CN114217058A - 纳米囊泡的多重表型分析 - Google Patents

纳米囊泡的多重表型分析 Download PDF

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Abstract

本文提供了使用SP‑IRIS系统从生物样品中捕获细胞外囊泡以用于定量和/或表征(例如，大小和/或形状鉴别)的方法。本文还提供了对捕获的细胞外囊泡上或捕获的囊泡内部的生物标志物(例如囊泡内生物标志物或外泌体内生物标志物)进行检测的方法。

Description

纳米囊泡的多重表型分析
本申请是申请日为2016年9月22日、发明名称为“纳米囊泡的多重表型分析”的申请号为201680066419.4的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年9月22日提交的美国临时申请号62/221,806的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明基于美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的合同No.AI089673在政府支持下完成。美国政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本公开涉及在单粒子水平上对细胞外囊泡(extracellular vesicles)进行的定量和表征。在一些实施方式中，本公开还涉及对细胞外囊泡表面上或囊泡内空间中的生物标志物表达进行的检测和/或定量。
背景技术
目前生物学家和研究人员正在积极使用高通量DNA和蛋白质分析技术(如微阵列技术)对用于药物开发、疾病研究和诊断的生物标志物进行高通量筛选。底物增强的微阵列成像能够以无标记(label-free)的方式在成千上万个斑点(spots)处同时检测生物分子与表面的结合。
单粒子干涉反射成像传感器(single particle interferometric reflectanceimaging sensor，SP-IRIS)系统包含多个非相干光源(如发光二极管(LED))，其可被用作干涉原理的检测和测量的照明源。LED的成本很低、紧凑并且耐用，因此LED对诊断和研究应用的大规模使用和配置而言是理想的。SP-IRIS系统使用低成本的非相干照明源，使得对分析物或样品中的单个生物分子靶标进行高放大率检测和成像成为可能。
SP-IRIS系统基于对来自传感器表面(目标粒子被捕获至该表面上)的反射光进行的成像。SP-IRIS传感器由层状介电基板构成。该层状结构提供了由纳米粒子靶标散射的光与从基板反射的基准光(reference light)之间必要的光程长度差。该SP-IRIS传感器可由位于硅(Si)上的多种介电材料(例如二氧化硅)制成。
发明内容
本文所述的方法部分基于以下发现：SP-IRIS可用于将细胞外囊泡从生物样品中捕获至SP-IRIS传感器上，并进一步允许对该细胞外囊泡进行定量和表征。另外，SP-IRIS系统可进一步用于对捕获的细胞外囊泡表面上或细胞外囊泡内部的生物标志物(例如囊泡内生物标志物或外泌体(exosomal)内生物标志物)的存在进行检测。
因此，在一个方面，本文提供了用于对生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针包含纳米粒子；以及(c)使用SP-IRIS系统对所述纳米粒子进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
在本文所述的所有其它方面和该方面的一个实施方式中，所述细胞外囊泡特异性探针和/或所述二级探针包括抗体。
在本文所述的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，使多种细胞外囊泡特异性探针与所述生物样品接触以允许对特定外泌体群进行分离和鉴别。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，使多种二级探针以多重方式(multiplex format)与具有捕获的囊泡的传感器接触。该多重方式允许对特定的细胞外囊泡和/或它们的组分进行差异化标记和鉴定。在一些实施方式中，此类差异化标记通过使用至少两种(例如，至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种)差异化标记的二级探针(例如不同的荧光标志物、不同大小或形状的纳米粒子或金粒子)来实现。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述细胞外囊泡包括外泌体。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，捕获的囊泡在所述传感器上进行固定和/或透化(permeabilized)。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述二级探针结合至囊泡内标志物或外泌体内标志物。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述生物样品包括从受试者获得的样品。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述从受试者获得的样品包括血液样品。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，细胞外囊泡特异性抗体包括抗CD63抗体。在本文提供的所有其它方面和该方面的其它实施方式中，所述细胞外囊泡特异性抗体包括抗CD81抗体或抗CD9抗体。在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，将至少两种细胞外囊泡特异性抗体组合使用，例如CD63/CD81抗体组合、CD63/CD9抗体组合或CD81/CD9抗体组合。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述细胞外囊泡特异性抗体包括针对生物标志物的抗体。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述纳米粒子包括金粒子。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，捕获的细胞外囊泡通过大小和/或形状进行表征。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述传感器进一步包含至少一种另外的细胞外囊泡特异性抗体或多种不同的细胞外囊泡特异性抗体，以对细胞外囊泡群进行多重检测或鉴别。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，多种细胞外囊泡特异性抗体包含至少2种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种或更多种不同的细胞外囊泡特异性抗体。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述多重检测进一步包含多种二级探针。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述多种二级探针是差异化标记的。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述多种二级探针是用通过大小和/或形状区分的多种纳米粒子进行差异化标记的。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述二级探针结合至外泌体内标志物。
本文提供的另一方面涉及用于从受试者内的生物样品中确定细胞外囊泡上生物标志物的存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含第一探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述至少一种囊泡捕获至所述传感器上；(b)对所述传感器进行成像以对结合的细胞外囊泡进行定量和单独(individually)表征；(c)使所述传感器与缀合至标记的第二探针接触，所述第二探针包含二级识别探针，所述二级识别探针与细胞外囊泡上的生物标志物结合；以及(d)对所述传感器进行成像并将图像与步骤(b)中获得的图像进行比较，其中与步骤(b)中所成像的信号相比，步骤(d)中所成像的信号的变化表示在所述至少一种囊泡上存在所述生物标志物。
在本文所述的所有其它方面和该方面的一个实施方式中，所述至少一种细胞外囊泡包括外泌体。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述第一探针和/或所述第二探针包括抗体。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述生物样品包括从受试者获得的样品。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述从受试者获得的样品包括血液样品。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述第一探针包括抗CD63抗体。在本文提供的所有其它方面和该方面的其它实施方式中，所述细胞外囊泡特异性抗体包括抗CD81抗体或抗CD9抗体。在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，将至少两种细胞外囊泡特异性抗体组合使用，例如CD63/CD81抗体组合、CD63/CD9抗体组合或CD81/CD9抗体组合。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述第一抗体和/或所述第二抗体包括针对生物标志物的抗体。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述纳米粒子包括金粒子。在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述二级标记可为使用例如连接至荧光团或量子点的抗体的荧光标记。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，捕获的细胞外囊泡通过大小和/或形状进行表征。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述传感器进一步包含至少一种另外的细胞外囊泡特异性抗体或多种不同的细胞外囊泡特异性抗体，以对细胞外囊泡群进行多重检测或鉴别。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，多种细胞外囊泡特异性抗体包含至少2种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种或更多种不同的细胞外囊泡特异性抗体。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述生物标志物为囊泡内标志物或外泌体内标志物。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述生物标志物为囊泡外标志物或外泌体外标志物。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，多种二级探针被用于本文所述的方法或测定法中。在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，用差异化标记的二级识别探针以多重方式进行该测定法。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述多种二级探针是差异化标记的。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述多种二级探针是用通过大小和/或形状区分的多种纳米粒子进行差异化标记的。
本文提供的另一方面涉及用于对生物样品中的细胞外囊泡进行无标记检测的方法或测定法，所述方法或测定法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使用SP-IRIS系统对纳米粒子进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行检测。
在本文提供的所有其它方面和该方面的一个实施方式中，所述方法进一步包括确定捕获的细胞外囊泡的大小、形状和数量。
