KR20230074181A - 바이오마커의 검출 - Google Patents

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애나 소피아 드 지저스 페레이라
매티스 칼 프란츠 랑고르스트
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리파인 리미티드
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Abstract

광 산란 현미경으로 샘플에서 바이오마커의 검출을 위한 방법 및 키트가 설명된다. 본 발명은 특히 복잡한 샘플에서 낮은 농도 바이오마커의 검출에 유용하며, 현장 진료 환경에서 사용하기에 적절하다. 실시예에서, 본 발명의 방법은 질량 측광법을 사용하여 샘플에서 바이오마커를 검출하는 것을 설명한다.

Description

바이오마커의 검출
본 발명은 샘플에서 바이오마커(biomarker)의 검출 또는 정량화를 위한 광 산란(light scattering), 특히 간섭계 산란 현미경(interferometric scattering microscopy) 또는 질량 측광법(mass photometry)의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 샘플의 바이오마커와 관련된 질환 또는 상태의 진단 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 샘플이 복잡할 수 있기 때문에 바이오마커는 다른 구성요소가 있을 때 부수적인(minor) 구성요소로 존재할 수 있다. 따라서 바이오마커는 낮은 농도로 존재할 수 있다.
바이오마커의 검출 또는 정량화는 질병 또는 상태를 진단하거나 특정 질병 상태에 대한 개인의 민감성을 결정하기 위한 도구로 널리 활용되고 있다. 바이오마커 검출은 맞춤의학(personalised medicine)의 성장에 매우 중요한 도구로, 지표 바이오마커(indicative biomarker) 또는 바이오마커 패널(panel of biomarkers)의 유무에 대해 양성 반응을 보이는 환자에게 표적 치료 요법(targeted treatment regimens)을 가능하게 한다. 예를 들어, 암(cancer), 자가면역(autoimmune) 또는 염증성 질환(inflammatory diseases)은 혈액, CSF 및 소변과 같은 체액에서 채취한 샘플에서 단백질 또는 기타 바이오마커의 비정상적인 존재를 검출하여 진단할 수 있다. 이러한 바이오마커는 특정 단백질, 단백질 동형(isoforms), 번역 후 변형(post-translation modifications), 비정상적인 양의 단백질 유무 또는 단백질 대 단백질/대사물질 또는 단백질 대 다른 생체분자(예: 당, 다당류, 핵산) 비율의 변화일 수 있다.
바이오마커는 평가, 모니터링 또는 측정할 수 있고 건강 상태, 병원성 프로세스(pathogenic process) 또는 치료 또는 의료 개입(medical intervention)에 대한 반응과 관련된 광범위한 세포, 생화학 및/또는 분자 변화를 포함한다. 바이오마커는 일반적으로 상대적으로 진행된 여러 질병의 진단으로 사용되지만, 치료 또는 예방 조치가 더 효과적일 수 있는 초기 단계의 검출 가능성은 여전히 매우 제한적이며, 대부분 초기 질병 바이오마커가 충분하지 않고 매우 낮은 농도로 존재하기 때문이다. 낮은 농도 바이오마커를 검출하는 가장 일반적인 방법은 표적 또는 정량적 질량 분석(quantitative mass spectrometry), 압타머(aptamer) 기반 프로테오믹스(proteomics)를 포함한다.
적절한 바이오마커 식별(identification)의 성장과 함께 바이오마커를 검출하거나 정량화하기 위한 방법, 시스템 및 하드웨어가 개발되었다. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 및 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 기반 검사로, 높은 감도를 제공하지만 신속한 비정량적 검사에 최적화되거나 완료하는 데 30분에서 몇 시간이 소요되므로 현장진료(point-of-care)환경에서 사용하기에는 너무 복잡하거나 비용이 많이 든다.
ELISA의 단점을 해결하기 위해 전기화학 면역측정법(electrochemical immunoassays), 표면 강화 라만 분광법(surface-enhanced Raman spectroscopy), 플로우 세포 측정법(flow cytometry) 또는 다른 형광 기반 기술과 같은 다른 접근법이 개발되었지만, 지금까지 어떤 것도 높은 특수성(specificity)과 민감성(sensitivity)을 가진 단순하고 저렴한 도구의 이상적인 조합에 도달하지 못했다.
최근 몇 년 동안 간섭계 산란 현미경(interferometric scattering microscopy, iSCAT), 특히 질량 측광법(mass photometry)은 단일 분자 검출을 위한 강력한 분석 기술로 개발되어 ELISA와 같은 분석법에 대한 간단하고 비용 효율적인 대안을 제공하고 있다. iSCAT는 라벨을 추가할 필요 없이 용액 내 다른 질량의 입자의 상대적 분포에 대한 정보를 제공한다. iSCAT는 정제된 단일 단백질 검출(Cole et al(ACS Photonics, 2017, 4(2), pp 211-216 및 WO2018/011591), 지질단백질(lipoproteins) 검출 및 용액 내 분자 농도 측정(WO2019/110977)을 위해 이전에 설명되었다. 질량 측광법은 특히 Young et al, Science, Apr 2018:Vol. 360, Issue 6387, 423-427 및 Li et al, Nucleic Acids Research, August 2020, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa632에서 설명되었다.
여기에서 질량 측광법(mass photometry, MP)으로 표시되는 간섭계 산란 질량 분석기(Interferometric scattering mass spectrometry, iSCAMS)는 단일 목적물의 질량과 이들이 용액에서 형성하는 복합체를 검출하고 측정하기 위한 수단이다. MP는 표면에 비특이적 또는 특이적으로 결합할 때 광 산란을 통해 단일 분자를 검출한다. 각각의 바인딩 이벤트는 표면/용액 인터페이스(surface/solution interface)에서 굴절률의 변화로 이어지며, 이는 국소 광 산란을 효과적으로 변경하고 산란된 광과 반사된 광 사이의 최적화된 간섭을 활용하여 높은 정확도로 검출할 수 있다. 알려진 질량의 분자로 교정하여 ~2% 질량 정확도와 최대 20kDa 질량 분해능(resolution)을 가진 폴리펩티드의 경우 신호 변화의 크기를 분자 질량으로 변환할 수 있다. 따라서 산란 신호는 분자의 질량에 정비례하므로 광으로 단일 분자의 무게를 측정하는 것이 가능하다. 그러나 이러한 기술은 한 개의 분자가 낮은 농도로 존재할 수 있는 복잡한 용액에 단순히 적용될 수 없다. 따라서, 낮은 농도의 분자가 표면에 비특이적으로 결합하여 질량 검출을 할 수 있음에도 불구하고, 분자의 동일성(identity)와 질량을 정확하게 결정하기에는 너무 많은 교란 요소가 존재할 수 있다. 이는 해당 분자의 식별을 복잡하게 하고 농도 결정을 어렵게 한다. 따라서 샘플에 존재하는 낮은 농도의 바이오마커에 이 기술을 적용하는 것은 제한적이다.
질량 측광법은 원래 상태(native state)에서 라벨 없이 용액에서 단일 분자의 정확한 질량 측정을 할 수 있다는 점에서 독특하다.
광 산란은 샘플을 통과하는 입사광과의 각도 차이로부터 광의 강도를 측정하여 용액에서 광 산란 종(light-scattering species)을 측정하는 것과 같은 생화학적 분석에 오랫동안 사용되어 왔으며, 이는 "nephelometry"로 알려져 있다. 다른 더 정교한 방법들은 광 산란의 원리에 의존하는 것으로, 예를 들어 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)(입자의 크기 및 크기 분포 측정), 전기영동 광 산란(Electrophoretic Light Scattering, ELS)(전기영동 이동성 및 제타 전위 측정), 및 저각 레이저-광 산란(Low-Angle Laser-Light Scattering, LALS)(샘플에서 중합체의 분자량 분포를 측정할 수 있음) 이 있다. 그러나, 사용되는 기술은 표면에서 단일 분자(목적물)의 직접적인 질량 측정을 가능하게 하기 때문에, 본 발명에서 사용되는 광 산란 방법 및 장치와는 모두 다르다. 특히, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)과 같은 광 산란의 원리에 의존하는 기술은 분석에서 굴절률의 벌크 변화(bulk change)를 유도하기 위해 다중 입자(multiple particles)의 결합에 전적으로 의존하며, 복잡한 용액에서 바이오마커의 존재, 농도 및 개별 질량을 결정하는 데 필요한 자세한 수준을 제공할 수 없다.
질병 진행, 질병 퇴행 또는 잠재적 약물 후보자에 대한 신속한 임상 스크리닝에 사용되는 바이오마커의 검출에 대한 민감도와 특이성이 여전히 부족하다. 예를 들어, 가장 일반적인 바이오마커 중 하나는 C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP)이지만, 이 바이오마커는 매우 비특이적이며 다양한 조건과 질병을 나타낼 수 있다. 일상적으로 접근할 수 있는 보다 구체적인 바이오마커의 분석을 개선하는 것은 일상적인 진단의 전환점이 될 것이다. 또한 신경계 질환 및 암에 대한 바이오마커는 종종 질병의 초기 단계에서 체액에 존재하지만 그 농도가 너무 낮아 현장 진료에서 일상적으로 사용되는 기술로 정확하게 검출할 수 없다. 현장 진료 환경에 적절하려면 정확도를 유지하면서 분석 결과를 얻는 데 필요한 비용, 시간 및 기술을 더 줄여야 한다.
따라서 생물학적 샘플과 같은 잔해 또는 큰 응집체를 포함하는 지저분한 환경에서 매우 낮은 농도의 바이오마커를 정량적으로 검출할 수 있고 현장 진료 환경에 더 적절한 구체적이고 민감한 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명자들은 본 명세서에 정의된 바와 같이 광 산란을 이용하여, 특히 샘플에서 낮은 농도로 존재하는 바이오마커의 특정한 검출을 가능하게 하는 방법론을 놀랍게도 확인하였다. 본 발명자들은 복잡한 샘플에서 긴 정제 절차 없이도 낮은 농도의 바이오마커를 검출할 수 있음을 보여주었다. 본 발명자들이 개발한 방법은 특히 생물학적 샘플에서 바이오마커의 검출에 적절하며, 예를 들어 질병 또는 상태의 진단에 사용된다. 또한, 예를 들어 바이러스성 질병이 발생할 수 있는 병원체 또는 하수도에 대한 식품 생산 시스템을 모니터링하는 것과 같은 바이오마커의 산업 및 농업 샘플 모니터링에 특히 적절하다.
간섭계 광 산란 현미경과 실제로 질량 측광법은 간단히 표면에 비특이적으로 결합함으로써 용액 내 분자의 질량과 농도를 결정하지만, 발명자들은 대신 포획제(capture agent)를 사용함으로써 표면에 바이오마커의 특정 결합에 의존하는 반직관적인 방법을 개발했다. 발명자들은 이러한 결합을 측정하는 대신(이러한 측정방법이 일상적임) 특히 샘플에 다른 구성 요소가 존재하고 비특이적 결합의 큰 배경에서는 낮은 농도의 종은 거의 결합이 일어나지 않을 것이므로 이러한 결합을 측정하는 것이 충분히 정확하거나 정량적인 결과를 산출하지 못 하리라고 결정하였다. 따라서, (입자로서) 일부 또는 전부가 방출되기 전과 후의 표면에서 목적물의 질량을 효과적으로 결정함으로써 샘플에서 훨씬 더 많은 종의 비특이적 결합과는 무관하게 목적물의 질량을 간접적으로 측정할 수 있다는 것을 깨달았다. 바이오마커가 포획제로부터 방출되거나, 실제로 포획제 또는 그의 일부가 포획제와 함께 방출된다면 본발명은 정확한 검출방법으로 사용될 수 있다. 이를 통해 포획제와 실제로 방출제(release agent)를 유연하게 선택할 수 있다.
바이오마커는 낮은 농도로 존재하고 샘플의 다른 구성 요소가 존재할 가능성이 높기 때문에 결합을 통한 일상적인 농도 검출은 현재 가능하지 않다. 이는 다른 구성 요소가 표면에 비특이적으로 결합하여 교란 데이터를 제공할 수 있기 때문이다. 이에 대한 우아한 해결책은 바이오마커를 특이적으로 포획하고 세척하여 혼란스러운 구성 요소를 제거한 다음 광 산란의 변화 또는 차이에 대해 표면을 모니터링하여 바이오마커의 방출을 검출하는 것이다. 그 차이는 질량으로 할당될(assigned) 수 있으며 바이오마커의 동일성(identity)을 할당할 수 있다.
이에, 첫번째 측면에서, 샘플에서 바이오마커를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 고정된 바이오마커에 대한 포획제를 포함하는 표면을 샘플과 접촉시키는 단계, 임의의 포획된 바이오마커를 표면으로부터 방출시키는 단계, 및 광 산란에 의해 바이오마커의 방출을 검출하는 것을 포함한다.
광 산란은 간섭계 광 산란 현미경 또는 질량 광도계에서 검출된다.
적절하게는,
I) 샘플에 존재하는 바이오마커에 결합할 수 있는 포획제가 고정된 포획제를 포함하는 표면을 제공하는 단계;
II) 샘플의 바이오마커가 포획제에 결합할 수 있는 조건에서 표면을 샘플과 접촉시키는 단계;
III) 표면의 첫 번째 검출 영역을 정의(define)하는 단계;
IV) 표면에 결합된 입자를 방출시키는 단계;
여기서 입자는 다음 중에서 선택:
i) 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
ii) 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
iii) 결합되지 않은 포획제;
V) 광 산란에 의해 표면의 첫 번째 검출 영역에서 방출되는 입자를 검출하는 단계;.를 포함하는 샘플에서 바이오마커를 검출하는 방법이 제공된다.
입자(들)는 표면에서 광 산란의 변화를 검출하여 검출된다. 따라서 방출 이벤트에는 적어도 두가지 이상의 측정, 방출 이전과 이후의 표면 측정이 필요할 수 있다.
방출 전후의 측정을 통해 음의 질량 이벤트를 검출할 수 있다. 방출된 입자의 질량은 표면에서의 변화를 기록함으로써 본 발명의 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 이를 통해 특정 바이오마커가 존재하는지 여부를 직접 결정할 수 있다.
적절하게는,
I) 샘플에 존재하는 바이오마커에 결합할 수 있는 포획제가 고정된 포획제를 포함하는 표면을 제공하는 단계;
II) 샘플의 바이오마커가 포획제에 결합할 수 있는 조건에서 표면을 샘플과 접촉시키는 단계;
III) 표면의 첫 번째 검출 영역을 정의하고 광 산란을 사용하여 표면을 측정하는 단계;
IV) 표면에 결합된 입자를 방출시키는 단계;
여기서 입자는 다음 중에서 선택:
i) 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
ii) 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
iii) 결합되지 않은 포획제;
V) 광 산란의 변화를 결정하여 표면의 첫 번째 검출 영역에서 방출된 입자를 검출하는 단계;.를 포함하는 샘플에서 바이오마커를 검출하는 방법이 제공된다.
표면의 측정은 표면에서의 목적물(들)의 측정일 수 있다. 표면은 바람직하게는 단일 표면이다. 표면의 특성(nature)은 측정 결과와 무관하기 때문에 표면은 임의의 적절한 형태일 수 있다. 실시예에서, 표면은 편평한 유리 커버슬립이다.
광 산란 방법은 간섭 산란 현미경일 수 있다. 광 산란 방법은 질량 측광법 일 수 있다.
첫 번째 검출 영역은 관찰 가능한 표면일 수 있고, 방출제에 의해 접촉된 영역일 수 있다.
효과적으로, 본 발명은 측정이 달성되는 방식을 완전히 역전시킴으로써 간섭계 광 산란(interferometric light scattering, iSCAT)이 사용되는 방식을 근본적으로 변화시킨다. iSCAT 및 유사한 기술은 일반적으로 실질적으로 순수하거나 최소한의 "불순물"(예: 관심 대상이 아닌 다른 분자)이 있는 샘플에 적용된다. 샘플에서 "희귀한" 종을 검출하기 위해 다른 종의 결합을 막기 위해 표면을 막는 등 다양한 기술이 시도되고 있다. 부동태화된 (passivated)표면에서도 비특이적 결합이 발생할 수 있다. 여기에 설명된 새로운 접근법은 비특이적 결합 이벤트가 모니터링되지 않기 때문에 복잡한 샘플에서 희귀종의 검출을 허용하며, 이들 종은 씻겨나갈 수 있으며, 방법은 희귀종에 특이적인 결합 이벤트에 전적으로 집중한다.
단일 바이오마커, 바이오마커/포획제 복합체 또는 결합되지 않은 포획제를 포함하는 입자의 표면으로부터 방출되는 것은 방출 이벤트(release event)로 지칭될 수 있다. 적절하게는, 표면으로부터 입자를 방출하는 단계는 광 산란에 의해 단일 방출 이벤트를 검출할 수 있는 속도로 수행될 수 있다. 광 산란 현미경은 표면에서 용액으로 방출되는 입자의 질량을 결정할 수 있으며, 그 질량에 대한 지식에 의해 그 동일성(identity)을 결정할 수 있다. 효과적으로, 질량의 손실은 표면에서 검출된다. 광 산란 현미경을 사용하여 표면에서 용액으로 방출된 바이오마커를 검출하면 매우 민감한 방식으로 낮은 농도 바이오마커를 특이적으로 검출할 수 있다. 이 방법은 바이오마커 또는 바이오마커/포획제 복합체의 라벨링이 필요하지 않다는 장점이 있다. 또한, 다른 기술로는 접근할 수 없는 바이오마커 집단의 대량 이질성(mass heterogeneity of a biomarker population)을 포착할 수 있다.
바람직하게는, 광 산란 현미경, 선택적으로 질량 측광법에서, 표면은 거의 연속적인 반복 속도를 통해 거의 지속적으로 조사되거나 조사되는 것으로 설명될 수 있다. 이것은 일반적으로 본 명세서에 기술된 표면의 조사(illumination)를 제어하여 수행된다. 광 산란 장치는 표면에서 광 산란을 통해 단일 분자를 검출한다. 따라서, 본 발명은 표면을 모니터링하고 표면에서 목적물을 검출할 수 있다(포획제 단독, 바이오마커에 결합된 포획제 또는 샘플로부터 추가적인 성분일 수도 있다). 방출 이벤트는 방출제의 추가로 인해 발생할 수 있다. 각 방출 이벤트는 산란광과 반사광 사이의 최적화된 간섭을 이용하여 높은 정확도로 검출할 수 있는 국소 광 산란(예: 목적물)의 변화로 이어진다. 신호 변화의 크기는 분자 질량으로 변환될 수 있다.
따라서 방출된 입자의 질량이 검출된다. 이 검출은 간접적이다.
바람직하게는, 방출 이벤트 전후에 측정이 이루어지기 때문에 위치에서의 변화 또는 위치에서의 목적물의 검출이 가능하다. 간단히 말해서, 이것은 방출 이벤트를 검출하기 위해 두 가지 측정이 수행된다는 것을 의미한다. 따라서 방출 이벤트는 음의 질량 이벤트로 검출될 수 있다. 즉, 질량의 이탈이 검출된다. 따라서 측정을 통해 표면에서 목적물을 검출한 다음 해당 목적물에서 입자를 방출할 수 있다. 방출된 입자의 동일성(identity)는 방출 이벤트 전후의 질량 차이를 계산하여 결정할 수 있다. 도 5는 검출된 "음의 질량"의 예이다. 따라서 이 방법에는 특정 목적물 또는 목적물의 변경 모니터링이 포함될 수 있다. 따라서 이 방법은 특정 위치 또는 변경 위치의 모니터링을 포함할 수 있다. 변화는 입자의 방출을 나타내는 광 산란의 변화일 수 있다.
