KR100773543B1 - 전기화학적 생분자 검출 센서, 그의 제조 방법 및 그를이용한 생분자 검출 방법 - Google Patents

전기화학적 생분자 검출 센서, 그의 제조 방법 및 그를이용한 생분자 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기판; 상기 기판 상에 고정되어 있고 캐비티 구조를 갖는 일차 물질; 상기 일차 물질의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질; 및 상기 이차 물질에 고정되어 있는 프로브 생분자;를 포함하는 생분자 검출 센서, 상기 생분자 검출 센서의 제조 방법 및 상기 생분자 검출 센서를 이용한 생분자의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 전기화학 반응을 이용하여 표적 생분자를 용이하게 검출할 수 있고, 검출 시간을 단축할 수 있으며, 검출의 정확성을 높일 수 있다. 또한, 프로브를 정교하게 설계할 필요가 없어 검출 센서의 제작이 용이하고, 별도의 표지가 필요 없어 검출 단계가 단순하고 고가의 보조 장비가 불필요하다.
생분자, 센서, 페로센, 사이클로덱스트린, 캐비티

Description

전기화학적 생분자 검출 센서, 그의 제조 방법 및 그를 이용한 생분자 검출 방법{Electrochemical sensor for detecting biomolecule, method for preparing the same, and method for detecting biomolecule using the electrochemical sensor}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서의 구조를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법을 단계별로 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법의 일차 물질 고정 단계 및 캐핑 단계에 있어서 표면 반사도 변화를 측정한 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법의 일차 물질 및 이차 물질의 선택적 결합 단계에 있어서 시간 및 입사각에 따른 표면 반사도 변화를 측정한 그래프이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법의 일차 물질 및 이차 물질의 선택적 결합 단계에 있어서 시간에 따른 표면 반사도 변화를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서를 이용하여 생분자를 검출하는 방법을 개념적으로 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 사용한 혼성화 버퍼와 종래의 전해질 용액의 산화 및 환원 피크를 비교 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서에 DNA를 전혀 포함하지 않는 혼성화 버퍼를 제공한 경우 측정 시간에 따른 순환 전압-전류 곡선(cyclic voltammogram)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서에 프로브 DNA와 완전 상보적인 표적 DNA를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우 측정 시간에 따른 순환 전압-전류 곡선을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서에 프로브 DNA와 완전 비상보적인 DNA를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우 측정 시간에 따른 순환 전압-전류 곡선을 나타낸 것이다.
도 9는 도 6 내지 도 8의 순환 전압-전류 곡선을 함께 나타낸 것이다(Fc-DNA: 도 6의 경우, comp-DNA: 도 7의 경우, mis-DNA: 도 8의 경우).
도 10은 도 6 내지 도 8의 경우의 시간에 따른 전류 변화를 비교 측정한 그래프이다(Fc-DNA: 도 6의 경우, comp-DNA: 도 7의 경우, mis-DNA: 도 8의 경우).
도 11은 도 6 내지 도 8의 경우의 2분에서의 전류 값 변화를 비교하여 나타낸 그래프이다(Fc-DNA: 도 6의 경우, comp-DNA: 도 7의 경우, mis-DNA: 도 8의 경우).
도 12는 도 6 내지 도 8의 경우의 시간에 따른 전류 변화를 10초 마다 비교 측정한 그래프이다(Fc-DNA: 도 6의 경우, comp-DNA: 도 7의 경우, mis-DNA: 도 8의 경우).
본 발명은 전기화학적 생분자 검출 센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표지가 필요 없고 신속한 검출이 가능한 전기화학적 생분자 검출 센서, 그의 제조 방법 및 그를 이용한 생분자 검출 방법에 관한 것이다.
생분자의 효과적인 검출법이 다양한 분야에서 요구되고 있다. 상기 생분자 검출이 필요한 대표적인 분야가 바이오칩이다. 바이오칩이란 기판 상에 분석하고자 하는 DNA 또는 단백질 등의 프로브 생분자를 고밀도로 부착시킨 칩으로서, 샘플 내 유전자 발현 양상, 유전자 결함, 단백질 분포 및 반응 양상 등을 분석해낼 수 있다. 바이오칩은 프로브 생분자의 부착형태에 따라 고체 기판 상에 부착된 마이크로어레이 칩(microarray chip)과 미세 채널 상에 부착된 랩온어칩(lab-on-a-chip)으로 나눌 수 있다. 이러한 바이오칩에서는, 샘플에 프로브 생분자와 결합할 수 있는 표적 생분자가 존재하는지를 알아내기 위하여, 기판 상에 고정된 프로브 생분자와 표적 생분자의 결합 여부를 검출할 수 있는 시스템이 필요하다.