在另一方面，本文还提供了用于对细胞外囊泡(例如一个或多个单独的细胞外囊泡)上的囊泡外生物标志物进行检测的方法或测定法，所述方法或测定法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针针对囊泡外生物标志物并进一步包含可检测部分；以及(c)使用SP-IRIS系统对所述可检测部分进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡(例如一个或多个单独的细胞外囊泡)上的囊泡外生物标志物进行检测。
在本文提供的所有其它方面和该方面的一个实施方式中，使用多重方式执行所述方法或测定法。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述多重方式包括在步骤(b)中使用多种二级探针。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述多种二级探针是差异化标记的。
在本文提供的所有其它方面和该方面的另一个实施方式中，所述多种二级探针是用通过大小和/或形状区分的多种纳米粒子进行差异化标记的。
本文所述的另一方面涉及用于对细胞外囊泡内部的囊泡内生物标志物进行检测的方法或测定法，所述方法或测定法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)对来自步骤(a)的捕获的囊泡进行固定和/或透化；(c)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针针对囊泡内生物标志物并进一步包含可检测部分；以及(d)使用SP-IRIS系统对所述可检测部分进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡上的囊泡内生物标志物进行检测。
本文提供的另一方面涉及用于对生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使用SP-IRIS系统对纳米粒子进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
在另一方面，本文还提供了用于对生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针标记有荧光标签或量子点；以及(c)使用SP-IRIS系统对所述荧光标签或量子点进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
本文提供的另一方面涉及用于对群体中表达生物标志物的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：(a)使包含至少一种细胞外囊泡的生物样品与一种或多种差异化标记的探针接触，所述探针结合一种或多种生物标志物；(b)使SP-IRIS传感器与步骤(a)中的标记的生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，从而将细胞外囊泡群从步骤(a)中的所述标记的生物样品中捕获至所述传感器上；(c)使用SP-IRIS系统对步骤(b)中的捕获的细胞外囊泡进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征；(d)使用SP-IRIS系统对所述一种或多种差异化标记的探针进行成像，从而对所述生物样品中经所述一种或多种差异化标记的探针标记的细胞外囊泡进行定量和/或表征；以及(e)将步骤(d)中获得的图像与步骤(c)中获得的图像进行比较，以对步骤(b)中捕获的细胞外囊泡群中表达所述一种或多种生物标志物的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
附图说明
图1示出了来自不同细胞系的细胞外囊泡检测。
图2示出了用SP-IRIS平台进行特异性外泌体检测的示意图。靶向不同表面标志物的探针被固定在芯片上。对粒子进行无标记检测。可通过纳米粒子标签确定正交共定位信息。可在同一外泌体上使用另外的标签。
图3A-图3B：图3A是针对两种波长的光(λ＝525nm和λ＝625nm)来自SP-IRIS的预期粒子响应。图3B是不均匀大小的粒子的示例图像。
图4：针对无标记群体和金纳米粒子标记群体的原始数据按大小vs.计数进行的分析。
图5示出了在外泌体上进行的示例性终点SP-IRIS检测实验。捕获的外泌体(无标记)的大小直方图和用Au-NP进行标记的第二步骤后大小分布的变化证明了直接检测大小和表型(phenotype)的能力。
图6A-图6D：使来自Panc-1细胞培养基的外泌体与SP-IRIS传感器表面接触，所述SP-IRIS传感器表面经外泌体特异性探针功能化。图6A示出了探针斑点上捕获的囊泡的无标记SP-IRIS图像。图6B是该无标记SP-IRIS图像的小插图。该无标记SP-IRIS图像允许对囊泡进行检测以及确定大小。图6C是将SP-IRIS传感器与来自Molecular ProbesTM的SYTORNASelect细胞染料一起孵育后在同一斑点上拍摄的荧光图像。图6D示出了该荧光图像的小插图，用于与图6B中的无标记SP-IRIS图像进行比较。通过比较这两幅图像，可看到在群体中仅有部分囊泡含有RNA。箭头有助于引导读者比较图6B和图6D中的两幅图像。
图7A-图7D：使来自Panc-1细胞培养基的外泌体与SP-IRIS传感器表面接触，所述SP-IRIS传感器表面经外泌体特异性探针功能化。图7A示出了探针斑点上捕获的囊泡的无标记SP-IRIS图像。图7B示出了该无标记SP-IRIS图像的小插图。该无标记SP-IRIS图像允许对囊泡进行检测以及确定大小。图7C是将SP-IRIS传感器与来自Molecular ProbesTM的BODIPY TR神经酰胺膜染料一起孵育后在同一斑点上拍摄的荧光图像。图7D示出了该荧光图像的小插图，用于与图7B中的无标记SP-IRIS图像进行比较。通过比较这两幅图像，如荧光图像所示，可看到检测到的无标记囊泡中的大部分含有脂质。箭头有助于引导读者比较这两幅图像。
具体实施方式
本文提供了使用SP-IRIS系统从生物样品中捕获细胞外囊泡以用于定量和/或表征(例如，大小和/或形状鉴别)的方法。本文还提供了对捕获的细胞外囊泡上或者捕获的囊泡内部的生物标志物(例如囊泡内生物标志物或外泌体内生物标志物)进行检测的方法。
定义
如本文所用的，术语“样品”是指包含至少一种细胞外囊泡的样品。在一个实施方式中，如本文所使用的术语“生物样品”是指从受试者获得的样品，其中该样品包含至少一种细胞外囊泡。尽管不是必需的或者需要的，但是术语“生物样品”旨在涵盖在使用本文所述的系统和方法进行成像之前进行处理的样品。例如，生物样品可为从受试者获得的全血样品，或者可被进一步加工成血清样品、血小板样品、外泌体样品等。
如本文所用的，术语“受试者”是指从中获得生物样品或生物样品源自其中的植物或动物，特别是人。如本文所用的，术语“受试者”涵盖人和非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛)和非哺乳动物(如鸡、两栖动物、爬行动物等)。在一个实施方式中，所述受试者是人。在另一个实施方式中，所述受试者是作为疾病模型的实验动物或动物替代物。在一些实施方式中，术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于：鼠科动物、猿猴、人、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、哺乳类农场动物、哺乳类竞技动物(sport animals)以及哺乳类宠物。在一个实施方式中，所述受试者是人受试者。
如本文所用的，术语“细胞外囊泡”是指大小为1nm-999μm的基本上成球形的小体或膜性小体，例如脂质体、微团(micelles)、外泌体、微泡(microbubbles)或单层囊泡。在一些实施方式中，所述粒子为小于900μm、小于800μm、小于700μm、小于600μm、小于500μm、小于400μm、小于300μm、小于200μm、小于100μm、小于90μm、小于80μm、小于75μm、小于70μm、小于60μm、小于50μm、小于40μm、小于30μm、小于25μm、小于20μm、小于15μm、小于10μm、小于5μm、小于2μm、小于1μm、小于750nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm、小于200nm、小于100nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm、小于10nm、小于5nm或更小。
如本文所用的，当用于指与SP-IRIS传感器结合的细胞外囊泡时，术语“单独表征”(individually characterize)是指对单个细胞外囊泡的大小、形状、密度、面积或其它表型测量值进行表征。
如本文所用的，术语“二级识别探针”是指结合细胞外囊泡内或细胞外囊泡上的生物标志物的第二探针。在一些实施方式中，所述二级识别探针还可结合未经标记的第一抗体探针，以允许对第一抗体的结合进行检测。这种方法类似于在ELISA方法中使用二级抗体。
术语“减少”(decrease)、“降低”(reduced或reduction)或“抑制”(inhibit)在本文中全部用于指统计学上显著量的减少。在一些实施方式中，“降低”或“减少”或“抑制”通常是指与参考水平(例如缺少指定治疗)相比减少至少10％，并且可包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用的，“降低”或“抑制”不包括与参考水平相比完全抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比100％的抑制。减少可优选下降至在未患指定疾病的个体的正常范围内的可接受水平。
术语“增加”(increased或increase)或“增强”(enhance)或“激活”(activate)在本文中全部用于通常指统计学上显著量的增加；为避免任何疑问，术语“增加”或“增强”或“激活”是指与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达且包括100％的增加，或者与参考水平相比10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加、至少约20倍的增加、至少约50倍的增加、至少约100倍的增加、至少约1000倍的增加或更多倍的增加。
如本文所用的，术语“包含/包括”(comprising)意味着除了提出的限定要素之外还可以存在其它要素。“包含/包括”的使用表示含有而非限制。
如本文所用的，术语“基本上由……组成”(consisting essentially of)是指指定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在不实质性地影响本发明的该实施方式的基本特征和新颖性或功能性特征的额外要素。
术语“由……组成”(consisting of)是指如本文所述的组合物、方法和它们各自的组成部分，排除没有在该实施方式的描述中列举的任何要素。
此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。
除了在操作实施例中或者另有说明，本文使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应当理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。当与百分比关联使用时，术语“约”可表示±1％。
