CN105209884A - 借助放大结构上的选择性沉积和结合的测定增强 - Google Patents

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Abstract

本公开特别提供了用于增强与基片结合的分析物的检测的方法，所述基片包括在所述基片表面上的信号放大层，其中所述信号放大层包括高放大区域和低放大区域，并且其中所述高放大区域比所述低放大区域更多地放大所述表面上的信号。所述方法包括选择性地掩蔽所述基片的低放大区域，由此增加分析物与高放大区域结合并被检测到的概率。

Description

借助放大结构上的选择性沉积和结合的测定增强
关于得到联邦政府资助的研究的声明
本发明是在美国政府的支持下由(美国)国防部高级研究计划局(DARPA)授予的基金号FA9550-08-1-0222资助而做出的。美国政府对本发明具有某些权利。
交叉引用
本申请是2013年3月15日提交的美国申请系列号13/838,600(NSNR-003)的部分继续申请，所述申请要求2012年4月10日提交的美国临时申请系列号61/622,226的权益，并且是2013年6月13日提交的美国专利申请系列号13/699,270的部分继续申请，所述申请是2011年5月20日提交的US2011/037455的§371申请案，并且要求2010年5月21日提交的美国临时申请系列号61/347,178的权益；
本申请也是2013年6月13日提交的美国申请系列号13/699,270(NSNR-001)的部分继续申请，所述申请是2011年5月20日提交的国际申请系列号US2011/037455的§371申请案，所述申请要求2010年5月21日提交的美国临时专利申请系列号61/347,178的权益；并且
本申请还要求以下申请的权益：2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,424(NSNR-004PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,096(NSNR-005PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/800,915(NSNR-006PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/793,092(NSNR-008PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,933(NSNR-009PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/794,317(NSNR-010PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/802,020(NSNR-011PRV)和2013年3月15日提交的临时申请系列号61/802,223(NSNR-012PRV)，通过提述并入所有这些申请用于所有目的。
背景
本发明涉及与可改进感测分析物的测定的特性的方法、装置、制造方法和应用，所述特性的改善是通过在具有高感测信号放大表面和低感测信号放大表面的测定中选择性地掩蔽表面和选择性地结合而实现的。所述感测包括拉曼散射、色度、发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。所述感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(误差棒更小)。本发明可在体外或体内感测中使用。
为了改进测定的感测特性，测定常常具有在固态支持物(例如，平板)的表面上的具备微/纳米结构的感测信号放大层，其中该放大层具有高放大表面的区域，其余区域为低放大区域。这样的放大层的一个实例是纳米结构等离子层，比如D2PA。
高放大区域和低放大区域之间的分析物检测灵敏度的差异可以是10倍或更大。高放大区域常常比低放大区域的灵敏度小得多。因此，如果分析物仅仅结合到高放大区域上而不结合在低放大区域中，则感测信号和相关特性将比分析物结合到高放大区域和低放大区域(或表面)两者的情况大大增强。因此，需要选择性地掩蔽低放大区域，以防止分析物结合在此区域中。
概述
以下概述并不意在包括本发明的所有特征和方面，也不意指本发明必须包括在此简述中论述的所有特征和方面。
本发明涉及与可改进感测分析物的测定的特性的方法、装置、制造方法和应用，所述特性的改善是通过在具有高感测信号放大表面和低感测信号放大表面的测定中选择性地掩蔽表面和选择性地结合而实现的。
所述感测包括拉曼散射、色度、发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。所述感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(更小的误差棒)。本发明可在体外或体内感测中使用。
附图简述
本领域技术人员将会理解，如下所述的附图仅用于说明目的。所述附图并不意图以任何方式限制本文教导的范围。有些附图并未依比例给出。
图1(a)具有信号放大层D2PA的平板的俯视图。(b)在阴影沉积掩模材料之前的D2PA的横截面。(c)沿着平板表面的法向从上到下地进行掩模材料的阴影沉积；沉积的掩模材料覆盖金属盘和金属底板的顶面，但不覆盖金属结构的侧壁，不覆盖在立柱侧壁上的金属纳米点。
图2(a)在沉积掩模材料之后，掩模材料掩蔽所述金属(金)的一部分。(b)涂覆分子接头，其仅仅覆盖金属金；(c)使捕捉剂(例如抗体)仅结合分子接头。
