JP2018530755A - ナノ小胞の多重表現型決定法 - Google Patents

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Abstract

SP-IRISシステムを使用した定量化ならびに/または特徴決定（例えば、サイズおよび/もしくは形状の識別）のため、生物学的試料由来の細胞外小胞を捕捉する方法を、本明細書において提供する。捕捉された細胞外小胞の上または捕捉された小胞の内部のバイオマーカー（例えば、小胞内バイオマーカーもしくはエクソソーム内バイオマーカー）を検出する方法も、本明細書において提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2015年9月22日に出願された米国仮出願第62/221,806号の35 U.S.C.§119（e）の下での恩典を主張するものであり、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
政府の後援
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された契約番号AI089673の下で政府の後援を受けて成された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
開示の分野
本開示は、一粒子レベルでの細胞外小胞の定量化および特徴決定に関する。いくつかの態様において、本開示は、さらに、細胞外小胞の表面または小胞内空間におけるバイオマーカー発現の検出および/または定量化に関する。
背景
マイクロアレイテクノロジーのようなハイスループットのDNAおよびタンパク質の分析テクノロジーは、創薬、疾患研究、および診断のためのバイオマーカーのハイスループットスクリーニングのため、今日、生物学者および研究者によって活発に使用されている。基質によって増強された（Substrate enhanced）マイクロアレイ画像化は、数万個のスポットにおける表面への生体分子の結合を、標識なしで同時に検出する能力を有する。
単一粒子干渉反射画像化センサー（SP-IRIS, single particle interferometric reflectance imaging sensor）システムは、検出および測定の干渉原理のための照明源として利用され得る発光ダイオード（LED）のような複数の非干渉性光源を含む。LEDは、極めて低コストであり、コンパクトであり、かつ頑強であり、従って、診断および研究に適用するための大規模な使用および流通にとって理想的である。SP-IRISシステムは、分析物または試料の中の単一の生体分子標的の高倍率の検出および画像化を可能にする低コストの非干渉性照明源を使用する。
SP-IRISシステムは、関心対象の粒子が捕捉されているセンサー表面からの反射光の画像化に基づく。SP-IRISセンサーは、層状の誘電性基質から構成されている。層構造は、ナノ粒子標的による散乱光と基質から反射された参照光との間の必要な光路長差を提供する。このSP-IRISセンサーは、シリコン（Si）上の二酸化ケイ素のような多様な誘電性材料で作製され得る。
概要
本明細書に記載された方法は、SP-IRISが、生物学的試料由来の細胞外小胞のSP-IRISセンサーへの捕捉のために使用され得、さらに、細胞外小胞の定量化および特徴決定を可能にするという発見に部分的に基づく。さらに、SP-IRISシステムは、捕捉された細胞外小胞の表面または細胞外小胞の内部におけるバイオマーカー（例えば、小胞内バイオマーカーもしくはエクソソーム内バイオマーカー）の存在を検出するためにさらに利用され得る。
従って、一つの局面において、（a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、（b）捕捉された小胞を有するセンサーを、ナノ粒子を含む二次プローブと接触させる工程、および（c）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法が、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるこの局面および他の全ての局面の一つの態様において、細胞外小胞特異的プローブおよび/または二次プローブは、抗体を含む。
本明細書に記載されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、特定のエクソソーム集団の単離および識別を可能にするため、複数の細胞外小胞特異的プローブが、生物学的試料と接触させられる。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の二次プローブが、多重フォーマットで、捕捉された小胞を有するセンサーと接触させられる。多重フォーマットは、特定の細胞外小胞および/またはその構成成分をそれぞれ区別して標識および同定することを可能にする。いくつかの態様において、そのような区別された標識は、例えば、異なる蛍光マーカー、異なるサイズまたは形のナノ粒子または金粒子によって区別して標識されている少なくとも2種（例えば、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、またはそれ以上）の二次プローブを使用することによって達成される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、細胞外小胞はエクソソームを含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、捕捉された小胞は、センサー上で固定されかつ/または透過処理される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、二次プローブは、小胞内マーカーまたはエクソソーム内マーカーに結合する。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、生物学的試料は、対象から入手された試料を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、対象から入手された試料は、血液試料を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、細胞外小胞特異的抗体は、抗CD63抗体を含む。本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面の他の態様において、細胞外小胞特異的抗体は、抗CD81抗体または抗CD9抗体を含む。本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、少なくとも2種の細胞外小胞特異的抗体が組み合わせられて使用される。例えば、CD63/CD81抗体の組み合わせ、CD63/CD9抗体の組み合わせ、またはCD81/CD-9抗体の組み合わせ。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、細胞外小胞特異的抗体は、バイオマーカーに対する抗体を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、ナノ粒子は、金粒子を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、捕捉された細胞外小胞は、サイズおよび/または形によって特徴決定される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、センサーは、細胞外小胞集団の多重の検出または識別のための少なくとも1種の付加的な細胞外小胞特異的抗体または複数の異なる細胞外小胞特異的抗体をさらに含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の細胞外小胞特異的抗体は、少なくとも2種、少なくとも5種、少なくとも10種、少なくとも50種、少なくとも100種、またはそれ以上の異なる細胞外小胞特異的抗体を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、多重検出は、複数の二次プローブをさらに含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の二次プローブは、区別して標識される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の二次プローブは、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、二次プローブは、エクソソーム内マーカーに結合する。
本明細書において提供されるもう一つの局面は、（a）第1のプローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、少なくとも1種の小胞をセンサーに捕捉する工程、（b）結合した細胞外小胞を定量化し個々に特徴決定するため、センサーを画像化する工程、（c）センサーを、標識にコンジュゲートされた細胞外小胞上のバイオマーカーに結合する二次認識プローブを含む第2のプローブと接触させる工程、および（d）センサーを画像化し、その画像を工程（b）において得られた画像と比較し、その際、工程（b）において画像化されたシグナルと比較された（d）において画像化されたシグナルの変化を、少なくとも1種の小胞におけるバイオマーカーの存在の指標とする工程、を含む、対象の生物学的試料由来の細胞外小胞におけるバイオマーカーの存在を決定するアッセイに関する。
本明細書に記載されるこの局面および他の全ての局面の一つの態様において、少なくとも1種の細胞外小胞は、エクソソームを含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、第1および/または第2のプローブは、抗体を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、生物学的試料は、対象から入手された試料を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、対象から入手された試料は、血液試料を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、第1のプローブは、抗CD63抗体を含む。本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面の他の態様において、細胞外小胞特異的抗体は、抗CD81抗体または抗CD9抗体を含む。本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、少なくとも2種の細胞外小胞特異的抗体が組み合わせられて使用される。例えば、CD63/CD81抗体の組み合わせ、CD63/CD9抗体の組み合わせ、またはCD81/CD-9抗体の組み合わせ。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、第1および/または第2の抗体は、バイオマーカーに対する抗体を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、ナノ粒子は、金粒子を含む。本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、二次標識は、例えば、フルオロフォアまたは量子ドットに付着した抗体を使用した蛍光であり得る。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、捕捉された細胞外小胞は、サイズおよび/または形によって特徴決定される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、センサーは、細胞外小胞集団の多重の検出または識別のための少なくとも1種の付加的な細胞外小胞特異的抗体または複数の異なる細胞外小胞特異的抗体をさらに含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の細胞外小胞特異的抗体は、少なくとも2種、少なくとも5種、少なくとも10種、少なくとも50種、少なくとも100種、またはそれ以上の異なる細胞外小胞特異的抗体を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、バイオマーカーは、小胞内マーカーまたはエクソソーム内マーカーである。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、バイオマーカーは、小胞外マーカーまたはエクソソーム外マーカーである。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の二次プローブが、本明細書に記載された方法またはアッセイにおいて使用される。本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、アッセイは、区別して標識された二次認識プローブによって多重に実施される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の二次プローブは、区別して標識される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の二次プローブは、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識される。
本明細書において提供されるもう一つの局面は、（a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、（b）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を検出する工程、を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞の標識なしの検出の方法またはアッセイに関する。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、方法は、捕捉された細胞外小胞のサイズ、形、および数を決定する工程をさらに含む。
もう一つの局面において、（a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、（b）捕捉された小胞を有するセンサーを、検出可能モエティをさらに含む小胞外バイオマーカーに対する二次プローブと接触させる工程、および（c）SP-IRISシステムを使用して検出可能モエティを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞（例えば、1個または複数個の個々の細胞外小胞）上の小胞外バイオマーカーを検出する工程、を含む、細胞外小胞（例えば、1個または複数個の個々の細胞外小胞）上の小胞外バイオマーカーを検出する方法またはアッセイも、本明細書において提供される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面の一つの態様において、方法またはアッセイは、多重フォーマットを使用して実施される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、多重フォーマットは、工程（b）における複数の二次プローブの使用を含む。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の二次プローブは、区別して標識される。
本明細書において提供されるこの局面および他の全ての局面のもう一つの態様において、複数の二次プローブは、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識される。
本明細書に記載されるもう一つの局面は、（a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、（b）工程（a）からの捕捉された小胞を固定しかつ/または透過処理する工程、（c）捕捉された小胞を有するセンサーを、検出可能モエティをさらに含む小胞内バイオマーカーに対する二次プローブと接触させる工程、および（d）SP-IRISシステムを使用して検出可能モエティを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞の小胞内バイオマーカーを検出する工程、を含む、細胞外小胞の内部の小胞内バイオマーカーを検出する方法またはアッセイに関する。