방출 이벤트가 수행되는 속도는 음의 질량 이벤트가 발생할 때 모니터링할 수 있도록 제어할 수 있다. 신호 변화의 크기는 해당 변화에 대한 분자 질량으로 변환된다.
본 발명의 방법을 사용하여 바이오마커에 대한 임의의 변형, 예를 들어 글리코실화(glycosylation), 핵산의 부착 또는 유비퀴틴화(ubiquitination)를 검출할 수 있다. "번역 후" 또는 다른 변형의 검출은 변형된 바이오마커와 관련된 특정 분자량으로 인한 것일 수 있다.
본 발명의 첫번째 측면은, 샘플에서 바이오마커의 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 포획제로부터 방출되는 바이오마커의 양 및/또는 포획제가 고정된 표면으로부터 방출되는 바이오마커/포획제 복합체의 양을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 검량선(calibration curve)과 비교하여 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 교정 그림을 구성하기 위해 알려진 기준 농도를 포함하는 일련의 교정 용액이 만들어진다. 검량선은 알려진 수의 방출 이벤트를 포함하는 대조군(control)을 사용하여 구성될 수 있다. 검량선은 바이오마커, 바이오마커/포획제 복합체 또는 결합되지 않은 포획제의 양 또는 농도의 측정을 얻기 위해 사용될 수 있다.
내부 표준(internal standard)도 사용할 수 있다. 분석 방법에서 일반적인 것처럼, 내부 표준은 교정 및/또는 바이오마커 검출 분석을 위해 표면에 일정량으로 첨가되는 화학 물질이다. 그런 다음 바이오마커 농도 함수로 바이오마커 신호 대 내부 표준 신호의 비율을 플로팅하여 교정에 사용할 수 있다.
방출 이벤트에서 검출된 대비는 그들의 질량을 식별하기 위해 두 번째 질량 검량선과 상관될 수 있다. 질량 교정 그림을 구성하기 위해 알려진 질량의 입자를 포함하는 일련의 교정 용액이 만들어진다. 질량 측광법을 사용하는 경우 입자는 질량으로 식별할 수 있으며 단일 바이오마커, 바이오마커/포획제 복합체 또는 결합되지 않은 포획제의 정량화는 검량선을 사용하여 얻을 수 있다. 표면에서 방출되는 결합되지 않은 포획제의 양을 측정하는 것은 샘플에 존재하는 바이오마커가 차지하는 포획제의 비율을 정량화하고 정량적인 결과를 제공하는 데 사용될 수 있다.
상기 바이오마커를 포획제 및/또는 바이오마커/포착제 복합체 또는 결합되지 않은 포획제를 표면으로부터 방출하는 단계는, 상기 바이오마커와 포획제 사이의 결합을 저해하는 단계 및/또는 포획제가 고정화된 표면 사이의 결합을 저해하는 단계를 포함할 수 있다. 저해(disruption)는 바이오마커와 포획제 및/또는 포획제를 표면으로부터 완전히 해리시키기에 적절하게 충분하다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 바이오마커 및/또는 포획제의 방출을 매개(mediating)하기 위한 임의의 적절한 수단 또는 방법이 사용될 수 있다. 적절한 방법에는 표면의 화학적 환경의 변화, 포획제의 효소적 분해 (enzymatic digestion)및/또는 광분해(photolysis) 또는 가수분해(hydrolysis)가 포함된다. 바이오마커를 방출하는 적절한 수단은 방출 이벤트를 촉진하는 포획제에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 경쟁적 리간드의 도입을 포함한다.
방법은 방출된 바이오마커/포획제 복합체의 질량을 바이오마커의 예상 질량과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 방법은 외래(heterogenous) 바이오마커 모집단에서 바이오마커를 검출하는 데 유용할 수 있다.
첫번째 측면의 방법은 표면의 두번째 또는 추가 검출 영역에 대해 단계IV) 및 단계V)를 반복하는 단계를 더 포함할 수 있다. 두번째 또는 추가 검출 영역에 대한 단계 IV) 및 V)의 반복은 표면의 첫번째 또는 임의의 이전 검출 영역에서 수행된 단계 IV) 및 V)와 동일하거나 상이한 관찰 이벤트가 있을 수 있다. 적절하게는, 바이오마커 및/또는 바이오마커/포획제 복합체의 방출은 임의의 특정 관찰 이벤트에서 관심 검출 영역으로 제한될 수 있다.
단계 I) 이전에, 본 발명의 방법은 표면 상의 샘플에 존재하는 바이오마커를 포획하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 포획은 특이적일 수 있으며, 이에 따라 표면에서 바이오마커를 풍부하게 할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 다음을 포함한다.
i) 표면을 제공하는 단계;
ii) 바이오마커의 존재 및/또는 양에 대해 분석할 샘플을 제공하는 단계;
iii) 검출할 바이오마커에 특이적으로 결합하는 포획제를 표면에 고정하는 단계;
iv) 샘플에 존재하는 바이오마커가 표면에 고정된 포획제에 결합할 수 있도록 적절한 시간 동안 적절한 조건에서 샘플과 함께 iii)의 표면을 배양하는 단계
임의로, 단계 iv)후에 표면을 세척하여 결합되지 않은 개체(entities)를 제거하고 표면 또는 포획제에 비특이적으로 결합된 개체를 제거할 수 있다. 포획제와 바이오마커 사이의 상호작용이 영향을 받지 않도록 세척 조건을 선택한다. 적절한 조건에는 순한 세제(mild detergent) 또는 저농도의 소금 용액(salt solutions)이 포함된다. 그 대신에, 상기 검출 단계에 적절한 용액을 추가하기 전에, 건조 단계를 포함할 수도 있다. 이러한 건조 단계는 표면에 질소 등의 가스 흐름을 이용하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 세척 및 선택적 건조 단계는 단계 v)로 라벨링될 수 있다.
이러한 단계 i) 내지 v)는 임의의 광 산란 장치 외부에서 수행될 수 있다.
이러한 단계 i) 내지 v)는 표면의 조사(illumination)에 앞서 수행될 수 있다.
일단 샘플에 표면을 접촉시키고 단계 i) 내지 v)와 같은 적절한 준비 단계가 수행된 후, 표면이 용액 안에 있는지 확인하기 위해 버퍼와 표면을 접촉시킬 수 있다.
단계 i) 내지 vi) 중 어떤 단계든지 임의의 적절한 순서로 임의의 검출 단계 이전에 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 표면의 광 산란의 기준선 측정을 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계는 단계 i) 내지 iv) 중 어느 하나 이상의 단계 후에 수행될 수 있다. 기준선(baseline) 측정은 대조군(control) 측정으로 사용될 수 있다. 기준선 측정은 광 산란에 의해 표면에 고정된 어떤 목적물에 대한 정보를 제공할 수 있다. 광 산란의 보정을 위해 표면으로부터 광 산란을 결정하는 데 기준선 측정이 사용될 수 있다. 또한 기준선 측정은 무작위 방출 이벤트의 측정을 제공하여 방출 이벤트가 구체적이고 검출 가치가 있을 것으로 예상되는 기준선을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법은 복수의 측정 단계를 포함할 수 있으며, 이는 표면이 광 산란 장치에 존재하면 시작될 수 있으며, 즉, 전술한 필요한 준비 단계가 모두 수행된 후 시작될 수 있다. 따라서 위에서 설명한 단계 iii) 이후의 어느 지점에서도 측정을 시작할 수 있다. 이러한 다중 측정(multiple measurements)은 불연속적(예: 시간 간격)이거나 측정이 효과적으로 연속적일 수 있다(필름을 생성하기 위해 일정한 속도로 측정 - 나중에 참조). 다중 측정은 표면에서 목적물의 질량을 결정할 수 있으므로 해당 목적물에서 입자가 방출되는 것을 검출할 수 있다. 따라서, 이를 통해 방출 이벤트를 검출할 수 있다. 따라서, 방출 이벤트의 검출은 방출 이벤트 전후의 목적물의 질량을 검출하고, 그 목적물의 질량 차이를 계산하는 것으로 설명될 수 있다. 따라서 특정 목적물(들)의 질량 변화를 모니터링한다. 따라서 목적물에 대한 신호 크기의 변화가 검출된다.
본 발명의 방법은 알려진 수의 방출 이벤트를 갖는 대조군(control) 분자를 사용하여 검량선을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 첫번째 측면의 방법은 샘플에서 바이오마커를 검출하거나 정량화하는 데 유용할 수 있다.
첫번째 측면의 방법은 생물학적 분자의 변형, 예를 들어 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification) 또는 핵산의 메틸화(methylation) 상태를 검출하는 데 유용할 수 있다. 변형된 생물학적 분자는 바이오마커일 수 있다.
첫번째 측면의 방법은 샘플에서 둘 이상의 생물학적 분자들 사이의 상호작용을 검출하는데 유용할 수 있다. 생물학적 분자들 사이의 복합체는 바이오마커일 수 있다.
첫번째 측면의 방법은 샘플에서 두 개 이상 바이오마커의 양을 비교하는 데 유용할 수 있다.
또한, 세포 배양 또는 식품 준비 샘플과 같은 샘플에서 오염을 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 첫번째 측면의 방법을 포함하며, 여기서 바이오마커의 존재는 샘플의 오염을 나타낸다.
또한, 생성물의 발현 수준을 정량화하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 첫번째 측면의 방법을 포함하고 여기서 바이오마커는 발현 생성물의 유무를 나타낸다.
또한, 샘플에서 생물학적 분자 간 상호작용을 검출하거나 양적으로 측정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 첫번째 측면의 방법을 포함하며, 여기서 바이오마커의 유무 또는 양은 상호작용의 유무 또는 양을 나타낸다. 이러한 방법은 바이오마커의 존재 또는 활동에 영향을 미치는 화합물의 존재 또는 양을 검출하는 데 유용할 수 있다.
두번째 측면에서, 본 발명은 대상에서 바이오마커의 유무 또는 양과 관련된 질병 또는 상태를 진단하는 방법이 제공되며, 이 방법은 고정된 바이오마커용 포획제를 포함하는 표면을 샘플과 접촉시키는 단계, 포획된 바이오마커를 표면에서 방출시키는 단계, 광 산란에 의해 바이오마커의 방출을 검출하는 것을 포함한다. 그 양은 다른 바이오마커와 비교한 상대적인 양일 수 있다.
적절하게는, 대상에서 바이오마커의 존재 또는 양과 관련된 질병 또는 상태를 진단하는 방법으로서, 여기서 방법은 다음을 포함한다.
I) 샘플에 존재하는 바이오마커에 결합할 수 있는 포획제가 고정된 포획제를 포함하는 표면을 용액으로 제공하는 단계;
II) 샘플의 바이오마커가 포획제에 결합할 수 있는 조건에서 표면을 샘플과 접촉시키는 단계;
III) 표면의 첫 번째 검출 영역을 정의하고 광 산란을 사용하여 표면을 측정하는 단계;
IV) 표면에 결합된 입자를 방출시키는 단계; 여기서 입자는 다음 중에서 선택:
i. 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
ii. 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
iii. 결합되지 않은 포획제;
V) 광 산란에 의해 표면의 첫 번째 검출 영역에서 방출된 입자(들)를 검출하는 단계,
여기서 i. 또는 ii.의 유무는 대상에서 질병 또는 상태의 존재, 중증도 또는 진행 가능성을 나타낸다.
입자(들)는 표면에서 광 산란의 변화를 검출하여 검출된다. 따라서 방출 이벤트에는 적어도 두가지 이상의 측정, 방출 이전과 이후의 표면 측정이 필요할 수 있다.
적절하게는, 대상에서 바이오마커의 존재 또는 양과 관련된 질병 또는 상태를 진단하는 방법으로서, 여기서 방법은 다음을 포함한다.
I) 샘플에 존재하는 바이오마커에 결합할 수 있는 포획제가 고정된 포획제를 포함하는 표면을 용액으로 제공하는 단계;
II) 샘플의 바이오마커가 포획제에 결합할 수 있는 조건에서 표면을 샘플과 접촉시키는 단계;
III) 표면의 첫 번째 검출 영역을 정의하고 광 산란을 사용하여 표면을 측정하는 단계;
IV) 표면에 결합된 입자를 방출시키는 단계; 여기서 입자는 다음 중에서 선택:
i. 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
ii. 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
iii. 결합되지 않은 포획제;
V) 광 산란의 변화를 결정하여 표면의 첫 번째 검출 영역에서 방출된 입자(들)를 검출하고,
여기서 i. 또는 ii.의 유무는 대상에서 질병 또는 상태의 존재, 중증도 또는 진행 가능성을 나타낸다.
표면의 측정은 표면에서의 목적물(들)의 측정일 수 있다. 표면은 바람직하게는 단일 표면이다. 표면의 특성(nature)은 측정 결과와 무관하기 때문에 표면은 임의의 적절한 형태일 수 있다. 실시예에서, 표면은 편평한 유리 커버슬립이다.
적절하게는, 샘플에서 바이오마커의 존재 또는 양과 관련된 오염의 유무를 결정하는 방법으로서, 여기서 방법은 다음을 포함한다.
I) 샘플에 존재하는 바이오마커에 결합할 수 있는 포획제가 고정된 포획제를 포함하는 표면을 용액으로 제공하는 단계;
II) 샘플의 바이오마커가 포획제에 결합할 수 있는 조건에서 표면을 샘플과 접촉시키는 단계;
III) 표면의 첫 번째 검출 영역을 정의(define)하는 단계;
IV) 표면에 결합된 입자를 방출시키는 단계; 여기서 입자는 다음 중에서 선택:
i. 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
ii. 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
iii. 결합되지 않은 포획제;
V) 광 산란에 의해 표면의 첫 번째 검출 영역에서 방출된 입자(들)를 검출하는 단계,
여기서 i. 또는 ii.의 유무는 오염물질의 존재, 심각도 또는 성질(nature)을 나타낸다.
입자(들)는 표면에서 광 산란의 변화를 검출하여 검출된다. 따라서 방출 이벤트에는 적어도 두가지 이상의 측정, 방출 이전과 이후의 표면 측정이 필요할 수 있다.
적절하게는, 샘플에서 바이오마커의 존재 또는 양과 관련된 오염의 유무를 결정하는 방법으로서, 여기서 방법은 다음을 포함한다.
I) 샘플에 존재하는 바이오마커에 결합할 수 있는 포획제가 고정된 포획제를 포함하는 표면을 용액으로 제공하는 단계;
II) 샘플의 바이오마커가 포획제에 결합할 수 있는 조건에서 표면을 샘플과 접촉시키는 단계;
III) 표면의 첫 번째 검출 영역을 정의(define)하고 광 산란을 사용하여 표면을 측정하는 단계;
IV) 표면에 결합된 입자를 방출시키는 단계; 여기서 입자는 다음 중에서 선택:
i. 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
ii. 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
iii. 결합되지 않은 포획제;
V) 광 산란의 변화를 결정하여 표면의 첫 번째 검출 영역에서 방출된 입자(들)를 검출하는 단계,
여기서 i. 또는 ii.의 유무는 오염물질의 존재, 심각도 또는 성질(nature)을 나타낸다.
표면의 측정은 표면에서의 목적물(들)의 측정일 수 있다. 표면은 바람직하게는 단일 표면이다. 표면의 특성(nature)은 측정 결과와 무관하기 때문에 표면은 임의의 적절한 형태일 수 있다. 실시예에서, 표면은 편평한 유리 커버슬립이다.
이들 중 어느 하나 또는 임의의 방법에서의 광 산란 방법은 간섭 산란 현미경 또는 질량 측광법일 수 있다.
표면을 샘플과 접촉시킨 후 세정하는 선택적 단계를 포함할 수 있다. 적절한 세척 조건이 본 명세서에 설명되어 있다.
상기 검출 단계 이전에 상기 표면을 용액과 접촉시키기 전에, 상기 표면을 건조시키는 선택적 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 표면의 광 산란의 기준선 측정을 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계는 상기 단계 (II) 이후에 수행될 수 있다. 기준선(baseline) 측정은 대조군(control) 측정으로 사용될 수 있다. 기준선 측정은 광 산란에 의해 표면에 고정된 어떤 목적물에 대한 정보를 제공할 수 있다. 또한 기준선 측정은 무작위 방출 이벤트의 측정을 제공하여 방출 이벤트가 구체적이고 검출 가치가 있을 것으로 예상되는 기준선을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 목적물은 포획제 또는 관련 바이오마커의 여부에 상관없이 표면상의 임의의 목적물, 심지어 샘플에서의 다른 구성요소도 될 수 있다.
본 발명의 방법은 적절한 내부 표준(internal standard) 또는 대조군(control)을 포함할 수 있다. 내부 대조군(internal control)을 사용하여 상대 농도를 결정할 수 있다. 본 발명의 방법은 임의의 적절한 내부 교정제(internal calibrant)를 포함할 수 있다.
방법은 샘플에서 바이오마커의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 방법은 포획제로부터 방출되는 바이오마커의 양 및/또는 고정된 표면으로부터 방출되는 바이오마커/ 포획제 복합체의 양을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 바이오마커의 양은 질병 또는 상태의 진행 또는 심각도의 표시로 사용될 수 있다.
상기 포획제 및/또는 상기 바이오마커/포획제 복합체 또는 결합되지 않은 포획제가 표면으로부터 방출되는 것은 본 명세서에 설명된 바와 같으며, 상기 첫번째 측면과 관련될 수 있다.
두번째 측면의 방법은 본 명세서에 설명된 바와 같이, 특히 첫번째 측면과 관련하여 한 개 이상의 추가 단계를 포함할 수 있다.
두번째 측면의 방법은 대상이 상기 질병 또는 상태를 진행시킬 위험을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
두번째 측면의 방법은 대상의 샘플에서 바이오마커의 존재 또는 양과 관련된 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하기에 적절한 물질 또는 조성물 또는 용량 요법(dosage regimen)이 대상에게 투여 또는 처방될 수 있는 적절성을 확인하는 데 적절하다. 샘플에서 바이오마커의 유무 또는 양이 질병 또는 상태의 발생 또는 가능성을 나타내는 경우, 해당 물질 또는 조성물의 투여 또는 치료 또는 용량 요법(dosage regimen)을 위해 대상이 선택될 수 있다.
두번째 측면은 질병 또는 상태의 진단이나 발생 가능성이 있는 대상의 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이 방법은 해당 대상에게 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는 데 효과적인 물질 또는 조성물을 투여하거나, 치료 방법을 수행하는 것을 포함한다.
또한, 두번째 측면에 따라 질병 또는 상태의 진단이나 발생 가능성이 있는 대상의 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 물질 또는 조성물이 제공된다.
또한 바이오마커의 유무 또는 양과 관련된 질병 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 의약품의 제조에 있어서 물질 또는 조성물의 사용이 제공된다, 여기서, 대상은 두번째 측면에 따른 방법으로 질병, 상태 또는 해당 질병 또는 상태가 발생할 가능성이 있는 것으로 진단된다.