图3展示了对于D2PA用掩模材料以不同角度进行的多次(二次)沉积。(a)在第一掩模材料阴影沉积的沉积之后。(b)第二掩模材料阴影沉积从不同的角度沉积，以掩蔽未被第一掩模材料掩蔽的区域。可以使用两种以上的掩模材料来掩蔽设计的区域。
图4展示了对于SAL层：柱上盘(Diskonpillar,DoP)的其他实施方案。
图5(a)没有涂层的D2PA的SEM(扫描电子显微照片)。(b)用于测试的蛋白质测定。和(c)例示说明在被掩蔽的D2PA中，捕捉剂和分析物与SAL的高放大区域结合，而不是像在未掩蔽的D2PA中那样结合SAL的所有区域。SAL层的其他实施方案包括：柱上盘(DoP)。显示了材料的定向蒸发如何改进增强的实例。通过在随机金属岛顶部用覆盖层遮蔽，IgG可仅结合在金属岛的边缘上，这里是最高的场增强定位之处。
图6观察到巨大的荧光增强。单掩蔽的D2PA中的荧光增强是未掩蔽的D2PA的约100倍，而且，与没有掩蔽的常规D2PA相比，双掩蔽的D2PA具有比单掩蔽的D2PA高约1.2倍的增强。
图7是显示掩蔽的D2PA的检测限(LoD)的曲线图，所述检测限为0.9aM，比标准D2PA的43aM的LoD灵敏约50倍。
相应的附图标记在附图的全部若干图面中均指示相应的部件。应当理解的是，附图用于示出本公开中给出的构思，并且不是依比例给出的。
在详细解释本发明的任何实施方案之前应当理解的是，本发明的应用不限于下文描述中陈述的或附图中图示的构造细节和部件布置。
定义
在更详细地描述例示性实施方案之前，列出下述定义，以说明并界定说明书中使用的术语的含义和范围。
如本文中使用的术语“盘耦合柱上点天线阵列”(“disk-coupleddots-on-pillarantennaarray”)和“D2PA”是指在图12和13中展示的装置，其中阵列100包括：(a)基片110；和(b)位于基片的表面上的D2PA结构，其包括从基片表面延伸出的一个或多个立柱115，其中所述立柱中的至少一个包括柱体120、在所述立柱顶部的金属盘130、在所述立柱底部的金属底板150，所述金属底板覆盖所述立柱底部附近的所述基片表面的相当大部分；布置在所述立柱侧壁上的金属点结构140。所述D2PA将邻近D2PA表面的光信号放大。所述D2PA增强邻近D2PA表面的区域中的局部电场和局部电场梯度。所述光信号包括光散射、光衍射、光吸收、非线性光产生和吸收、拉曼散射、色度、发光，其中发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。
D2PA阵列还可包括覆盖所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板的至少一部分的分子粘附层、和任选地特异性地与分析物结合的捕捉剂，其中所述捕捉剂连接到所述D2PA阵列的分子粘附层上。当所述分析物结合于捕捉剂时，纳米传感器可放大来自分析物的光信号。一个优选的SAL实施方案是，SAL的一个、几个或所有关键金属和介电部件的尺度小于感测中的光的波长。盘耦合柱上点天线阵列的物理结构的详情、用于制造它们的方法、用于将捕捉剂连接到盘耦合柱上点天线阵列上的方法和使用盘耦合柱上点天线阵列来检测分析物的方法描述于许多出版物中，包括WO2012024006、WO2013154770、Li等(OpticsExpress201119,3925-3936)、Zhang等(Nanotechnology201223:225-301)；和Zhou等(Anal.Chem.201284:4489)，通过提述将这些出版物的公开内容并入本文。
术语“分子粘附层”指具有确定厚度的一层或多层分子，其包括附接于纳米器件的内表面和能结合至捕捉剂的外表面。
术语“捕捉剂反应性基团”指分子中具有化学功能的部分，其对捕捉剂具有反应性，即，能与捕捉剂中的部分(例如羟基、硫氢基、羧基或胺基团)反应生成稳定的强(例如共价)键。
如本文中使用的，术语“捕捉剂”指经由相互作用结合靶分析物的药剂，该相互作用足以允许该药剂结合该靶分子并从不同分子的异质混合物中浓缩该靶分子。结合相互作用通常由捕捉剂的亲和力区介导。典型的捕捉剂包括任何能特异性结合靶分析物的部分。某些捕捉剂以小于约10-6M(例如小于约10-7M、小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M、小于约10-12M、至低达10-16M)的解离常数(KD)特异性结合靶分子，而与其它分子没有显著结合。例示性捕捉剂包括但不限于蛋白质(例如抗体)和核酸(例如寡核苷酸、DNA、RNA，包括适体)。
术语“特异性结合”和“选择性结合”指捕捉剂优先结合存在于不同靶分子的异质混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用会区分样品中想要的(例如有活性的)和不想要的(例如无活性的)靶分子，通常大于约10至100倍或更多(例如大于约1000或10,000倍)。
术语“蛋白质”指任何长度的氨基酸聚合物形式，即大于2个氨基酸、大于约5个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基酸、大于约200个氨基酸、大于约500个氨基酸、大于约1000个氨基酸、大于约2000个氨基酸，通常不大于约10,000个氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸，和具有经过修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源或同源前导序列、带有或不带有N端甲硫氨酸残基的融合物；带免疫学标签的蛋白质；具有可检测的融合配偶的融合蛋白，例如包含荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶的融合蛋白；等等。这些术语还包括在细胞中经过翻译后修饰(例如糖基化、切割、分泌、异戊二烯化、羧基化、磷酸化、等)的多肽，具有二级或三级结构的多肽，和与其它部分(例如其它多肽、原子、辅因子等)强结合(例如共价或非共价)的多肽。