本明細書において提供されるもう一つの局面は、（a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、（b）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法に関する。
もう一つの局面において、（a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、（b）捕捉された小胞を有するセンサーを、蛍光タグまたは量子ドットによってタグ付けされた二次プローブと接触させる工程、および（c）SP-IRISシステムを使用して蛍光タグまたは量子ドットを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法も、本明細書において提供される。
本明細書において提供されるもう一つの局面は、（a）少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料を、1種または複数種のバイオマーカーに結合する1種または複数種の区別して標識されたプローブと接触させる工程、（b）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、工程（a）の標識された生物学的試料と接触させ、それによって、工程（a）の標識された生物学的試料由来の細胞外小胞の集団をセンサーに捕捉する工程、（c）SP-IRISシステムを使用して工程（b）の捕捉された細胞外小胞を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、（d）SP-IRISシステムを使用して1種または複数種の区別して標識されたプローブを画像化し、それによって、生物学的試料の中の1種または複数種の区別して標識されたプローブによって標識された細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、および（e）工程（b）において捕捉された細胞外小胞の集団の中の1種または複数種のバイオマーカーを発現する細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定するため、工程（d）において得られた画像を工程（c）において得られた画像と比較する工程、を含む、バイオマーカーを発現する集団内の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法に関する。
異なる細胞株からの細胞外小胞検出を示す。 SP-IRISプラットフォームによる特異的エクソソーム検出の模式図を示す。異なる表面マーカーを標的とするプローブが、チップに固定化される。粒子は、標識なしに検出される。直交の共局在情報が、ナノ粒子タグを介して決定され得る。付加的なタグが、同一のエクソソームに対して使用され得る。 A、光の2つの波長（λ＝525nmおよびλ＝625nm）についてのSP-IRISからの予想される粒子応答。B、不均一なサイズの粒子の例としての画像。 標識なしの集団および金ナノ粒子によって標識された集団についての生データの分析（サイズ対カウント）。 エクソソームに対する例示的な終点SP-IRIS検出実験を示す。捕捉されたエクソソーム（標識なし）のサイズヒストグラム、およびAu-NPによる二次標識工程の後のサイズ分布の変化は、サイズおよび表現型を直接検出する能力を証明する。 Panc-1細胞培養培地からのエクソソームを、エクソソーム特異的プローブによって機能化されたSP-IRISセンサー表面と接触させた。図6Aは、プローブスポット上の捕捉された小胞の標識なしのSP-IRIS画像を示す。図6Bは、標識なしのSP-IRIS画像の小さい挿入図である。標識なしのSP-IRIS画像は、小胞の検出およびサイズの決定を可能にする。図6Cは、Molecular Probes（商標）からのSYTO RNA Select細胞染料と共にSP-IRISセンサーをインキュベートした後に同スポットにおいて得られた蛍光画像である。図6Dは、図6Bの標識なしのSP-IRIS画像との比較のための蛍光画像の小さい挿入図を示す。2つの画像を比較することによって、集団内の小胞のうちの一部のみがRNAを含有していることが分かる。矢印は、読み手が図6Bおよび6Dの2つの画像を比較する際の助けとなる。 Panc-1細胞培養培地からのエクソソームを、エクソソーム特異的プローブによって機能化されたSP-IRISセンサー表面と接触させた。図7Aは、プローブスポット上の捕捉された小胞の標識なしのSP-IRIS画像を示す。図7Bは、標識なしのSP-IRIS画像の小さい挿入図を示す。標識なしのSP-IRIS画像は、小胞の検出およびサイズの決定を可能にする。図7Cは、Molecular Probes（商標）からのBODIPY TR Ceramide膜染料と共にSP-IRISセンサーをインキュベートした後に同スポットにおいて得られた蛍光画像である。図7Dは、図7Bの標識なしのSP-IRIS画像との比較のための蛍光画像の小さい挿入図を示す。2つの画像を比較することによって、標識なしで検出された小胞の大部分が、蛍光画像によって示される脂質を含有していることが分かる。矢印は、読み手が2つの画像を比較する際の助けとなる。
詳細な説明
SP-IRISシステムを使用した定量化ならびに/または特徴決定（例えば、サイズおよび/もしくは形の識別）のため、生物学的試料由来の細胞外小胞を捕捉する方法が、本明細書において提供される。捕捉された細胞外小胞の上または捕捉された小胞の内部のバイオマーカー（例えば、小胞内バイオマーカーもしくはエクソソーム内バイオマーカー）を検出する方法も、本明細書において提供される。
定義
本明細書において使用されるように、「試料」という用語は、少なくとも1種の細胞外小胞を含む試料をさす。一つの態様において、「生物学的試料」とは、その用語が本明細書において使用されるように、少なくとも1種の細胞外小胞を含む、対象から入手された試料をさす。必要ではなく要求もされないが、「生物学的試料」という用語には、本明細書に記載されたシステムおよび方法を使用した画像化の前に処理される試料が包含されるものとする。例えば、生物学的試料は、対象から入手された全血試料であってもよいし、または血清試料、血小板試料、エクソソーム試料等へさらに処理されてもよい。
本明細書において使用されるように、「対象」という用語は、生物学的試料が入手されるかまたは由来する植物または動物、特にヒトをさす。「対象」という用語には、本明細書において使用されるように、ヒトおよび非ヒト動物の両方が包含される。「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（具体的には、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシのような哺乳類、およびニワトリ、両生類、爬虫類のような非哺乳類等が含まれる。一つの態様において、対象はヒトである。もう一つの態様において、対象は、実験動物または疾患モデルとしての代理動物である。いくつかの態様において、「対象」という用語は、マウス、サル、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、哺乳類家畜動物、哺乳類スポーツ動物、および哺乳類ペットを含むが、これらに限定されるわけではない、哺乳類をさす。一つの態様において、対象はヒト対象である。
本明細書において使用されるように、「細胞外小胞」という用語は、例えば、リポソーム、ミセル、エクソソーム、マイクロバブル、または単層小胞のような、1nm〜999μmのサイズの実質的に球状の物体または膜性の物体をさす。いくつかの態様において、粒子は、900μm未満、800μm未満、700μm未満、600μm未満、500μm未満、400μm未満、300μm未満、200μm未満、100μm未満、90μm未満、80μm未満、75μm未満、70μm未満、60μm未満、50μm未満、40μm未満、30μm未満、25μm未満、20μm未満、15μm未満、10μm未満、5μm未満、2μm未満、1μm未満、750nm未満、500nm未満、400nm未満、300nm未満、200nm未満、100nm未満、50nm未満、40nm未満、30nm未満、20nm未満、10nm未満、5nm未満、またはそれよりも小さい。
本明細書において使用されるように、「個々に特徴決定する」という用語は、SP-IRISセンサーに結合した細胞外小胞に関して使用される時、単一の細胞外小胞のサイズ、形、密度、面積、またはその他の表現型尺度の特徴決定をさす。
本明細書において使用されるように、「二次認識プローブ」という用語は、細胞外小胞の中または上のバイオマーカーに結合する第2のプローブをさす。いくつかの態様において、二次認識プローブは、第1の抗体の結合の検出を可能にするよう、未標識の第1の抗体プローブに結合してもよい。そのような方法は、ELISA法における二次抗体の使用と類似している。
「減少する」、「低下した」、「低下」、または「阻害する」という用語は、全て、統計的に有意な量の減少を意味するために本明細書において使用される。いくつかの態様において、「低下させる」、「低下」または「減少させる」または「阻害する」とは、典型的には、参照レベル（例えば、所与の処理のない）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の減少を含み得る。本明細書において使用されるように、「低下」または「阻害」には、参照レベルと比較して完全な阻害または低下は包含されない。「完全な阻害」とは、参照レベルと比較した100％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有しない個体についての正常範囲内として認められるレベルへの減少であり得る。
「増加した」、「増加」または「増強する」または「活性化する」という用語は、全て、一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書において使用される；疑問の回避のため、「増加した」、「増加」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、もしくは100％までで、100％の増加もしくは10〜100％の間の任意の増加も含み、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、少なくとも約20倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、少なくとも約1000倍の増加、もしくはそれ以上を意味する。
本明細書において使用されるように、「を含む」という用語は、提示された明確な要素に加えて他の要素が存在してもよいことを意味する。「を含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
本明細書において使用されるように、「から本質的になる」という用語は、所与の態様のために必要とされる要素をさす。この用語は、本発明のその態様の基本的な新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響を与えない付加的な要素の存在を可能にする。
「からなる」という用語は、態様のその説明において列挙されない要素を除外する、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成成分をさす。
さらに、そうでないことが前後関係によって必要とされない限り、単数形は複数を含むものとし、複数形は単数を含むものとする。
実施例またはそうでないことが示された場合を除き、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す数は、全て、「約」という用語によって常に修飾されるものと理解されるべきである。「約」という用語は、百分率に関して使用される時、±1％を意味することができる。
本明細書においてそうでないことが定義されない限り、本願に関して使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載された具体的な方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、従って、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、具体的な態様を記載するためのものに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するためのものではない。分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp.,2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S. Porter et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd.,1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006；Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012)(ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing,Inc., New York, USA (2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)、およびCurrent Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005 (ISBN 0471142735)に見出され得、それらの内容は、全て、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
がんおよび疾患のモニタリングおよび処置
がん疾患のモニタリングおよび処置は、個別化医療の最先端にある。がん治療は、患者の健常細胞に対する有害な効果を最小限に抑えながら、より正確にがんを標的とすることを可能にするよう開発されている。処置中に疾患の状態を継続的にモニタリングする必要があるため、特異的な標的型治療は困難である。現在、疾患モニタリングは、分子サインまたはバイオマーカーを追跡するための反復的な組織生検を必要とする。しかしながら、組織生検は、侵襲性であり、合併症のリスクを抱えている。針生検のような低侵襲性の方法は、不均一性を欠く極めて小さい腫瘍の一部分を試料採取するため、理想的でない。コンピューター断層撮影スキャン（CTスキャン）ような非侵襲性の画像化技術は、処置の効力を反映する腫瘍のサイズ/負荷をモニタリングするために使用される。CTスキャンは、小さい変化を解像することができず、従って、医師は、数週間または数ヶ月間の処置の有効性を同定することはできない。また、CTスキャンは、放射線リスクのため、頻繁には実施できない。がん治療を改善するため、低侵襲性のモニタリング技術の必要性が存在する。
組織生検に関連したコストおよび侵襲性を克服するため、循環腫瘍細胞（CTC）および循環腫瘍DNA（ctDNA）が血液およびその他の生物学的液体の中に見出され得ることが、この十年の間に示されている（例えば、Alix-Panabieres and Pantel. (2013) Clin Chem 59(1):110-118；Bettegowda et al. (2014) Sci Transl Med 6(224):224ra24；Diaz and Bardelli. (2014) J Clin Oncol 32(6):579-586を参照されたい）。これらの方法は、血液、血清、尿、および唾液のような低侵襲性の試料を使用してがんの分子的組立てを解明する見込みを示している。これらの方法は、患者のがんの進行およびがん細胞の分子的組立てのほぼ継続的なモニタリングを可能にしながら、組織生検と類似の結果を提供することを目標とするため、「液体生検」と名付けられている。CTCは、細胞10億個中約1個という極めて低い濃度で見出されるため、CTCの単離（Ozkumur et al. (2013) Sci Transl Med 5(179):179ra47；Karabacak et al. (2014) Nat Protoc 9(3):694-710）および検出（Castro et al. (2014) Lab Chip 14(1):14-23）を可能とすることについて、意義深い技術的開発があった。ctDNAは、絶対数ではより豊富であるが、高濃度の正常DNAと共に体液中に存在する。最近、核酸配列決定および変異検出の改善が、ctDNAの使用を可能にした（Bettegowda et al. (2014) Sci Transl Med 6(224):224ra24；Dawson et al. (2013) N Engl J Med 368(13):1199-1209）。