세번째 측면에서는, 본 발명의 첫번째 또는 두번째 측면의 방법을 수행하기에 적절한 수단(means)을 포함하는 키트가 제공된다. 이러한 키트는 적절한 표면, 포획제, 버퍼, 교정 차트(calibration chart), 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 지침, 샘플 수집 장치, 본 명세서에 설명된 바와 같이 바이오마커 또는 포획제의 방출을 조절하는 데 사용되는 시약(agent), 그리고 교정(calibration)을 위한 한 개 이상의 표준 바이오마커 샘플 등 한 개 이상의 항목을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들은 첨부된 도면들을 참조하여 이하에서 더 설명된다:
도 1은 본 발명의 방법을 도식화한 것이다;
도 2는 실시예 1에서 설명한 바와 같이 실시된 본 발명의 방법의 결과를 나타낸 것이다. 첫 번째 그래프는 대조군(control) 측정값(질량으로 확인된 방출 입자의 수)을 나타내고, 두 번째 그래프는 TBS 버퍼의 pH를 감소시키기 위해 염산을 첨가한 후 코팅된 커버슬립으로부터 방출된 Her2의 양, 방출된 입자의 질량을 나타낸다;
도 3은 iSCAT에서 사용할 수 있고 본 발명에서 사용하기에 적절한 장치의 가능한 배열을 보여준다;
도 4는 본 발명의 방법을 도식화한 것으로서, 이는 실시예 2에 예시되어 있다.
도 5는 실시예 2의 실험 결과를 보여준다. 이것은 표면에서 방출된 입자의 질량을 보여주는 그래프이다(질량이 방출됨에 따라 음의 수치가 나타난다).
본 발명자들은 단일 입자 광 산란, 바람직하게는 단일 입자 간섭 산란 현미경 또는 질량 측광법을 사용하여 샘플에서 바이오마커를 검출하는 방법을 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 광 산란 현미경법을 이용하여 복잡한 샘플에서 낮은 농도 바이오마커를 검출하는 것이 놀랍게도 가능하다는 것을 발견하였다. 일반적으로 바이오마커를 낮은 농도에서도 검출하기 위해서는, 지지체(support)나 항체나 수용체 단백질과 같은 결합 파트너에 대한 결합 이벤트를 검출함으로써 수행된다. 본 발명은 본 발명자들이 취하 새로운 접근법에 기반하며, 복잡한 샘플에서 낮은 농도의 바이오마커를 검출하기에 적절한 매우 특이적이고 민감한 분석법을 최초로 제공한다. 본 발명자들은 결합 이벤트를 검출하기보다는, 결합된 표면으로부터 바이오마커를 방출하고, 광 산란 현미경을 이용하여 방출을 검출함으로써, 낮은 농도 바이오마커를 특이적이고 민감하게 검출할 수 있음을 발견하였다. 따라서 본 발명은 표면으로부터 입자의 비결합(unbinding) 또는 방출을 검출하는 새로운 접근법에 기반한다.
이러한 방법은 샘플에서 임의의 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 의료 진단, 산업 공정 및 품질 관리 방법과 같은 다양한 응용 분야가 있다. 적절하게는, 본 발명의 방법은 본 발명의 첫번째 및 두번째 측면에서 설명된 바와 같다. 또한 본 발명의 세번째 측면에서 설명된 바와 같은 키트가 제공된다.
본 출원의 목적상, 다음의 용어들은 아래에 제공된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적, 과학적 용어는 달리 정의되지 않는 한 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
샘플
샘플은 생물학적, 산업적 또는 환경적 샘플일 수 있다. 샘플은 단순하거나 복잡한 용액일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액(blood), 혈청(serum), 혈장(plasma), 소변(urine), 침(saliva), 림프액(lymph), 땀(sweat), 양수(amniotic fluid), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 모유(breast milk), 눈물(tears), 분비물(secretions), 활액(synovial fluid), 정액(semen), 담즙(bile) 또는 점액(mucus), 폐액(lung fluid) 샘플, 대변(stool) 샘플을 포함한다. 체액은 모세혈관(capillary), 정맥(venous) 또는 동맥혈(arterial blood), 혈장 또는 혈청일 수 있다. 적절하게는, 손가락에서 추출한 혈액 샘플 등은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 특정 실시예에서 타액의 구강 면봉(Buccal swab)과 같은 타액 샘플이 사용될 수 있다. 체액은 전해질, 설탕, 요소를 포함한 수많은 용질이 존재하는 복잡한 용액의 예이다. 생물학적 샘플은 임상 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 인간 또는 동물의 몸 또는 개인으로부터 얻은 조직 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 세포 배양 샘플, 예를 들어 파지 배양을 포함한 박테리아 또는 바이러스 배양일 수 있다. 생물학적 샘플은 in vitro source로부터 나올 수 있다. 조직 균질화 및 세포 용해와 같은 표준 기술을 사용하여 분석하기 전에 샘플을 준비할 수 있다.
샘플이 환경 샘플인 경우에는 물(예: 우물, 개울, 강, 호수, 빗물, 바닷물 등) 또는 하수도, 농업용 폐수 등의 폐기물에서 채취할 수 있다.
산업용 샘플은 식품 및 음료(예: 음료), 농업용 샘플 또는 공장 및 제조 공정에서 액체 샘플을 채취할 수 있다. 산업용 샘플은 생물학적 오염 여부를 확인하기 위해 생물 반응기 및 실험실에서 얻은 세포 준비물 등의 샘플도 포함될 수 있다.
본 발명의 방법 또는 장치에 의해 서로 다른 유형의 샘플이 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 처리될 수 있다. 특정 실시예에서는 한 번에 한 개의 샘플 유형만 사용될 수 있다. 대안적인 실시예들에서, 두 개 이상의 샘플을 통합 또는 결합하여 동일한 방법으로 사용될 수 있다.
샘플은 세포 용해, 세포 부스러기 제거 또는 다른 진단 기법에서 일반적인 기타 전 처리와 같은 일상적인 전 처리가 필요할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 샘플을 사용하기 위해 준비하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플은 예를 들어 적절한 버퍼에서 희석이 필요할 수도 있다. 일반적으로 적절한 버퍼는 생리적 pH와 염분 농도를 갖는다.
본 발명의 방법은 임의의 적절한 방법을 사용하여 대상으로부터, 또는 산업적 또는 환경적 원천으로부터 샘플을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 적절한 방법은 당업계에 공지되어 있으며 침(saliva), 가래(sputum) 또는 소변(urine) 채취, 면봉 테스트(swab test), 손가락 찌르기 테스트(finger prick test), 바늘에 의한 동맥 또는 정맥 혈액 샘플링(arterial or venous blood sampling by needle), 요추 천자(lumbar puncture), 폐 흡인(lung aspiration), 생검(biopsy), 양수천자(amniocentesis), 부신천자(paracentesis), 또는 관통초점 (throacocentasis)을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 세포 배양 또는 산업 공정, 또는 환경으로부터 샘플을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 하수도 물의 샘플을 얻는 단계를 포함할 수 있다.
광 산란에 의한 바이오 마커의 검출에 필요한 샘플량은 최소이며, 샘플의 종류와 채취 방법에 따라 마이크로리터(microlitre)만큼 작을 수 있다.
샘플은 임의의 적절한 샘플 챔버에서 수집되거나 제공될 수 있다. 적절한 챔버는 검체 용기 (specimen container), 바이알(vial), 병(bottle), 앰플(ampoule), 테스트 튜브(test tube), 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube), 마이크로 원심분리기 튜브(microcentrifuge tube), 모세관 또는 백(capillary tube or bag) 일 수 있다. 본 발명의 방법은 샘플의 저장을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 샘플 또는 그 일부를 본 발명의 방법을 수행하는 표면으로 이송하는 단계를 포함할 수 있다.
대상
"대상(subject)"이라는 용어는 "개인" 및 "환자"라는 용어와 함께 사용될 수 있으며, 동물 대상, 특히 척추동물 대상, 더욱 적절하게는 포유류 대상을 지칭한다. 적절한 척추동물은 영장류를 비롯한 척추동물아문(the subphylum Chordata)의 임의의 종을 포함하며, 포유류 (예: 쥐, 쥐, 기니피그), 진드기류 (예: 토끼, 사향토끼), 소과 동물 (예: 소), 양과 동물 (예: 양), 염소과 동물 (예: 염소), 돼지과 동물 (예: 돼지), 말 (예: 말), 개 (예: 개), 고양이 (예: 고양이), 조류 (예: 닭, 칠면조, 오리, 거위, 집조류, 진딧물 등), 해양 포유류 (예: 돌고래, 고래), 파충류 (뱀, 개구리, 도마뱀 등) 및 어류를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 선호 대상은 영장류 (예: 인간, 원숭이, 침팬지)다.
대상은 질병 또는 상태 중 하나 이상의 증상을 앓고 있는 개인일 수 있다. 또한 특정 질병이나 상태에 대한 소인(predisposition) 특정 질병 또는 상태가 발생할 가능성에 대한 테스트가 필요한 것으로 분류된 개인일 수 있다.
바이오마커
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오마커"는 검출되거나 정량화될 샘플의 임의의 생물학적 특징을 의미한다. 바이오마커는 분석대상 샘플에 존재할 수 있는 단백질 및 그 단편, 예를 들어 펩타이드(peptide), 폴리펩타이드(polypeptide), 프로테오글리칸(proteoglycan), 당단백질(glycoprotein), 리포단백질(lipoprotein), 탄수화물(carbohydrate), 지질(lipid), 핵산(nucleic acid), 유기 또는 무기 화합물(organic or inorganic chemical), 천연 고분자(natural polymer) 및 소분자(small molecule) 등 사실상 임의의 생물학적 화합물일 수 있다. 바이오마커는 디옥시리보스 핵산 또는 병원성 게놈 또는 그 단편과 같은 리보핵산과 같은 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 바이오마커는 상기 둘 이상의 조합 또는 결합일 수 있다. 본 발명에 따른 검출에 적절한 바이오마커는, 예를 들어, 포획제를 통해 표면에 결합 또는 고정될 수 있다.
생물학적 과정, 병원성 과정, 질병, 상태 또는 치료적 개입에 대한 응답의 개시, 진행, 심각도, 병리학, 공격성, 등급, 활동성, 장애, 사망률, 유병률, 질병 하위 분류 또는 다른 기저 특성을 측정하는 데 유용하거나 잠재적으로 유용한 바이오마커가 될 수 있다. 본 명세서에 언급된 진단은 이러한 측정을 수행하는 것을 포함한다.
바이오마커는 진단 바이오마커, 모니터링 바이오마커, 약역학/반응 바이오마커, 예측, 예후, 안전성 및 민감성/위험 바이오마커, 품질관리 마커 등을 포함하는 다양한 그룹으로 분류할 수 있다. (Califf, R. M. Biomarker definitions and their applications. Exp. Biol. Med. 243, 213-221 (2018)).
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산(nucleic acid)"은 자연적으로 생성되는 염기, 당 및 당 간 연결로 구성된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 단량체의 중합체 또는 올리고머를 의미한다. 용어 "핵산"은 또한 유사하게 기능하는 비자연적으로 발생하는 단량체 또는 이의 일부를 포함하는 중합체 또는 올리고머를 포함한다. 핵산은 디옥시-뉴클레오타이드와 리보-뉴클레오타이드를 모두 포함하는 DNA, RNA 또는 키메라(chimeric)일 수 있다. 바이오마커는 핵산의 변형된 형태, 예를 들어 메틸화된 형태일 수 있다.
탄수화물은 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류를 포함할 수 있으며, 특정 아세틸(acetyl)-기, 아실(acyl)-기 또는 아릴(aryl)-기의 존재와 같은 이들의 변형된 형태를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 번역 후 변형된 단백질, 예를 들어 유비퀴티네이션, 지질화, 인산화, 알킬화 또는 글리코실화에 의한 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법들은 바이오마커가 번역 후 변형되었는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
바이오마커에는 지질, 지방산, 모노글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 글리세롤지질, 글리세롤지질, 스핑고지질, 사카롤지질 등의 지방도 포함된다.
또한 제한 없이 약물 및 이의 대사물, 호르몬, 신경전달물질, 대사물 및 비타민을 포함하는 소분자를 포함한다.
생물학적 지표가 될 수 있는 다른 생물학적 분자로는 글리코펩타이드, 당단백질, 당지질, 왁스, 스테롤, 지용성 비타민 및 지질단백질이 있다.
또한 분자, 집합체(assemblies), 집합체(aggregations), 단백질/단백질 상호작용, 단백질/소분자 상호작용, 단백질-핵산 상호작용, 단백질-당 상호작용 및/또는 올리고머 집합체가 포함된다.
상기 개체의 유도체 또는 대사산물도 바이오마커로 간주될 수 있다.
바이오마커의 예는 제한 없이 다음을 포함한다.
암 - AFP(간암, liver cancer), BCR-ABL(만성 골수성 백혈병, chronic myeloid leukaemia), BRCA1/BRCA2(유방/난소암, breast/ovarian cancer), BRAF V600E(흑색종/대장암, melanoma/colorectal cancer), CA-125(난소암, ovarian cancer), CA19.9(췌장암, pancreatic cancer), CEA(대장암, colorectal cancer), EGFR(소세포 폐암, non-small-cell lung cancer), HER-2(유방암, breast cancer), KITA(장암, gastrointestinal cancer), PSA(전립선 특이 항원, prostate specific antigen), S100(흑색종, melanoma).
심혈관 질환(Cardiovascular disease) - 심부전(heart failure) 및/또는 심부전 악화(heart failure exacerbation) 진단을 위한 BNP 및 NT-proBNP; 급성 관상동맥증후군(acute coronary syndrome) 의심 환자의 진단 및 위험 계층화(risk stratification)를 위한 트로포닌(troponin); 심혈관 질환(Cardiovascular disease), 심장마비(heart attack), 뇌졸중(stroke) 위험 평가를 위한 CRP; 관상동맥 심장 질환(coronary heart disease)의 위험을 예측하기 위한 MPO의 순환 수준(Huang, et al Dis. Markers 2017, 2-4 (2017); Truemper, et al Biomarkers Cardiovasc. Dis. 27, 1- 20 (2015).
자가면역질환(Autoimmune disease) - 광범위한 바이오마커가 현장에서 알려져 있고 이용 가능하며 검토되었다. 예를 들어 Norouzinia, et al Gastroenterol. Hepatol. from Bed to Bench 10, 155-167 (2017); Jin, F. et al. Front. Immunol. 9, 1-9 (2018); Shi, G., et al J. Immunol. Res. 2017, 1-2 (2017); Prince, H. E. et al Biomarkers 10 Suppl 1, 44- 49 (2005)).
세균 감염(Bacterial infections) - CRP, 백혈구(WBC) 수, 다형핵(PMN) 백혈구 수 및 PCT.
바이러스 감염(예: Epstein-Barr virus 또는 급성 HIV 감염의 초기 단계)은 CD64와 CD169를 측정하여 세균 감염과 구별할 수 있다.
간 손상 - 알라닌 아미노기전이효소(alanine aminotransferase), 아스파르트산 아미노기전이효소(aspartate aminotransferase), 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 감마-글루타밀기전이효소(gamma-glutamyl transferase)의 혈청 수준.
적절하게는, 본 발명에 따른 검출을 목적으로 바이오마커 및/또는 바이오마커/결합제 복합체는 라벨링되지 않는다. 따라서, 포획제 또는 바이오마커에 대한 어떤 형태의 라벨도 포함할 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 방법은 라벨 프리(label-free)로 설명될 수 있다.
바이오 마커는 샘플에서 낮은 농도 또는 매우 낮은 농도로 존재할 수 있다. 샘플은 높은 농도 및 낮은 농도 바이오마커의 복합 혼합물일 수 있으며, 여기서 후자는 밀리리터(millilitre) 당 마이크로그램(microgram)에서 밀리리터 당 피코그램(picogram)의 농도를 거쳐 밀리리터 당 펨토그램(femtogram)까지 농도 수준이 달라질 수 있다.
여기서, 바이오마커는 또한 두개 이상의 미리 정의된(pre-defined) 바이오마커들의 세트를 포함할 수 있다. 세트는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 이상의 바이오마커를 포함할 수 있다. 이러한 미리 정의된 바이오마커 세트는 예를 들어 동일한 질병/상태와 관련될 수 있으며, 패널(panel)로 설명되므로 단일 테스트를 사용하여 완전한 진단 또는 예후가 가능하다. 임의의 멀티플렉스 세트(multiplexed set)에서, 상이한 포획제에 대해 상이한 방출 메커니즘을 사용하는 것이 가능하다.
표면
본 발명에서 사용하기 위한 표면은 샘플에서 바이오마커의 농축을 위해 기능화될 수 있고, 선택된 검출 방법과 호환되는 임의의 적절한 표면일 수 있다. 적절한 표면은 포획제에 결합하거나 고정될 수 있다.
표면은 한 개 이상의 검출 영역을 포함할 수 있다. 검출 영역(detection area)은 임의의 적절한 크기(size) 및 형상(shape)일 수 있다. 적절하게는, 검출 영역은 동시에 또는 단일 관측 이벤트에서 광 산란 현미경으로 분석할 수 있는 영역이다. 검출 영역의 크기 및 형상은 광 산란 중에 조사되는 영역의 크기 및 형상에 의해 유도될 수 있으며, 따라서 사용되는 현미경의 종류에 의해 유도될 수 있다. 표면은 한 개 이상의 검출 영역을 포함할 수 있다. 한 개 이상의 검출 영역이 표면에 제공되는 경우, 이들은 인접하거나 중복될 수 있다.
한 개 이상의 검출 영역이 제공되는 경우, 이들은 서로 떨어져 있을 수 있다. 표면은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 70, 100, 500 또는 1000 이상의 검출 영역을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 표면은 평면이거나 실질적으로 평면이다. 표면은 곡면이거나 일부 곡률을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 실질적으로 평면상의 오목하거나 볼록한 구조일 수 있다. 작은 구형의 목적물은 실질적으로 자체적으로 광의 산란을 유발하고 방출 이벤트의 정확한 질량 결정을 방해하기 때문에, 표면은 나노 입자의 표면이 아닌 것이 바람직하다. 나노 입자 또는 초미세 입자는 일반적으로 직경이 1~100 나노미터, 선택적으로 직경이 1~60 나노미터, 선택적으로 직경이 50 나노미터 미만인 물질의 입자로 정의된다. 따라서, 본 발명에 따른 표면으로는 직경이 60μm 이하, 선택적으로 50μm 이하, 선택적으로 40μm 이하인 작은 구형 입자를 선택적으로 사용하지 않는다. 실질적으로 평면인 표면이 선호될 수 있다.
검출 영역은 미리 정의될 수 있다. 그 대신에, 방법을 수행하는 동안 검출 영역이 정의될 수 있다. 검출 영역은, 예를 들어, 표면에 대한 방출제의 흐름에 의해 정의될 수 있으며, 검출 영역은 방출제가 접촉하는 영역에 의해 완전히 또는 부분적으로 정의될 수 있다. 검출 영역은 방출제의 농도에 의해 정의될 수 있다. 검출 영역은 광분해 조사의 조사 영역에 의해 정의될 수 있다. 대체 방출 메커니즘을 선택한 경우 방출과 관찰 영역 간의 상호 작용에 따라 검출 영역이 결정된다.
표면은 적절하게 단단하다(즉, 겔 또는 액체가 아니다). 적절하게는 표면의 검출 영역은 자외선(여기서 10nm에서 380nm 범위의 파장을 갖는 것으로 정의될 수 있음), 가시광선(여기서 380nm에서 740nm 범위의 파장을 갖는 것으로 정의될 수 있음) 및/또는 적외선(여기서 740nm 에서 300μm 범위의 파장을 갖는 것으로 정의될 수 있음)의 투과를 허용한다. 적절하게는, 검출 영역은 가시광선 스펙트럼에서 광의 투과를 허용한다. 적절하게는, 검출 영역은 실질적으로 투명하다.