통상적으로 유전자 분석용 DNA 칩은 샘플 DNA에 형광색소를 라벨링하고, 칩 위의 프로브와 반응시킨 후 공초점 현미경(confocal microscope)이나 CCD 카메라를 사용하여 칩 표면에 남은 형광 물질을 검출하는 방법을 사용한다(미국 특허 제 6,141,096호 참조). 그러나, 이러한 형광 검출법은 소형화가 어렵고, 디지털화 된 출력을 볼 수 없다는 문제점이 있다.
DNA의 혼성화와 같은 생분자의 결합 여부를 검출하는 다른 방법으로서 전기화학적 검출법이 있다.
예컨대, 기존의 샌드위치 어세이와는 반대로 DNA 랩(wrap) 어세이를 이용하여 표적 핵산을 전기화학적으로 검출하는 방법이 있다(Chad E. Immoos, Stephen J. Lee, and Mark W. Grinstaff, J.AM.CHEM.SOC., 126: 10814-10815, 2004). 상기 방법에 있어서, 기판 상에 포획 사슬(capture strand)이 고정되어 있고, 상기 포획 사슬에는 차례로 링커(linker), 프로브 사슬 및 전기화학적 활성 물질이 연결되어 있다. 상기 전기화학적 활성 물질은 기판으로부터 멀리 떨어져 있다가 표적 사슬이 결합되면 기판 상으로 접근하게 되고, 그에 따라 순환 전압-전류 곡선(cyclic voltammogram)이 변하게 된다.
또한, 헤어핀 구조를 갖는 프로브 사슬을 이용하는 검출 방법이 있다(Chunhai Fan, Kevin W. Plaxco, and Alan J. Heeger, PNAS, 100: 9134-9137, 2003). 상기 방법에 있어서, 기판 상에 전기화학적 활성 물질을 구비하는 프로브 사슬이 고정되어 있고, 상기 프로브 사슬은 헤어핀 구조를 갖고 있다. 상기 프로브 사슬이 표적 사슬과 결합하게 되면 헤어핀 구조가 풀리면 전기화학적 활성 물질은 기판으로부터 멀어지게 되고, 그에 따라 순환 전압-전류 곡선이 변한다.
또한, DNA 간의 경쟁적 혼성화 반응을 이용하는 검출 방법이 있다(미국 공개 제 20040110214호 참조). 상기 방법에 있어서, 기판에 프로브 DNA가 고정되어 있 고, 상기 프로브 DNA에는 전기화학적 활성 물질을 구비하는 시그널링 DNA가 혼성화 되어 있다. 만약 표적 DNA가 제공되면 상기 표적 DNA는 상기 프로브 DNA 또는 시그널링 DNA에 경쟁적으로 혼성화함으로써 상기 시그널링 DNA는 기판으로부터 방출되고, 그에 따라 순환 전압-전류 곡선이 변한다.
하지만, 상기에서 설명된 전기화학적 검출법들은 표적 생분자의 검출을 위해서 프로브 생분자 또는 시그널링 생분자 등을 매우 정밀하게 설계 및 제작해야 하고, 생분자의 검출에 장시간이 소요되는 문제점이 있다.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 표지가 필요 없고, 설계 및 제작이 용이하며, 생분자를 매우 신속하게 검출할 수 있는 생분자 검출 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생분자 검출 센서의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생분자 검출 센서를 이용하여 생분자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 고정되어 있고 캐비티 구조를 갖는 일차 물질; 상기 일차 물질의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질; 및 상기 이차 물질에 고정되어 있는 프로브 생분자;를 포함하는 생분자 검출 센서를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기판의 표면에 금이 코팅 되어 있을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 일차 물질은 사이클로덱스트린 또는 칼렉스아렌(Calixarene)일 수 있고, 상기 이차 물질은 페로센(ferrocene)을 포함하는 메탈로센(metallocene), 알킬암모늄 또는 아다만틸(adamantly)기를 포함하는 화합물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 일차 물질은 자기 조립법(self-assembly)에 의해 기판 상에 고정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생분자는 핵산 또는 단백질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, PNA, LNA 및 그 혼성체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판 상에 캐비티 구조를 갖는 일차 물질을 고정하는 단계; 상기 일차 물질의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질에 프로브 생분자를 고정하는 단계; 및 상기 일차 물질에 이차 물질을 제공하여 선택적인 결합을 형성하는 단계;를 포함하는 생분자 검출 센서의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제조 방법은 기판 상에 일차 물질을 고정한 다음 캐핑(capping) 물질을 제공하여 상기 일차 물질이 고정되지 않은 기판 표면을 캐핑하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 일차 물질 및 이차 물질은 각각 β-사이클로덱스트린 및 페로센일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기판 상에 일차 물질을 고정하는 단계는 자기 조립법(self-assembly)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 고정되어 있고 캐비티 구조를 갖는 일차 물질; 상기 일차 물질의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질; 및 상기 이차 물질에 고정되어 있는 프로브 생분자;를 포함하는 생분자 검출 센서에 검출하고자 하는 표적 생분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계; 및 상기 샘플 제공 전후의 전류 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 생분자의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 전류 변화의 측정은 순환 전압-전류법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 샘플에 표적 생분자가 존재하는 경우 상기 표적 생분자가 상기 프로브 생분자와 결합함에 따라 상기 이차 물질은 일차 물질로부터 분리되고, 그에 의해 전류가 변하는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 전기화학 반응을 이용하여 표적 생분자를 용이하게 검출할 수 있고, 검출 시간을 단축할 수 있으며, 검출의 정확성을 높일 수 있다. 또한, 프로브를 정교하게 설계할 필요가 없어 검출 센서의 제작이 용이하고, 별도의 표지가 필요 없어 검출 단계가 단순하고 고가의 보조 장비가 불필요하다.