术语“抗体”意图指免疫球蛋白或其任何片段，包括能够结合抗原的单链抗体和噬菌体展示抗体。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，描述由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任何长度的聚合物，或合成生成的、能够与天然存在的核酸以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式杂交(例如能参与Watson-Crick碱基配对相互作用)的化合物(例如美国专利no.5,948,902及其引用的参考文献中记载的PNA)。
如本文中使用的，术语“互补”指核苷酸序列通过氢键与感兴趣的靶核酸碱基配对。在规范的Watson-Crick碱基配对中，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)替换。如此，A与T互补，而G与C互补。通常，“互补”指核苷酸序列与感兴趣的靶完全互补，使得序列中的每一个核苷酸与靶核酸中对应的位置上的每一个核苷酸互补。当核苷酸序列与非靶序列不是完全互补(100％互补性)，但由于核苷酸序列的某些区段与非靶序列的互补性而仍然可以与非靶序列进行碱基配对时，可以计算百分比互补性以评估非特异性(脱靶)结合的可能性。一般而言，50％或更低的互补性不引起非特异性结合。另外，70％或更低的互补性在严格杂交条件下可能不引起非特异性结合。
如本文中使用的，术语“核糖核酸”和“RNA”表示由核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文中使用的，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”表示由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文中使用的，术语“寡核苷酸”表示长约10个至200个核苷酸，直至300个核苷酸或更长，例如长至500nt或更长的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的，而且在某些实施方案中，长度小于300个核苷酸。
如本文中使用的，术语“附接”指一个分子与另一个分子的强(例如共价或非共价)键连接。
如本文中使用的，术语“表面附接”指分子强附接于表面。
如本文中使用的，术语“样品”涉及含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材料混合物。在特定实施方案中，样品可以是自生物学样品获得的，生物学样品例如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕(nasaldrainage)和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液(rheum)、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。在特定实施方案中，样品可以是自受试者(例如人)获得的，而且可以在用于主题测定法之前进行加工。例如，在分析之前，可以在使用之前自组织样品提取蛋白质/核酸，提取方法是已知的。在特定实施方案中，样品可以是临床样品，例如自患者收集的样品。
术语“分析物”指能被捕捉剂结合和检测的分子(例如蛋白质、核酸、聚合物或其它分子、它们的复合物或颗粒)。
术语“测定”指测试样品以检测分析物的存在和/或丰度。
如本文中使用的，术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，包括定量和定性测定二者。
如本文中使用的，术语“发光标记物”指当处于外部激发下时能发出光的标记物。这可以是冷发光(luminescence)。荧光标记物(其包括染料分子或量子点)和冷发光标记物(例如电致发光或化学发光标记物)是发光标记物的类型。外部激发对于荧光而言是光(光子)、对于电致发光而言是电流，对于化学发光而言是化学反应。外部激发可以是上述的组合。
短语“带标记的分析物”指这样的分析物，该分析物被发光标记物可检测地标记，使得该分析物能够通过评估该标记物的存在来加以检测。带标记的分析物可以是被直接标记的(即，可以将分析物自身直接缀合于标记物，例如通过强的键，如共价或非共价键直接缀合于标记物)，或者，带标记的分析物可以是被间接标记的(即，分析物被次级捕捉剂所结合，而次级捕捉剂是被直接标记的)。
术语“杂交”指核酸与互补核酸经Watson-Crick碱基配对的特异性结合。因而，术语“原位杂交”指核酸与中期或间期染色体的特异性结合。
就核酸而言，术语“杂交”和“结合”可互换使用。
术语“捕捉剂/分析物复合物”是捕捉剂与分析物的特异性结合所导致的复合物。捕捉剂和该捕捉剂所针对的分析物通常会在“特异性结合条件”或“适合于特异性结合的条件”下彼此特异性结合，其中此类条件为那些容许捕捉剂和溶液中要结合的分析物之间发生结合的条件(在盐浓度、pH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等方面)。此类条件(特别是就抗体及其抗原和核酸杂交而言)是本领域公知的(参见例如Harlow和Lane(Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和金subel等,ShortProtocolsinMolecularBiology,5thed.,Wiley&Sons,2002)。
