CN105247349A - 用于分析物检测增强的等离子纳米空穴测定传感器及制造和使用所述传感器的方法 - Google Patents

用于分析物检测增强的等离子纳米空穴测定传感器及制造和使用所述传感器的方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了，除其他事项外，用于感测分析物的纳米传感器。在一些实施方案中，所述纳米传感器包括(a)基片；(b)信号放大层，其包括：(i)位于所述基片上的基本上连续的金属底板，(ii)从金属底板伸出、或从所述基片穿过底板中的孔伸出的一个或多个立柱，和(iii)位于立柱顶部的金属盘，其中所述盘的边缘的至少一个部分从所述金属底板分隔开；和(c)与分析物特异性地结合的捕捉剂，其中所述捕捉剂连接于信号放大层的表面；其中，当分析物与捕捉剂结合时，所述纳米传感器放大来自分析物的光信号。还提供了用于制造纳米传感器的方法以及使用纳米传感器的方法。

Description

用于分析物检测增强的等离子纳米空穴测定传感器及制造和使用所述传感器的方法
关于得到联邦政府资助的研究的声明
本发明是在美国政府的支持下由(美国)国防部高级研究计划局(DARPA)授予的基金号FA9550-08-1-0222资助而做出的。美国政府对本发明具有某些权利。
交叉引用
本申请是2013年3月15日提交的美国申请系列号13/838,600(NSNR-003)的部分继续申请，所述申请要求2012年4月10日提交的美国临时申请系列号61/622,226的权益，并且是2013年6月13日提交的美国专利申请系列号13/699,270的部分继续申请，所述申请是2011年5月20日提交的US2011/037455的§371申请案，并且要求2010年5月21日提交的美国临时申请系列号61/347,178的权益；
本申请也是2013年6月13日提交的美国申请系列号13/699,270(NSNR-001)的部分继续申请，所述申请是2011年5月20日提交的国际申请系列号US2011/037455的§371申请案，所述申请要求2010年5月21日提交的美国临时专利申请系列号61/347,178的权益；并且
本申请还要求以下申请的权益：2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,424(NSNR-004PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,096(NSNR-005PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/800,915(NSNR-006PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/793,092(NSNR-008PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,933(NSNR-009PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/794,317(NSNR-010PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/802,020(NSNR-011PRV)和2013年3月15日提交的临时申请系列号61/802,223(NSNR-012PRV)，所有这些申请出于所有目的通过提述并入本文。
背景
本发明涉及可改善测定对分析物的感测特性，尤其是传感灵敏度，的装置、系统、和方法，以及它们的制造和用途。本发明涉及具有信号放大层(SAL)的测定有关，所述信号放大层固定捕捉剂并放大所捕捉的分析物。本发明涉及显著增加这样的放大。所述放大层可增加测定灵敏度而不扩增分子的数目。本发明涉及能够以高生产量和低成本制作这样的测定的方法。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、和确定目标分析物的状态。
亟需开发能够显著增强分析物检测的测定装置、以及可显著降低此类装置的成本的制造方法。
本发明克服了现有技术的缺点并提供了更高的分析物感测灵敏度。
概述
以下简述并不意在包括本发明的所有特征和方面，也不意味着本发明必须包括在此简述中论述的所有特征和方面。
本发明涉及，除其他事项外，用于感测分析物的纳米传感器以及此类纳米传感器的制造。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、和确定目标分析物的状态。
本发明涉及具有信号放大层(SAL)的测定，所述信号放大层固定捕捉剂并放大被捕捉的分析物。本发明涉及显著增加这样的放大。所述放大层能够增加测定灵敏度而不扩增分子的数目。本发明涉及能够以高生产量和低成本制作这样的测定的方法。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。所述感测包括光吸收、光散射、光辐射、拉曼散射、色度、发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。所述感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(误差棒更小)。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、和确定目标分析物的状态。本发明可在体外或体内感测中使用。
附图简述
本领域技术人员将会理解，如下所述的附图仅用于说明目的。所述附图并不意图以任何方式限制本文教导的范围。有些附图并未依比例给出。
图1展示每个“层”的相对位置的“盒状图”。所述图不是成比例的，也不反映某些离散分子“层”的事实。所述分子粘附层是可选的。
图2示意性地展示了示例系统的一些部件。
图3.柱上盘(DoP)结构(400)的示意图。(a)一般结构的概观。(b)一个实施方案的横截面，该实施方案中背面金属膜在立柱周围并且与之相邻，所述立柱是电介质或半导体。(c,d,e)另一个实施方案的横截面，该实施方案中金属膜是在所述盘的下方展开的膜片，但是所述立柱具有与所述盘不同的横向尺寸。
图4.立柱小于盘的DoP的电磁仿真，显示高放大区域在金属尖锐边缘以及两个金属材料之间的小间隙中。虚线指示捕捉剂可及、故而分析物亦可及的表面。
图5.随机金属纳米岛(530)位于金属膜片层(550)上的连续介电膜(521)顶部而非立柱顶部的PCCM的示意图。
图6.具有分子连接层的盘耦合柱上点天线阵列(D2PA)板的示意图。(A)无免疫测定的D2PA板的概观。(b)在涂覆所述分子连接层(也称为“分子粘附层”)(160)之后的横截面。(c)涂覆所述分子连接层之前和之后。
图7示意性地展示了示例性抗体检测测定。
图8示意性地展示了示例性核酸检测测定。
图9示意性地展示了核酸检测测定的另一个实施方案。
图10显示了示例性制造方法1。
图11显示了示例性制造方法2。
图12显示了示例性制造方法3。
图13DoP结构的一个实施方案的制造结果。(a)制造中使用的参数，包括盘大小S盘、盘高度t金、以及立柱高度t氧化物。制成的DoP结构的(b)俯视图和(c)斜视图。
图14DoP样品的反射光谱，其共振峰被调节至800nm并且峰宽为80nm。通过有意调节盘和立柱大小，可实现650nm-850nm的共振峰。
图15在玻璃(蓝色曲线，参考，放大1000倍)、DoP(绿色曲线)和具有立柱收缩的DoP(红色曲线)上进行的免疫测定试验。来自具有立柱收缩的DoP的增强因子可高达平均6500。
图16制造PCCM的流程图的示意图。
图17连续介电膜上的纳米岛(PCCM)的SEM图片。(a)俯视图；(b)斜视图。
相应的附图标记在附图的全部若干图面中均指示相应的部件。应当理解的是，附图用于示出本公开中给出的构思，并且不是依比例给出的。
在详细解释本发明的任何实施方案之前应当理解的是，本发明的应用不限于下文描述中陈述的或附图中图示的构造细节和部件布置。
定义
在更详细地描述例示性实施方案之前，列出下述定义，以说明并界定说明书中使用的术语的含义和范围。
术语“分子粘附层”或“粘附/间隔层”指具有确定厚度的一层或多层分子，其包括附接于纳米传感器的内表面和能结合至捕捉剂的外表面。它还控制从金属至发光分子或材料的距离。
术语“捕捉剂反应性基团”指分子中具有化学功能的部分，其对捕捉剂具有反应性，即，能与捕捉剂中的部分(例如羟基、硫氢基、羧基或胺基团)反应生成稳定的强(例如共价)键。
如本文中使用的，术语“捕捉剂”指通过相互作用结合靶分析物的作用剂，该相互作用足以允许该作用剂结合该靶分子并从不同分子的异质混合物中浓缩该靶分子。结合相互作用通常由捕捉剂的亲和力区介导。典型的捕捉剂包括任何能特异性结合靶分析物的部分。某些捕捉剂以小于约10-6M(例如小于约10-7M、小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M、小于约10-12M、至低达10-16M)的解离常数(KD)特异性结合靶分子，而与其它分子没有显著结合。例示性捕捉剂包括但不限于蛋白质(例如抗体)和核酸(例如寡核苷酸、DNA、RNA，包括适体)。
术语“特异性结合”和“选择性结合”指捕捉剂优先结合存在于不同靶分子的异质混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用会区分样品中想要的(例如有活性的)和不想要的(例如无活性的)靶分子，通常大于约10至100倍或更多(例如大于约1000或10,000倍)。
术语“蛋白质”指任何长度的氨基酸聚合物形式，即大于2个氨基酸、大于约5个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基酸、大于约200个氨基酸、大于约500个氨基酸、大于约1000个氨基酸、大于约2000个氨基酸，通常不大于约10,000个氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸，和具有经过修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源或同源前导序列、带有或不带有N端甲硫氨酸残基的融合物；带免疫学标签的蛋白质；具有可检测的融合配偶的融合蛋白，例如包含荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶的融合蛋白；等等。这些术语还包括在细胞中经过翻译后修饰(例如糖基化、切割、分泌、异戊二烯化、羧基化、磷酸化、等)的多肽，具有二级或三级结构的多肽，和与其它部分(例如其它多肽、原子、辅因子等)强结合(例如共价或非共价)的多肽。