이하 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 캐비티 구조를 갖는 일차 물질 및 상기 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있는 물질 간의 선택적인 결합을 이용하는 생분자 검출 센서에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서의 구조를 개략적으로 도시한 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 생분자 검출 센서(100)는 기판(102); 상기 기판(102) 상에 고정되어 있고 캐비티 구조를 갖는 일차 물질(104); 상기 일차 물질(104)의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질(106); 및 상기 이차 물질(106)에 고정되어 있는 프로브 생분자(108);를 포함한다.
상기 기판(102)의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 기판(102)과 별도의 작동 전극(미도시)을 사용하는 경우 상기 기판(102)에는 전류가 흐르지 않으므로, 상기 기판(102)은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 기판(102)을 작동 전극으로 사용하는 경우 상기 기판(102)은 전기를 통할 수 있는 재질로 제작될 수 있다. 예컨대, 상기 기판(102)은 금속, 특히 금으로 제조되거나, 상기 기판의 표면에 금이 코팅 될 수 있다.
상기 캐비티 구조를 갖는 일차 물질(104)은 임의의 통상적인 방법에 의해 상기 기판(102)에 고정될 수 있다. 예컨대, 상기 캐비티 구조를 갖는 일차 물질 (104)의 말단을 티올기, 아민기, 실란기 또는 바이오틴으로, 바람직하게 티올기로 유도 시킨 다음 자기 조립법(self-assembly)에 의해 상기 기판(102) 상에 고정시킬 수 있다.
상기 이차 물질(106)은 상기 일차 물질(104)의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는다. 상기 이차 물질(106)은 전기화학적 반응을 일으켜 특유한 순환 전압-전류 곡선을 얻을 수 있게 함으로써, 표적 생분자의 존재 또는 농도를 검출할 수 있게 한다.
본 발명에 있어서, 상기 일차 물질(104)은 캐비티 구조를 갖고 이차 물질(106)은 상기 캐비티 구조에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 한, 그들은 특정 종류의 물질로 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 일차 물질(104)은 사이클로덱스트린 또는 칼렉스아렌(Calixarene)일 수 있고, 상기 이차 물질(106)은 페로센(ferrocene)을 포함하는 메탈로센(metallocene), 알킬암모늄 또는 아다만틸(adamantly)기를 포함하는 화합물일 수 있다. 특히, 상기 일차 물질(104) 및 이차 물질(106)은 각각 β-사이클로덱스트린 및 페로센일 수 있다.
다시 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 상기 일차 물질(104) 및 이차 물질(106)로서 각각 β-사이클로덱스트린 및 페로센이 사용되었음을 알 수 있다.
상기 β-사이클로덱스트린(이하, 'CD'라고 약칭하는 경우도 있음)은 하기 화학식 I의 물질로서, 크라운 또는 캐비티 구조를 갖는다.
<화학식 I>
Figure 112005070965871-pat00001
상기 페로센(이하, 'Fc'라고 약칭하는 경우도 있음)은 방향족 전이금속착물인 메탈로센(metallocene)의 대표적인 물질로, 철 이온 양쪽에 5각형 고리 모양의 리간드인 사이클로펜타디엔이 배위결합을 하고 있는 화합물이다. 상기 페로센은 전기화학적 반응을 일으켜 특유한 순환 전압-전류 곡선을 얻을 수 있게 함으로써, 표적 생분자의 존재 또는 농도를 검출할 수 있게 한다.