如本文中使用的，术语“特异性结合条件”指生成包含彼此特异性结合的成对分子的核酸双链体或蛋白质/蛋白质(例如抗体/抗原)复合物，同时不利于并非彼此特异性结合的分子之间形成复合物的条件。特异性结合条件是杂交和清洗条件二者的总和或组合(全体)，而且在必要时可以包括清洗和封闭步骤。
对于核酸杂交，特异性结合条件可以如下实现：于42℃在50％甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖酐、和20μg/ml经变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育，接着于约65℃在0.1xSSC中清洗滤膜。
对于抗体结合抗原，特异性结合条件可以如下实现：在封闭溶液(例如含3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭含有抗体的基片，接着与在封闭缓冲液中稀释的含有分析物的样品一起温育。在该温育之后，在清洗溶液(例如PBS+TWEEN20)中清洗基片并与捕捉第二抗体(检测抗体，它识别抗原中的另一位点)一起温育。捕捉第二抗体可以缀合有光学可检测标记物，例如荧光团，诸如IRDye800CW、Alexa790、Dylight800。再次清洗之后，可以检测结合的捕捉第二抗体的存在。本领域技术人员会知道可加以修改以提高检测到的信号及降低背景噪声的参数。
术语“次级捕捉剂”(也可称作“检测剂”)指对抗原具有高度特异性亲和力的一组生物分子或化合物。次级捕捉剂可以与光学可检测标记物，例如酶、荧光标记物等强连接，或者次级捕捉剂自身可以被另一通过生物缀合而连接有光学可检测标记物的检测剂所检测((Hermanson,“BioconjugateTechniques”AcademicPress,2ndEd.,2008)。
术语“生物素部分”指包含生物素或生物素类似物如脱硫生物素、氧代生物素、2’-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等的亲和剂。生物素部分以至少10-8M的亲和力结合链霉亲合素。生物素亲和剂还可以包含接头，例如─LC-生物素、─LC-LC-生物素、─SLC-生物素或─PEGn-生物素，其中n为3-12。
术语“链霉亲合素”指链霉亲合素和亲合素二者，以及它们的任何以高亲和力结合生物素的变体。
术语“标志物”指这样的分析物，它在生物学样品中的存在或丰度与某种疾病或状况相关。
术语“键”包括共价和非共价键，包括氢键、离子键和由范德华力生成的键。
术语“放大”指信号的量级(magnitude)的增大，例如信号增大至少10倍、增大至少100倍、增大至少1,000倍、增大至少10,000倍、或增大至少100,000倍。
其他特异性结合条件是本领域已知的并且也可在本文中采用。
必须注意，如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”和“该”包括复数指称，除非上下文另外明确指明，例如在使用词语“单个/单种”时。例如，提到“一种分析物”包括单种分析物和多种分析物，提到“一种捕捉剂”包括单种捕捉剂和多种捕捉剂，而提到“一种检测剂”包括单种检测剂和多种检测剂。
示例实施方案的详述
下面详细的描述以举例的方式而不是以限制的方式示出了本发明的一些实施方案。
本发明涉及可改进测定的感测特性的方法和装置、以及它们的制造和用途。本发明涉及具有信号放大表面的测定，所述信号放大表面捕捉分析物并且具有高信号放大区域和低放大区域。本发明涉及选择性地掩蔽所述低信号放大区域的方法，使得所述分析物会结合到所述高信号放大区域，因此改进感测特性。
所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。所述感测包括光吸收、光散射、光辐射、拉曼散射、色度、发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。所述感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(误差棒更小)。本发明可在体外或体内感测中使用。具有信号放大层的测定由于其纳米结构有时被称为“纳米传感器”。
为了改进测定感测特性，测定常常具有位于固态支持物(例如平板)的表面上的感测信号放大(SAL)层，捕捉剂附接于SAL层，捕捉剂进而可捕捉分析物。所述SAL层常常包括金属和介电材料的微/纳米结构。在要附接捕捉剂的SAL的表面中，常常进一步分成高信号放大区域和其他低信号放大区域。高放大区域和低放大区域之间信号放大的差异可以是10倍或更大。
这样的信号放大层的一个实例是在D2PA(盘耦合柱上点天线阵列)中的纳米结构等离子层(图1)。所述高放大区域为具有金属材料的尖锐(即，曲率小)边缘的区域以及两个金属材料之间的小间隙的区域。
此外，通常对于给定的信号放大表面而言，高放大区域比低放大区域小得多。因此，如果分析物仅仅结合到高放大区域上而不结合在低放大区域中，那么与分析物结合高放大区域和低放大区域(或表面)的概率相同的情况相比，信号感测灵敏度和其他有关感测特性将大大增强。
本发明涉及使分析物与所述高放大区域而不与所述低放大区域结合的方法。所述方法包括选择性地改性所述低放大区域的至少一部分而保持所述高放大区域的至少一部分未改性，使得所述捕捉剂具有更高的概率结合高放大区域而不是低放大区域。
