JP2023542931A - バイオマーカーの検出 - Google Patents
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Abstract
光散乱顕微鏡によるサンプル中のバイオマーカーの検出のための方法およびキットが記載される。本発明は、複雑なサンプル中の存在量の少ないバイオマーカーの検出に特に有用であり、医療環境の点では使用に適している。一実施形態では、本発明の方法は、マスフォトメトリーを使用したサンプル中のバイオマーカーの検出について説明する。
Description
本発明は、サンプル中のバイオマーカーの検出または定量化のための、光散乱、特に干渉散乱顕微鏡法またはマスフォトメトリーの使用に関する。特に、本発明は、サンプル中のバイオマーカーに関連する疾患もしくは状態の診断方法に関する。また、本発明の方法を実施するためのキットも提供される。サンプルは複雑な場合があるため、バイオマーカーは、他の成分の存在下において微量成分として存在しうる。したがって、バイオマーカーは低濃度で存在してもよい。
バイオマーカーの検出または定量化は、疾患もしくは状態の診断のためのツールとして、または特定の疾患状態に対する個人の感受性を決定するためのツールとして、広く利用されるようになっている。バイオマーカーの検出は、個別化医療の発展における非常に貴重なツールであり、指標となるバイオマーカーの有無またはバイオマーカーのパネルについて検査で陽性と判定された患者に対する標的化された治療レジメンを可能にする。例えば、がん、自己免疫疾患、または炎症性疾患は、血液、CSF、尿などの体液から採取したサンプル中のタンパク質またはその他のバイオマーカーの異常な存在を検出することによって診断され得る。そのようなバイオマーカーは、特定のタンパク質、タンパク質アイソフォーム、翻訳後修飾、タンパク質の異常な量、またはタンパク質とタンパク質/代謝産物またはタンパク質と他の生体分子(例えば、糖、多糖、核酸)の相対比の変化の有無であり得る。
バイオマーカーは、評価、モニタリング、または測定することができ、健康状態、発病プロセス、または治療もしくは医療介入への反応に関連付けられている広範な細胞、生化学的、および/または分子の変化を含む。バイオマーカーは、比較的進行した段階にあるいくつかの疾患の診断に一般的に使用されているが、初期の疾患バイオマーカーは豊富ではなく、非常に低濃度で存在するため、治療もしくは予防措置がより効果的となり得る初期段階の検出におけるそれらのポテンシャルは依然として非常に限定的である。存在量の少ないバイオマーカーを検出する最も一般的な方法は、標的化または定量的質量分析、およびアプタマーベースのプロテオミクスを含む。
適切なバイオマーカーの同定における発展と並行して、バイオマーカーを検出または定量化するための方法、システム、およびハードウェアが開発された。最も一般的に使用されている方法は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの検査であり、これらは高い感度を提供するが、迅速な非定量的検査に最適化されなければならないか、完了までに30分から数時間かかるかのいずれかであり、よって、診療現場の環境における使用には複雑すぎ、かつ/または高価すぎる。
ELISAの欠点に対処するために、電気化学的イムノアッセイ、表面増強ラマン分光法、フローサイトメトリー、またはその他の蛍光ベースの技術などの他のアプローチが開発されたが、これまでのところ、高い特異性と感度を持ちながらシンプルで手頃な価格の装置という理想的な組み合わせに到達したものはない。
近年、干渉散乱顕微鏡法(iSCAT)、最も著しくはマスフォトメトリーが、単一分子検出のための強力な分析技術として開発され、ELISAなどのアッセイに代わるシンプルで費用対効果の高い選択肢を提供している。iSCATは、標識を追加する必要なく、溶液中の異なる質量の粒子の相対的な分布に関する情報を提供する。iSCATは、精製された単一タンパク質の検出についてと(Coleら(ACS Photonics、2017年、4(2)、211~216ページおよびWO2018/011591)、リポタンパク質の検出と溶液中の分子の濃度の決定(WO2019/110977)について、以前に記述されている。特にマスフォトメトリーについては、Youngら、Science、2018年4月:Vol.360、Issue 6387、423~427ページ)およびLiら、Nucleic Acids Research、2020年8月、https://doi.org/10.1093/nar/gkaa632に記載されている。
本明細書においてマスフォトメトリー(MP)と表示される干渉散乱質量分析法(iSCAMS)は、単一の対象物とそれらが溶液中で形成する複合体の質量を検出および測定するための手段である。MPは、単一の分子が非特異的または特異的に表面に結合する際の光散乱によって、それらを検出する。各結合イベントは、表面/溶液界面での屈折率の変化につながり、これにより、局所的な光散乱が効果的に変化し、散乱光と反射光の間の最適化された干渉を利用して高精度で検出され得る。既知の質量の分子を用いた較正により、ポリペプチドについて、約2%の質量精度と最高20kDaの質量分解能で、シグナル変化の大きさが分子量へと変換され得る。散乱シグナルは、このように分子の質量に正比例し、単一の分子を光で計量することが可能となる。しかしながら、そのような手法は、1つの分子が少量で存在しうる複雑な溶液には単純に適用し得ない。したがって、存在量の少ない分子が非特異的に表面に結合し、質量の検出を可能としうるという事実にもかかわらず、存在する交絡成分が多すぎて、質量を正確に決定し、したがって分子のアイデンティティを決定することができないおそれがある。これは、前記分子の同定を複雑化させ、濃度の決定を困難にする。したがって、サンプル中の存在量の少ないバイオマーカーへのこの手法の適用は限定的なものとなっていた。
マスフォトメトリーは、溶液中の単一分子を、ネイティブな状態で、標識を必要とせずに、正確に質量測定できるという点で独特である。
光散乱は、例えば、「ネフロメトリー」として知られる、サンプルを通過する入射光から離れた角度の光強度を用いて溶液中の光散乱種を測定するなど、生化学的分析において長い間使用されてきた。他にも、動的光散乱(DLS)(粒子のサイズとサイズ分布を測定)、電気泳動光散乱(ELS)(電気泳動移動度とゼータ電位を測定)、低角度レーザー光散乱(LALLS)(サンプル中のポリマーの分子量分布を測定可能)など、光散乱原理に依拠した、より洗練された方法が存在する。しかしながら、本発明において使用される光散乱法および装置は、使用される技術が表面における単一分子(対象物)の直接的な質量測定を可能にすることから、いずれとも異なっている。特に、表面プラズモン共鳴のような光散乱の原理に依拠する手法は、アッセイにおける屈折率のバルク変化を誘導するために複数の粒子の結合に完全に依存しており、複雑な溶液中のバイオマーカーの存在、濃度および個々の質量を決定するために必要なレベルの詳細を提供することはできない。
光散乱は、例えば、「ネフロメトリー」として知られる、サンプルを通過する入射光から離れた角度の光強度を用いて溶液中の光散乱種を測定するなど、生化学的分析において長い間使用されてきた。他にも、動的光散乱(DLS)(粒子のサイズとサイズ分布を測定)、電気泳動光散乱(ELS)(電気泳動移動度とゼータ電位を測定)、低角度レーザー光散乱(LALLS)(サンプル中のポリマーの分子量分布を測定可能)など、光散乱原理に依拠した、より洗練された方法が存在する。しかしながら、本発明において使用される光散乱法および装置は、使用される技術が表面における単一分子(対象物)の直接的な質量測定を可能にすることから、いずれとも異なっている。特に、表面プラズモン共鳴のような光散乱の原理に依拠する手法は、アッセイにおける屈折率のバルク変化を誘導するために複数の粒子の結合に完全に依存しており、複雑な溶液中のバイオマーカーの存在、濃度および個々の質量を決定するために必要なレベルの詳細を提供することはできない。
疾患の進行、疾患の退縮、または潜在的な医薬品候補の迅速な臨床スクリーニングのために使用されるバイオマーカーの検出には、感度と特異性が依然として不足している。例として、最も一般的なバイオマーカーの1つは、C反応性タンパク質(CRP)であるが、このバイオマーカーは高度に非特異的であり、様々な異なる状態および疾患を指し示し得る。日常的にアクセスできる、より具体的なバイオマーカーの分析を改善することは、日常的な診断のターニングポイントとなるであろう。さらに、神経疾患およびがんのバイオマーカーはしばしば、疾患の初期段階において体液中に存在するが、その濃度が低すぎて、診療現場で利用できる日常的に使用される手法では正確に検出できないおそれがある。診療現場の環境に適したものとするためには、精度を維持しながら、アッセイ結果を得るために必要なコスト、時間、およびスキルを削減する必要がある。
したがって、破片または生物学的サンプルなどの大きな凝集体を含む汚れた環境において非常に存在量の少ないバイオマーカーの定量的検出を可能にし、さらに診療現場の環境に適した特異性と感度の高い方法がなおも必要とされている。
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書において定義される光散乱を使用して、バイオマーカー、特にサンプル中に少量で存在するバイオマーカーの特異的な検出を可能にする方法論を特定した。本発明者らは、長い精製手順を必要とせずに、複雑なサンプル中の少量のバイオマーカーを検出することが可能であることを示した。本発明者らによって開発された方法は、生物学的サンプル中のバイオマーカーの検出、例えば、疾患もしくは状態の診断における使用に特に適している。これはさらに、例えば、病原体に関して食料生産システムをモニタリングしたり、ウイルス性疾患の大流行に関して下水道をモニタリングしたりといった、バイオマーカーに関する工業および農業サンプルのモニタリングに特に適している。
干渉光散乱顕微鏡、そして実際にマスフォトメトリーが、単に分子が表面に非特異的に結合することで溶液中の分子の質量および濃度を決定できることに鑑みれば、捕捉剤を利用したバイオマーカーの表面への特異的な結合に依拠するという直感に反する方法を本発明者らはその代わりに開発した。しかしながら、(そのような測定で日常的であるように)この結合を測定する代わりに、特に他の成分がサンプル中に存在する場合、したがって存在量の少ない種が、非特異的結合イベントの大きなバックグラウンドの中で非常に少数の結合イベントのみを表すに過ぎない場合、これが十分に正確または定量的な結果をもたらさないと本発明者らは判断した。したがって、ある対象物の一部または全部が(粒子として)放出される前と後の表面における対象物の質量を効果的に決定することで、サンプル中のはるかに多い種の非特異的結合とは無関係に、粒子の質量を間接的に測定できることに本発明者らは気がついた。正確な検出方法に鑑み、バイオマーカーが捕捉剤から放出される場合、または実際に捕捉剤またはその一部が捕捉剤とともに放出される場合に本発明は使用されうる。これは、捕捉剤および放出剤の選択における柔軟性を可能にする。
バイオマーカーは存在量が少なく、また、サンプルの他の成分の存在下で存在する可能性も高いため、結合による濃度のルーチン的な検出は、現在は可能でない。これは、他の成分が非特異的に表面に結合し、交絡するデータを提供しうるためである。これに対する洗練された解決策は、バイオマーカーを特異的に捕捉し、洗浄によって交絡する成分を除去し、光散乱の変化または差異について表面をモニタリングすることによってバイオマーカーの放出を検出することである。その差異に質量を割り当てることができ、それからバイオマーカーのアイデンティティを割り当てることができる。
したがって、第1の態様では、サンプル中のバイオマーカーを検出する方法であって、表面上に固定化されたバイオマーカーの捕捉剤を含む表面をサンプルと接触させるステップと、捕捉されたバイオマーカーを表面から放出させるステップと、光散乱によってバイオマーカーの放出を検出するステップを含む方法が提供される。
光散乱は、干渉光散乱顕微鏡またはマスフォトメーターで検出される。
適切には、サンプル中のバイオマーカーを検出するための方法が提供され、ここで、本方法は、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義するステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i)結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii)捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii)結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
V)光散乱により、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含む。
適切には、サンプル中のバイオマーカーを検出するための方法が提供され、ここで、本方法は、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義するステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i)結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii)捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii)結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
V)光散乱により、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含む。
粒子は、表面で散乱する光の変化を検出することによって検出される。したがって、放出イベントは、少なくとも2つの測定イベント;放出イベントの前と後における表面の1回の測定を必要としうる。
放出イベントの前後の測定は、負の質量イベントが検出されることを可能とする。放出された粒子の質量は、本発明の方法を使用して、表面での変化を記録することにより決定され得る。これは、特定のバイオマーカーが存在するかどうかの直接的な決定を可能とする。
適切には、サンプル中のバイオマーカーを検出するための方法が提供され、ここで、本方法は、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義し、光散乱を使用して表面の測定を行うステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i)結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii)捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii)結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
VI)光散乱の変化を決定することにより、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含む。
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義し、光散乱を使用して表面の測定を行うステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i)結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii)捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii)結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
VI)光散乱の変化を決定することにより、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含む。
表面の測定は、表面における対象物の測定であってもよい。表面は好ましくは単一の表面である。表面の性質は行われる測定とは無関係であるため、表面は任意の適切な構造でありうる。実施例では、表面は平らなガラスカバースリップである。
光散乱法は干渉散乱顕微鏡法であってもよい。光散乱法は、マスフォトメトリーであってもよい。
第1の検出領域は、観察可能な表面、または放出剤が接触する領域でありうる。
第1の検出領域は、観察可能な表面、または放出剤が接触する領域でありうる。
事実上、本発明は、測定が達成される方法を完全に逆転させることによって、干渉光散乱(iSCAT)が使用される方法を根本的に変える。iSCATおよび同様な手法は一般に、実質的に純粋な、または「不純物」(目的外の他の分子など)が最小限のサンプルに適用される。サンプル中の「希少」な種を検出するために、表面をブロックして他の種の結合を防ぐなど、様々な手法が試みられてきた。不動態化された表面であっても、非特異的な結合が発生しうる。ここで説明する新しいアプローチは、非特異的結合イベントをモニタリングせず、これらの種を洗い流すことができ、その後、本方法は希少種に特異的な解離イベントに完全に集中するため、複雑なサンプル中の希少種の検出を可能にする。
表面からの、単一のバイオマーカー、バイオマーカー/捕捉剤複合体、または結合していない捕捉剤を含む粒子の放出は、放出イベントと呼ばれてもよい。適切には、表面から粒子を放出させるステップは、光散乱による単一の放出イベントの検出を可能にする速度で実行されうる。光散乱顕微鏡法は、表面から溶液中に放出された粒子の質量を決定することができ、粒子の質量を知ることでそのアイデンティティが決定され得る。事実上、質量の損失は表面において検出される。光散乱顕微鏡を使用して、表面から溶液中に放出されたバイオマーカーを検出することは、存在量の少ないバイオマーカーの高感度で特異的な検出を可能にする。本方法は、バイオマーカーまたはバイオマーカー/捕捉剤複合体の標識の必要性を回避できるという利点を有する。さらに、それはバイオマーカー集団の質量の不均一性という、他の手法ではアクセスできない情報の捕捉を可能とする。
好ましくは、光散乱顕微鏡法、場合によりマスフォトメトリーにおいて、表面は、ほぼ連続的な反復率などを介して、ほぼ一定に調査または検査されると説明されてもよい。これは一般に、本明細書に記載の表面の制御された照明を使用して実行される。光散乱デバイスは、表面での光散乱によって単一分子を検出する。したがって、本発明は、表面をモニタリングして、表面において対象物を検出しうる(これは捕捉剤単独、バイオマーカーに結合した捕捉剤またはサンプル由来の追加の成分でさえありうる)。放出イベントは、放出剤の添加により引き起こされうる。各放出イベントは、(例えば対象物の)局所的な光散乱の変化をもたらし、これは、散乱光と反射光の間の最適化された干渉を利用して高精度で検出され得る。シグナルの変化の大きさは、分子量へと変換され得る。
このようにして、放出された粒子の質量が検出される。この検出は間接的である。
好ましくは、放出イベントの前後に測定が行われるため、ある場所での変化またはある場所での対象物の検出が可能である。簡単に言えば、これは放出イベントを検出するために2回の測定が行われることを意味する。したがって、放出イベントは、負の質量イベントとして検出されうる:質量の離脱が検出される。したがって、測定は、表面での対象物の検出と、それから、その対象物からの粒子の放出の検出を可能とする。放出された粒子のアイデンティティは、放出イベントの前後の質量の差異を計算することによって決定され得る。図5は、検出された「負の質量」の例である。したがって、本方法は、特定の対象物または複数の対象物の変化をモニタリングすることを含みうる。したがって、本方法は、特定の場所または複数の場所の変化をモニタリングすることを含みうる。変化は、粒子の放出を指し示す光散乱の変化でありうる。
好ましくは、放出イベントの前後に測定が行われるため、ある場所での変化またはある場所での対象物の検出が可能である。簡単に言えば、これは放出イベントを検出するために2回の測定が行われることを意味する。したがって、放出イベントは、負の質量イベントとして検出されうる:質量の離脱が検出される。したがって、測定は、表面での対象物の検出と、それから、その対象物からの粒子の放出の検出を可能とする。放出された粒子のアイデンティティは、放出イベントの前後の質量の差異を計算することによって決定され得る。図5は、検出された「負の質量」の例である。したがって、本方法は、特定の対象物または複数の対象物の変化をモニタリングすることを含みうる。したがって、本方法は、特定の場所または複数の場所の変化をモニタリングすることを含みうる。変化は、粒子の放出を指し示す光散乱の変化でありうる。
負の質量イベントが発生する際にそれらをモニタリングできるように、放出イベントが実行される速度が制御されてもよい。
シグナルの変化の大きさは、その変化に対する分子量に変換される。
シグナルの変化の大きさは、その変化に対する分子量に変換される。