术语“抗体”意图指免疫球蛋白或其任何片段，包括能够结合抗原的单链抗体和噬菌体展示抗体。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，描述由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任何长度的聚合物，或合成生成的、能够与天然存在的核酸以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式杂交(例如能参与Watson-Crick碱基配对相互作用)的化合物(例如美国专利no.5,948,902及其引用的参考文献中记载的PNA)。
如本文中使用的，术语“互补”指核苷酸序列通过氢键与感兴趣的靶核酸碱基配对。在规范的Watson-Crick碱基配对中，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)替换。如此，A与T互补，而G与C互补。通常，“互补”指核苷酸序列与感兴趣的靶完全互补，使得序列中的每一个核苷酸与靶核酸中对应的位置上的每一个核苷酸互补。当核苷酸序列与非靶序列不是完全互补(100％互补性)，但由于核苷酸序列的某些区段与非靶序列的互补性而仍然可以与非靶序列进行碱基配对时，可以计算百分比互补性以评估非特异性(脱靶)结合的可能性。一般而言，50％或更低的互补性不引起非特异性结合。另外，70％或更低的互补性在严格杂交条件下可能不引起非特异性结合。
如本文中使用的，术语“核糖核酸”和“RNA”表示由核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文中使用的，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”表示由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文中使用的，术语“寡核苷酸”表示长约10个至200个核苷酸，直至300个核苷酸或更长，例如长至500nt或更长的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的，而且在某些实施方案中，长度小于300个核苷酸。
如本文中使用的，术语“附接”指一个分子与另一个分子的强(例如共价或非共价)键连接。
如本文中使用的，术语“表面附接”指分子强附接于表面。
如本文中使用的，术语“样品”涉及含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材料混合物。在特定实施方案中，样品可以是自生物学样品获得的，生物学样品例如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕(nasaldrainage)和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液(rheum)、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。在特定实施方案中，样品可以是自受试者(例如人)获得的，而且可以在用于主题测定法之前进行加工。例如，在分析之前，可以在使用之前自组织样品提取蛋白质/核酸，提取方法是已知的。在特定实施方案中，样品可以是临床样品，例如自患者收集的样品。
术语“分析物”指能被捕捉剂结合和检测的分子(例如蛋白质、核酸、聚合物或其它分子、它们的复合物或颗粒)。
术语“测定”指测试样品以检测分析物的存在和/或丰度。
如本文中使用的，术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，包括定量和定性测定二者。
如本文中使用的，术语“发光标记物”指当处于外部激发下时能发出光的标记物。这可以是发光(luminescence)。荧光标记物(其包括染料分子或量子点)和发光标记物(例如电致发光或化学发光标记物)是发光标记物的类型。外部激发对于荧光而言是光(光子)、对于电致发光而言是电流，对于化学发光而言是化学反应。外部激发可以是上述的组合。
短语“带标记的分析物”指这样的分析物，该分析物被发光标记物可检测地标记，使得该分析物能够通过评估该标记物的存在来加以检测。带标记的分析物可以是被直接标记的(即，可以将分析物自身直接缀合于标记物，例如通过强的键，如共价或非共价键直接缀合于标记物)，或者，带标记的分析物可以是被间接标记的(即，分析物被次级捕捉剂所结合，而次级捕捉剂是被直接标记的)。
术语“杂交”指核酸与互补核酸经Watson-Crick碱基配对的特异性结合。因而，术语“原位杂交”指核酸与中期或间期染色体的特异性结合。
就核酸而言，术语“杂交”和“结合”可互换使用。
术语“捕捉剂/分析物复合物”是捕捉剂与分析物的特异性结合所导致的复合物。捕捉剂和该捕捉剂所针对的分析物通常会在“特异性结合条件”或“适合于特异性结合的条件”下彼此特异性结合，其中此类条件为那些容许捕捉剂和溶液中要结合的分析物之间发生结合的条件(在盐浓度、pH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等方面)。此类条件(特别是就抗体及其抗原和核酸杂交而言)是本领域公知的(参见例如Harlow和Lane(Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和Ausubel等,ShortProtocolsinMolecularBiology,5thed.,Wiley&Sons,2002)。
如本文中使用的，术语“特异性结合条件”指生成包含彼此特异性结合的成对分子的核酸双链体或蛋白质/蛋白质(例如抗体/抗原)复合物，同时不利于并非彼此特异性结合的分子之间形成复合物的条件。特异性结合条件是杂交和清洗条件二者的总和或组合(全体)，而且在必要时可以包括清洗和封闭步骤。
对于核酸杂交，特异性结合条件可以如下实现：于42℃在50％甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖酐、和20μg/ml经变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育，接着于约65℃在0.1xSSC中清洗滤膜。
对于抗体结合抗原，特异性结合条件可以如下实现：在封闭溶液(例如含3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭含有抗体的基片，接着与在封闭缓冲液中稀释的含有分析物的样品一起温育。在该温育之后，在清洗溶液(例如PBS+TWEEN20)中清洗基片并与捕捉第二抗体(检测抗体，它识别抗原中的另一位点)一起温育。捕捉第二抗体可以缀合有光学可检测标记物，例如荧光团，诸如IRDye800CW、Alexa790、Dylight800。再次清洗之后，可以检测结合的捕捉第二抗体的存在。本领域技术人员会知道可加以修改以提高检测到的信号及降低背景噪声的参数。
术语“次级捕捉剂”(也可称作“检测剂”)指对抗原具有高度特异性亲和力的一组生物分子或化合物。次级捕捉剂可以与光学可检测标记物，例如酶、荧光标记物等强连接，或者次级捕捉剂自身可以被另一通过生物缀合而连接有光学可检测标记物的检测剂所检测((Hermanson,“BioconjugateTechniques”AcademicPress,2ndEd.,2008)。
术语“生物素部分”指包含生物素或生物素类似物如脱硫生物素、氧代生物素、2’-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等的亲和剂。生物素部分以至少10-8M的亲和力结合链霉亲合素。生物素亲和剂还可以包含接头，例如─LC-生物素、─LC-LC-生物素、─SLC-生物素或─PEGn-生物素，其中n为3-12。
术语“链霉亲合素”指链霉亲合素和亲合素二者，以及它们的任何以高亲和力结合生物素的变体。
术语“标志物”指这样的分析物，它在生物学样品中的存在或丰度与某种疾病或状况相关。
术语“键”包括共价和非共价键，包括氢键、离子键和由范德华力生成的键。
术语“放大”指信号的量级(magnitude)的增大，例如信号增大至少10倍、增大至少100倍、、增大至少1,000倍、增大至少10,000倍、或增大至少100,000倍。
术语“局部”是指“在某个位置”。
其他特异性结合条件是本领域已知的并且也可在本文中采用。
必须注意，如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”和“该”包括复数指称，除非上下文另外明确指明，例如在使用词语“单个/单种”时。例如，提到“一种分析物”包括单种分析物和多种分析物，提到“一种捕捉剂”包括单种捕捉剂和多种捕捉剂，而提到“一种检测剂”包括单种检测剂和多种检测剂。
示例实施方案的详述
下面详细的描述以举例的方式而不是以限制的方式示出了本发明的一些实施方案。
本发明涉及可改善感测分析物的测定的特性(尤其是感测灵敏度)的装置、系统、和方法，以及它们的制造和用途。本发明与具有信号放大层(SAL)的测定有关，所述信号放大层固定捕捉剂并放大所捕捉的分析物。本发明涉及显著增加这样的放大。所述放大层可增加测定灵敏度而不扩增分子的数目。本发明涉及能够以高生产量和低成本制作这样的测定的方法。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。所述感测包括光吸收、光散射、光辐射、拉曼散射、色度、发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。所述感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(误差棒更小)。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、和确定目标分析物的状态。本发明可在体外或体内感测中使用。具有信号放大层的测定由于其纳米结构有时被称为“纳米传感器”。
本发明的一个实施方案是一种传感器结构，其具有立柱上的金属盘和金属底板，其中具有最高信号放大(增强)的区域是分析物可及的。