所述改性可以为若干方式，包括(a)将掩蔽材料沉积到减少捕捉剂结合的低放大区域上，(b)将粘附材料沉积到增加捕捉剂结合的高放大区域上，(c)改变减少捕捉剂结合的低放大区域的表面(一个或几个原子层)的化学特性，和(e)改变增加捕捉剂结合的高放大区域的表面(一个或几个原子层)的化学特性。在许多情况下，所述未改性的低放大区域并不结合所述捕捉剂，或者结合是如此地弱，以至于简单洗涤即会使其脱落。为了使测定正确运行，分析物在测定表面上的非特异性结合应该非常低。
以及(2)使用不与掩蔽材料结合但是与未覆盖(即，未掩蔽)的高放大区域中的表面材料(一种或多种)结合的捕捉剂。在步骤(2)的一些情形下，分子粘附层用于连接在所述高放大区域与所述捕捉剂之间。例如，在D2PA中，分子粘附层为SAM层二硫代双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)(DSU)。所述DSUSAM层通过硫金(sulfer-gold)键结合到SAL的金属表面上，并且具有与许多蛋白质捕捉剂上的伯胺位点结合的NHS酯的末端基团。
掩蔽所述低放大区域的选择性沉积具有若干方式。一种方式是仅仅在所述低放大区域上沉积掩蔽材料。另一种方式是在所有地方(即，低放大区域和高放大区域两者)沉积掩蔽材料，然后选择性地从高放大区域移除掩蔽材料，或者将另一种可附接所述捕捉剂的材料选择性地沉积到所述高放大区域上。
所述掩蔽材料的选择性沉积可以通过若干方式实现，包括(a)使用光刻、沉积和剥离(lift-off)，(b)使用阴影沉积，(d)使用阴影掩模的沉积，和(d)使用其他方式。所述阴影沉积利用信号放大层的3D(三维)表面拓扑特征来选择性地覆盖所述表面的一部分。在使用阴影掩模的沉积中，通过阴影掩模将掩蔽材料沉积在SAL层的选定区域上。阴影掩模是一种平板，其具有多个可以让材料或能量束通过，同时阻挡材料进入其他区域的孔。
材料沉积的一个替代方案是使用定向能量束(光子、电子、离子等等)将暴露的表面化学进行改性，使得分子的官能头部基团将结合所述改性的表面，而不结合未改性的表面，或反之。所述改性可在气体环境中进行。例如，可通过在氧气环境中照射能量束来氧化金属或半导体(例如硅)的表面。
本发明的一个实施方案是通过选择性地掩蔽(即，阻挡)低信号放大区域，同时保留高信号放大区域开放用以捕捉分析物，来改进感测分析物的测定的特性(包括灵敏度)的方法。
本发明的一个实施方案是通过阴影沉积捕捉剂不会结合的掩蔽材料来选择性地掩蔽低放大区域的方法。
本发明的一个实施方案是使用具有结合高放大区域中的材料而不结合低放大区域中的材料的末端官能基团的捕捉剂来实现选择性掩蔽的方法。
本发明的一个实施方案是以相同的沉积角度或不同的角度沉积掩蔽材料多次，以便实现更高的感测信号的目的。
本发明可用于改进从1微米到100厘米乃至更大的不同大小的测定。本发明还可用于微流体通道内部的测定。
感测放大表面
本发明的方法适用于任何具有具备高放大区域和低放大区域的SAL层的测定。在许多测定中，感测放大表面具有金属(等离子)和介电材料的微/纳米结构。高信号放大区域为具有尖锐曲率的区域和/或在两个金属结构的小间隙之间的区域。此类测定的实施方案的一些实例如下所述。
所述测定之一是D2PA测定，如在“定义”中所述的。在D2PA中，所述高信号放大区域为：金属纳米点、金属盘的边缘、以及金属底板的边缘的周围，和所有金属部分之间的小间隙之间。低感测放大区域是金属盘和金属底板的上表面。显然，高放大区域的总面积比低放大区域的总面积小得多。在没有选择性掩蔽的D2PA中，所述捕捉剂将相当均匀地附接，取决于结合化学，或是附接在所有金属表面上，或是附接在所有开放表面上，因此仅有小部分的分析物被捕捉在高放大区域。
用于操作约800nm波长的光信号的一个优选D2PA包括周期性非金属(例如电介质或半导体)立柱阵列(200nm跨距和约100nm直径)、每个立柱顶部的金属盘(约135nm直径)、立柱底部的金属底板、随机定位于立柱壁上的金属纳米点、以及这些金属部件之间的纳米间隙。纳米点具有约5-20nm的直径，并且它们与纳米盘之间的纳米间隙为1-10nm。所述盘的直径略微比立柱大，因此具有突出部分。
感测涉及表面的另一个实施方案包括一个或多个金属盘和基本上(significantly)连续的金属膜，其中所述金属盘的主要部分与所述金属膜具有一定的间隔。所述间隔为0.5到30nm，并且盘的平均横向尺寸为20nm到250nm。
所述感测牵涉表面的另一个实施方案包括一个或多个在基片上的金属盘，并且盘的平均横向尺寸为20nm到250nm，在两个相邻盘之间的间隙为至少0.5到30nm。
所有实施方案中的金属盘具有选自以下形状组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。
金属可为金、银、铂、钯、铅、铁、钛、镍、铜、铝、其合金、或其组合，尽管也可使用其他材料，只要所述材料的等离子体频率高于光信号的频率和用于产生光信号的光的频率即可。
SAL层的其他实施方案为显示在图4中的柱上盘(DoP)400，其包括基片410；基本上连续的金属膜420、从所述基片的表面延伸出的一个或多个立柱，其中至少一个所述立柱包括柱体420、立柱顶部的金属盘430、和金属底板450。所述金属底板可以为A451型：在立柱的底部，覆盖立柱底部附近的基片表面的相当大部分；或B452型：在立柱下方展开的一片膜。所述盘可具有比所述立柱大(优选)、或比所述立柱小、或与所述立柱相同的横向尺寸。
为了增强波长为400nm到1,000nm的光(可见光到近红外光)，所述间隔为0.5到30nm，盘的平均横向尺寸为20nm到250nm，盘厚度为10nm到60nm，这取决于在感测中使用的光波长。
测定基片的大小可以是从大到供体外应用的10厘米计，到适于体内应用的1微米的范围。当基片大小非常小时，常常首先在大的晶片上制造它们，然后切割成小的尺寸。基片可以是任何材料，但是可能受到信号放大层所需要的化学反应性或等离子效应的限制。
用于选择性掩蔽方法的阴影沉积.