除非本文另有限定，否则与本申请结合使用的科学术语和技术术语应具有该公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。应当理解的是，本发明并不限于本文描述的具体方法学、方案和试剂等，因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。分子生物学中的常用术语的定义可在下述出版物中找到：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，Merck Sharp&Dohme Corp.出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等(编)，The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine，Blackwell Science Ltd.出版，1999-2012(ISBN 9783527600908)；和Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann，Elsevier出版，2006；Lewin's Genes XI，Jones&Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing,Inc.，New York,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA，Jon Lorsch(编)，Elsevier，2013(ISBN0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)，Frederick M.Ausubel(编)，John Wiley and Sons，2014(ISBN 047150338X、9780471503385)；以及CurrentProtocols in Protein Science(CPPS)，John E.Coligan(编)，John Wiley and Sons,Inc.，2005(ISBN 0471142735)；以引用的方式将它们的内容全部整体并入本文。
癌症和疾病监测及治疗
癌症疾病监测及治疗处于个性化医疗的前沿。正在开发癌症疗法以使得能够在患者内更精确地靶向癌症同时使对健康细胞的不良影响最小化。由于治疗期间需要持续监测疾病的状态，所以特异性靶向疗法具有挑战性。目前，疾病监测需要反复的组织活检来追踪分子标记(molecular signatures)或生物标志物。然而，组织活检具有侵袭性并且会带来并发症风险。由于侵袭性较小的方法(如细针活检)对肿瘤的很小一部分取样，缺少异质性，所以它们并不是理想的。非侵袭性成像技术(例如计算机断层摄影扫描(CT扫描))被用于监测肿瘤大小/负荷，肿瘤大小/负荷反映治疗功效。由于CT扫描无法分辨微小的变化，因此医生无法识别出数周或数月治疗的有效性。此外，由于辐射风险，不能频繁执行CT扫描。需要侵袭性较小的监测技术来改善癌症疗法。
为了克服与组织活检相关的成本和侵袭性，过去十年已证明了可在血液和其它生物流体中发现循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)(参见例如Alix-Panabieres和Pantel，(2013)Clin Chem 59(1):110-118；Bettegowda等，(2014)Sci Transl Med 6(224):224ra24；Diaz和Bardelli，(2014)J Clin Oncol 32(6):579-586)。这些方法有望使用侵袭性较小的样品(如血液、血清、尿液和唾液)来揭示癌症的分子组成。由于这些方法旨在提供与组织活检相似的结果，同时允许对患者的癌症进展和癌细胞的分子组成进行几乎持续不断的监测，将这些方法命名为“液体活检”(liquid-biopsy)。由于CTC以非常低的浓度(约十亿个细胞中有1个)存在，已有的显著技术发展围绕着能够对CTC进行的分离(Ozkumur等，(2013)Sci Transl Med 5(179):179ra47；Karabacak等，(2014)Nat Protoc 9(3):694-710)和检测(Castro等，(2014)Lab Chip 14(1):14-23)。从绝对数量上看，ctDNA更丰富，但是它们处于具有高浓度的正常DNA的流体中。最近，在核酸测序和突变检测方面的进步使得能够使用ctDNA(Bettegowda等，(2014)Sci Transl Med 6(224):224ra24；Dawson等，(2013)N Engl J Med 368(13):1199-1209)。
尽管正在开发CTC和ctDNA技术用于肿瘤学应用，但证明了第三类循环生物标志物细胞外囊泡(EV)也从癌细胞流入循环(Revenfeld等，(2014)Clin Ther 36(6):830-846；Yang等，(2014)PLoS ONE 9(11):e110641)。EV是由细胞释放并可在体液中发现的脂质囊泡。这些EV可共享与其亲代细胞相同的表面标志物和内部分子标志物(例如蛋白、mRNA和miRNA)。已提议癌细胞每细胞可分泌出浓度高得多的EV(Taylor和Gercel-Taylor，(2008)Gynecol Oncol 110(1):13-21；Riches等，(2014)50(5):1025-1034)，这使得EV比CTC更丰富。较高浓度的外泌体可使早期检测成为可能，并且还提供来自亲代肿瘤细胞的表型信息。因此，EV可在治疗、监测和伴随诊断(companion diagnostics)中发挥作用。最近的研究表明，对西妥昔单抗(Erbitux)而言，EV可充当伴随诊断(cDx)，因为EV携带药物靶标表皮生长因子和突变的KRAS基因(其与不良的治疗应答相关)(Yamashita等，(2013)Phar-In JPharm Sci 68(12):969-973；Kahlert等，(2014)J Biol Chem 289(7):3869-3875)。自从40多年前发现EV以来(Crawford,N，(1971)Br J Haematol 21(1):53-69)，最近该领域出现了强劲的复苏(Caby,MP，(2005)In Immunol 17(7):879-887；van Niel,G.，(2006)J Biochem(Tokyo)140(1):13-21；Simpson等，(2008)8(19):4083-4099)，在许多肿瘤学领域对EV进行了研究(Katsuda等，(2014)Proteomics 14(4-5):412-425；Thery等，(2009)Nat RevImmunol 9(8):581-593)。在最近的研究中，EV被证明在如下方面中发挥作用：细胞-细胞通讯(Thery等，(2009)Nat Rev Immunol 9(8):581-593；Ratajcxak等，(2006)Leukemia 20(9):1487-1495)、细胞外基质降解(Inder等，(2014)J Extracell Vesicles vol.3；Cocucci和Meldolesi，(2015)Trends Cell Biol 25(6):364-372)、肿瘤生长和转移(Logozzi等，(2009)PLoS ONE 4(4):e5219；Peinado等，(2012)Nat Med 18(6):883-891)以及耐药性(Gong等，(2012)Cancer Treat Rev 38(3):226-234)。由于EV比CTC更丰富，因此对从体液中筛选EV用于如下目的感兴趣：早期诊断(Vlassov等，(2012)Biochim BiophysActa BBA 1820(7):940-948)、进展/复发监测(Shao等，(2012)Nat Med 18(12):1835-1840；Gong等，(2014)Semin Cell Dev Biol 40:35-40)以及药物治疗的确定(Shao等，(2012)Nat Med 18(12):1835-1840)。
EV由通过不同机制形成的各种群体组成(van der Pol等，(2012)Pharmacol Rev64(3):676-705；Andaloussi等，(2013)Nat Rev Drug Discov 12(5):347-357；Gyorgy等，(2011)Cell Mol Life Sci 68(16):2667-2688)。EV可分为三种类型：外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体在与质膜融合后从多囊泡胞内体(multivesicular endosome)分泌，直径为40nm-200nm。微囊泡由细胞质膜出芽形成，直径为50nm-1,000nm。凋亡小体由细胞崩解产生，具有最大的大小范围50nm-5,000nm。外泌体通常可通过支架蛋白(如四跨膜蛋白(例如CD63、CD81和CD9))的存在而与其它EV区分。
考虑将EV用于多种疾病的检测和/或预后，并且其使用不严格限制于对癌症的检测和/或预后。例如，也可确定各种神经退行性疾病、传染病和心血管疾病的检测和/或预后。使用本文所述的方法可进行检测或监测的癌症的实例包括但不限于：癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更具体的实例列举如下，包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer或stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾癌(kindey cancer或renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌以及头颈部癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如其细胞没有迁移到受试者体内除原始恶性肿瘤或肿瘤部位以外的部位的那些肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移(恶性细胞或肿瘤细胞向不同于原始肿瘤部位的继发部位迁移)产生的那些肿瘤)。
在一些实施方式中，所述癌症为腺癌。在一些实施方式中，所述癌症选自于乳腺癌、肺癌、头部或颈部癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌和皮肤癌。在一些实施方式中，所述癌症为以下部位的腺癌：乳腺、肺、头部或颈部、前列腺、食管、气管、脑、肝、膀胱、胃、胰腺、卵巢、子宫、宫颈、睾丸、结肠、直肠或皮肤。在一些实施方式中，所述癌症选自于胰腺癌、肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)以及乳腺癌。
可使用EV进行检测的神经退行性疾病包括例如阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病、亨廷顿舞蹈病、帕金森氏病和朊病毒病。
表1：癌症及相关的EV生物标志物
Figure BDA0003359349270000151
生物样品
基本上任何样品都可使用本文所述的方法和系统进行测试，只要该样品包含至少一种细胞外囊泡(例如外泌体)。术语“生物样品”可指含有细胞外囊泡的任何样品，例如诸如血液、血浆、血清、尿液、胃肠分泌物、肿瘤或组织匀浆物、循环细胞和细胞粒子(例如循环肿瘤细胞)、滑液、粪便、唾液、痰、囊液、羊水、脑脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、眼泪、前列腺液、细胞培养液或细胞裂解物。样品也可从环境来源获得，例如从被污染的湖泊或其它水体获得的水样、从被认为已污染的食物源获得的液体样品、或植物样品。
用于对细胞外囊泡进行定量和/或表征(例如大小和/或形状鉴别)的SP-IRIS系统的明显优势是在执行本文所述的方法之前不需要从生物样品中分离或富集细胞外囊泡。例如，当从全血中对循环外泌体进行定量和/或表征时，不需要预先分离步骤，而是可简单地使血液样品与SP-IRIS传感器接触。因此，在一个实施方式中，该方法不包括从生物样品中分离细胞外囊泡(例如外泌体)的步骤。在另一个实施方式中，该方法不包括富集生物样品中的细胞外囊泡(例如外泌体)的步骤。
外泌体
外泌体是由大部分活细胞释放的直径为30nm-200nm的源于细胞的纳米囊泡。外泌体存在于身体的几乎所有生物体液(包括血液和尿液)(8、9)中。外泌体首先是在网织红细胞细胞培养物的收获培养基中作为包含膜蛋白(包括转铁蛋白受体)的微囊泡被识别(10)。在此之后，描述了将外泌体释放到细胞外环境中的几种细胞类型。外泌体由晚期胞内体的膜内陷形成，产生了含有细胞的一些胞质成分和质膜受体的胞外结构域的囊泡。晚期胞内体多囊泡小体(MVB)与质膜融合之后，外泌体从细胞释放到细胞外环境中(11、12)，或者外泌体可直接从质膜释放(13)。由于外泌体为细胞内来源，外泌体具有胞内体通路的特定蛋白质标志物(例如四跨膜蛋白(CD63、CD9和CD81)和热休克蛋白(HSP70))，这些特定蛋白质标志物没有在相似大小的其它类型的纳米囊泡中发现(9、14)。越来越清楚的是，外泌体在诸如凝血、细胞间信号传导和废物管理(waste management)等过程中发挥关键作用并且具有特化功能(12)。因此，外泌体的临床应用引起了越来越多的关注。