本发明的一个实施方案是一种传感器结构，其具有金属底板和薄层金属岛，金属底板和薄层金属岛共同形成等离子空穴阵列以增强分析物感测。
本发明的一个实施方案是使传感器结构上的捕捉剂特异性地与目标分析物选择性结合。并且所述分析物可以在被捕捉剂捕捉之前或之后被标记。
本发明的一个实施方案是可以高生产量和低成本地在大面积上生产纳米传感器的制造方法。
具有信号放大层(SAL)的纳米传感器
如图1中的箱形图所示，用于感测分析物18的纳米传感器包括：(a)基片10；(b)位于基片10顶部的信号放大层(SAL)12，(c)位于SAL12的表面上的可选的分子粘附层14，(d)与分析物18特异性结合的捕捉剂16，其中，当分析物与捕捉剂16结合时，所述纳米传感器放大来自分析物18的光信号。所述SAL，其包括金属和非金属微/纳米结构，放大由捕捉剂捕捉的分析物的感测信号，而不扩增分子的数目。此外，这样的扩增在距SAL表面的很小深度(约100nm)以内是最有效的。
在某些实施方案中，在分析物与捕捉剂结合之前或之后，用发光标记物标记所述分析物。所述分析物在某些实施方案中也称为生物标志物。
在某些实施方案中，还使用电场来辅助分子灵敏度、或结合、以及检测。
所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。所述感测包括光吸收、光散射、光辐射、拉曼散射、色度、发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。所述感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(误差棒更小)。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、和确定目标分析物的状态。本发明可在体外或体内感测中使用。
SAL的一般结构包括扩增局部表面电场及梯度和光信号的纳米级金属-介电/半导体-金属结构。在存在金属结构的尖锐(即，曲率大)边缘的位置处，以及位于两个金属结构的小间隙之间的位置处具有高放大。最高的增强区域是既具有所述尖锐边缘又具有所述小间隙的区域。此外，针对所有金属和非金属微/纳米结构的优选尺寸应当小于SAL所放大的光的波长(即，亚波长)。
优选的SAL层应当具有尽可能多的金属尖锐边缘和小间隙。这要求有密集的、由小间隔分开的金属纳米结构。本发明包括几种不同的SAL层结构。此外，可以通过能进一步覆盖不具有尖锐边缘和小间隙的金属材料的部分的过程来进一步改善SAL层自身，如在2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/801,424、和2014年3月15日提交的名称为“Methodsforenhancingassaysensingpropertiesbyselectivelymaskinglocalsurfaces”的共同未决PCT申请中所述的，通过提述将这些申请并入本文。
光放大来源于一个或几个以下因素：纳米传感器能够(a)有效吸收光激发(例如，可激发荧光部分的波长的光)，(b)将吸收的光聚焦于某些位置，(c)将分析物放入大部分光被聚焦的区域中，和(d)将分析物所产生的光从固定分析物的位置高效辐射。
在一些实施方案中，不同的捕捉剂附接于纳米传感器表面，其中每种捕捉剂包被在所述表面的不同位置，例如以阵列形式，由此在对不同分析物的检测中提供多重化，因为每个位置对于捕捉特定种类的分析物是特异性的。
在一些实施方案中，所述纳米传感器可作为多孔格式实现，例如24孔、96孔或384孔格式，其中多孔板的每个孔包括纳米传感器(例如，纳米传感器在每个孔中，或者纳米传感器是每个孔的底部或侧壁的一部分)。每个孔中的捕捉剂可以是相同或不同的。在一些实施方案中，可将多种不同的捕捉剂放入孔中，每一种包被在不同的位置上，由此提供对不同分析物的多重化检测。在这些实施方案中，可并行分析样品中的几种分析物。在一些实施方案中，所述纳米传感器可以是微流体通道或纳米流体通道的一部分。
在特定的实施方案中，主题纳米传感器可进一步包括与捕捉剂特异性结合的标记分析物。如以上提及的，可用发光标记物直接地或间接地标记所述标记分析物。在其中用发光标记物间接标记分析物的实施方案中，所述分析物可与其自身带有光标记物的次级捕捉剂结合，所述次级捕捉剂也称为检测剂(例如，第二抗体或另一种核酸)。所述次级捕捉剂在一些情况下可被称为“检测剂”。
在其他实施方案中，主题传感器可布置在微流体通道(具有1到1000微米的通道宽度)或纳米流体通道(通道宽度小于1微米)中，或者是这样的通道的内壁的一部分。所述纳米传感器可被布置在每个通道内的多个位置处，并且可在多个通道中使用。位于不同位置或不同流体通道中的纳米传感器随后可用不同的捕捉剂包被，以实现检测的多重化。
用于SAL结构1的示例实施方案：柱上盘(DoP)
如图3中所示，用于感测分析物的纳米传感器的某些实施方案，称为“柱上盘”，包括：(a)基片410；(b)信号放大层411，其包括(i)位于所述基片上的基本上连续的金属底板450，(ii)从金属底板450伸出、或从所述基片穿过底板450中的孔伸出的一个或多个立柱420，和(iii)位于立柱顶部的金属盘430，其中所述盘的边缘的至少一个部分与所述金属底板的一个部分有小的间隔；(c)与分析物特异性地结合的捕捉剂，其中所述捕捉剂连接于信号放大层的表面；其中，当分析物与捕捉剂结合时，所述纳米传感器放大来自分析物的光信号。
当立柱420从金属底板450伸出时，所述底板为B452型：在所述立柱下面展开的膜片层。当从所述基片穿过底板450中的孔伸出时，所述金属底板可以为A451型：接近立柱的底部覆盖基片表面的相当大部分。在一些情况下，纳米传感器可以是两种类型。所述盘可具有比所述立柱大(优选)、或比所述立柱小、或与所述立柱相同的横向尺寸。A451型的优点为，所述纳米传感器的高信号放大区对于待检测的分析物而言是可及的。盘横向尺寸大于立柱的结构可提供相似的优点，因此是优选的。在一些情况下，制造中的额外蚀刻进一步减小立柱大小，同时保持金属盘的大小固定(见“制造”部分)。此外，在某些实施方案中，可将纳米点添加至所述立柱的侧壁的外表面。
金属盘、立柱、和间隔的优选尺寸应当小于SAL放大的光的波长(即，亚波长)。例如，为了增强波长为400nm到1,000nm的光(可见光到近红外)，所述间隔应当为0.2nm到50nm，优选0.2到25nm，盘的平均横向尺寸为20nm到250nm，并且盘厚度为5nm到60nm，取决于在感测中使用的光波长。
用于SAL结构2的示例实施方案：具有金属底板的随机金属纳米岛
所述金属盘可以是随机金属纳米岛。在某些情况下，这样的结构具有低成本的优点。这样的结构称为“金属岛单和金属底板所成的等离子空穴(PCMM)”。PCC包括在金属膜片层(550)上的连续介电膜(521)(而不是立柱)顶部的随机金属纳米岛(530)。
用于SAL结构3的示例实施方案：D2PA
参考图6，D2PA板是具有称为“盘耦合柱上点天线阵列”(D2PA)100的表面结构的板，其包括：(a)基片110；和(b)位于所述基片的表面上的D2PA结构，其包括从基片表面伸出的一个或多个立柱115，其中所述立柱中的至少一个包括柱体120、位于立柱顶部的金属盘130、位于立柱底部的金属底板150，所述金属底板覆盖所述立柱底部附近的基片表面的相当大部分；布置在所述立柱侧壁上的金属点结构140。所述D2PA放大邻近D2PA表面的光信号。所述D2PA增强邻近D2PA表面的区域中的局部电场和局部电场梯度。
D2PA的一般形状和大小。在一些实施方案中，所述立柱的一个或多个部分的尺寸或两个部件之间的距离可以小于被放大的光的波长。例如，立柱体120的横向尺寸、柱体120的高度、金属盘130的尺寸、金属点结构140之间的任何间隙之间的距离、金属点结构140与金属盘130之间的距离可以小于被放大的光的波长。在一些实施方案中，不使用金属点，仅是所述金属盘和所述金属底板被间隙分隔开。
如图3中所示，立柱可以以阵列的形式安排在基片上。在特定情况下，阵列中最接近的立柱相隔的距离可以小于所述光的波长。所述立柱阵列可以是周期性的，也可以是非周期性的。
用于所有SAL层的金属盘的尺寸。所述盘阵列可以是周期性的430和非周期性的501。在所有实施方案中的金属盘具有选自以下形状组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。每个盘可具有与其他盘相同、相似或不同的形状。在每个立柱顶部的金属盘可具有圆形、尖端(如处于金字塔形或锥体的形式)、多边形、椭圆形、长条形、多边形的形状、其他类似形状或其组合。金属盘横向尺寸和厚度应当小于被放大的光波长。取决于放大的光波长，每个盘的横向尺寸可选自4nm到1500nm，并且盘的厚度为1nm到500nm。每个盘的形状可以与该盘布置于其上的相关立柱的顶面的形状相同、比所述立柱的顶面的形状小、或比所述立柱的顶面的形状大、或与立柱的顶面的形状不同。形状差可依赖于工作波长在0到200nm之间变化。
用于所有具有立柱的SAL层的立柱与非金属层的材料和尺寸。所述立柱阵列可以是周期性的也可以是非周期性的。具有立柱的SAL的基片的顶层上的柱体、以及用于没有立柱的SAL的非金属层可以由绝缘材料形成，但可以是半导体。用于形成立柱的示例性材料是电介质：聚合物、二氧化硅、氮化硅、氧化铪(HfO)、氧化铝(AIO)或半导体：硅、GaAs、和GaN。
一旦形成，所述立柱可具有柱形的(直的)、倾斜的、弯曲的，或其任何组合的侧壁。立柱的顶面的形状可以是圆形、尖端(金字塔体的)、多边形、椭圆形、长条形、多边形、其他类似形状或其组合。每个立柱的高度可选自5nm到300nm。
每个立柱的横向尺寸应当小于被放大的光波长，并且应当根据被放大的光波长自5nm到8,000nm选择。阵列中的所述立柱之间的间距可以是周期性或非周期性的。优选的间距应当小于被放大的光波长。对于某些应用，周期性周期是优选的，并且选择所述周期使光吸收和辐射最大化，所述光吸收和辐射是光波长依赖性的。在阵列中的邻近立柱之间的间距(跨距)可为4nm到4000nm。
用于所有SAL层的金属底板的材料和尺寸：金属底板150、450、503与金属盘协作形成光空穴。在该实施方案中，金属底板在基片上定义一金属层，对每个立柱有一个孔。孔的大小应当小于被放大的光波长。金属底板的厚度选择为1nm到2000nm，其优选厚度在50nm-200nm的范围内。金属底板的材料可选自与用来形成上述金属盘的相同的材料组，但是对于给定的D2PA结构，用于形成金属底板的材料与用来形成盘的材料可以相同或不同。任一前述权利要求的D2PA纳米器件，其中所述立柱具有柱形的、倾斜的、或弯曲的侧壁表面。