材料的阴影沉积是指将材料以束的形式从给定的方向(图1c)朝着具有3D拓扑特征的表面沉积。就像电话线杆阻挡日光形成阴影一样，某些表面拓扑结构将阻挡材料束，在后面留下“阴影”，因此在阴影区域中没有材料沉积。在阴影沉积中要沉积的区域和要掩蔽的区域由阴影沉积的角度以及表面拓扑特征来确定。所述掩蔽材料可以是任何不结合所述捕捉剂和所述分析物的材料。在许多情况下，阴影沉积可以仅仅是部分定向的。
掩蔽材料阴影沉积的角度
用来增强测定的阴影沉积角度由高放大区域和低放大区域的位置决定。对于具有相似拓扑特征的D2PA或SAL层，高放大区域主要在立柱的侧面上，而低放大区域是立柱的顶部和立柱底部的平坦表面。因此对于D2PA和类似物，以表面法向的角度阴影沉积掩蔽材料180将掩蔽最大部分的低放大区域。如图1中所示，通过在法向方向进行阴影沉积，沉积的掩蔽材料180位于每个金属盘130的顶部、和金属底板150的顶部，同时保留金属纳米点、金属盘和底板的边缘、以及在金属部件之间的纳米间隙未被掩蔽。在一个实例中，所述掩蔽材料是二氧化硅。典型的厚度为约1nm到10nm。
掩蔽材料的多次阴影沉积。
可以以相同的沉积角度或不同的角度多次沉积掩蔽材料，以实现更高的感测信号的目的。沉积角度是指沉积束与SAL表面的法向之间的角度。
利用不同角度的多次沉积，可以覆盖更多需要覆盖的区域。通过选择适当次数的沉积和适当的角度，可以选择特定的高放大区域用于分析物结合，同时掩蔽所有其他区域而防止(或多或少地)结合。选择性掩蔽的另一个目的是精确控制分析物的结合位点。位置控制在某些信号阅读和分析方法中具有一定优势。
图3展示了从两个角度进行的D2PA的二次阴影沉积。第一阴影沉积用掩蔽材料180覆盖立柱顶部的金属盘130和金属底板150，而保留金属纳米点、金属盘和底板的边缘、以及在金属部件之间的纳米间隙未被掩蔽。在第二阴影沉积中，掩蔽材料190覆盖所述盘和所述底板的边缘的一部分，因此使更多的捕捉剂与纳米点140结合，纳米点是放大最高的位置之一。
掩蔽材料和厚度
所述掩蔽材料可以从任何防止所述捕捉剂的结合、或产生所述捕捉剂的结合的材料中选择(注意它们还应当与分析物没有非特异性结合或者非特异性结合微小)。厚度可以从0.1nm到200nm，只要它发挥掩蔽的功能即可。选择掩蔽材料和厚度的另一个考虑因素是放大层的共振波长；它们不应对共振有显著的不利影响，共振对于放大而言是关键的。
掩蔽材料可以是电介质和半导体，并且可以为无定形、晶体、多晶、小分子、大分子等等形式。一种常用的掩蔽材料是二氧化硅。另一种是聚合物，如聚苯乙烯，PMMA。其他适合的掩蔽材料包括氮化硅和由PS-b-PMMA组成的二嵌段共聚物、PS-r-PMMA无规共聚物(参见例如，US8513359)和其他无定形介电材料。在某些情况下，共聚物可选自聚苯乙烯-嵌段-聚甲基丙烯酸甲酯(PS-b-PMMA)、聚苯乙烯-嵌段-聚异戊二烯(PS-b-PI)、聚苯乙烯-嵌段-聚丁二烯(PS-b-PBD)、聚苯乙烯-嵌段-聚乙烯吡啶(PS-b-PVP)、聚苯乙烯-嵌段-聚环氧乙烷(PS-b-PEO)、聚苯乙烯-嵌段-聚乙烯(PS-b-PE)、聚苯乙烯-b-聚有机硅酸酯(PS-b-POS)、聚苯乙烯-嵌段-聚二茂铁基二甲基硅烷(PS-b-PFS)、聚环氧乙烷-嵌段-聚异戊二烯(PEO-b-PI)、聚环氧乙烷-嵌段-聚丁二烯(PEO-b-PBD)、聚环氧乙烷-嵌段-聚甲基丙烯酸甲酯(PEO-b-PMMA)、聚环氧乙烷-嵌段-聚乙基乙烯(PEO-b-PEE)、聚丁二烯-嵌段-聚乙烯吡啶(PBD-b-PVP)、和聚异戊二烯-嵌段-聚甲基丙烯酸甲酯(PI-b-PMMA)。
优选调整掩蔽材料的厚度以获得最佳掩蔽效果。例如，在实际的定向沉积中，少量的掩蔽材料可能偏离沉积方向而进入阴影区域。在这种情况下，应降低沉积厚度，使得偏离的掩蔽材料如此微小，以至于仅仅覆盖阴影区域的小部分。掩蔽材料的典型厚度为约0.5nm到150nm。
D2PA的结构、材料、表面功能化(结合化学)、检测、和应用(例如生物/化学检测和疾病检测)的实例已经得到描述，这些实例对于本发明都适用(参见，例如，Li等OpticsExpress201119,3925-3936,WO2012/024006，以及名称为“Ultra-SensitiveSensors”(作为说明书的一部分被包括在内)的专利申请，通过提述将其并入本文)。
材料的阴影沉积方法
用于阴影沉积材料的方法可以是任何方法，只要它或多或少是定向性的，并且可使目标材料蒸发即可。沉积方法包括蒸发、溅射、以及化学或分子束。所述蒸发进一步包括利用化学蒸汽、分子束、电子束加热、热量加热、激光加热、和其他加热方法的蒸发。溅射包括利用离子、电子、等离子、光子(即，激光)、和其他能量颗粒的溅射。