CTCおよびctDNAのテクノロジーが、腫瘍学への適用のために開発中であるが、循環バイオマーカーの第3のセットである細胞外小胞（EV）も、がん細胞から循環血中へ排出されることが示されている（Revenfeld et al. (2014) Clin Ther 36(6):830-846；Yang et al. (2014) PLoS ONE 9(11):e110641）。EVは、細胞から放出され、体液中に見出され得る脂質小胞である。これらのEVは、親細胞と同一の表面マーカーおよび内部分子マーカー（例えば、タンパク質、mRNA、およびmiRNA）を共有する場合がある。がん細胞は、1細胞当たりはるかに高い濃度のEVを排出し得ることが提唱されており（Taylor and Gercel-Taylor.(2008)Gynecol Oncol 110(1):13-21；Riches et al.(2014)50(5):1025-1034）、従って、それらはCTCより豊富である。より高い濃度のエクソソームは、早期検出を可能にし、親腫瘍細胞からの表現型情報を提供することもできる。従って、EVは、処置、モニタリング、およびコンパニオン診断薬において役割を果たすことができる。EVは、不十分な治療応答と相関する薬物標的上皮増殖因子および変異型KRAS遺伝子を保持するため、EVは、セツキシマブ（Erbitux）のためのコンパニオン診断薬（cDx）として役立ち得ることが、最近の研究により示されている（Yamashita et al.(2013)Phar-In J Pharm Sci 68(12):969-973；Kahlert et al.(2014)J Biol Chem 289(7):3869-3875）。40年以上前のEVの発見以来（Crawford,N.(1971)Br J Haematol 21(1):53-69）、この領域は最近、強力に復活し（Caby,MP.(2005)In Immunol 17(7):879-887；van Niel,G .(2006)J Biochem(Tokyo)140(1):13-21；Simpson,et al.(2008)8(19):4083-4099）、EVは多くの腫瘍学の分野において研究されている（Katsuda et al.(2014)Proteomics 14(4-5):412-425；Thery et al.(2009)Nat Rev Immunol 9(8):581-593）。最近の研究において、EVは、細胞-細胞コミュニケーション（Thery et al.(2009)Nat Rev Immunol 9(8):581-593；Ratajcxak et al.(2006)Leukemia 20(9):1487-1495）、細胞外マトリックス分解（Inder et al.(2014)J Extracell Vesicles vol.3；Cocucci and Meldolesi.(2015)Trends Cell Biol 25(6):364-372）、腫瘍の増殖および転移（Logozzi et al.(2009)PLoS ONE 4(4):e5219；Peinado et al.(2012)Nat Med 18(6):883-891）、ならびに薬物に対する耐性（Gong et al.(2012)Cancer Treat Rev 38(3):226-234）において役割を果たすことが示されている。EVはCTCより豊富であるため、早期診断（Vlassov et al.(2012)Biochim Biophys Acta BBA 1820(7):940-948）、進行/再発モニタリング（Shao et al.(2012)Nat Med 18（12):1835-1840；Gong et al.(2014)Semin Cell Dev Biol 40:35-40）、および薬物処置の決定（Shao et al.(2012)Nat Med 18(12):1835-1840）のために体液由来のEVをスクリーニングすることが注目されている。
EVは、異なる機序を通して形成された多様な集団からなる（van der Pol et al.(2012)Pharmacol Rev 64(3):676-705；Andaloussi et al.(2013)Nat Rev Drug Discov 12(5):347-357；Gyorgy et al.(2011)Cell Mol Life Sci 68(16):2667-2688）。EVは、エクソソーム、マイクロベシクル、およびアポトーシス小体という三つの型へ分け得る。エクソソームは、細胞膜との融合の後に多胞性エンドソームから分泌され、直径40〜200nmである。マイクロベシクルは、細胞の細胞膜の出芽から形成され、直径50〜1,000nmである。アポトーシス小体は、細胞崩壊から生成され、50〜5,000nmという最大のサイズ範囲を有する。エクソソームは、一般的には、テトラスパニン（例えば、CD63、CD81、およびCD9）のような足場タンパク質の存在によって、他のEVから区別され得る。
EVの使用は、多様な疾患の検出および/または予後判定のために企図され、がんの検出および/または予後判定に厳密には限定されない。例えば、多様な神経変性疾患、感染性疾患、および心血管疾患の検出および/または予後判定も、決定され得る。本明細書に記載された方法を使用して検出するかまたはモニタリングすることができるがんの例には、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患が含まれるが、これらに限定されるわけではない。そのようながんのより具体的な例は、以下に記述され、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌を含む。「がん」という用語には、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、最初の悪性疾患または腫瘍の部位以外の対象の身体部位へ細胞が移動していないもの）、および二次性の悪性細胞または腫瘍（例えば、最初の腫瘍の部位とは異なる二次性の部位への悪性細胞または腫瘍細胞の移動である転移から発生したもの）が含まれる。
いくつかの態様において、がんは腺癌である。いくつかの態様において、がんは、乳房、肺、頭頸部、前立腺、食道、気管、脳、肝臓、膀胱、胃、膵臓、卵巣、子宮、子宮頸部、精巣、結腸、直腸、および皮膚より選択される。いくつかの態様において、がんは、乳房、肺、頭頸部、前立腺、食道、気管、脳、肝臓、膀胱、胃、膵臓、卵巣、子宮頸部、精巣、結腸、直腸、または皮膚の腺癌である。いくつかの態様において、がんは、膵臓、肺（例えば、小細胞または非小細胞）、および乳房より選択される。
EVを使用して検出され得る神経変性疾患には、例えば、アルツハイマー病、慢性外傷性脳症、ハンチントン病、パーキンソン病、およびプリオン病が含まれる。
（表１）がんおよび関連EVバイオマーカー
Figure 2018530755
生物学的試料
試料が少なくとも1種の細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を含む限り、本質的に任意の試料が、本明細書に記載された方法およびシステムを使用して試験され得る。「生物学的試料」という用語は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胃腸分泌液、組織もしくは腫瘍のホモジネート、循環している細胞および細胞粒子（例えば、循環腫瘍細胞）、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊水、脳脊髄液、腹水、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙、前立腺液、細胞培養培地、または細胞溶解物のような、細胞外小胞を含有する任意の試料をさすことができる。試料は、汚染された湖もしくはその他の水域から入手された水試料、汚染されていると考えられる食物起源から入手された液体試料、または植物試料のような、環境起源から入手されたものであってもよい。
細胞外小胞の定量化ならびに/または特徴決定（例えば、サイズおよび/もしくは形の識別）のためのSP-IRISシステムの有意な利点は、本明細書に記載された方法を実施する前に生物学的試料から細胞外小胞を単離したり濃縮したりする必要がないという点である。例えば、全血由来の循環エクソソームを定量化しかつ/または特徴決定する時、事前の単離工程は必要とされず、単に血液試料をSP-IRISセンサーと接触させればよい。従って、一つの態様において、方法は、生物学的試料から細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を単離する工程を含まない。もう一つの態様において、方法は、生物学的試料の中の細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を濃縮する工程を含まない。
エクソソーム
エクソソームは、大部分の生細胞から放出される直径30〜200nmの細胞由来ナノ小胞である。エクソソームは、血液および尿を含む、生体の事実上全ての生物学的液体の中に存在する（8、9）。エクソソームは、トランスフェリン受容体を含む膜タンパク質を含有しているマイクロベシクルとして、網状赤血球細胞培養物の採集された培地の中に最初に同定された（10）。それ以来、いくつかの細胞型が細胞外環境へエクソソームを放出することが、記述されている。エクソソームは、後期エンドソームの膜陥入によって形成され、その結果、細胞のサイトゾル構成成分と細胞膜受容体の細胞外ドメインとを含有する小胞をもたらす。エクソソームは、後期エンドソーム多胞体（MVB）の細胞膜との融合の後、細胞から細胞外環境へ放出されるか（11、12）、または細胞膜から直接放出される場合もある（13）。細胞内起源のため、エクソソームは、類似サイズの他の型のナノ小胞には見出されない、テトラスパニン（CD63、CD9、およびCD81）ならびに熱ショックタンパク質（HSP70）のようなエンドソーム経路の特異的タンパク質マーカーを保有している（9、14）。エクソソームは、専門の機能を有し、凝固、細胞間シグナリング、および老廃物管理のような過程において重大な役割を果たすことが、ますます明らかになってきている（12）。その結果、エクソソームの臨床適用は、ますます注目されてきている。
典型的には、40nm〜100nmのサイズ範囲のエクソソームが、本明細書に記載された方法によって計数されかつ/またはサイズ決定され得るが、150nmまでのエクソソームまたはその他の細胞外小胞も、本明細書に記載されるようにして特徴決定され得る。本明細書に記載された方法およびシステムを使用した定量化および/または特徴決定のために企図される細胞外小胞は、少なくとも15nm、少なくとも20nm、少なくとも25nm、少なくとも30nm、少なくとも35nm、少なくとも40nm、少なくとも45nm、少なくとも50nm、少なくとも55nm、少なくとも60nm、少なくとも65nm、少なくとも70nm、少なくとも75nm、少なくとも80nm、少なくとも85nm、少なくとも90nm、少なくとも95nm、少なくとも100nm、少なくとも125nm、少なくとも150nm、またはそれ以上であり得る。いくつかの態様において、細胞外小胞は、150nm未満、125nm未満、100nm未満、95nm未満、90nm未満、85nm未満、80nm未満、75nm未満、70nm未満、65nm未満、60nm未満、55nm未満、50nm未満、45nm未満、40nm未満、35nm未満、30nm未満、25nm未満、20nm未満、またはそれよりも小さい。一定の態様において、細胞外小胞は、15〜200nm、30〜200nm、50〜200nm、75〜200nm、100〜200nm、125〜200nm、150〜200nm、175〜200nm、15〜25nm、15〜50nm、15〜75nm、15〜100nm、15〜125nm、15〜150nm、15〜175nm、30〜100nm、40〜100nm、50〜100nm、60〜100nm、70〜100nm、80〜100nm、40〜80nm、40〜60nm、30〜60nm、30〜50nm、またはその間の任意の範囲である。
いくつかの態様において、細胞外小胞は、本明細書に記載された方法を使用して、形によって識別され得る。例えば、細胞外小胞は、とりわけ、以下の形であり得る：完全に球状、実質的に球状、楕円形、長方形、涙形、ドーム形、ボタン形、非線対称形。
SP-IRIS検出システム
DNAおよびタンパク質のマイクロアレイは、ほとんど専門知識なしで、高度に多重のアッセイを迅速に安価に実施可能であることから、現在、広範に使用されている医学研究のツールである。しかしながら、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（核酸検出の場合）およびELISAまたは発光イムノアッセイ（タンパク質および低分子の場合）が、依然として感度および選択性において至適基準を提供しており、多重化が不十分であり試料調製に大きな労力を要するにも関わらず、好まれ続けている。マイクロアレイフォーマットアッセイの感度の増強の問題は、多様な方式で取り組まれており、その中で最も成功しているのは、光散乱技術（15〜17）または電気化学的技術（18、19）である。マイクロアレイセンサーの領域を越えて、形状標識を有するハイドロゲル微粒子（20）およびDNAバーコードを有するナノ粒子（15、16）を利用する技術が、アッセイの複雑さに関連した一連の独自の欠点を有する高感度の検出プラットフォームに、ある程度の多重化を提供するために開発されている。それにも関わらず、これらのテクノロジーはいずれも、現在の商業的な増幅または酵素に基づくプロトコルに取って代わるために必要とされる単純さ、スピード、および性能を達成していない。従って、単純さおよび多重化における固有の利点が利用され得るよう、マイクロアレイに基づくテクノロジーの感度を十分に増強することができるシステムが必要とされている。
本発明者らの知る限り、マイクロアレイフォーマットで、捕捉表面上の個々のナノ小胞を検出し、サイズ/形を決定することができる高度に多重化された方法は存在しない。Boston UniversityのUnlu Labによって開発されたSP-IRISテクノロジー（例えば、WO2011/014282（これの内容は参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい）は、マイクロアレイフォーマットで多くの捕捉プローブ（即ち、抗体、ペプチド、グリカン、DNAオリゴ、アプタマー等）がタイルのように敷き詰められていてよいセンサー表面に捕捉された個々のナノ小胞の標識ありの検出および標識なしの検出を可能にする。次いで、検出されたナノ小胞のSP-IRIS画像内のシグナルが、ナノ小胞のサイズおよび/または形を決定するために使用され得る。SP-IRISについての検出の原理は、層状基質上の粒子からの散乱シグナルの増強されたコントラストに基づく。
ナノ粒子を検出し、サイズ/形を決定するため、SP-IRISは、シリコン基質上の二酸化ケイ素層からなるセンサー表面に結合したナノ粒子に可視LED光源から光を照射する。センサー表面から反射された光の干渉は、別個のシグナルを生じる粒子の存在によって修飾され、そのシグナルが粒子のサイズおよび/または形を明らかにする。本発明者らのアプローチにおいて、誘電性の層構造は、高感度の検出および分析のため、ナノ粒子の弾性散乱特徴を最適化する光学的アンテナとして機能する。本発明者らは、60nm〜200nmの直径を有する低指数誘電性粒子ならびに20nm〜100nmの直径を有する金属（AuおよびAg）ナノ粒子を成功裡に検出した（21）。血清または全血および高レベルの細菌によって汚染された試料における複数のウイルスの同時検出が、このアプローチを使用して実施された（22）。アフィニティに基づく捕捉、サイズおよび/または形の識別、ならびに単一ウイルス粒子を計数する「デジタル」検出スキームを利用することによって、SP-IRISシステムは、複雑な試料の中の標的のために確立され得る、頑強で高感度のウイルス感知アッセイであることが示される。