표면의 검출 영역은 매끄럽거나(smooth) 질감이(textured) 있을 수 있다. 예를 들어 메쉬(mesh), 편물(knitted) 또는 직물(woven fabric)은 검출 영역의 결합 용량(binding capacity)을 증가시킬 수 있다. 검출 영역을 제외한 나머지 부분은 매끄럽거나 질감이 있을 수 있으며, 검출 영역과 동일하거나 다를 수 있다. 매끄러운 표면이 선호된다.
표면 또는 검출 영역은 예를 들어 유리(glass), 다이아몬드(diamond), 플라스틱(plastic), 중합체 재료(polymeric material)(예를 들어, 사이클릭 올레핀 공중합체(cyclic olefin copolymer), 폴리비닐(polyvinyl), 예를 들어 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET)를 포함하는 폴리에틸렌(polyethylene, PE) 및 높은-밀도 폴리에틸렌(high-density polyethylene, HDPE) 및 저밀도 폴리에틸렌(low-density polyethylene, LDPE), 폴리아크릴레이트(polyacrylate, 아크릴로 만든(acrylic)), 내충격성 폴리스티렌(high impact polystyrene, HIPS)을 포함한 폴리스티렌(polystyrene, PS), 실리콘(silicone), 폴리에스테르(polyester)(예: 폴리락트산(polylactic acid, PLA) 또는 폴리락트산 코글리콜산(polylactic coglycolic acid, PGLA) ), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리아미드(polyamide, 나일론(nylon)), 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(Acrylonitrile butadiene styrene, ABS), 폴리에틸렌/아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(Polyethylene/Acrylonitrile Butadiene Styrene, PE/ABS), 베이클라이트(bakelite), 고무(rubber), 라텍스(latex), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리카보네이트/아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(Polycarbonate/Acrylonitrile Butadiene Styrene, PC/ABS) 및 예를 들어 폴리비닐리덴 클로라이드(polyvinylidene chloride, PVDC) 및 사파이어(sapphire)를 포함하는 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride)를 제한 없이 포함하는 임의의 적절한 재료일 수 있다.
표면의 두 개 이상의 검출 영역은 재료, 질감, 크기, 모양 및 기능화(functionalisation) 면에서 동일하거나 다를 수 있다.
표면에는 적절한 기하학적 구조(geometry)가 있을 수 있다. 예를 들어, 표면은 커버슬립(coverslip)과 같은 평판(flat plate)을 포함하거나, 웰(well), 플레이트(plate), 채널(channel), 용기(container), 플로우 셀(flow cell), 플로우 챔버(flow chamber), 미세유체 셀 또는 챔버(microfluidic cell or chamber), 또는 슬라이드(slide) 일 수 있다. 표면은 더 큰 기하학적 구조 또는 장치의 일부일 수 있다. 적절한 표면은 유리 커버슬립 또는 플라스틱 커버슬립일 수 있으며, 여기서 플라스틱은 표면과 관련하여 전술한 바와 같다.
표면은 바람직하게는 샘플 홀더(holder)의 일부를 형성한다. 상기 샘플 홀더는 광 산란 현미경의 요소(element)일 수 있다. 샘플 홀더는 표면 대 부피가 큰 챔버일 수 있다.
표면 또는 실제로 검출 영역이 기능화될 수 있다. 표면 또는 검출 영역은 부동태화(passivated), 활성화(activated), 코팅(coated), 처리(treated) 또는 유도화(derivatised)될 수 있다. 표면은 부동태화된 표면일 수 있다. 패시베이션(Passivation)은 화학적 반응성을 향상 시키거나 감소시켜 결합 이벤트의 수를 증가 시키거나 감소시키기 위해 표면을 처리하거나 코팅하는 과정입니다. 당업자는 적절한 부동태화제(passivating agents)를 알고 있을 것이며, 그 예로는 BSA, PVPA, DDS 및/또는 PEG가 포함된다. 표면 상의 단일층 및 이중층과 같은 지질층(lipid layers)의 사용이 고려된다. 그 대신에, 표면은 부동태화되지 않는다.
표면이 코팅, 유도화 또는 변형되는 경우, 얇은 표면 변경이 바람직할 수 있다. 변경된 표면층이 너무 두꺼우면 표면의 광 산란 특성이 변경될 수 있습니다. 가장 바깥쪽 몇 개의 분자층 (3-10 nm)만 변경하는 것이 바람직할 수 있다.
표면 또는 검출 영역은 그에 대한 포획제의 결합을 가능하게 하기 위해 활성화, 코팅, 처리 및/또는 유도화될 수 있다. 표면 또는 검출 영역의 기능화는 샘플에서 바이오마커를 선택할 수 있게 하여 표면의 바이오마커를 효과적으로 풍부하게 한다. 검출 영역의 기능화는 i) 임의의 비특이적 결합을 방지하기 위해 표면을 변경하는 단계, ii) 포획제를 결합할 수 있도록 표면을 변경하는 단계; iii) 포획제를 변경된 표면에 결합하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 검출 영역에 결합된 포획제는 바이오마커에 결합하기 위해 기능적으로 배향될 것이다. 기능화는 화학적 (예: 공유 결합) 또는 물리적 (예: 흡착) 일 수 있다.
포획제의 결합을 가능하게 하기 위해 임의의 적절한 표면 코팅이 적용될 수 있다. 적절한 방법과 코팅, 예를 들어 기능화된 PEG, 실란, 아민, 아미노실란, APTES와 같은 아민 변경 시약을 사용한 알데히드 변경, 예를 들어 GOPTS를 사용한 에폭시 변경, 예를 들어 EDC, NHS, HOBt, TBTU, PAMAM을 사용한 카르복실산염 변형; 예를 들어 NaNO2와 같은 디아조(diazo) 사용, 예를 들어 칼릭스렌(calixarenes)과 같은 초분자(supramolecules)들이 있으나 이들에 제한 되는 것은 아니며, 이들은 이 기술분야의 기술자에게 알려져 있고, 사용이 가능하다. 표면에 포획제를 고정시키기 위한 적절한 방법이 당업계에 공지되어 있고 이용 가능하다.
포획제의 결합을 가능하게 하기 위해 표면 또는 검출 영역이 본 명세서에 설명된 바와 같이 기능화되는 경우, 포획제의 기능화 또는 결합은 본 명세서에 설명된 바와 같은 바이오마커를 검출하는 능력을 크게 변경하지 않는다. 적절하게는, 포획제의 기능화 과정 및/또는 결합은 표면의 처리된 검출 영역을 통한 광 투과에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
표면의 기능화는 화학적 상호작용(예: 공유 결합) 또는 물리적 상호작용(예: 흡착)과 같은 포획제와의 다양한 상호작용을 허용하는 것일 수 있다. 포획제는 아민 또는 카르복실기와 같은 자유 반응성 그룹을 통해 표면의 작용기와 화학적으로 반응하여 공유 결합을 형성하여 포획제를 고정화할 수 있다. 소수(Hydrophobic), 수소(hydrogen), 반 데르 발스(van der Waals), 이온 및 배위(ionic and coordinate) 결합 유형은 정전기 상호 작용과 함께 포획제와 표면 사이에 발생할 수 있다. 이러한 유형의 상호작용은 특히 조건에 의해 영향을 받을 수 있으며, 온도 및 pH의 변화는 포획제와 표면의 상호작용을 변화시킬 수 있고, 조건이 변경될 때 포획제의 방출을 가능하게 한다.
소수성 코팅이 표면에 적용될 수 있도록 소수성을 변경하기 위해 표면을 처리할 수 있습니다. 이러한 경우 포획제가 고정되지 않을 수 있다. 예를 들어, 단백질과 지질은 각각 비극성 및 극성 그룹에 끌리는 소수성 그룹과 친수성 그룹을 모두 가지고 있기 때문에 양친매성 고분자(amphiphilic macromolecules)로 설명될 수 있다. 이 기능은 포획제의 고정화를 가능하게 하는 데 사용될 수 있다.
포획제를 표면에 고정화하기 위한 방법은 방출 이벤트에 대한 요건에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 포획제가 영구적으로 고정화될 수 있고 바이오마커가 방출제를 사용하여 바이오마커로부터 선택적으로 방출될 수 있다면, 표면은 영구적인 고정화를 허용하도록 기능화될 수 있어서, 방출 이벤트 동안 바이오마커만이 방출된다. 그 대신에, 포획제가 포획제에 대해 높은 친화도를 갖는 경우, 고정화 방법은 포획제 (및 임의의 관련 바이오마커)가 pH의 변화와 같은 방출제를 사용하여 방출될 수 있도록 선택될 수 있다.
표면은 고정화를 가능하게 하기 위해 포획제에 대한 결합 파트너를 포함하도록 변형되거나 기능화될 수 있다. 예시된 바와 같이, 비오틴은 PEG 및 비오티닐화된 PEG로 표면을 코팅함으로써 표면에 고정화될 수 있다. 포획제로서의 스트렙타비딘(Streptavidin)은 비오틴에 대한 결합 친화도를 사용하여 고정될 수 있다. 스트렙타비딘은 호모 테트라머(homo-tetramer)이기 때문에 샘플에서 비오틴화된 바이오마커를 포획하기 위해 비오틴에 대한 결합 부위를 여전히 제시할 수 있다.
포획제
임의의 적절한 포획제는 샘플로부터 관심있는 바이오마커를 포획하기 위해 표면의 검출 영역 상에 고정될 수 있다. 적절한 포획제는 관심있는 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 특이적 결합이란 포획제가 동일한 조건하에서 다른 분자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로 검출되는 바이오마커에 결합하는 것을 의미한다. 특이적 결합은 일반적으로 1 μM 이하, 예를 들어, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 250 nM 이하, 200 nM 이하, 150 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 40 nM 이하, 30 nM 이하, 20 nM 이하, 20 nM 이하의 해리 상수(dissociation constant)로 표시되고, 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하.
포획제는 검출하고자 하는 바이오마커를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 포획제는 단백질 또는 비-단백질 표적(예를 들어, 소분자 바이오마커와 같은 리간드에 특이적으로 결합하는 단백질, 또는 단백질 바이오마커에 결합하는 수용체)에 결합하는 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic)일 수 있다. 포획제는 압타머 또는 리보자임과 같은 핵산일 수 있다. 포획제는 상보적 서열에 혼성화할 수 있는 핵산일 수 있다. 포획제는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 다당류(polysaccharide), 지질(lipid), 지질다당류(lipopolysaccharide), 테이코산(teichoic acid), 또는 리포테이코산(lipoteichoic acid)일 수 있다. 포획제는 항체 또는 그의 단편, 또는 수용체인 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항원 또는 리간드일 수 있다. 포획제는 완전히 자연적으로 발생하는 것은 아니며, 자연적으로 발생하는 부분과 재조합 또는 비자연적으로 발생하는 부분의 단편 또는 부분을 포함할 수 있다.
검출 영역은 임의의 적절한 수의 포획제들을 포함할 수 있다. 포획제의 수는 검출되는 바이오마커의 유형 및 양에 따라 달라질 수 있다. 검출 영역은 관심있는 바이오마커에 특이적인 1,000개 이상, 또는 10,000개 이상, 또는 100,000개 이상, 또는 500,000개 이상, 또는 1,000,000개 이상의 포획제를 포함할 수 있다.
바이오마커와 포획제 사이의 결합은 비공유결합, 예컨대 수소 결합, 반 데르발스 힘, 정전기력, 소수성 힘 등일 수 있다. 그러나 상호작용 또는 결합은 공유 결합 일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체(antibody)" 또는 "항체(antibodies)"는 온전한(intact) 면역글로불린(immunoglobulin) 또는 Fc 영역의 Fc(crystallizable fragment) 영역 또는 FcRn 결합 단편을 갖는 단클론 또는 다클론 항원 결합 단편을 의미한다. 용어 "항체"는 또한 "항체-유사 분자", 예컨대 항체의 부분, 예를 들어, 항원-결합 부분을 포함한다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 또는 온전한 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. "항원-결합 부분"은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, 및 상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR) 단편, 단일쇄 항체(single-chain antibodies, scFv), 단일-도메인 항체, 키메라(chimeric) 항체, 디아바디(diabodies), 및 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 선형(linear) 항체는 또한 본 명세서에 설명된 목적을 위해 포함된다. 항체는 조작될 수 있다.
핵산 포획제는 앱타머(aptamer)와 같은 비서열(non-sequence)의존적 방식으로 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 시약일 수 있다. 압타머는 일반적으로 결합할 수 있는 형태를 얻는 짧은 핵산 서열이다. 결합할 수 있는 다른 핵산은 리보자임(ribozymes) 등을 포함한다.
핵산 포획제는 본 명세서에 정의된 핵산일 수 있으며, 이는 검출하고자 하는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 핵산 포획제는 비특이적 서열 및 특이적 서열의 조합을 포함할 수 있다. 핵산 포획제는 자연적으로 발생하거나 재조합될 수 있다. 핵산 포획제는 검출되는 바이오마커에 특이적인 한 개 이상의 결합 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 서열의 특이성은 핵산 포획 서열이 엄격한 조건(stringent conditions) 하에서 바이오마커의 핵산 바이오마커 또는 핵산 부분에 결합하도록 할 수 있다.
용어 "엄격한 조건(stringent conditions)"은 핵산 가닥이 그의 상보적 결합 파트너에 우선적으로 혼성화되거나 특이적으로 결합하고, 다른 서열에는 덜 혼성화하거나 전혀 혼성화하지 않는 조건을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization conditions)"은 상보성 핵산 가닥들 사이에서 듀플렉스(duplexes)를 생성하기 위해 호환되는 조건들, 예를 들어, 샘플에서 DNA 탐침(probes)과 상보적 표적 사이, 또는 프라이머와 핵산 분자 사이에서 보완적이지 않은 핵산 가닥 사이에 형성된 상당한 이중성 부족으로 증폭될 수 있다.
엄격한 조건은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995)).
단백질 포획제는 핵산, 탄수화물 또는 지질에 선택적으로 접합된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드일 수 있다. 단백질 포획제는 포획될 바이오마커를 위한 적절한 결합 부위를 포함한다. 단백질 포획제의 결합 부위는 핵산, 단백질, 소분자, 지질 또는 탄수화물 바이오마커에 대한 특이적 결합을 나타낼 수 있다. 단백질 포획제의 예는 수용체(receptors), 전사 인자(transcription factors), 독소 (toxins), 항독소(anti-toxins), 다당류 및 다당류 유도체를 포함한다. 적절한 단백질 포획제는 나노몰(nanomolar) 내지 피코몰(picomolar) 범위의 해리 상수로 검출될 바이오마커에 결합할 수 있다. 본 발명의 방법은 ELISA와 같은 다른 기술만큼 고도로 특이적이지 않은 포획제의 사용을 허용할 수 있음을 주목해야 하는데, 그 이유는 이 기술이 결합된 종을 무게(weight)으로 식별할 수 있기 때문이다. 따라서 바이오마커가 쉽게 식별할 수 있는 무게를 가지고 있다면 마이크로몰(micromolar) 범위에서 결합 특이성을 가진 포획제의 사용도 가능하다.
바이오마커 자체가 개체에 결합할 수 있는 경우, 예를 들어 항체, 효소 또는 수용체인 경우 이를 위한 포획제는 항원, 기질 또는 리간드와 같은 바이오마커에 대한 결합 파트너일 수 있다.
포획제는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 하이브리도마 조직 배양 상청액(hybridoma tissue culture supernatant) 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 제조된 항혈청(antiserum)에서 발견될 수 있거나, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 재조합 발현 시스템으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 항체, 수용체 또는 기타 종의 단편(fragments), 부분(portions) 또는 서브유닛(subunits)은 화학적, 효소적 또는 기타 수단에 의해 생성될 수 있다. 본 발명은 또한 포획제가 재조합, 키메라 하이브리드(chimeric hybrid), 인간화(humanised), 영장류(primatised) 또는 기타 변형된 형태를 포함할 수 있다고 고려한다.
포획제는 예를 들어 포획제로서 역할을 하는 생체분자의 임의의 적절한 조합을 포함하는 생체접합체(bioconjugate)일 수 있다. 예를 들어, 단백질-핵산 조합, 또는 항체-단백질 접합체, 항체-핵산 접합체.
포획제는 복수의 결합 부위를 갖는 결합제일 수 있다. 따라서, 이러한 포획제는 그의 결합 친화력을 사용하여 고정화될 수 있다. 실시예에서, 비오티닐화(biotinylated)된 PEG로 표면을 코팅함으로써 스트렙타비딘(streptavidin)이 표면에 고정될 수 있음을 보여준다. 스트렙타비딘 호모테트라머(Streptavidin homo-tetramers)는 비오틴에 대해 높은 친화력(Kd ~ 10-14 mol/L)을 가지며 각 서브유닛은 동일한 친화성으로 비오틴에 결합한다. 따라서, 비오티닐화된 PEG에 고정된 스트렙타비딘은 여전히 실시예에서 비오티닐화된 바이오마커에 이용 가능한 결합 부위를 가질 것이다. 스트렙타비딘은 유리(free) 비오틴에 대한 친화력이 가장 높기 때문에 유리 비오틴을 방출제로 첨가하여 표면에서 입자를 방출할 수 있으며 이의 이탈(departure)이 검출될 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 결합되지 않은 포획제는 검출될 바이오마커에 결합되지 않은 포획제이다. 적절하게는, 결합되지 않은 포획제는 특이적으로 또는 비특이적으로 임의의 다른 생체분자에 결합되지 않는다. 포획 물질은 방출 이벤트("목적물"로서) 전에 표면에서 측정되는 지점에서 바인딩되지 않을 수 있습니다. 따라서, 어떠한 바이오마커도 포획제에 결합하지 않는다.
방출제는 방출 동안 포획제(및 존재하는 임의의 바이오마커)에 결합할 수 있다(예 2에서 비오틴에서 스트렙타비딘으로). 방출된 입자 자체의 신호가 아니라 검출되는 방출 이벤트이므로 방출 후 입자의 특성은 조사되지(interrogated) 않는다. 따라서 방출제의 바인딩은 관련이 없다.
포획제는 효소에 의한 분해 또는 광분해 또는 가수분해(pH 변화)에 의한 절단을 위한 한 개 이상의 절단 부위(들)를 포함할 수 있다. 한 개 이상의 절단 부위는 절단 시 결합된 바이오마커가 방출되도록 바이오마커 결합 부위에 제공될 수 있다. 절단 시 결합 또는 비결합 상태의 포획제가 표면으로부터 방출되도록 하나 이상의 절단 부위가 대안적으로 또는 추가로 제공될 수 있다. 포획제를 표면으로부터 방출하는 절단 부위는 바람직하게는 포획제의 표면 결합 부위에 근접하여 실질적으로 전체 포획제가 표면으로부터 방출된다. 절단 부위는 포획제에서 자연적으로 발생할 수 있거나, 예를 들어 재조합 기술에 의해 인위적으로 도입될 수 있다. 포획제에 도입된 링커 서열(linker sequence)에 절단 부위가 제공될 수 있다. 포획제가 핵산인 경우, 제한 효소 부위와 같은 DNA 절단 효소에 적절한 서열이 포함될 수 있다.
시약이 광분해를 위한 절단 부위를 함유하는 경우, 이것은 포획제를 표면에 묶는 링커를 포함하여 포획제의 임의의 적절한 부분에 포함될 수 있는 임의의 적절한 광분해 부위일 수 있다. 포획제는 감광성(photosensitive) 절단을 위해 광불안정성 보호기(photolabile protecting group, PPG, 또한 광제거성(photoremovable), 감광성 또는 광절단성 보호기(photocleavable protecting group)로도 알려짐)를 포함할 수 있다. PPG는 니트로벤질(nitrobenzyl-)계, 카르보닐(carbonyl-)계 또는 벤질(benzyl-)계일 수 있다. 포획 부분(moiety)에 간단한 광절단성 링커가 내장될 수 있다.