捕捉剂和分子粘附层
捕捉剂应当选择性地结合到未掩蔽的或结合(与所述捕捉剂)增强的选定高放大区域。
在一个实施方案中，捕捉剂与SAL层表面上的所有材料不结合或微弱地结合，而是使用分子粘附层(MAL)将所述捕捉剂连接到期望的表面上。例如，在D2PA中，选择将MAL160包覆在金中，如图2中所示。
在用于D2PA和类似物的MAL的一个实施方案中，分子粘附层160为交联分子或配体的自组装单分子层(SAM)，SAM的每个分子包括三个部分：(i)头部基团，其对金属表面具有特异性化学亲和力，(ii)末端基团，其对捕捉剂具有特异性亲和力，和(iii)分子链，其是连接所述头部基团和末端基团的一长串分子，并且其长度(该长度决定在金属与捕捉剂之间的平均间距)可影响测定的光放大。
作为一个例子，所述分子粘附层，可含有SAM层二硫代双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)(DSU)。所述DSUSAM层通过硫金(sulfer-gold)键结合到SAL的金属表面上，并且具有与许多蛋白质捕捉剂上的伯胺位点结合的NHS酯的末端基团。一个例子是在D2PA中，其中捕捉剂202通过MAL160结合到金。
所述分子粘附层可具有许多不同的构造，包括(a)交联分子的自组装单分子层(SAM)，(b)多分子层薄膜，(c)(a)和(b)的结合，以及(d)捕捉剂本身。
WO2013154770中描述了用于将捕捉剂连接到具有或没有分子连接层的金属表面上的不同方法，就这样的方法通过提述将其并入本文。例如，在一些情况下，可首先将所述金属表面接合到具有规定长度(例如，0.5nm到50nm长)的分子的一端(例如，经由硫醇或硅烷头部基团)，并且可经由捕捉剂反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、或碘代乙酰基)将所述捕捉剂连接到所述分子的另一端。在某些情况下可使用具有通过硫-金键结合到金表面上的–SH头部基团、以及与伯胺反应的NHS-酯末端基团的二硫代双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)。
测定
所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。所述感测包括光吸收、光散射、光辐射、拉曼散射、色度、发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。所述感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(误差棒更小)。本发明可在体外或体内感测中使用。具有信号放大层的测定由于其纳米结构有时被称为“纳米传感器”。不同的测定和应用描述于WO2013154770中，就这样的方法通过提述将其并入本文。
在一些测定中，根据上述方法将生物传感器连接至抗体，以产生包含连接至生物传感器的分子粘附层的抗体的生物传感器。在产生了生物传感器之后，使生物传感器与含有目标分析物(例如，目标蛋白)的样品在适合于特异性结合的条件下接触。所述抗体与样品中的目标分析物特异性地结合。在从所述生物传感器洗掉未结合的分析物之后，使所述生物传感器与以发光标记物标记的第二抗体在适合于特异性结合的条件下接触。在从所述生物传感器去除未结合的第二抗体之后，可阅读所述生物传感器，以鉴定和/或定量原始样品中的分析物。
在其他测定中，根据上述方法将生物传感器连接至核酸，例如，寡核苷酸，以产生包含连接至分子粘附层的核酸分子的生物传感器。在产生了生物传感器之后，使生物传感器与含有目标核酸的样品在适合于目标核酸特异性地杂交到核酸捕捉剂的条件下接触。所述核酸捕捉剂与样品中的目标核酸特异性地结合。在从所述生物传感器洗掉未结合的核酸之后，使所述生物传感器与用发光标记物标记的第二核酸在用于特异性杂交的条件下接触。在从所述生物传感器去除未结合的第二核酸之后，可阅读所述生物传感器，以鉴定和/或定量原始样品中的分析物。
在这些实施方案中，可使用第二捕捉剂(即，“检测剂”)检测结合的分析物，所述第二捕捉剂可与荧光团或催化显色化合物的合成的酶缀合，所述显色化合物可以视觉检测或使用成像系统进行检测。在一个实施方案中，可使用辣根过氧化物酶(HRP)，其可将显色底物(例如，TMB、DAB、或ABTS)转化成有色产物，或作为替代，当使用化学发光底物时产生发光产物。在特定的实施方案中，由标记物产生的光信号具有从300nm到900nm范围的波长。在某些实施方案中，所述标记可以是电化学发光物的，因此，可通过向传感器供应电流而产生光信号。