バイオマーカーに対する任意の修飾、例えば、グリコシル化、核酸の結合、またはユビキチン化が、本発明の方法を使用して検出されてもよい。「翻訳後」または他の修飾の検出は、修飾されたバイオマーカーに関連する特定の分子量に起因しうる。
第1の態様の方法は、サンプル中のバイオマーカーの濃度を決定するために使用されうる。したがって、本方法は、捕捉剤から放出されたバイオマーカーの量および/または固定化された表面から放出されたバイオマーカー/捕捉剤複合体の量を測定することを含みうる。本方法は、検量線との比較によって濃度を決定するために使用されてもよい。較正プロットを作成するためには、既知の濃度の参照標準を含む一連の較正溶液が作成される。検量線は、既知の数の放出イベントを含む対照を使用して作成されてもよい。検量線は、バイオマーカー、バイオマーカー/捕捉剤複合体、または結合していない捕捉剤の量または濃度の測定値を得るために使用されうる。
内部標準もまた使用されうる。分析方法には日常的であるように、内部標準は、較正およびバイオマーカー検出アッセイのいずれか/両方のために表面に一定量添加される化学物質である。次に、バイオマーカー濃度の関数としてバイオマーカーシグナルと内部標準シグナルの比率をプロットすることにより、内部標準が較正のために使用され得る。
次に、放出イベントにおいて検出されたコントラストが、それらの質量を同定するために第2の質量検量線と関連付けられる。質量較正プロットを作成するためには、既知の質量の粒子を含む一連の較正溶液が作成される。マスフォトメトリーが使用される場合、粒子は質量によって同定することができ、単一のバイオマーカー、バイオマーカー/捕捉剤複合体、または結合していない捕捉剤の定量化が、検量線を使用して得られ得る。表面から放出された結合していない捕捉剤の量の測定が、サンプル中に存在するバイオマーカーにより占められる捕捉剤の割合を定量化し、定量的な結果を提供するために使用されうる。
捕捉剤および/またはバイオマーカー/捕捉剤複合体または結合していない捕捉剤からバイオマーカーを放出させるステップは、バイオマーカーと捕捉剤との間の結合を破壊すること、および/または捕捉剤と捕捉剤が固定されている表面との間の結合を破壊することを含みうる。破壊は、適切には、バイオマーカーを捕捉剤から、および/または捕捉剤を表面から完全に解離させるのに十分である。本明細書に記載のように、バイオマーカーおよび/または捕捉剤の放出を媒介するための任意の適切な手段または方法が使用されうる。適切な方法は、表面の化学環境を変化させること、捕捉剤の酵素消化、および/または光分解もしくは加水分解を含む。バイオマーカーを放出させる適切な手段は、放出イベントを促進する捕捉剤に対してより高い結合親和性を有する競合的リガンドの導入を含む。
本方法は、放出されたバイオマーカー/捕捉剤複合体の質量をバイオマーカーの予想質量と比較することをさらに含んでいてもよい。そのような方法は、不均一なバイオマーカー集団におけるバイオマーカーの検出に有用でありうる。
第1の態様の方法はさらに、表面の第2の検出領域またはさらなる検出領域についてステップIV)およびV)を繰り返すことを含んでいてもよい。第2の検出領域またはさらなる検出領域に対するステップIV)およびV)の繰り返しは、表面の第1の検出領域または任意の以前の検出領域に対して実行されたステップIV)およびV)と同一または異なる観察イベントでありうる。適切には、バイオマーカーおよび/またはバイオマーカー/捕捉剤複合体の放出は、特定の観察イベントにおける目的検出領域に制限されうる。
ステップI)の前に、本発明の方法は、サンプル中に存在するバイオマーカーを表面に捕捉することをさらに含みうる。そのような捕捉は特異的であり、それによって表面上のバイオマーカーを濃縮するのに役立つ。したがって、本発明の方法は、以下を含みうる:
i)表面を提供するステップ
ii)バイオマーカーの存在および/または量について分析されるサンプルを提供するステップ;
iii)検出されるバイオマーカーに特異的に結合する捕捉剤を表面に固定化するステップ;
iv)サンプル中に存在するバイオマーカーを、表面上に固定化された捕捉剤に結合させるのに適した条件下で、サンプルとともにステップiii)の表面を適切な時間の間インキュベートするステップ。
i)表面を提供するステップ
ii)バイオマーカーの存在および/または量について分析されるサンプルを提供するステップ;
iii)検出されるバイオマーカーに特異的に結合する捕捉剤を表面に固定化するステップ;
iv)サンプル中に存在するバイオマーカーを、表面上に固定化された捕捉剤に結合させるのに適した条件下で、サンプルとともにステップiii)の表面を適切な時間の間インキュベートするステップ。
場合により、ステップ(iv)に続いて、表面を洗浄して、結合していない実体を除去し、表面または捕捉剤に非特異的に結合した実体を除去してもよい。洗浄条件は、捕捉剤とバイオマーカーとの間の相互作用が影響を受けないように選択される。適切な条件は、マイルドな界面活性剤または低濃度の塩溶液の含有を含む。あるいは、検出ステップに適した溶液を添加する前に、乾燥ステップが含められうる。この乾燥ステップは、表面上に窒素などのガスの流れを使用することを含みうる。そのような洗浄および任意選択の乾燥ステップは、ステップ(v)と表示されうる。
そのようなステップ(i)から(v)は、光散乱装置の外で実行されうる。
そのようなステップ(i)から(v)は、表面の照明の前に実行されうる。
表面をサンプルと接触させ、(i)から(v)などの適切な調製ステップを実行した後、(vi)表面を緩衝液と接触させて、表面が確実に溶液中にあるようにしてもよい。
そのようなステップ(i)から(v)は、表面の照明の前に実行されうる。
表面をサンプルと接触させ、(i)から(v)などの適切な調製ステップを実行した後、(vi)表面を緩衝液と接触させて、表面が確実に溶液中にあるようにしてもよい。
ステップ(i)から(vi)のいずれも、検出ステップの前に任意の適切な順序で実施されうる。
本発明の方法は、表面の光散乱のベースライン測定を実行することをさらに含んでいてもよい。そのようなステップは、上記のステップi)からiv)のいずれか1つまたは複数の後に実行されてもよい。ベースライン測定値は、対照測定値として働きうる。ベースライン測定は、光散乱によって、表面に固定化された対象物に関する情報を提供しうる。ベースライン測定を使用して、補正を可能とするための表面からの光散乱を決定してもよい。さらに、ベースライン測定は、ランダムな放出イベントの測定値を提供し、それを超えると放出イベントが特異的であり、検出の価値があると予想されるベースラインを提供しうる。
本発明の方法は、表面の光散乱のベースライン測定を実行することをさらに含んでいてもよい。そのようなステップは、上記のステップi)からiv)のいずれか1つまたは複数の後に実行されてもよい。ベースライン測定値は、対照測定値として働きうる。ベースライン測定は、光散乱によって、表面に固定化された対象物に関する情報を提供しうる。ベースライン測定を使用して、補正を可能とするための表面からの光散乱を決定してもよい。さらに、ベースライン測定は、ランダムな放出イベントの測定値を提供し、それを超えると放出イベントが特異的であり、検出の価値があると予想されるベースラインを提供しうる。
本発明の方法は、複数の測定ステップを含んでいてもよく、それらは、表面が光散乱装置内に存在するようになった後、すなわち、上記の必要な全ての準備ステップが実行された後に始められうる。したがって、測定は、上記のステップ(iii)の後の任意の時点で始められうる。これらの複数の測定値は離散的(例えば、時間間隔)であってもよく、また、測定値は実質上、連続的であってもよい(フィルムを生成するために一定のレートで行われる測定 - 後述)。複数の測定は、表面における対象物の質量の決定を可能とし、したがって、前記対象物からの粒子の放出を検出する。よって、これは放出イベントの検出を可能とする。したがって、放出イベントの検出は、放出イベントの前後における対象物の質量を検出し、その対象物の質量の差異を計算するとして説明されうる。よって、特異的な対象物が、質量の変化についてモニタリングされる。したがって、対象物のシグナルの大きさの変化が検出される。
本発明の方法は、既知の数の放出イベントを有する対照分子を使用して検量線を生成することをさらに含みうる。
本発明の第1の態様の方法は、サンプル中のバイオマーカーを検出または定量化するために有用でありうる。
本発明の第1の態様の方法は、サンプル中のバイオマーカーを検出または定量化するために有用でありうる。
第1の態様の方法は、生体分子の修飾、例えば、タンパク質の翻訳後修飾または核酸のメチル化状態を検出するのに有用でありうる。修飾された生体分子は、バイオマーカーでありうる。
第1の態様の方法は、サンプル中の2つ以上の生体分子間の相互作用を検出するのに有用でありうる。生体分子間の複合体は、バイオマーカーでありうる。
第1の態様の方法は、サンプル中の2つ以上のバイオマーカーの量を比較するのに有用でありうる。
第1の態様の方法は、サンプル中の2つ以上のバイオマーカーの量を比較するのに有用でありうる。
また、バイオマーカーの存在がサンプルの汚染を指し示す第1の態様の方法を含む、サンプル、例えば細胞培養物または食品調製サンプル中の汚染を検出する方法も提供される。
また、第1の態様の方法を含む、産物の発現レベルを定量化する方法であって、バイオマーカーが発現産物の存在または非存在を指し示す方法も提供される。
また、バイオマーカーの存在または量が相互作用の有無または量を指し示す第1の態様の方法を含む、サンプル中の生体分子間の相互作用を検出または定量する方法も提供される。そのような方法は、バイオマーカーの存在または活性に影響を与える化合物の存在または量を検出するのに有用でありうる。
また、バイオマーカーの存在または量が相互作用の有無または量を指し示す第1の態様の方法を含む、サンプル中の生体分子間の相互作用を検出または定量する方法も提供される。そのような方法は、バイオマーカーの存在または活性に影響を与える化合物の存在または量を検出するのに有用でありうる。
第2の態様では、本発明は、対象におけるバイオマーカーの存在、非存在または量に関連する疾患もしくは状態を診断する方法であって、表面上に固定されたバイオマーカーに対する捕捉剤を含む表面をサンプルと接触させるステップ、捕捉されたバイオマーカーを表面から放出させるステップ、および光散乱によってバイオマーカーの放出を検出するステップを含む方法を提供する。量は、別のバイオマーカーと比較した相対量でありうる。
適切には、対象におけるバイオマーカーの存在または量に関連する疾患もしくは状態を診断する方法は、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義するステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
V)光散乱により、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、ここでi)またはii)の存在または非存在が、対象における疾患もしくは状態の存在、重症度、または発症の可能性を指し示す。
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義するステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
V)光散乱により、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、ここでi)またはii)の存在または非存在が、対象における疾患もしくは状態の存在、重症度、または発症の可能性を指し示す。
粒子は、表面で散乱する光の変化を検出することによって検出される。したがって、放出イベントは、少なくとも2つの測定イベント;放出イベントの前と後における表面の1回の測定を必要としうる。
適切には、対象におけるバイオマーカーの存在または量に関連する疾患もしくは状態を診断する方法は、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義し、光散乱を使用して表面の測定を行うステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
VI)光散乱の変化を決定することにより、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、ここでi)またはii)の存在または非存在が、対象における疾患もしくは状態の存在、重症度、または発症の可能性を指し示す。
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義し、光散乱を使用して表面の測定を行うステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
VI)光散乱の変化を決定することにより、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、ここでi)またはii)の存在または非存在が、対象における疾患もしくは状態の存在、重症度、または発症の可能性を指し示す。
表面の測定は、表面における対象物の測定であってもよい。表面は好ましくは単一の表面である。表面の性質は行われる測定とは無関係であるため、表面は任意の適切な構造でありうる。実施例では、表面は平らなガラスカバースリップである。
適切には、サンプル中のバイオマーカーの存在または量に関連する汚染の有無の決定を行う方法は、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義するステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下から選択される、ステップ:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤;
V)光散乱により、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、ここでi)またはii)の存在または非存在が、汚染の存在、重大性、または性質を指し示す。
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義するステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下から選択される、ステップ:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤;
V)光散乱により、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、ここでi)またはii)の存在または非存在が、汚染の存在、重大性、または性質を指し示す。
粒子は、表面で散乱する光の変化を検出することによって検出される。したがって、放出イベントは、少なくとも2つの測定イベント;放出イベントの前と後における表面の1回の測定を必要としうる。
適切には、サンプル中のバイオマーカーの存在または量に関連する汚染の有無の決定を行う方法は、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義し、光散乱を使用して表面の測定を行うステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下から選択される、ステップ:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤;
V)光散乱の変化を決定することにより、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、ここでi)またはii)の存在または非存在が、汚染の存在、重大性、または性質を指し示す。
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義し、光散乱を使用して表面の測定を行うステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下から選択される、ステップ:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤;
V)光散乱の変化を決定することにより、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、ここでi)またはii)の存在または非存在が、汚染の存在、重大性、または性質を指し示す。
表面の測定は、表面における対象物の測定であってもよい。表面は好ましくは単一の表面である。表面の性質は行われる測定とは無関係であるため、表面は任意の適切な構造でありうる。実施例では、表面は平らなガラスカバースリップである。
これらの方法のいずれも、またはいずれかにおける光散乱法は、干渉散乱顕微鏡法またはマスフォトメトリーでありうる。
これらの方法のいずれも、またはいずれかにおける光散乱法は、干渉散乱顕微鏡法またはマスフォトメトリーでありうる。
表面をサンプルと接触させた後に表面を洗浄する任意選択のステップが含まれていてもよい。適切な洗浄条件は、本明細書に記載されている。
検出ステップの前に、表面を溶液と接触させる前に、表面を乾燥させる任意選択のステップが含められてもよい。
検出ステップの前に、表面を溶液と接触させる前に、表面を乾燥させる任意選択のステップが含められてもよい。
本発明の方法は、表面の光散乱のベースライン測定を実行することをさらに含んでいてもよい。そのようなステップは、上記のステップ(II)の後に実行されうる。ベースライン測定値は、対照測定値として働きうる。ベースライン測定は、光散乱によって、表面に固定化された対象物に関する情報を提供しうる。さらに、ベースライン測定は、ランダムな放出イベントの測定値を提供し、それを超えると放出イベントが特異的であり、検出の価値があると予想されるベースラインを提供しうる。
本明細書で使用する場合、対象物は、関連するバイオマーカーを含む、または含まない捕捉剤、さらにはサンプルからの他の成分など、表面におけるあらゆる対象物でありうる。
本発明の方法は、任意の適切な内部標準または対照を含みうる。内部対照は、相対濃度を決定するために使用されうる。本発明の方法は、任意の適切な内部較正物質を含みうる。
本方法は、サンプル中のバイオマーカーの濃度を決定するために使用されうる。したがって、本方法は、捕捉剤から放出されたバイオマーカーの量および/または固定化された表面から放出されたバイオマーカー/捕捉剤複合体の量を測定することを含みうる。バイオマーカーの量は、疾患もしくは状態の進行または重症度の指標として使用されうる。
捕捉剤からのバイオマーカーの放出、および/またはバイオマーカー/捕捉剤複合体もしくは結合していない捕捉剤の表面からの放出は、本明細書に記載のとおりであり、第1の態様に関連しうる。
第2の態様の方法は、本明細書に記載されるように、特に第1の態様に対して1つまたは複数の追加のステップを含んでいてもよい。
第2の態様の方法は、対象が前記疾患もしくは状態を発症するリスクを決定するために使用されうる。
第2の態様の方法は、対象が前記疾患もしくは状態を発症するリスクを決定するために使用されうる。
第2の態様の方法は、物質もしくは組成物が投与される対象、または治療もしくは投薬レジメンが処方される対象を選択するのに好適でありうるが、ここで、前記物質もしくは組成物またはレジメンは、対象からのサンプル中のバイオマーカーの存在または量に関連する疾患もしくは状態を治療または予防するのに適している。サンプル中のバイオマーカーの存在または非存在または量が、疾患もしくは状態の存在またはその発症可能性を指し示す場合、対象は、物質もしくは組成物の投与、または治療もしくは投薬レジメンのために選択されうる。
また、第2の態様は、対象において、第2の態様に従って、疾患もしくは状態を有するか、または前記疾患もしくは状態を発症する可能性があると診断された対象における疾患もしくは状態を治療または予防する方法であって、方法が、対象における前記疾患もしくは状態を治療または予防するのに有効な、物質もしくは組成物を対象に投与するステップ、またはレジメンを対象に実施するステップを含む、方法も提供する。
また、対象において、第2の態様に従って、疾患もしくは状態を有するか、または前記疾患もしくは状態を発症する可能性があると診断された対象における疾患もしくは状態を治療または予防する方法における使用のための物質または組成物も提供される。
また、バイオマーカーの存在、非存在または量に関連する疾患もしくは状態の治療または予防のための医薬品の製造における物質または組成物の使用も提供されるが、ここで、対象は、第2の態様に従う方法において、疾患もしくは状態または前記疾患もしくは状態を発症する可能性があると診断されている。
第3の態様では、本発明の第1または第2の態様の方法を実施するのに適した手段を含むキットが提供される。キットは、適切な表面、捕捉剤、緩衝液、較正チャート、本発明の方法に従う使用のための説明書、サンプル収集デバイス、および本明細書に記載のバイオマーカーまたは捕捉剤の放出を媒介するための薬剤、および較正用の1つまたは複数の標準バイオマーカーサンプルから選択される1つまたは複数のアイテムを含みうる。
