JP2013507641A - 黒色腫腫瘍細胞の識別のためのバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
ニューロピリン−2は黒色腫腫瘍細胞の新規のバイオマーカーとして同定された。本明細書に記載される例及び実施形態は説明の目的のみのためのものであって、これらを考慮した様々な修飾又は変更は当業者に示唆されるであろうし本出願の趣旨及び範囲内に含まれるものであることが理解される。
腫瘍細胞の近隣の内皮細胞との相互作用は腫瘍の生存及び転移にとって決定的である。黒色腫はその発生の比較的早いステージで転移する能力のために悪名高い。この攻撃的な挙動は少なくとも部分的に、腫瘍細胞とそれらを囲む間質との間の相互作用に依存する。インビボでの転移の間に生じる腫瘍−間質細胞間の相互作用のモデルとなる長期間のヘテロタイプ細胞共培養系を用いて、血管新生及び軸索誘導に関与する細胞表面受容体であるニューロピリン−2(NRP2)は、黒色腫と内皮細胞との相互作用の間に黒色腫細胞において高度にアップレギュレートされる遺伝子として同定されている。
用いられる共培養法のなかで、ランダム混合法は同様の相対的なヘテロタイプ細胞の数及び広範囲に及ぶヘテロタイプ細胞間の界面のために共培養に加わる細胞のゲノム組成変化における大規模評価にとりわけ有利であり、おそらく大半の細胞が細胞間、内皮−黒色腫間の細胞間コミュニケーションに参加するようになるであろう。したがって、ランダム混合法を用いて、その後に細胞タイプ特異的な蛍光標識の色に基づいてヘテロタイプ細胞をソーティングすることで、ソートされた細胞の遺伝子発現プロファイルが試験された。
NRPは神経系及び血管系の発達を調整する膜貫通型糖タンパク質である(Bielenberg DR, Pettaway CA, Takashima S, Klagsbrun M (2006) Neuropilins in neoplasms: expression, regulation, and function Exp Cell Res 312(5): 584-593、Favier B, Alam A, Barron P, Bonnin J, Laboudie P et al. (2006) Neuropilin-2 interacts with VEGFR-2 and VEGFR-3 and promotes human endothelial cell survival and migration. Blood 108(4): 1243-1250、Staton CA, Kumar I, Reed MW, Brown NJ (2007) Neuropilins in physiological and pathological angiogenesis. J Pathol 212(3): 237-248)。NRPは血管内皮増殖因子(VEGF,vascular endothelial growth factor)受容体及びプレキシンと相互作用する共受容体として機能し、別個の機能を有する2つの既知のリガンド、軸索誘導に関与するクラス3セマフォリン及び血管新生を促進することが知られるVEGFファミリーメンバーを結びつける。NRP2の機能を遮断することは、近年、リンパ管内皮細胞運動及び腫瘍に関連したリンパ脈管新生に対する作用を通じて腫瘍転移を阻害することが示されている(Caunt M, Mak J, Liang WC, Stawicki S, Pan Q et al. (2008) Blocking neuropilin-2 function inhibits tumor cell metastasis. Cancer Cell 13(4): 331-342)。NRPはまた、いろいろながんにおいて発現されることから、腫瘍形成にもかかわっている(Bielenberg DR, Pettaway CA, Takashima S, Klagsbrun M (2006) Neuropilins in neoplasms: expression, regulation, and function Exp Cell Res 312(5): 584-593、Klagsbrun M, Takashima S, Mamluk R (2002) The role of neuropilin in vascular and tumor biology. Adv Exp Med Biol 515: 33-48、Bielenberg DR, Hida Y, Shimizu A, Kaipainen A, Kreuter M et al. (2004) Semaphorin 3F, a chemorepulsant for endothelial cells, induces a poorly vascularized, encapsulated, nonmetastatic tumor phenotype. J Clin Invest 114(9): 1260-1271、Chen C, Li M, Chai H, Yang H, Fisher WE et al. (2005) Roles of neuropilins in neuronal development, angiogenesis, and cancers. World J Surg 29(3): 271-275、Chabbert-de Ponnat I, Buffard V, Leroy K, Bagot M, Bensussan A et al. (2006) Antiproliferative effect of semaphorin 3F on human melanoma cell lines. J Invest Dermatol 