상기 프로브 생분자(108)는 상기 이차 물질(106)에 링커를 통해 고정될 수도 있다. 상기 링커의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 실시예에서는 상기 링커로서 -CO2NH(CH2)6-를 사용하였다.
상기 프로브 생분자(108)는 검출하고자 하는 표적 생분자와 혼성화 될 수 있도록 설계된다.
본 발명에 있어서, 상기 생분자는 핵산 또는 단백질일 수 있다. 상기 핵산은 다양한 핵산, 유사핵산, 또는 그 혼성체를 의미하고, 예컨대 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid) 및 그 혼성체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 올리고뉴클레오티드 또는 PCR 산물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법은 기판 상에 캐비티 구조를 갖는 일차 물질을 고정하는 단계; 상기 일차 물질의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질에 프로브 생분자를 고정하는 단계; 및 상기 일차 물질에 이차 물질을 제공하여 선택적인 결합을 형성하는 단계;를 포함한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법을 단계별로 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 생분자 검출 센서를 제조하기 위해서, 먼저 기판(102) 상에 캐비티 구조를 갖는 일차 물질(104a, 104b, 104c)을 고정한다. 도 2에 있어서, 상기 일차 물질(104a, 104b, 104c)로서 β-사이클로덱스트린을 사용하였다.
상기 기판(102) 상에 일차 물질(104a, 104b, 104c)을 고정하는 단계는 자기 조립법(self-assembly)에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 캐비티 구조를 갖는 일차 물질(104a, 104b, 104c)의 말단을 티올기, 아민기, 실란기 또는 바이오틴으로, 바람직하게 티올기로 유도 시킨 다음 자기 조립법(self-assembly)에 의해 상기 기판(102) 상에 고정시킬 수 있다. 도 2에 있어서, β-사이클로덱스트린의 하이드록실기를 티올기로 유도 시킨 다음 자기 조립법에 의해 상기 기판(102) 상에 모노레이어를 형성하여 고정시켰다.
다음으로, 선택적으로, 상기 기판(102) 상에 캐핑(capping) 물질(110a, 110b)을 제공하여 상기 일차 물질이 고정되지 않은 기판 표면을 캐핑할 수 있다. 이것은 이후 표적 생분자 검출 시에 발생할 가능성이 있는 상기 기판(102)과 외부 물질 사이의 부반응을 방지하기 위한 것이다.
상기 캐핑 물질(110a, 110b)은 특정 종류에 한정되지 않는다. 예컨대, 도 2에 있어서, 일 말단이 티올기로 치환된 C12의 직쇄 알칸(C12-SH)을 사용하였다.
다음으로, 상기 일차 물질(104a, 104b, 104c)의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질(106a, 106b, 106c)에 프로브 생분자(108a, 108b, 108c)를 고정한다. 도 2에 본 단계는 도시 되어 있지 않다.
상기 프로브 생분자(108a, 108b, 108c)는 상기 이차 물질(106a, 106b, 106c)에 링커를 통해 고정될 수 있다. 상기 링커의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 실시예에서는 상기 링커로서 -CO2NH(CH2)6-를 사용하였다.
다음으로, 상기 일차 물질(104a, 104b, 104c)에 이차 물질(106a, 106b, 106c)을 제공하여 선택적인 결합을 형성하여, 본 발명에 따른 생분자 검출 센서를 제조하였다. 도 2에 있어서, 일차 물질(104a, 104b, 104c)인 β-사이클로덱스트린의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있는 페로센을 이차 물질(106a, 106b, 106c)로 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 일차 물질 고정 단계, 캐핑 단계, 선택적 결합 형성 단계에 있어서 표면 반사도 변화를 측정하였다. 그 결과 일차 물질 고 정 단계 전후의 표면 반사도는 유의한 차이를 보였지만, 캐핑 단계 전후의 표면 반사도는 상대적으로 매우 적은 차이를 보였다(도 3a 참조). 또한, 선택적 결합 형성 단계의 경우 이차 물질을 제공한 후 약 6분이 경과하면 상기 선택적 결합이 포화되는 양상을 보였다(도 3b 및 3c 참조).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 생분자 검출 센서를 이용하여 표적 생분자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생분자 검출 방법은 본 발명에 따른 생분자 검출 센서에 검출하고자 하는 표적 생분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계; 및 상기 샘플 제공 전후의 전류 변화를 측정하는 단계;를 포함한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 생분자 검출 센서를 이용하여 생분자를 검출하는 방법을 개념적으로 도시한 것이다.