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して以下にさらに説明される。
本発明者らは、サンプル中のバイオマーカーを検出するために、単一粒子光散乱、好ましくは単一粒子干渉散乱顕微鏡法またはマスフォトメトリーを使用する方法を同定した。特に、本発明者らは驚くべきことに、光散乱顕微鏡法を利用して複雑なサンプル中の存在量の少ないバイオマーカーを検出することが可能であることを見出した。典型的には、当技術分野では、存在量が少なくても、バイオマーカーの検出は、支持体または抗体もしくは受容体タンパク質などの結合パートナーのいずれかへの結合イベントを検出することによって行われる。本発明は、複雑なサンプル中の存在量の少ないバイオマーカーの検出に適した高度に特異的かつ感度の高いアッセイを初めて提供する、本発明者らにより採用された新規のアプローチに基づいている。結合イベントを検出するのではなく、本発明者らは、バイオマーカーが結合している表面からバイオマーカーを放出させ、光散乱顕微鏡法を使用して放出を検出することにより、存在量の少ないバイオマーカーが特異的かつ高感度に検出され得ることを見出した。したがって、本発明は、表面からの粒子の結合解除または放出を検出する新規のアプローチに基づいている。
そのような方法は、サンプル中の任意のバイオマーカーの検出に使用でき、例えば、医療診断、工業プロセス、および品質管理の方法において多数の用途を有する。適切には、本発明の方法は、本発明の第1および第2の態様に記載されているとおりである。また、本発明の第3の態様に記載のキットも提供される。
以下の用語は、本出願の目的のために、以下に提供されるような意味を有する。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
サンプル
サンプルは、生物学的、工業的、または環境サンプルのいずれであってもよい。サンプルは、単純な溶液でも複雑な溶液でもよい。生物学的試料は、ヒトまたは動物の身体または個体から採取または取得されたサンプル、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、リンパ液、汗、羊水、脳脊髄液、母乳、涙、分泌物、滑液、精液、胆汁、または粘液、肺液サンプル;および便サンプルを含む。体液は、毛細血管、静脈血もしくは動脈血、またはそれらからの血漿もしくは血清でありうる。適切には、フィンガープリックに由来する血液のサンプルなどの血液サンプルが、本発明の方法において使用されうる。特定の実施形態では、唾液のバッカルスワブ(Buccal swab)などの唾液サンプルが使用されてもよい。体液は、電解質、糖および尿素を含む、多数の溶質が存在する複雑な溶液の例である。生物学的サンプルは、臨床サンプルであってもよい。生物学的サンプルは、ヒトまたは動物の体または個体から得られた組織サンプルでありうる。生物学的サンプルは、細胞培養サンプル、例えば、ファージ培養を含む細菌またはウイルス培養でありうる。生物学的サンプルは、in vitroの供給源からのものであってもよい。サンプルは、組織のホモジナイゼーションおよび細胞溶解などの標準的な手法を使用して、分析の前に調製されうる。
サンプルは、生物学的、工業的、または環境サンプルのいずれであってもよい。サンプルは、単純な溶液でも複雑な溶液でもよい。生物学的試料は、ヒトまたは動物の身体または個体から採取または取得されたサンプル、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、リンパ液、汗、羊水、脳脊髄液、母乳、涙、分泌物、滑液、精液、胆汁、または粘液、肺液サンプル;および便サンプルを含む。体液は、毛細血管、静脈血もしくは動脈血、またはそれらからの血漿もしくは血清でありうる。適切には、フィンガープリックに由来する血液のサンプルなどの血液サンプルが、本発明の方法において使用されうる。特定の実施形態では、唾液のバッカルスワブ(Buccal swab)などの唾液サンプルが使用されてもよい。体液は、電解質、糖および尿素を含む、多数の溶質が存在する複雑な溶液の例である。生物学的サンプルは、臨床サンプルであってもよい。生物学的サンプルは、ヒトまたは動物の体または個体から得られた組織サンプルでありうる。生物学的サンプルは、細胞培養サンプル、例えば、ファージ培養を含む細菌またはウイルス培養でありうる。生物学的サンプルは、in vitroの供給源からのものであってもよい。サンプルは、組織のホモジナイゼーションおよび細胞溶解などの標準的な手法を使用して、分析の前に調製されうる。
サンプルが環境サンプルである場合、それは、水(例えば、井戸、小川、川、湖、雨水、海水など)、または下水道、農業排水などの廃棄物などの任意の供給源から採取されうる。
工業サンプルは、食品および飲み物(例えば飲料)、農業サンプル、または工場および製造プロセスからの液体サンプルが採取されてもよい。工業サンプルは、細胞調製物などの生物学的汚染をチェックするためのバイオリアクターおよび実験室からのサンプルも含みうる。
本発明の方法またはデバイスによって、異なる種類のサンプルが同時に、連続的に、または別々に処理されうる。特定の実施形態では、1種類のサンプルのみが一度に使用されうる。別の実施形態では、2つ以上のサンプルが統合され、または組み合わされて、同じ方法で使用されうる。
サンプルは、細胞溶解、細胞片の除去、または他の診断手法で一般的に行われている他の前処理など、ルーチン的な前処理を必要とする場合がある。したがって、本発明の方法は、使用のためにサンプルを調製することを含みうる。サンプルはまた、例えば適切な緩衝液での希釈も必要としうる。典型的には、適切な緩衝液は生理学的なpHおよび塩濃度を有する。
本発明の方法は、任意の適切な方法を使用して対象から、または工業または環境の供給源からサンプルを取得するステップを含みうる。適切な方法は、当技術分野で知られており、唾液、痰または尿の採取、スワブ検査、フィンガープリック検査、針による動脈血または静脈血のサンプリング、腰椎穿刺、肺吸引、生検、羊水穿刺、穿刺、または喉頭穿刺を含みうる。
本発明の方法は、細胞培養物から、または工業プロセスから、または環境からサンプルを取得するステップを含んでいてもよい。本発明の方法は、下水のサンプルを得るステップを含んでいてもよい。
光散乱によるバイオマーカーの検出に必要なサンプルの量は最小限であり、サンプルの種類および収集の手段によっては、わずか1マイクロリットル程度にもなりうる。
サンプルは、任意の適切なサンプルチャンバーにおいて収集または提供されうる。適切なチャンバーは、試料容器、バイアル、ボトル、アンプル、試験管、エッペンドルフチューブ、微量遠心管、キャピラリーチューブまたはバッグでありうる。本発明の方法は、サンプルの保存を含んでいてもよい。本発明の方法は、サンプルまたはその一部を、本発明の方法が実施される表面に移すことを含みうる。
サンプルは、任意の適切なサンプルチャンバーにおいて収集または提供されうる。適切なチャンバーは、試料容器、バイアル、ボトル、アンプル、試験管、エッペンドルフチューブ、微量遠心管、キャピラリーチューブまたはバッグでありうる。本発明の方法は、サンプルの保存を含んでいてもよい。本発明の方法は、サンプルまたはその一部を、本発明の方法が実施される表面に移すことを含みうる。
対象
「対象」という用語は、「個体」および「患者」という用語と交換可能に使用されてもよく、動物対象、適切には脊椎動物対象、さらにより適切には哺乳動物対象を指しうる。適切な脊椎動物は、霊長類、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ウサギ目(例えば、ウサギ、ノウサギ)、ウシ(例えば、畜牛)、ヒツジ(例えば、緬羊)、ヤギ(例えば、山羊)、ブタ(例えば、豚)、ウマ(例えば、馬)、イヌ(例えば、犬)、ネコ(例えば、猫)、鳥類(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、カナリア、セキセイインコなどのコンパニオンバード)、海洋哺乳類(例えば、イルカ、クジラ)、爬虫類(ヘビ、カエル、トカゲなど)、および魚を含む脊索動物亜門の任意の一員を含むが、これらに限定はされない。好ましい対象は霊長類(例えば、ヒト、類人猿、サル、チンパンジー)である。
「対象」という用語は、「個体」および「患者」という用語と交換可能に使用されてもよく、動物対象、適切には脊椎動物対象、さらにより適切には哺乳動物対象を指しうる。適切な脊椎動物は、霊長類、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ウサギ目(例えば、ウサギ、ノウサギ)、ウシ(例えば、畜牛)、ヒツジ(例えば、緬羊)、ヤギ(例えば、山羊)、ブタ(例えば、豚)、ウマ(例えば、馬)、イヌ(例えば、犬)、ネコ(例えば、猫)、鳥類(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、カナリア、セキセイインコなどのコンパニオンバード)、海洋哺乳類(例えば、イルカ、クジラ)、爬虫類(ヘビ、カエル、トカゲなど)、および魚を含む脊索動物亜門の任意の一員を含むが、これらに限定はされない。好ましい対象は霊長類(例えば、ヒト、類人猿、サル、チンパンジー)である。
対象は、疾患もしくは状態の1つまたは複数の症状を患っている個体でありうる。対象は、疾患もしくは状態に対する素因、または特定の疾患もしくは状態を発症する可能性についての試験を必要とするものとして分類された個体でありうる。
バイオマーカー
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、検出または定量化されるサンプルからの任意の生物学的特徴を指す。バイオマーカーは、分析されるサンプル中に存在しうるタンパク質およびそのフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機もしくは無機化学物質、天然ポリマー、および小分子など、実質的にあらゆる生物学的化合物でありうる。バイオマーカーは、病原性ゲノムまたはそのフラグメントなどのデオキシリボース核酸またはリボ核酸などのポリヌクレオチドであってもよい。バイオマーカーは、上記のうちの2つ以上の組み合わせまたはコンジュゲートであってもよい。本発明による検出に適したバイオマーカーは、例えば、捕捉剤を介して表面に結合または固定化されることができる。
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、検出または定量化されるサンプルからの任意の生物学的特徴を指す。バイオマーカーは、分析されるサンプル中に存在しうるタンパク質およびそのフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機もしくは無機化学物質、天然ポリマー、および小分子など、実質的にあらゆる生物学的化合物でありうる。バイオマーカーは、病原性ゲノムまたはそのフラグメントなどのデオキシリボース核酸またはリボ核酸などのポリヌクレオチドであってもよい。バイオマーカーは、上記のうちの2つ以上の組み合わせまたはコンジュゲートであってもよい。本発明による検出に適したバイオマーカーは、例えば、捕捉剤を介して表面に結合または固定化されることができる。
バイオマーカーは、1つまたは複数の生物学的プロセス、病原性プロセス、疾患、状態または治療的介入に対する反応の開始、進行、重症度、病理、攻撃性、グレード、活性、障害、死亡率、罹患率、疾患の下位分類、またはその他の根底にある特徴を測定するのに有用または潜在的に有用であり得る。本明細書で言及される診断は、そのような測定を行うことを含む。
バイオマーカーは、その可能な用途に従って、とりわけ、診断用バイオマーカー、モニタリング用バイオマーカー、薬力学/反応バイオマーカー、予測、予後、安全性および感受性/リスクバイオマーカー、および品質管理マーカーを含む異なるグループとして分類され得る(Califf, R. M. Biomarker definitions and their applications.Exp. Biol.Med.243、213~221ページ(2018年))。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、天然に存在する塩基、糖、および糖間結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「核酸」という用語はまた、同様に機能する天然に存在しないモノマーまたはその一部を含むポリマーまたはオリゴマーも含む。核酸は、DNA、RNAまたはキメラ、すなわち、デオキシおよびリボヌクレオチドの両方を含むものであり得る。バイオマーカーは、核酸の修飾された形態、例えば、そのメチル化された形態でありうる。
炭水化物は、単糖、二糖、オリゴ糖、および多糖、ならびに特定のアセチル基、アシル基またはアリール基の存在などのそれらの修飾形態を含みうる。
本明細書で使用されるタンパク質は、ペプチド、ポリペプチド、例えば、ユビキチン化、脂質化、リン酸化、アルキル化またはグリコシル化による翻訳後修飾を受けたタンパク質を含みうる。本発明の方法は、バイオマーカーが翻訳後修飾されているかどうかを決定するために使用されうる。
本明細書で使用されるタンパク質は、ペプチド、ポリペプチド、例えば、ユビキチン化、脂質化、リン酸化、アルキル化またはグリコシル化による翻訳後修飾を受けたタンパク質を含みうる。本発明の方法は、バイオマーカーが翻訳後修飾されているかどうかを決定するために使用されうる。
また、バイオマーカーは、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、および糖脂質を含む脂肪も含む。
また、薬物およびその代謝産物、ホルモン、神経伝達物質、代謝産物、およびビタミンを含むが、それらに限定はされない小分子も含まれる。
バイオマーカーとなりうる他の生体分子は、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン、およびリポタンパク質を含む。
バイオマーカーとなりうる他の生体分子は、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン、およびリポタンパク質を含む。
また、分子のクラスター、集合体、凝集体、タンパク質/タンパク質相互作用、タンパク質/小分子相互作用、タンパク質-核酸相互作用、タンパク質-糖相互作用;および/またはオリゴマー集合体も含まれる。
上記の実体のいずれかの誘導体または代謝産物もまた、バイオマーカーとみなされうる。
バイオマーカーの例は、以下を含むが、これらに限定はされない:
がん - AFP(肝臓がん)、BCR-ABL(慢性骨髄性白血病)、BRCA1/BRCA2(乳がん/卵巣がん)、BRAF V600E(メラノーマ/大腸がん)、CA-125(卵巣がん)、CA19.9(膵臓がん)、CEA(大腸がん)、EGFR(非小細胞肺がん)、HER-2(乳がん)、KIT(消化器がん)、PSA(前立腺特異抗原)、S100(メラノーマ)。
バイオマーカーの例は、以下を含むが、これらに限定はされない:
がん - AFP(肝臓がん)、BCR-ABL(慢性骨髄性白血病)、BRCA1/BRCA2(乳がん/卵巣がん)、BRAF V600E(メラノーマ/大腸がん)、CA-125(卵巣がん)、CA19.9(膵臓がん)、CEA(大腸がん)、EGFR(非小細胞肺がん)、HER-2(乳がん)、KIT(消化器がん)、PSA(前立腺特異抗原)、S100(メラノーマ)。
心血管疾患 - 心不全および/または心不全増悪の診断のためのBNPおよびNT-proBNP;急性冠症候群が疑われる患者の診断およびリスク層別化のためのトロポニン;心血管疾患、心臓発作および脳卒中のリスク評価のためのCRP;冠動脈心疾患のリスクを予測するためのMPOの循環レベル(Huangら、Dis.Markers 2017年、2~4ページ(2017年);Truemperら、Biomarkers Cardiovasc.Dis.27、1~20ページ(2015年)。
自己免疫疾患 - 広範なバイオマーカーが知られており、この分野で利用可能であり、例えば、Norouziniaら、Gastroenterol. Hepatol. from Bed to Bench 10、155~167ページ(2017年);Jin, F.ら、Front.Immunol.9、1~9ページ(2018年);Shi, G.ら、J. Immunol.Res. 2017年、1~2ページ(2017年);Prince, H. E.ら、Biomarkers 10 Suppl 1、44~49ページ(2005年))においてレビューされている。
細菌感染 - CRP、白血球(WBC)数、多形核(PMN)白血球数およびPCT。
ウイルス感染症(例えば、エプスタイン-バーウイルスの初期段階または急性HIV感染)は、CD64およびCD169を測定することで細菌感染症と区別され得る。
ウイルス感染症(例えば、エプスタイン-バーウイルスの初期段階または急性HIV感染)は、CD64およびCD169を測定することで細菌感染症と区別され得る。
肝障害 - アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびガンマグルタミルトランスフェラーゼの血清レベル。
適切には、バイオマーカーおよび/またはバイオマーカー/結合剤複合体は、本発明による検出のために標識されていない。したがって、捕捉剤についてもバイオマーカーについても、いかなる形式の標識も含める必要はない。したがって、本発明の方法は、標識を用いないものとして説明されうる。
バイオマーカーは、サンプル中に低濃度または非常に低濃度で存在しうる。サンプルは、高濃度と低濃度の両方のバイオマーカーの複雑な混合物であってもよく、ここで、後者は、その濃度レベルが、1ミリリットルあたりマイクログラムのレベルから、1ミリリットルあたりピコグラムの範囲の濃度;下は1ミリリットルあたりフェムトグラムのレベルまで変動しうる。
ここで、バイオマーカーは、予め定義された2つ以上のバイオマーカーのセットを含んでいてもよい。セットは、2、3、4、5、10、または20以上のバイオマーカーを含みうる。この予め定義されたバイオマーカーのセットは、例えば、同じ疾患/状態に関連していてもよく、1回の検査を用いて完全な診断または予後が可能となるように、パネルとして説明されうる。任意の多重化されたセットでは、異なる捕捉剤に対して異なる放出メカニズムを使用することが可能である。
表面
本発明で使用するための表面は、サンプル中のバイオマーカーの濃縮のために官能化されていてもよく、選択された検出方法に適合する任意の適切な表面でありうる。適切な表面は、捕捉剤をその上に結合または固定化することが可能であってもよい。
本発明で使用するための表面は、サンプル中のバイオマーカーの濃縮のために官能化されていてもよく、選択された検出方法に適合する任意の適切な表面でありうる。適切な表面は、捕捉剤をその上に結合または固定化することが可能であってもよい。
表面は、1つ以上の検出領域を含みうる。検出領域は、任意の適切なサイズおよび形状でありうる。適切には、検出領域は、光散乱顕微鏡によって同時に、または単一の観察イベントで分析できる領域である。検出領域のサイズおよび形状は、光散乱中に照射される領域のサイズおよび形状、したがって使用される顕微鏡の種類によって導かれてもよい。表面は、複数の検出領域を含みうる。表面上に複数の検出領域が提供される場合、それらは隣接していてもよいし、重なり合っていてもよい。複数の検出領域が提供される場合、それらは互いに間隔をあけて配置されうる。表面は、1、2、3、4、5、10、20、50、70、100、500、または1000以上の検出領域を含みうる。
好ましくは、表面は平面または実質的に平面である。表面は、湾曲していてもよいし、何らかの曲率を含んでいてもよく、例えば、実質的に平面である表面に凹状の窪みまたは凸状の構造を有していてもよい。小さな球状の対象物はそれ自体で光散乱を引き起こし、放出イベントの質量の正確な測定を妨げるため、表面はナノ粒子の表面ではないことが好ましい。ナノ粒子または超微粒子は通常、直径1から100ナノメートル、場合により直径1から60ナノメートル、場合により直径50ナノメートル未満の物質の粒子として定義される。したがって、直径が60μm以下、場合により50μm以下、場合により40μm以下の小さな球状粒子は、本発明による表面としては、場合により使用されない。実質的に平坦な表面が好ましい場合がある。
検出領域は、事前に定義されうる。あるいは、方法の実行中に検出領域が定義されてもよい。例えば、検出領域は、放出剤によって接触される領域によって完全にまたは部分的に定義されるように、表面上の放出剤の流れによって定義されてもよい。検出領域は、放出剤の濃度によって定義されてもよい。検出領域は、光分解照明の照明領域によって定義されてもよい。別の放出メカニズムが選択された場合、放出と観察領域の間の相互作用が、検出領域を決定するであろう。
表面は適切には固体である(すなわち、ゲルでも液体でもない)。適切には、表面の検出領域は、紫外線(本明細書では10nmから380nmの範囲の波長を有すると定義されうる);可視光(本明細書では380nmから740nmの範囲の波長を有すると定義されうる);および/または赤外線(本明細書では740nmから300μmの範囲の波長を有すると定義されうる)の透過を可能にする。適切には、検出領域は、可視光スペクトルの光の透過を可能にする。適切には、検出領域は実質的に透明である。