광분해는 가시광선에만 국한되지 않는다. 이를 위해서는 충분한 에너지를 가진 광자(photon)를 사용해야 한다. 따라서 자외선, X선, 감마선 등 가시광선 이상의 에너지를 가진 전자기파가 이러한 반응에 주로 관여한다. 절단에 사용되는 광이 간섭계 광산란을 위한 조사원(illumination source)과 함께 사용하기에 적절하도록 광불안정 부위가 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어 UV 광이 바람직할 수 있다. 광절단성 부위(sites)는 광이 매우 높은 시공간 정밀도(spatiotemporal precision)로 전달될 수 있기 때문에 화학 및 생물학에서 광범위하게 사용된다. 다양한 포획제를 방출하기 위해 다른 파장의 광을 사용하여, 다른 광절단성 부위를 사용하는 다수의 포획제가 단일 표면에 사용될 수 있다.
PPG의 사용은 포획제가 바이오마커와 상호작용하는 것을 막지 않는 것으로 이해될 것이다. PPG는 단순히 포획제 또는 그 일부의 절단을 허용하고 이를 표면으로부터 방출하기 위해 존재한다.
가수분해는 물 분자가 하나 이상의 화학 결합을 파열시키는 임의의 화학 반응이다. 예를 들어, 수용액에서 펩타이드에 위치한 아미드 결합의 비효소(non-enzymatic)절단 속도는 pH에 따라 다르다. 알칼리성 pH는 아미드 결합의 파손을 촉진할 수 있다. 포획제는 보다 가수분해되기 쉬운 섹션을 포함하도록 설계될 수 있다. 바이오마커도 유사하게 분해되지 않도록 적절한 조건을 선택해야 한다.
적절한 절단 부위의 예는 단백질/항체에 대한 절단 부위 또는 핵산에 대한 제한 효소 부위의 포함을 포함한다. 효소 절단은 또한 DNA 또는 RNA 효소(DNAzymes 또는 RNAzymes)를 사용하여 수행될 수 있다. 이는 표적 부위에서 특정 절단을 허용하도록 조작될 수 있다. 제한 부위는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일반적으로 (for endonucleases) 길이가 약 6 내지 8개 뉴클레오티드인 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 내의 특정 서열을 포함한다.
고정화를 야기하는 비공유 상호작용을 방해함으로써 포획제가 방출될 수 있다. 따라서 pH 또는 온도의 변화는 포획제의 고정화를 방해하기에 충분할 수 있으며 이것이 방출 이벤트가 될 수 있다.
포획제는 경쟁적 결합 파트너를 제공함으로써 방출될 수 있으며, 따라서 고정된 결합 파트너에 대한 결합을 방해한다(실시예 5 및 도 4 참조).
포획제가 이형제를 사용하여 방출되도록 포획제 및 고정화 수단이 선택된다면, 본 발명의 방법은 바이오마커가 방출 이벤트 이전에 표면 상의 포획제에 결합되었는지 여부를 결정할 수 있다.
포획제의 일부 또는 전부는 사용된 방출 메커니즘에 따라 방출 이벤트 동안 입자를 형성할 수 있다.
샘플과 표면 접촉
하나의 실시예에서, 표면은 샘플에 존재하는 임의의 바이오마커가 표면에 고정된 포획제에 결합할 수 있도록 샘플과 접촉한다.
샘플 및 표면을 접촉시키기 위해 임의의 적절한 수단 및 방법이 사용될 수 있다. 샘플과 표면을 접촉시키는 것은 샘플을 표면에 노출, 혼합 또는 전달하는 배양을 포함한다. 접촉은 특정 실시예에서 교반(agitating), 볼텍싱(vortexing), 파이펫팅(pipetting) 등을 필요로 할 수 있다. 접촉은 샘플에 존재하는 바이오마커가 표면에 고정된 포획제에 결합할 수 있도록 충분한 시간 동안 수행될 수 있다. 접촉 시간은 포획제 또는 바이오마커의 결합 친화도 및/또는 농도, 이들의 농도 또는 배양 조건(예를 들어, 온도)에 따라 임의의 적절한 길이일 수 있다. 접촉 시간은 적어도 약 30초 이상, 적어도 약 1분 이상, 적어도 약 5분 이상, 적어도 약 10분 이상, 적어도 약 15분 이상, 적어도 약 30분 이상, 적어도 약 1시간 이상, 적어도 약 2시간 이상, 적어도 약 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 48시간 또는 더 길 수 있다. 당업자는 그에 따라 접촉 시간 및 조건을 조정할 수 있을 것이다.
적절한 혼성화 조건은 당업자에게 공지될 것이며, 바이오마커 및 포획제의 성질(nature)에 따라 달라질 것이다.
세척
표면을 준비하는 동안 비특이적 결합이 발생할 수 있다. 표면에 비특이적으로 결합하는 임의의 분자를 제거하기 위해, 포획제의 고정화 또는 그에 대한 관심 바이오마커의 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않는 적절한 방법을 사용하여 표면은 세척될 수 있다. 적절한 세척 버퍼 및 방법은 당업자에게 공지되고 이용 가능할 것이며, 예를 들어 특정 원하는 상호작용만이 온전하게 유지되도록 적절하게 보장할 다양한 염 농도 또는 순한 세제(mild detergents)가 있다. 이상적으로, 세척 단계는 포획제가 고정되는 조건을 변경하지 않는다.
버퍼 또는 검출 용액
세척된 표면은 검출 단계를 위해 버퍼 또는 다른 적절한 용액과 접촉될 수 있으며, 이것은 바람직하게는 깨끗한 버퍼다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “깨끗한 버퍼”라는 용어는 측정, 결과 또는 결론을 방해하는 결과를 생성하지 않도록 최소한의 배경노이즈를 생성하는 버퍼를 의미한다. 당업자는 검출 단계에서 적절하게 사용될 수 있는 버퍼의 예가 많다는 것을 알 것이다. 깨끗한 버퍼의 예로는 트리스 버퍼 식염수(Tris buffered saline), 인산 버퍼 식염수(phosphate buffered saline), HEPES, MES, MOPS 또는 MEM이 있다. 적절한 용액은 물이다. 표면 또는 그 검출 영역은 완전히 또는 부분적으로 잠길 수 있다. 적절하게는, 적어도 관찰되는 검출 영역은 버퍼 또는 용액에 완전히 잠긴다.
표면으로부터 바이오마커 및/또는 복합체의 방출
본 발명은 제어된 속도로 표면에서 바이오마커를 방출하면 샘플의 매우 낮은 농도에서도 바이오마커를 식별할 수 있다는 인식에 기초한다. 방출 이벤트는 바이오마커가 표면에 고정된 포획제로부터 방출되게 할 수 있다. 이것은 추가로 또는 대안적으로 그것이 고정된 표면으로부터 포획제(또는 그 일부)의 방출을 야기할 수 있다. 포획제는 관심 바이오마커에 결합되거나 결합되지 않을 수 있다. 포획제는 방출 후 바이오마커에 결합된 상태로 남거나 분리될 수 있다. 본 발명의 방법은 입자로서의 바이오마커의 방출 및 입자로서의 포획제 및/또는 바이오마커의 방출 모두를 측정하기에 충분히 민감하다.
방출 이벤트는 표면/용액 인터페이스(interface)에서 바인딩의 변경이다. 따라서 적절하게 방출 이벤트는 입자가 표면에서 표면을 유지하는 용액으로 완전히 분리되는 것을 의미한다. 입자가 표면에서 방출되면 이 방출이 검출된다. 이러한 방출은 방출 이벤트 전후에 표면을 측정하여 검출된다. 목적물, 예를 들어 포획제(관련된 바이오마커가 있거나 없는)는 입자의 방출 전과 후에 표면에서 측정될 수 있다. 측정값 간의 광 산란 차이는 입자의 방출 이벤트를 검출한다. 각 방출 이벤트는 높은 정확도로 검출할 수 있는 국소 광 산란(예: 목적물)의 변화로 이어진다. 신호 변화의 크기는 분자량으로 변환될 수 있다. 따라서 입자의 질량은 표면에서 측정 전/후를 기준으로 계산된다. 의심을 피하기 위해 방출된 입자 자체는 용액에 방출되었기 때문에 광 산란에 의해 검출되지 않는다.
따라서, 본 발명은 표면에서 존재 검출 및 표면으로부터 입자 부재에 관한 것이다. 이러한 측정값의 차이를 계산하여 입자의 질량을 계산할 수 있다. 따라서 광 산란의 변화에 대해 탐지 영역의 목적물 또는 위치를 효과적으로 모니터링한다.
따라서 포획제와 바이오마커가 방출 이벤트 도중 또는 이후에 분리되더라도 방출 이벤트의 검출 또는 방출된 질량 계산에 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 바이오마커가 먼저 방출되고, 포획제가 방출되는 경우, 이는 표면에서 광 산란의 두 가지 변화로 검출되어 방출 이벤트 이전에 바이오마커가 표면에 존재하고, 포획제가 방출된다는 계산으로 이어진다. 또는 처음에 방출된 입자가 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하고 이후 용액에서 이들이 해리되는 경우에는 입자의 방출만 검출된다. 표면 밖의 입자(용액 중)에 발생하는 현상은 측정되거나 검출되지 않는다. 검출되는 이벤트는 표면에서 입자가 “비결합(unbinding)”"이기 때문에 검출은 동일하다. 비결합이 발생하면 입자가 더 이상 표면에 없기 때문에 어떤 일이 발생하는지 검출되지 않는다.
방출될 수 있는 여러 입자 유형이 있다. 이들은 바이오마커 단독, 포획제에 결합된 바이오마커(또는 이의 일부) 또는 결합되지 않은 포획제(또는 이의 일부)를 포함한다. 세 가지 입자 유형, 즉 임의의 바이오마커, 결합되지 않은 포획제 및/또는 결합된 포획제(바이오마커/포획제 복합체)는 정의된 속도와 정의된 조건 하에서 표면으로부터 방출된다. 적절하게는, 이러한 입자는 표면이 접촉하는 용액으로 방출된다.
방출 속도는 광 산란에 의해 개별 방출 이벤트를 검출할 수 있도록 적절하게 선택된다. 따라서, 본 발명은 관심 있는 임의의 바이오마커, 복합체 또는 결합되지 않은 포획제를 포함하는 표면으로부터 방출되는 개별 입자를 검출할 수 있고, 이를 특징화할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 표면으로부터 입자의 방출 전 및 후에 목적물로부터 얻은 측정치를 기초로 개별 입자에 질량을 할당할 수 있다. 입자가 방출되면 목적물이 표면에서 방출될 수 있다(예: 결합되지 않은 포획제 또는 포획제/바이오마커 복합체). 입자의 방출은 목적물의 일부를 방출하는 결과를 초래할 수 있다(예를 들어, 포획제로부터 방출된 바이오마커, 또는 표면에 일부가 남아있는 포획제의 일부에 복합된 바이오마커). 따라서 방출된 입자의 특성(nature)을 결정하는 것은 표면에서 목적물을 모니터링하고 방출 이벤트 전후에 무엇이 존재하는지 결정함으로써 달성된다.
따라서 적절하게는, 본 발명의 방법의 감도를 최대화하기 위해, 표면으로부터 결합된 입자의 방출은 광 산란에 의한 검출을 가능하게 하는 속도로 발생하여 개별 결합 비결합(방출) 이벤트를 식별하고 특징화하도록 제어된다. 이를 통해 입자 방출을 위해 표면에서 개별 목적물을 모니터링할 수 있다.
따라서 적절하게는 개별 입자가 검출 영역에서 한 번에 방출된다. 이는 방출 속도가 매초 또는 단일 이미지 프레임 캡처 내에서 100개 이상의 방출 이벤트가 발생하지 않는다는 것을 의미할 수 있다. 방출 속도는 초당 최대 100개, 최대 90개, 최대 80개, 최대 70개, 최대 60개, 최대 50개 또는 최대 40개의 방출 이벤트일 수 있다. 따라서 단일 방출 이벤트가 하나 이상의 후속 프레임에서 캡처될 수 있지만 단일 프레임에는 적절하게 100개 이상의 방출 이벤트가 포함되지 않는다. 이를 통해 바이오마커, 포획제 또는 복합체를 개별적으로 검출하고 개별 방출 이벤트를 정량화할 수 있다. 여러 방출 이벤트가 실질적으로 동시에 발생하여 프레임에서 개별 이벤트를 구별할 수 없는 경우(예: 조사된 스팟(illuminated spots) 의 겹침으로 인해) 방출 속도가 너무 높을 수 있으며 방출 속도를 줄이기 위해 조정이 필요하다. 본질적으로 광 산란 현미경의 이미지 캡처 장치는 방출 이벤트와 관련된 광 산란 이벤트를 기록할 수 있지만 특정 농도 이상에서는 개별 목적물을 구별하고 여기에 질량을 할당하는 것이 불가능하다. 따라서 다른 말로 표현하면 적절한 방출 속도는 모든 이벤트가 겹치지 않아 개별적으로 식별되고 특징화될 수 있는 이미지 캡처 프레임을 제공하는 속도이다. 프레임당 스팟 수와 방출 속도는 프레임 크기에 따라 달라진다. 프레임당 노출 시간은 0.01~50ms, 적절하게는 0.5~20ms가 될 수 있다.
검출 영역에 대한 방출 이벤트를 검출하기 위한 적절한 시간 간격은 검출 영역의 크기를 포함한 다양한 요인에 따라 달라진다. 이에 결합된 포획제의 농도; 임의의 바이오마커의 풍부함; 방출제의 강도 및 방출 속도; 프레임 캡처 속도. 따라서 적절한 시간 간격은 검출 이벤트에 대한 특정 매개변수에 따라 달라진다. 그러나 10,000프레임과 같은 특정 시간 또는 프레임의 제한을 부과하는 것이 가능할 수 있다.
방출 이벤트는 임의의 적절한 방법으로 촉발될 수 있다. 적절한 방법의 예는 다음과 같다:
i) 표면의 화학적 환경을 변화시키는 것. 따라서 본 발명의 방법은 방출 이벤트를 촉발하기 위해 표면 환경에서 화학적 변화를 일으키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어 검출 영역을 포함하는 용액의 pH를 변경하는 것을 포함한다. pH의 변화는 항체-항원 상호작용과 같은 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 것으로 알려져 있다. pH 감소가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 화학적 환경의 변화는 염산과 같은 산의 첨가에 의해 그의 pH를 낮추는 것을 포함할 수 있다. 유사하게, 검출 영역의 환경에서 산화환원 조건을 변경하는 것도 방출 이벤트를 촉발하는 역할을 할 수 있다. 특히 핵산과 관련하여, 예를 들어 이온을 추가하여 환경의 이온 강도를 변경하면 방출 이벤트를 유발하기에 충분할 수 있다. 환경에 화학적 변화를 일으키기 위해 임의의 적절한 수단을 사용할 수 있다. 적절한 수단에는 광에 대한 노출(예: pH에 영향을 미치는 갇힌 양성자의 광분해); 버퍼 또는 염 추가.
ii) 바이오마커와 포획제, 및/또는 포획제와 표면 사이의 결합을 효소적 절단에 의해 방해하는 것. 포획제의 결합 부위에서 절단 부위를 표적화하기 위해 적절한 효소가 사용될 수 있다. 결합 부위는 바이오마커 결합 부위이거나 표면 결합 부위일 수 있다. 바이오마커 결합 부위의 절단은 포획제로부터 바이오마커를 방출하는 역할을 할 수 있다. 표면 결합 부위의 절단은 포획제를 표면으로부터 방출시키는 역할을 할 수 있다. 방출된 포획제는 결합되지 않거나 바이오마커에 결합될 수 있다. 적절한 효소는 예를 들어 광에 노출되어 활성화될 수 있다. 적절한 효소는 단백질성(proteinaceous)이거나 핵산 또는 이의 하이브리드로 구성될 수 있다.
iii) 포획제의 분해. 임의의 적절한 수단을 표면에 적용하여 포획제를 분해함으로써 표면으로부터 바이오마커를 방출할 수 있다. 포획제를 분해하기 위해 효소를 사용할 수 있다. 예를 들어 포획제가 핵산이고 바이오마커가 단백질인 경우, 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 사용하여 바이오마커를 방출할 수 있다.
iv) 포획제에서 화학적 절단을 유도하거나 포획제로부터 바이오마커의 방출을 유발하기 위해 광분해(Photolysis)를 사용할 수 있다. 화학적 절단 부위는 바이오마커 결합 부위이거나 표면 결합 부위일 수 있다. 바이오마커 결합 부위의 절단은 포획제로부터 바이오마커를 방출하는 역할을 할 수 있다. 표면 결합 부위의 절단은 포획제를 표면으로부터 방출시키는 역할을 할 수 있다. 방출된 포획제는 결합되지 않거나 바이오마커에 결합될 수 있다. 광분해는 절단을 유도하기에 적절한 파장의 광, 예를 들어 UV 광에 검출 영역을 노출시키는 것을 포함할 수 있다.
v) 포획제로부터 바이오마커 및/또는 표면으로부터 포획제를 대체하기 위한 경쟁 결합제(competitive binding agents)의 첨가.
따라서, 본 발명의 방법은 검출 영역의 화학적 환경을 변경하는 단계; 절단을 유도하기에 적절한 파장의 광을 검출 영역에 적용하는 단계; 및/또는 검출 영역에 효소를 적용하는 것.
대신에, 방출 이벤트를 유발하도록 표면의 조건(환경)을 변경할 수 있다.
원하는 방출 속도를 제공하도록 표면 환경의 변화 속도가 조정된다. 환경의 변화는 버퍼, 염, 산 또는 효소와 같은 시약의 적용 속도와 같은 요인에 의해 제어될 수 있다. 시약 또는 효소의 농도, 또는 전력 밀도 또는 광의 강도를 변경한다. 방출 속도를 제한하기 위해 낮은 농도, 강도 또는 속도로 시약, 효소 또는 광을 적용하는 것이 바람직할 수 있으며, 방출 속도의 증가가 필요한 경우 선택적으로 하나 이상의 이러한 요인을 증가시킨다. 예를 들어, 효소와 같은 시약의 부위 간 확산 속도를 최대화하여 원하는 방출 속도가 생성되도록 할 수 있다. 방출제의 확률적(Stochastic) 방출은 사전 정의된 검출 영역으로 제한될 수 있다. 예를 들어, 광분해와 같이 방출이 광에 의해 영향을 받는 경우, 광활성화 광을 관찰 광(observation light) 또는 광학 장치(optics)에 연결하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에 정의된 임의의 방법의 단계 IV는 표면에 결합된 입자를 방출하는 것을 수반하며, 여기서 입자는 다음 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된다:
i. 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
ii. 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
iii. 결합되지 않은 포획제.
따라서 단계 IV는 모든 가능한 유형의 입자의 방출을 포함할 수 있으며, 여기에 설명된 방법은 각각의 이러한 방출 이벤트를 구별하기에 충분히 민감하다. 이것은, 예를 들어, 얼마나 많은 이벤트가 포획제에 결합된 바이오마커를 방출하는지, 얼마나 많은 이벤트가 포획제를 단독으로 방출하는지 결정하는 것이 가능할 것이다.
결과/검출
이전에 논의한 대로 방출 이벤트 전에 기준 측정을 수행할 수 있다.