도 4를 참조하면, 표적 생분자를 검출하기 위해서 본 발명에 따른 생분자 검출 센서에 검출하고자 하는 표적 생분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공한다.
통상적으로 사용되는 혼성화 버퍼가 사용될 수 있고, 예컨대, 본 발명의 실시예에서는 1 X SSPET 버퍼를 사용하였다.
다음으로, 상기 샘플 제공 전후의 전류 변화를 측정한다. 상기 전류 변화의 측정은 순환 전압-전류법에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 기판을 작동 전극으로 하고, 기준 전극으로서 Ag/AgCl을 사용하고, Pt 와이어를 보조 전극으로 하는 삼전극계를 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 이차 물질이 반응할 수 있는 적절한 범위의 전압을 일정전위기를 이용하여 작업전극에 인가함으로써 순환 전압-전류 곡선을 얻을 수 있다.
본 발명의 생분자 검출 방법에 있어서, 상기 순환 전압-전류 곡선을 측정하기 위해 별도의 전해질 용액을 투입할 필요 없이, 상기 혼성화 버퍼를 그대로 사용할 수 있다(도 5 참조).
상기 전류가 유의하게 변하는 경우 상기 샘플에 표적 생분자가 존재하는 것으로 판단할 수 있다.
다시 도 4를 참조하면, 상기 샘플에 표적 생분자(112)가 존재하는 경우 상기 표적 생분자(112)가 상기 프로브 생분자(108)와 결합함에 따라 상기 이차 물질(106)은 일차 물질(104)로부터 분리되고, 그에 의해 전류가 변하는 것일 수 있다.
만약 상기 전류가 유의하게 변하지 않는 경우 상기 샘플에 임의의 생분자 또는 표적 생분자가 존재하지 않는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에 따른 생분자 검출 센서에 각각 DNA를 전혀 포함하지 않는 샘플, 상기 생분자 검출 센서의 프로브 DNA와 완전 상보적인 DNA를 포함하는 샘플, 및 상기 생분자 검출 센서의 프로브 DNA와 완전 비상보적인 DNA를 포함하는 샘플을 제공하여 순환 전압-전류 곡선을 측정 비교 분석하였다.
그 결과 본 발명에 따른 생분자 검출 센서를 이용하여 표적 생분자를 용이하게 검출할 수 있고, 검출 시간을 단축할 수 있으며, 검출의 정확성을 높일 수 있음을 확인하였다(도 6 내지 도 12 참조).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실시예 1>
본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 제조
도 2에 도시되어 있는 방법을 이용하여 본 발명에 따른 생분자 검출 센서를 제조하였다.
먼저, 금 재질의 기판을 증류수에서 5분간 세척하고, 메탄올로 5분간 세척하고, 아세톤으로 3분간 세척한 후 다시 증류수로 5분간 세척하여 기판 상의 불순물을 완전히 제거하였다
다음으로, β-사이클로덱스트린의 하부 말단의 하이드록실기를 티올기로 치환한 다음, 상기 티올기를 갖는 β-사이클로덱스트린을 상기 기판 상에 올린 후 건조하지 않은 습윤 챔버 내에 밤새도록 유지시킴으로서 자기 조립법에 의해 상기 기판 상에 고정시켰다.
다음으로, 일 말단이 티올기로 치환된 C6의 직쇄 알칸(1% mercaptohexanol)을 상기 기판 표면에 제공하여, 반응하지 않고 남아 있는 Au 표면을 블락킹(blocking) 시키고, 증류수로 10분간 2회 세척, 메탄올로 1회 세척 후 건조시킴으로써, 상기 고정된 β-사이클로덱스트린 사이의 외부에 노출된 기판 표면을 캐핑하 였다.
다음으로, 링커로서 -CO2NH(CH2)6-를 사용하여 페로센에 프로브 생분자(서열번호 1)를 고정하여, 페로센-CO2NH(CH2)6-프로브 생분자를 제조하였다.
다음으로, 물 중에서 상기 β-사이클로덱스트린이 고정되어 있는 기판 상에 상기 페로센-CO2NH(CH2)6-프로브 생분자를 제공하여 상기 β-사이클로덱스트린 및 페로센 사이에 선택적인 결합을 형성하였고, 그에 의해 본 발명에 따른 생분자 검출 센서를 제조하였다.
<실시예 2>
본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 제조 단계에 따른 표면 반사도 측정
실시예 1의 생분자 검출 센서 제조의 각 단계에 있어서, 표면 반사도 변화를 측정하였다.