さらに、いくつかの態様において、SP-IRISセンサーは、センサー基質上の1個または複数個の別個の位置における干渉パターンの変化を検出するために使用され得る。例えば、センサーが細胞外小胞上の生体分子標的を同定するために使用される時、センサー基質表面上の1個または複数個の別個の位置において、捕捉された細胞外小胞を、所望のバイオマーカーに対するプローブと接触させることができる。次いで、1個または複数個の別個の位置の光干渉パターンを検出し、最初の光干渉パターンと比較する。細胞外小胞の最初の捕捉と、バイオマーカーに特異的な結合剤との接触後に入手された画像との間で観察される光干渉パターンのシフトは、バイオマーカー発現レベルおよび/またはバイオマーカーを発現する細胞外小胞の数の指標となる。
本明細書において使用されるように、「SP-IRISセンサー」という用語は、少なくとも1種のプローブによって機能化されており、SP-IRISシステムを使用した画像化を可能にする基質をさすために使用される。典型的には、センサーは、二酸化ケイ素（SiO2）が重層されたシリコン（Si）ウエハを含むが、SP-IRISシステムを使用してSi/SiO2センサーと実質的に類似の結果を可能にする限り、他の基質が代用されてもよい。いくつかの態様において、SP-IRISセンサーはマイクロアレイを含む。
本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された100nm〜1000nmのSiO2を含む層状基質上において製作される。即ち、センサーは、Siウエハ上に重層された100nm〜1000nmのSiO2を含む基質を含み、少なくとも1種のプローブをさらに含む。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも100nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも200nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも300nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも400nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも500nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも600nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも700nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも800nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも900nmのSiO2を含む層状基質において製作される。この局面のいくつかの態様において、マイクロアレイは、Siウエハ上に重層された少なくとも1000nmのSiO2を含む層状基質において製作される。
本明細書に記載された方法と共に使用されるセンサーは、基質層に付着した複数の固定化されたプローブのうちの1個または複数個を含むことができる。例えば、1個または複数個の特異的な固定化されたプローブは、バイオセンサーの表面上の1個または複数個の別個の位置のアレイに配置されていてよい。1個または複数個の別個の位置は、直径約50〜500ミクロンまたは約150〜200ミクロンのマイクロアレイスポットを定義することができる。
いくつかの態様において、固定化されるプローブは、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、ペプチド、転写因子、抗体、もしくは酵素のようなタンパク質、小さい有機分子、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。そのようなバイオセンサーは、DNA-DNA、DNA-RNA、DNA-タンパク質、RNA-RNA、RNA-タンパク質、およびタンパク質-タンパク質の相互作用を含むが、これらに限定されるわけではない、生体分子の相互作用の検出のために有用である。
本明細書において使用されるように、バイオセンサーの基質表面に固定化されるプローブは、例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（scFv）、F(ab)断片、F(ab')2断片、Fv断片、小さい有機分子、ポリマー、コンビナトリアルケミカルライブラリー由来の化合物のような有機分子、無機分子、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの態様において、SP-IRISシステムは、細胞外小胞の標識なしの検出のために構成される。他の態様において、SP-IRISシステムは、金粒子のようなナノ粒子または蛍光モエティを間接的に画像化することによる細胞外小胞の標識ありの検出のために構成される。本明細書において使用されるように、「ナノ粒子」という用語は、本明細書において定義されるように、999nmまでの半径を有する、本明細書に記載されたバイオセンサーおよび方法によって検出される任意の標的をさす。例えば、ナノ粒子は、1nm〜999nm、1nm〜900nm、1nm〜800nm、1nm〜700nm、1nm〜600nm、1nm〜500nm、1nm〜400nm、1nm〜300nm、1nm〜200nm、1nm〜150nm、1nm〜100nm、1nm〜75nm、1nm〜50nm、1nm〜25nm、1nm〜20nm、1nm〜10nm、1nm〜5nm、1nm〜2.5nm、500nm〜999nm、600nm〜999nm、700nm〜999nm、800nm〜999nm、900nm〜999nm、100nm〜500nm、100nm〜400nm、100nm〜300nm、100nm〜200nm、またはその間の任意の範囲であり得る。いくつかの態様において、半径は、少なくとも2.5nm、少なくとも5nm、少なくとも10nm、少なくとも15nm、少なくとも20nm、少なくとも25nm、少なくとも30nm、少なくとも35nm、少なくとも40nm、少なくとも45nm、少なくとも50nm、少なくとも55nm、少なくとも60nm、少なくとも65nm、少なくとも70nm、少なくとも80nm、少なくとも85nm、少なくとも90nm、少なくとも95nm、少なくとも100nm、少なくとも125nm、少なくとも150nm、少なくとも200nm、少なくとも300nm、少なくとも400nm、少なくとも500nm、またはそれ以上である。ナノ粒子は、多様な形を有することができ、例えば、完全に球状の形を有していなくてもよく、楕円体、桿状体、六面体、多面体、立方体、または少なくとも一つの寸法が本明細書に記載された値に相当する任意のそのような形であってもよいことが理解されるべきである。いくつかの態様において、異なる形のナノ粒子が使用されてもよい。
いくつかの態様において、二次標識は、例えば、フルオロフォアまたは量子ドットに付着した抗体を使用することによって、蛍光標識を利用する。そのような蛍光法は、センサーとの最初の接触から、標識なしに細胞外小胞（EV）を検出し、計数し、サイズ/形を決定することができるという付加的な利点を提供する。EVの標識は、ナノ粒子タグ付きプローブ（例えば、抗体）または蛍光タグ付きアプローチを通したものであり得る。いくつかの態様において、第2の蛍光検出モダリティは、SP-IRIS顕微鏡へ組み込まれていてもよい。
多重SP-IRIS：SP-IRISシステムは、1種または多種の特異的結合相互作用を平行して研究するために使用され得る（即ち、多重適用）。表面に固定化された1種または複数種の特異的結合分子を有するSP-IRISセンサーへ、1種または複数種の細胞外小胞を含む試料を適用することによって、標識の使用なしに、1種または複数種の特異的結合物質のそれぞれの結合分子への結合を検出することができる。SP-IRISセンサーに光が照射され、試料の中の1種または複数種の細胞外小胞が、固定化された分子のうちの1種または複数種に特異的に結合する場合、1種または複数種の特異的な細胞外小胞が、固定化された結合分子に結合していない時の干渉パターンと比べて、干渉パターンの位相シフトが起こる。センサー基質表面が、1種または複数種の特異的な固定化された結合分子を含む、1個または複数個の別個の位置のアレイを含む態様においては、次いで、バイオセンサーの各々の別個の位置から干渉パターンが検出される。
従って、いくつかの態様において、多様な特異的結合分子、例えば、抗体が、SP-IRISセンサーの基質表面にアレイフォーマットで固定化され得る。次いで、センサーは、タンパク質のような可能性のある細胞外小胞結合パートナーを含む関心対象の試験試料と接触させられる。センサーに固定化された抗体に特異的に結合するタンパク質のみが、センサーに結合したままとなる。そのようなアプローチは、本質的には、酵素結合免疫吸着アッセイの大規模バージョンである；しかしながら、酵素または蛍光標識の使用は必要とされない。ハイスループット適用のため、基質表面上の特異的結合分子のアレイを含む数個のセンサーがアレイに配置されたアレイのアレイに、センサーを配置することもできる。
従って、本明細書に記載されたこの局面および全てのそのような局面の他の態様において、センサーは、試料中に存在する複数の細胞外小胞のうちの1種または複数種の、基質層に付着した複数の固定化された分子のうちの1種または複数種を含むバイオセンサー基質層への結合を検出するために使用される。例えば、1種または複数種の特異的な固定化された分子は、センサーの表面上の1個または複数個の別個の位置のアレイに配置されていてよい。
いくつかの態様において、「多重」という用語は、1500未満の異なるバイオマーカー（例えば、タンパク質バイオマーカー、miRNAバイオマーカー等）を、単一の試料において、または一度に、検出することをさす。他の態様において、「多重」とは、1000未満、900未満、800未満、700未満、600未満、500未満、400未満、300未満、200未満、100未満、50未満、40未満、30未満、20未満、10未満、または5未満の異なるタンパク質マーカーまたはポリヌクレオチドマーカーを、同時にまたは平行して検出することをさす。
エクソソーム特徴決定のためのSP-IRISシステムの利点
がんのような疾患をモニタリングするための従来の細胞外小胞検出技術は、試料中の小胞の濃縮の必要なしにEVを検出する能力において限定されている。従って、従来のEV検出技術は、（i）表現型、または（ii）サイズ、形、および数しか測定することができない。SP-IRISシステムは、そのような従来の技術と比べて、以下のとおり、いくつかの利点を有する。
1.SP-IRISシステムは、EVの高感度の検出およびサイズ決定を可能にする。マイクロアレイアッセイは、体液由来のEVを捕捉することによって、多数の表現型を評価することができる。各々の捕捉されたEVが、表面上のプローブの各々について個々に計数されサイズ決定される時、最終的な検出がなされる。数十〜数百の異なるプローブを、単一のマイクロアレイにおいて使用することができる。
2.SP-IRISシステムは、試料の調製または濃縮を必要としない。
3.単一結合イベントの検出は、＜106ナノ粒子/mlの濃度での検出を可能にし、検出下限値を劇的に改善する。
4.SP-IRISは、小さい試料体積（例えば、25μLの試料）で実施され得る。
5.単一の試験で、一次プローブによってセンサーに捕捉された個々のEVにおいて複数のバイオマーカーを探すことができる。例えば、EVは、マイクロアレイフォーマットでセンサーに固定化された一次プローブを使用して、表面に捕捉される。捕捉されたEVは、全ての一次プローブについて、計数されサイズ決定され得る。次いで、マイクロアレイ内の全ての一次プローブについて表面に捕捉された個々のEVにおいて、2種以上のバイオマーカーが共局在することを決定するため、二次プローブをチップに導入することができる。
プローブ
SP-IRISシステムを使用した定量化および/または特徴決定のため、生物学的試料由来の細胞外小胞を捕捉するために、本質的に任意のプローブを使用することができる。いくつかの態様において、捕捉プローブは、細胞外小胞を生物学的試料から捕捉することができ、生物学的試料の他の非小胞構成成分を洗浄除去することができるような、細胞外小胞特異的プローブである。捕捉プローブまたは細胞外小胞特異的プローブは、細胞外小胞の外側に露出したマーカーまたは抗原に結合することが、当業者によって容易に理解されるであろう。例えば、プローブは、膜貫通タンパク質の小胞外抗原、または小胞外構成成分（例えば、小胞に関連したRNAもしくはタンパク質）に結合することができる。いくつかの態様において、捕捉された細胞外小胞は、センサー上のプローブへ小胞内構成成分を曝すため、透過処理または溶解されてもよい。そのような態様において、SP-IRISは、エクソソーム内構成物を検出するために使用され得る。例示的なプローブには、抗体、抗体断片、低分子、化合物、またはその他のリガンドが含まれ得る。
本明細書において使用されるように、「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらの抗原結合性の誘導体または断片が含まれ得る。周知の抗原結合断片には、例えば、シングルドメイン抗体（dAb；単一のVL抗体ドメインまたはVH抗体ドメインから本質的になる）、単鎖Fv断片（scFv）を含むFv断片、Fab断片、およびF(ab')2断片が含まれる。そのような抗体分子の構築のための方法は、当技術分野において周知である。本明細書において使用されるように、「抗体」という用語は、完全免疫グロブリン、またはFc（結晶化可能断片）領域を含むモノクローナルもしくはポリクローナルの抗原結合断片、またはFc領域のFcRn結合断片をさす。抗原結合断片は、組換えDNA技術または完全抗体の酵素的もしくは化学的な切断によって作製され得る。「抗原結合断片」には、とりわけ、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、dAb断片、および相補性決定領域（CDR）断片、単鎖抗体（scFv）、シングルドメイン抗体、キメラ抗体、ジアボディ（diabody）、ならびに特異的抗原結合をポリペプチドに付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有しているポリペプチドが含まれる。Fab、Fc、pFc'、F(ab')2、およびFvという用語は、標準的な免疫学的意味で利用される［Klein,Immunology(John Wiley,New York,N.Y.,1982)；Clark,W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern Immunology(Wiley & Sons,Inc.,New York)；Roitt,I.(1991)Essential Immunology,7th Ed.,(Blackwell Scientific Publications,Oxford)］。