用于具有点的所有SAL层的金属点的材料和尺寸。布置在所述金属盘与所述金属底板之间的每个立柱的侧壁上的金属点140具有大致为球形、盘状、多边形、长条形的形状、其他形状或其组合。立柱上的金属点140可以全部具有大致相同的形状，或可以个别地变化。所述金属点的尺寸应当小于被放大的光波长，并且依赖于放大的光波长，优选在3nm到600nm之间，并且可以在三个维度上不同。在一些实施方案中，相邻金属点之间的间隙、以及盘与邻近金属点之间的间隙在0.5nm到200nm之间。对于许多应用，小的间隙是优选的，以实现更强的信号增强。立柱上的每个金属点之间的间隙可以变化。
用于所有SAL的金属材料：用于金属盘、底板、和点的金属材料选自(a)单元素金属，如金、银、铜、铝、镍；(b)单种金属的单分子层和/或多层的组合；(c)金属合金；(d)半导体，(e)任何其他在被放大的光波长下产生等离子体的材料，或(f)(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的任何组合。每个金属盘、底板和点使用彼此相同的金属材料，或使用不同的金属材料。
用于所有SAL的基片。基片110、410、504为D2PA物理支持，并且可以为任何材料，只要它不产生对D2PA放大的化学和电磁干扰即可。所述基片还可以处于许多种不同的形式：薄膜(膜)和厚板，柔性和刚性。所述基片可由电介质(例如SiO2)制成，虽然可以使用其他材料，例如硅、GaAs、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。
优选的D2PA实施方案。D2PA的关键元件的所有尺寸均小于所述光的波长。所述金属材料选自金、银、铜、和铝及其合金。在配置为用于增强波长约800nm的光的一个实施方案中，所述D2PA纳米结构可以包括：周期性的非金属(例如，电介质或半导体)立柱阵列(200nm跨距和约100nm直径)、每个立柱顶部的金属盘、立柱底部的金属底板、随机定位于立柱壁上的金属纳米点、以及这些金属部件之间的纳米间隙。所述金属盘具有约120nm直径，且略大于立柱的直径，因此具有突出部分。所述盘阵列和底板(两者均为40nm厚)形成一3D空穴天线，其可高效地竖向和横向捕获激发光。所述立柱的高度为约50nm，因此所述金属盘与所述金属底板之间的最近距离为约10nm。该最近距离，常称为“纳米间隙”，优选尽可能地小，以实现更高的增强。每个立柱具有约3到30个纳米点，取决于立柱的几何形状和制造加工条件；并且立柱的密度为2.5×109个立柱/cm2。同样，在一些实施方案中，不使用金属点，所述金属盘和所述金属底板仅被间隙所分隔开。
其他SAL层。
所述感测放大表面的另一个实施方案包括一个或多个位于基片上的金属盘，并且盘的平均横向尺寸为20nm到250nm，两个邻近的盘之间的间隙为至少0.5到30nm。
捕捉剂及其附接
将针对目标分析物的捕捉剂16直接地固定、或通过薄的分子粘附/间隔层(MAL)16固定在信号放大层(SAL)12上。
在一个实施方案中，捕捉剂16主要附接在高电场和/或高电场梯度的区域，即，具有金属材料的尖锐边缘和小间隙的区域。实现这一点的一种方法在于(a)使用捕捉剂(用于直接附接)中或MSL中的末端官能团，该末端官能团仅附接金属，和(b)选择性地掩蔽具有低局部电场或低局部电场梯度的金属表面(如在2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/801,424、和2014年3月15日提交的名称为“Methodsforenhancingassaysensingpropertiesbyselectivelymaskinglocalsurfaces”的共同未决PCT申请中所述，通过提述将这些申请并入本文。)
涂覆在SAL12外表面上的分子粘附/间隔层(MAL)14(SAL的内表面是与基片表面接触的表面)发挥以下两种作用或其中之一：(1)提供良好的粘附以便与捕捉剂结合，以及(2)作为间隔物，控制SAL中的金属与信号产生分子之间的距离以优化信号放大。一个优选的SAL实施方案是，SAL的一个、几个或所有关键金属和介电部件的尺寸均小于感测中的光的波长。
分子间隔物厚度的实施例：将金属与产生光信号的分子分开的间隔物(即，MAL)的厚度对于荧光而言为1nm到50nm(对于约800nm光波长优选为5nm)；并且对于表面增强拉曼散射(SERS)而言为1到15nm。所述厚度依赖于光的波长。
如图6中所示，纳米器件100包括分子粘附层160，其覆盖下方的D2PA的金属表面的至少一部分。所述分子粘附层具有两个目的。首先，所述分子粘附层充当间隔物。为了最佳的荧光，不能使发光标记物(例如，荧光团)太靠近金属表面，因为非辐射过程将使荧光淬灭。发光标记物也不能离开金属表面太远，因为这将减弱放大。理想的是，所述发光标记物应当距金属表面一段的最佳距离。其次，分子粘附层为捕捉剂附接到纳米器件上提供了良好的粘附。所述良好的粘附是通过分子粘附层的分子中的反应性基团实现的，所述反应性基团在一侧与捕捉剂具有高亲和力，在另一侧与所述纳米器件具有高亲和力。
分子粘附层(MAL)160可以有许多不同的构造，包括(a)交联分子的自组装单分子层(SAM)，(b)多分子层薄膜，(c)(a)和(b)的组合，和(d)捕捉剂本身。
在MAL的实施方案(a)中，其中分子粘附层160是交联分子或配体的自组装单分子层(SAM)，SAM的每个分子由三部分组成：(i)头部基团(headgroup)，其与纳米器件的表面具有特异性的化学亲和力，(ii)末端基团，其与捕捉剂具有特异性的亲和力，和(iii)分子链，它是连接头部基团与末端基团的长分子系列，并且其长度(该长度决定金属与捕捉剂间的平均间距)可以影响纳米器件的光放大。这样的SAM如图3所示。
在许多实施方案中，附接在金属表面的头部基团属于硫基，即-SH。附接于金属表面的头部基团的其它的选择是羧酸(-COOH)、胺(C＝N)、硒醇(-SEH)或膦(-P)。其他的头部基团，如硅烷(SiO)，可以使用，如果要在电介质材料或半导体(如硅)上涂覆单层的话。
在许多实施方案中，末端基团可包括各种捕捉剂反应性基团，包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤素取代的苯酚酯、五氟苯酚酯、硝基取代的苯酚酯、酸酐、异氰酸盐或酯、异硫氰酸盐或酯、亚氨酸酯、马来酰亚胺、碘乙酰基、酰肼、醛、或环氧化物。其他合适的基团在本领域是已知的，并可例如Hermmanson,“BioconjugateTechniques”AcademicPress,2ndEd，2008中所描述的。末端基团可在它们组装到纳米器件表面之后化学附接到分子链，或在它们在表面上组装之前与分子链一起合成。
其他的末端基团是羧基-COOH基团(用EDC/NHS活化以与配体上的–NH2形成共价结合)；胺，-NH2，基团(通过用EDC/NHS活化的酰胺键与配体上的-COOH形成共价结合)；环氧，与–NH2反应(不需要交联剂的配体)；醛，(与配体上的–NH2反应而不需要交联剂)；硫醇，-SH，(通过SMCC类生物缀合手段连接配体上的–NH2)；以及谷胱甘肽，(GHS)(理想地用于捕捉GST标记蛋白质)。
分子链可以是碳链，可以调整其长度来改变发光标记物与金属之间的距离，以便优化光信号。在一个实施方案中，如将在例子中详细描述的，SAM层是二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)，其头部基团是通过硫金键与金表面结合的–SH，而末端基团是结合捕捉剂的伯胺位点的NHS酯，以及长度1.7纳米的分子烷烃链。
在许多实施方案中，连接头部基团和末端基团的分子链是烷烃链，其仅由碳原子和氢原子组成，所有的键均是单键，并且碳原子不联合成环状结构，而是形成简单的线性链。分子链的其它选择可以是来自聚合物，如聚(乙二醇)(PEG)、聚(乳酸)(PLA)等等的配体。分子链与头部基团所附接的金属表面以及末端基团所附接的捕捉剂均无化学反应性。链的长度，其决定分析物与纳米器件表面的距离，可以加以优化以获得最大的信号放大。如下面将更详细地描述的那样，分子链可具有例如0.5纳米到50纳米的厚度。
在主题纳米传感器中使用的分子粘附层可以由这样的自组装单分子层(SAM)组成，其一侧牢固地附接到金属(通过例如硫原子)并且在另一侧(外部)以捕捉剂反应性基团为末端，所述捕捉剂反应性基团例如胺反应性基团、硫醇反应性基团、羟基反应性基团、咪唑反应性基团和胍基反应性基团。单层可具有疏水性或亲水性表面。最常用的捕捉剂反应性基团是NHS(其为胺反应性)和马来酰亚胺(其为巯基反应性)，但许多其他的也可使用。
在一些实施方案中，分子粘附层可以是烷硫醇的自组装单分子层(见，例如，KatoJournalofPhysicalChemistry2002106:9655-9658)，聚乙二醇硫醇(见，例如，ShenoyetalInt.J.Nanomedicine.20061:5157)，芳香硫醇，或某些其他的以硫醇为末端的链。
硫醇基可以使用的原因是(a)硫醇硫与金及其他金属相互作用以形成牢固和稳定的键(见，例如，Nuzzoetal.,J.AM.Chem.Soc.1987109:2358-2368)；和(b)范德华力使烷烃与其他链堆积，导致SAM自发组织(见，例如，Loveetal.，Chem.Rev.2006105:1103-1169)。此外，末端基团可供用于直接附接捕捉分子或进一步的化学修饰。
在一些实施方案中，可以使用烷硫醇。据估计，在一层拥挤的烷硫醇单分子层中有4×1014个烷硫醇分子/cm2(Nuzzo等人，J.Am.Chem.Soc.1987109:733-740)，这大约相当于下面的表面上的每个金原子对应一个烷硫醇键。由烷硫醇组成的自组装单分子层可通过将金基片浸泡在烷硫醇溶液中来产生(见，例如，Leeetal.Anal.Chem.2006,78:6504-6510)。金与还原的烷硫醇(-SH基团)和烷基二硫化物(-S-S-)均能够反应(见，例如，Loveetal.Chem.Rev.2005,105:1103-1169)。
一旦制得聚乙二醇硫醇或烷硫醇的自组装单分子层膜，则有多种策略可以用来将捕捉剂连接到自组装单分子层。在一个实施方案中，捕捉剂，如链霉亲和素(SA)，可以附接到SAM，用来固定生物素化捕捉剂。
在一个实施方案中，链霉亲和素(SA)本身可以用作SAM的功能基团(如末端基团)，以交联与SA具有高亲和力的捕捉剂分子，如生物素分子，包括肽、寡核苷酸、蛋白质和糖。