상기 표면 반사도 측정은 SPR(Surface-Plasmon Resonance) 장비를 이용하여 수행되었다.
도 3a는 실시예 1에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법의 일차 물질 고정 단계 및 캐핑 단계에 있어서 표면 반사도 변화를 측정한 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c에 있어서, Ro는 초기 반사도를, R은 최종 반사도를 의미한다.
도 3a를 참조하면, β-사이클로덱스트린 고정 단계 전후의 상대 반사도 (relative reflectance)는 유의한 차이를 보였지만, 캐핑 단계 전후의 상대 반사도는 상대적으로 매우 적은 차이를 보임을 알 수 있다.
도 3b는 실시예 1에 따른 생분자 검출 센서의 제조 방법의 일차 물질 및 이차 물질의 선택적 결합 단계에 있어서 시간 및 입사각에 따른 표면 반사도 변화를 측정한 그래프이고, 도 3c는 상기 단계에 있어서 시간에 따른 표면 반사도 변화를 측정한 그래프이다.
도 3a 및 3b를 참조하면, 선택적 결합 형성 단계의 경우 페로센을 제공한 후 약 6분이 경과하면 상기 선택적 결합이 포화되는 양상을 보임을 확인할 수 있다.
<실시예 3>
혼성화 버퍼가 선택적 결합 반응을 저해하는지 여부 확인
DNA 혼성화에 일반적으로 사용되는 혼성화 버퍼가 본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 일차 물질 및 이차 물질 사이의 선택적 결합 반응을 저해하는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1의 β-사이클로덱스트린 및 페로센 사이에 선택적인 결합을 형성 단계에 있어서, 물 대신에 β-사이클로덱스트린 및 페로센의 결합에 통상적으로 사용되는 전해질 용액인 0.2M Na2SO4를 사용하였고, 상기 페로센은 50 μM의 농도로 사용하였다.
또한, 상기 단계에 있어서, 물 대신에 본 발명의 실시예에서 혼성화 버퍼로 사용되는 1×SSPET(0.9 M NaCl, 60 mM NaH2PO4, 6 mM EDTA, pH 7.4, 0.005% Triton X-100 (Sigma))를 사용하였고, 상기 페로센은 50 μM의 농도로 사용하였다.
상기 각 경우에 있어서, 생분자 검출 센서의 금 기판을 작동 전극으로, Ag/AgCl을 기준 전극으로 사용하였다. 상기 작동 전극에 일정 범위의 전압을 인가하고 그에 따른 산화/환원 전류 변화를 측정함으로써 순환 전압-전류 곡선(cyclic voltammogram)을 얻었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 사용한 혼성화 버퍼와 종래의 전해질 용액의 산화 및 환원 피크를 비교 측정한 그래프이다.
도 5를 참조하면, 물 대신에 전해질 용액인 0.2M Na2SO4를 사용한 경우 및 혼성화 버퍼인 1×SSPET를 사용한 경우의 산화/환원 피크가 거의 일치함을 확인하였다. 따라서, 혼성화 버퍼인 1×SSPET는 β-사이클로덱스트린 및 페로센 사이의 선택적인 결합을 저해하지 않고, 따라서 순환 전압-전류 곡선을 얻기 위하여 별도의 전해질 용액이 필요치 않음을 알 수 있다.
<실시예 4>
본 발명에 따른 생분자 검출 센서를 이용한 표적 생분자의 검출
실시예 1에서 제조된 본 발명에 따른 생분자 검출 센서가 표적 생분자를 효과적으로 검출할 수 있는지 여부를 확인하였다.
이를 확인하기 위해, 실시예 1에서 제조된 생분자 검출 센서에 DNA를 전혀 포함하지 않는 혼성화 버퍼를 제공한 경우, 프로브 DNA(Cp2FeCO2NH(CH2)6-TGT TCT CTT GTC TTG: 서열번호 1)와 완전 상보적인 표적 DNA, -CAA GAC AAG AGA ACA-(서열번호 2)를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우, 및 상기 프로브 DNA와 완전 비상보적인 DNA, -TTT TTT TTT TTT TTT-(서열번호 3)를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우에 있어서, 측정 시간에 따른 순환 전압-전류 곡선을 측정하였다. 상기 측정은 실시예 3에 기재된 방법은 이용하였다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 혼성화 버퍼로서 1×SSPET를 사용하였고, 완전 상보적인 표적 DNA 및 완전 비상보적인 DNA의 농도는 각각 100 nM이었고, 혼성화 온도는 20 ℃였다.