表面の検出領域は、平滑であってもよいし、テクスチャがあってもよい。テクスチャのある表面、例えば、メッシュまたは編物もしくは織物は、検出領域の結合能力を高めうる。検出領域を除いた残りの表面は、平滑であってもよいし、テクスチャがあってもよく、また、検出領域と同じであっても異なっていてもよい。滑らかな表面が好ましい。
表面またはその検出領域は、例えば、ガラス、ダイヤモンド、プラスチック、高分子材料(例えば、環状オレフィンコポリマー、ポリビニル、例えば、ポリエチレンテレフタレート(PET)および高密度ポリエチレン(HDPE)および低密度ポリエチレン(LDPE)を含むポリエチレン(PE)、ポリアクリレート(アクリル)、ハイインパクトポリスチレン(HIPS)を含むポリスチレン(PS)、シリコン、ポリエステル(例えば、ポリ乳酸(PLA)またはポリ乳酸コグリコール酸(PGLA))、ポリウレタン、ポリプロピレン(PP)、ポリアミド(ナイロン)、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)、ポリエチレン/アクリロニトリルブタジエンスチレン(PE/ABS)、ベークライト、ゴム、ラテックス、ポリカーボネート(PC)、ポリカーボネート/アクリロニトリルブタジエンスチレン(PC/ABS)、および例えば、ポリ塩化ビニリデン(PVDC)を含むポリ塩化ビニル、およびサファイアを含むが、限定はされない、任意の適切な材料のものでありうる。
表面の任意の2つ以上の検出領域は、材料、テクスチャ、サイズ、形状、および官能化の1つまたは複数に関して、同じであっても異なっていてもよい。
表面は、任意の適切な幾何学的形状を有しうる。例えば、表面は、カバースリップなどの平板を含んでもよく、またはウェル、プレート、チャネル、容器、フローセル、フローチャンバー、マイクロ流体セルもしくはチャンバー、またはスライドであってもよい。表面は、より大きな幾何学的形状またはデバイスの一部であってもよい。適切な表面は、ガラスカバースリップまたはプラスチックカバースリップであってもよく、ここで、プラスチックは表面に関して上述したとおりである。
表面は、任意の適切な幾何学的形状を有しうる。例えば、表面は、カバースリップなどの平板を含んでもよく、またはウェル、プレート、チャネル、容器、フローセル、フローチャンバー、マイクロ流体セルもしくはチャンバー、またはスライドであってもよい。表面は、より大きな幾何学的形状またはデバイスの一部であってもよい。適切な表面は、ガラスカバースリップまたはプラスチックカバースリップであってもよく、ここで、プラスチックは表面に関して上述したとおりである。
表面は、好ましくはサンプルホルダーの一部を構成する。前記サンプルホルダーは、光散乱顕微鏡の要素であってもよい。サンプルホルダーは、高表面積対体積のチャンバーであってもよい。
表面または実際のところ検出領域は、官能化されていてもよい。表面または検出領域は、不動態化、活性化、コーティング、処理、または誘導体化されていてもよい。表面は、不動態化された表面であってもよい。不動態化は、化学反応性を高めるか、または低下させるために表面を処理またはコーティングし、結合イベントの数を増加または減少させるプロセスである。当業者は、適切な不動態化剤を認識しており、その例には、BSA、PVPA、DDSおよび/またはPEGが含まれる。表面上の単層および二重層などの脂質層の使用が企図される。あるいは、表面は不動態化されていない。
表面がコーティング、誘導体化、または修飾されている場合、薄い表面の変更が望ましい場合がある。厚すぎる変更された表面層は、表面の光散乱特性を変え得る。最も外側のいくつかの分子層(3~10nm)のみの変更が望ましい場合がある。
表面または検出領域は、そこへの捕捉剤の結合を可能にするために、活性化、コーティング、処理および/または誘導体化されうる。表面または検出領域の官能化は、サンプルからのバイオマーカーの選択を可能とし、表面上のバイオマーカーを効果的に濃縮する。検出領域の官能化は、i)非特異的結合を防止するために表面を修飾すること、ii)捕捉剤を結合できるように表面を修飾すること、およびiii)修飾された表面に捕捉剤を結合させることを含みうる。適切には、検出領域に結合した捕捉剤は、バイオマーカーとの結合のために機能的に配向されることになる。官能化は、化学的(例えば、共有結合)または物理的(例えば、吸着)でありうる。
捕捉剤の結合を可能にするために、任意の適切な表面コーティングが適用されうる。適切な方法およびコーティングは公知で、当業者に利用可能であり、例えば、官能化PEG、シラン、アミン、アミノシラン、APTESなどのアミン修飾試薬を用いたアルデヒド修飾、例えばGOPTSを用いたエポキシ修飾、例えばEDC、NHS、HOBt、TBTU、PAMAMを用いたカルボン酸修飾;例えばNaNO2を用いたジアゾ、および例えばカリックスアレーンといった超分子を含むが、これらに限定はされない。捕捉剤を表面上に固定化するための適切な方法は、当技術分野で公知であり、利用可能である。
捕捉剤の結合を可能にするために表面または検出領域が本明細書に記載のようにして官能化される場合、捕捉剤の官能化または結合は、本明細書に記載のバイオマーカーを検出する能力を有意に変化させない。適切には、官能化プロセスおよび/または捕捉剤の結合は、表面の処理された検出領域を通る光透過に実質的に影響を及ぼさない。
表面の官能化は、化学的相互作用(例えば共有結合)または物理的相互作用(例えば吸着)などの捕捉剤との様々な相互作用を可能にすることでありうる。捕捉剤は、アミンまたはカルボキシル基などの遊離反応基を介して表面の官能基と化学的に反応して、共有結合の形成をもたらし、捕捉剤が固定されうる。また、疎水性結合、水素結合、ファンデルワールス結合、イオン結合および配位結合の結合型も、静電相互作用とともに、捕捉剤と表面の間で生じうる。これらの種類の相互作用は、温度およびpHの変化が捕捉剤と表面との相互作用を変化させ、条件が変化したときに捕捉剤の放出を可能にするなど、条件によって特に影響を受ける可能性がある。
疎水性コーティングが表面に適用され得るため、その疎水性を変えるために表面が処理されてもよい。これにより、捕捉剤の固定化が可能になりうる。例えば、タンパク質および脂質は、非極性基および極性基にそれぞれ引き付けられる疎水性基および親水性基の両方を有するため、両親媒性高分子と説明されうる。これは、捕捉剤の固定化を可能にするために使用されうる。
捕捉剤を表面に固定するための手段は、放出イベントの要件に基づいて選択され得る。例えば、捕捉剤を永久的に固定化することができ、放出剤を使用してバイオマーカーをバイオマーカーから選択的に放出させることができる場合、放出イベント中にバイオマーカーのみが放出されるように、表面を官能化して永久的な固定化を可能にすることができる。あるいは、捕捉剤が捕捉剤に対して高い親和性を有する場合、固定化の方法は、pHの変化など、放出剤を使用して捕捉剤(および結合したバイオマーカー)が放出されうるように選択されうる。
固定化を可能にするために、表面は、捕捉剤の結合パートナーを含むように修飾または官能化されてもよい。例示されているように、表面をPEGおよびビオチン化PEGでコーティングすることによって、ビオチンが表面に固定化され得る。次いで、捕捉剤としてのストレプトアビジンは、ビオチンに対するその結合親和性を使用して固定化されうる。ストレプトアビジンはホモ四量体であるため、サンプル中のビオチン化バイオマーカーを捕捉するために、ビオチンの結合部位をなおも提示することができる。
捕捉剤
サンプルから目的のバイオマーカーを捕捉するために、任意の適切な捕捉剤が、表面の検出領域に固定化されうる。適切な捕捉剤は、目的のバイオマーカーに特異的に結合できるものである。特異的な結合とは、捕捉剤が、検出されるバイオマーカーに対して、同じ条件下で他の分子に結合するよりも高い親和性で結合することを意味する。特異的な結合は一般に1μM以下、例えば、500nM以下、400nM以下、300nM以下、250nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、10nM以下、または1nM以下の解離定数によって指し示される。
サンプルから目的のバイオマーカーを捕捉するために、任意の適切な捕捉剤が、表面の検出領域に固定化されうる。適切な捕捉剤は、目的のバイオマーカーに特異的に結合できるものである。特異的な結合とは、捕捉剤が、検出されるバイオマーカーに対して、同じ条件下で他の分子に結合するよりも高い親和性で結合することを意味する。特異的な結合は一般に1μM以下、例えば、500nM以下、400nM以下、300nM以下、250nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、10nM以下、または1nM以下の解離定数によって指し示される。
捕捉剤は、検出されるバイオマーカーを特異的に認識する抗体または抗体フラグメントでありうる。捕捉剤は、タンパク質または非タンパク質標的(低分子バイオマーカーなどのリガンドに特異的に結合するタンパク質、またはタンパク質バイオマーカーに結合する受容体など)に結合するタンパク質、ペプチドまたはペプチドミメティックでありうる。捕捉剤は、アプタマーまたはリボザイムなどの核酸であってもよい。捕捉剤は、相補配列にハイブリダイズできる核酸であってもよい。捕捉剤は、バイオマーカーに特異的に結合する多糖、脂質、リポ多糖、テイコ酸、またはリポテイコ酸であってもよい。捕捉剤は、抗体もしくはそのフラグメント、または受容体であるバイオマーカーに特異的に結合する抗原またはリガンドであってもよい。捕捉剤は、天然に存在するか、または組換え、もしくは合成でありうる。捕捉剤は、全体的に天然に存在していなくてもよく、天然に存在するその一部と、組換えまたは非天然に存在するフラグメントまたはその一部を含んでいてもよい。
検出領域は、任意の適切な数の捕捉剤を含みうる。捕捉剤の数は、検出されるバイオマーカーの種類と存在量に依存しうる。検出領域は、目的のバイオマーカーに特異的な1,000個以上、または10,000個以上、または10万個以上、または50万個以上、または100万個以上の捕捉剤を含みうる。
バイオマーカーと捕捉剤との間の結合は、水素結合、ファンデルワールス力、静電力、疎水性力などのうちの1つまたは複数といった非共有結合でありうる。しかしながら、相互作用または結合は共有結合でもあり得る。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」または「抗体(複数)」は、完全な免疫グロブリン、またはFc(結晶化可能フラグメント)領域もしくはFc領域のFcRn結合フラグメントを有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗原結合部分を指す。「抗体」という用語はまた、抗体の一部、例えば抗原結合部分などの「抗体様分子」も含む。抗原結合部分は、組換えDNA技術によって、または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって生成され得る。「抗原結合部分」は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dAb、および相補性決定領域(CDR)フラグメント、一本鎖抗体(scFv)、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドに特異的な抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。また、本明細書に記載の目的のために、線状の抗体も含まれる。抗体は改変されていてもよい。
核酸捕捉剤は、アプタマーなど、配列に依存しない方法でバイオマーカーに特異的に結合することができる薬剤であってもよい。アプタマーは一般に、結合可能なコンフォメーションを得る短い核酸配列である。結合できる他の核酸は、リボザイムなどを含む。
核酸捕捉剤は、検出されるバイオマーカーに特異的に結合する能力を有する、本明細書で定義される核酸でありうる。核酸捕捉剤は、非特異的配列と特異的配列の組み合わせを含みうる。核酸捕捉剤は、天然に存在するか、または組換えでありうる。核酸捕捉剤は、検出されるバイオマーカーに特異的な1つまたは複数の結合配列を含むように設計されうる。配列の特異性は、核酸捕捉配列が核酸バイオマーカーまたはバイオマーカーの核酸部分にストリンジェントな条件下で結合するようなものでありうる。
「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸鎖がその相補的結合パートナーに優先的にハイブリダイズするか、または特異的に結合し、他の配列には低い程度で、または全く結合しない条件を指す。本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、相補的な核酸鎖間、例えば、DNAプローブとサンプル中の相補的な標的との間、またはプライマーと増幅される核酸分子との間に二重鎖が生成するのに適合し、相補的でない核酸鎖間に二重鎖が実質的に形成されない条件を指す。ストリンジェントな条件は、当技術分野で知られており、例えば、Sambrookら、2001年、Molecular Cloning:A laboratory manual、第3版、Cold Spring Harbour Laboratory Press;およびCurrent Protocols in Molecular Biology、第2章、Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley-lnterscience、New York(1995年))において定義されている。
タンパク質捕捉剤は、場合により核酸、炭水化物または脂質にコンジュゲートされたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドでありうる。タンパク質捕捉剤は、捕捉されるバイオマーカーに適した結合部位を含む。タンパク質捕捉剤の結合部位は、核酸、タンパク質、小分子、脂質または炭水化物のバイオマーカーに対して特異的な結合を示しうる。タンパク質捕捉剤の例は、受容体、転写因子、毒素、抗毒素、多糖および多糖誘導体を含む。適切なタンパク質捕捉剤は、検出されるバイオマーカーにナノモルからピコモル範囲の解離定数で結合しうる。本発明の方法は、重量による結合種の同定を可能にする手法であることから、ELISAなどの他の手法ほど高度に特異的ではない捕捉剤の使用を可能としうることに留意されたい。したがって、バイオマーカーが容易に識別可能な重量を有する場合、マイクロモル範囲の結合特異性を有する捕捉剤の使用も可能である。
バイオマーカー自体が実体に結合できる場合、例えば、抗体、酵素または受容体である場合、その捕捉剤は、抗原、基質またはリガンドなどのバイオマーカーの結合パートナーでありうる。
捕捉剤は、当技術分野で知られている任意の方法によって生成され得る。例えば、抗体は、当技術分野で周知のように、ハイブリドーマ組織培養上清または腹水から調製された抗血清中に見出すことができ、または組換え発現系から得ることができる。例えば、抗体、受容体または他の種のフラグメント、部分またはサブユニットは、化学的、酵素的または他の手段によって生成され得る。本発明はまた、捕捉剤が、組換え、キメラハイブリッド、ヒト化、霊長類化、または他の修飾された形態を含みうることも企図している。
捕捉剤は、例えば、捕捉剤として機能する生体分子の任意の適切な組み合わせを含むバイオコンジュゲートであってもよい。例えば、タンパク質と核酸の組み合わせ、または抗体-タンパク質コンジュゲート、抗体-核酸コンジュゲート。
捕捉剤は、複数の結合部位を有する結合剤でありうる。したがって、そのような捕捉剤は、その結合親和性を利用して固定化されうる。実施例では、ビオチン化PEGで表面をコーティングすることにより、ストレプトアビジンが表面に固定化され得ることが示されている。ストレプトアビジンのホモ四量体は、ビオチンに対して高い親和性を有しており(Kd≒10-14mol/L)、各サブユニットは同じ親和性でビオチンに結合する。したがって、実施例において、ビオチン化PEG上に固定化されたストレプトアビジンは、ビオチン化バイオマーカーに利用可能な結合部位をなおも有している。ストレプトアビジンは遊離ビオチンに対して最高の親和性を有するため、遊離ビオチンを放出剤として添加して、表面から粒子を放出させ、その離脱を検出することができる。
本明細書において言及される結合していない捕捉剤は、検出されるバイオマーカーに結合していない捕捉剤である。適切には、結合していない捕捉剤は、特異的にも非特異的にも、他の生体分子に結合していない。捕捉剤は、(「対象物」として)放出イベントの前に表面で測定された時点では結合していない可能性がある。したがって、バイオマーカーは捕捉剤に結合していない。
放出剤は、放出の際に捕捉剤(および存在するバイオマーカー)に結合しうる(実施例2におけるストレプトアビジンに対するビオチンなど)。検出されるのは、放出された粒子自体からのシグナルではなく、放出イベントであるため、放出後の粒子の性質は調べられない。したがって、放出剤の結合は無関係である。
捕捉剤は、酵素による消化または光分解による切断または加水分解(pHの変化)のための1つまたは複数の切断部位を含みうる。切断の際に結合したバイオマーカーが放出されるように、1つまたは複数の切断部位がバイオマーカー結合部位に提供されうる。切断時に、結合または非結合状態の捕捉剤が表面から放出されるように、1つまたは複数の切断部位が代替的または追加的に提供されていてもよい。捕捉剤を表面から放出する切断部位は、好ましくは、実質的に捕捉剤全体が表面から放出されるように、捕捉剤の表面結合部位に近接している。切断部位は、捕捉剤に天然に存在していてもよいし、または例えば、組換え技術によって人工的に導入されてもよい。切断部位は、捕捉剤に導入されるリンカー配列中に提供されうる。捕捉剤が核酸である場合、制限酵素部位などの任意のDNA切断酵素に適した配列が含められうる。
薬剤が光分解のための切断部位を含む場合、これは、捕捉剤を表面につなぐリンカーを含む、捕捉剤の任意の適切な部分に含まれ得る任意の適切な光分解部位でありうる。捕捉剤は、感光性切断のための光不安定性保護基(PPG、光除去可能、感光性、または光切断性保護基としても知られる)を含んでいてもよい。PPGは、ニトロベンジルベース、カルボニルベース、またはベンジルベースでありうる。捕捉部分に、単純な光切断可能リンカーが組み込まれてもよい。
光分解は可視光に限定されない;これは十分なエネルギーを持つ光子の使用を必要とする。そのため、紫外線、X線およびガンマ線など、可視光以上のエネルギーを持つ電磁波が通常、そのような反応に関与する。光分解性部位は、切断に使用される光が干渉光散乱用の照明源と組み合わせて使用するのに適しているように選択され得る。したがって、例えば、UV光が好ましい場合がある。光は非常に高い時空間精度で送達され得ることから、光切断部位は化学および生物科学で広く使用されている。異なる波長の光を使用して様々な捕捉剤を放出させるために、異なる光切断可能部位を使用した複数の捕捉剤が、単一の表面で使用され得る。
PPGの使用は、捕捉剤がバイオマーカーと相互作用することを妨げないことが理解されるであろう。PPGは単に、捕捉剤またはその一部の切断を可能にし、表面からそれを放出するために存在する。
加水分解は、水の分子が1つまたは複数の化学結合を破壊する化学反応である。例えば、水溶液中のペプチド中に位置するアミド結合の非酵素的な切断の速度はpHに依存的である;アルカリ性のpHは、アミド結合の切断を促進し得る。捕捉剤は、より加水分解されやすい部分を含むように設計されうる。バイオマーカーも同様に分解されないようにするには、適切な条件を選択する必要があるであろう。
適切な切断部位の例は、タンパク質/抗体の切断部位、または核酸の制限酵素部位の包含を含む。酵素による切断は、DNAまたはRNA酵素(DNAザイムまたはRNAザイム)を使用して行われてもよい。そのようなものは、標的部位での特異的な切断を可能にするように設計され得る。制限部位は当業者に周知であり、一般に(エンドヌクレアーゼについては)長さが約6から8ヌクレオチドである二本鎖ポリヌクレオチド内の特定の配列を含む。
捕捉剤は、固定化を引き起こす非共有相互作用を破壊することによって放出されうる。したがって、pHまたは温度の変化が、捕捉剤の固定化を妨害するのに十分である可能性があり、これが放出イベントとなり得る。
捕獲剤は、競合する結合パートナーを提供して、固定化された結合パートナーとの結合を破壊することにより、放出されてもよい(実施例5および図4を参照)。
捕捉剤および固定化の手段が、捕捉剤が放出剤を使用して捕捉剤が放出されるように選択される場合、本発明の方法は、バイオマーカーが放出イベントの前に表面上の捕捉剤に結合されたかどうかを決定することができる。
捕捉剤および固定化の手段が、捕捉剤が放出剤を使用して捕捉剤が放出されるように選択される場合、本発明の方法は、バイオマーカーが放出イベントの前に表面上の捕捉剤に結合されたかどうかを決定することができる。
使用される放出メカニズムに応じて、放出イベント中に捕獲剤は粒子を形成しないか、捕捉剤の一部または全部が粒子を形成しうる。