126(10): 2343-2345、Ellis LM (2006) The role of neuropilins in cancer. Mol Cancer Ther 5(5): 1099-1107、Guttmann-Raviv N, Kessler 0, Shraga-Heled N, Lange T, Herzog Y et al. (2006) The neuropilins and their role in tumorigenesis and tumor progression. Cancer Lett 231(1): 1-11、Bielenberg DR, Klagsbrun M (2007) Targeting endothelial and tumor cells with semaphorins. Cancer Metastasis Rev 26(3-4): 421-431)。加えてNRP2は、近年、黒色腫転移及び血管新生に不可欠なプロセスをインビボで調節することが示されているが(Cohen T, Herzog Y Brodzky A, Greenson JK, Eldar S, Gluzman-Poltorak Z, Neufeld, G Resnick MB. Neuropilin-2 is a novel marker expressed in pancreatic islet cells and endocrine pancreatic tumours. The Journal of pathology 2002; 198:77-82)、これら調節のメカニズムは明確でない。したがって、共培養条件への表現型細胞応答の調節におけるNRP2の潜在的な役割が上記の様々な方法を用いて評価された。
NRP2は細胞増殖及び/又は運動を調節することが知られるVEGF及びセマフォリンのシグナル伝達と相互作用することが可能なことから、黒色腫−内皮共培養におけるNRP2過剰発現の機能的意義がNRP2中和抗体を用いて調査された(Nasarre P, Constantin B, Rouhaud L, Harnois T, Raymond G et al. (2003) Semaphorin SEMA3F and VEGF have opposing effects on cell attachment and spreading. Neoplasia 5(1): 83-92、Nasarre P, Kusy S, Constantin B, Castellani V, Drabkin HAet al. (2005) Semaphorin SEMA3F has a repulsing activity on breast cancer cells and inhibits E-cadherin-mediated cell adhesion. Neoplasia 7(2): 180-189)。研究において評価された抗体はNRP2のアミノ酸560〜858位に対して生成されたものであり、したがってセマフォリン及びVEGFリガンドの両者の結合を遮断するであろう。
細胞は平底96ウェルプレート中に3,000個の細胞/ウェルで播種された。ウサギポリクローナルNRP2抗体(sc−5542,Santa Cruz社製)及び正常ウサギIgG(sc−2027,Santa Cruz社製)、又はマウスモノクローナルNRP2抗体(sc−13117,Santa Cruz社製)及び正常マウスIgG(sc−2025,Santa Cruz社製)は終濃度10pg/mlで機能研究のために用いられた。XTT試薬(Cell Proliferation Kit II,Roche Applied Science社製)は24時間ごとに8日間、ウェルのサブセットに添加され、色の変化が分光光度計によりモニターされた。細胞数は標準曲線から外挿された。細胞は抗体の存在下で播種され、培地が交換され、抗体は2、4及び6日目に再び新しくされた。BrdU取り込みはBrdU Labeling and Detection Kit I(Roche Applied Science社製)を用いて、製造業者の説明書に従って測定された。
細胞は平底96ウェルプレート中に3,000個の細胞/ウェルで播種された。ウサギポリクローナルNRP2抗体(sc−5542,Santa Cruz社製)及び正常ウサギIgG(sc−2027,Santa Cruz社製)、又はマウスモノクローナルNRP2抗体(sc−13117,Santa Cruz社製)及び正常マウスIgG(sc−2025,Santa Cruz社製)は終濃度10pg/mlで機能研究のために用いられた。TUNELアッセイの場合、細胞は抗体の存在下で播種され、TUNEL染色は48時間の抗体処理の後又はトランスフェクション後48時間で行われた。TUNEL染色はIn situ Cell Death Detection Kit(TMR Red,Roche Applied Science社製)を用いて行われた。
細胞は平底96ウェルプレート中に3,000個の細胞/ウェルで播種された。ウサギポリクローナルNRP2抗体(sc−5542,Santa Cruz社製)及び正常ウサギIgG(sc−2027,Santa Cruz社製)、又はマウスモノクローナルNRP2抗体(sc−13117,Santa Cruz社製)及び正常マウスIgG(sc−2025,Santa Cruz社製)は終濃度10pg/mlで機能研究のために用いられた。スクラッチアッセイの場合、GFP−1205Lu細胞は100%コンフルエンスで24ウェルプレート中に播種された。200plピペットチップが細胞単層中に線を引っかくのに用いられ、細胞はPBS中で3回洗浄された。マイトマイシンCは終濃度0pM又は3pMで10%FBSを加えたDMEM中に添加された。DAPI染色は核を可視化するのに用いられた。全ての実験は3連で行われた。全ての実験についての顕微鏡写真はNikon社製のEclipse顕微鏡を使用して撮影され、MetaMorphソフトウェア(Molecular Devices社製)を用いて分析された。