「ポリクローナル抗体」という用語は、完全な動物の場合のように、Bリンパ球の数種のクローンによって産生される抗体として、本明細書において定義される。「ポリクローナル抗体」という用語は、一般的には、免疫感作された動物において産生される抗体をさす。「モノクローナル抗体」とは、体内に存在してもよいしまたは培養物中に存在してもよい、単一のクローン起源を有する細胞株として、本明細書において定義される。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞の単一のクローンによって産生され、従って、単一の抗体分子種である。「単鎖抗体（Scfv）」とは、軽鎖および重鎖の2個の抗原結合領域（VhおよびVl）が連結ペプチドによって接続されており、そのため、異種生物における軽鎖および重鎖の両方の等しい発現が可能であり、タンパク質が安定化されている、組換え融合タンパク質として、本明細書において定義される。「F(Ab)断片」とは、パパイン処理によって調製された免疫グロブリンの断片として、本明細書において定義される。Fab断片は、ジスルフィド結合を通して重鎖の一部分に連結された1本の軽鎖からなり、1個の抗原結合部位を含有している。それらは、一価抗体と見なされ得る。「F(Ab')2断片」とは、ペプシン攻撃部位のN末端側における免疫グロブリン分子のペプシン加水分解によって得られる、およそ90kDaのタンパク質断片として、本明細書において定義される。Fe断片の短いセクションにおいてジスルフィド結合によって連結された両方のFab断片を含有している。「Fv断片」とは、1本の軽鎖および1本の重鎖の可変部分からなる、免疫グロブリン分子のFab断片のN末端部分として、本明細書において定義される。
本明細書において使用されるように、「低分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物（即ち、ヘテロ有機（heteroorganic）化合物および有機金属化合物を含む）、1モル当たり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、1モル当たり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、1モル当たり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、およびその他の薬学的に許容される型を含むが、これらに限定されるわけではない、化学的物質をさす。
本明細書において使用されるように、「薬物」または「化合物」という用語は、例えば、疾患または状態をコントロールするため、生物学的作用を処置するかまたは生物学的作用が生じるのを防止するため、ヒトへ投与される、化学的エンティティもしくは生物学的生成物、または化学的エンティティもしくは生物学的生成物の組み合わせをさす。化学的エンティティまたは生物学的生成物は、好ましくは、低分子量化合物であるが、必ずしもそうではなく、より大きい化合物、例えば、非限定的に、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAザイム、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの修飾および組み合わせを含む、核酸、アミノ酸のオリゴマー、または炭水化物であってもよい。
ある種の態様において、エクソソーム集団、エクソソーム外バイオマーカー、またはエクソソーム内バイオマーカーをさらに区別するため、二次プローブが使用されることが企図される。二次プローブは、小胞が細胞外小胞特異的プローブまたは捕捉プローブによって捕捉された後の、エクソソームのバイオマーカー発現および/またはその他の特性の識別のために設計される。
必ずしもそうではないが、いくつかの態様において、二次プローブは検出可能モエティによって標識されることが企図される。従って、SP-IRISシステムが多重フォーマットで使用される時、バイオマーカー発現（例えば、内部または外部）に基づくエクソソーム集団の識別を容易にするため、複数の二次プローブが、例えば、蛍光モエティによって、各々区別して標識されることが企図される。
いくつかの態様において、本明細書に記載された試薬（例えば、抗体試薬および/または核酸プローブ）のうちの1種または複数種は、検出可能モエティもしくは標識を含んでいてよく、かつ/または（例えば、化合物を検出可能生成物へ変換する反応を触媒することによって）検出可能シグナルを生成する能力を含んでいてよい。検出可能標識には、例えば、光吸収色素、蛍光色素、または放射性標識が含まれ得る。検出可能標識、それらを検出する方法、ならびに試薬（例えば、抗体プローブおよび核酸プローブ）へそれらを組み込む方法は、当技術分野において周知である。
いくつかの態様において、検出可能標識には、蛍光、化学蛍光、もしくは化学発光のような、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁気学的、放射化学的、もしくは化学的な手段、またはその他の適切な手段によって検出され得る標識が含まれ得る。本明細書に記載された方法において使用される検出可能標識は、一次標識（直接検出可能であるモエティもしくは直接検出可能なモエティを生じるモエティを含む標識）または二次標識（例えば、二次抗体および三次抗体を使用した免疫学的標識において一般的であるように、検出可能シグナルを生じるもう一つのモエティに結合する検出可能標識）であり得る。検出可能標識は、共有結合性または非共有結合性の手段によって試薬に連結され得る。あるいは、検出可能標識は、例えば、リガンド-受容体結合対配置またはその他のそのような特異的認識分子を介して、試薬との結合を達成する分子を直接標識することによって連結され得る。検出可能標識には、放射性同位体、生物発光化合物、発色団、抗体、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート化合物、および酵素が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
他の態様において、検出試薬は、蛍光化合物によって標識される。いくつかの態様において、検出可能標識は、フルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレサミン、Cy3（商標）、Cy5（商標）、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ペリデニン（peridenin）葉緑素、シアニン、フィコエリトリン-Cy5（商標）のようなタンデムコンジュゲート、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、およびオレゴングリーン（商標）、ローダミンおよび誘導体（例えば、テキサスレッドおよびテトラローダミンイソチオシアネート（TRITC））、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDye（商標）、6-カルボキシフルオレセイン（FAMおよびFという略語によって一般的に公知）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（JOEもしくはJ）、N,N,N',N'-テトラメチル-6カルボキシローダミン（TAMRAもしくはT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROXもしくはR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5もしくはG5）、6-カルボキシローダミン-6G（R6G6もしくはG6）、およびローダミン110；シアニン色素、例えば、Cy3色素、Cy5色素、Cy7色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えば、ヘキスト33258；フェナントリジン色素、例えば、テキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン（polymethine）色素、例えば、Cy3、Cy5等のようなシアニン色素；BODIPY色素およびキノリン色素；またはそれらの誘導体を含むが、これらに限定されるわけではない蛍光色素分子またはフルオロフォアであり得る。いくつかの態様において、検出可能標識は、3H、125I、35S、14C、32P、および33Pを含むが、これらに限定されるわけではない放射標識であり得る。いくつかの態様において、検出可能標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含むが、これらに限定されるわけではない酵素であり得る。酵素標識は、例えば、化学発光シグナル、色シグナル、または蛍光シグナルを生じることができる。
いくつかの態様において、検出可能標識は、コロイド金または有色のガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびラテックス）のビーズを含むが、これらに限定されるわけではない分光比色標識であり得る。
細胞外小胞の標識なしの検出および特徴決定
センサーに捕捉され、SP-IRIS分析に供された細胞外小胞の特徴決定は、標識なしのフォーマットで実施され得る。一つの態様において、標識なしの検出法を使用して捕捉され査定される細胞外小胞は、エクソソームである。一般に、標識なしの検出は、決定すべき細胞外小胞の小胞の数および形態学的特徴（例えば、サイズ、形等）を当業者が査定することを可能にする。
標識なしの検出の方法は、一般に、所望のバイオマーカーを有する小胞を捕捉する、少なくとも1種の細胞外小胞特異的プローブを含むセンサーを準備する工程を含む。例えば、エクソソームは、エクソソーム表面タンパク質CD63、CD9、CD81、本明細書に提示された表1の中の少なくとも1種のマーカー（例えば、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも15種、少なくとも20種、もしくはそれ以上）に結合する抗体またはそれらの組み合わせのようなエクソソーム特異的プローブを使用して捕捉され得る。
センサーは、異なるエクソソーム表面マーカーを発現するエクソソームの集団のような細胞外小胞の少なくとも2種の異なる集団を捕捉するための複数の細胞外小胞特異的プローブを含むよう構成され得る。複数の細胞外小胞特異的プローブを使用する時、プローブの位置はセンサー上の位置によって立証されることが認識されるであろう。従って、当業者は、容易に、特定の捕捉された集団における細胞外小胞の数を計数し、捕捉された各小胞集団における小胞の平均サイズおよびその他の形態学的特徴（例えば、形）を決定することができる。当業者は、対照試料と比較して、各部分集団における捕捉された小胞の分布パターンを分析し、それによって、捕捉された小胞集団の間のエクソソームの数、形、またはサイズのシフトが、例えば、疾患の進行、治療剤による処置の結果として起こるか否かを決定するか、または患者が所望の薬剤による処置に応答する可能性が高いか否かを決定することができる。エクソソーム集団におけるこのシフトは、定性的または定量的に査定され得る。
本明細書において提供される実施例は、血液試料のような生物学的試料に由来するエクソソームを検出するためのSP-IRIS技術の最初の証明を示す。
標識を使用した細胞外小胞の検出および特徴決定
第2の標識されたプローブを使用して、細胞外小胞の内部および小胞の表面の両方におけるバイオマーカー発現を特徴決定する方法も、本明細書において提供される。標識されたプローブを使用して検出され得るバイオマーカーには、核酸（例えば、DNA、RNA、mRNA、miRNA等）、脂質、およびタンパク質マーカーが含まれる。プローブは、相補的な核酸、色素、抗体またはその断片等であり得る。具体的なプローブ、検出可能標識、およびそれらの使用に関するさらなる情報は、「プローブ」という表題のセクションに見出され得る。本明細書において具体的に企図されるのは、複数のエクソソームバイオマーカーの発現を同定し特徴決定するために使用され得る、複数の区別して標識されたプローブの使用である。いくつかの態様において、複数のプローブは、異なるサイズおよび/または形を含むナノ粒子によって、区別して標識される。
外部バイオマーカーの検出：細胞外小胞の表面または外部のバイオマーカーの検出は、センサーへの小胞の捕捉の前に実施されてもよいし、または小胞が捕捉された後に「オンチップ」で実施されてもよい。コストを節約するため、試薬についての最小必要量の使用を確実にするため、オンチップ分析は、より少量の標識されたプローブを必要とし、さらに、未結合のプローブを除去するための洗浄工程を容易にするであろうことが認識される。
典型的には、小胞外マーカーは、表面タンパク質、脂質、または炭水化物バイオマーカーである。
標識されたプローブを使用したバイオマーカー発現の検出および特徴決定は、簡便であり、単に、捕捉された小胞をプローブと接触させ、未結合のプローブを洗浄除去し、標識されたプローブをSP-IRISを使用して検出することによって実施され得る。いくつかの態様において、第1の未標識の抗体プローブを、検出のために第1の未標識の抗体に結合する第2の標識された抗体と組み合わせて、エクソソームバイオマーカーに結合するよう使用することができる。
内部バイオマーカーの検出：任意の小胞内バイオマーカーが、本明細書に記載された方法を使用して染色され得る。例えば、タンパク質バイオマーカーは、標識された抗体、アプタマー、またはペプチドによって染色され得；核酸は、フルオロフォアによって標識された相補配列によって染色され得（例えば、FISHアッセイ）；脂質は、色素（例えば、Molecular Probes（商標）（Eugene,OR）のDiO、DiA、DiL、DiD）によって染色され得る。具体的なRNA（例えば、mRNA、miRNA）またはDNAの存在、量、またはレベルの変化は、本明細書に記載された方法を使用して決定され得る。特異的な変異、多形、または融合を、本明細書に記載された方法を使用して検出することができ、疾患の診断のために使用することができることが、さらに企図される（例えば、肺癌、結腸癌、または膵臓癌のようながんの診断のため、KRASの変異を検出することができ；肺癌のようながんの診断のため、ALK遺伝子の融合を検出することができる）。プローブ、検出可能標識、およびそれらの使用は、「プローブ」という表題のセクションに記載される。
必ずしもそうではないが、いくつかの態様において、小胞内バイオマーカーまたはエクソソーム内バイオマーカーの検出は、小胞の固定および/または透過処理の後に実施され得る。固定は、当技術分野において公知の任意の方法によって実施され得、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、メタノール、エタノール、アセトン、ホルマリン、またはそれらの組み合わせのような固定液と、小胞（例えば、捕捉された小胞または予め捕捉された小胞）を接触させることを含む。メタノール、エタノール、およびアセトンのようないくつかの固定液は、小胞を透過処理するためにも機能する。透過処理は、電気穿孔を使用して、または界面活性剤もしくは酵素（とりわけ、例えば、サポニン、SDS、トリトンX100、トゥイーン20、NP40、プロテイナーゼK、ストレプトリジンO、ジギトニン）の使用を通して実施され得る。
小胞内バイオマーカーの染色は、オンチップ染色を介して実施されてもよいし、またはセンサーに未だ捕捉されていない小胞に対する固定および/または透過処理の後に実施されてもよい。多数のアウトプット尺度を決定するため、データの後処理を実施することができる。例えば、試料の不均一性、またはある種の生体分子（例えば、脂質、タンパク質、核酸等）もしくは生体分子の組み合わせを含む捕捉されたエクソソームの割合を決定することができる。さらに、サイズ、形、およびその他の特徴に関する標識なしのデータを、小胞内バイオマーカーの存在量または発現に関する蛍光データと相関させることができる。
本明細書に記載された実施例、具体的には、実施例3は、SP-IRIS技術を使用したエクソソーム内構成物の検出の最初の証明である。
参照試料
いくつかの態様において、試料について決定された細胞外小胞の特徴（数、表現型、もしくはサイズ、形）およびまたは細胞外小胞上の1個もしくは複数個のバイオマーカーの発現レベル（例えば、アウトプットパラメータ）は、参照と比較される。「参照レベル」、「参照試料」、および「参照」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、もう一つの試料が比較される（即ち、より早い時点から入手されたか、または未処理の試料から入手された）試験生物学的試料において測定されたアウトプットパラメータをさす。