通常而言，大小范围为40nm-100nm的外泌体可用本文所述的方法进行计数和/或确定大小，然而，大至150nm的外泌体或其它细胞外囊泡也可如本文所述进行表征。在使用本文所述的方法和系统进行定量和/或表征的考虑之列的细胞外囊泡可为至少15nm、至少20nm、至少25nm、至少30nm、至少35nm、至少40nm、至少45nm、至少50nm、至少55nm、至少60nm、至少65nm、至少70nm、至少75nm、至少80nm、至少85nm、至少90nm、至少95nm、至少100nm、至少125nm、至少150nm或更大。在一些实施方式中，所述细胞外囊泡为小于150nm、小于125nm、小于100nm、小于95nm、小于90nm、小于85nm、小于80nm、小于75nm、小于70nm、小于65nm、小于60nm、小于55nm、小于50nm、小于45nm、小于40nm、小于35nm、小于30nm、小于25nm、小于20nm或更小。在某些实施方式中，所述细胞外囊泡为15-200nm、30-200nm、50-200nm、75-200nm、100-200nm、125-200nm、150-200nm、175-200nm、15-25nm、15-50nm、15-75nm、15-100nm、15-125nm、15-150nm、15-175nm、30-100nm、40-100nm、50-100nm、60-100nm、70-100nm、80-100nm、40-80nm、40-60nm、30-60nm、30-50nm或在其间的任何范围内。
在一些实施方式中，所述细胞外囊泡可使用本文所述的方法通过形状进行鉴别。例如，细胞外囊泡可为以下形状：完美球形、基本上球形、椭圆形、长圆形(oblong)、泪滴形、圆顶形、纽扣形、非轴对称等。
SP-IRIS检测系统
DNA和蛋白质微阵列目前是医学研究中常见的工具，因为它们能够实现在几乎没有专业知识的情况下快速且廉价地进行高度多重测定法。然而，尽管多重性薄弱并且样品制备劳动强度大，但聚合酶链式反应(PCR)(在核酸检测的情况下)和ELISA或发光免疫测定法(在蛋白质和小分子的情况下)仍然提供了灵敏度和选择性方面的金标准，因此继续得到青睐。增强微阵列方式的测定法的灵敏度的问题已经尝试了多种方法，其中最成功的是光散射技术(15-17)或电化学技术(18、19)。除了微阵列传感器之外，还开发了利用具有形状标记的水凝胶微粒(20)和具有DNA条形码(barcodes)的纳米粒子(15、16)的技术来为高度灵敏的检测平台(其自身具有与测定法复杂性相关联的一套缺点)提供一定程度的多重性。无论如何，这些技术都没有达到取代当前商业化的基于扩增或基于酶的方法所需的简易性、速度和性能。因此，需要这样一种系统，该系统能够充分提高基于微阵列的技术的灵敏度，从而可利用其在简易性和多重性方面的固有优势。
发明人了解到，还没有能够以微阵列方式在捕获表面上检测单个纳米囊泡并且确定大小/形状的高度多重方法。由波士顿大学Unlu实验室开发的SP-IRIS技术(参见例如WO2011/014282，以引用的方式将其内容整体并入本文)允许在传感器表面上对单个捕获的纳米囊泡进行标记检测和无标记检测，该传感器表面可以以微阵列方式平铺有许多捕获探针(即抗体、肽、聚糖、DNA寡核苷酸、适体等)。然后可将所检测的纳米囊泡的SP-IRIS图像中的信号用于确定该纳米囊泡的大小和/或形状。SP-IRIS的检测原理是基于来自层状基底上的粒子的散射信号的增强对比度。
为了对纳米粒子进行检测以及确定纳米粒子的大小/形状，SP-IRIS将来自可见LED源的光照射到结合在传感器表面的纳米粒子上，所述传感器表面由在硅基底顶部的二氧化硅层组成。粒子的存在改变传感器表面反射的光的干涉，产生揭示该粒子的大小和/或形状的明显信号。在发明人的方法中，对灵敏检测和分析而言，介电层状结构充当优化纳米粒子的弹性散射特性的光学天线。发明人成功检测了直径为60nm至200nm的低折射率(low-index)介电粒子以及直径为20nm至100nm的金属(Au和Ag)纳米粒子(21)。使用该方法进行了对血清或全血中以及被高浓度细菌污染的样品中的多种病毒的同时检测(22)。通过采用基于亲和性的捕获、大小和/或形状鉴别以及“数字化”检测方案来对单个病毒粒子进行计数，SP-IRIS系统被证明是一种可建立用于复杂样品中的靶标的强大且灵敏的病毒传感测定法。
进而，在一些实施方式中，所述SP-IRIS传感器可用于检测传感器基底上一个或多个不同位置处的干涉图案的变化。例如，当使用所述传感器识别细胞外囊泡上的生物分子靶标时，可使捕获的细胞外囊泡与传感器基底表面上一个或多个不同位置处的探针(所述探针针对期望的生物标志物)接触。然后检测所述一个或多个不同位置处的光学干涉图案并将其与初始光学干涉图案进行比较。在细胞外囊泡的初始捕获和与生物标志物特异性结合剂接触后获得的图像之间观察到的光学干涉图案的变化指明了生物标志物表达水平和/或表达该生物标志物的细胞外囊泡的数量。
如本文所用的，术语“SP-IRIS传感器”用于指经至少一种探针功能化并且允许使用SP-IRIS系统进行成像的基底。通常而言，所述传感器包含层叠有二氧化硅(SiO2)的硅(Si)晶片，但是，也可替换成其它基底，只要它们允许使用SP-IRIS系统得到与Si/SiO2传感器基本上相似的结果。在一些实施方式中，所述SP-IRIS传感器包含微阵列。
在本文所述方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的100nm-1000nm的SiO2。也就是说，所述传感器包含基底(该基底包含在Si晶片上层叠的100nm-1000nm的SiO2)并且还包含至少一种探针。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少100nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少200nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少300nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少400nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少500nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少600nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少700nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少800nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少900nm的SiO2。在该方面的一些实施方式中，在层状基底上制造所述微阵列，所述层状基底包含在Si晶片上层叠的至少1000nm的SiO2。
与本文所述的方法一起使用的传感器可包含附着到基底层上的多种固定化探针中的一种或多种。例如，一种或多种特定的固定化探针可排列在生物传感器表面上的一个或多个不同位置的阵列中。所述一个或多个不同位置可限定直径为约50-500μm或约150-200μm的微阵列斑点。
在一些实施方式中，所述固定化探针可为DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸、肽、蛋白质(例如转录因子、抗体或酶)、有机小分子或它们的任意组合。此类生物传感器对检测生物分子相互作用(包括但不限于DNA-DNA、DNA-RNA、DNA-蛋白质、RNA-RNA、RNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用)是有用的。
如本文所用的，固定在生物传感器基底表面上的探针可为例如有机分子，如核酸、寡核苷酸、肽、多肽、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab’)2片段、Fv片段、有机小分子、聚合物、来自组合化学文库的化合物；无机分子；或它们的任意组合。
在一些实施方式中，所述SP-IRIS系统被配置用于对细胞外囊泡进行无标记检测。在其它实施方式中，所述SP-IRIS系统被配置用于通过间接使纳米粒子(例如金粒子)或荧光部分成像来对细胞外囊泡进行标记检测。如本文所用的，如本文所定义的术语“纳米粒子”是指待由本文所述的生物传感器和方法检测的半径直至999nm的任何靶标。例如，纳米粒子可为1nm-999nm、1nm-900nm、1nm-800nm、1nm-700nm、1nm-600nm、1nm-500nm、1nm-400nm、1nm-300nm、1nm-200nm、1nm-150nm、1nm-100nm、1nm-75nm、1nm-50nm、1nm-25nm、1nm-20nm、1nm-10nm、1nm-5nm、1nm-2.5nm、500nm-999nm、600nm-999nm、700nm-999nm、800nm-999nm、900nm-999nm、100nm-500nm、100nm-400nm、100nm-300nm、100nm-200nm或其间的任意范围。在一些实施方式中，所述半径为至少2.5nm、至少5nm、至少10nm、至少15nm、至少20nm、至少25nm、至少30nm、至少35nm、至少40nm、至少45nm、至少50nm、至少55nm、至少60nm、至少65nm、至少70nm、至少80nm、至少85nm、至少90nm、至少95nm、至少100nm、至少125nm、至少150nm、至少200nm、至少300nm、至少400nm、至少500nm或更大。应当理解的是，纳米粒子可具有多种形状(例如可以不具有完美的球形形状，但也可为椭圆形的、杆状的、六面体的、多面体的、长方体的或其中至少一个维度(dimension)对应于本文所述的测量值的任何此类形状)。在一些实施方式中，可使用不同形状的纳米粒子。
在一些实施方式中，二级标记采用荧光标记(例如通过使用连接至荧光团或量子点的抗体)。此类荧光方法提供了另外的优势，即从与传感器的第一次接触起，就可对细胞外囊泡(EV)进行无标记检测、计数和确定大小/形状。对EV进行的标记可通过带纳米粒子标签的探针(例如抗体)或带荧光标签的方法来进行。在一些实施方式中，第二荧光检测程序(modality)被构建到SP-IRIS显微镜中。
多重SP-IRIS：所述SP-IRIS系统可用于并行研究一种或多种特异性结合相互作用，即多重应用。一种或多种特异性结合物质与它们各自的结合分子的结合可在不使用标记的情况下通过以下方法来检测：将包含一种或多种细胞外囊泡的样品施加于SP-IRIS传感器，所述SP-IRIS传感器具有固定在其表面上的一种或多种特异性结合分子。用光照射所述SP-IRIS传感器，如果样品中的一种或多种细胞外囊泡特异性地结合固定化分子中的一种或多种，则相对于当一种或多种特定细胞外囊泡尚未与固定化结合分子结合时的干涉图案，干涉图案发生相移(phase-shift)。在传感器基底表面包含一个或多个不同位置的阵列(该阵列包含一种或多种特异性固定化结合分子)的那些实施方式中，然后从该生物传感器的各个不同位置处对干涉图案进行检测。
因此，在一些实施方式中，多种特异性结合分子(例如抗体)可以以阵列方式固定在SP-IRIS传感器的基底表面上。然后使所述传感器与目标测试样品接触，所述目标测试样品包含可能的细胞外囊泡结合伴侣(如蛋白质)。只有特异性地结合至固定在传感器上的抗体的蛋白质才会保持结合在所述传感器上。这种方法实质上是酶联免疫吸附测定法的大规模版本；但是并不需要使用酶或荧光标记。对高通量应用而言，传感器可排列成一组阵列(an array of arrays)，其中数个传感器(在基底表面上包含特异性结合分子的阵列)被排列成阵列。
因此，在本文所述的所有这些方面和该方面的其它实施方式中，使用传感器来检测存在于样品中的多种细胞外囊泡中的一种或多种与生物传感器基底层的结合，所述生物传感器基底层包含附着至该基底层的多种固定化分子中的一种或多种。例如，一种或多种特异性固定化分子可被排列在传感器表面上的一个或多个不同位置的阵列中。
在一些实施方式中，术语“多重”(multiplex)是指在单个样品中或单次检测时对少于1500种不同生物标志物(例如蛋白质生物标志物、miRNA生物标志物等)进行检测。在其它实施方式中，“多重”是指同时或平行对少于1000种、少于900种、少于800种、少于700种、少于600种、少于500种、少于400种、少于300种、少于200种、少于100种、少于50种、少于40种、少于30种、少于20种、少于10种或少于5种不同蛋白质标志物或多核苷酸标志物进行检测。