NRP2が全ての共培養法で観察された枝状及びループ状ネットワークへの細胞再組織化を伴う方向性を持った集団性内皮細胞運動をも制御することが可能かを調査するために、HUVEC細胞運動の高度時間分解微速度撮影イメージングが用いられた。この目的のためには、最も制御された細胞共培養の方法であるマイクロパターニング法が、初期条件すなわち内皮細胞コロニーの形状及びその大きさの高い再現性度のためにとりわけ都合が良かった。
黒色腫細胞株のパネルにおけるNRP2リガンド及び共受容体の発現は、黒色腫におけるNRP2の機能に関連した経路を定義するために評価された。以前の変化する悪性進行ステージからの黒色腫細胞株の遺伝子発現研究は、黒色腫進行に関連した分子の特徴的性質を与えた(Ryu B, Kim DS, Deluca AM, Alani RM (2007) Comprehensive expression profiling of tumor cell lines identifies molecular signatures of melanoma progression. PLoS One 2(7): e594)。これらのデータはNRP2、そのホモログであるNRP1並びにその結合相手であるVEGFR1、プレキシンA4A、プレキシンA3、VEGF−A、VEGF−C及びSema3Fの発現を調査するためにマイニングされた。NRP2発現は黒色腫の全てのステージにおいて検出され、放射生育期のものの3つのうち2つにおいてより低い発現が認められた(図5A)。VEGF−Aの発現は早期ステージの黒色腫で後期ステージに対して上昇した一方(図5A)、プレキシン、Sema3F及びVEGF−Cの低レベル発現が評価された全ての黒色腫細胞株において見られ、Nrp1発現は実質的に欠けていた(図5A)。
VEGFR1フォワード(5'-GCACCTTGGTIGTGGCTGAC-3')
VEGFR1リバース(5'-GAGCAAGGATGAAGGCACTC-3')
VEGFR2フォワード(5'-CATCACATCCACTGGTATTGG-3')
VEGFR2リバース(5'-GCCAAGCTTGTACCATGTGAG-3')
VEGFR3フォワード(5'-CCCACGCAGACATCAAGACG-3')
VEGFR3リバース(5'-TGCAGAACTCCACGATCACC-3')
GAPDHフォワード(5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3')
GAPDHリバース(5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3')
間隙界面共培養法を用いて、様々な腫瘍細胞のHUVECパターニングを促進する能力が評価された(図6)。パターニングはHUVEC細胞のネットワークにより形成された円形領域を自動画像解析システムを用いて定量することにより査定された(図6A〜C、下)。興味深いことに、様々な腫瘍細胞株による幅広いHUVECパターン誘導が観察され、これには卵巣がん細胞、結腸がん細胞及び膵臓がん細胞により誘導された軽度から中等度のパターニング、並びに非小細胞肺がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫及び黒色腫の細胞により誘導された最も強いパターニングがあった(図6D、上)。腫瘍細胞のNRP2の発現とパターニングとの間に厳密な相関はなかったが(図6D)、パターニングに関連した腫瘍細胞株の上位5つのうち3つは顕著なレベルのNRP2を発現した。
免疫組織化学的分析において評価された組織はDepartment of Pathology of Memorial Sloan-Kettering Cancer Centerのアーカイブに由来し、適切なプロトコールの下で回収されたホルマリン固定、パラフィン包埋された保管材料から確立された検体マイクロアレイであった。用いられた組織検体は患者の臨床データに関するアノテーションは包含されない故に、転帰測定のために選択されなかった。色素性及び非色素性、紡錘及び類上皮、同様に線維形成性の黒色腫の混合物が黒色腫組織マイクロアレイ(TMA,melanoma tissue microarray)に包含された。これらの組織学的パラメーターはメラニン細胞分化抗原の発現と既に相関していた。良性母斑はJohns Hopkins Department of PathologyアーカイブからIRBに許可されたプロトコールの下で取得された。免疫組織化学検査はEnVision System HRP(DakoCytomation社製)を用いて行われた。スライドは脱パラフィン処理され、段階的なアルコール系列を用いて再水和された。クエン酸バッファー(pH6.0、10mM)が抗原回復のために用いられた。キャピラリーギャップ法を用いて、切片はNRP2に対するウサギポリクローナル抗体(SC−5542,Santa Cruz Biotechnology社製)と共に一晩インキュベートされた。1:50の希釈が最適な染色結果を与えることが見い出された。3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC,3-amino-9-ethyl carbazole)が色素原として用いられ、切片はヘマトキシリンで対比染色された。