標準は、例えば、バイオマーカーを含む捕捉された細胞外小胞の数、形、またはサイズを、全ての捕捉された細胞外小胞のサブセットへ分類するために有用である。典型的には、この態様における標準は、バイオマーカーを検出するためのプローブによる処理の前の、捕捉された細胞外小胞のサイズ、形、または数（即ち、バイオマーカープローブの接触によって起こる位相シフトの前の、捕捉された細胞外小胞の入手された画像）である。また、バイオマーカー含有細胞外小胞：全細胞外小胞の定義された比が、本明細書において企図され、次いで、それは、疾患についての診断を決定する目的のため、標準比と比較され得る。標準は、生物学的試料における測定可能なアウトプットパラメータの変化またはアウトプットパラメータの相対的な増加/減少を検出するためにも有用である。
標準は、適切な標準に対して試料を正規化することができるよう、比較のための参照レベルとして機能する。適切な標準は、測定すべきアウトプットパラメータ、および本明細書に記載された方法が使用される適用に基づき、当業者によって決定され得る。例えば、本明細書に記載された方法が、生物学的効果について候補薬剤を試験するために適用される時、標準は候補薬剤による処理の前の生物学的試料であり得る。
一つの態様において、参照標準は、本明細書に記載されるように試験されるかまたは処理される同一の生物学的試料から、より早い時点で（おそらく処理の前に）入手される。あるいは、標準は、本明細書に記載される処理の後の同一の生物学的試料に由来し得る。
疾患についての細胞的な診断アッセイまたは予後判定アッセイに関して、標準レベルは、例えば、疾患を実質的に有しない異なる個体（例えば、試験されている個体ではない）に由来する既知の生物学的試料から得られうる。もう一つの態様において、標準レベルは、（例えば、疾患を有しないことが既知の部位において）捕捉された細胞外小胞の外部で同一の個体に由来する既知の生物学的試料から入手され得る。既知の試料は、平均化された集団における標準を作製するため、複数の個体に由来する試料をプールすることによって得られてもよく、その場合、標準は、個体の集団（例えば、疾患を有する個体の集団）におけるアウトプットパラメータの平均レベルを表す。従って、このように得られた標準におけるアウトプットパラメータのレベルは、疾患を有する個体の一般集団におけるこのパラメータの平均レベルを表す。生物学的試料は、試料からのアウトプットパラメータを集団標準と比較することによって、この集団標準と比較される。一般に、特定の集団（例えば、疾患を有する対象の集団）において決定された範囲内に入るアウトプットパラメータの測定値は、疾患の存在を示し、範囲内に入らない測定値は、個体が疾患を有しないことを示すであろう。標準が疾患を欠く対象の集団から得られる場合には、反対のことが企図される。集団内の個体の間にはしばしば可変性が存在するため、所与のアウトプットパラメータについてより高い測定値を有する個体もいるし、同一のパラメータについてより低い測定値を有する個体もいることに注意すべきである。しかしながら、当業者は、本明細書に記載される疾患の検出および処置に関して、個別に論理的推論を行うことができる。
一つの態様において、ある種の小胞集団の位置または数の位相シフトが起こるか否かを決定するため、特定のセンサー上の捕捉された小胞の特徴が、捕捉された小胞の参照試料の特徴と比較される。
生理活性物質の効力の同定および/または試験のためのスクリーニングアッセイ
一つの態様において、本明細書に記載された方法は、生物学的効果について候補薬剤（例えば、低分子、抗体、阻害性RNA等）をスクリーニングするために使用され得る。典型的には、細胞外小胞を含む生物学的試料は、SP-IRISセンサーへの細胞外小胞の捕捉の前または後に、候補薬剤と接触させられ、少なくとも1種のアウトプットパラメータが、本明細書に記載された方法を使用して査定される。アウトプットパラメータの測定値は、候補薬剤による処理の前のアウトプットパラメータの測定値のような参照と比較される。
「候補薬剤」という用語は、所望の生物学的活性について調査されている任意の物質を意味するために本明細書において使用される。候補薬剤は、所望の活性をモジュレートする能力について調査することが望まれる、例えば、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、または小さい有機分子を含む任意の型の分子であり得る。「薬剤」とは、非限定的に、合成および天然に存在するタンパク質性および非タンパク質性のエンティティを含む、任意の化学物質、エンティティ、またはモエティであり得る。いくつかの態様において、薬剤は、非限定的に、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAザイム、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの修飾および組み合わせ等を含む、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸、アミノ酸のオリゴマー、または炭水化物である。
いくつかの態様において、核酸は、DNAまたはRNAおよび核酸類似体であり、例えば、PNA、pcPNA、およびLNAであり得る。核酸は、一本鎖であってもよいしまたは二本鎖であってもよく、関心対象のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、PNA等を含む群より選択され得る。そのような核酸配列には、例えば、転写抑制因子として機能するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、小さい阻害性核酸配列、例えば、以下に限定されるわけではないが、RNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi（mRNAi）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。タンパク質および/もしくはペプチド薬剤またはそれらの断片は、例えば、通常、細胞に存在しないかまたはより低いレベルで発現される変異型タンパク質；治療用タンパク質；短縮型タンパク質であり得るが、これらに限定されるわけではない。関心対象のタンパク質は、変異型タンパク質、遺伝学的に改変されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾型タンパク質、およびそれらの断片を含む群より選択され得る。
候補薬剤は、所望の活性および/もしくは特性を有することが既知のものであってもよいし、または多様な化合物のライブラリーから選択されてもよい。薬理学的活性を有する薬物、遺伝学的活性を有する分子等も、候補薬剤として含まれる。そのような関心対象の候補薬剤には、例えば、化学療法剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、増殖因子または組換え増殖因子、ならびにそれらの断片およびバリアントが含まれる。
化学的化合物のような候補薬剤は、低分子化合物のような合成または天然の化合物のライブラリーを含む多様な起源から入手され得る。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、数多くの手段が、生体分子を含む多様な有機化合物のランダム合成および指向性合成のために利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、入手可能であるか、または容易に作製される。さらに、天然のまたは合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために使用され得る。既知の薬理学的薬剤が、構造的類似体を作製するため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、指向性のまたはランダムな化学的修飾に供されてもよい。
スクリーニング法の一つの態様において、化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。市販のコンビナトリアル低分子薬物ライブラリーを、当技術分野において周知のかつ/または本明細書に記載される画像化のシステムおよび方法を使用して、細胞に対する所望の効果についてスクリーニングすることができる。コンビナトリアルライブラリーは、例えば、Vitas-M LabおよびBiomol International,Inc.を含む商業的に利用可能な供給元から入手され得る。化合物ライブラリーの包括的なリストは、Broad Institute at Harvard Universityに見出され得る。NIH Roadmap,Molecular Libraries Screening Centers Network（MLSCN）からの10,000種の化合物および86,000種の化合物のもののような、その他の化学的化合物ライブラリーも、本明細書に記載された方法のための候補薬剤を供給するために使用され得る。
介入に関して、所望の生物学的活性を含む任意の処置が、ヒトの治療的介入のための候補と見なされるべきである。
本発明は、以下の番号のパラグラフのいずれかに定義されるようなものである。
1. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
（b）捕捉された小胞を有するセンサーを、ナノ粒子を含む二次プローブと接触させる工程、および
（c）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程
を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法。
2. 細胞外小胞特異的プローブおよび/または二次プローブが抗体を含む、パラグラフ1の方法。
3. 細胞外小胞がエクソソームを含む、パラグラフ1の方法。
4. 生物学的試料が、対象から入手された試料を含む、パラグラフ1の方法。
5. 対象から入手された試料が血液試料を含む、パラグラフ4の方法。
6. 細胞外小胞特異的抗体が抗CD63抗体を含む、パラグラフ2の方法。
7. 細胞外小胞特異的抗体が、バイオマーカーに対する抗体を含む、パラグラフ2の方法。
8. ナノ粒子が金粒子を含む、パラグラフ1の方法。
9. 捕捉された細胞外小胞がサイズおよび/または形によって特徴決定される、パラグラフ1の方法。
10. センサーが、多重検出のための少なくとも1種の付加的な細胞外小胞特異的抗体または複数の異なる細胞外小胞特異的抗体をさらに含む、パラグラフ1の方法。
11. 複数の細胞外小胞特異的抗体が少なくとも2種、少なくとも5種、少なくとも10種、少なくとも50種、少なくとも100種、またはそれ以上の異なる細胞外小胞特異的抗体を含む、パラグラフ10の方法。
12. 多重検出が複数の二次プローブを含む、パラグラフ11の方法。
13. 複数の二次プローブが、区別して標識されている、パラグラフ12の方法。
14. 複数の二次プローブが、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識されている、パラグラフ13の方法。
15. 二次プローブがエクソソーム内マーカーに結合する、パラグラフ1の方法。
16. （a）第1のプローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、少なくとも1種の小胞をセンサーに捕捉する工程、
（b）結合した細胞外小胞を定量化し個々に特徴決定するため、センサーを画像化する工程、
（c）センサーを、標識にコンジュゲートされた細胞外小胞の上または内部のバイオマーカーに結合する二次認識プローブを含む第2のプローブと接触させる工程、および
（d）センサーを画像化し、その画像を工程（b）において得られた画像と比較し、その際、工程（b）において画像化されたシグナルと比較された（d）において画像化されたシグナルの変化を、少なくとも1種の小胞におけるバイオマーカーの存在の指標とする工程
を含む、対象の生物学的試料由来の細胞外小胞におけるバイオマーカーの存在を決定するアッセイ。
17. 少なくとも1種の細胞外小胞がエクソソームを含む、パラグラフ16のアッセイ。
18. 第1および/または第2のプローブが抗体を含む、パラグラフ16のアッセイ。
19. 生物学的試料が、対象から入手された試料を含む、パラグラフ16のアッセイ。
20. 対象から入手された試料が血液試料を含む、パラグラフ19のアッセイ。
21. 第1のプローブが抗CD63抗体を含む、パラグラフ16のアッセイ。
22. 第1および/または第2の抗体が、バイオマーカーに対する抗体を含む、パラグラフ16のアッセイ。
23. 標識がナノ粒子、蛍光モエティ、または量子ドットを含む、パラグラフ16のアッセイ。
24. ナノ粒子が金粒子を含む、パラグラフ23のアッセイ。
25. 捕捉された細胞外小胞がサイズおよび/または形によって特徴決定される、パラグラフ16のアッセイ。
26. センサーが、多重検出のための少なくとも1種の付加的な細胞外小胞特異的抗体または複数の異なる細胞外小胞特異的抗体をさらに含む、パラグラフ16のアッセイ。
27. 複数の細胞外小胞特異的抗体が少なくとも2種、少なくとも5種、少なくとも10種、少なくとも50種、少なくとも100種、またはそれ以上の異なる細胞外小胞特異的抗体を含む、パラグラフ21のアッセイ。
28. バイオマーカーがエクソソーム内バイオマーカーである、パラグラフ16のアッセイ。
29. バイオマーカーがエクソソーム外バイオマーカーである、パラグラフ16のアッセイ。
30. 複数の二次プローブが工程（c）において使用される、パラグラフ16のアッセイ。
31. 複数の二次プローブが、区別して標識されている、パラグラフ30のアッセイ。
32. 複数の二次プローブが、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識されている、パラグラフ31のアッセイ。
33. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
（b）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を検出する工程
を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞の標識なしの検出の方法。
34. 捕捉された細胞外小胞のサイズ、形、および/または数を決定する工程をさらに含む、パラグラフ33の方法。
35. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
（b）捕捉された小胞を有するセンサーを、小胞外バイオマーカーに対する二次プローブであって、検出可能モエティをさらに含む二次プローブと、接触させる工程、および
（c）SP-IRISシステムを使用して検出可能モエティを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞上の小胞外バイオマーカーを検出する工程
を含む、細胞外小胞上の小胞外バイオマーカーを検出する方法。
36. 多重フォーマットを使用して実施される、パラグラフ35の方法。
37. 多重フォーマットが、工程（b）における複数の二次プローブの使用を含む、パラグラフ36の方法。
38. 複数の二次プローブが、区別して標識されている、パラグラフ37の方法。
39. 複数の二次プローブが、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識されている、パラグラフ35の方法。
40. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
（b）工程（a）からの捕捉された小胞を固定しかつ/または透過処理する工程、
（c）捕捉された小胞を有するセンサーを、小胞内バイオマーカーに対する二次プローブであって、検出可能モエティをさらに含む二次プローブと、接触させる工程、および
（d）SP-IRISシステムを使用して検出可能モエティを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞の小胞内バイオマーカーを検出する工程
を含む、細胞外小胞の内部の小胞内バイオマーカーを検出する方法。
41. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、および
（b）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程
を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法。
42. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
（b）捕捉された小胞を有するセンサーを、蛍光タグまたは量子ドットによってタグ付けされた二次プローブと接触させる工程、および
（c）SP-IRISシステムを使用して蛍光タグまたは量子ドットを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程
を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法。
43. （a）少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料を、1種または複数種のバイオマーカーに結合する1種または複数種の区別して標識されたプローブと接触させる工程、
（b）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、工程（a）の標識された生物学的試料と接触させ、それによって、工程（a）の標識された生物学的試料由来の細胞外小胞の集団をセンサーに捕捉する工程、
（c）SP-IRISシステムを使用して工程（b）の捕捉された細胞外小胞を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、
（d）SP-IRISシステムを使用して1種または複数種の区別して標識されたプローブを画像化し、それによって、生物学的試料の中の1種または複数種の区別して標識されたプローブによって標識された細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、および
（e）工程（b）において捕捉された細胞外小胞の集団の中の1種または複数種のバイオマーカーを発現する細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定するため、工程（d）において得られた画像を工程（c）において得られた画像と比較する工程
を含む、バイオマーカーを発現する集団の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法。
実施例1：細胞外小胞のSP-IRIS検出
検出システム
SP-IRIS（単一粒子干渉反射画像化センサー）は、サイズおよび形に基づく、個々の捕捉されたナノ粒子の同定を可能にする、低コストでコンパクトなバイオセンシングプラットフォームである。可視光LED源によるセンサー表面の照射によって、読み取り機が生データを取得し、40倍対物レンズおよびカメラを使用して表面の画像が獲得される。シリコン基質上の二酸化ケイ素層からなるセンサー表面は、再現性の高い半導体プロセスによって作成される。センサー表面から反射された光の干渉は、従来のカメラによって獲得される別個のシグナルを生ずる粒子の存在によって修飾される。センサーに捕捉されたナノ粒子が、画像上にドットとして出現し、フォワードモデル（Daaboul et al.(2010)Nano Lett 10:4727-4731）を使用して、特定の波長における粒子の明度から、粒子のサイズが計算される。サイズ識別は、表面に結合した異なるナノ粒子集団からの鑑別を可能にし、それは、表面に非特異的に結合した粒子（即ち、環境由来の細片または埃粒子）からのノイズの低下にも役立つ。SP-IRIS画像において、100万もの別個のナノ粒子を同時に検出することができる。さらに、SP-IRISシステムは、器機の実行を少数のボタンクリックへと単純化するハードウェアおよびソフトウェアの自動化を通して、使用が容易になるよう最適化されている。
SP-IRISプラットフォームによる細胞外小胞の画像化
ある研究において、SP-IRISシステムは、黒色腫細胞株（WM35および1205Lu）ならびに乳癌細胞株（MCF-7）の細胞培養上清に由来する個々のエクソソームおよびEVを検出することが示された。SP-IRISチップを、CD63、ニューロピリン2（NRP-2）、およびカベオリン1に対する抗体によって機能化した。CD63は、一般的なエクソソーム特異的マーカーである（Simpson et al.(2008)Proteomics 8(19):4083-4099；Kowal et al.(2014)Curr Opin Cell Biol 29:116-125）。NRP-2は、悪性疾患特異的な細胞表面マーカーであることが示されている（Ellis,LM.(2006)Mol Cancer Ther 5(5):1099-1107）。カベオリン1は、腫瘍細胞から分泌されたエクソソームからのみ検出され、他の正常細胞からは検出されない黒色腫特異的なエクソソームマーカーである（Logozzi et al.(2009)PLoS ONE 4(4):e5219）。
図1中の結果は、黒色腫細胞株（WM35および1205LU）について、CD63プローブ、NRP-2プローブ、およびカベオリン1プローブにEVが捕捉されたことを示す。アレイ上のCD63スポットは、エクソソームとして分類され得るEVの均一な分布を示すが、NRP-2およびカベオリン1は、エクソソームまたはマイクロベシクルとして分類され得る、より大きいEVに加えて、類似した粒子サイズ分布を示す（示されないデータ）。表現型決定、サイズ決定、および計数を行うことができるマイクロアレイは、SP-IRISプラットフォームの新規の能力である。
個々のEVにおける複数のマーカーの共局在
アレイ化された捕捉プローブを含むマイクロアレイにEVを捕捉した後、金ナノ粒子によって標識された二次抗体を、センサーへ導入する。標識された抗体タグは、二次抗体に対する表面マーカーを有するエクソソームに結合する。金によって標識された抗体によるエクソソームのタグ付けは、そのサイズを増加させ、従って、それは、図2に例示されるようにSP-IRIS画像においてより明るく見える。ロースループットであり、高価であり、広い適用のためにスケーラブルでない電子顕微鏡法（EM）を使用して表面マーカーを見る時、免疫金タグによるこの二次標識は、標準的な実務である（Yang et al.(2014)PLoS ONE 9(11):e110641；Kanwar et al.(2014)Lab Chip 14(11):1891）。対照的に、SP-IRISプラットフォームを使用したSP-IRISアッセイは、数分の一のコストで、ハイスループットマイクロアレイフォーマットで、EMによる免疫金染色と類似の能力を、当業者が達成することを可能にする。一次プローブによって表面にエクソソームを捕捉し、次いで、例えば、40nmの金粒子によってタグ付けされた二次プローブを使用して、第2のマーカーを検出することによって、2種の表面マーカーの共局在を決定することができる。2種を越える表面マーカーの共局在の決定は、例えば、40nmより小さいナノ粒子を使用して達成され得る。標識サイズの低下は、異なる表面マーカーに対する複数の金ナノ粒子の結合の立体障害を低下させる。従って、異なる二次タグを連続的に添加することによって、表面上に表面タンパク質マーカーを有する場合、検出されるエクソソームのサイズが連続的に増加する。サイズ増加の段階は、免疫金標識のサイズおよびマーカーの表面濃度と相関する。
ナノ粒子、即ち、エクソソームおよびマイクロベシクルのサイズ決定
SP-IRISプラットフォームは、200nm未満の直径を有するウイルス性病原体を、全血のような複雑な試料から直接、迅速に超高感度に検出するために主として開発された。SP-IRISシステムは、70nm〜200nmの粒子を計数し正確にサイズ決定することが示されている（Daaboul et al.(2010)Nano Lett（前記）；Yurt et al.(2012)Nanoscale 4(3):715）。最近、＜3.5×103 PFU/mlの感度で、全血から直接、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスを直接検出するためのアッセイが開発された（Daaboul et al.(2014)ACS Nano 8(6):6047-6055）。SP-IRISシステムは、50nm〜1μmの範囲のがんに関連したエクソソームおよびマイクロベシクルの検出のために使用され得る。粒子は、1μmより大きくなると、顕微鏡によって解像され得る。およそ800nmである回折限界より小さい粒子については、異なる波長における粒子応答の明度から、粒子のサイズが推論される。
SP-IRISシステムは、200nmを越えるサイズを検出するために最適化され得る。この目的のため、100nm段階で50nm〜1μmの範囲の直径サイズを有するポリスチレンビーズを、SP-IRISセンサーチップ上に固定化する。粒子の応答を異なる波長で取得する。短波長LEDおよび長波長LEDの組み合わせを使用することによって、50nm〜細胞サイズ特色の広いダイナミックレンジで、粒子を計数しサイズ決定することができるシステムが開発される。
ナノ粒子標識による個々のEVにおける複数のマーカーの共局在の決定
SP-IRISプラットフォームは、異なるマーカーに対するプローブを表面上にアレイ化することによって、エクソソームの多重化された検出を実施するために使用され得る。多重化された検出は、異なるタンパク質マーカーについてエクソソームの量を定量化する；しかしながら、それは、必ずしも同一のエクソソームにおける複数のマーカーの存在を認証するものではない。ナノ粒子タグ付き二次プローブを開発することによって、表面に捕捉された個々のエクソソームにおける2種以上の表面バイオマーカーの共局在を決定するため、システムをさらに使用することができる。この技術は、従来、金免疫染色によって実施され、電子顕微鏡法（EM）によって検出されている。EMは、高価であり、特別の試料調製および特殊な訓練を必要とし、スループットにおいて限定されている。
対照的に、SP-IRISプラットフォームは、高いシグナルノイズ比で、直径40nmの金ナノ粒子へタグ付けされた抗体プローブを可視化することができる。センサー表面上のCD63プローブによって捕捉されたエクソソームを、標識なしの検出を使用して、計数し、サイズ決定することができる（示されないデータ）。次いで、40nmの金ナノ粒子によってタグ付けされた二次抗体（抗NRP-2）が、表面上に流され、二次抗体が、黒色腫細胞株由来エクソソームに結合し、一次検出されたエクソソームをより大きく見せる（示されないデータ）。図4中のサイズ決定ヒストグラムは、金ナノ粒子によってタグ付けされた二次抗体の結合によって、結果として生じたサイズ決定ヒストグラムのシフトを示す。
捕捉されたエクソソームの二次タグによる標識を最適化することができ、例えば、二次標識を、周知のEDC/NHS化学を使用して、カルボキシレート金ナノ粒子に共有結合で結合させることができる。標識の濃度およびインキュベーションの時間は、ほぼ100％のタグ付け効率を確実にするために最適化され得る。タグ付けは、免疫金検出のための至適基準であるEMによって確認される。
実施例2：SP-IRISを使用したエクソソームナノ小胞の検出および表現型決定の最適化
図5に示される終点で乾条件で収集されたデータは、エクソソーム粒子の検出におけるSP-IRISテクノロジーの能力を証明する。黒色腫細胞培養物から単離され、超遠心を使用して精製されたたエクソソームを、抗CD63抗体を使用して表面に捕捉した。直径60〜100nmのサイズ分布を有する集団由来のエクソソームは、バックグラウンドから容易に判別され得るが、正確な定量化およびサイズ識別のため、さらなる最適化が実施されてもよい。同一のチップを、後に、Au-NPによって標識された二次抗体と共にインキュベートし、乾条件下で再び画像化する。以前に捕捉され、検出され、サイズ決定されたエクソソームの多くが、Au-NPを付着させていることを示す、サイズ分布の有意なシフトが起こり、それによって、特定の抗体に対する親和性が示され、従って、表現型が示される。SP-IRISテクノロジーのこのエクソソーム表現型弁別能力は、腫瘍から分泌されたエクソソームを、NRP2およびカベオリン1のような腫瘍特異的なエクソソームマーカータンパク質の二重標識によって定量的に検出することができることを示す。
実験設計
エクソソームナノ小胞のデジタル検出のためのSP-IRISの機器使用：
SP-IRISは、抗体マイクロアレイに捕捉されたナノメートルサイズの粒子を検出し、単一の粒子が、最先端の光学顕微鏡技術を超える解像度でデジタルに計数される。分析ソフトウェアは、5nmの識別精度で、40nm〜200nmの範囲内の検出されたエクソソーム粒子のサイズを抽出する。粒子集団のサイズ分布は、試料の不均一性および疾患状態の指標となり得るため、サイズ識別はエクソソームの特徴決定にとって重要である。電子顕微鏡法のようなこのスケールでのサイズ識別を有する最先端テクノロジーには、スループットおよび使用の難しさという欠点がある。本明細書に記載されたプラットフォームは、多重マイクロアレイ配置での捕捉を通したエクソソームの表現型特徴決定、および金ナノ粒子タグ付き二次抗体の検出によるさらなる立証を可能にする。プラットフォームは、エクソソームおよび金ナノ粒子の同時検出が可能であり、分析ソフトウェアは、2つの粒子集団の弁別を可能にする。最先端のエクソソーム分析技術とは対照的に、本明細書に例証されたプラットフォームは、低コストで、使用が容易で、生体適合性のシステムによる、低い試料体積からのハイスループット分析を提供する。
エクソソームタンパク質マーカーを使用した腫瘍特異的エクソソームの計数のためのSP-IRISアッセイ最適化：
エクソソームの計数および表現型決定：SP-IRISセンサーは、各々商業的に製作されているシリコン基質と薄い酸化物層とからなる。次いで、複雑な媒体（ヒト全血）の中のウイルス粒子の検出のために試験され、大きな防汚特性を示した3Dポリマー表面によって、センサーがコーティングされる（22）。次いで、Scienion（商標）からのS3 Flexarrayer（商標）が、表面に捕捉プローブをアレイ化するために使用される。センサー表面へのプローブ固定化は、異なる濃度、緩衝液の組成、およびpHの試験を通して最適化される。表面上の最適化された捕捉プローブ（例えば、抗体）は、滑らかなタンパク質スポットおよび高い捕捉プローブ密度（＞3ng/mm2）をもたらす。希釈曲線は、nMから0まで、10％ヒト血清アルブミンを含むPBSにタンパク質標準を添加することによって実施され得る。希釈曲線は、センサー表面上の抗体の機能性を試験し、アッセイの感度を示す。抗体がタンパク質標的に結合し得ない場合、さらなる抗体を試験し最適化することができる。SP-IRISセンサーは、アレイ化された表面抗体への分子の結合のデジタル計数を可能にするため、40nmの金ナノ粒子にコンジュゲートされた検出抗体を必要とする。
ニューロピリン2（NRP2）は、その発現レベルが黒色腫の悪性進行と相関する膜貫通受容体タンパク質である（4、5）。カベオリン1は、受容体非依存性エンドシトーシスに関与する膜内在性タンパク質であり（24〜26）、黒色腫特異的なエクソソームマーカータンパク質である（7）。これらの2種のエクソソームマーカータンパク質は、SP-IRISを使用した腫瘍特異的なエクソソームの定量的検出（エクソソーム表現型区別）のための理想的な候補である。これらのエクソソームマーカーの抗体は、標準的なEDC/NHS化学を使用して、商業的に購入されたカルボキシル化金ナノ粒子にコンジュゲートされ得る。
血液試料によるプラットフォームの有効性確認：
臨床試料の状況におけるSP-IRIS技術のアッセイ再現性および検出感度を決定するため、本発明者らは、がん細胞株から単離された既知量のエクソソームが添加された正常健常ドナー由来の血液試料を使用した。エクソソームは、1205Lu黒色腫およびMCF-7乳癌細胞から単離される。がん細胞を、エクソソームを含まないFBS培地によって32時間培養し、次いで、Theryら（27）によって記載される伝統的な超遠心法の変法である超遠心およびろ過の組み合わせによって、エクソソームを単離する。エクソソームペレットを-20℃で保管し、収率をBCAアッセイによって測定する。ウサギ抗NRP2抗体（sc-5542、Santa Cruz（商標））およびマウス抗カベオリン1抗体（sc-53564、Santa Cruz（商標））を使用する。
SP-IRISシステムの最適化：