방출 이벤트의 검출은 광 산란 현미경, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 공간 필터 또는 질량 광도계를 갖는 iSCAT를 사용하여 수행될 수 있다. iSCAT는 샘플에서 목적물에 의해 산란된 광과 샘플 위치에서 반사된 광 사이의 간섭을 결정하는 것을 포함한다. 간섭은 목적물의 산란 진폭에 따라 달라지며 iSCAT 신호로 측정된다. 방출 이벤트의 검출을 허용하는 것은 이 목적물의 질량을 모니터링하는 것이다.
검출은 표면의 이미지를 캡처하여 수행된다. 여러 이미지 또는 프레임을 결합하여 필름을 제공할 수 있다. 비디오 또는 필름은 1,000에서 48,000 프레임으로 구성될 수 있다. 최대 60,000 프레임 또는 최대 100,000 프레임으로 구성될 수 있다. 방출 이벤트에 대해 각 목적물을 모니터링할 수 있으므로 여러 이미지가 선호된다.
초기 측정 또는 측정은 방출제를 적용하기 전에 수행된다. 앞서 설명한 바와 같이, 표면이 샘플과 접촉하고 임의의 세척 단계가 수행된 공정의 시점에 해당할 수 있다. 이 초기 측정은 표면에 있는 임의의 목적물에 대한 정보를 제공한다. 이러한 목적물은 결합되지 않은 포획제이거나 결합된 바이오마커가 있는 포획제일 수 있다.
이 초기 측정에서 표면에 있는 목적물의 동일성(identity)을 직접 결정하는 것은 불가능하다. 목적물의 질량은 검량선의 사용을 포함하여 여기에 설명된 표준 기술을 사용하여 계산할 수 있다.
초기 검출(또는 추가 측정)은 방출제의 적용 즉시, 또는 5초 이하, 1초 또는 1초의 몇 분의 1초 이내에 수행될 수 있다. 그러나 방출제가 작동하는 데 정의된 시간이 걸리는 경우 이 정의된 시간을 고려하여 초기 검출을 최적화할 수 있다. 대안적으로, 방출제가 예를 들어 광분해에서와 같이 즉시 작용하는 경우, 방출 및 검출을 위한 광을 병렬(parallel)로 적용할 수 있으며(방출을 위한 하나의 파장, 검출을 위한 다른 파장) 즉시 검출을 수행할 수 있다. 이미지 캡처 형태의 측정은 0.01~1초 간격으로 수행될 수 있다. 현미경 카메라의 프레임 캡처 속도는 초당 0.01~1일 수 있다. 프레임 캡처 속도는 검출 또는 측정 속도 또는 시간 간격에 해당할 수 있다.
이미지 캡처에 의한 검출은 일정 기간 동안 효과적으로 연속적으로 발생할 수 있고 규칙적이거나 불규칙한 간격으로 발생할 수 있다. 이러한 연속 측정은 방출제를 적용하기 전에 시작할 수 있으며 적절한 시간 동안 계속될 수 있다. 측정 간격은 조사 중인 입자와 관련될 수 있으므로 더 길어질 수 있다. 또한 시간 간격은 하나의 분석 내에서 다양할 수 있다. 예를 들어 처음 몇 번의 측정은 매초마다 수행할 수 있으며, 몇 분의 더 긴 시간 간격으로 추가 측정을 수행할 수 있다.
당업자는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 방출제를 조정함으로써 방출 속도를 조정할 수 있고, 프레임 캡처 속도를 조정하여 적절한 검출 속도를 얻을 수 있다.
각 방출 이벤트에는 입자가 표면에서 용액으로 이탈하는 것이 포함된다. 이는 표면에서 목적물의 광 산란 변화로 검출된다. 이 변화는 방출된 입자의 질량과 관련이 있다. 목적물로부터 방출 이벤트의 부족도 검출될 수 있으며, 이는 샘플에서 바이오마커의 존재 부족을 나타낼 수 있다.
각 방출 이벤트는 광 산란에 따라 질량을 할당할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 결합된 대(versus) 결합되지 않은 포획제 및/또는 바이오마커의 직접적인 정량화를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 바이오마커에 결합한 포획제의 비율 측정을 제공할 수 있다. 샘플에 낮은 양으로 존재하는 바이오마커는 표면에 결합되지 않은 포획제를 생성할 수 있다. 이는 본 발명의 방법에 의해 결정될 수 있는데, 이는 결합된 포획제와 결합되지 않은 포획제 사이의 구별이 이루어지기 때문이다. 본 발명의 방법은 공지된 표준과 비교하여 바이오마커 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
이 방법은 또한 바이오마커의 이종 집단(heterogenous populations)을 분석하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 각 방출 이벤트에 질량을 할당하는 단계를 포함한다. 바이오마커의 질량, 또는 풍부한 포획제 대(versus) 결합되지 않은 포획 물질의 질량 비교는 예상 질량에 대한 질량 비교에 의해 바이오마커의 특성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
이 방법은 특정 바이오마커의 유무를 확인하는 데만 적절하지 않다. 번역 후 변형의 존재 또는 복합체 내 바이오마커의 존재와 같은 바이오마커의 상태를 결정하는 데 사용될 수 있다. 따라서 이 방법은 특정 단백질 올리고머화, 단백질-핵산 상호작용, 단백질-당 또는 다당류 상호작용의 존재/부재의 상대적 정량화 및 결정에 적절하다. 따라서 많은 다른 생물학적 상호 작용을 면밀히 조사할 수 있다. 번역 후 변형은 단순히 바이오마커의 질량을 결정하거나 다르게 변형된 바이오마커에 특이적인 포획제를 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 다른 내부 표준에 대한 분자의 상대적 정량화 또는 관심 있는 두 개 이상의 바이오마커 사이에 적절하다.
내부 대조군은 샘플에서 바이오마커의 상대적 정량화를 허용할 수 있다. 예를 들어 내부 표준은 알려진 농도로 샘플에 추가될 정의된 분자량의 생체 분자일 수 있다. 내부 대조군의 방출과 바이오마커의 방출을 정량화함으로써 샘플에서 바이오마커의 상대적 농도를 알 수 있다.
이 측면에서, 내부 대조군은 바이오마커(들)에 대해 상이한 분자량을 가지며 이들 바이오마커와 어떠한 교차 반응도 갖지 않는다.
일부 측면에서, 내부 대조군은 특정 포획제를 필요로 할 것이고, 포획제가 바이오마커에 대해 갖는 것과 같이 포획제가 내부 표준에 대해 동일하거나 유사한 친화성을 갖는 것이 이상적일 것이다. 그러나 이 두 친화도가 다른 경우 친화도 차이를 알고 바이오마커의 상대적 농도를 결정하는 데 사용할 수 있다. 이러한 배열에서 내부 대조군과 바이오마커 모두에 대한 방출 과정은 동일하다.
일부 측면에서, 내부 대조군은 분석할 샘플에 존재하는 것으로 알려진 두 번째 바이오마커일 수 있다. 이는 혈청 내 알부민과 같이 농도가 이미 설정된 일반적인 바이오마커일 수 있다. 두 번째 바이오마커의 수준은 질병 독립적이며 관심 바이오마커의 농도를 결정하는 데 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 내부 대조군은 내부 표준으로 지칭될 수 있다.
검출 장치
공간 필터 또는 질량 광도계를 포함하는 간섭 산란 현미경의 사용을 포함할 수 있다. 아래에 설명된 배열을 포함하여 임의의 적절한 장치가 사용될 수 있다.
적절한 현미경 또는 광도계는 다음을 포함할 수 있다: 샘플 위치에 표면을 고정하기 위한 샘플 홀더; 조사광(illuminating light)을 제공하도록 배열된 조사원; 검출기; 및 조사광을 샘플 위치로 향하게 하도록 배열되고 반사된 출력광을 수집하도록 배열된 광학 시스템을 포함하며, 출력광은 샘플 위치에서 산란된 광과 샘플 위치에서 반사된 조사광으로 구성되며, 출력광은 검출기로 향한다.
현미경은 출력광을 필터링하도록 배치된 공간 필터를 더 포함할 수 있으며, 공간 필터는 출력광을 통과시키되 더 큰 개구수(numerical aperture)에서보다 미리 결정된 개구수 내에서 더 큰 강도 감소를 갖도록 배열된다. 이러한 공간 필터는 PCT/GB2017/052070 및 Cole et al (ACS Photonics, 2017, 4(2), pp 211-216)에 설명된 바와 같이 이미지 대비를 유리하게 극대화한다.
사용되는 광은 다음과 같다: 자외선(10nm ~ 380nm 범위의 파장을 갖는 것으로 정의할 수 있음); 가시광선(380nm ~ 740nm 범위의 파장을 갖는 것으로 정의할 수 있음); 적외선(740nm ~ 300μm 범위의 파장을 갖는 것으로 정의할 수 있음). 광은 가급적 가시광선이다. 광은 파장의 혼합일 수 있다. 조사광(illuminating light)은 예를 들어 레이저에 의해 제공되는 간섭성 광(coherent light)일 수 있다.
본 발명의 방법은 광 산란, 바람직하게는 단일 입자 광 산란을 검출하는 적절한 현미경을 사용하여 수행될 수 있다. iSCAT 기기의 예시적인 설계는 Cole et al ACS Photonics, 2017, 4 (2), pp 211-216 and Arroyo et al. Nat Protocols 2016, 617-633. 기기에 대한 자세한 내용은 WO2018/011591 및 GB2552195에 나와 있다. 적절한 질량 광도계는 영국 옥스퍼드 소재의 Refeyn Limited에서 구입할 수 있으며, 예를 들어 OneMP 질량 광도계가 있다.
적절한 iSCAT 현미경은 도 3에 나와 있다.
도 3은 본 발명에 사용될 수 있는 iSCAT 현미경1을 도시하며, 이는 다음과 같이 배열된다(및 위에서 논의된 바와 같이 공간 필터로 구성됨). 공간 필터는 논의된 이유들로 인해 대비를 향상시키기 위해 유리하지만, 본 발명의 방법은 대안적으로 공간 필터가 없는 iSCAT 현미경을 사용할 수 있다.
현미경1은 이하에서 더 상세히 설명되는 공간 필터를 제외하고 현미경 분야에서 통상적인 구성을 갖는 다음 구성요소를 포함한다.
현미경1은 샘플 위치에서 샘플3을 고정하기 위한 샘플 홀더2를 포함한다. 샘플3은 이미지화될 목적물을 포함하는 액체 샘플일 수 있으며, 이는 아래에서 더 상세히 설명된다. 샘플 홀더2는 샘플3을 유지하기에 적절한 임의의 형태를 취할 수 있다. 전형적으로, 샘플 홀더2는 샘플 홀더2와 샘플3 사이의 인터페이스를 형성하는 표면 상에 샘플3을 유지한다. 예를 들어, 샘플 홀더2는 커버슬립 및/또는 유리로 만들 수 있다. 샘플3은 예를 들어 마이크로피펫을 사용하여 샘플 홀더 2에 간단한 방식으로 제공될 수 있다.
현미경1은 조사원4과 검출기5를 더 포함한다.
조사원4은 조사광을 제공하도록 배열된다. 조사광은 간섭성 광일 수 있다. 예를 들어, 조사원4은 레이저일 수 있다. 조사광의 파장은 샘플3의 특성 및/또는 검사할 특성에 따라 선택될 수 있다. 한 예에서, 조사광은 405nm의 파장을 갖는다.
선택적으로, 조사의 일관성 있는 특성과 레이저 노이즈로부터 발생하는 스펙클 패턴(speckle patterns)을 제거하기 위해 조사광을 공간적으로 변조할 수 있다. 예를 들어, Kukura et al., “High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus”, Nature Methods 2009 6:923-935에 자세히 설명되어 있다.
검출기5는 샘플 위치로부터 반사되는 출력광을 수신한다. 일반적으로, 현미경1은 광시야 모드에서 작동할 수 있으며, 이 경우 검출기5는 샘플3의 이미지를 캡처하는 이미지 센서일 수 있다. 도 5는 이미지 센서일 수 있거나 포토다이오드(photo-diode)와 같은 점형(point-like) 검출기일 수 있으며, 이 경우 스캐닝 장치는 이미지를 구축하기 위해 샘플3의 영역을 스캔하는 데 사용될 수 있다. 검출기5로 채용될 수 있는 이미지 센서의 예는 CMOS(complementary metal-oxide semiconductor) 이미지 센서 또는 CCD(charge-coupled device)를 포함한다.
현미경1은 샘플 홀더2, 조사원4 및 검출기5 사이에 배열된 광학 시스템10을 추가로 포함한다. 광학 시스템10은 샘플3을 조사하기 위해 샘플 위치에 조사광을 유도하고, 샘플 위치로부터 반사된 출력광을 수집하여 검출기 5로 출력광을 유도하기 위해 다음과 같이 배치된다.
광학 시스템 6은 샘플 홀더 2 앞에 배치된 렌즈 시스템인 대물(objective) 렌즈 11을 포함한다. 광학 시스템 6은 또한 집광(condenser) 렌즈 12와 튜브(tube) 렌즈 13을 포함한다.
집광 렌즈 12는 광원 11(도 1에서 연속선으로 나타냄)로부터의 조사광을 대물 렌즈 11을 통해 샘플 위치에서 샘플 3상에 집광한다.
대물 렌즈 11은 (a) 샘플 위치에서 반사된 조사광과 (b) 샘플 3에서 샘플 위치로 산란된 광을 모두 포함하는 출력광을 수집한다. 반사광은 주로 샘플 홀더 2와 샘플 3 사이의 인터페이스에서 반사된다. 일반적으로 이는 유리-물 반사와 같이 상대적으로 약한 반사이다. 예를 들어, 반사 조사의 강도는 입사 조사 강도의 0.5% 정도일 수 있다. 산란광은 샘플 3의 목적물에 의해 산란된다.
기존의 iSCAT와 유사한 방식으로 샘플 표면 또는 그 근처에 있는 목적물의 산란광은 반사광을 구성적으로 방해하므로 검출기 5에 의해 캡처된 이미지에서 볼 수 있다. 이 효과는 검출기에 도달한 조사광이 샘플의 깊이를 통해 전송되어 훨씬 더 작은 이미지 대비를 초래하는 전송 방식으로 작동하는 현미경과 다르다.
반사된 조사광과 산란광은 서로 다른 방향성을 갖는다. 특히, 반사된 조사광은 광원 4와 광학시스템 10에 의해 출력되는 광의 빔의 기하학적 형상에 기인하는 수치적 개구를 가지고 있다. 산란광은 넓은 범위의 각도에 걸쳐 산란되므로 반사된 조사광보다 더 큰 수치 조리개를 채운다.
튜브 렌즈 13은 대물 렌즈 11의 출력광을 검출기 5에 집중시킨다.
광학 시스템 6은 또한 광원 4로부터의 조사광과 검출기 5로 향하는 출력광을 위한 광학 경로를 분할하도록 배열된 빔 스플리터(beam splitter)14를 포함한다. 빔 스플리터14는, 후술하는 것과 같은 공간 필터를 구비하는 것을 제외하고, 그 위에 입사하는 광의 부분 반사 및 부분 투과를 제공하는 종래의 구성일 수 있다. 예를 들어, 빔 스플리터 14는 광로에 대해 45° 배치된 금속성(metallic) 또는 유전체성(dielectric)의 필름이 전형적으로 제공되는 플레이트일 수 있다. 대신에, 빔 스플리터 14는 프리즘들 사이의 계면에 부분적으로 반사되는 필름을 갖는 프리즘들의 일치된 한 쌍에 의해 형성된 큐브 빔 스플리터(cube beam splitter)일 수 있다. 대신에, 빔 스플리터 14는 빔 스플리터 14와 샘플 3 사이의 4분의 1파장판(quarter wave plate)과 조합하여 사용되는 편광 빔 스플리터(polarising beam splitter)일 수 있다.
예를 들어, 광원 4는 대물 렌즈 11의 광학 경로로부터 상쇄(offset)되어 광원 4로부터의 조사광이 빔 스플리터 14에 의해 대물 렌즈 11에 반사되고, 반대로, 검출기 5는 대물 렌즈 11의 광학 경로에 정렬되어 샘플 위치로부터의 출력광이 빔 스플리터 14를 통해 검출기 5로 전달된다.
현미경 1은 위에서 설명한 구성 요소에 더해 공간 필터 20을 포함한다. 공간 필터 20은 빔 스플리터 14 위에 형성되어 대물 렌즈 11의 후면 개구 뒤, 즉 대물 렌즈 11의 후면 초점면 15 바로 뒤에 위치한다. 따라서, 위상 대비 현미경(phase contrast microscopy)에서와 같이 공간 필터 20은 대물 렌즈에 들어가지 않고 구현될 수 있다. 공간 필터를 공액 평면(conjugate plane)이 아닌 목적물의 입구 구멍 바로 뒤에 배치하면(예: 아래 설명된 바와 같이) 높은 수치의 개구 현미경 목표 내에서 다수의 렌즈에서 발생하는 역반사를 강하게 억제할 수 있는 뚜렷한 이점이 있다. 이를 통해 이미지 노이즈가 감소하고 비간섭적 배경이 감소하며 실험 복잡성, 광학 수 및 광학 경로 길이가 감소하여 광학 설정의 안정성이 향상되어 이미지 품질이 향상된다.
그러나 이 위치는 필수적인 위치가 아니며 아래 설명된 것처럼 동등한 기능을 가진 공간 필터가 다른 곳에서 제공될 수 있다.
따라서 공간 필터 20은 검출기 5로 전달되는 출력광을 필터링하도록 배치된다. 따라서 검출기 5가 대물 렌즈 11의 광학 경로와 정렬된 예에서 공간 필터 20은 투과적이다.
공간 필터 20은 부분적으로 투과적이므로 반사된 조사광을 포함하는 출력광을 통과하지만 강도는 감소한다. 공간 필터 20은 또한 광축과 정렬되어 있고 미리 정해진 개구부를 가지고 있어서 미리 정해진 개구수 내에서 강도의 감소를 제공한다. 여기서 개구수는 출력광이 발생하는 샘플 위치에 대한 각도 범위를 특징짓는 무차원 양으로 일반적인 방식으로 정의된다. 구체적으로, 개구수 NA는 NA=n·sin(θ) 방정식으로 정의될 수 있다. 여기서 θ는 수집의 반각이고 n은 출력광이 통과하는 재료의 굴절률이다(예: 광학 시스템 6의 구성 요소의 재료).
공간 필터 20은 미리 결정된 개구수 외부에서 강도 감소를 제공하지 않는다. 원칙적으로, 공간 필터20은 미리 결정된 개구수 외부의 강도 감소를 대안적으로 제공할 수 있지만, 이는 덜 바람직하지만 미리 결정된 개구수 내의 강도 감소보다 작은 강도 감소를 제공할 수 있다.
공간 필터 20은 전형적으로 증착된 물질의 층을 포함하는 임의의 적절한 방식으로 형성될 수 있다. 상기 물질은 예를 들어 은과 같은 금속일 수 있다. 증착은 임의의 적절한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
계면 근처의 서브 회절 크기의 목적물은 반사 조사광보다 큰 개구수에 우선적으로 광을 산란시키기 때문에 공간 필터 20에 의해 제공되는 강도의 감소는 산란광에 대한 반사 조사광의 검출 강도를 우선적으로 감소시킨다. 따라서 낮은 개구수에서 공간 필터 20에 의한 강도 감소는 주로 반사된 조사광에 영향을 미치고 산란광에 대한 영향이 최소화되므로 캡처 이미지의 대비를 최대화할 수 있다. 향상된 이미징 대비를 사용하면 약한 산란체(scatterers)인 목적물을 고대비(high contrast)로 탐지할 수 있다.