亲合素、链霉亲合素的功能基团与生物素基团具有很高的亲和力，形成亲合素-生物素。这样的高亲和力使亲合素/链霉亲合素能够良好地充当功能基团、且生物素基团充当互补功能基团结合。这些功能基团可以将分子粘附层结合到纳米器件、在分子粘附层和捕捉剂之间结合并将发光标记物结合到次级捕获剂。在一个实施方案中，含巯基反应性基团的分子粘附层可通过将金表面连接到胺末端的SAM，并使用磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸(磺基SMCC)进一步修饰所述胺基团产生马来酰亚胺活化表面。马来酰亚胺活化的表面是反应性硫醇基团，而且可用于连接含有硫醇(例如半胱氨酸)基团的捕捉剂。
在另一个实施方案中，可以通过例如在琥珀酰亚胺基烷基二硫化物，诸如二硫代双-磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯(DSP)或二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)的1-10mM溶液中浸泡金基片来生成含有胺反应性基团(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))的分子粘附层(参见例如PeelenetalJ.ProteomeRes.20065:1580-1585和StorrietalBiosens.Bioelectron.199813:347-357)。
在另一个实施方案中，可使用以羧基为末端的SAM诸如12-羧基-1-十一烷硫醇来生成含有胺反应性基团(NHS)的分子粘附层。在这种情况中，可以在1-乙基-3(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl(EDC)存在下将SAM的表面连接于NHS以生成与伯胺形成稳定酰胺键的中间体(参见例如JohnssonetalAnal.Biochem.1001,198:268-277)。
在另一个实施方案中，分子粘附层可含有蛋白A，蛋白A以高亲和力结合IgG，其它免疫球蛋白形式(例如IgE)的Fc区。
在另一个实施方案中，可以通过与具有羧基末端的SAM与1,1’-羰基二吲哚(CDI)反应来添加吲哚基团(其与胺也有反应性)。
在另一个实施方案中，可使用具有醛末端的链烷硫醇单层来固定化蛋白质和具有胺为末端的DNA寡核苷酸二者，而且可以在氮川三乙酸(NTA)修饰的金表面上固定化带his标签的融合蛋白。
可以将硫醇反应性基团连接于合成的DNA和RNA寡核苷酸，包括适体；具有硫醇末端的适体能容易地商业合成。也可以将硫醇反应性基团连接于含有半胱氨酸基团的蛋白质，例如抗体。可以将硫醇化分子附接于马来酰亚胺修饰的表面(参见例如SmithetalLangmuir2002,19:1486-1492)。在某些情况下，可以使用插在末端Cys后面的氨基酸间隔物(例如Ser-Gly-Ser-Gly)，其相对于缺乏间隔物的肽提高结合的量。对于寡核苷酸，可使用烷烃间隔物。按照相同方式可以将合成的含有末端硫醇的碳水化合物与金拴系。
胺反应性基团能与伯胺(诸如赖氨酸残基上的游离胺)形成键。除蛋白质以外，胺反应性表面还可用来固定化其它生物分子，包括含有赖氨酸残基的肽和合成具有胺末端的寡核苷酸。
在MAL(b)的实施方案中，其中分子粘附层160是多分子层薄膜，该分子可以通过物理吸附或强结合而涂覆在D2PA纳米器件上。在一个例子中，可以将蛋白A涂覆在D2PA纳米器件表面的全部或部分区域上，在这种情况下，蛋白A可以通过物理吸附过程沉积，具有4纳米到5纳米的厚度。在另一个例子中，该层可为聚合物的薄膜，所述聚合物如聚乙二醇(PEG)，其在一端具有功能性头部基团，如巯基(-SH)。该功能PEG分子层与D2PA纳米器件的表面形成强键。PEG分子层的厚度可以通过改变PEG聚合物链的长度来调整。另一个例子是无定形的SiO2薄膜，其使用物理或化学沉积方法(例如蒸镀、溅射、溶胶-凝胶法)附接到D2PA纳米器件表面。在沉积过程中可以精确控制SiO2薄膜的厚度。
在MAL(c)的实施方案中，其中分子粘附层160是多分子层薄膜和SAM的组合，可以首先沉积SAM层，再沉积多分子层。
在一个例子中，分子粘附层可首先含有链霉亲合素单层，接着是与链霉亲合素具有高结合亲和力的分子的其它层，所述分子诸如生物素、生物素化分子，包括肽、寡核苷酸、蛋白质、和糖。
在一个例子中，分子粘附层可含有SAM层二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)(DSU)和蛋白A层。DSUSAM层通过硫-金键结合纳米器件的金属表面，而且具有NHS-酯末端基团，后者结合蛋白A上的伯胺位点。在特定情况中，捕捉抗体通过它们的Fc区与DSU顶上的此类蛋白A双层接合。蛋白A能确保抗体的取向，以改善捕捉效率。
在MAL(d)的实施方案中，其中分子粘附层160本身是捕捉剂，捕捉剂具有这样的头部基团，该头部基团与主题纳米器件(即D2PA)的金属或立柱部侧壁具有高亲和力。常用头部基团之一是硫醇反应性基团。硫醇反应性基团可以连接于合成的DNA和RNA寡核苷酸，包括适体；具有硫醇末端的适体能容易地从商业渠道获得。硫醇反应性基团也可以连接于含有半胱氨酸基团的蛋白质，例如抗体。使用MAL自身作为捕捉剂的另一个例子是抗体片段层，例如半IgG、Fab、F(ab’)2、Fc。抗体片段通过位于铰链区中的硫醇-内肽酶直接与金属表面接合。该实施方案在图8中示出。在这个实施方案中，核酸包括直接结合到纳米器件的头部基团。其余的步骤图7中描述的那样进行。
分子吸附层厚度应在0.5纳米到50纳米范围内，例如，1纳米到20纳米。分子粘附层的厚度可以针对特定的应用来优化，通过例如增加或减少使用的SAM的接头(烷烃或聚(乙二醇)链)的长度来优化。假设接头中的每个键为0.1到0.15纳米，那么最优的SAM可包含5至50个碳原子(例如，在某些情况下，10至20个碳原子)的聚合物接头。
可通过捕捉剂与分子粘附层表面上的捕捉剂反应性基团之间的反应将捕捉剂附接到分子粘附层，来制作纳米传感器。
可以通过任何方便的方法，如上面所讨论的那些方法，来将捕捉剂附接到分子粘附层。在许多情况下，可通过高亲和力强相互作用，如生物素和链霉亲和素之间高亲和力强相互作用，来将捕捉剂附接于分子粘附层。因为链霉亲和素是蛋白质，可以使用任何上述的胺反应性方法将链霉亲和素连接到分子粘附层的表面。可以通过将生物素化的捕捉剂点样到链霉亲和素上而将它们固定。在其它实施方案中，可以通过形成强键的反应，例如蛋白质的赖氨酸残基中的胺基团或胺化寡核苷酸与NHS酯在捕捉剂和分子粘附层之间产生酰胺键的反应，将捕捉剂附接于分子粘附层。在其它实施方案中，可以通过蛋白质的半胱氨酸残基中的巯基或巯基-寡核苷酸与分子粘附层上的巯基反应性马来酰亚胺之间的反应将捕捉剂附接于分子粘附层。将捕捉剂与各种反应性基团连接的规程是本领域众所周知的。
在一个实施方案中，捕捉剂可以是捕捉蛋白的核酸，或捕捉剂可以是捕捉核酸(例如，DNA，RNA)的蛋白质。核酸能经由序列特异性(紧密)或非序列特异性(松散)的键来结合蛋白。
在某些情况下，可以使用如下方法制造主题纳米器件：(a)在基片的顶面上成型至少一个突出部；(b)沉积顶面的金属材料层；(c)让沉积在立柱部顶上的金属材料形成盘，沉积在立柱部底部的金属材料形成金属底板，沉积在侧壁上的金属材料形成至少一个金属点结构；而且，如上所述，(d)在沉积的金属材料的顶上沉积分子粘附层，其中分子粘附层覆盖金属点结构、金属帽和/或金属底板的至少一部分，其中分子粘附层的外表面包括捕捉剂反应性基团。
此外，(a)中的成型包括直接压印(模压)材料，所述材料的电性质可以是为电介质或半导体，并可以是聚合物或由单体或低聚物固化形成的聚合物，或无定形无机材料。该材料可以是厚度从10纳米到10毫米的薄膜，或带有基片的多层材料。压印(即模压)意指：模具在其表面上具有结构，将模具压入要压印的材料中，在该材料中形成该结构的反向结构(inverse)。基片或顶上的压印层可以是塑料(即聚合物)，例如聚苯乙烯(PS、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、其他的丙烯酸树脂和相似材料。压印可以使用滚筒刻印机通过筒对筒的技术完成。这样的处理，具有很大的经济优势，从而降低成本。
纳米传感器的制造
通过使用纳米压印技术，包括滚筒纳米压印或卷对卷纳米压印，可在大面积上以高生产量和低成本制造纳米传感器。在滚筒纳米压印中，或者模具或者基片是卷的形式。在卷对卷纳米压印中，模具和基片两者都为卷。基于滚筒技术的纳米压印是指滚筒纳米压印和卷对卷纳米压印。
图10显示了示例性制造方法1，直接立柱形成，其包括：1.准备基片610；2.通过纳米压印光刻直接成型立柱阵列620；3.沉积金属以形成顶部金属盘630和金属底板651。在所述方法的某些实施方案中，可在立柱侧壁上形成纳米点。所述纳米压印可以是卷纳米压印或卷对卷纳米压印。所述基片可以是非金属柔性薄膜、或在表面上具有薄金属膜。
图11显示了示例性制造方法2，通过剥离形成立柱-盘，其包括：1.准备基片710，其被金属层752覆盖；2.进行光刻(例如，纳米压印光刻)以成型光刻胶660，蚀刻掉剩余的光刻胶以暴露出基片上的金覆盖层752；3.相继沉积介电材料和金属以形成介电立柱820和金属顶盘730；4.在剥离光刻胶760之后，可进一步收缩介电立柱720以增强性能。
图12显示了示例性制造方法3，通过蚀刻形成立柱，其包括：1.准备基片810，其被厚金属层852和另一个介电层821覆盖；2.进行光刻(例如，纳米压印光刻)和剥离以形成Cr掩模图案阵列880；3.通过Cr掩模880，将顶部电介质蚀刻成立柱阵列820；4.最后进行金属沉积，同时形成顶部金属盘830和金属底板851。
压印模具材料：模具材料可以是硬质的(硅、二氧化硅等)、或软质的(PDMS、PFPE等)，只要它对沉积的金属膜具有低粘附即可，这是为了易于脱模；
DoP的优点之一在于，它可通过确立的标准制造工艺以大规模制造来实现。具体而言，借助于纳米压印技术的成型使得在大面积上快速和低成本地制造DoP成为可能。DoP结构制造中的关键创新点包括：