表面とサンプルの接触
一実施形態では、サンプル中に存在するバイオマーカーを表面上に固定化された捕捉剤に結合させるために、表面をサンプルと接触させる。
表面とサンプルの接触
一実施形態では、サンプル中に存在するバイオマーカーを表面上に固定化された捕捉剤に結合させるために、表面をサンプルと接触させる。
サンプルと表面を接触させるために、任意の適切な手段および方法が使用されうる。サンプルと表面との接触は、表面に対してサンプルをインキュベート、曝露、混合、または送達することを含む。接触は、特定の実施形態では、攪拌、ボルテックス、ピペッティングなどを必要としうる。接触は、サンプル中に存在するバイオマーカーと表面に固定化された捕捉剤との結合を可能にするのに十分な時間行われうる。接触時間は、捕捉剤またはバイオマーカーの結合親和性および/または濃度、その濃度、またはインキュベーション条件(例えば、温度)に応じて、任意の適切な長さであり得る。接触時間は、少なくとも約30秒、少なくとも約1分、少なくとも約5分、少なくとも約10分、少なくとも約15分、少なくとも約30分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約3時間、少なくとも約4時間、少なくとも約6時間、少なくとも約8時間、少なくとも約10時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約48時間またはそれ以上でありうる。当業者は適宜、接触時間および条件を調整することができるであろう。
適切なハイブリダイゼーション条件は当業者に知られており、バイオマーカーおよび捕捉剤の性質に依存するであろう。
洗浄
表面の調製の際に、非特異的な結合が生じる場合がある。表面に非特異的に結合する分子を除去するために、捕捉剤の固定化または目的のバイオマーカーのそれへの結合に実質的に影響を与えない適切な方法を使用して、表面が洗浄されうる。適切な洗浄緩衝液および方法は、当業者に知られており、利用可能であり、例えば、特定の所望の相互作用のみが完全なまま残ることを適切に確実にする様々な塩濃度またはマイルドな洗剤である。理想的には、洗浄ステップは、捕捉剤が固定化される条件を変えない。
表面の調製の際に、非特異的な結合が生じる場合がある。表面に非特異的に結合する分子を除去するために、捕捉剤の固定化または目的のバイオマーカーのそれへの結合に実質的に影響を与えない適切な方法を使用して、表面が洗浄されうる。適切な洗浄緩衝液および方法は、当業者に知られており、利用可能であり、例えば、特定の所望の相互作用のみが完全なまま残ることを適切に確実にする様々な塩濃度またはマイルドな洗剤である。理想的には、洗浄ステップは、捕捉剤が固定化される条件を変えない。
緩衝液または検出液
次いで、洗浄された表面は、検出ステップのために、緩衝液または他の適切な溶液、好ましくはクリーンな緩衝液と接触させられうる。本明細書で使用する場合、用語「クリーンな緩衝液」は、測定、結果、または結論を妨げる結果を生み出さないように、最小のバックグラウンドノイズを生成する緩衝液を指す。当業者は、検出ステップで適切に使用可能な緩衝液の多くの例があることを認識するであろう。クリーンな緩衝液の例は、Tris緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、HEPES、MES、MOPS、またはMEMを含む。適切な溶液は水である。表面またはその検出領域は、完全にまたは部分的に水没していてもよい。適切には、観察される少なくとも1つの検出領域が、緩衝液または溶液中に完全に沈められている。
次いで、洗浄された表面は、検出ステップのために、緩衝液または他の適切な溶液、好ましくはクリーンな緩衝液と接触させられうる。本明細書で使用する場合、用語「クリーンな緩衝液」は、測定、結果、または結論を妨げる結果を生み出さないように、最小のバックグラウンドノイズを生成する緩衝液を指す。当業者は、検出ステップで適切に使用可能な緩衝液の多くの例があることを認識するであろう。クリーンな緩衝液の例は、Tris緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、HEPES、MES、MOPS、またはMEMを含む。適切な溶液は水である。表面またはその検出領域は、完全にまたは部分的に水没していてもよい。適切には、観察される少なくとも1つの検出領域が、緩衝液または溶液中に完全に沈められている。
表面からのバイオマーカーおよび/または複合体の放出
本発明は、制御された速度での表面からのバイオマーカーの放出が、サンプル中の存在量が非常に少なくてもバイオマーカーの同定を可能にするという認識に基づいている。放出イベントは、表面に固定化された捕捉剤からバイオマーカーを放出させうる。これは、追加的または代替的に、捕捉剤(またはその一部)が固定化されている表面からの放出を引き起こしうる。捕捉剤は、目的のバイオマーカーに結合していても、結合していなくてもよい。捕捉剤は、放出後にバイオマーカーに結合したままでも、解離してもよい。本発明の方法は、粒子としてのバイオマーカーの放出と、粒子としての捕捉剤および/またはバイオマーカーの放出の両方を測定するのに十分な感度を有する。
本発明は、制御された速度での表面からのバイオマーカーの放出が、サンプル中の存在量が非常に少なくてもバイオマーカーの同定を可能にするという認識に基づいている。放出イベントは、表面に固定化された捕捉剤からバイオマーカーを放出させうる。これは、追加的または代替的に、捕捉剤(またはその一部)が固定化されている表面からの放出を引き起こしうる。捕捉剤は、目的のバイオマーカーに結合していても、結合していなくてもよい。捕捉剤は、放出後にバイオマーカーに結合したままでも、解離してもよい。本発明の方法は、粒子としてのバイオマーカーの放出と、粒子としての捕捉剤および/またはバイオマーカーの放出の両方を測定するのに十分な感度を有する。
放出イベントは、表面/溶液界面での結合の変化である。したがって、適切には、放出イベントは、表面から表面を保持する溶液中への粒子の完全な解離を意味する。粒子が表面から放出されると、この放出が検出される。そのような放出は、放出イベントの前後に表面を測定することによって検出される。対象物、例えば捕捉剤(結合したバイオマーカーを含む、または含まない)は、粒子の放出の前後に表面で測定され得る。測定間の光散乱の違いは、粒子の放出イベントを検出する。各放出イベントは、(例えば対象物の)局所的な光散乱の変化をもたらし、これが高精度で検出され得る。シグナルの変化の大きさは、分子量へと変換され得る。したがって、粒子の質量は、表面からの測定の前後から計算される。誤解を避けるために、放出された粒子自体は、溶液中に放出されているため、光散乱によって検出されない。
したがって、本発明は表面における粒子の存在、それから表面からの粒子の非存在の検出に関する。これらの測定値の差を計算することにより、質量が粒子に割り当てられ得る。したがって、実質的に、検出領域内の対象物または位置は、光散乱の変化についてモニタリングされる。
したがって、放出イベント中または放出イベント後に捕捉剤とバイオマーカーが解離した場合、これは放出イベントの検出または放出された質量の計算には影響しない。例えば、バイオマーカーが最初に放出され、続いて捕捉剤が放出された場合、これは、表面における光の散乱の2つの変化として検出され、バイオマーカーが放出イベントの前に表面に存在し、その後、捕獲剤が放出されたとの計算を導く。あるいは、最初に放出された粒子が捕捉剤に結合したバイオマーカーを含み、これらがその後溶液中で解離する場合、粒子の放出のみが検出される。表面を越えて(溶液中で)粒子に何が起こるかは、測定も検出もされない。検出されるイベントは表面からの粒子の「結合解除」であるため、検出は同じになる。粒子がもはや表面にないため、結合解除が生じた後、何が起こるかは検出されない。
放出されうる粒子の種類は複数ある。これらは、バイオマーカー単独、捕捉剤(またはその一部)に結合したバイオマーカー、または結合していない捕捉剤(またはその一部)を含む。3つの粒子の種類、すなわちバイオマーカー、結合していない捕捉剤、および/または結合した捕捉剤(バイオマーカー/捕捉剤複合体)が、定義された速度で、定義された条件下で、表面から放出される。適切には、これらの粒子は、表面が接触している溶液中に放出される。
放出の速度は、光散乱による個々の放出イベントの検出を可能にするように適切に選択される。したがって、本発明は、目的のバイオマーカー、複合体または結合していない捕捉剤を含む表面から放出された個々の粒子を検出し、それらを特徴付けることができる。このようにして、本発明の方法は、粒子が表面から放出される前後に対象物から得られた測定値に基づいて、個々の粒子に質量を割り当てることができる。粒子の放出は、対象物を表面から放出させうる(例えば、結合していない捕捉剤または捕捉剤/バイオマーカー複合体)。粒子の放出は、対象物の一部を放出させうる(例えば、捕捉剤から放出されたバイオマーカー、または捕捉剤の一部と複合体を形成したバイオマーカーと表面に残された一部)。したがって、放出された粒子の性質の決定は、表面で対象物をモニタリングし、放出イベントの前後に何が存在するかを決定することによって達成される。
したがって、適切には、本発明の方法の感度を最大化するために、表面からの結合粒子の放出は、光散乱による検出を可能にして個々の結合解除(放出)イベントを同定および特徴付けできる速度で起こるように制御される。これは、粒子の放出について表面の個々の対象物をモニタリングすることを可能とする。
したがって、適切には、個々の粒子が検出領域から一度に放出される。これは、放出の速度が、毎秒または単一画像フレームキャプチャ内に生じる放出イベントが100を超えないようなものであることを意味しうる。放出の速度は、1秒あたり最大100、最大90、最大80、最大70、最大60、最大50、または最大40の放出イベントでありうる。したがって、単一の放出イベントが1つまたは複数の後続のフレームでキャプチャされる可能性があるが、単一のフレームは適切には100を超える放出イベントを含まない。これは、バイオマーカー、捕捉剤または複合体の個々の検出、および個々の放出イベントの定量化を可能とする。複数の放出イベントが実質的に同時に発生し、フレーム内で個々のイベントを区別できない場合(例えば、照明スポットの重なりにより)、放出速度が高すぎる可能性があり、放出速度を下げるための調整が必要となる。本質的に、光散乱顕微鏡の画像キャプチャデバイスは、放出イベントに関連する光散乱イベントを記録することができるが、特定の濃度を超えると、個々の対象物を区別してそれに質量を割り当てることができなくなる。したがって、別の言い方をすれば、適切な放出速度は、どのイベントも重複せず、したがって個別に同定および特徴付けが可能な画像キャプチャフレームを提供する放出速度である。フレームあたりのスポットの数、つまり放出レートは、フレームのサイズに依存することになる。フレーム当たりの露出時間は、0.01から50ms、適切には0.5から20msでありうる。
検出領域の放出イベントを検出するための適切な時間間隔は、検出領域のサイズ;それに結合した捕捉剤の濃度;バイオマーカーの豊富さ;放出剤の強度と放出の速度;およびフレームキャプチャレートを含む様々な要因に依存することになる。したがって、適切な時間間隔は、検出イベントの特定のパラメータに依存することになる。しかしながら、10,000フレームなど、特定の時間またはフレームの制限を課すことは可能でありうる。
放出イベントは、任意の適切な方法で誘発されうる。適切な方法の例は、以下を含む:
i)表面の化学的環境を変える。したがって、本発明の方法は、放出イベントを誘発するために表面の環境に化学変化をもたらすことを含みうる。例は、検出領域を含む溶液のpHを変更することを含む。pHの変化は、抗体-抗原相互作用などのタンパク質-タンパク質相互作用を乱すことが知られている。pHの低下が好ましい場合がある。例えば、化学的環境の変化は、例えば、塩酸などの酸の添加によって、そのpHを低下させることを含みうる。同様に、検出領域の環境における酸化還元条件を変更することも、放出イベントを誘発するのに役立ちうる。特に核酸に関しては、例えば、イオンの添加による環境のイオン強度の変化は、放出イベントを誘発するのに十分でありうる。環境に化学変化を導入するために、任意の適切な手段が使用されうる。適切な手段は、光への曝露(例えば、pHに影響を与えるケージドプロトンの光分解による);緩衝液または塩の添加を含む。
i)表面の化学的環境を変える。したがって、本発明の方法は、放出イベントを誘発するために表面の環境に化学変化をもたらすことを含みうる。例は、検出領域を含む溶液のpHを変更することを含む。pHの変化は、抗体-抗原相互作用などのタンパク質-タンパク質相互作用を乱すことが知られている。pHの低下が好ましい場合がある。例えば、化学的環境の変化は、例えば、塩酸などの酸の添加によって、そのpHを低下させることを含みうる。同様に、検出領域の環境における酸化還元条件を変更することも、放出イベントを誘発するのに役立ちうる。特に核酸に関しては、例えば、イオンの添加による環境のイオン強度の変化は、放出イベントを誘発するのに十分でありうる。環境に化学変化を導入するために、任意の適切な手段が使用されうる。適切な手段は、光への曝露(例えば、pHに影響を与えるケージドプロトンの光分解による);緩衝液または塩の添加を含む。
ii)バイオマーカーと捕捉剤の間、および/または捕捉剤と表面の間の結合を酵素的切断によって破壊すること。適切な酵素が、捕捉剤の結合部位における切断部位を標的化するために使用されうる。結合部位は、バイオマーカー結合部位であってもよいし、表面結合部位であってもよい。バイオマーカー結合部位の切断は、捕捉剤からバイオマーカーを放出させるのに役立ちうる。表面結合部位の切断は、捕捉剤を表面から放出させるのに役立ちうる。放出された捕捉剤は、バイオマーカーに結合していなくてもよいし、結合していてもよい。適切な酵素は、例えば光への曝露によって活性化されてもよい。適切な酵素は、タンパク質性であるか、または核酸またはそのハイブリッドから構成され得る。
iii)捕捉剤の消化。捕捉剤を消化し、それによってバイオマーカーを表面から放出させるために、任意の適切な手段が表面に適用されうる。捕捉剤を消化するために酵素が使用されてもよい。例えば、捕捉剤が核酸であり、バイオマーカーがタンパク質である場合、バイオマーカーを放出させるために、エキソヌクレアーゼが使用され得る。
iv)光分解が、捕捉剤の化学的切断を誘導するため、または捕捉剤からのバイオマーカーの放出を引き起こすために使用されうる。化学的切断部位は、バイオマーカー結合部位であっても、表面結合部位であってもよい。バイオマーカー結合部位の切断は、捕捉剤からバイオマーカーを放出させるのに役立ちうる。表面結合部位の切断は、捕捉剤を表面から放出させるのに役立ちうる。放出された捕捉剤は、バイオマーカーに結合していなくてもよいし、結合していてもよい。光分解は、切断を誘導するのに適した波長の光、例えばUV光に検出領域を曝露することを含みうる。
v)バイオマーカーを捕獲剤から、および/または捕獲剤を表面からはずすための競合的結合剤の添加。
したがって、本発明の方法は、検出領域の化学的環境を変化させること;切断を誘導するのに適した波長の光を検出領域に適用すること;および/または検出領域に酵素を適用することを含みうる。
したがって、本発明の方法は、検出領域の化学的環境を変化させること;切断を誘導するのに適した波長の光を検出領域に適用すること;および/または検出領域に酵素を適用することを含みうる。
あるいは、放出イベントを刺激するために、表面の条件(環境)が修飾され得る。
表面環境の変化率は、所望の放出速度を提供するために調節される。環境の変化は、緩衝液、塩、酸、または酵素などの試薬の適用速度などの要因によって;試薬もしくは酵素の濃度、または光の出力密度もしくは強度を変更することによって、制御され得る。放出速度を制限するために、試薬、酵素、または光を低い濃度、強度、または速度で適用し、また場合により、放出速度の増加が望まれる場合は、そのような要因の1つまたは複数を増加させることが好ましい場合がある。例えば、部位から部位への酵素などの試薬の拡散速度を最大化して、所望の放出速度の生成を確保することができる。放出剤の確率的な放出は、事前に定義された検出領域に制限されうる。放出が光によって、例えば光分解によってもたらされる場合、光活性化の光を観察の光または光学系にカップリングすることが望ましい場合がある。
表面環境の変化率は、所望の放出速度を提供するために調節される。環境の変化は、緩衝液、塩、酸、または酵素などの試薬の適用速度などの要因によって;試薬もしくは酵素の濃度、または光の出力密度もしくは強度を変更することによって、制御され得る。放出速度を制限するために、試薬、酵素、または光を低い濃度、強度、または速度で適用し、また場合により、放出速度の増加が望まれる場合は、そのような要因の1つまたは複数を増加させることが好ましい場合がある。例えば、部位から部位への酵素などの試薬の拡散速度を最大化して、所望の放出速度の生成を確保することができる。放出剤の確率的な放出は、事前に定義された検出領域に制限されうる。放出が光によって、例えば光分解によってもたらされる場合、光活性化の光を観察の光または光学系にカップリングすることが望ましい場合がある。
本明細書で定義される方法のいずれかのステップIVは、表面に結合した粒子を放出することを含み、ここで粒子は、以下のいずれか1つまたは複数から選択される:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤。
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤。
したがって、ステップIVは、可能なあらゆる種類の粒子の放出を含み、本明細書に記載の方法は、これらの放出イベントのそれぞれを区別するのに十分な感度を有する。これは、例えば、どのくらいの数のイベントが捕捉剤に結合したバイオマーカーを放出するかと、どのくらいの数のイベントが捕捉剤のみを放出するかを決定することを可能とするであろう。
結果/検出
前述のように、放出イベントの前にベースライン測定が行われうる。
放出イベントの検出は、光散乱顕微鏡、例えば空間フィルタを備えたiSCAT、または例えば本明細書に記載のマスフォトメーターを使用して実行されてもよい。iSCATは、サンプル内の対象物によって散乱された光とサンプル位置から反射された光との間の干渉を決定することを含む。干渉は対象物の散乱振幅に依存し、iSCATシグナルとして測定される。放出イベントの検出を可能にするのは、この対象物の質量のモニタリングである。
前述のように、放出イベントの前にベースライン測定が行われうる。
放出イベントの検出は、光散乱顕微鏡、例えば空間フィルタを備えたiSCAT、または例えば本明細書に記載のマスフォトメーターを使用して実行されてもよい。iSCATは、サンプル内の対象物によって散乱された光とサンプル位置から反射された光との間の干渉を決定することを含む。干渉は対象物の散乱振幅に依存し、iSCATシグナルとして測定される。放出イベントの検出を可能にするのは、この対象物の質量のモニタリングである。
検出は、表面の画像をキャプチャすることによって実行される。複数の画像またはフレームを組み合わせて、フィルムを提供してもよい。ビデオまたはフィルムは、1,000から48,000フレームを含みうる。それは最大60,000フレームまたは最大100,000フレームを含みうる。各対象物の放出イベントをモニタリングすることを可能とするため、複数のイメージが好ましい。
放出剤を適用する前に、最初の測定が1回または複数回行われる。これは、前述のように、表面がサンプルと接触し、洗浄ステップが実行されたプロセスの時点であり得る。この最初の測定は、表面に存在する対象物に関する情報を提供する。そのような対象物は、結合していない捕捉剤または結合したバイオマーカーを有する捕捉剤のいずれかでありうる。
この最初の測定値から、表面にある対象物のアイデンティティを直接判断することは可能でない。対象物の質量は、検量線の使用を含む、本明細書に記載の標準的な手法を使用して計算され得る。
最初の検出(またはさらなる測定)は、放出剤の適用の直後、またはその5秒以内、1秒以内または数分の1秒以内に行われうる。しかしながら、放出剤が作用するまでに一定の時間がかかる場合、この一定の時間を考慮して、初期の検出が最適化され得る。あるいは、例えば光分解のように、放出剤が即座に作用する場合、放出用と検出用の光(放出用の1つの波長と検出用の別の波長)が並行して適用され、即座に検出が行われ得る。画像キャプチャの形式での測定は、0.01から1秒の間隔で取得されうる。顕微鏡カメラによるフレームキャプチャレートは、1秒あたり0.01から1である。フレームキャプチャレートは、検出または測定レートまたは時間間隔に対応しうる。
画像キャプチャによる検出は、一定期間に実質的に連続して行われても、規則的または不規則的な間隔で行われてもよい。そのような連続測定は、放出剤の適用前に開始し、任意の適切な期間継続し得る。測定間の間隔は、調査中の粒子に関係する可能性があり、したがって、より長くなり得ることが理解されるであろう。さらに、時間間隔は、1回のアッセイ内で変更され得る。例えば、最初の数回の測定は毎秒行い、それ以降の測定は、より長い分単位の時間間隔で行うことができる。