SP-IRIS系统用于外泌体表征的优势
在不需要富集样品中的囊泡即对EV进行检测的能力方面，用于监测疾病(例如癌症)的常规细胞外囊泡检测技术是受限的。因此，常规EV检测技术仅能测量(i)表型；或(ii)大小、形状以及数目(enumeration)。与这些常规技术相比，所述SP-IRIS系统具有以下几个优势：
1.所述SP-IRIS系统允许对EV进行灵敏检测和确定大小。微阵列测定法可通过从生物流体中捕获EV来对大量表型进行评估。当针对表面上的每一个探针对各个捕获的EV单独计数并且确定大小时，发生最终检测。可在单个微阵列上使用数十种至数百种不同的探针；
2.所述SP-IRIS系统不需要样品制备或富集；
3.对单个结合事件的检测允许在<106个纳米粒子/ml的浓度下进行检测，显著改善了检测的下限；
4.SP-IRIS可以利用小样品体积(例如25μL样品)进行；
5.单次测试可在被传感器上的初级探针捕获的单个EV上寻找多种生物标志物。例如，使用以微阵列方式固定在传感器上的初级探针将EV捕获至表面。可针对所有的初级探针对捕获的EV进行计数以及确定大小。然后可将二级探针引入芯片，以针对微阵列中的每个初级探针对捕获至所述表面上的单个EV上的两种或更多种生物标志物进行共定位。
探针
基本上，可使用任何探针来从生物样品中捕获细胞外囊泡，以使用SP-IRIS系统进行定量和/或表征。在一些实施方式中，捕获探针为细胞外囊泡特异性探针，使得可从生物样品中捕获细胞外囊泡，而可冲洗掉该生物样品中的其它非囊泡成分。本领域技术人员将容易理解的是，捕获探针或细胞外囊泡特异性探针将与相对于所述细胞外囊泡而言暴露于外部的标志物或抗原结合。例如，所述探针可与跨膜蛋白的囊泡外抗原或与囊泡外成分(例如囊泡相关RNA或蛋白质)结合。在一些实施方式中，捕获的细胞外囊泡可被透化或裂解，以将囊泡内成分暴露于传感器上的探针。在这样的实施方式中，可使用SP-IRIS来检测外泌体内的组分。示例性探针可包括抗体、抗体片段、小分子、化合物或其它配体。
如本文所用的，术语“抗体”可包括多克隆抗体和单克隆抗体及它们的抗原结合衍生物或片段。熟知的抗原结合片段包括例如：单结构域抗体(dAb；其基本上由单个VL或VH抗体结构域组成)、Fv片段(包括单链Fv片段(scFv))、Fab片段以及F(ab’)2片段。用于构建此类抗体分子的方法在本领域中是众所周知的。如本文所用的，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或者是指具有Fc(可结晶片段)区域或Fc区域的FcRn结合片段的单克隆抗原结合片段或多克隆抗原结合片段。抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过对完整抗体进行酶切割或化学切割来产生。“抗原结合片段”包括尤其是Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双抗体(diabodies)以及多肽(其含有足以使得特异性抗原结合至该多肽的免疫球蛋白的至少一部分)。术语Fab、Fc、pFc'、F(ab’)2和Fv采用标准的免疫学上的含义[Klein，Immunology(John Wiley，New York，N.Y.，1982)；Clark,W.R.，(1986)The Experimental Foundations of Modern Immunology(Wiley&Sons,Inc.，New York)；Roitt,I.，(1991)Essential Immunology，第7版，(Blackwell Scientific Publications，Oxford)]。
术语“多克隆抗体”在本文中被定义为由B淋巴细胞的几个克隆产生的抗体，如同在整个动物中一样。术语“多克隆抗体”通常指在经免疫的动物内产生的抗体。“单克隆抗体”在本文中被定义为具有单个克隆来源的细胞系，无论是在体内还是在培养物中。单克隆抗体是由杂交瘤细胞的单个克隆产生的，因此是单一种类的抗体分子。“单链抗体(Scfv)”在本文中被定义为重组融合蛋白，其中重链和轻链的两个抗原结合区(Vh和Vl)通过连接肽连接，使得能够在异种生物体中实现重链和轻链的表达相当并且使该蛋白稳定。“F(Ab)片段”在本文中被定义为通过木瓜蛋白酶处理而制备的免疫球蛋白片段。Fab片段由一条轻链通过二硫键与重链的一部分连接组成，并且含有一个抗原结合位点。它们可被认为是单价抗体。“F(Ab’)2片段”在本文中被定义为通过对免疫球蛋白分子进行胃蛋白酶水解而获得的胃蛋白酶攻击位点N端的大约90kDa的蛋白质片段。Fe片段的短区段中含有通过二硫键结合在一起的两个Fab片段。“Fv片段”在本文中被定义为免疫球蛋白分子的Fab片段的N端部分，由一条重链和一条轻链的可变部分组成。
如本文所用的，术语“小分子”是指包括但不限于以下化学药剂的化学药剂：肽、肽模拟物(peptidomimetics)、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适体、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机化合物或无机化合物(即，包括杂有机(heteroorganic)化合物和有机金属化合物)、分子量小于约5,000克/摩尔的有机化合物或无机化合物、分子量小于约1,000克/摩尔的有机化合物或无机化合物、分子量小于约500克/摩尔的有机化合物或无机化合物、以及这些化合物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。
如本文所用的，术语“药物”或“化合物”是指为了治疗或预防给予人以产生生物作用(例如控制疾病或病症)的化学实体或生物制品、或者生物制品或化学实体的组合。所述化学实体或生物制品优选为低分子量化合物，但并不必然，也可为较大的化合物，例如糖(carbohydrates)、氨基酸或核酸的寡聚体(包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体及它们的修饰物和组合)。
在某些实施方式中，在考虑之列的是使用二级探针来进一步区分外泌体群、外泌体外生物标志物或外泌体内生物标志物。将二级探针设计用于一旦囊泡被细胞外囊泡特异性探针或捕获探针捕获时对外泌体生物标志物表达和/或其它性质进行鉴别。
尽管不是必要的，在一些实施方式中，在考虑之列的是用可检测部分对二级探针进行标记。因此，当以多重方式使用所述SP-IRIS系统时，在考虑之列的是将多种二级探针各自进行差异化标记(例如使用荧光部分)，以便根据生物标志物表达(例如内部或外部的)鉴别外泌体群。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种试剂(例如抗体试剂和/或核酸探针)可包含可检测部分或标记和/或包含产生可检测信号的能力(例如通过催化将化合物转化为可检测产物的反应)。可检测标记可包括例如光吸收染料、荧光染料或放射性标记。可检测标记、检测它们的方法以及将它们掺入试剂(例如抗体和核酸探针)中的方法在本领域中是众所周知的。
在一些实施方式中，可检测标记可包括可通过以下方式进行检测的标记：光谱学手段、光化学手段、生物化学手段、免疫化学手段、电磁学手段、放射化学手段或化学手段(如荧光、化学荧光或化学发光)或任何其它适当手段。本文所述方法中使用的可检测标记可为初级标记(其中所述标记包含可直接检测的部分或产生可直接检测部分的部分)或二级标记(其中该可检测标记与另一部分结合从而产生可检测信号，例如，如在免疫学标记中常见的，使用二级抗体和三级抗体)。可检测标记可通过共价或非共价方式连接至试剂。可替代地，可检测标记可通过例如直接标记通过配体-受体结合对设置实现与试剂的结合的分子或其它此类特异性识别分子来连接。可检测标记可包括但不限于放射性同位素、生物发光化合物、发色团(chromophore)、抗体、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物以及酶。
在其它实施方式中，用荧光化合物标记检测试剂。在一些实施方式中，可检测标记可为：荧光染料分子或荧光团，包括但不限于：荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺(fluorescamine)、Cy3TM、Cy5TM、别藻蓝蛋白、德克萨斯红、peridenin叶绿素、花青(cyanine)、串联缀合物(如藻红蛋白-Cy5TM)、绿色荧光蛋白、罗丹明、异硫氰酸荧光素(FITC)和Oregon GreenTM、罗丹明及衍生物(例如德克萨斯红和四甲基异硫氰酸罗丹明(tetrarhodamine isothiocyanate，TRITC))、生物素、藻红蛋白、AMCA、CyDyesTM、6-羧基荧光素(通常所知为缩写FAM和F)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和罗丹明110；花青染料，例如Cy3染料、Cy5染料和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；多甲川染料(polymethine dyes)，例如花青染料(如Cy3、Cy5等)；BODIPY染料和喹啉染料；或它们的衍生物。在一些实施方式中，可检测标记可为放射性标记，包括但不限于3H、125I、35S、14C、32P和33P。在一些实施方式中，可检测标记可为酶，包括但不限于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。酶标记可产生例如化学发光信号、颜色信号或荧光信号。
在一些实施方式中，可检测标记可为光谱比色标记，包括但不限于胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯和乳胶(latex))珠。细胞外囊泡的无标记检测和表征
对捕获在传感器上并进行SP-IRIS分析的细胞外囊泡的表征可以以无标记方式进行。在一个实施方式中，使用无标记检测方法捕获和评估的细胞外囊泡是外泌体。通常而言，无标记检测允许本领域技术人员评估囊泡的数量以及待确定的细胞外囊泡的形态学特征(例如大小、形状等)。
用于无标记检测的方法通常涉及提供包含至少一种细胞外囊泡特异性探针的传感器，所述探针将捕获具有所期望的生物标志物的囊泡。例如，外泌体可使用外泌体特异性探针来捕获，所述外泌体特异性探针例如为与外泌体表面蛋白CD63、CD9、CD81；本文所示的表1中的至少一种标志物(例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种或更多种)；或它们的组合结合的抗体。
传感器可被配置成包含多种细胞外囊泡特异性探针，从而捕获至少两种不同的细胞外囊泡群(例如表达不同外泌体表面标志物的外泌体群)。当使用多种细胞外囊泡特异性探针时，将认识到所述探针的位置应当是通过传感器上的定位记录(documented)的。因此，本领域技术人员可容易地对特定的捕获的群体中细胞外囊泡的数量进行计数并且确定各个捕获的囊泡群中囊泡的平均大小和其它形态学特征(例如形状)。本领域技术人员还可分析与对照样品相比各个亚群中所捕获的囊泡的分布模式，由此确定捕获的囊泡群之间的外泌体的数量、形状或大小是否作为例如用治疗剂进行治疗、疾病进展的结果而发生变化，或者用来确定患者是否可能对用期望的药剂进行治疗产生应答。外泌体群中的这种变化可以用定性或定量的方式来评估。
本文提供的操作实施例示出首次证实了SP-IRIS技术从生物样品(如血液样品)中对外泌体进行了检测。
使用标记对细胞外囊泡进行的检测和表征
本文还提供了使用经标记的第二探针对细胞外囊泡内部和囊泡表面上的生物标志物表达进行表征的方法。可使用标记探针进行检测的生物标志物包括核酸(例如DNA、RNA、mRNA、miRNA等)、脂质和蛋白质标志物。所述探针可为互补核酸、染料、抗体或其片段等。关于特定探针、可检测标记及其用途的更多信息请参见名为“探针”的部分。在本文具体考虑之列的是使用多种差异化标记的探针，该探针可被用于识别和表征多种外泌体生物标志物的表达。在一些实施方式中，用包含不同大小和/或形状的纳米粒子对所述多种探针进行差异化标记。
检测外部生物标志物：对细胞外囊泡外部或表面上的生物标志物的检测可在将所述囊泡捕获至所述传感器上之前进行或者可在一旦捕获了所述囊泡时“在芯片上(on-chip)”进行。为了确保使用最小需求量的试剂以节约成本，认识到了在芯片上的分析将需要较少量的标记探针并且进一步将使洗涤步骤(为去除未结合的探针)更便利。