콘트라스트 향상은 다음과 같이 이해될 수 있다. 공간 필터(20)가 미리 결정된 개구수에서 출력광의 일부를 통과함에 따라(즉, 이 예에서 부분적으로 투과됨), 조사광 및 산란광 필드의 일부가 검출기에 도달하고 충분히 간섭성 있는 조사원에 간섭한다. 검출기 I det 에 도달하는 광의 강도는 I det = |E inc |2{r 2 t 2+|s|2+2rt|s|cosΦ}에 의해 주어진다. 여기서 E inc 는 입사광 필드, r 2는 인터페이스의 반사율, t 2는 공간 필터 20의 투과율, s는 목적물의 산란 크기이고, Φ는 투과된 조사광과 산란광의 위상차이다. 따라서 검출된 광자의 총 수를 소비(expense)하더라도 산란 대비가 향상된다.
따라서 대비는 기존의 iSCAT와 유사한 방식으로 제공되지만 공간 필터의 투과성에 의해 추가적으로 제어된다. 이것은 표준 iSCAT와 같이 유리-물 인터페이스의 반사율에 의해 고정되는 것과 반대로 공간 필터 20의 투과율 t 2 선택을 통해 직접 기준 필드의 크기를 조정할 수 있는 기능을 제공한다. 공간 필터 20이 증착된 재료의 층일 경우 투과율 t 2는 재료 및/또는 그 층의 두께 중에서 선택할 수 있다. 이러한 튜닝은 예를 들어 관심 있는 산란 목적물, 카메라 전체 웰 용량 및 확대에 따라 수행될 수 있다.
iSCAT에 대한 이러한 유익한 효과를 극대화하기 위해 미리 결정된 개구수는 출력광에서 반사된 조사광의 개구수일 수 있지만, 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 미리 결정된 개구수가 반사된 조사광의 개구수보다 약간 작거나 더 클 경우 유사한 특성의 이점을 얻을 수 있다.
검출 방법
바이오마커의 검출은 광 산란, 예를 들어 간섭 산란 현미경(iSCAT), 간섭 산란 질량 분석기 또는 질량 측광법을 사용하여 수행할 수 있다. 적절하게는 iSCAT 또는 질량 측광법이 사용된다.
iSCAT는 샘플에서 목적물에 의해 산란된 광과 샘플 위치에서 반사된 광 사이의 간섭을 결정하는 것을 포함한다. 간섭은 목적물의 산란 진폭(및 편광 가능성, 즉 부피, 밀도 및 굴절률)에 따라 달라지며 iSCAT 신호로 측정된다. 이 기술은 예를 들어 Kukura et al. , Nature Methods 2009 6:923-935, 및 Ortega -Arroyo et al., Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14:15625-15636에서 검토되었다.
질량 측광법은 iSCAT(Kukura et al., Nature Methods 2009 6:923-935, and in Ortega Arroyo et al., Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14:15625-15636)의 개발이며 단일 분자에 의해 산란된 광을 측정하고 분자 질량과 직접적으로 연관된다. 질량 측광의 원리는 도 4에 나와 있다. 입자에 의해 산란된 광은 입자 부피와 굴절률에 따라 선형으로 확장된다. 단백질의 광학적 특성과 밀도는 몇 퍼센트에 불과하기 때문에 산란 신호는 서열 질량에 정비례하므로 광으로 단일 분자의 무게를 측정할 수 있다. 산란 신호와 질량의 상관관계는 다양한 생체 분자(당단백질, 핵산 또는 지질)에 대해 사실이므로 질량 측광법은 용액 내 생체 분자에 대한 보편적인 분석 도구이다.
iSCAT 신호는 입자가 있을 때와 없을 때 검출된 광의 비율로 설명할 수 있다. 보다 구체적으로, 다음과 같이 정의될 수 있으며 (I s -I p )/I s , 여기서 I s 는 입자가 없는 샘플 위치(예: 유리 표면)에서 반사된 강도이고 I p 는 입자가 있는 상태에서 동일한 측정값이다.
광 산란 신호는 검출되는 목적물에 질량을 할당하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 광 산란 신호를 결정하고 신호를 사용하여 입자의 질량을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 입자는 목적물에서 효과적으로 방출되므로 목적물의 질량 변화를 결정하여 입자에 질량을 부여할 수 있다. 본 발명의 방법에서 질량 측광법이 사용되는 경우, 질량은 질량 측광법으로 표시된다.
검출할 목적물의 예상 질량과 비교하여 입자의 유무를 결정할 수 있다. 입자의 유무를 측정하여 방출 이벤트를 검출할 수 있다. 따라서, 바이오마커의 검출에서 바이오마커 및/또는 바이오마커/포획제 복합체의 예상 질량을 광 산란에 의해 최종적으로 식별되는 방출 입자의 질량과 비교할 수 있으며, 바이오마커 또는 바이오마커/포획제 복합체의 유무를 결정할 수 있다. 유사하게, 결합되지 않은 포획제의 예상 질량은 광 산란에 의해 확인된 입자의 질량과 비교될 수 있고 결합되지 않은 포획제의 유무가 결정될 수 있다. 바이오마커, 바이오마커/포획제 복합체 및 결합되지 않은 포획제의 질량은 다를 수 있다. 효과적으로, 본 발명의 방법은 입자를 구체적으로 조사하지 않고 입자가 방출되는 목적물을 검사함으로써 입자의 질량을 측정할 수 있게 한다.
본 발명의 방법은 관심 있는 입자의 질량 또는 농도를 결정하기 위해 iSCAT 대비를 검량선 또는 표준 곡선과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 예를 들어, 제한 없이 이미지의 배경을 제거하고 이미지 품질을 향상시키는 것을 포함하는 하나 이상의 이미지 처리 단계를 포함할 수 있다.
입자는 표면의 목적물에서 방출되어 간접적으로 측정된다. 따라서 검출되고 정량화되는 것은 입자의 질량을 계산하는 데 사용할 수 있는 목적물에 대한 "음의 질량(negative mass)" 이벤트이다. 입자의 질량은 그 입자에서 바이오마커의 유무를 결정할 수 있다.
일단 방출되면 입자 또는 그 구성 요소가 표면에 결합할 수 있다. 이러한 바인딩 이벤트는 방출 이벤트 이후에 발생하므로 이러한 바인딩 이벤트는 검출되지만 무시될 수 있다. 이것은 특히 실시예 1에서 볼 수 있다.
검량선
iSCAT가 본 발명의 방법에 사용될 때 방출된 입자의 질량을 결정하기 위해 검량선이 사용될 수 있다. iSCAT에 의해 생성된 산란 값(scatter values)에 대해 두 개 이상의 표준의 알려진 질량을 플로팅하여 검량선을 생성할 수 있다. 이러한 검량선은 iSCAT에서 얻은 산란 값에서 입자의 질량을 결정하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 관심 입자의 질량을 결정하기 위해 검량선에 iSCAT 산란 값을 플로팅하는 단계; 및 선택적으로 예를 들어 바이오마커, 바이오마커에 결합된 포획제, 또는 결합되지 않은 포획제로서 입자를 특성화하는 단계를 포함한다.
샘플에서 입자의 농도를 결정하기 위해 검량선을 생성할 수 있다.
한 측면에서, 검량선을 생성하기 위해, 정제된 바이오마커의 농도를 증가시키면서 측정이 수행될 수 있다. 이는 상이한 농도의 바이오마커와 함께 배양될 때 발생하는 비결합 이벤트의 수에 대한 지식을 허용할 것이다. 추가된 바이오마커의 농도에 대한 공지된 비결합 이벤트의 플롯은 바이오마커의 농도를 결정할 수 있게 한다.
또 다른 측면에서, 복합 샘플(예를 들어 혈청)이 사용될 수 있고 알려진 농도를 갖는 두번째 바이오마커(예를 들어 혈청 알부민)에 대한 포획제를 포함함으로써 보정(calibration)이 수행될 수 있다. 이 측면은 두번째 바이오마커가 내부 대조군으로서 사용되도록 본 명세서에서 추가로 설명된다.
추가 보정 방법은 샘플의 연속 희석에 대해 방법을 수행하는 것이다. 또는 다양한 농도의 바이오마커가 있는 다른 샘플을 사용하여 농도 대 비결합 플롯의 구성을 허용할 수 있다.
선택된 방출 조건이 측정 시간에 걸쳐 정량적일 필요가 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 광분해에서 시간이 지남에 따라 양을 증가시켜 마지막에 절단 가능한 모든 결합이 절단되도록 할 수 있다. 결합 및 결합되지 않은 포획제 모두의 검출은 결합 비율의 계산을 허용할 것이다: 내부 대조군으로서 결합되지 않은, 그리고 궁극적으로 바이오마커 농도.
또는 내부 대조군 또는 표준을 사용할 수 있다. 내부 표준 또는 대조군은 바이오마커, 포획제 또는 바이오마커와 포획제의 복합체와 같은 입자와 유사한 특성을 가질 수 있다. 내부 내조군 및 표준에 대해서는 본 문서의 앞부분에서 설명한다.
키트
키트는 광 산란 현미경에 의한 바이오마커의 검출에 적절한 하나 이상의 구성 성분을 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 방법에 따른 키트의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 하나 이상의 바이오마커의 질량 또는 농도에 대한 기준 수준 및/또는 바이오마커에 대한 기준 단일 입자 히스토그램(single particle histograms)을 제공할 수 있다. 키트는 또한 진단 방법이 수행될 수 있는 대상에 관한 세부 사항을 포함할 수 있다. 키트는 적절한 표면, 예를 들어 커버슬립, 포획제, 차단 버퍼, 세척 버퍼, 방출 버퍼, 본 명세서에 기재된 바와 같은 보정 차트 또는 히스토그램, 다음에 따른 사용 지침서로부터 선택된 하나 이상의 항목을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법, 샘플 수집 용기, 샘플 수집 장치(예: 모세혈관 채혈 장치, 손가락 채혈 장치 또는 바늘을 포함하는 임의의 기구), 바이오마커의 방출을 매개하는 시료 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 포획제, 및 보정을 위한 하나 이상의 표준 바이오마커 샘플.
키트는 다른 실험실 또는 임상 파라미터의 측정을 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 키트를 사용하는 절차는 임상 실험실, 실험 실험실, 의료 종사자 또는 개인이 수행할 수 있다.
추가 방법론
본 발명의 방법은 하나 이상의 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 진단 방법은 본 발명에 따른 방법의 결과에 기초하여 대상에게 진단 또는 예후를 부여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 진단 방법은 본 발명의 방법에 따라 질병 또는 상태로 진단된 대상에게 투여하기 위한 적절한 치료 요법 또는 투여 요법을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 대상에게 적절한 치료 또는 투여 요법을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 세포 또는 바이러스 배양 방법을 변경하여 배양의 특정 바이오마커를 감소시키거나 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 제품을 변경하기 위해 제조 공정을 변경하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 본 발명의 방법에 의한 검출을 위한 바이오마커의 유무 또는 양은 제품의 바람직하거나 바람직하지 않은 특징, 예를 들어 품질을 나타낸다.
본 발명의 방법은 예를 들어 올리고머화, 번역후 변형 또는 바이오마커 상호작용에 영향을 미치는 특징 또는 파라미터를 제거하기 위해 생성물 또는 배양물을 제거하거나 세정하는 것을 포함할 수 있다.
질병/감염
본 발명의 방법은 바이오마커의 존재를 검출하는데 적절할 수 있다. 바이오마커는 존재, 유형, 개시, 중증도, 가능성 있는 재발 또는 재발, 질병 또는 상태의 진행, 또는 질병 또는 상태에 대한 소인(predisposition)과 같은 요인을 나타낼 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 언급된 바와 같이 진단은 존재, 유형, 개시, 중증도, 가능성 있는 재발 또는 재발, 및 질환 또는 상태의 진행, 또는 질환 또는 상태에 대한 소인에 대한 시험을 포함한다.
소인은 예를 들어 특정 시간 프레임과 같이 대상이 질병 또는 상태에 걸릴 가능성이다. 따라서, 본 발명은 특정 질병 또는 상태에 대한 대상체의 소인을 결정하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 제공한다. 생물학적 샘플에서 낮은 농도의 바이오마커를 검출하는 본 발명의 능력은 대상이 바이오마커 나타내는 질병 또는 상태에 걸릴 가능성을 결정하는 데 특히 적절하다. 다른 실시예들에서, 상기 방법은 대상체에서 질병을 진단하기 위한 방법이고 대상체에서 검출가능한 마커의 존재는 대상체가 질병을 앓는 것을 나타내고 대상체에서 검출가능한 마커의 부재는 대상체가 질병이 없음을 나타낸다.
적절하게는, 본 명세서에 기술된 진단 방법은 대상으로부터 얻은 샘플에 대해 수행된다. 샘플은 모세혈관 채혈 장치, 손가락 채혈 장치 또는 바늘이 포함된 기구를 사용하여 얻을 수 있다. 샘플은 임의의 적절한 생검(biopsy) 기술 또는 기관지폐포 세척, 가래 흡인, 면봉 등을 포함하는 수집 방법을 사용하여 수집할 수 있으며 임의의 적절한 용기에 넣을 수 있다.
본 발명은 암, 퇴행성 질병, 간 손상 또는 질병, 박테리아, 진균 또는 바이러스 감염, 또는 염증성 질병을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병 또는 상태의 진단에 적절할 수 있다.
본 발명은 단백질 변형을 포함한 어떤 단백질 변형을 유발하는 질병이나 상태의 진단에 적절할 수 있으며, 다음에 의해 야기된 질병을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 단백질 올리고머화의 변화, 단백질-단백질 상호작용, 단백질-다른 생체 분자(예: 핵산, 당, 고분자, 더 작은 펩타이드, 유기 및 무기 분자) 상호작용, 단백질 번역 후 변형(예: 단백질 인산화, 글리코실화, 유비퀴티네이션, 핵산(예: 메틸화) 또는 다당류(예: 특정 아세틸- 또는 아실-기의 존재). 본 발명은 또한 특정 DNA 또는 RNA 서열, 포락(envelop) 및/또는 막 단백질, 리포다당류, 이펙터 단백질의 존재를 포함하는 특정 바이오마커의 유무로 인한 특정 세균, 진균 또는 바이러스 감염의 검출에 적절할 수 있다. 본 발명은 탄수화물, 핵산 또는 단백질 바이오마커 또는 이들의 임의의 조합의 검출에 의한 암의 진단에 적절할 수 있다.
단백질 변형과 관련된 질병에는 동물의 스크래피(scrapie), 스크래피 및 소해면상뇌증(bovine spongiform encephalopathy)과 같은 프리온 질병과 인간의 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 및 게르스트만-스트라이슬러-샤인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker)질병이 포함된다. 내포물 형성을 초래하는 단백질 응집체 는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 파킨슨병(Parkinson's disease) 및 헌팅턴병(Huntington's disease)을 비롯한 많은 신경퇴행성 질환에 공통적인 병리학적 특징이다.
본원에 사용된 용어 "암"은 림프종(lymphomas), 림프구성 백혈병(lymphocytic leukaemia’s), 폐암(lung cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung, NSCL) 암, 세기관지폐포세포 폐암(bronchioloalviolar cell lung cancer), 골암(bone cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 폐암과 같은 증식성(proliferative) 질환을 의미한다. 머리 또는 목의 암(cancer of the head or neck), 피부 또는 안색 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁암(uterine cancer), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(cancer of the anal region), 위암(stomach cancer), 위암(gastric cancer), 결장암 (colon cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁암 (uterine cancer), 난관암 (carcinoma of the fallopian tubes), 자궁내막암 (carcinoma of the endometrium), 자궁경부암종 (carcinoma of the cervix), 질암종 (carcinoma of the vagina), 외음부암종 (carcinoma of the vulva), 호지킨병 (Hodgkin's Disease), 식도암 (cancer of the oesophagus), 소장암 (cancer of the small intestine), 내분비계암 (cancer of the endocrine system), 갑상선암 (cancer of the thyroid gland), 부갑상선암 (cancer of the parathyroid gland), 부신암 (cancer of the adrenal gland), 연조직 육종 (sarcoma of soft tissue), 요도암 (cancer of the urethra), 음경암 (cancer of the penis), 전립선암 (prostate cancer), 방광암 (cancer of the bladder), 신장 또는 요관암 (cancer of the kidney or ureter), 신장 세포 암종 (renal cell carcinoma), 신장 골반 암종 (carcinoma of the renal pelvis), 중피종 (mesothelioma), 간세포암 (hepatocellular cancer), 담도암 (biliary cancer), 중추신경계(CNS)의 신생물 (neoplasms of the central nervous system), 척추축 종양 (spinal axis tumours), 뇌간 신경아교종 (brain stem glioma), 다형성 교모세포종 (glioblastoma multiforme), 성상세포종 (astrocytomas), 신경초종 (schwanomas), 상의세포종 (ependymonas), 수모세포종 (medulloblastomas), 수막종 (meningiomas), 편평 세포 암종 (squamous cell carcinomas), 뇌하수체 선종 및 유윙 육종 (pituitary adenoma and Ewings sarcoma) (상기 암 중 임의의 난치성 버전 포함), 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합.
염증성 질환(Inflammatory disease)에는 심혈관 질환(Cardiovascular Disease), 염증성 장 질환(inflammatory Bowel Disease), 감염(infection), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 죽상 동맥 경화증(atherosclerosis), 알레르기 질환(allergic disease), 천식(asthma), 및 COPD와 같은 상태가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
자가면역질환(Autoimmune diseases)은 면역계가 자기항원에 반응하여 조직의 손상이나 기능장애를 일으키는 공통된 병인을 가진 다양한 질환군이다. 크론병(Crohn’s disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선 및 전신성 홍반성 루푸스를 포함하는 자가면역 질환(psoriasis and systemic lupus erythematosus) (Norouzinia, et al Gastroenterol. Hepatol. from Bed to Bench 10, 155-167 (2017); Jin, F. et al. Front. Immunol. 9, 1-9(2018), Shi, G., Zhang, Z. & Li, QJ Immunol. Res. 2017, 1-2(2017), Prince, HE Biomarkers 10 Suppl 1, 44-49(2005)).
간 손상에는 알코올 관련 간 질환(alcohol related liver disease), 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease), 간염(hepatitis), 혈색소침착증(heamochromatosis) 및 간경변증(cirrhosis)이 포함될 수 있다.
박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스 감염은 예를 들어 보데텔라(Bordetella), 클라미디아(Chlamydia) 또는 마이코플라스마(Mycoplasma), 레지오넬라(legionella), 박테리아성 수막염(bacterial meningitis), 폐렴(pneumonia), 기관지염(bronchitis), 패혈증(sepsis), 및 코로나바이러스(Coronavirus) 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 또는 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV), HSV, CMV, 라이노바이러스, 인플루엔자 A(Influenza A), 인플루엔자 B(Influenza B), 파라인플루엔자(Parainfluenza) 또는 RSV와 같은 바이러스 감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 곰팡이 감염에는 Aspergillus, Candida, Penicillin, Paracoccidodiodes, Histoplasma, Fonsecaea, Cryptococcus, Saccaromyces, Pichia, C albicans, C glabrata, C tropicalis, Fusarium spp, Saccaromyces cerevisiae, spp Acremonium spp 등이 있지만 이에 제한되지 않는다. 기생충 감염에는 Malaria, Toxoplasmosis, Leishmaniasis, 및 African Trypanosomiasis이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 Naegleria fowleri 또는 Entamoeba histolytica 와 같은 아메바 감염도 검출될 수 있다.