当業者は、本明細書で論じるように放出剤を調整することによって放出速度を調整することができ、また、フレームキャプチャレートを調整して、適切な検出レートをもたらすことができる。
各放出イベントは、表面から溶液への粒子の離脱を含む。これは、表面における対象物の光の散乱の変化によって検出される。この変化は、放出された粒子の質量に相関付けられる。対象物からの放出イベントの欠如もまた検出されうるが、これは、サンプル中におけるバイオマーカーの存在の欠如を指し示しうる。
各放出イベントには、光の散乱に基づいて質量が割り当てられ得る。したがって、本発明の方法は、結合した捕捉剤と結合していない捕捉剤、および/またはバイオマーカーの直接的な定量化を含みうる。したがって、本発明は、バイオマーカーに結合した捕捉剤の割合の測定を提供し得る。サンプル中における存在量が少ないバイオマーカーは、結合していない捕捉剤を表面にもたらしうる。結合した捕捉剤と結合していない捕捉剤との間の識別が行われるため、これは本発明の方法によって決定され得る。本発明の方法は、既知の標準との比較によるバイオマーカー濃度の決定を含みうる。
この方法はまた、バイオマーカーの不均一な集団を分析するためにも使用されうる。本発明の方法は、質量を各放出イベントに割り当てることを含む。バイオマーカーの質量、または結合していない捕捉剤に対する大量の捕捉剤の質量の比較を使用して、予想される質量と質量を比較することにより、バイオマーカーの性質が決定されうる。
本方法は、特定のバイオマーカーの存在または非存在を確認するためだけに適しているわけではない。また、翻訳後修飾の存在または複合体中のバイオマーカーの存在など、バイオマーカーの状態を決定するためにも使用されうる。したがって、本方法は、特定のタンパク質オリゴマー化、タンパク質-核酸相互作用、タンパク質-糖または多糖相互作用の存在/非存在の相対的な定量化および決定に適している。したがって、多くの異なる生物学的相互作用が精査されうる。翻訳後修飾は、バイオマーカーの質量を決定することによって、または異なる修飾バイオマーカーに特異的な捕捉剤を使用することによって、決定されうる。
本発明の方法はまた、他の内部標準に対する分子の相対的定量化、または目的の2つ以上のバイオマーカー間の分子の相対的定量化にも適している。
内部対照は、サンプル中のバイオマーカーの相対的な定量化を可能としうるが、例えば、内部標準は、サンプルに既知の濃度で添加される定義された分子量の生体分子でありうる。内部対照の放出とバイオマーカーの放出を定量化することにより、我々は、サンプル中のバイオマーカーの相対濃度を得るであろう。
内部対照は、サンプル中のバイオマーカーの相対的な定量化を可能としうるが、例えば、内部標準は、サンプルに既知の濃度で添加される定義された分子量の生体分子でありうる。内部対照の放出とバイオマーカーの放出を定量化することにより、我々は、サンプル中のバイオマーカーの相対濃度を得るであろう。
この態様において、内部対照は、バイオマーカーとは異なる分子量を有し、これらのバイオマーカーとの交差反応性を有さない。
いくつかの態様において、内部対照は特定の捕捉剤を必要とするが、捕捉剤はバイオマーカーに対して有するのと同じまたは同様な親和性を内部標準に対して有していれば理想的であろう。しかしながら、これら2つの親和性が異なり、親和性の違いが既知である場合、バイオマーカーの相対濃度を決定するために使用され得る。そのような取り合わせでは、内部対照とバイオマーカーの両方の放出プロセスは同じである。
いくつかの態様において、内部対照は特定の捕捉剤を必要とするが、捕捉剤はバイオマーカーに対して有するのと同じまたは同様な親和性を内部標準に対して有していれば理想的であろう。しかしながら、これら2つの親和性が異なり、親和性の違いが既知である場合、バイオマーカーの相対濃度を決定するために使用され得る。そのような取り合わせでは、内部対照とバイオマーカーの両方の放出プロセスは同じである。
いくつかの態様において、内部対照は、分析されるサンプル中に存在することが知られている第2のバイオマーカーでありうる。これは、血清中のアルブミンなど、濃度が既に確立されている一般的なバイオマーカーであり得るであろう。第2のバイオマーカーのレベルは、疾患に依存せず、目的のバイオマーカーの濃度を決定するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、内部対照は内部標準と呼ばれる場合がある。
検出装置
本方法は、適切な光散乱顕微鏡、例えば、空間フィルタまたはマスフォトメーターを含む干渉散乱顕微鏡の使用を含みうる。以下に説明される構成を含む、任意の適切な装置が使用されうる。
検出装置
本方法は、適切な光散乱顕微鏡、例えば、空間フィルタまたはマスフォトメーターを含む干渉散乱顕微鏡の使用を含みうる。以下に説明される構成を含む、任意の適切な装置が使用されうる。
適切な顕微鏡またはフォトメーターは、サンプル位置に表面を保持するためのサンプルホルダー;照明光を提供するように配置された照明源;検出器;および照明光をサンプル位置に向けるように配置され、反射する出力光を収集するように配置されており、出力光が、サンプル位置から散乱された光と、サンプル位置から反射された照明光の両方を含み、出力光を検出器に向けさせるように配置されている光学系を含みうる。
顕微鏡は、出力光をフィルタリングするように配置された空間フィルタをさらに備えていてもよく、この空間フィルタは、出力光を通過させるが、開口数が大きい場合よりも所定の開口数内でより大きくなる強度の低減を有する。そのような空間フィルタは、PCT/GB2017/052070およびColeら(ACS Photonics、2017年、4(2)、211~216ページ)に記載されているように、画像のコントラストを有利に最大化する。
使用される光は、紫外線(本明細書では10nmから380nmの範囲の波長を有すると定義されうる);可視光(本明細書では380nmから740nmの範囲の波長を有すると定義されうる);赤外線(本明細書では740nmから300μmの範囲の波長を有すると定義されうる)でありうる。光は可視光であることが好ましい。光は波長の混合であってもよい。照明光は、例えばレーザーによって提供されるコヒーレント光であってもよい。
本発明の方法は、光散乱、好ましくは単一粒子光散乱を検出する適切な顕微鏡を使用して実行されうる。iSCAT機器の例示的な設計は、Coleら、ACS Photonics、2017年、4(2)、211~216ページおよびArroyoら、Nat Protocols 2016年、617~633ページに記載されている。この機器に関する詳細は、WO2018/011591およびGB2552195に提供されている。適切なマスフォトメーターは、例えば、OneMPマスフォトメーターであり、英国オックスフォードのRefeyn Limitedから入手可能である。
適切なiSCAT顕微鏡が図3に示されている。
図3は、以下のように構成されている(また、上述の空間フィルタを用いて構成されている)本発明において使用されうるiSCAT顕微鏡1を示している。空間フィルタは、説明した理由からコントラストを改善するために有利であるが、本発明の方法は、代替的に空間フィルタなしでiSCAT顕微鏡を使用してもよい。
図3は、以下のように構成されている(また、上述の空間フィルタを用いて構成されている)本発明において使用されうるiSCAT顕微鏡1を示している。空間フィルタは、説明した理由からコントラストを改善するために有利であるが、本発明の方法は、代替的に空間フィルタなしでiSCAT顕微鏡を使用してもよい。
顕微鏡1は、以下でより詳細に説明する空間フィルタを除き、顕微鏡の分野で従来から用いられている構造を有する以下の構成要素を含む。
顕微鏡1は、サンプル3をサンプル位置に保持するためのサンプルホルダー2を含む。サンプル3は、画像化される対象物を含む液体サンプルであってもよく、これについては以下でより詳細に説明される。サンプルホルダー2は、サンプル3を保持するのに適した任意の形態を取りうる。典型的には、サンプルホルダー2は、サンプルホルダー2とサンプル3との間の界面を形成する表面上にサンプル3を保持する。例えば、サンプルホルダー2は、カバースリップであってもよく、および/またはガラスから作られていてもよい。サンプル3は、例えばマイクロピペットを使用して、単刀直入な方法でサンプルホルダー2上に提供されうる。
顕微鏡1は、サンプル3をサンプル位置に保持するためのサンプルホルダー2を含む。サンプル3は、画像化される対象物を含む液体サンプルであってもよく、これについては以下でより詳細に説明される。サンプルホルダー2は、サンプル3を保持するのに適した任意の形態を取りうる。典型的には、サンプルホルダー2は、サンプルホルダー2とサンプル3との間の界面を形成する表面上にサンプル3を保持する。例えば、サンプルホルダー2は、カバースリップであってもよく、および/またはガラスから作られていてもよい。サンプル3は、例えばマイクロピペットを使用して、単刀直入な方法でサンプルホルダー2上に提供されうる。
顕微鏡1は、照明源4および検出器5をさらに含む。
照明源4は、照明光を提供するように配置される。照明光はコヒーレント光であってもよい。例えば、照明源4はレーザーであってもよい。照射光の波長は、サンプル3の性質および/または検査される特性に応じて選択されうる。一例では、照明光は405nmの波長を有する。
照明源4は、照明光を提供するように配置される。照明光はコヒーレント光であってもよい。例えば、照明源4はレーザーであってもよい。照射光の波長は、サンプル3の性質および/または検査される特性に応じて選択されうる。一例では、照明光は405nmの波長を有する。
場合により、照明光は、例えば、Kukuraら、“High-speed nanoscopic tracking of position and orientation of a single virus”、Nature Methods 2009年 6:923~935ページに詳述されているように、照明のコヒーレント性およびレーザーノイズから生じるスペックルパターンを除去するために空間的に変調されていてもよい。
検出器5は、サンプル位置から反射された出力光を受け取る。典型的には、顕微鏡1は、広視野モードで動作することができ、その場合、検出器5はサンプル3の画像を捕捉する画像センサでありうる。あるいは、顕微鏡1は、共焦点モードで動作してもよく、その場合、検出器5は、画像センサであってもよいし、フォトダイオードなどの点状検出器であってもよく、その場合、走査装置が、サンプル3の領域をスキャンして画像を構築するために使用されてもよい。検出器5として採用されうる画像センサの例は、CMOS(相補型金属酸化膜半導体)画像センサまたはCCD(電荷結合素子)を含む。
顕微鏡1は、サンプルホルダー2、照明源4および検出器5の間に配置された光学系10をさらに含む。光学系10は、以下のように、試料3を照明するために照明光をサンプル位置に向け、サンプル位置から反射した出力光を収集し、出力光を検出器5に向けるように配置される。
光学系10は、サンプルホルダー2の前方に配置されたレンズ系である対物レンズ11を含む。光学系10はまた、集光レンズ12および結像レンズ13も含む。
集光レンズ12は、光源11からの照明光(図1において実線で示される)を、対物レンズ11を通してサンプル位置のサンプル3上に集光する。
集光レンズ12は、光源11からの照明光(図1において実線で示される)を、対物レンズ11を通してサンプル位置のサンプル3上に集光する。
対物レンズ11は、(a)サンプル位置から反射された照明光と、(b)サンプル位置でサンプル3から散乱された光の両方を含む出力光を収集する。反射光は、主にサンプルホルダー2とサンプル3の間の界面から反射される。典型的にはこれは、例えば、ガラスと水の反射のような、比較的弱い反射である。例えば、反射された照明光の強度は、入射照明光の強度の0.5%のオーダーでありうる。散乱光は、サンプル3中の対象物によって散乱される。
従来的なiSCATと同様に、サンプルの表面またはその近くの対象物からの散乱光は、反射光と建設的に干渉するため、検出器5によってキャプチャされた画像において可視となる。この効果は、検出器に到達する照明光がサンプルの深さを透過し、はるかに小さい画像化コントラストをもたらす透過型の顕微鏡とは異なる。
反射した照明光と散乱した光は、異なる指向性を有している。特に、反射した照明光は、光源4および光学系6によって出力される光のビームの幾何学的形状に起因する開口数を有する。散乱光は広範囲の角度にわたって散乱されるため、反射した照明光よりも大きな開口数を満たす。
結像レンズ13は、対物レンズ11からの出力光を検出器5上に集束させる。
光学系6はまた、光源4からの照明光と検出器5に向けられた出力光の光路を分割するように配置されたビームスプリッタ14も含む。以下に説明するように空間フィルタを設けることを除き、ビームスプリッタ14は、そこに入射する光の部分反射および部分透過を提供する従来的な構造を有しうる。例えば、ビームスプリッタ14は、光路に対して45°で配置された、金属または誘電体であってもよいフィルムを典型的に備えたプレートでありうる。あるいは、ビームスプリッタ14は、プリズム間の界面に部分反射フィルムを有する、対応する一対のプリズムによって形成されるキューブビームスプリッタであってもよい。あるいは、ビームスプリッタ14は、ビームスプリッタ14とサンプル3との間の1/4波長プレートと組み合わせて使用される偏光ビームスプリッタであってもよい。
光学系6はまた、光源4からの照明光と検出器5に向けられた出力光の光路を分割するように配置されたビームスプリッタ14も含む。以下に説明するように空間フィルタを設けることを除き、ビームスプリッタ14は、そこに入射する光の部分反射および部分透過を提供する従来的な構造を有しうる。例えば、ビームスプリッタ14は、光路に対して45°で配置された、金属または誘電体であってもよいフィルムを典型的に備えたプレートでありうる。あるいは、ビームスプリッタ14は、プリズム間の界面に部分反射フィルムを有する、対応する一対のプリズムによって形成されるキューブビームスプリッタであってもよい。あるいは、ビームスプリッタ14は、ビームスプリッタ14とサンプル3との間の1/4波長プレートと組み合わせて使用される偏光ビームスプリッタであってもよい。
一例において、光源4は、光源4からの照明光がビームスプリッタ14によって対物レンズ11に反射されるように対物レンズ11の光路からオフセットされ、逆に、検出器5は、サンプル位置からの出力光がビームスプリッタ14を通して検出器5に向かって透過するように対物レンズ11の光路に並べられる。
従来的な構造であってもよい上記の構成要素に加えて、顕微鏡1は、空間フィルタ20を含む。空間フィルタ20は、ビームスプリッタ14上に形成され、それにより対物レンズ11の後方開口部の後方、つまり対物レンズ11の後方焦点面15の真後ろに配置される。したがって、空間フィルタ20は、位相コントラスト顕微鏡のように対物レンズに入ることなく実装されうる。共役面ではなく、(例えば、以下で説明するように)対物レンズの入口開口のすぐ後ろに空間フィルタを配置することは、高開口数の顕微鏡対物レンズ内の多数のレンズから発生する後方反射を強力に抑制するという明確な利点を有する。これは次いで、画像化ノイズを低減させ、非干渉バックグラウンドを低下させ、実験の複雑さ、光学系の数および光路長を低減させて、光学セットアップの安定性と画質の増加を導く。
しかしながら、この位置は必須ではなく、後述するように同等の機能を有する空間フィルタを他の場所に設けてもよい。
空間フィルタ20は、それによって、検出器5を通過する出力光をフィルタリングするように配置される。検出器5が対物レンズ11の光路と整列している例では、空間フィルタ20は、したがって、透過型である。
空間フィルタ20は、それによって、検出器5を通過する出力光をフィルタリングするように配置される。検出器5が対物レンズ11の光路と整列している例では、空間フィルタ20は、したがって、透過型である。
空間フィルタ20は部分的に透過性であるため、反射された照明光を含む出力光を通過させるが、強度は低減する。空間フィルタ20もまた、光軸と整列され、所定の開口を有するため、所定の開口数内で強度を低減させる。ここで、開口数は、出力光が発生するサンプル位置に対する角度の範囲を特徴付ける無次元の量として通常の方法で定義される。具体的には、開口数NAは、式NA=n・sin(θ)によって定義されうるが、ここで、θは収集の半角であり、nは出力光が通過する材料(例えば、光学系6の構成要素)の屈折率である。
空間フィルタ20は、所定の開口数の外側では強度を低減させない。原理的には、空間フィルタ20は、代替的に、その所定の開口の外における強度の低減であるが、所定の開口数内の強度の低減よりも小さい強度の低減を提供し得るものの、これはあまり望ましくない。
空間フィルタ20は、典型的には堆積材料の層を含む任意の適切な方法で形成されうる。材料は、例えば、銀などの金属であってもよい。堆積は、任意の適切な手法を使用して実行されうる。
界面近くの回折サイズ以下の対象物は、反射照明光よりも大きな開口数に優先的に光を散乱するため、空間フィルタ20によって提供される強度の低減は、散乱光よりも反射した照明光の検出における強度を優先的に低減させる。したがって、低開口数での空間フィルタ20による強度の低減は、主に反射した照明光に影響を与え、散乱光への影響は最小限であり、それによってキャプチャ画像のコントラストを最大化する。強化された画像化コントラストは、弱い散乱体である対象物の高コントラスト検出を可能にする。
界面近くの回折サイズ以下の対象物は、反射照明光よりも大きな開口数に優先的に光を散乱するため、空間フィルタ20によって提供される強度の低減は、散乱光よりも反射した照明光の検出における強度を優先的に低減させる。したがって、低開口数での空間フィルタ20による強度の低減は、主に反射した照明光に影響を与え、散乱光への影響は最小限であり、それによってキャプチャ画像のコントラストを最大化する。強化された画像化コントラストは、弱い散乱体である対象物の高コントラスト検出を可能にする。
コントラストの向上は、次のように理解されうる。空間フィルタ20が出力光の一部を所定の開口数で通過させると(すなわち、この例では部分透過性である)、照明光および散乱光場の一部が検出器に到達し、十分にコヒーレントな照明源に対して干渉する。そして、検出器Idetに到達する光強度は、Idet=|Einc|2{r2t2+|s|2+2rt|s|cosΦ}で与えられ、ここでEincは入射光場、r2は界面の反射率、t2は空間フィルタ20の透過率、sは対象物の散乱振幅、Φは透過照明光と散乱光の位相差である。したがって、検出された光子の総数を犠牲にするものの、散乱コントラストは向上する。
したがって、コントラストは従来的なiSCATと同様の方法で提供されるが、空間フィルタの透過率によってさらに制御される。これは、標準的なiSCATのようにガラスと水の界面の反射率で固定されるのではなく、空間フィルタ20の透過率t2の選択を通して直接的に参照フィールドの振幅を調整する能力を提供する。空間フィルタ20が堆積材料の層である場合、透過率t2は、層の材料および/または厚さの選択によって選択されうる。そのような調整は、例えば、目的の散乱対象物、カメラのフルウェル容量および倍率に従って実行されうる。
iSCATに対するこれらの有益な効果を最大化するために、所定の開口数は、出力光内の反射した照明光の開口数でありうるが、それは本質的ではない。例えば、所定の開口数が反射した照明光の開口数よりもわずかに小さいか、または大きい場合、同様の性質の利益が達成され得る。
検出の方法
バイオマーカーの検出は、光散乱、例えば干渉散乱顕微鏡法(iSCAT)、干渉散乱質量分析法またはマスフォトメトリーを使用して行われうる。適切には、iSCATまたはマスフォトメトリーが使用される。
バイオマーカーの検出は、光散乱、例えば干渉散乱顕微鏡法(iSCAT)、干渉散乱質量分析法またはマスフォトメトリーを使用して行われうる。適切には、iSCATまたはマスフォトメトリーが使用される。
iSCATは、サンプル内の対象物によって散乱された光とサンプル位置から反射された光との間の干渉を決定することを含む。干渉は、対象物の散乱振幅(次いで、その分極率、すなわち体積、密度、屈折率)に依存し、iSCATシグナルとして測定される。この手法は、例えば、Kukuraら、Nature Methods 2009年 6:923~935ページ、Ortega-Arroyoら、Physical Chemistry Chemical Physics 2012年 14:15625~15636ページでレビューされている。
マスフォトメトリーは、iSCATの発展型であり(Kukuraら、Nature Methods 2009年 6:923~935ページ、Ortega-Arroyoら、Physical Chemistry Chemical Physics 2012年 14:15625~15636ページ)、単一分子による散乱光を測定して、それを分子量と直接的に相関させる。マスフォトメトリーの原理は図4に示されている。粒子によって散乱される光は、粒子の体積と屈折率に直線的に比例する。タンパク質の光学特性と密度は数パーセントしか変化しないため、それらの散乱シグナルは配列質量に正比例し、それゆえ、単一分子を光で計量することが可能になる(図X1)。散乱シグナルと質量の相関は、様々な生体分子(糖タンパク質、核酸、脂質)に当てはまり、マスフォトメトリーは溶液中の生体分子の普遍的な分析ツールとなる。