도 6 내지 7은 실시예 1에서 제조된 생분자 검출 센서에 각각 DNA를 전혀 포함하지 않는 혼성화 버퍼를 제공한 경우, 프로브 DNA와 완전 상보적인 표적 DNA(서열번호 2)를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우, 및 프로브 DNA와 완전 비상보적인 DNA(서열번호 3)를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우에 있어서, 측정 시간에 따른 순환 전압-전류 곡선을 나타낸 것이다.
도 6을 참조하면, 기판에 프로브 생분자를 구비하는 페로센이 제공되지 않은 경우의 곡선이 대조구로서 표시되어 있다(β-CD Au electrode without Fc-ssDNA).
다시 도 6을 참조하면, 실시예 1에서 제조된 생분자 검출 센서에 DNA를 전혀 포함하지 않는 혼성화 버퍼를 제공한 경우 약 10분 후의 곡선이 상기 대조구 곡선 과 유사해짐을 확인하였다.
한편, 도 7을 참조하면, 실시예 1에서 제조된 생분자 검출 센서에 프로브 DNA와 완전 상보적인 표적 DNA(서열번호 2)를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우 약 2분 후의 곡선이 상기 대조구 곡선과 유사해짐을 확인하였다.
또한, 도 8을 참조하면, 실시예 1에서 제조된 생분자 검출 센서에 프로브 DNA와 완전 비상보적인 표적 DNA(서열번호 3)를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우 약 5분 후의 곡선이 상기 대조구 곡선과 유사해짐을 확인하였다.
상기 결과로부터, 각 경우에 있어서, 10분, 2분, 및 (5)분이 경과해야 상기 프로브 생분자가 고정되어 있는 페로센이 β-사이클로덱스트린으로부터 완전히 확산되어 나옴을 알 수 있다.
따라서, 예컨대, 본 발명에 따른 생분자 검출 센서에 샘플을 제공한 후 약 2분에 상기 순환 전압-전류 곡선을 확인함으로써 표적 생분자를 효과적으로 검출할 수 있다.
<실시예 5>
본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 ΔE 변화 측정
실시예 4에서 측정된 세 경우의 순환 전압-전류 곡선을 이용하여 산화 피크와 환원 피크의 차이인 ΔE 변화를 측정하였다.
도 9는 도 6 내지 도 8의 순환 전압-전류 곡선을 함께 나타낸 것이다(Fc-DNA: 도 6의 경우, comp-DNA: 도 7의 경우, mis-DNA: 도 8의 경우).
도 9로부터 표 1의 값을 얻었다.
<표 1>
Ea(mV) Ea(mV) ΔE(mV)
Fc-DNA 343 277 66
comp-DNA 349 275 74
mis-DNA 343 277 66
상기 표에서, Ea는 산화 피크, Ec는 환원 피크, ΔE는 Ea 및 Ec의 차이를 나타낸다.
상기 표 1로부터, DNA를 전혀 포함하지 않거나 완전 비상보적인 DNA(서열번호 3)를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우와는 달리 완전 상보적인 표적 DNA(서열번호 2)를 포함하는 혼성화 버퍼를 제공한 경우 생분자 검출 센서의 페로센의 산화 환원 반응에 영향을 미침을 알 수 있다.
<실시예 6>
본 발명에 따른 생분자 검출 센서의 전류 변화 측정
실시예 4에서 측정된 세 경우에 있어서, 시간에 따른 전류 변화를 측정하였다. 상기 시간에 따른 전류 변화를 측정하기 위해, 인가 전압은 -100mV~ 700mV 범위에서 500mV/s로 가하였다.
도 10은 도 6 내지 도 8의 경우의 시간에 따른 전류 변화를 비교 측정한 그래프이다(Fc-DNA: 도 6의 경우, comp-DNA: 도 7의 경우, mis-DNA: 도 8의 경우).
도 10에 있어서, 상기 전류 변화는 log(x/x1) 값으로 나타내었고, 상기에서 x1은 초기 전류값을 상기 x는 측정시 전류값을 의미한다. 또한, 전류 변화는 2분, 5분, 10분, 및 20분에서 측정하였다.
도 11은 도 6 내지 도 8의 경우의 2분에서의 전류 값 변화를 비교하여 나타낸 그래프이다(Fc-DNA: 도 6의 경우, comp-DNA: 도 7의 경우, mis-DNA: 도 8의 경우).
도 11에 있어서, 상기 전류 변화는 (I0-I2) 값으로 나타내었고, 상기에서 I0은 초기 전류값을 상기 I2는 측정시 전류값을 의미한다.
도 10 및 도 11을 참조하면, 완전 상보적인 표적 DNA(서열번호 2)가 제공된 경우의 전류 변화는 DNA를 전혀 포함하지 않거나 완전 비상보적인 DNA(서열번호 3)를 제공한 경우의 전류 변화로부터 현저히 구분됨을 알 수 있다.