通常地，囊泡外标志物为表面蛋白、脂质或糖类生物标志物。
使用标记探针对生物标志物表达的检测和表征是直接的，并且可通过简单地使捕获的囊泡与探针接触、洗掉未结合的探针并使用SP-IRIS检测标记探针来进行。在一些实施方式中，为了检测目的，可使用未标记的第一抗体探针联合经标记的第二抗体来结合外泌体生物标志物，所述第二抗体结合至未标记的第一抗体。
检测内部生物标志物：可使用本文所述的方法对任何囊泡内生物标志物进行染色。例如，蛋白质生物标志物可使用经标记的抗体、适体或肽进行染色；核酸可通过经荧光团标记的互补序列进行染色(例如FISH测定法)；而脂质可使用染料(例如来自MolecularProbesTM，Eugene，OR的DiO、DiA、DiL、DiD)进行染色。特定RNA(例如mRNA、miRNA)或DNA的存在、量或水平的变化可使用本文所述的方法确定。进一步在本文考虑之列的是特定的突变、多态性或融合可使用本文所述的方法进行检测，并且可被用于疾病诊断(例如，可检测KRAS中的突变以用于诊断癌症(例如肺癌、结肠癌或胰腺癌)；可检测ALK基因中的融合以用于诊断癌症(例如肺癌))。探针、可检测标记及它们的用途在名为“探针”的部分中进行描述。
尽管不是必需的，在一些实施方式中，可在固定和/或透化囊泡之后进行对囊泡内生物标志物或外泌体内生物标志物的检测。固定可通过本领域已知的任何方法进行，包括使囊泡(例如捕获的囊泡或捕获前的囊泡)与固定剂(例如戊二醛、多聚甲醛、甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、福尔马林或它们的组合)接触。一些固定剂(如甲醇、乙醇和丙酮)也起到透化囊泡的作用。透化可使用电穿孔或者通过使用去污剂或酶(例如皂苷、SDS、Triton-X100、吐温-20、NP40、蛋白酶K、链球菌溶血素O、洋地黄皂苷(digitonin)等)来进行。
对囊泡内生物标志物的染色可通过在芯片上的染色来进行或者可在对待被捕获至传感器上的囊泡进行固定和/或透化之后进行。可进行数据的后处理以确定多个输出测量值。例如，可确定样品的异质性或者包含某些生物分子(例如脂质、蛋白质、核酸等)或生物分子组合的捕获的外泌体的比例。另外，可将关于大小、形状和其它特征的无标记数据与涉及囊泡内生物标志物丰度或表达的荧光数据相关联。
本文所述的操作实施例(特别是实施例3)首次证实了使用SP-IRIS技术对外泌体内组分进行了检测。
参考样品
在一些实施方式中，将针对样品而测定的细胞外囊泡的特征(数量、表型、或大小、形状)和/或细胞外囊泡上的一种或多种生物标志物的表达水平(例如输出参数)与参考进行比较。术语“参考水平”、“参考样品”和“参考”在本文中可互换使用，是指另一样品针对其进行比较的测试生物样品中所测量的输出参数(即，从较早的时间点获得，或从未处理的样品获得)。
对于例如将捕获的包含生物标志物的细胞外囊泡的数量、形状或大小分类成全部捕获的细胞外囊泡的子集而言，标准(standard)是有用的。通常地，该实施方式中的所述标准为在用探针处理以检测生物标志物之前所捕获的细胞外囊泡的大小、形状或数量(即，在相移之前获得的捕获的细胞外囊泡的图像，所述相移因接触生物标志物探针而发生)。同样在本文考虑之列的是含生物标志物的细胞外囊泡:总细胞外囊泡的所定义的比例(definedratios)，随后可将该比例与对于确定疾病诊断目的而言的标准比例进行对比。对于在生物样品中检测可测量的输出参数的变化或者输出参数的相对增加/减少而言，标准也是有用的。
标准作为用于比较的参考水平，使得样品可相对于适当标准进行归一化。本领域技术人员基于待测量的输出参数以及待使用本文所述方法的应用可确定适当的标准。例如，当本文所述的方法被应用于测试候选药剂的生物效果时，所述标准可为使用候选药剂处理之前的生物样品。
在一个实施方式中，在较早的时间点(假定在处理之前)从如本文所述的待测或待处理的相同的生物样品获得参考标准。或者，标准可来自于如本文所述的处理后的相同的生物样品。
涉及疾病的细胞诊断或预后分析时，标准水平例如可从来自于基本上没有患病的不同个体(例如，不是待测个体)的已知生物样品获得。在另一个实施方式中，标准水平可在捕获的细胞外囊泡外部(例如，在已知没有患病的部位)从来自于同一个体的已知生物样品获得。已知样品也可通过汇集来自多个个体的样品而获得，从而产生关于平均群体的标准，其中标准代表个体群(例如患有该疾病的个体群)之中的输出参数的平均水平。因此，以这种方式获得的标准中的输出参数的水平代表患有该疾病的一般个体群中该参数的平均水平。通过比较样品相对于群体标准的输出参数，将生物样品与该群体标准进行比较。通常而言，落入在特定群体中(例如在患病的受试者群中)确定的范围内的输出参数的测量值将表明存在这种疾病，而落在该范围之外的测量值将表明该个体没有患这种疾病。在从未患该疾病的受试者群中获得标准的情况下，相反的情况是可以预见的。应当注意的是，群体中的个体之间通常存在变异性，使得一些个体对于给定的输出参数将具有较高的测量值，而其它个体对于同一参数具有较低的测量值。然而，本领域技术人员可根据本文所述的关于疾病的检测和治疗基于个体作出合理的推论。
在一个实施方式中，将特定传感器上捕获的囊泡的特征与捕获的囊泡的参考样品的特征进行比较，来确定某些囊泡群的数量或位置是否发生了相移。
用于鉴定和/或测试生物活性剂的功效的筛选测定法
在一个实施方式中，本文所述的方法可用于针对生物学效果对候选药剂(例如小分子、抗体、抑制性RNA等)进行筛选。通常地，在将细胞外囊泡捕获至SP-IRIS传感器上之前或之后，使包含细胞外囊泡的生物样品与候选药剂接触，并使用本文所述的方法对至少一个输出参数进行评估。将所述输出参数的测量值与参考(例如用所述候选药剂处理之前的输出参数的测量值)进行比较。
本文所用的术语“候选药剂”(candidate agent)是指正针对期望的生物活性进行检测的任何药剂。候选药剂可为有望检测到具有调节期望活性的能力的任何类型的分子，包括例如肽、肽模拟物、多核苷酸或有机小分子。“药剂”可为任何化学制品、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的蛋白质实体和非蛋白质实体。在一些实施方式中，药剂为核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸寡聚物、氨基酸或糖类(包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体、以及它们的修饰物和组合等)。
在一些实施方式中，所述核酸为DNA或RNA，而核酸类似物例如可为PNA、pcPNA和LNA。核酸可为单链或双链的，并且可选自于包含编码目的蛋白的核酸、寡核苷酸、PNA等的组。这样的核酸序列包括例如(但不限于)：编码作为转录抑制子、反义分子、核酶的蛋白质的核酸序列、小抑制性核酸序列(例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等)。蛋白质和/或肽药剂或它们的片段可为例如(但不限于)：突变蛋白、治疗性蛋白、截短蛋白，其中所述蛋白在细胞中通常不存在或以较低水平表达。目的蛋白可选自于包含以下蛋白的组：突变蛋白、基因工程化蛋白、肽、合成肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、人源化蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、修饰蛋白以及它们的片段。
候选药剂可已知具有期望的活性和/或性质，或者可选自于多种化合物的文库。作为候选药剂还包括药理学上的活性药物、遗传学上的活性分子等。此类目的候选药剂包括例如化疗药剂、激素或激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子以及它们的片段和变体。
候选药剂(例如化学化合物)可从各种来源(包括合成化合物或天然化合物(例如小分子化合物)文库)获得。例如，对各种各样的有机化合物(包括生物分子)的随机和定向合成而言，存在多种可用手段(包括表达随机化的寡核苷酸和寡肽)。或者，处于细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可用的或容易生产的。另外，天然或合成产生的文库和化合物容易通过常规化学、物理和生物化学手段进行修饰，并且可用于产生组合文库。可对已知的药理学药剂进行定向或随机的化学修饰(例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等)以产生结构类似物。
在筛选方法的一个实施方式中，可对化合物文库进行筛选。可使用如本文所述的和/或本领域众所周知的成像系统和方法来筛选针对细胞具有期望效果的商业上可获得的小分子药物组合文库。组合文库可从商业上可获得的来源(包括例如来自Vitas-M实验室和Biomol International,Inc.)获得。在哈佛大学Broad研究所可找到化合物文库的综合列表。也可使用来自NIH Roadmap、Molecular Libraries Screening Centers Network(MLSCN)的其它化学化合物文库(例如来自10,000种化合物和86,000种化合物的那些化合物文库)来为本文所述的方法提供候选药剂。
关于干预(intervention)，包括所需生物活性的任何治疗都应当被视为是针对人进行治疗性干预的候选。
本发明可由以下编号段落中的任意一者所定义：
1.一种用于对生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针包含纳米粒子；以及(c)使用SP-IRIS系统对所述纳米粒子进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
2.如段落1所述的方法，其中，所述细胞外囊泡特异性探针和/或所述二级探针包括抗体。
3.如段落1所述的方法，其中，所述细胞外囊泡包括外泌体。
4.如段落1所述的方法，其中，所述生物样品包括从受试者获得的样品。
5.如段落4所述的方法，其中，所述从受试者获得的样品包括血液样品。
6.如段落2所述的方法，其中，细胞外囊泡特异性抗体包括抗CD63抗体。
7.如段落2所述的方法，其中，细胞外囊泡特异性抗体包括针对生物标志物的抗体。
8.如段落1所述的方法，其中，所述纳米粒子包括金粒子。
9.如段落1所述的方法，其中，捕获的细胞外囊泡通过大小和/或形状进行表征。
10.如段落1所述的方法，其中，所述传感器进一步包含至少一种另外的细胞外囊泡特异性抗体或多种不同的细胞外囊泡特异性抗体，以用于进行多重检测。
11.如段落10所述的方法，其中，多种细胞外囊泡特异性抗体包含至少2种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种或更多种不同的细胞外囊泡特异性抗体。
12.如段落11所述的方法，其中，所述多重检测包含多种二级探针。
13.如段落12所述的方法，其中，所述多种二级探针是差异化标记的。
14.如段落13所述的方法，其中，所述多种二级探针是用通过大小和/或形状区分的多种纳米粒子进行差异化标记的。
15.如段落1所述的方法，其中，所述二级探针结合至外泌体内标志物。
16.一种用于从受试者内的生物样品中确定细胞外囊泡上生物标志物的存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含第一探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将至少一种囊泡捕获至所述传感器上；(b)对所述传感器进行成像以对结合的细胞外囊泡进行定量和单独表征；(c)使所述传感器与缀合至标记的第二探针接触，所述第二探针包含二级识别探针，所述二级识别探针与细胞外囊泡上或细胞外囊泡内部的生物标志物结合；以及(d)对所述传感器进行成像并将图像与步骤(b)中获得的图像进行比较，其中，与步骤(b)中所成像的信号相比，步骤(d)中所成像的信号的变化表示在所述至少一种囊泡上存在所述生物标志物。
17.如段落16所述的测定法，其中，所述至少一种细胞外囊泡包括外泌体。
18.如段落16所述的测定法，其中，所述第一探针和/或所述第二探针包括抗体。
19.如段落16所述的测定法，其中，所述生物样品包括从受试者获得的样品。
20.如段落19所述的测定法，其中，所述从受试者获得的样品包括血液样品。
21.如段落16所述的测定法，其中，所述第一探针包括抗CD63抗体。
22.如段落16所述的测定法，其中，所述第一抗体和/或所述第二抗体包括针对生物标志物的抗体。
23.如段落16所述的测定法，其中，所述标记包括纳米粒子、荧光部分或量子点。