iSCATシグナルは、粒子の存在下および非存在下で検出される光の比率として説明されうる。より詳細には、それは(Is-Ip)/Isと定義することができ、ここでIsは粒子の非存在下でのサンプル位置(ガラス表面など)からの反射強度、Ipは粒子の存在下での同じ測定値である。
光散乱シグナルを使用して、検出されている対象物に質量を割り当てることができる。したがって、本発明の方法は、光散乱シグナルを決定すること、およびそのシグナルを使用して粒子の質量を決定することを含みうる。粒子は対象物から実質的に放出され、よって、対象物の質量の変化を測定することにより、質量を粒子に帰属させることができる。本発明の方法においてマスフォトメトリーが使用される場合、質量はマスフォトメトリー法によって指し示される。
検出される対象物の予想質量と比較することにより、粒子の有無が判断され得る。粒子の存在/非存在を測定することにより、放出イベントが検出され得る。したがって、バイオマーカーの検出では、バイオマーカーおよび/またはバイオマーカー/捕捉剤複合体の予想される質量が、光散乱によって最終的に同定される放出された粒子の質量と比較され、バイオマーカーまたはバイオマーカー/捕獲剤複合体の存在または非存在が決定され得る。同様に、結合していない捕捉剤の予想される質量が、光散乱によって同定される粒子の質量と比較され、結合していない捕捉剤の存在または非存在が決定され得る。バイオマーカー、バイオマーカー/捕捉剤複合体、および結合していない捕捉剤の質量は異なりうる。実質的には、本発明の方法は、粒子を具体的に調べることなく、粒子が放出される対象物を検査することによって、粒子の質量を測定することを可能にする。
本発明の方法は、目的の粒子の質量または濃度を決定するために、iSCATコントラストと較正曲線または標準曲線との比較をさらに含んでいてもよい。
本発明の方法はまた、限定はしないが、例えば、画像上のバックグランドの除去、および画質を改善することを含む、1つまたは複数の画像処理ステップも含みうる。
本発明の方法はまた、限定はしないが、例えば、画像上のバックグランドの除去、および画質を改善することを含む、1つまたは複数の画像処理ステップも含みうる。
粒子は、表面上の対象物からのその放出によって間接的に測定される。したがって、検出および定量化されるものは、対象物の「負の質量」イベントであり、これが粒子の質量を計算するために使用され得る。次いで、粒子の質量は、その粒子におけるバイオマーカーの存在または非存在を決定できる。
放出されると、粒子またはその成分は表面に結合しうる。そのような結合イベントは検出されうるが、そのような結合イベントは放出イベントの後に生じることから、無視されうる。これは特に実施例1で確認できる。
検量線
本発明の方法でiSCATが使用される場合、放出された粒子の質量を決定するために検量線が使用されうる。検量線は、iSCATによって生成された散乱値に対して2つ以上の標準の既知の質量をプロットすることによって生成されうる。そのような検量線は、iSCATによって得られた散乱値から粒子の質量を決定するために使用されうる。本発明の方法は、iSCAT散乱値を検量線上にプロットして目的の粒子の質量を決定すること;そして場合により、粒子を、例えば、バイオマーカー、バイオマーカーに結合した捕捉剤、または結合していない捕捉剤として特徴付けることを含みうる。
本発明の方法でiSCATが使用される場合、放出された粒子の質量を決定するために検量線が使用されうる。検量線は、iSCATによって生成された散乱値に対して2つ以上の標準の既知の質量をプロットすることによって生成されうる。そのような検量線は、iSCATによって得られた散乱値から粒子の質量を決定するために使用されうる。本発明の方法は、iSCAT散乱値を検量線上にプロットして目的の粒子の質量を決定すること;そして場合により、粒子を、例えば、バイオマーカー、バイオマーカーに結合した捕捉剤、または結合していない捕捉剤として特徴付けることを含みうる。
検量線は、サンプル中の粒子の濃度を決定するために作成されてもよい。
1つの態様では、検量線を生成するために、精製バイオマーカーの濃度を増加させて、測定が実行されてもよい。これは、異なる濃度のバイオマーカーとインキュベートしたときに発生する結合解除イベントの数を知ることを可能とするであろう。追加されたバイオマーカーの濃度に対する既知の結合解除イベントのプロットは、バイオマーカーの濃度の決定を可能とし得る。
1つの態様では、検量線を生成するために、精製バイオマーカーの濃度を増加させて、測定が実行されてもよい。これは、異なる濃度のバイオマーカーとインキュベートしたときに発生する結合解除イベントの数を知ることを可能とするであろう。追加されたバイオマーカーの濃度に対する既知の結合解除イベントのプロットは、バイオマーカーの濃度の決定を可能とし得る。
別の態様では、複雑なサンプル(例えば血清)を使用して、既知の濃度を有する第2のバイオマーカー(血清アルブミンなど)に対する捕捉剤を含めることによって、較正を行うことができる。この態様は、第2のバイオマーカーが内部対照として使用されるように、本明細書にさらに記載される。
さらなる較正方法は、サンプルの連続希釈においてこの方法を実行することであり、または代替的に、バイオマーカーの濃度を変化させた異なるサンプルの使用は、結合解除に対する濃度のプロットの構築を可能とするであろう。
選択された放出条件が、測定時間にわたって定量的である必要があることは、当業者には理解されるであろう。例えば、光分解では、最終的に全ての切断可能な結合が確実に切断されるように、時間の経過とともに線量が増やされ得る。結合した捕捉剤と結合していない捕捉剤の両方の検出は、内部対照としての結合:非結合の比、および最終的にはバイオマーカー濃度の計算を可能とするであろう。
あるいは、内部対照または標準が使用されてもよい。内部標準または対照は、バイオマーカー、捕捉剤、またはバイオマーカーと捕捉剤の複合体などの粒子と同様な特性を有していてもよい。内部対照および基準については、本明細書で前述している。
キット
キットは、光散乱顕微鏡法によるバイオマーカーの検出に適した1つまたは複数の構成要素を含みうる。キットは、本発明の方法に従ってキットを使用するための説明書を含みうる。説明書は、1つまたは複数のバイオマーカーの質量または濃度の参照レベル、および/またはバイオマーカーの参照単一粒子ヒストグラムを提供してもよい。キットはまた、診断方法が実施されうる対象に関する詳細を含みうる。キットは、本明細書に記載の適切な表面、例えば、カバースリップ、捕捉剤、ブロッキング緩衝液、洗浄緩衝液、放出緩衝液、較正チャートまたはヒストグラム、本明細書に記載の本発明の方法に従って使用するための説明書、サンプル収集容器、サンプル収集デバイス(毛細管血収集デバイス、フィンガープリック収集デバイス、または針を含む任意の器具など)、本明細書に記載のバイオマーカーまたは捕捉剤の放出を媒介する薬剤、および較正用の1つまたは複数の標準バイオマーカーサンプルから選択される1つまたは複数のアイテムを含みうる。
キットは、光散乱顕微鏡法によるバイオマーカーの検出に適した1つまたは複数の構成要素を含みうる。キットは、本発明の方法に従ってキットを使用するための説明書を含みうる。説明書は、1つまたは複数のバイオマーカーの質量または濃度の参照レベル、および/またはバイオマーカーの参照単一粒子ヒストグラムを提供してもよい。キットはまた、診断方法が実施されうる対象に関する詳細を含みうる。キットは、本明細書に記載の適切な表面、例えば、カバースリップ、捕捉剤、ブロッキング緩衝液、洗浄緩衝液、放出緩衝液、較正チャートまたはヒストグラム、本明細書に記載の本発明の方法に従って使用するための説明書、サンプル収集容器、サンプル収集デバイス(毛細管血収集デバイス、フィンガープリック収集デバイス、または針を含む任意の器具など)、本明細書に記載のバイオマーカーまたは捕捉剤の放出を媒介する薬剤、および較正用の1つまたは複数の標準バイオマーカーサンプルから選択される1つまたは複数のアイテムを含みうる。
キットは、他の検査パラメータまたは臨床パラメータの測定のための手段をさらに含んでいてもよい。
これらのキットを使用した手順は、臨床検査室、実験室、開業医、または個人によって実行されうる。
これらのキットを使用した手順は、臨床検査室、実験室、開業医、または個人によって実行されうる。
追加の方法論
本発明の方法は、1つまたは複数のさらなるステップを含んでいてもよい。
本発明による診断方法は、本発明による方法の結果に基づいて、対象に診断または予後を帰することをさらに含みうる。診断方法は、本発明の方法に従って疾患もしくは状態を診断された対象に投与するための適切な治療レジメンまたは投薬レジメンを選択することをさらに含みうる。本発明の方法は、対象に適切な治療または投薬レジメンを施すことを含みうる。
本発明の方法は、1つまたは複数のさらなるステップを含んでいてもよい。
本発明による診断方法は、本発明による方法の結果に基づいて、対象に診断または予後を帰することをさらに含みうる。診断方法は、本発明の方法に従って疾患もしくは状態を診断された対象に投与するための適切な治療レジメンまたは投薬レジメンを選択することをさらに含みうる。本発明の方法は、対象に適切な治療または投薬レジメンを施すことを含みうる。
本発明の方法は、細胞またはウイルスの培養方法を変更して、培養の特定のバイオマーカーを低減または増加させることを含みうる。
本発明の方法は、生成物を変更するために製造プロセスを変更することを含んでいてもよく、ここで、本発明の方法による検出のためのバイオマーカーの存在、非存在または量は、生成物の望ましいまたは望ましくない特徴、例えば品質を指し示す。
本発明の方法は、生成物を変更するために製造プロセスを変更することを含んでいてもよく、ここで、本発明の方法による検出のためのバイオマーカーの存在、非存在または量は、生成物の望ましいまたは望ましくない特徴、例えば品質を指し示す。
本発明の方法は、例えば、オリゴマー化、翻訳後修飾、またはバイオマーカー相互作用に影響を及ぼす特徴またはパラメータを除去するために、生成物または培養物を除去または洗浄することを含みうる。
疾患/感染症
本発明の方法は、バイオマーカーの存在を検出するのに適したものでありうる。バイオマーカーは、疾患もしくは状態の存在、種類、発症、重症度、再発の可能性または再発、および進行、または疾患もしくは状態に対する素因などの要因を限定することなく指し示しうる。本明細書で言及される診断は、疾患もしくは状態の存在、種類、発症、重症度、再発の可能性または再発、および進行、または疾患もしくは状態に対する素因についての検査を含む。
本発明の方法は、バイオマーカーの存在を検出するのに適したものでありうる。バイオマーカーは、疾患もしくは状態の存在、種類、発症、重症度、再発の可能性または再発、および進行、または疾患もしくは状態に対する素因などの要因を限定することなく指し示しうる。本明細書で言及される診断は、疾患もしくは状態の存在、種類、発症、重症度、再発の可能性または再発、および進行、または疾患もしくは状態に対する素因についての検査を含む。
素因とは、例えば、対象が特定の時間枠で疾患もしくは状態にかかる可能性である。したがって、本発明は、特定の疾患もしくは状態に対する対象の素因を決定するための、本明細書に記載の方法を提供する。生物学的サンプル中の存在量の少ないバイオマーカーを検出する本発明の能力は、本発明をバイオマーカーが指し示す疾患もしくは状態に対象がかかる可能性を決定するのに特に適したものにする。他の実施形態において、本方法は、対象における疾患を診断する方法であり、対象における検出可能なマーカーの存在は、対象が疾患を有することを指し示し、対象において検出可能なマーカーが存在しないことは、対象が疾患を有していないことを指し示す。
適切には、本明細書に記載の診断方法は、対象から得られたサンプルに対して実施される。サンプルは、毛細管血収集デバイス、フィンガープリック収集デバイス、または針を含む任意の機器を使用して取得されうる。サンプルは、任意の適切な生検手法、または気管支肺胞洗浄、喀痰吸引、スワブなどを含む収集方法を使用して収集することができ、任意の適切な容器に入れることができる。
本発明は、がん、変性疾患、肝障害または疾患、細菌、真菌またはウイルス感染、または炎症性疾患を含むが、これらに限定されない疾患もしくは状態の診断に好適でありうる。
本発明は、任意のタンパク質修飾を伴う疾患もしくは状態の診断に好適であり、タンパク質オリゴマー化、タンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質と他の生体分子(例えば、核酸、糖、ポリマー、より小さいペプチド、有機および無機分子)との相互作用、タンパク質の翻訳後修飾(例えば、タンパク質のリン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、核酸(例えば、メチル化)または多糖(例えば、特定のアセチル-またはアシル-基の存在)における変化により引き起こされる疾患を含むが、限定はされない。本発明は、特定のDNAまたはRNA配列;エンベロープおよび/または膜タンパク質;リポ多糖;エフェクタータンパク質の存在を含む、特定のバイオマーカーの存在/非存在による特定の細菌、真菌またはウイルス感染の検出に適している場合がある。本発明は、炭水化物、核酸またはタンパク質バイオマーカー、またはそれらの任意の組み合わせの検出による、がんの診断に適している場合がある。
タンパク質修飾に関連する疾患は、スクレイピーなどのプリオン病、動物のスクレイピーおよびウシ海綿状脳症、ヒトのクロイツフェルト-ヤコブ病およびゲルストマン-シュトラウスラー-シャインカー病を含む。封入体の形成をもたらすタンパク質の凝集は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む、多くの神経変性疾患に共通する病理学的特徴である。
本明細書で使用される「がん」という用語は、リンパ腫、リンパ球性白血病、肺がん、非小細胞肺(NSCL)がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系(CNS)の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、神経鞘腫、上衣、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮がん、下垂体腺腫、ユーイング肉腫、上記のがんのいずれかの難治性の型、または上記のがんの1つまたは複数の組み合わせを含む増殖性疾患を指す。
炎症性疾患は、心血管疾患、炎症性腸疾患、感染症、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、アレルギー疾患、喘息、およびCOPDなどの状態が含まれるが、これらに限定はされない。
自己免疫疾患は、免疫系が自己抗原に反応し、組織の損傷または機能不全を引き起こす、共通の病因を持つ多様な疾患群である。クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患(Norouziniaら、Gastroenterol. Hepatol. from Bed to Bench 10、155~167ページ(2017年);Jin, F.ら、Front. Immunol. 9、1~9ページ(2018年);Shi, G., Zhang, Z. & Li, Q. J. Immunol. Res. 2017年、1~2ページ(2017年);Prince, H. E. Biomarkers 10 Suppl 1、44~49ページ(2005年))。
肝臓の損傷は、アルコール関連の肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、肝炎、ヘモクロマトーシス、および肝硬変を含みうる。
細菌、真菌、寄生虫、またはウイルス感染は、例えば、ボルデテラ、クラミジア、またはマイコプラズマ、レジオネラ、細菌性髄膜炎、肺炎、気管支炎、敗血症などの細菌感染、ならびにコロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、またはC型肝炎ウイルス(HCV))、HSV、CMV、ライノウイルス、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、パラインフルエンザ、またはRSVなどのウイルス感染を含むが、これらに限定はされない。真菌感染症は、アスペルギルス、カンジダ、ペニシリン、パラコクシド、ヒストプラズマ、フォンセカエア、クリプトコッカス、サッカロミセス、ピキア、Cアルビカンス、Cグラブラタ、Cトロピカリス、フザリウム種、サッカロミセスセレビシエ、アクレモニウム種を含むが、これらに限定はされない。寄生虫感染は、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、およびアフリカトリパノソーマ症を含むが、これらに限定はされない。また、アメーバの感染も検出されることがあり、例えば、ネグレリアフォーレリまたは赤痢アメーバがある。
細菌、真菌、寄生虫、またはウイルス感染は、例えば、ボルデテラ、クラミジア、またはマイコプラズマ、レジオネラ、細菌性髄膜炎、肺炎、気管支炎、敗血症などの細菌感染、ならびにコロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、またはC型肝炎ウイルス(HCV))、HSV、CMV、ライノウイルス、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、パラインフルエンザ、またはRSVなどのウイルス感染を含むが、これらに限定はされない。真菌感染症は、アスペルギルス、カンジダ、ペニシリン、パラコクシド、ヒストプラズマ、フォンセカエア、クリプトコッカス、サッカロミセス、ピキア、Cアルビカンス、Cグラブラタ、Cトロピカリス、フザリウム種、サッカロミセスセレビシエ、アクレモニウム種を含むが、これらに限定はされない。寄生虫感染は、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、およびアフリカトリパノソーマ症を含むが、これらに限定はされない。また、アメーバの感染も検出されることがあり、例えば、ネグレリアフォーレリまたは赤痢アメーバがある。
工業的な用途
本文で説明されているアプローチは、診断薬用途に限られず、品質管理、環境管理、およびバイオ分析法などの関連する他の用途に拡張することが可能である。本発明は、食品および飲料の大量生産など、生体分子の検出および/または定量化を必要とする任意の用途において有用となりうる。
本文で説明されているアプローチは、診断薬用途に限られず、品質管理、環境管理、およびバイオ分析法などの関連する他の用途に拡張することが可能である。本発明は、食品および飲料の大量生産など、生体分子の検出および/または定量化を必要とする任意の用途において有用となりうる。
したがって、本発明の方法は、サンプルまたは細胞またはウイルス培養における汚染の検出、既知の標準と比較したサンプルの品質の決定、生体分子の修飾(例えばタンパク質の翻訳後修飾)の検出、サンプル中の2つ以上の生体分子間の相互作用の検出または定量化(例えば、結合または会合の検出または定量化)、サンプル中の2つ以上のバイオマーカーの量の比較、生成物の発現レベルの定量化に有用となりうる。
本発明はまた、ウイルス感染などの感染の大流行について下水または廃液を検査するなどの大量検査手順にも有用でありうる。
本明細書に記載のキットは、そのような方法での使用のために提供されうる。
本明細書に記載のキットは、そのような方法での使用のために提供されうる。
この明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「含む(comprise)」および「含有する(contain)」という語、ならびにその変形、例えば「含んでいる(comprising)」および「含む(comprises)」は、「含むが限定されない(including but not limited to)」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図するものではない(そして除外しない)。
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを要求しない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈がそうでないことを要求しない限り、明細書は複数性と単数性を意図していると理解されるべきである。
本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、化学部分または化学基は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。