基片对DoP顶部的纳米结构提供机械支持。DoP的优点之一在于，它在硬基片(诸如SiO2覆盖的硅基片、二氧化硅基片、蓝宝石基片)和软基片(诸如塑料基片)上均适合制造。DoP对软基片的相容性的重要性包括：(1)塑料基片是柔性的，其适合于最先进的大面积成型技术，诸如滚筒压印技术。这对于扩大产品产量和降低制造成本而言是关键特征。另外，基片的柔性使得在制造操作和实际使用过程中对于产品保护的要求降低。(2)大多数塑料基片是天然介电材料，不要求在金属底板沉积之前进行额外介电层涂覆过程。(3)通过使用透明塑料基片，塑料基片的高透明性扩宽了DoP在光学应用中的能力。
用于DoP基片目的的塑料材料可以是多种多样的聚合物，包括(但不限于)聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰亚胺(PI)、和聚醚醚酮(PEEK)。
对于大规模DoP制造，使用金属溅射和电子束蒸镀来沉积金属底板可能不是高效的。实现大面积金属涂覆的一个可行途径是金属电镀。它只需要预先沉积薄的种子层。在电镀过程中，将目标物(DoP基片)浸入电解液中并且连接于阴极，而阳极连接于形成底板的小片纯金属。电镀可促进DoP制造中低成本且快速的金属涂覆。
在小规模制造中，考虑到基片是圆形的，可将压印光刻胶旋涂在硬基片上。在大规模制造中，这样的旋涂需要很大的旋转器和强力电动机来驱动。相反，可通过刮刀涂覆、喷雾涂覆或卷对卷(R2R)涂覆将压印光刻胶涂覆在大面积基片上。具体而言，喷雾涂覆应用小喷嘴将光刻胶液滴均匀地印在基片表面上。卷对卷涂覆将光刻胶从光刻胶滚筒转移到在目标滚筒上的DoP基片上。这种设置可直接集成到滚筒压印系统中。
介电立柱和顶盘形成可通过蒸镀实现。其他低温沉积工艺也可能凑效，只要它不改变光刻胶轮廓即可。
最后的立柱大小调整过程是可选的。其目的是精细调整介电立柱和顶部金属盘的相对位置。有两个途径实现大小调整：通过干蚀刻和通过湿蚀刻。在干蚀刻中，必须将气体压力设置为高，以便诱导等向性蚀刻。对于这两种蚀刻方法，通过蚀刻时间来精确地控制大小收缩。取决于立柱的介电材料，蚀刻气体配方(对于干蚀刻)或蚀刻化学品(对于湿蚀刻)可以不同。
PCMM的制造。PCMM结构的制造工艺如下(在这里金用作例子，每层的厚度不必是严格的，而取决于实际应用)：首先，通过电子束蒸镀将60nm厚的金膜沉积在涂覆有钛的载玻片上，随后沉积另一个钛涂层作为粘附层。通过使用SiH4和N2O的混合物，通过等离子体增强化学气相沉积在250℃下在金底板上沉积18nm厚的SiO2间隔层。然后，通过两步法生长金岛，所述两步法包括溶液相接种和生长：将样品浸入3mMHAuCl4溶液(水)中。每1mL的总体积加入20μLNH4OH，同时迅速振摇一分钟。通过两轮清水浴去除未结合的金离子之后，将样品浸入1mMNaBH4溶液中持续1分钟并完成播种步骤。对于生长步骤，将样品浸入浓度为750μM的HAuCl4和NH2OH的1:1水溶液中，均匀振摇5分钟，随后进行温育10分钟的过程以完成生长步骤。对样品再次进行清水浴，用氮气吹干。此时，PCMM结构已告完成。整个过程由图16所示，某些结果显示在图17中。
随机岛的大小可通过调整氯金酸(HAuCl4)和羟胺(NH2OH)的浓度来控制。对于越大的岛尺寸，其间将有越小的间隙。例如，通过调整氯金酸(HAuCl4)的浓度，可以实现不同的金属岛尺寸(从而实现不同的间隙)。
对于金岛技术而言，还有可能制作纳米压印模具，进而使用纳米压印模式来进行制造。
系统
还提供了系统，其包括：主题纳米传感器、用于纳米传感器的保持件、从标记物(即发光标记物)诱发光信号的激发源；和适于读取光信号的读取器(例如光检测器、CCD照相机、CMOS照相机、分光计或能够产生纳米传感器的表面的二维光谱图的成像装置)。容易想到的是，该系统还可以具有放大、过滤、调节、控制和存储来自读取器的电信号并控制读取器和样本保持件的位置的电子器件、计算机系统、软件和其它硬件。样品保持件的位置可以沿一个或所有三个正交方向移动，以容许读取器扫描来自样品的不同位置的光信号。
激发源可以是(a)光源，例如，波长适于激发特定荧光团的激光器和带有用于选择波长的滤光器的灯或发光二极管；或(b)电源，用于提供电流，以从纳米传感器激发出光(当使用电致化学发光标记物时可采用)。图2中示出了一个示例性系统。参考图2，激发系统可以包括激光器、激光光学器件(包括扩束器、透镜、反射镜和激光带通滤波器)、读取器(例如，具有CCD传感器的分光计)，其它光学器件(例如，长波通滤波器、分束器和透镜)，以及用于纳米传感器的保持件。在某些情况下，保持件可以在具有X－Y和Z运动的机动台上。
在特定情况下，激光带通滤波器过滤掉波长与激光器不同的光，且长波通滤波器将会仅允许从光学可检测标记物发出的光穿过。由于不同的荧光标记物吸收处于不同的光谱范围的光，应选择荧光标记物使其峰值吸收波长与激光激发波长匹配，以达到最佳的量子效率。在许多实施方案中，从纳米传感器上的荧光标记物发出的光信号的波长比激光器波长长至少20纳米。因此应该调谐纳米传感器的等离激元共振以覆盖荧光标记的吸收峰、发射峰和激光激发波长。在一些实施方案中，激发和荧光的波长范围可以从100纳米至20000纳米。优选的范围是从300纳米到1200纳米。600-850纳米的范围是优选的，原因是背景噪声低。
显然还有其他途径来实现光激发和读取功能。
从上文可以显见，某些纳米传感器可以以多孔格式实现。在这些实施方案中，可移动平台，使得读取器可独立地读取来自多孔板每一个孔的光信号。
测定方法
所述主题纳米传感器可用来检测样品中的分析物。这种方法可包括：(a)使包含分析物的样品与纳米传感器在适合于样品中的分析物与捕捉剂特异性结合的条件下接触；和(b)读取来自所述纳米传感器的光学可检测信号，其中所述光学可检测信号指示所述分析物与所述捕捉剂结合。在上述步骤(a)中，在结合至捕捉剂之前，可用发光标记物标记所述分析物，或者不予标记(也被称为直接标记或间接标记)。在其中在结合之前未用发光标记物标记分析物的实施方案中，所述分析物在结合至捕捉剂之后可与自身带有光学标记的第二捕捉剂(即，检测剂)(例如，第二抗体或另一种核酸)、标记的次级捕捉剂或标记的检测剂结合(这种过程也被称为分析物的间接标记)。在使用间接标记进行的感测中，未与分析物结合的标记的二级捕捉剂在上述读取步骤(b)之前被去除。在使用直接标记进行的感测中，未与分析物结合的光学标记物在上述读取步骤(b)之前被去除。
在读取测定上的发光标记物的过程中，对发光标记物施加激发(光、电、化学或其组合)，并检测光的特性，包括强度、波长、和位置。
在某些实施方案中，该方法包括将捕捉剂附接于主题纳米器件的分子粘附层以生成纳米传感器，其中该附接是通过如上文描述的捕捉剂与分子粘附层上的分子中的捕捉剂反应性基团的化学反应进行的。接下来，该方法包括使含有靶分析物的样品与纳米传感器接触，该接触是在适合于特异性结合的条件下进行的，靶分析物特异性结合捕捉剂。这个步骤之后，该方法包括去除任何未结合于捕捉剂的靶分析物(例如通过在结合缓冲液中清洗纳米传感器的表面)；然后，添加缀合有光学可检测标记物的检测剂以检测靶分析物。去除未结合靶分析物的检测剂之后，可以将纳米器件与读取系统一起使用，以读取来自保持结合于纳米传感器的检测剂的光信号(例如波长在300纳米至1200纳米的范围中的光)。容易想到的是，该方法进一步包括用发光标记物标记靶分析物。这可以在接触步骤之前或之后进行，即在分析物结合于捕捉剂之后。在某些实施方案中，在使分析物与纳米传感器接触之前标记分析物。在其它实施方案中，在分析物结合纳米传感器的捕捉剂之后标记分析物。而且，如上文提到的，可以直接标记分析物(在这种情况中，可以在该方法开始时将分析物强连接于发光标记物)或间接标记分析物(即通过使靶分析物结合第二捕捉剂，第二捕捉剂特异性结合靶分析物且连接有发光标记物，例如经过标记的第二抗体或经过标记的核酸)。在一些实施方案中，该方法可包括在接触步骤(b)之前封闭纳米传感器，由此防止捕捉剂非特异性结合非靶分析物。
适合于特异性结合和靶分析物特异性结合捕捉剂的条件包括恰当的温度、时间、溶液pH水平、环境光水平、湿度、化学试剂浓度、抗原-抗体比、等。
在某些实施方案中，可使用核酸捕捉剂来捕捉蛋白质分析物(例如DNA或RNA结合蛋白)。在备选实施方案中，可使用蛋白质捕捉剂(例如DNA或RNA结合蛋白)来捕捉核酸分析物。
样品可以是液体样品，而且，在某些实施方案中，样品可以是来源于细胞、组织、或体液的临床样品。感兴趣体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。
测定的一些步骤显示于图7和8。捕捉剂和它们的结合配偶(包括分析物)之间的分子相互作用的方法的通用方法是本领域公知的(参见例如Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,FirstEdition(1988)ColdspringHarbor,N.Y.和Ausubeletal.,ShortProtocolsinMolecularBiology,3rded.,Wiley&Sons,1995)。图4和5中显示的方法是例示性的；那些图中描述的方法并非实施测定法的唯一方式。
一种例示性抗体结合测定法的一些步骤显示于图7。在这种测定中，依照上文描述的方法将纳米器件100连接于抗体以生成纳米传感器200，其包含连接于纳米传感器的分子粘附层的抗体202。在生成纳米传感器200之后，在适合于特异性结合的条件下使纳米传感器与含有靶分析物(例如靶蛋白质)的样品接触。抗体202特异性结合样品中的靶分析物204。在自纳米传感器清洗掉未结合的分析物之后，在适合于特异性结合的条件下使纳米传感器与用发光标记物208标记的第二抗体206接触。在自纳米传感器去除未结合的第二抗体之后，可以读取纳米传感器以鉴定和/或定量初始样品中分析物204的量。
一种例示性核酸结合测定的一些步骤显示于图3。在这种测定中，依照上文描述的方法将纳米器件100连接于核酸(例如寡核苷酸)以生成纳米传感器300，其包含连接于分子粘附层的核酸分子302。在生成纳米传感器200之后，使纳米传感器与含有靶核酸304的样品在适合于靶核酸504和核酸捕捉剂302特异性杂交的条件下接触。核酸捕捉剂304特异性结合样品中的靶核酸304。在自纳米传感器清洗掉未结合的核酸之后，在适合于特异性杂交的条件下使纳米传感器与用发光标记物508标记的次级核酸306接触。在自纳米传感器去除未结合的次级核酸之后，可以读取纳米传感器以鉴定和/或定量初始样品中核酸304的量。