도 12는 도 6 내지 도 8의 경우의 시간에 따른 전류 변화를 10초 마다 비교 측정한 그래프이다(Fc-DNA: 도 6의 경우, comp-DNA: 도 7의 경우, mis-DNA: 도 8의 경우).
도 12를 참조하면, 순환 전압-전류를 10초 간격으로 연속적으로 측정한 경우에도 상기 도 10과 유사한 결과를 얻어, 에러 범위 보다 큰 시그널 변화를 관찰할 수 있었다.
2분 방치 후 순환 전압-전류를 측정한 경우(도 10 참조)와 10초 간격으로 연속적으로 2분까지 순환 전압-전류를 측정한 경우(도 12 참조)를 비교한 결과, Fc-DNA의 경우 0.1 단위의 차이를 보였지만, comp-DNA의 값은 -1.2425 및 -1.2752로 거의 유사함을 확인하였다. 따라서, 순환 전압-전류 측정 횟수 보다는 시간에 따른 확산의 영향이 더 큼을 알 수 있다.
상기 결과들로부터, 본 발명에 따른 생분자 검출 장치는 표적 DNA를 용이하고, 정확하고, 신속하게(예컨대, 2분 내) 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 전기화학 반응을 이용하여 표적 생분자를 용이하게 검출할 수 있고, 검출 시간을 단축할 수 있으며, 검출의 정확성을 높일 수 있다. 또한, 프로브를 정교하게 설계할 필요가 없어 검출 센서의 제작이 용이하고, 별도의 표지가 필요 없어 검출 단계가 단순하고 고가의 보조 장비가 불필요하다.
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Claims (15)

  1. 기판;
    상기 기판 상에 고정되어 있고 캐비티 구조를 갖는 일차 물질;
    상기 일차 물질의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질; 및
    상기 이차 물질에 고정되어 있는 프로브 생분자;
    를 포함하는 생분자 검출 센서.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생분자 검출 센서.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 기판의 표면에 금이 코팅 되어 있는 것을 특징으로 하는 생분자 검출 센서.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 일차 물질은 사이클로덱스트린 또는 칼렉스아렌(Calixarene)이고, 상기 이차 물질은 페로센(ferrocene)을 포함하는 메탈로센(metallocene), 알킬암모늄 또는 아다만틸(adamantly)기를 포함하는 화합물인 것을 특징으로 하는 생분자 검출 센서.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 일차 물질 및 이차 물질은 각각 β-사이클로덱스트린 및 페로센인 것을 특징으로 하는 생분자 검출 센서.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 일차 물질은 자기 조립법(self-assembly)에 의해 기판 상에 고정되는 것을 특징으로 하는 생분자 검출 센서.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 생분자는 핵산 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 생분자 검출 센서.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA, PNA, LNA 및 그 혼성체로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 생분자 검출 센서.
  9. 기판 상에 캐비티 구조를 갖는 일차 물질을 고정하는 단계;
    캐핑(capping) 물질을 제공하여 상기 일차 물질이 고정되지 않은 기판 표면을 캐핑하는 단계;
    상기 일차 물질의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질에 프로브 생분자를 고정하는 단계; 및
    상기 일차 물질에 이차 물질을 제공하여 선택적인 결합을 형성하는 단계;
    를 포함하는 생분자 검출 센서의 제조 방법.
  10. 삭제
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 일차 물질 및 이차 물질은 각각 β-사이클로덱스트린 및 페로센인 것을 특징으로 하는 생분자 검출 센서의 제조방법.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 기판 상에 일차 물질을 고정하는 단계는 자기 조립법(self-assembly)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 기판; 상기 기판 상에 고정되어 있고 캐비티 구조를 갖는 일차 물질; 상기 일차 물질의 캐비티에 선택적으로 결합할 수 있고 전기화학적 활성을 갖는 이차 물질; 및 상기 이차 물질에 고정되어 있는 프로브 생분자;를 포함하는 생분자 검출 센서에 검출하고자 하는 표적 생분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계; 및
    상기 샘플 제공 전후의 전류 변화를 측정하는 단계;
    를 포함하는 생분자의 검출 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 전류 변화의 측정은 순환 전압-전류법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 샘플에 표적 생분자가 존재하는 경우 상기 표적 생분자가 상기 프로브 생분자와 결합함에 따라 상기 이차 물질은 일차 물질로부터 분리되고, 그에 의해 전류가 변하는 것을 특징으로 하는 방법.
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