HUVECパターニングは腫瘍に関連した分泌性可溶性因子に依存し、かつNRP2は分泌型及び細胞表面受容体としての両方で存在することができることから(Staton CA, Kumar I, Reed MW, Brown NJ (2007) Neuropilins in physiological and pathological angiogenesis. J Pathol 212(3): 237-248)、HUVEC単独、GFP−1205Lu細胞単独のいずれか、又はランダム混合法を用いて共培養された細胞に由来する条件培地におけるNRP2の発現が評価された(図13A)。HUVEC単独により条件付けされた培地に対してRFP−HUVEC及びランダム混合法共培養系の両者により条件付けされた培地におけるNRP2の濃度の顕著な上昇が観察された。これらの結果は、NRP2が少なくとも部分的に可溶性型で黒色腫細胞により生産され得、それ故にNRP2はパラクライン黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションの潜在的に興味深い推定上のメディエーターであることを示唆する。
濃度を変化させた組換え型ヒトNRP2(R&D Systems社製,2215−N2)は96ウェルプレート中に播種された。ウサギポリクローナルNRP2抗体(Santa Cruz(登録商標)社製,sc−5542)及びマウスモノクローナルNRP2抗体(Santa Cruz(登録商標)社製,sc−13117)は濃度を変化させた組換え型ヒトNRP2を検出することができた(図14)。したがって、ELISAは患者血流中のNRP2レベルを検出するのに用いられることが可能であり、黒色腫患者のスクリーニングのための鋭敏なツールを提供するものである。
SCIDマウスは1205Lu黒色腫細胞及びH460肺がん細胞を皮下注射された。NRP2に対する抗体(Santa Cruz社製,sc−5542)、ポドプラニン(リンパ脈管構造を見るため)及びCD31(血管密度を見るため)は125Iで放射性標識された。抗体は静脈内注射され、注射から4時間後(図15A)、72時間後(図15B)及び120時間後(図15C)にイメージングされた。
実験は、NRP2発現がNRP2抗体標識(Santa Cruz社製,sc−5542)及びFACs分析を通じて黒色腫細胞上で検出され得るかを決定するために行われた。垂直成長期黒色腫細胞株の細胞外染色及びFACS分析は、標識され得る細胞のサブ集団を明らかにする(図16A)。NRP2についての細胞内染色は、99.8%を超える黒色腫細胞がNRP2の細胞外MAMドメインを標的とするNRP2特異的抗体を用いて標識され識別され得ることを実証する(図16B)。これらの結果は、NRP2発現についてのFACS分析が細胞試料中で黒色腫細胞を検出するのに十分な感度及び特異度を提供することを指し示す。
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Claims (46)
- 対象における黒色腫を検出又は診断する方法であって、
a.前記対象から生物試料を取得すること、
b.前記試料中のi)ニューロピリン−2を発現している細胞、ii)可溶性のニューロピリン−2、又はiii)可溶性のニューロピリン−2断片の存在を検出すること、及び
c.前記ニューロピリン−2の発現を黒色腫の存在と関連付け、それによって対象における黒色腫を検出又は診断すること
を含む方法。 - 黒色腫を発症するリスクがある対象を識別する方法であって、
a.前記対象から生物試料を取得すること、
b.前記試料中のi)ニューロピリン−2を発現している細胞、ii)可溶性のニューロピリン−2、又はiii)可溶性のニューロピリン−2断片の存在を検出すること、及び
c.前記ニューロピリン−2の発現を黒色腫を発症するリスクと関連付け、それによって黒色腫を発症するリスクがある対象を識別すること
を含む方法。 - 対象における黒色腫の再発を予測する方法であって、
a.前記対象から生物試料を取得すること、
b.前記試料中のi)ニューロピリン−2を発現している細胞、ii)可溶性のニューロピリン−2、又はiii)可溶性のニューロピリン−2断片の存在を検出すること、及び
c.前記ニューロピリン−2の発現を黒色腫再発のリスクと関連付け、それによって対象における黒色腫の再発を予測すること
を含む方法。 - 生物試料が組織、組織ホモジネート、組織薄片、細胞、剖検試料、病理試料、生検試料又は体液である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 体液が血液、血漿、血清、尿、浸出液又は髄液である、請求項4に記載の方法。
- 検出がイムノアッセイ、アフィニティーカラム分離、磁気選別又はFACSを行うことを含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 検出が、生物試料をニューロピリン−2又はニューロピリン−2の結合相手であるタンパク質を発現している細胞を選択的に検出する作用物質と接触させることを含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 作用物質が、ニューロピリン−2に特異的に結合する抗体である、請求項7に記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項8に記載の方法。
- 抗体がポリクローナル抗体である、請求項8に記載の方法。
- 抗体が標識化されている、請求項8〜10のいずれかに記載の方法。
- タンパク質がVEGF、VEGFの断片、PLEXIN、PLEXINの断片、セマフォリン又はセマフォリンの断片である、請求項7に記載の方法。