24.如段落23所述的测定法，其中，所述纳米粒子包括金粒子。
25.如段落16所述的测定法，其中，捕获的细胞外囊泡通过大小和/或形状进行表征。
26.如段落16所述的测定法，其中，所述传感器进一步包含至少一种另外的细胞外囊泡特异性抗体或多种不同的细胞外囊泡特异性抗体，以用于进行多重检测。
27.如段落21所述的测定法，其中，多种细胞外囊泡特异性抗体包含至少2种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种或更多种不同的细胞外囊泡特异性抗体。
28.如段落16所述的测定法，其中，所述生物标志物为外泌体内生物标志物。
29.如段落16所述的测定法，其中，所述生物标志物为外泌体外生物标志物。
30.如段落16所述的测定法，其中，在步骤(c)中使用多种二级探针。
31.如段落30所述的测定法，其中，所述多种二级探针是差异化标记的。
32.如段落31所述的测定法，其中，所述多种二级探针是用通过大小和/或形状区分的多种纳米粒子进行差异化标记的。
33.一种用于对生物样品中的细胞外囊泡进行无标记检测的方法，所述方法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使用SP-IRIS系统对纳米粒子进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行检测。
34.如段落33所述的方法，其中，所述方法进一步包括确定捕获的细胞外囊泡的大小、形状和/或数量。
35.一种用于对细胞外囊泡上的囊泡外生物标志物进行检测的方法，所述方法包括：
(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针针对囊泡外生物标志物并进一步包含可检测部分；以及(c)使用SP-IRIS系统对所述可检测部分进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡上的囊泡外生物标志物进行检测。
36.如段落35所述的方法，其中，使用多重方式执行所述方法。
37.如段落36所述的方法，其中，所述多重方式包括在步骤(b)中使用多种二级探针。
38.如段落37所述的方法，其中，所述多种二级探针是差异化标记的。
39.如段落35所述的方法，其中，所述多种二级探针是用通过大小和/或形状区分的多种纳米粒子进行差异化标记的。
40.一种用于对细胞外囊泡内部的囊泡内生物标志物进行检测的方法，所述方法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)对来自步骤(a)的捕获的囊泡进行固定和/或透化；(c)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针针对囊泡内生物标志物并进一步包含可检测部分；以及(d)使用SP-IRIS系统对所述可检测部分进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡上的囊泡内生物标志物进行检测。
41.一种用于对生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使用SP-IRIS系统对纳米粒子进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
42.一种用于对生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针标记有荧光标签或量子点；以及(c)使用SP-IRIS系统对所述荧光标签或量子点进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
43.一种用于对群体中表达生物标志物的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：(a)使包含至少一种细胞外囊泡的生物样品与一种或多种差异化标记的探针接触，所述探针结合一种或多种生物标志物；(b)使SP-IRIS传感器与步骤(a)中的标记的生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，从而将细胞外囊泡群从步骤(a)中的所述标记的生物样品中捕获至所述传感器上；(c)使用SP-IRIS系统对步骤(b)中的捕获的细胞外囊泡进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征；(d)使用SP-IRIS系统对所述一种或多种差异化标记的探针进行成像，从而对所述生物样品中经所述一种或多种差异化标记的探针标记的细胞外囊泡进行定量和/或表征；以及(e)将步骤(d)中获得的图像与步骤(c)中获得的图像进行比较，以对步骤(b)中捕获的细胞外囊泡群中表达所述一种或多种生物标志物的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
实施例
实施例1：细胞外囊泡的SP-IRIS检测
检测系统-SP-IRIS(单粒子干涉反射成像传感器)是一种低成本且紧凑的生物传感平台，该平台允许基于大小和形状来鉴定单个捕获的纳米粒子。通过使用LED可见光源照射传感器表面，读取器获取原始数据，而表面图像使用40X物镜和相机来捕获。传感器表面由高度可复现的半导体工艺制成，由位于硅基底顶部的二氧化硅层组成。从传感器表面反射的光的干涉被粒子的存在所改变，产生被常规相机捕获的明显信号。被捕获至传感器上的纳米粒子在图像上显示为斑点，并使用前向模型(forward model)由特定波长下的粒子亮度来计算粒子的大小(Daaboul等，(2010)Nano Lett 10:4727-4731)。大小鉴别允许辨别与表面结合的不同的纳米粒子群，这也有助于减少来自非特异性结合至表面的粒子(即，来自环境的碎片或尘埃粒子)的噪音。在SP-IRIS图像中，可同时检测多达百万个不同的纳米粒子。此外，通过硬件和软件的自动化将运行仪器简化为几次按钮点击，对所述SP-IRIS系统在易于使用方面进行了优化。
用SP-IRIS平台进行细胞外囊泡成像-在一项研究中证明了SP-IRIS系统从黑色素瘤细胞系(WM35和1205Lu)和乳腺癌细胞系(MCF-7)的细胞培养上清液中对单个外泌体和EV进行了检测。用针对CD63、神经纤毛蛋白-2(neuropilin-2，NRP-2)和小窝蛋白-1的抗体将SP-IRIS芯片功能化。CD63是通用的外泌体特异性标志物(Simpson等，(2008)Proteomics8(19):4083-4099；Kowal等，(2014)Curr Opin Cell Biol 29:116-125)。NRP-2已被证明是恶性肿瘤特异性细胞表面标志物(Ellis,LM.(2006)Mol Cancer Ther 5(5):1099-1107)。小窝蛋白-1是一种黑色素瘤特异性外泌体标志物，其仅从肿瘤细胞分泌的外泌体中被检测到，而不是从其它正常细胞分泌的外泌体中(Logozzi等，(2009)PLoS ONE 4(4):e5219)。
图1中的结果示出了对于黑色素瘤细胞系(WM35和1205LU)而言EV被捕获在CD63、NRP-2和小窝蛋白-1探针上。阵列上的CD63斑点表明了可被分类为外泌体的EV的均匀分布；而除了较大EV之外，NRP-2和小窝蛋白-1还表明了粒子(可被分类为外泌体或微囊泡)的相似大小分布(数据未示出)。可进行表型分析、确定大小和计数的微阵列是SP-IRIS平台的新功能。
多种标志物在单个EV上的共定位–在用排成阵列的捕获探针将EV捕获至微阵列上之后，向传感器引入用金纳米粒子标记的二级抗体。该标记的抗体标签与具有针对该二级抗体的表面标志物的外泌体结合。用金标记的抗体对外泌体进行的标记增加了该外泌体的大小，因此其在SP-IRIS图像中看起来更亮，如图2所示。当使用电子显微镜(EM)观察表面标志物时，用免疫金标签进行二级标记是标准操作(Yang等，(2014)PLoS ONE 9(11):e110641；Kanwar等，(2014)Lab Chip 14(11):1891)，该方法是低通量、昂贵、并且不可扩展用于广泛应用的。与之相反，使用SP-IRIS平台的SP-IRIS测定法允许本领域技术人员以部分成本和高通量微阵列方式执行与EM的免疫金染色相似的功能。通过用初级探针将外泌体捕获至表面上，然后使用以例如40nm金粒子标记的二级探针检测第二标志物，可共定位两种表面标志物。使用小于例如40nm的纳米粒子可实现对多于两种表面标志物的共定位。降低标记的大小减少了多种金纳米粒子与不同表面标志物结合的空间位阻。因此，通过依次添加不同的二级标签，如果所检测到的外泌体表面上具有表面蛋白质标志物，则其大小依次增加。大小增加的步骤与免疫金标记的大小和标志物的表面浓度相关。
确定纳米粒子(即外泌体和微囊泡)的大小。开发SP-IRIS平台主要是用于直接从复杂样品(如全血)中快速且超灵敏地检测直径小于200nm的病毒病原体。已证明SP-IRIS系统能够对70nm至200nm的粒子进行计数和精确确定大小(Daaboul等，(2010)Nano Lett,supra；Yurt等，(2012)Nanoscale 4(3):715)。最近，开发了用于以<3.5×103PFU/ml的灵敏度直接从全血中对埃博拉病毒和马尔堡病毒进行直接检测的测定法(Daaboul等，(2014)ACS Nano 8(6):6047-6055)。SP-IRIS系统可用于对与癌症相关以及在50nm-1μm范围内的外泌体和微囊泡进行检测。当粒子大于1μm时，可通过显微镜进行分析。对于处于衍射极限(800nm左右)下的粒子，粒子的大小可根据不同波长下的粒子响应(response)的亮度来推断。
可对SP-IRIS系统进行优化以用于检测大于200nm的大小。为此，将聚苯乙烯珠固定在SP-IRIS传感器芯片上，直径大小范围为50nm-1μm，步幅(steps)为100nm。在不同波长下获得粒子的响应。通过组合使用短波长LED和长波长LED，开发了一种系统，该系统可对具有从50nm至细胞大小特性的宽动态范围的粒子进行计数并确定大小。
通过纳米粒子标记在单个EV上进行多种标志物的共定位。通过将针对不同标志物的探针排列在表面上，SP-IRIS平台可用于进行对外泌体的多重检测。多重检测针对不同蛋白质标志物对外泌体的量进行定量；但是，并不是必需验证相同外泌体上多种标志物的存在。通过开发带纳米粒子标签的二级探针，该系统可进一步用于对捕获至表面上的单个外泌体上的两种或更多种表面生物标志物进行共定位。该技术常规地是通过金免疫染色进行并用电子显微镜(EM)进行检测。EM价格昂贵，需要特殊的样品制备和专业化培训，并且受限于通量。
相比之下，所述SP-IRIS平台可将带有40nm直径的金纳米粒子标签的抗体探针可视化，具有高信噪比。使用无标记检测可对用CD63探针捕获至传感器表面上的外泌体进行计数和确定大小(数据未示出)。随后，使带有40nm金纳米粒子标签的二级抗体(抗NRP-2)流经该表面，该二级抗体与源于黑色素瘤细胞系的外泌体结合，使得最初检测到的外泌体看起来更大(数据未示出)。图4中的大小直方图还示出了由于结合带金纳米粒子标签的二级抗体而导致的大小直方图中的变化。
用二级标签对捕获的外泌体进行的标记可以进行优化，例如，可使用熟知的EDC/NHS化学反应使二级标签与羧化金纳米粒子(carboxylate gold nanoparticle)共价结合。标记的浓度和孵育时间可经优化以确保接近100％的标记效率。标记利用就免疫金检测而言的金标准EM进行确认。
实施例2：使用SP-IRIS进行的外泌体纳米囊泡检测和表型分析的优化
在图5示出的终点处在干燥条件下收集的数据证明了SP-IRIS技术检测外泌体粒子的能力。使用抗CD63抗体将从黑色素瘤细胞培养物中分离并且使用超速离心纯化的外泌体捕获至表面上。来自具有直径为60nm-100nm的大小分布的群体的外泌体很容易与背景区别，但是对它们的准确定量和大小鉴别而言，可进行进一步优化。随后使同一芯片与经Au-NP标记的二级抗体孵育，并再次在干燥条件下成像。大小分布出现显著变化，说明许多先前捕获、检测并确定大小的外泌体被Au-NP修饰，这表示它们对特定抗体的亲和性——从而，它们的表型。SP-IRIS技术的这种外泌体表型区分功能表明，通过对肿瘤特异性外泌体标志物蛋白(例如NRP2和小窝蛋白-1)的双重标记，可定量检测肿瘤分泌的外泌体。
实验设计
用于外泌体纳米囊泡数字化检测的SP-IRIS的仪器：