산업 응용분야
이 문서에서 설명된 이 접근 방법은 진단 응용분야에 국한되지 않고 품질 관리, 환경 관리 및 생물 분석 방법과 같은 다른 관련 응용분야로 확장될 수 있다. 본 발명은 음식 및 음료의 대량 생산과 같이 생물 분자의 검출 및/또는 정략적 분석이 필요한 모든 응용분야에서 유용할 수 있다.
따라서 본 발명의 방법은 샘플 또는 세포 또는 바이러스 배양물에서 오염을 검출하고, 알려진 기준과 비교하여 샘플의 품질을 결정하며, 생물 분자의 변형 (예: 단백질의 번역 후 변형)을 검출하고, 샘플에서 두 개 이상의 생물 분자 간 상호작용을 검출하거나 정량화 (예: 결합 또는 연관성 검출 또는 정량화), 샘플에서 두 개 이상의 바이오마커의 양 비교, 제품의 발현 수준을 양적으로 분석하는 데 유용할 수 있다.
또한 본 발명은 하수 또는 폐수를 대상으로 바이러스같은 감염병의 발생을 검사하는 대량 검사 절차와 같은 대량 검사 절차에서 유용할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 대로 키트는 해당 방법에 사용하기 위해 제공될 수 있다.
본 명세서의 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(contain)" 및 단어의 변형, 예를 들어 "포함하는(comprising)" 및 "포함하다(comprises)"는 "포함하지만 이에 제한되지 않는" 을 의미하며, (및 하지 않는다) 다른 부분, 첨가제, 구성 요소, 정수 또는 단계를 제외한다.
본 명세서의 설명 및 청구범위 전체에서, 단수형은 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 복수형을 포함한다. 특히, 부정 관사가 사용되는 경우, 본 명세서는 문맥상 달리 요구하지 않는 한 복수형 및 단수형을 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 특정 측면, 실시예 또는 예와 관련하여 기술된 특징, 정수, 특성, 화합물, 화학적 물질 또는 그룹은 호환되지 않는 한 본 명세서에 기술된 임의의 다른 측면, 실시예 또는 예에 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다.
독자의 주의는 본 출원과 관련하여 본 명세서와 동시에 또는 그 이전에 제출되고 본 명세서와 함께 대중이 열람할 수 있는 모든 논문 및 문서로 향하며, 이러한 모든 논문 및 문서의 내용은 참조로 본 명세서에 통합된다.
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이 명세서에 개시된 각 특징(첨부된 청구범위, 요약 및 도면 포함)은 달리 명시되지 않는 한 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적 특징으로 대체될 수 있다. 따라서 달리 명시되지 않는 한, 개시된 각 특징은 등가이거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 한 예일 뿐이다.
본 발명은 임의의 전술한 실시예의 세부 사항에 제한되지 않는다. 본 발명은 본 명세서(첨부된 청구범위, 요약 및 도면 포함)에 개시된 특징의 임의의 신규한 것 또는 임의의 신규한 조합, 또는 임의의 방법 또는 프로세스 단계의 임의의 신규한 것 또는 임의의 신규한 조합으로 확장된다.
깨끗한 커버슬립에 400μM 농도의 항체(Herceptin)(Hoffmann-LaRoche) 용액 10μl로 10분간 배양하여 비특이적 흡수를 통해 커버슬립에 결합할 수 있도록 했다. 배양 후 TBS 버퍼로 커버슬립을 세척하여 초과 및 결합되지 않은 항체를 제거했다. 과도한 버퍼는 질소 공기 인라인을 사용하여 제거되었다. 그런 다음 Her2( 500nM) 10μl를 커버슬립에 추가하고 단백질이 커버슬립의 항체에 결합할 수 있도록 실온에서 20분 동안 배양했다. 배양 후 풍부한 TBS 버퍼로 세척하여 여분의 결합되지 않은 단백질을 제거했다. 커버 슬립은 질소 공기 인라인을 사용하여 건조되었으며 질량 측광에 사용되었다. AcquireMP(Refine, UK)는 동영상당 512x260픽셀의 ROI(관심 영역) 18000프레임을 수집하도록 설정되었다. 측정을 위해 TBS(pH7.4) 10μl를 커버슬립에 추가하여 초점을 찾고 코팅 자체로 인한 무작위 결합/비결합 이벤트를 평가하기 위한 대조군 데이터를 획득하였다(대조군 실험, 도 2a). 그 후 5μl의 버퍼를 제거하고 혼합하지 않고 5μl의 염산(1M)을 첨가하여 두 번째 영상을 획득하였다(도 2b).
TBS pH 7.4와 함께 배양된 코팅된 커버슬립은 표면에서 단백질이 크게 방출되지 않음을 보여준다(도 2a).
TBS 버퍼에 HCl을 첨가하여 버퍼 pH를 낮추면 대부분 표면에 결합된 상태로 남아 있는 Herceptin으로부터 Her2 단백질의 방출이 유도된다. 버퍼 pH를 낮추면 항체가 결합된 항원을 방출하도록 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이는 Her2 비결합을 설명한다. 표면 패시베이션(passivation)이 없기 때문에 Her2는 유리의 사용 가능한 공간에 다시 결합할 수 있으며, 이는 도 2b에서 많은 결합 이벤트(334 결합 이벤트)를 설명한다. 여전히 비결합 이벤트의 수는 결합보다 많다(비결합 이벤트 516개 대 결합 334개).
상기 결과는 항체(Herceptin)로부터 유방암 바이오마커(Her2)를 방출하는 것이 가능하다는 것을 보여주며, 나아가 그 방출을 유도하는 조건을 이용하여, 결과는 질량 측광법이 항체로부터 결합되지 않은 바이오마커를 평가하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여주며, 방출 이벤트 전후에 Her2가 있든 없든 표면에 결합된 Herceptin의 분자량을 평가함으로써 그것의 방출을 확인할 수 있다. 이는 도 1에 나와 있다. Herceptin 이 장착된 기능화된 커버 슬립이 준비되어 있다. 이것은 많은 성분을 포함할 수 있는 샘플과 함께 배양된다. Herceptin 은 Her2(존재하는 경우)에 특이적으로 결합하고 다른 성분들은 씻겨진다. 그런 다음 표면을 장치에 도입하고 목적물을 묘사하는 표면의 이미지가 얻어진다. (여기서는 Her2가 결합되거나 결합되지 않은 Herceptin). 그런 다음 Herceptin 이 표면에서 방출되도록 조건이 변경된다. 그런 다음 각 목적물에 대한 광 산란의 변화를 결정하고 방출된 입자의 질량을 할당할 수 있다. 질량은 그것이 Herceptin 단독으로 방출되었는지(no Her2) 또는 Her2에 결합된 Herceptin인지를 나타낸다. 결합되지 않은 Herceptin 의 비율은 샘플에서 Her2의 농도를 나타내는 데 사용될 수 있다.
실험 설정 요약 (도4)
유리 커버슬립은 PEG와 PEG-비오틴의 혼합물로 코팅되었다(1단계). PEG는 표면에 대한 비특이적 단백질 결합을 최소화하는 알려진 오염 방지 코팅이다. PEG-비오틴 중합체에 존재하는 비오틴 분자는 이 단백질과 함께 배양하면 스트렙타비딘에 결합한다(2단계).
이제 비오틴을 통해 코팅에 결합된 스트렙타비딘은 비오틴 표지(biotin-labelled)단백질, 이 경우 비오틴으로 표지된 Herceptin 항체의 포획제로 사용된다(3단계). 유리 표면에 PEG의 존재는 다른 단백질의 부착을 최소화한다. 따라서, Herceptin-비오틴(Herc-B)이 혈청 단백질과 같은 다른 단백질의 복잡한 혼합물과 함께 표면에서 배양되더라도, 배양 및 세척 후 유리에 남아 있는 유일한 단백질은 라벨링된 항체인 Herc-B(3단계)이다.
스트렙타비딘은 표지된 항체와 같은 표지된 분자보다 유리 비오틴에 훨씬 더 많은 친화력을 가지고 있으므로 유리 커버슬립에 높은 농도의 유리 비오틴을 추가하면 유리 표면에서 항체의 방출이 촉진된다(4단계). 이 방출은 표면에서 광 산란을 측정하고 신호 크기의 변화를 기록하여 질량 광도 측정을 수행할 수 있다.
자세한 프로토콜 - 커버슬립 준비:
깨끗한 커버슬립을 PEG와 PEG-비오틴 비율(9:1)로 코팅하였다. 코팅된 커버슬립을 스트렙타비딘(200nM에서 50μl)과 함께 30분 동안 배양하여 스트렙타비딘이 코팅의 비오틴에 결합하도록 하였다. 배양 후, 커버슬립을 철저히 세척하고 건조시켰다.
코팅이 Herc-B의 선택적 결합을 촉진하고 표면에 결합하는 다른 단백질을 효과적으로 감소시키는지 확인하기 위해 커버슬립에서 배양하기 전에 Herc-B를 희석된 태아 소 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 혼합하였다. FBS를 PBS에서 두 배 희석하고 Herc-B와 혼합하여 표시된 항체의 최종 농도 100nM이 되도록 하였다. 생성된 복합 및 고농도 단백질 혼합물을 커버슬립에서 30분 동안 배양한 후 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거하고 건조하고 질량 광도 측정에 사용하였다.
질량 광도 측정 및 결과:
Herc-B가 복잡한 샘플의 일부일 때 코팅된 커버슬립에서 Herc-B가 방출된 후:
준비된 커버슬립을 질량 광도계에 도입하여 초기 측정을 수행하고 커버슬립에서 방출되거나 커버슬립에 결합하는 단백질을 500초 동안 큰 FOV를 사용하여 추적하였다.
간략하게, 측정은 다음과 같이 수행되었다:
웰을 20ul PBS로 약 5분간 배양하여 표면에 수분을 다시 공급했다. 이 짧은 배양 후, PBS를 제거하고, 신선한 PBS를 첨가하고 대조군 측정을 수행하였다. 기준선 또는 대조군 측정 동안 검출된 이벤트는 코팅 및 배경 노이즈에 대한 비특이적 비결합/결합을 설명한다. 대조군 측정 후 PBS를 제거하고 유리에 유리 비오틴을 25mM 농도로 첨가하여 동일한 웰에서 측정을 수행하였다.
결과(표 1 및 도 5)는 비오틴의 존재가 검출된 이벤트의 전체 수를 상당히 증가시키고 특히 비결합 이벤트의 수는 Herc-B 항체에 대해 예상되는 150kDa에 가까운 분자량과 연관될 수 있음을 나타낸다(도 5). 표 1은 다양한 입자의 방출이 이 범위 내에서 검출될 것이라고 가정할 때 76~273kDa 범위 내에서 검출된 결합 및 비결합 이벤트의 수를 요약한 것이다.
데이터는 유리 비오틴 첨가 후 처음 500초가 Herc-B MW 범위 내에서 460개의 이벤트 방출을 촉진했음을 보여준다(도5, 어두운 회색 선). 연속적인 측정은 더 많은 카운트를 나타냈지만, 결합(표시되지 않음)과 비결합 이벤트(도 5, 밝은 회색 선)의 수 간의 차이는 더 작았으며 이는 비결합 이벤트의 대부분이 처음 500초 이내에 발생했음을 나타낸다. 두 시점 모두 PBS 대조군보다 비결합 이벤트에 대한 결합의 차이가 더 크며, 이는 비오틴이 라벨링된 항체의 제어된 방출을 촉진한다는 것을 나타낸다(표 1).
또한, 비오틴을 사용하여 검출된 대부분의 방출 이벤트는 방출된 입자가 Herc-B 방출에 대해 예상되는 분자량 방출에 가까운 분자량을 갖는다는 계산을 가능하게 하며, 이는 코팅이 복잡한 고농도 단백질 혼합물로부터 항체를 효과적으로 포획했음을 나타내며 이러한 혼합물은 소 혈청(매우 높은 농도) 및 Herc-B에 흔히 존재하는 일반적인 단백질로 구성되며 낮은 농도(100nM)로 혼합된다.
도 5는 검출된 음의 질량 이벤트, 즉 비결합 이벤트만 보여준다. 음의 질량은 입자(이 경우 Herc-B)의 방출에 대해 표면의 복합체(목적물)가 모니터링되기 때문에 검출된다. 이 항체의 분자량이 알려져 있는 경우 표면에서 예상되는 질량의 방출과 관련된 비결합 이벤트를 모니터링하는 것이 가능하다. 도 5는 표면에서 방출된 질량(kDa) 대 개수의 히스토그램이다. 세 가지 데이터 세트가 표시되어 있다. 진한 회색과 밝은 회색 선은 25mM 비오틴(2회 반복)으로 얻은 결과를 나타낸다. 가장 어두운 선은 비오틴 대신 PBS를 사용한 결과를 나타낸다.
표 1: 76 kDa와 273 kDa 사이의 분자량과 상관관계가 있을 수 있는 유리에서 결합 및 비결합 이벤트의 수, 비결합 및 결합 이벤트 수 간의 차이 그리고 백분율로 계산된 대조군(PBS) 대비 비결합 이벤트 증가에 대한 요약.
Figure pct00001
따라서, 본 실시예는 본 발명의 방법에서 방출제로서 사용되는 비오틴의 능력, 또한 스트렙타비딘 포획제를 고정화하기 위한 비오틴화된 PEG의 유용성을 입증한다. 결합 이벤트가 기록되었지만, 이것은 본 발명의 방법에 중요하지 않다. 항체의 방출은 방출 이벤트로서 검출될 수 있고 표면에서의 변화의 크기는 입자에 분자량을 할당하는 데 사용될 수 있다.

Claims (25)

  1. I) 샘플에 존재하는 바이오마커에 결합할 수 있는 포획제가 고정된 표면을 용액에서 제공하는 단계;
    II) 샘플의 바이오마커가 포획제에 결합할 수 있는 조건에서 표면을 샘플과 접촉시키는 단계;
    III) 표면의 첫 번째 검출 영역을 정의하고 광 산란을 사용하여 표면을 측정하는 단계;
    IV) 표면에 결합된 입자를 방출시키는 단계; 여기서 입자는 다음 중에서 선택:
    ⅰ. 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
    ⅱ. 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
    ⅲ. 결합되지 않은 포획제;
    Ⅴ) 표면에서 광 산란의 변화를 결정하여 표면의 첫 번째 검출 영역에서 방출된 입자를 검출하는 단계;.를 포함하는 것을 특징으로 하는 간섭계 광 산란 또는 질량 측광법에 의해 샘플에서 바이오마커를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계Ⅴ)에서 결정은 상기 표면으로부터 질량 손실을 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 표면으로부터 질량 손실은 입자의 동일성(identity)를 결정할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 IV)에서 입자의 방출은 상기 표면의 검출 영역에 방출제를 도포하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단계 IV)에서 입자의 방출은 상기 표면의 검출 영역의 화학적 환경의 변경; 상기 포획제의 효소적 분해 및/또는 상기 포획제의 광분해를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 방출제는 효소, 광, 버퍼 또는 화학 시약인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면의 검출 영역은 부동태화(passivated), 활성화(activated), 코팅(coated), 처리(treated) 또는 유도화(derivatised)되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 제1항의 입자의 예상 질량을 결정하는 단계,
    ii) 표면에서 방출되는 예상 질량의 입자 수 또는 대비를 결정하는 단계; 및 선택적으로
    iii) 상기ii)의 결과를 표준 또는 검량선과 비교하는 단계를 포함하는 상기 바이오마커의 농도를 측정하는 방법을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 표면의 두 번째 또는 추가 검출 영역에 대해 단계 IV) 및 V)를 반복하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. I) 샘플에 존재하는 바이오마커에 결합할 수 있는 포획제가 고정된 표면을 용액에서 제공하는 단계;
    II) 샘플의 바이오마커가 포획제에 결합할 수 있는 조건에서 표면을 샘플과 접촉시키는 단계;
    III) 표면의 첫 번째 검출 영역을 정의하고 광 산란을 사용하여 표면을 측정하는 단계;
    IV) 표면에 결합된 입자를 방출시키는 단계; 여기서 입자는 다음 중에서 선택:
    ⅰ. 결합된 포획제로부터 방출된 바이오마커;
    ⅱ. 포획제에 결합된 바이오마커를 포함하는 복합체; 및/또는
    ⅲ. 결합되지 않은 포획제;
    V) 광 산란의 변화를 결정하여 표면의 첫 번째 검출 영역에서 방출된 입자(들)를 검출하는 단계;.를 포함하는 것을 특징으로 하는 간섭계 광 산란 또는 질량 측광법에 의해 대상에서 바이오마커의 존재 또는 양과 관련된 질병 또는 상태를 진단하는 방법이며,
    여기서 i. 또는 ii.의 유무는 대상에서 질병 또는 상태의 존재, 중증도 또는 진행 가능성을 나타내는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 방법은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
    ⅰ) 표면을 제공하는 단계;
    ⅱ) 바이오마커의 존재 및/또는 양에 대해 분석할 샘플을 제공하는 단계;
    ⅲ) 검출할 바이오마커에 특이적으로 결합하는 포획제를 표면에 고정하는 단계.;를 더 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 II)는 샘플에 존재하는 바이오마커를 표면에 고정된 포획제에 결합시키기에 적절한 조건에서 적절한 시간 동안 표면을 샘플과 함께 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 물질 또는 조성물이 투여되거나 치료 또는 투여 요법이 처방되는 대상을 선택하는 방법으로서, 상기 물질 또는 조성물이 대상으로부터 샘플에서 바이오마커의 존재 또는 양과 관련된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 데 적절하고, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 진단 방법을 포함하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법으로 대상이 질병 또는 상태로 진단되거나 발병할 가능성이 있는 것으로 진단된 대상에서 물질 또는 조성물을 투여하거나 대상에서 상기 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는데 효과적인 요법을 수행하는 것을 포함하는 방법으로 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법.
  16. 질병 또는 상태로 진단되거나 발병할 가능성이 있는 것으로 진단된 대상에서 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 물질 또는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커는 단백질 및 이의 단편, 펩티드, 폴리펩티드, 프로테오글리칸, 당단백질, 지단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 무기 화합물에 대한 유기 물질, 천연 폴리머, 소분자, 또는 이들의 조합인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획제는 항체 또는 이의 유도체, 핵산, 단백질, 무기 분자 또는 중합체인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획제는 화학적 분해, 효소에 의한 분해 또는 광분해에 의한 절단을 위한 한 개 이상의 부위를 포함하여, 포획제로부터 바이오마커를 방출 및/또는 표면으로부터 포획제를 방출하게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 방법으로 생물학적 분자의 변형을 검출하는 방법으로서, 바이오마커가 변형된 생물학적 분자의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 방법으로 샘플에서 두 개 이상의 생물학적 분자 사이의 상호작용을 검출하는 방법으로서, 바이오마커가 두 개 이상의 생물학적 분자 사이의 상호작용의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항을 포함하는 방법으로 샘플에서 오염을 검출하는 방법으로서, 바이오마커가 샘플의 오염을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제8항을 포함하는 방법으로 생성물의 발현 수준을 정량하는 방법으로서, 바이오마커가 발현 생성물의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에서 정의된 방법에 따른 사용을 위한 표면, 포획제, 버퍼, 사용 방법, 샘플 채취 장치, 보정을 위한 하나 이상의 표준 바이오마커 샘플, 및 선택적으로 상기 바이오마커 또는 포획제의 표면으로부터의 방출을 매개하는 시약을 포함하는 키트.
  25. 제24항에 있어서, 상기 시약은 화학 시약 또는 효소인 키트.
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