- タンパク質が標識化されている、請求項7又は12に記載の方法。
- 標識が、蛍光標識、別のレポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子又は量子ドットである、請求項11又は13に記載の方法。
- 対象における黒色腫細胞をインビボで識別する方法であって、
a.前記対象に、ニューロピリン−2を選択的に検出する標識化された作用物質の診断上有効な量を投与すること、及び
b.前記標識化された作用物質を検出すること
を含む方法。 - 作用物質が、ニューロピリン−2に特異的に結合する抗体である、請求項15に記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項16に記載の方法。
- 抗体がポリクローナル抗体である、請求項16に記載の方法。
- 標識が、蛍光標識、別のレポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子又は量子ドットである、請求項15〜18のいずれかに記載の方法。
- ニューロピリン−2を発現していると識別された対象に黒色腫に対する処置を与えることをさらに含む、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 対象における黒色腫を診断又は検出するためのキットであって、i)ニューロピリン−2を発現している細胞、ii)可溶性のニューロピリン−2、又はiii)可溶性のニューロピリン−2断片の存在を検出する作用物質を少なくとも1つ含むキット。
- 黒色腫を発症するリスクがある対象を識別するためのキットであって、i)ニューロピリン−2を発現している細胞、ii)可溶性のニューロピリン−2、又はiii)可溶性のニューロピリン−2断片の存在を検出する作用物質を少なくとも1つ含むキット。
- 対象における黒色腫の再発を予測するためのキットであって、i)ニューロピリン−2を発現している細胞、ii)可溶性のニューロピリン−2、又はiii)可溶性のニューロピリン−2断片の存在を検出する作用物質を少なくとも1つ含むキット。
- 作用物質が、ニューロピリン−2又は可溶性のニューロピリン−2断片に特異的に結合する抗体である、請求項21〜23のいずれかに記載のキット。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項24に記載のキット。
- 抗体がポリクローナル抗体である、請求項24に記載のキット。
- 作用物質が、ニューロピリン−2の結合相手であるタンパク質である、請求項21〜23のいずれかに記載のキット。
- タンパク質がVEGF、VEGFの断片、PLEXIN、PLEXINの断片、セマフォリン又はセマフォリンの断片である、請求項27に記載のキット。
- 作用物質が標識化されている、請求項21〜28のいずれかに記載のキット。
- 標識が、蛍光標識、別のレポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子又は量子ドットである、請求項29に記載のキット。
- 作用物質を収容するための容器をさらに含む、請求項21〜30のいずれかに記載のキット。
- 対象から生物試料を得るための説明書をさらに含む、請求項21〜30のいずれかに記載のキット。
- 細胞試料から標的黒色腫細胞を少なくとも1つ選択的に単離する方法であって、
a.標的黒色腫細胞を少なくとも1つ含む細胞試料を準備すること、及び
b.前記細胞試料と、ニューロピリン−2を発現している細胞を選択的に検出する作用物質とを、前記標的黒色腫細胞(複数可)が前記作用物質に結合して、結合した黒色腫細胞(複数可)が得られるのに有効な条件下で接触させること
を含む方法。 - 結合した黒色腫細胞(複数可)を水性媒体で洗浄することをさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 標的黒色腫細胞(複数可)の存在を検出することをさらに含む、請求項33又は34に記載の方法。
- 単離された標的黒色腫細胞(複数可)をインビトロアッセイにおいて用いることをさらに含む、請求項33〜35のいずれかに記載の方法。
- 作用物質が、ニューロピリン−2に特異的に結合する抗体である、請求項33〜36のいずれかに記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項37に記載の方法。
- 抗体がポリクローナル抗体である、請求項37に記載の方法。
- 作用物質が標識化されている、請求項33〜39のいずれかに記載の方法。
- 標識が、蛍光標識、別のレポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子又は量子ドットである、請求項40に記載の方法。
- 黒色腫について対象を処置する方法であって、
a.黒色腫に罹患している又は黒色腫を発症するリスクがある対象を識別すること、及び
b.前記対象に黒色腫細胞の増殖を阻害する作用物質を投与することであって、前記作用物質がニューロピリン−2介在性の細胞増殖を阻害するものであること
を含む方法。 - 作用物質が、ニューロピリン−2に選択的に結合する分子である、請求項42に記載の方法。
- 作用物質が、ニューロピリン−2に特異的に結合する抗体である、請求項42又は43に記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項44に記載の方法。
- 抗体がポリクローナル抗体である、請求項44に記載の方法。
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