可使用主题装置实施的增强型DNA杂交测定的一个例子是夹心杂交测定。捕捉DNA为在其3’端用硫醇功能化的单链DNA。检测DNA为在其3’端用荧光标记物(例如IRDye800CW)功能化的单链DNA。捕捉和检测DNA均具有20bp的长度。它们是以不同序列合成的，与靶定DNA的不同区域形成互补结合。首先，通过硫-金反应在D2PA纳米器件的金属表面上固定化捕捉DNA。然后，将靶定DNA添加至纳米器件，以供捕捉DNA捕捉。最后，将经过荧光标记的检测DNA添加至纳米传感器以检测固定化的靶定DNA。在清洗掉未结合的检测DNA之后，测量从纳米器件表面发出的荧光信号，用于检测和定量靶DNA分子。
在图4和5中显示的实施方案中，可以使用次级捕捉剂(即“检测剂”)来检测结合的分析物，次级捕捉剂可缀合有荧光团或催化合成可目测或用成像系统检测的生色化合物的酶。在一个实施方案中，可以使用辣根过氧化物酶(HRP)，它能将生色底物(例如TMB、DAB、或ABTS)转变成有色产物，或者，在使用化学发光底物时生成冷发光产物。在特定实施方案中，由标记物生成的光信号具有300纳米至900纳米范围的波长。在某些实施方案中，标记物可以是电化学发光的，因此，可以通过给传感器提供电流来生成光信号。
在一些实施方案中，次级捕捉剂(即检测剂)，例如第二抗体或次级核酸，可以连接有荧光团，例如呫吨染料，例如荧光素和罗丹明染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常以其缩写FAM和F指称)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE或J)，N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)，6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)，5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)，6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)，和罗丹明110；花青染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙啡啶染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲川染料，例如花青染料，诸如Cy3、Cy5、等；BODIPY染料和喹啉染料。主题应用中通常使用的具体的感兴趣的荧光团包括：芘，香豆素，二乙基氨基香豆素，FAM，氯三嗪基荧光素，荧光素，R110，曙红，JOE，R6G，四甲基罗丹明，TAMRA，丽丝胺，ROX，萘荧光素，德克萨斯红，萘荧光素，Cy3，和Cy5，IRDye800，IRDye800CW，Alexa790，Dylight800，等。
初级和次级捕捉剂应当以高特异性亲和力结合靶分析物。然而，初级和次级捕捉剂不能是相同分子，因为它们需要结合抗原中的不同位点。一个例子是抗人β-淀粉状蛋白捕捉抗体6E10和检测G210，在这种情况中6E10只结合人β-淀粉状蛋白肽上的第10个胺位点，而G210只结合第40个胺位点。捕捉剂和次级捕捉剂彼此不反应。另一个例子使用家兔抗人IgG作为捕捉抗体和驴抗人IgG作为检测抗体。因为捕捉和检测剂来源于不同宿主物种，所以它们彼此不反应。
用荧光团标记物蛋白质(例如第二抗体)和核酸的方法是本领域公知的。化学发光标记物包括吖啶酯和磺酰胺，鲁米诺和异鲁米诺；电化学发光标记物包括钌(II)螯合物，其它的也是已知的。
应用
本主题方法和组合物可用于多种应用，此类应用一般是分析物检测应用，其中至少定性地(即使不是定量地)检测给定样品中特定分析物的存在。用于进行分析物检测测定的方案是本领域技术人员公知的，不需要在本文中铺陈。通常，怀疑含有感兴趣分析物的样品与主题纳米传感器的表面在足以令分析物结合其相应捕捉剂(捕捉剂拴系于传感器)的条件下使接触。捕捉剂对靶定的感兴趣分子具有高特异性亲和力。此亲和力可以是抗原-抗体反应，其中抗体结合抗原上的特定表位，或者可以是两条或更多条互补核酸链之间的序列特异性的DNA/RNA或DNA/RNA杂交反应。因此，如果感兴趣分析物存在于样品中，那么它很可能结合于传感器上捕捉剂的部位，并在传感器表面上形成复合物。就是说，捕捉到的分析物固定化在传感器表面。在去除未结合的分析物之后，接下来检测传感器的表面上这种结合复合物的存在(即固定化的感兴趣分析物)，例如使用经过标记的次级捕捉剂。
感兴趣的特定分析物检测应用包括杂交测定，其中采用核酸捕捉剂，和蛋白质结合测定法，其中采用多肽，例如抗体。在这些测定法中，首先制备样品，并在样品制备后，在特异性结合条件下使样品与主题纳米传感器接触，由此在与附接于传感器表面的捕捉剂互补的靶核酸或多肽(或其它分子)之间形成复合物。
在一个实施方案中，捕捉寡核苷酸为合成单链DNA，长20-100个碱基，一端硫醇化。这些分子固定化在纳米器件的表面上，用于捕捉具有与固定化的捕捉DNA互补的序列的靶定单链DNA(其长度可为至少50bp)。在杂交反应之后，加入其序列与靶定DNA的未被占据的核酸互补的检测单链DNA(可以长20-100bp)以与靶杂交。检测DNA的一端缀合有荧光标记物，其发射波长在纳米器件的等离子激元共振以内。因此，通过检测从纳米器件表面发出的荧光发射，能精确检测和定量靶单链DNA。捕捉和检测DNA的长度决定解链温度(在解链温度以上核苷酸链会分开)、错配的程度(链越长，相同那个错配对数的情况下，错配比例越低)。选择互补结合的长度的关注点之一取决于最小化错配同时保持尽可能高的解链温度的需求。另外，确定杂交长度的总长度以实现最佳信号放大。
主题传感器可用于诊断疾病或状况的方法，其包括：(a)从怀疑具有疾病或状况的患者获得液体样品，(b)使样品与主题纳米传感器接触，其中纳米传感器的捕捉剂特异性结合疾病的生物标志物，且其中接触是在适合于生物标志物特异性结合捕捉剂的条件下进行的；(c)去除未结合于捕捉剂的任何生物标志物；并(d)读取来自保持结合于纳米传感器的生物标志物的光信号，其中光信号指示患者具有疾病或状况，其中该方法进一步包括在生物标志物结合捕捉剂之前或之后用发光标记物标记生物标志物。正如下文会更详细描述的，患者可能被怀疑患有癌症，且抗体结合癌症生物标志物。在其它实施方案中，患者被怀疑具有神经病学病症，且抗体结合神经病学病症生物标志物。
主题传感器的应用包括但不限于：(a)检测、纯化和定量与某些疾病(例如感染性和寄生虫疾病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神病症和器官疾病，例如肺病、肾病)的阶段相关的化合物或生物分子；(b)检测、纯化和定量来自环境(例如水、土壤、或生物学样品，例如组织、体液)的微生物，例如病毒、真菌和细菌；(c)检测、定量对食品安全或国家安全造成威胁的化合物或生物学样品，例如有毒废物、炭疽；(d)定量医学或生理学监控器中的生命参数，例如葡萄糖、血氧水平、总血细胞计数；(e)检测和定量来自生物样品(例如细胞、病毒、体液)的特定DNA或RNA；(f)测定和比较染色体和线粒体中的DNA中的遗传序列用于基因组分析；或(g)检测反应产物，例如在药品合成或纯化过程中。
可以在各种样品基质中进行检测，诸如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。
在一些实施方案中，主题生物传感器可用于通过检测样品中来自病原体的靶核酸来诊断病原体感染。例如，靶核酸可以来自选自下组的病毒：人免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2)，人T-细胞白血病病毒1和2(HTLV-1和HTLV-2)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒，乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，人乳头瘤病毒(HPV)，水痘带状疱疹病毒(VZV)，巨细胞病毒(CMV)，单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)，人疱疹病毒8(HHV-8，也称作卡波西肉瘤疱疹病毒)和黄病毒，包括黄热病毒、登革病毒、日本脑炎病毒和西尼罗病毒。然而，本发明不限于检测来自上述病毒的DNA序列，而是可以没有问题地应用于在兽医和/或人医中重要的其它病原体。
基于它们的DNA序列同源性，人乳头瘤病毒(HPV)进一步细分成超过70种不同类型。这些类型引起不同的疾病。1、2、3、4、7、10和26-29型HPV引起良性疣。5、8、9、12、14、15、17和19-25和46-50型HPV在免疫系统削弱的患者中引起损害。6、11、34、39、41-44和51-55型在生殖器区和呼吸道的粘膜上引起良性尖形疣。16和18型HPV是医学上特别令人关注的，因为它们引起生殖器粘膜的上皮发育异常且与子宫颈、阴道、阴门和肛管浸润性癌的高比例有关。据信人乳头瘤病毒的DNA的整合在子宫颈癌的致癌作用中是决定性的。例如，人乳头瘤病毒可以通过它们的衣壳蛋白L1和L2的DNA序列来检测。相应地，本发明的方法尤其适合于检测组织样品中16和/或18型HPV的DNA序列，用于评估癌发生的风险。
在一些情况中，纳米传感器可用于检测以低浓度存在的生物标志物。例如，纳米传感器可用于检测容易获取的体液(例如血、唾液、尿、泪、等)中的癌抗原，检测容易获取的体液中的组织特异性疾病的生物标志物(例如神经病学病症(例如阿尔茨海默氏抗原)的生物标志物)，检测感染(特别是检测低滴度潜伏病毒，例如HIV)，检测母血中的胎儿抗原，及检测例如受试者血流中的外源化合物(例如药物或污染物)。
下表提供可使用主题纳米传感器(与适宜的单克隆抗体联合使用时)来检测的蛋白质生物标志物及其相关疾病的清单。表中还指出生物标志物的一种潜在来源(例如“CSF”；脑脊液)。在许多情况中，主题生物传感器能在与所标示的体液不同的体液中检测那些生物标志物。例如，在CSF中找到的生物标志物能在例如尿、血或唾液中鉴定到。
如上所述，主题纳米传感器可用于检测样品中的核酸。除了上文描述的诊断应用之外，主题纳米传感器还可用于各种药物发现和研究应用。例如，主题纳米传感器可用于多种应用，包括但不限于疾病或状况的诊断或监测(其中核酸的存在提供疾病或状况的生物标志物)、药物靶的发现(其中例如核酸在疾病或状况中差异表达，且可以作为药物治疗的靶)、药物筛选(其中通过评估核酸水平来监测药物的效果)、药物易感性测定(其中药物易感性与特定核酸谱有关)和基础研究(其中期望鉴定样品中核酸的存在，或者，在某些实施方案中，两份或更多份样品中特定核酸的相对水平)。