読者の注意は、本願に関連して本明細書と同時にまたは以前に提出され、本明細書とともに公の閲覧に供される全ての論文および文献に向けられ、そのような全ての論文および文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されている全ての特徴(添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)、および/またはそのように開示されている方法またはプロセスの全てのステップは、そのような特徴および/またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせられうる。
本明細書(添付の特許請求の範囲、要約、および図面を含む)に開示されている各特徴は、別段の明示的な記載がない限り、同じ、同等または類似の目的を果たす別の特徴に置き換えられうる。したがって、特に明記しない限り、開示の各特徴は、一般的な一連の等価または同様な特徴の例に過ぎない。
本発明は、前述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書(添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)に開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせ、またはそのように開示された任意の方法またはプロセスのステップの任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。
実施例1
清潔なカバースリップを抗体(ハーセプチン)(Hoffmann-LaRoche)の400μM溶液10μlとともに10分間インキュベートし、非特異的な吸収によりカバースリップに結合させた。インキュベーション後、カバースリップをTBS緩衝液で洗浄することにより、過剰な未結合抗体を除去した。インラインの窒素空気を使用して、過剰な緩衝液を除去した。次に、10μlのHer2(約500nM)をカバースリップに加え、室温で20分間インキュベートして、カバースリップ中の抗体にタンパク質を結合させた。インキュベーション後、過剰な未結合のタンパク質を豊富なTBS緩衝液で洗浄することにより除去した。カバースリップをインラインの窒素空気を使用して乾燥させ、マスフォトメトリーに使用した。AcquireMP(Refeyn、英国)は、1動画あたり512×260ピクセルのROI(関心領域)を18000フレーム収集するように設定した。測定のために、10μlのTBS(pH7.4)をカバースリップに加えて焦点を見つけ、対照データを取得して、コーティング自体によるランダムな結合/非結合イベントを評価した(対照実験、図2a)。次に、5μlの緩衝液を除去し、5μlの塩酸(1M)を混合せずに添加し、第2の動画を取得した(図2b)。
清潔なカバースリップを抗体(ハーセプチン)(Hoffmann-LaRoche)の400μM溶液10μlとともに10分間インキュベートし、非特異的な吸収によりカバースリップに結合させた。インキュベーション後、カバースリップをTBS緩衝液で洗浄することにより、過剰な未結合抗体を除去した。インラインの窒素空気を使用して、過剰な緩衝液を除去した。次に、10μlのHer2(約500nM)をカバースリップに加え、室温で20分間インキュベートして、カバースリップ中の抗体にタンパク質を結合させた。インキュベーション後、過剰な未結合のタンパク質を豊富なTBS緩衝液で洗浄することにより除去した。カバースリップをインラインの窒素空気を使用して乾燥させ、マスフォトメトリーに使用した。AcquireMP(Refeyn、英国)は、1動画あたり512×260ピクセルのROI(関心領域)を18000フレーム収集するように設定した。測定のために、10μlのTBS(pH7.4)をカバースリップに加えて焦点を見つけ、対照データを取得して、コーティング自体によるランダムな結合/非結合イベントを評価した(対照実験、図2a)。次に、5μlの緩衝液を除去し、5μlの塩酸(1M)を混合せずに添加し、第2の動画を取得した(図2b)。
TBS pH7.4でインキュベートしたコーティングされたカバースリップは、その表面からのタンパク質の有意な放出を示さない(図2a)。
TBS緩衝液にHClを加えて緩衝液のpHを下げると、ハーセプチンからのHer2タンパク質の放出が誘導されるが、ハーセプチンのほとんどは表面に結合したままとなる。緩衝液のpHを下げると、抗体が結合した抗原を放出することが誘導されることが知られており、これはHer2の結合解除を説明する。表面の不動態化の欠如は、Her2がガラス上の空いているスペースに再結合することを可能とし、これが図2bの結合イベント数の多さ(334の結合イベント)の説明となりうる。それでも、結合解除イベントの数は、結合よりも多い(516の結合解除イベントと334の結合)。
TBS緩衝液にHClを加えて緩衝液のpHを下げると、ハーセプチンからのHer2タンパク質の放出が誘導されるが、ハーセプチンのほとんどは表面に結合したままとなる。緩衝液のpHを下げると、抗体が結合した抗原を放出することが誘導されることが知られており、これはHer2の結合解除を説明する。表面の不動態化の欠如は、Her2がガラス上の空いているスペースに再結合することを可能とし、これが図2bの結合イベント数の多さ(334の結合イベント)の説明となりうる。それでも、結合解除イベントの数は、結合よりも多い(516の結合解除イベントと334の結合)。
結果は、乳がんバイオマーカー(Her2)を抗体(Herceptin)から、その放出を誘導する条件を使用して、放出させることが可能なことを示しており、さらに、結果は、マスフォトメトリーを使用して抗体からのバイオマーカーの結合解除を評価することができ、その放出イベントの前後に、Her2の有無にかかわらず、表面に結合したハーセプチンの分子量を評価することにより、放出を確認できることを示している。そのようなことが図1に表されている。ハーセプチンで官能化されたカバースリップを用意する。これを多くの成分を含み得るサンプルと一緒にインキュベートする。ハーセプチンはHer2(存在する場合)に特異的に結合し、他の成分は洗い流される。次に、表面を装置に導入し、対象物(ここでは、Her2が結合している、または結合していないハーセプチン)を表す表面の画像を撮影する。次いで、ハーセプチンが表面から放出されるように条件を変更する。次いで、各対象物の光散乱の変化を決定し、放出された粒子の質量を割り当てることができる。質量は、放出されたハーセプチンのみか(Her2なし)、Her2に結合したハーセプチンかを指し示すであろう。未結合のハーセプチンに対する結合したハーセプチンの比率を使用して、サンプル中のHer2の濃度を指し示すことができる。
実施例2
実験セットアップの概要(図4)
ガラスカバースリップをPEGとPEG-ビオチンの混合物でコーティングした(ステップ1)。PEGは、表面への非特異的なタンパク質の結合を最小限に抑える既知の防汚コーティングである。PEG-ビオチンポリマー中に存在するビオチン分子は、このタンパク質とのインキュベーション時にストレプトアビジンに結合するであろう(ステップ2)。
実験セットアップの概要(図4)
ガラスカバースリップをPEGとPEG-ビオチンの混合物でコーティングした(ステップ1)。PEGは、表面への非特異的なタンパク質の結合を最小限に抑える既知の防汚コーティングである。PEG-ビオチンポリマー中に存在するビオチン分子は、このタンパク質とのインキュベーション時にストレプトアビジンに結合するであろう(ステップ2)。
ここでビオチンを介してコーティングに結合したストレプトアビジンは、ビオチン標識タンパク質、この場合はビオチンで標識されたハーセプチン抗体の捕捉剤として使用される(ステップ3)。ガラス表面にPEGが存在するため、他のタンパク質の付着が最小限に抑えられる。したがって、たとえハーセプチン-ビオチン(Herc-B)が血清タンパク質などの他のタンパク質の複雑な混合物と一緒に表面でインキュベートされたとしても、インキュベーションと洗浄後にガラスに残る唯一のタンパク質は、標識された抗体、Herc-Bとなるであろう(ステップ3)。
ストレプトアビジンは、標識された抗体などの標識分子よりも遊離ビオチンに対して有意に高い親和性を有するため、高濃度の遊離ビオチンをガラスカバースリップに添加すると、ガラス表面からの抗体の放出が促進されることになる(ステップ4)。この放出に続いて、表面での光散乱を測定し、シグナルの大きさの変化に注目することにより、マスフォトメトリーを行うことができる。
詳細なプロトコル - カバースリップの調製:
清潔なカバースリップを比率(9:1)のPEGとPEG-ビオチンでコーティングした。コーティングされたカバースリップをストレプトアビジン(200nMで50μl)とともに30分間インキュベートして、コーティング上のビオチンにストレプトアビジンを結合させた。インキュベーション後、カバースリップを十分に洗浄し、乾燥させた。
清潔なカバースリップを比率(9:1)のPEGとPEG-ビオチンでコーティングした。コーティングされたカバースリップをストレプトアビジン(200nMで50μl)とともに30分間インキュベートして、コーティング上のビオチンにストレプトアビジンを結合させた。インキュベーション後、カバースリップを十分に洗浄し、乾燥させた。
コーティングがHerc-Bの選択的結合を促進し、表面に結合する他のタンパク質を効果的に低減させるかどうかを判断するために、カバースリップ上でのインキュベーションの前に、希釈したウシ胎児血清(FBS)とHerc-Bとを混合した。FBSをPBSで2倍に希釈し、Herc-Bと混合して、標識抗体の最終濃度を100nMとした。次いで、結果として得られた複雑で濃度の高いタンパク質混合物をカバースリップ上で30分間インキュベートした後、洗浄して結合していないタンパク質を除去し、乾燥させ、マスフォトメトリー測定に使用した。
マスフォトメトリー測定および結果:
Herc-Bが複雑なサンプルの一部であった場合、コーティングされたカバースリップからHerc-Bが放出された後:
調製したカバースリップをマスフォトメーターに導入し、初期測定を行い、カバースリップから放出されたタンパク質またはカバースリップに結合したタンパク質を500秒間、大視野を用いて追跡した。
Herc-Bが複雑なサンプルの一部であった場合、コーティングされたカバースリップからHerc-Bが放出された後:
調製したカバースリップをマスフォトメーターに導入し、初期測定を行い、カバースリップから放出されたタンパク質またはカバースリップに結合したタンパク質を500秒間、大視野を用いて追跡した。
簡単に説明すると、測定は次のようにして実行した:
ウェルを20ulのPBSで約5分間インキュベートして、表面を再水和させた。この短いインキュベーションの後、PBSを除去し、新鮮なPBSを加え、対照測定を行った。ベースラインまたは対照測定中に検出されたイベントは、コーティング上の非特異的な結合解除/結合およびバックグラウンドノイズを説明する。対照測定の後、PBSを除去し、遊離ビオチンを25mMの濃度でガラスに添加したのと同じウェルで測定を行った。
ウェルを20ulのPBSで約5分間インキュベートして、表面を再水和させた。この短いインキュベーションの後、PBSを除去し、新鮮なPBSを加え、対照測定を行った。ベースラインまたは対照測定中に検出されたイベントは、コーティング上の非特異的な結合解除/結合およびバックグラウンドノイズを説明する。対照測定の後、PBSを除去し、遊離ビオチンを25mMの濃度でガラスに添加したのと同じウェルで測定を行った。
結果(表1および図5)は、ビオチンの存在が、Herc-B抗体に予想される150kDaに近い分子量と関連付けることができるイベントの全体的な検出数、特に結合解除イベントの数を有意に増加させることを指し示している(図5)。表1は、様々な粒子の放出が76~273kDaの範囲内で検出されると仮定して、この範囲内で検出された結合および結合解除イベントの数をまとめたものである。
データは、遊離ビオチン添加後の最初の500秒で、Herc-Bの分子量範囲内の460イベントの放出が促進されたことを示している(図5の濃い灰色の線)。連続的な測定は、より多くのカウントを示したが、結合(図示せず)と結合解除イベント(図5、薄い灰色の線)の数の差はより小さくなっており、これは結合解除イベントのほとんどが最初の500秒以内に起こったことを指し示している。どちらの時点でも、結合イベントと結合解除イベントの差はPBS対照よりも大きく、これはビオチンが標識抗体の制御された放出を促進することを指し示している(表1)。
さらに、ビオチンを使用して検出された放出イベントのほとんどは、放出された粒子が、Herc-B放出に予想される予想分子量放出に近い分子量を有しているという計算を可能にし、これはコーティングが、ウシ血清中に存在する一般的なタンパク質(非常に高濃度)と低濃度(100nM)で混合されたHerc-Bにより構成される複雑で高濃度なタンパク質混合物から抗体を効果的に捕捉したことを指し示している。
図5は、検出された負の質量イベント、つまり結合解除イベントのみを示している。表面の複合体(対象物)が粒子(この場合はHerc-B)の放出についてモニタリングされるため、負の質量が検出される。この抗体の分子量は既知であるため、表面からの予想される質量の放出を伴う結合解除イベントをモニタリングすることが可能である。図5は、表面から放出された質量(kDa)対カウントのヒストグラムである。3セットのデータが示されている - 濃い灰色と薄い灰色の線は、25mMのビオチンで得られた結果を指し示している(2回反復)。最も濃い線は、ビオチンの代わりにPBSを使用した結果を示している。
したがって、この実施例は、本発明の方法において放出剤として使用されるビオチンの能力を実証し、また、ストレプトアビジン捕捉剤を固定化するためのビオチン化PEGの有用性も実証する。結合イベントが記録されたが、これは本発明の方法にとって重要ではない。抗体の放出は、放出イベントとして検出でき、表面における変化の大きさを使用して、分子量を粒子に割り当てることができる。
Claims (25)
- 干渉光散乱法またはマスフォトメトリーによってサンプル中のバイオマーカーを検出する方法であって、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義し、光散乱を使用して表面の測定を行うステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
V)表面での光散乱の変化を決定することにより、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含む方法。 - ステップV)が、表面からの質量の損失を決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 表面からの質量の損失が、粒子のアイデンティティの決定を可能にする、請求項2に記載の方法。
- ステップIV)が、表面の検出領域への放出剤の適用を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップIV)が、表面の検出領域の化学的環境を変更すること;捕捉剤の酵素消化、および/または捕捉剤の光分解を含む、請求項4に記載の方法。
- 放出剤が酵素、光、緩衝液または化学試薬である、請求項4または5に記載の方法。
- 表面の検出領域が、不動態化、活性化、コーティング、処理、または誘導体化されている、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- バイオマーカーの濃度を測定するための請求項1から7のいずれか一項に記載の方法であって、i)請求項1の粒子の予想される質量を決定するステップ、ii)表面から放出された予想される質量またはコントラストの粒子の数を決定するステップ;および場合によりiii)標準曲線または検量線とii)の結果を比較するステップを含む、方法。
- 表面の第2の検出領域またはさらなる検出領域についてステップIV)およびV)を繰り返すことを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 干渉光散乱法またはマスフォトメトリーによって、対象におけるバイオマーカーの存在または量に関連する疾患もしくは状態を診断する方法であって、
I)表面上に固定化された捕捉剤を含む表面を溶液中に提供するステップであって、捕捉剤がサンプル中に存在するバイオマーカーに結合することができる、ステップ;
II)サンプル中のバイオマーカーの捕捉剤への結合を可能とする条件下で、表面をサンプルと接触させるステップ;
III)表面の第1の検出領域を定義し、光散乱を使用して表面の測定を行うステップ;
IV)表面に結合した粒子を放出させるステップであって、粒子が以下:
i.結合している捕捉剤から放出されたバイオマーカー;
ii.捕捉剤に結合したバイオマーカーを含む複合体;および/または
iii.結合していない捕捉剤
から選択される、ステップ;
V)光散乱の変化を決定することにより、表面の第1の検出領域から放出された粒子を検出するステップ
を含み、
ここでi)またはii)の存在または非存在が、対象における疾患もしくは状態の存在、重症度、または発症の可能性を指し示す、方法。 - 請求項1から9のいずれか一項において定義される方法である、請求項10に記載の方法。
- i)表面を提供するステップ;
ii)バイオマーカーの存在および/または量について分析されるサンプルを提供するステップ;
iii)検出されるバイオマーカーに特異的に結合する捕捉剤を表面に固定化するステップ
をさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。 - ステップII)が、サンプル中に存在するバイオマーカーを表面上に固定化された捕捉剤に結合させるのに適した条件下で、サンプルとともに表面を適切な時間の間インキュベートすることを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 物質または組成物が投与される対象、または治療または投薬レジメンが処方される対象を選択する方法であって、前記物質または組成物またはレジメンが、対象からのサンプル中のバイオマーカーの存在または量に関連する疾患もしくは状態を治療または予防するのに適しており、方法が、請求項10から13のいずれか一項において定義される診断方法を含む、方法。
- 対象において、請求項10から13のいずれか一項に従って、疾患もしくは状態を有するか、または前記疾患もしくは状態を発症する可能性があると診断された対象における疾患もしくは状態を治療または予防する方法であって、方法が、対象における前記疾患もしくは状態を治療または予防するのに有効な、物質もしくは組成物を対象に投与するステップ、またはレジメンを対象に実施するステップを含む、方法。
- 対象において、請求項10から13のいずれか一項に従って、疾患もしくは状態を有するか、または前記疾患もしくは状態を発症する可能性があると診断された対象における疾患もしくは状態を治療または予防する方法における使用のための物質または組成物。
- バイオマーカーが、タンパク質およびそのフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機もしくは無機化学物質、天然ポリマー、または小分子、またはそれらの組み合わせである、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 捕捉剤が、抗体またはその誘導体、核酸、タンパク質、無機分子、またはポリマーである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 捕捉剤が、化学的消化、酵素による消化、または光分解による切断のための、1つまたは複数の切断部位を含み、バイオマーカーを捕捉剤から放出させる、および/または捕捉剤を表面から放出させる、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の方法を含む、生体分子の修飾を検出する方法であって、バイオマーカーが、修飾された生体分子の存在を指し示す、方法。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の方法を含む、サンプル中の2つ以上の生体分子間の相互作用を検出する方法であって、バイオマーカーが、2つ以上の生体分子間の相互作用の存在を指し示す、方法。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の方法を含む、サンプル中の汚染を検出する方法であって、バイオマーカーがサンプルの汚染を指し示す、方法。
- 請求項8に記載の方法を含む、産物の発現レベルを定量化する方法であって、バイオマーカーが発現産物の存在を指し示す、方法。
- 表面、捕捉剤、緩衝液、請求項1から23のいずれか一項において定義される方法に従う使用のための説明書、サンプル収集デバイス、較正用の1つまたは複数の標準バイオマーカーサンプル、および場合により表面からのバイオマーカーまたは捕捉剤の放出を媒介するための薬剤を含むキット。
- 薬剤が化学試薬または酵素である、請求項24に記載のキット。
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