以前に、本発明者らは、直径60nmもの小さい低指数ナノ粒子を検出し、サイズ決定する能力を示した。本発明者らは、40nmサイズに及ぶようその能力を改善することを期待するが、それは、SP-IRIS画像の明スポットの認識のおよそ4倍の改善を必要とする。例えば、改善された画像処理ツールを使用することによる、SP-IRISシステムのルーチンの最適化は、より小さい粒子を可視化するのに十分であろう。しかしながら、改善された定量化およびサイズ識別のためには、ナノ粒子（エクソソーム）の可視性を増加させるためのハードウェアソリューションを有することが望ましいかもしれない。例示的な方法は、（照明/収集のマッチングと比較された）部分暗視野照明の使用である。本発明者らは、予備実験および計算が有望であることを見出した（示されないデータ）。さらに、以前の実験は、単色画像取得に限定されており、本発明者らは、多波長の画像化および画像登録を実行することを計画している。
実施例3：小胞内バイオマーカーまたはエクソソーム内バイオマーカーの検出および特徴決定
本明細書に記載された方法は、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）内のバイオマーカーの検出および/または特徴決定のため、さらに企図される。内部バイオマーカー（例えば、カーゴ）を特徴決定する例示的な方法は、本明細書において提供される。
細胞外小胞（例えば、エクソソーム）は、細胞外小胞特異的プローブ、例えば、少なくとも1種の抗体、少なくとも1種のペプチド、または少なくとも1種のアプタマーを使用して、本明細書に記載されるセンサーに捕捉される。いくつかの態様において、内部マーカーを特徴決定する時、小胞集団は、センサー上の1スポット当たり1〜10,000個の小胞を含む。
いくつかの態様において、捕捉された小胞は、第2のプローブの小胞内バイオマーカーへのアクセスを可能にするため、透過処理される。他の態様において、捕捉された小胞は、まず、（とりわけ、例えば、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、メタノール、エタノール、アセトン、ホルマリン、またはそれらの組み合わせによって）表面に固定された後、透過処理される。透過処理は、界面活性剤（とりわけ、例えば、サポニン、SDS、トリトンX100、トゥイーン20、NP40、プロテイナーゼK、ストレプトリジンO、ジギトニン）または有機溶媒（とりわけ、例えば、メタノール、エタノール、アセトン）の使用を通して、電気穿孔を使用して実施され得る。
小胞内バイオマーカーの染色は、オンチップ染色を介して実施され得る。任意の小胞内バイオマーカーが、本明細書に記載された方法を使用して染色され得る。例えば、タンパク質バイオマーカーは、標識された抗体、アプタマー、またはペプチドによって染色され得；核酸は、フルオロフォアによって標識された相補配列によって染色され得（例えば、FISHアッセイ）；脂質は、色素（例えば、Molecular Probes（商標）（Eugene,OR）のDiO、DiA、DiL、DiD）によって染色され得る。特定のRNA（例えば、mRNA、miRNA）またはDNAの存在、量、またはレベルの変化は、本明細書に記載された方法を使用して決定され得る。特異的な変異、多形、または融合を、本明細書に記載された方法を使用して検出することができ、疾患の診断のために使用することができることが、さらに企図される（例えば、肺癌、結腸癌、または膵臓癌のようながんの診断のため、KRASの変異を検出することができ；肺癌のようながんの診断ため、ALK遺伝子の融合を検出することができる）。
多数のアウトプット尺度を決定するため、データの後処理を実施することができる。例えば、サイズおよびその他の特徴に関する標識なしのデータを、小胞内バイオマーカーの存在量または発現に関する蛍光データと相関させることができる。もう一つの態様において、試料の不均一性、またはある種の生体分子（例えば、脂質、タンパク質、核酸等）もしくは生体分子の組み合わせを含む捕捉されたエクソソームの割合を決定することができる。
一つの態様において、捕捉された小胞の内部カーゴの特徴決定の方法は、以下の工程を含む：
（i）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーに細胞外小胞またはエクソソームを捕捉する工程、
（ii）任意で、捕捉された小胞を固定する工程、
（iii）捕捉された小胞を透過処理する工程、
（iv）第2のプローブを使用して、所望の小胞内バイオマーカーを染色する工程、および
（v）任意で、参照と比較して、特定のバイオマーカーを含む小胞の数/サイズ、試料の不均一性、または小胞内コンパートメントに位置するバイオマーカーの量を決定する工程。
もう一つの態様において、捕捉された小胞の内部カーゴの特徴決定の方法は、以下の工程を含む：
（i）体液中または緩衝液中の細胞外小胞の試料を提供する工程、
（ii）体液中または緩衝液中の細胞外小胞を固定し、透過処理する工程、
（iii）少なくとも第2のプローブによって体液中または緩衝液中の細胞外小胞を染色する工程、
（iv）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーに細胞外小胞を捕捉する工程、
（v）本明細書に記載されるSP-IRISの標識なしの方法を使用して、捕捉された小胞のサイズおよび数を決定する工程、
（vi）第2のプローブの蛍光（または複数の区別して標識されたプローブが使用される場合、複数の色）を測定する工程、
（vii）試料の不均一性を測定し、ある種の小胞内バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせを含む捕捉されたエクソソームの割合を決定するため、標識なしのデータと蛍光データとを相関させる工程。
参照
Figure 2018530755
Figure 2018530755

Claims (43)

  1. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
    （b）捕捉された小胞を有するセンサーを、ナノ粒子を含む二次プローブと接触させる工程、および
    （c）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程
    を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法。
  2. 細胞外小胞特異的プローブおよび/または二次プローブが抗体を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 細胞外小胞がエクソソームを含む、請求項1に記載の方法。
  4. 生物学的試料が、対象から入手された試料を含む、請求項1に記載の方法。
  5. 対象から入手された試料が血液試料を含む、請求項4に記載の方法。
  6. 細胞外小胞特異的抗体が抗CD63抗体を含む、請求項2に記載の方法。
  7. 細胞外小胞特異的抗体が、バイオマーカーに対する抗体を含む、請求項2に記載の方法。
  8. ナノ粒子が金粒子を含む、請求項1に記載の方法。
  9. 捕捉された細胞外小胞がサイズおよび/または形によって特徴決定される、請求項1に記載の方法。
  10. センサーが、多重検出のための少なくとも1種の付加的な細胞外小胞特異的抗体または複数の異なる細胞外小胞特異的抗体をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  11. 複数の細胞外小胞特異的抗体が少なくとも2種、少なくとも5種、少なくとも10種、少なくとも50種、少なくとも100種、またはそれ以上の異なる細胞外小胞特異的抗体を含む、請求項10に記載の方法。
  12. 多重検出が複数の二次プローブを含む、請求項11に記載の方法。
  13. 複数の二次プローブが、区別して標識されている、請求項12に記載の方法。
  14. 複数の二次プローブが、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識されている、請求項13に記載の方法。
  15. 二次プローブがエクソソーム内マーカーに結合する、請求項1に記載の方法。
  16. （a）第1のプローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、少なくとも1種の小胞をセンサーに捕捉する工程、
    （b）結合した細胞外小胞を定量化し個々に特徴決定するため、センサーを画像化する工程、
    （c）センサーを、標識にコンジュゲートされた細胞外小胞の上または内部のバイオマーカーに結合する二次認識プローブを含む第2のプローブと接触させる工程、および
    （d）センサーを画像化し、その画像を工程（b）において得られた画像と比較し、その際、工程（b）において画像化されたシグナルと比較された（d）において画像化されたシグナルの変化を、少なくとも1種の小胞におけるバイオマーカーの存在の指標とする工程
    を含む、対象の生物学的試料由来の細胞外小胞におけるバイオマーカーの存在を決定するアッセイ。
  17. 少なくとも1種の細胞外小胞がエクソソームを含む、請求項16に記載のアッセイ。
  18. 第1および/または第2のプローブが抗体を含む、請求項16に記載のアッセイ。
  19. 生物学的試料が、対象から入手された試料を含む、請求項16に記載のアッセイ。
  20. 対象から入手された試料が血液試料を含む、請求項19に記載のアッセイ。
  21. 第1のプローブが抗CD63抗体を含む、請求項16に記載のアッセイ。
  22. 第1および/または第2の抗体が、バイオマーカーに対する抗体を含む、請求項16に記載のアッセイ。
  23. 標識がナノ粒子、蛍光モエティ、または量子ドットを含む、請求項16に記載のアッセイ。
  24. ナノ粒子が金粒子を含む、請求項23に記載のアッセイ。
  25. 捕捉された細胞外小胞がサイズおよび/または形によって特徴決定される、請求項16に記載のアッセイ。
  26. センサーが、多重検出のための少なくとも1種の付加的な細胞外小胞特異的抗体または複数の異なる細胞外小胞特異的抗体をさらに含む、請求項16に記載のアッセイ。
  27. 複数の細胞外小胞特異的抗体が少なくとも2種、少なくとも5種、少なくとも10種、少なくとも50種、少なくとも100種、またはそれ以上の異なる細胞外小胞特異的抗体を含む、請求項21に記載のアッセイ。
  28. バイオマーカーがエクソソーム内バイオマーカーである、請求項16に記載のアッセイ。
  29. バイオマーカーがエクソソーム外バイオマーカーである、請求項16に記載のアッセイ。
  30. 複数の二次プローブが工程（c）において使用される、請求項16に記載のアッセイ。
  31. 複数の二次プローブが、区別して標識されている、請求項30に記載のアッセイ。
  32. 複数の二次プローブが、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識されている、請求項31に記載のアッセイ。
  33. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
    （b）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を検出する工程
    を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞の標識なしの検出の方法。
  34. 捕捉された細胞外小胞のサイズ、形、および/または数を決定する工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
  35. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
    （b）捕捉された小胞を有するセンサーを、小胞外バイオマーカーに対する二次プローブであって、検出可能モエティをさらに含む二次プローブと、接触させる工程、および
    （c）SP-IRISシステムを使用して検出可能モエティを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞上の小胞外バイオマーカーを検出する工程
    を含む、細胞外小胞上の小胞外バイオマーカーを検出する方法。
  36. 多重フォーマットを使用して実施される、請求項35に記載の方法。
  37. 多重フォーマットが、工程（b）における複数の二次プローブの使用を含む、請求項36に記載の方法。
  38. 複数の二次プローブが、区別して標識されている、請求項37に記載の方法。
  39. 複数の二次プローブが、サイズおよび/または形によって区別される複数のナノ粒子によって、区別して標識されている、請求項35に記載の方法。
  40. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
    （b）工程（a）からの捕捉された小胞を固定しかつ/または透過処理する工程、
    （c）捕捉された小胞を有するセンサーを、小胞内バイオマーカーに対する二次プローブであって、検出可能モエティをさらに含む二次プローブと、接触させる工程、および
    （d）SP-IRISシステムを使用して検出可能モエティを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞の小胞内バイオマーカーを検出する工程
    を含む、細胞外小胞の内部の小胞内バイオマーカーを検出する方法。
  41. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、および
    （b）SP-IRISシステムを使用してナノ粒子を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程
    を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法。
  42. （a）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料と接触させ、それによって、小胞をセンサーに捕捉する工程、
    （b）捕捉された小胞を有するセンサーを、蛍光タグまたは量子ドットによってタグ付けされた二次プローブと接触させる工程、および
    （c）SP-IRISシステムを使用して蛍光タグまたは量子ドットを画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程
    を含む、生物学的試料由来の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法。
  43. （a）少なくとも1種の細胞外小胞を含む生物学的試料を、1種または複数種のバイオマーカーに結合する1種または複数種の区別して標識されたプローブと接触させる工程、
    （b）細胞外小胞特異的プローブを含むSP-IRISセンサーを、工程（a）の標識された生物学的試料と接触させ、それによって、工程（a）の標識された生物学的試料由来の細胞外小胞の集団をセンサーに捕捉する工程、
    （c）SP-IRISシステムを使用して工程（b）の捕捉された細胞外小胞を画像化し、それによって、生物学的試料の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、
    （d）SP-IRISシステムを使用して1種または複数種の区別して標識されたプローブを画像化し、それによって、生物学的試料の中の1種または複数種の区別して標識されたプローブによって標識された細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する工程、および
    （e）工程（b）において捕捉された細胞外小胞の集団の中の1種または複数種のバイオマーカーを発現する細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定するため、工程（d）において得られた画像を工程（c）において得られた画像と比較する工程
    を含む、バイオマーカーを発現する集団の中の細胞外小胞を定量化しかつ/または特徴決定する方法。
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