SP-IRIS检测抗体微阵列上所捕获的纳米级粒子，并且对单个粒子进行的数字化计数的分辨率超过了最先进的光学显微镜技术。分析软件以5nm的鉴别精度选取大小在40nm至200nm范围内的检测到的外泌体粒子。因为粒子群的大小分布可能指示样品异质性和疾病状态，大小鉴别对外泌体的表征而言是重要的。具有这种级别的大小鉴别度的最先进的技术(如电子显微镜)受到通量和使用困难的困扰。通过捕获在多重微阵列构造上并用带金纳米粒子标签的二级抗体进行检测来实施进一步验证，本文所述的平台能够实现对外泌体的表型表征。该平台能够同时检测外泌体和金纳米粒子，并且分析软件能够区分这两种粒子群。与最先进的外泌体分析技术相比，本文所示例的平台提供了用低成本且易于使用的生物相容系统从低样品体积中进行高通量分析。
使用外泌体蛋白质标志物对肿瘤特异性外泌体进行计数的SP-IRIS测定法优化：
外泌体计数和表型分析：SP-IRIS传感器由具有薄氧化物层的硅基底组成，薄氧化物层和硅基底各自为商业制造。然后用3D聚合物表面涂覆该传感器，该3D聚合物表面已经被测试用于在复杂介质(人全血)中检测病毒粒子，并显示出良好的防污性能(22)。然后使用来自ScienionTM的S3 FlexarrayerTM将捕获探针在表面上排成阵列。通过测试不同浓度、缓冲液组成和pH来优化传感器表面上的探针固定。表面上经优化的捕获探针(例如抗体)产生平滑的蛋白质斑点和高捕获探针密度(>3ng/mm2)。可通过将nM至0的蛋白质标准品掺入PBS(含10％人血清白蛋白)中来获得稀释曲线。稀释曲线测试了传感器表面上抗体的功能，并表明了该测定法的灵敏度。如果抗体未能结合蛋白质靶标，则可对更多的抗体进行测试和优化。SP-IRIS传感器需要缀合至40nm金纳米粒子的检测抗体，以允许对排成阵列的表面抗体上的分子结合进行数字化计数。
神经纤毛蛋白-2(NRP2)是一种跨膜受体蛋白，其表达水平与黑色素瘤的恶性进展相关(4、5)。小窝蛋白-1是参与非受体依赖性胞吞作用的整合膜蛋白(24-26)和黑色素瘤特异性外泌体标志物蛋白(7)。这两种外泌体标志物蛋白是使用SP-IRIS定量检测肿瘤特异性外泌体的理想候选者(外泌体表型区分)。可使用标准的EDC/NHS化学反应将这些外泌体标志物的抗体缀合至商业上购买的羧化金纳米粒子。
以血液样品进行的平台验证：
为了确定在临床样品背景下SP-IRIS技术的检测灵敏度和测定法的可再现性，发明人使用了来自正常健康供体的血液样品，该血液样品中掺入了已知量的从癌细胞系分离的外泌体。外泌体从1205Lu黑色素瘤细胞和MCF-7乳腺癌细胞中分离。在不含外泌体的FBS培养基中培养癌细胞32小时，然后通过超速离心和过滤的组合来分离外泌体，超速离心和过滤的组合是由传统的超速离心方法改进而得的(如Thery等所描述的，27)。将外泌体团块(pellets)储存在-20℃，并通过BCA测定法测量产量。使用了兔抗NRP2抗体(sc-5542，SantaCruzTM)和小鼠抗小窝蛋白-1抗体(sc-53564，Santa CruzTM)。
SP-IRIS系统的优化：
之前，发明人已经证明了对直径小至60nm的低折射率纳米粒子进行检测和确定大小的能力。发明人期望改善该能力以扩展至40nm大小——这需要将SP-IRIS图像中亮斑的分辨率提高～4倍。对SP-IRIS系统的常规优化(例如通过使用改进的图像处理工具)将足以对较小的粒子进行可视化。然而，期望具有硬件方面的解决方法来增加纳米粒子(外泌体)的可见度，用于改善定量和大小鉴别。示例性方法为使用部分暗场照明(与匹配照明/采集相比)。发明人发现初步实验和计算是令人鼓舞的(数据未示出)。而且，之前的实验限于单色图像采集，发明人正计划实施多波长成像和图像配准(image registration)。
实施例3：囊泡内生物标志物或外泌体内生物标志物的检测和表征
本文所述的方法进一步被考虑用于对细胞外囊泡(例如外泌体)内的生物标志物进行检测和/或表征。本文提供了用于对内部生物标志物(例如货物蛋白(cargo))进行表征的示例性方法。
使用细胞外囊泡特异性探针(例如至少一种抗体、至少一种肽或至少一种适体)将细胞外囊泡(例如外泌体)捕获在如本文所述的传感器上。在一些实施方式中，当表征内部标志物时，囊泡群在传感器上每个点处包含1-10,000个囊泡。
在一些实施方式中，将捕获的囊泡透化，以使得第二探针能接近囊泡内生物标志物。在其它实施方式中，在进行透化之前，首先将捕获的囊泡固定至表面(例如，用戊二醛、多聚甲醛、甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、福尔马林或它们的组合等)。透化可使用电穿孔或通过使用去污剂(例如皂苷、SDS、Triton-X100、吐温-20、NP40、蛋白酶K、链球菌溶血素O、洋地黄皂苷等)或有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙酮等)进行。
对囊泡内生物标志物的染色可通过在芯片上的染色来进行。可使用本文所述的方法对任何囊泡内生物标志物进行染色。例如，蛋白质生物标志物可使用经标记的抗体、适体或肽进行染色；核酸可通过经荧光团标记的互补序列进行染色(例如FISH测定法)；而脂质可使用染料(例如来自Molecular ProbesTM，Eugene，OR的DiO、DiA、DiL、DiD)进行染色。特定RNA(例如mRNA、miRNA)或DNA的存在、量或水平的变化可使用本文所述的方法确定。进一步在本文考虑之列的是特定的突变、多态性或融合可使用本文所述的方法进行检测，并且可被用于疾病诊断(例如，可检测KRAS中的突变以用于诊断癌症(例如肺癌、结肠癌或胰腺癌)；可检测ALK基因中的融合以用于诊断癌症(例如肺癌))。
可进行数据的后处理以确定多个输出测量值。例如，可将关于大小和其它特征的无标记数据与涉及囊泡内生物标志物丰度或表达的荧光数据相关联。在另一个实施方式中，可确定样品的异质性或者包含某些生物分子(例如脂质、蛋白质、核酸等)或生物分子组合的捕获的外泌体的比例。
在一个实施方式中，用于对捕获的囊泡的内部货物蛋白进行表征的方法包括以下步骤：
(i)将细胞外囊泡或外泌体捕获至SP-IRIS传感器上，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针；
(ii)任选地固定捕获的囊泡；
(iii)透化捕获的囊泡；
(iv)使用第二探针对期望的囊泡内生物标志物进行染色；以及
(v)与参考相比，任选地确定包含特定生物标志物的囊泡的数量/大小、样品的异质性或位于囊泡内区室中的生物标志物的量。
在另一个实施方式中，用于对捕获的囊泡的内部货物蛋白进行表征的方法包括以下步骤：
(i)提供在生物流体或缓冲液中的细胞外囊泡的样品；
(ii)固定并透化所述生物流体或缓冲液中的所述细胞外囊泡；
(iii)用至少第二探针对所述生物流体或缓冲液中的所述细胞外囊泡进行染色；
(iv)将细胞外囊泡捕获至SP-IRIS传感器上，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针；
(v)使用如本文所述的SP-IRIS的无标记方法确定捕获的囊泡的大小和数量；
(vi)测量所述第二探针的荧光(或者，如果使用了多种差异化标记的探针，则测量多种颜色)；
(vii)将无标记数据和荧光数据相关联以测量样品的异质性、确定包含某些囊泡内生物标志物或生物标志物组合的捕获的外泌体的比例。
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Claims (22)

1.一种用于对生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：
(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；
(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针包含纳米粒子；以及
(c)使用SP-IRIS系统对所述纳米粒子进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞外囊泡特异性探针和/或所述二级探针包括抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞外囊泡包括外泌体。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品包括从受试者获得的样品。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述从受试者获得的样品包括血液样品。
6.如权利要求2所述的方法，其中，细胞外囊泡特异性抗体包括抗CD63抗体。
7.如权利要求2所述的方法，其中，细胞外囊泡特异性抗体包括针对生物标志物的抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述纳米粒子包括金粒子。
9.如权利要求1所述的方法，其中，捕获的细胞外囊泡通过大小和/或形状进行表征。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述传感器进一步包含至少一种另外的细胞外囊泡特异性抗体或多种不同的细胞外囊泡特异性抗体，以用于进行多重检测。
11.如权利要求10所述的方法，其中，多种细胞外囊泡特异性抗体包含至少2种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种或更多种不同的细胞外囊泡特异性抗体。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述多重检测包含多种二级探针。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述多种二级探针是差异化标记的。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述多种二级探针是用通过大小和/或形状区分的多种纳米粒子进行差异化标记的。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述二级探针结合至外泌体内标志物。
16.一种用于对细胞外囊泡上的囊泡外生物标志物进行检测的方法，所述方法包括：
(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；
(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针针对囊泡外生物标志物并进一步包含可检测部分；以及
(c)使用SP-IRIS系统对所述可检测部分进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡上的囊泡外生物标志物进行检测。
17.如权利要求16所述的方法，其中，使用多重方式执行所述方法。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述多重方式包括在步骤(b)中使用多种二级探针。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述多种二级探针是差异化标记的。
20.如权利要求16所述的方法，其中，所述多种二级探针是用通过大小和/或形状区分的多种纳米粒子进行差异化标记的。
21.一种用于对细胞外囊泡内部的囊泡内生物标志物进行检测的方法，所述方法包括：
(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；
(b)对来自步骤(a)的捕获的囊泡进行固定和/或透化；
(c)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针针对囊泡内生物标志物并进一步包含可检测部分；以及
(d)使用SP-IRIS系统对所述可检测部分进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡上的囊泡内生物标志物进行检测。
22.一种用于对生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征的方法，所述方法包括：
(a)使SP-IRIS传感器与生物样品接触，所述SP-IRIS传感器包含细胞外囊泡特异性探针，所述生物样品包含至少一种细胞外囊泡，从而将所述囊泡捕获至所述传感器上；
(b)使具有捕获的囊泡的传感器与二级探针接触，所述二级探针标记有荧光标签或量子点；以及
(c)使用SP-IRIS系统对所述荧光标签或量子点进行成像，从而对所述生物样品中的细胞外囊泡进行定量和/或表征。
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