在某些实施方案中，可以使用上述方法获得两份或更多份不同核酸样品中核酸的相对水平，并进行比较。在这些实施方案中，通常将自上文描述的方法获得的结果相对于样品中核酸的总量(例如组成性RNA)标准化，并进行比较。这可以通过比较比率或通过任何其它手段来实现。在特定实施方案中，可以比较两份或更多份不同样品的核酸谱以鉴定与特定疾病或状况有关的核酸。
在一些例子中，不同样品可以由“实验”样品(即感兴趣样品)和“对照”样品(实验样品可以与其比较)组成。在许多实施方案中，不同样品是成对的细胞类型或其级分，一种细胞类型是感兴趣的细胞类型，例如异常细胞，而另一种是对照，例如正常细胞。如果比较两个细胞级分，这些级分通常是来自两种细胞中每一种的相同级分。然而，在某些实施方案中，可以比较同一细胞的两个级分。例示性的成对细胞类型包括，例如，从组织活检(例如具有疾病，如结肠、乳腺、前列腺、肺、皮肤癌等，或受到病原体感染等等的组织)分离的细胞，与来自相同组织(通常来自同一患者)的正常细胞；在组织培养中培养的永生的(例如具有增殖突变或永生化转基因的细胞)、受到病原体感染的、或经过处理(例如用环境或化学剂，诸如肽、激素、改变的温度、生长条件、生理应激、细胞转化等)的细胞，与正常细胞(例如除了不是永生的、未受感染、或未经处理等等之外，在其它方面与实验细胞相同的细胞)；从具有癌症、疾病的哺乳动物、衰老的哺乳动物、或暴露于某种条件的哺乳动物分离的细胞，和来自属于同一物种(优选属于同一家族)的健康或年轻的哺乳动物的细胞；及来自同一哺乳动物的已分化细胞和未分化细胞(例如一种细胞是另一种细胞的祖细胞)。在一个实施方案中，可采用不同类型的细胞，例如神经元和非神经元细胞，或者不同状态(例如对细胞施加刺激之前和之后)的细胞。在本发明的另一个实施方案中，实验材料是对病原体(诸如病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)等)感染易感的细胞，而对照材料是对病原体感染有抗性的细胞。在本发明的另一个实施方案中，成对样品由未分化细胞(例如干细胞)与已分化细胞代表。
尽管为了清楚理解起见已经通过举例说明较为详细地描述了上述实施方案，但本领域普通技术人员根据上述教导容易想到可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
实施例
已经制造了各种纳米传感器。图13显示了DoP结构的一个实施方案的制造结果。(a)制造中使用的参数，包括盘大小S盘、盘高度t金、以及立柱高度t氧化物。制成的DoP结构的(b)俯视图和(c)斜视图。制造过程包括：(a)在硅上热生长200nm的SiO2层并蒸镀40nm的金背膜；(b)通过使用200nm跨距的立柱模具进行纳米压印；(c)在蚀刻剩余光刻胶之后，相继蒸镀10nm的SiO2层和20nm的金层，以Ti为粘合层；(d)剥离光刻胶，并且(e)在稀的缓冲氧化物蚀刻(BOE)中进行蚀刻，以收缩SiO2立柱的尺寸，产生竖直的纳米间隙，容许标记分子被捕捉，由此进一步增强感测。
图14显示了DoP样品的反射光谱，其共振峰已被调节至800nm并且峰宽为80nm。通过有意调节盘和立柱大小，可实现650nm-850nm的共振峰。
图15显示了在玻璃(蓝色曲线，参考，放大1000倍)、DoP(绿色曲线)和有立柱收缩的DoP(红色曲线)上进行的免疫测定试验。来自有立柱收缩的DoP的增强因子可高达平均6500。
图16显示了制造的流程图。
图17显示了在连续介电膜上的纳米岛的SEM图片。(a)俯视图；(b)斜视图。

Claims (30)

1.用于感测分析物的纳米传感器，其包括：
(a)基片；
(b)信号放大层，其包括：
(i)位于所述基片上的基本上连续的金属底板；
(ii)一个或多个立柱，所述立柱从所述金属底板伸出，或从所述基片穿过所述底板中的孔伸出；和
(iii)位于所述立柱顶部的金属盘，其中所述盘的边缘的至少一个部分与所述金属底板分隔开；以及
(c)特异性结合分析物的捕捉剂，其中该捕捉剂连接于信号放大层的表面；
其中当分析物与捕捉剂结合时，该纳米传感器放大来自分析物的光信号。
2.权利要求1的纳米传感器，其中所述捕捉剂通过分子粘附层连接于所述放大层，该分子粘附层覆盖所述金属盘和/或所述金属底板的至少一部分。
3.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述金属盘、所述立柱、所述孔、和所述间隔的尺寸都小于所述信号的波长。
4.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述立柱仅位于所述金属底板的顶面上。
5.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述立柱仅位于所述基片的顶面上且穿过所述孔。
6.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述盘的边缘的至少一部分与所述金属底板以小于30nm的间隔分开。
7.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述盘的边缘的至少一部分与所述金属底板以小于15nm的间隔分开。
8.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述立柱是周期性的或非周期性的。
9.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述立柱包括选自下组的电介质或半导体材料：聚合物、二氧化硅、氮化硅、氧化铪、氧化铝、硅、砷化镓、和氮化镓。
10.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述金属材料选自金、银、铜、铝、其合金，及其组合。
11.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述立柱的顶部具有选自以下形状组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。
12.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述分析物选自蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、和具有不同形状的纳米颗粒。
13.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述信号为选自下组的发光信号：荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光信号。
14.权利要求1-12中任一项的纳米传感器，其中所述信号为拉曼散射信号。
15.任一前述权利要求的纳米传感器，其中来自分析物的光信号来自直接标记的分析物，或来自与所述分析物结合的检测剂。
16.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述分子粘附层为自组装单分子层(SAM)，其中SAM的每个分子包括三个部分：(i)头部基团，其与纳米器件的金属表面具有特异亲和力，(ii)末端基团，其与捕捉剂具有特异亲和力，和(iii)接头，其连接所述头部基团和所述末端基团，其中接头的长度决定金属表面与附接的捕捉剂之间的平均间距，能够影响纳米器件的光放大。
17.任一前述权利要求的纳米传感器，其中该纳米传感器是板的一部分或位于微流体通道内。
18.任一前述权利要求的纳米传感器，其中该纳米传感器具有1微米到100厘米的横向尺寸。
19.任一前述权利要求的纳米传感器，其中所述盘的边缘的至少一个部分与所述金属底板以小于10nm的间隔分开。
20.一种系统，其包括：
(a)权利要求1的纳米传感器；
(b)用于所述纳米传感器的保持件；
(c)诱导来自标记物的光信号的激发源；以及
(d)适于读取所述光信号的读取器。
21.制造权利要求1的纳米器件的方法，其包括：
(a)在基片的顶面上成型至少一个立柱；
(b)沉积所述顶面的金属材料层；
(c)让沉积在立柱顶部的金属材料形成盘，并且让沉积在立柱底部的金属材料形成金属底板；和
(d)在沉积的金属材料的顶部沉积分子粘附层，其中该分子粘附层覆盖所述金属盘和/或所述金属底板的至少一部分，并且其中所述分子粘附层的外表面包括捕捉剂反应性基团。
22.权利要求21的方法，其中所述成型是纳米压印。
23.权利要求21或22的方法，其中所述成型是基于滚筒技术的纳米压印。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述金属材料沉积(b)将金属材料沉积在侧壁上，以形成至少一个金属点结构。
25.一种诊断疾病或病症的方法，其包括：
(a)从怀疑具有所述疾病或病症的患者获得液体样品；
(b)使所述样品与权利要求1的纳米传感器接触，其中所述纳米传感器的捕捉剂与所述疾病的生物标志物特异性结合，并且其中所述接触是在适合于所述生物标志物与所述捕捉剂特异性结合的条件下进行的；
(c)去除任何未与所述捕捉剂结合的生物标志物；以及
(d)读取来自保持结合于所述纳米传感器的生物标志物的光信号，其中光信号指示所述患者具有所述疾病或病症；
其中所述方法进一步包括在所述生物标志物与所述捕捉剂结合之前或之后用发光标记物标记该生物标志物。
26.权利要求25的方法，其中所述患者被怀疑具有癌症，且所述捕捉剂与癌症生物标志物结合。
27.权利要求25的方法，其中所述患者被怀疑具有神经障碍，且所述捕捉剂与该神经障碍的生物标志物结合。
28.权利要求25-27中任一项的方法，其中所述液体样品包括羊水、房水、玻璃体液、全血、成分血、血浆、血清、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、胃酸、胃液、淋巴液、粘液(包括鼻涕和体内痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油脂)、精液、咳出痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿、或呼气冷凝液。
29.权利要求25-28中任一项的方法，其中所述传感器用来检测或定量与疾病的阶段相关的化合物或生物分子。
30.权利要求25-29中任一项的方法，其中所述疾病是癌症、心脏病、肺病、肾病、或精神障碍。
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