자를 포커싱하는 렌즈 어레이를 포함하는 촬영 시스템.
  10. 레이저 펄스를 출력하는 레이저 모듈;
    상기 레이저 모듈로부터 상기 레이저 펄스를 수신하도록 구성되며, 상기 레이저 펄스를 제1 서브 빔 및 제2 서브 빔을 포함하는 복수의 서브 빔으로 분할하는 빔 스플리터를 포함하고, 상기 제1 서브 빔 및 상기 제2 서브 빔은 목표 용적 내에서 제1 깊이에 형성된 제1 상평면에 대해 공간적으로 분리되는 공간 다중화 모듈;
    상기 공간 다중화 모듈로부터 상기 목표 용적으로 상기 제1 및 제2 서브 빔을 전달하는 망원경; 및
    상기 제1 및 제2 서브 빔에 의한 상기 목표 용적의 여기(excitation)에 응답하여 상기 목표 용적 내에 생성된 광자를 수집하도록 구성된 광 검출기를 포함하는 촬영 시스템.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 공간 다중화 모듈은, 상기 제1 및 제2 서브 빔을 각도 편향시킴으로써 상기 제1 및 제2 서브 빔이 상기 제1 상평면의 제1 및 제2 포커싱 영역에서 각각 스캐닝되도록 하는 스캐너를 더 포함하는 촬영 시스템.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 레이저 모듈은 제1 반복률 및 지속시간으로 방출되는 광 펄스를 포함하는 레이저 빔을 출력하도록 구성되며, 상기 공간 다중화 모듈은, 상기 레이저 모듈에 의한 광 출력에 대한 상기 목표 용적 내의 초점 스폿이 상기 레이저 모듈에 의해 연속적으로 펄스들이 방출되는 사이에 대략 상기 초점 스폿의 제1 방향의 폭만큼 상기 제1 방향으로 편향되도록, 상기 제1 반복률에 기초한 속도로 상기 스캐너를 이동시키도록 구성된 제어기를 더 포함하는, 촬영 시스템.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 공간 다중화 모듈은, 상기 스캐너로부터 상기 각도 편향된 제1 및 제2 서브 빔을 수신하고 상기 각도 편향된 제1 및 제2 서브 빔의 광 펄스를 각각의 스펙트럼 성분으로 분산시키는 시간 포커싱 격자를 더 포함하는 촬영 시스템.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 광 검출기는, 광전자 증배관; 및
    상기 목표 용적 내에 생성된 상기 광자를 포커싱하는 렌즈 어레이를 포함하는 촬영 시스템.
  15. 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법으로서,
    지속시간이 각각 10 ps 미만인 펄스를 포함하는 펄스형 레이저 빔을 제공하는 단계;
    상기 펄스형 레이저 빔의 펄스를 제1 서브 펄스 및 제2 서브 펄스를 포함하는 복수의 서브 펄스로 분할하는 단계;
    상기 목표 용적에 진입하는 상기 제1 서브 펄스 및 상기 목표 용적에 진입하는 상기 제2 서브 펄스 사이에 시간 지연을 도입하는 단계; 및
    상기 제1 및 제2 서브 펄스에 의한 상기 목표 용적의 여기(excitation)에 응답하여 상기 목표 용적 내에 생성된 광자를 수집하는 단계를 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 서브 펄스에 의한 상기 목표 용적의 상기 여기는, 2-광자 여기 방식(two-photon excitation scheme), 3-광자 여기 방식(three-photon excitation scheme), 또는 이들의 조합에 의한 상기 목표 용적 내의 형광체의 여기를 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 제1 서브 펄스 및 상기 제2 서브 펄스 사이의 상기 시간 지연은 자유 공간 전파 또는 광섬유를 통해 도입되는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 공통 평면에 포커싱하는 단계를 더 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 제1 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 제1 깊이에 포커싱하는 단계; 및
    상기 제2 서브 펄스를 상기 목표 용적 내의 상기 제1 깊이와 상이한 제2 깊이에 포커싱하는 단계를 더 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 펄스를 조합하여 상기 제1 및 제2 서브 펄스를 포함하는 시간 다중화 레이저 펄스를 형성하는 단계;
    상기 시간 다중화 레이저 펄스를 제1 서브 빔 및 제2 서브 빔을 포함하는 복수의 서브 빔으로 공간적으로 분리하는 단계로서, 상기 제1 서브 빔 및 상기 제2 서브 빔은 상기 목표 용적 내에서 상기 제1 깊이에 형성된 제1 상평면 및 상기 목표 용적 내에서 상기 제2 깊이에 형성된 제2 상평면에 대해 공간적으로 분리되는 단계; 및
    상기 공간적으로 분리된 시간 다중화 레이저 펄스를 상기 목표 용적으로 전달하는 단계를 더 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 서브 빔을 스캐너로 각도 편향시키는 단계로서, 상기 제1 및 제2 서브 빔이 상기 제1 및 제2 상평면의 제1 및 제2 포커싱 영역에서 각각 스캐닝되도록 하는 단계를 더 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 레이저 모듈에 의한 광 출력에 대한 상기 목표 용적 내의 초점 스폿이 상기 펄스형 레이저 빔의 펄스들이 연속적으로 방출되는 사이에 대략 상기 초점 스폿의 제1 방향의 폭만큼 상기 제1 방향으로 편향되도록, 상기 펄스형 레이저 빔의 반복률에 기초한 속도로 상기 스캐너를 이동시키는 단계를 더 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  23. 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법으로서,
    지속시간이 각각 10 ps 미만인 펄스를 포함하는 펄스형 레이저 빔을 제공하는 단계;
    상기 펄스형 레이저 빔을 제1 서브 빔 및 제2 서브 빔을 포함하는 복수의 서브 빔으로 분할하는 단계로서, 상기 제1 서브 빔 및 상기 제2 서브 빔은 목표 용적 내에서 제1 깊이에 형성된 제1 상평면에 대해 공간적으로 분리되는 단계;
    상기 목표 용적으로 상기 제1 및 제2 서브 빔을 전달하는 단계; 및
    상기 제1 및 제2 서브 펄스에 의한 상기 목표 용적의 여기(excitation)에 응답하여 상기 목표 용적 내에 생성된 광자를 수집하는 단계를 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 서브 빔을 스캐너로 각도 편향시키는 단계로서, 상기 제1 및 제2 서브 빔이 상기 제1 상평면의 제1 및 제2 포커싱 영역에서 각각 스캐닝되도록 하는 단계를 더 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 레이저 모듈에 의한 광 출력에 대한 상기 목표 용적 내의 초점 스폿이 상기 펄스형 레이저 빔의 펄스들이 연속적으로 방출되는 사이에 대략 상기 초점 스폿의 제1 방향의 폭만큼 상기 제1 방향으로 편향되도록, 상기 펄스형 레이저 빔의 반복률에 기초한 속도로 상기 스캐너를 이동시키는 단계를 더 포함하는, 목표 용적 내의 형광체의 고속 촬영 방법.
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