在一些实施方案中，第二捕捉剂(即，检测剂)，例如，第二抗体或第二核酸，可与荧光团连接。用荧光团标记蛋白质(例如第二抗体)和核酸的方法是本领域公知的。化学发光标记物包括吖啶酯类和磺酰胺类、鲁米诺和异鲁米诺；电致化学发光标记物包括钌(II)螯合物、和其他已知的标记物。
实施例-1.单次和二次阴影沉积的D2PA
我们已经实验演示了本主题发明的方法。我们使用二氧化硅作为掩蔽材料，将其从顶部沿着垂直方向定向地蒸发到D2PA的表面上。捕捉剂仅结合到未被覆盖的金上。该测定被增强约50到100倍。
制造过程(a)在硅上热生长二氧化硅层；(b)通过使用200nm跨距立柱模具进行纳米压印；(c)在刻蚀残余光刻胶之后，蒸发铬垫并剥离；(d)将二氧化硅层刻蚀成被铬垫掩蔽的立柱阵列。(e)蒸发40nm金以自形成D2PA结构。没有涂层的D2PA的SEM示于图5.a中。
单次掩蔽阴影沉积，(自法线方向沉积4nm-二氧化硅掩蔽材料。对于二次阴影沉积，使晶片倾斜，角度为30°)。沉积的二氧化硅掩蔽厚度为3nm。
如图5b.中所示，用自组装DSU单分子层作为分子粘附层。使用人IgG作为捕捉剂。用BSA封闭。添加用IRDye800CW标记的抗IgG作为检测剂。在经掩蔽的D2PA中，捕捉剂和分析物与SAL的高放大区域结合，而不是像在未掩蔽的D2PA中那样结合SAL的所有区域，如图5c.中所示。
观察到巨大的荧光增强(图6)。在单次掩蔽的D2PA中的荧光增强超过未掩蔽的D2PA约100倍，而二次掩蔽的D2PA的增强是单次掩蔽的D2PA的约1.2倍。图7显示单次掩蔽的D2PA的检测限(LoD)，所述检测限为0.9aM，灵敏度是常规D2PA(LoD为43aM)的约50倍。
应用
主题传感器的应用包括但不限于(a)与某些疾病的阶段相关的化学化合物或生物分子的检测、纯化和定量，所述疾病例如传染病和寄生虫病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神障碍以及器质性疾病(例如肺部疾病、肾病)；(b)来自环境例如水、土壤的微生物(例如，病毒、真菌和细菌)或生物样品(例如，组织、体液)的检测、纯化和定量；(c)会对食品安全或国家安全造成危害的化合物或生物样品(例如，有毒废物、炭疽)的检测、定量；(d)医学或生理监测的生命参数例如葡萄糖、血氧水平、总血细胞计数的定量；(e)来自生物样品例如细胞、病毒、体液的特异性DNA或RNA的检测和定量；(f)用于基因组分析的染色体和线粒体中的DNA的基因序列的测序和比较；或者(g)例如在药物合成或纯化过程中检测反应产物。
检测可在各种样品基质如细胞、组织、体液、以及粪便中进行。目标体液包括但不限于羊水、房水、玻璃体液、血液(例如，全血、成分血、血浆、血清等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、粘液(包括鼻涕和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、炎性分泌物、唾液、皮脂(皮肤油脂)、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿以及呼气冷凝液。
虽然为了理解清楚的目的已经通过图解和实例相当详细地描述了前述实施方案，本领域普通技术人员根据以上教导容易想到可以对其作出某些变化和修改，而不脱离所附权利要求书的精神或范围。

Claims (37)

1.一种增强对与基片结合的分析物的检测的方法，所述方法包括：
(a)获得基片，所述基片包括位于该基片的表面上的信号放大层，其中该信号放大层包括高放大区域和低放大区域，且其中所述高放大区域比所述低放大区域更多地放大所述表面处的信号；
(b)选择性地改性所述基片的低放大区域和/或高放大区域，由此增加分析物与高放大区域结合的概率和/或降低分析物与低放大区域结合的概率；
由此改进检测所述分析物的灵敏度和/或其他感测特性。
2.权利要求1的方法，其中选择性地改性包括将掩蔽材料沉积到低放大区域上，以减少捕捉剂结合。
3.任一前述权利要求的方法，其中选择性地改性包括将粘附材料沉积到高放大区域上，以增加捕捉剂结合。
4.任一前述权利要求的方法，其中选择性地改性包括改变低放大区域的表面化学特性，以减少捕捉剂与低放大区域的结合。
5.任一前述权利要求的方法，其中选择性地改性包括改变高放大区域的表面化学特性，以增加捕捉剂与高放大区域的结合。
6.任一前述权利要求的方法，其中改性包括阴影沉积。
7.任一前述权利要求的方法，其中改性包括从相同沉积角度或多个不同沉积角度进行多次阴影沉积。
8.任一前述权利要求的方法，其中选择性地改性是通过掩蔽低放大区域完成的。
9.权利要求8的方法，其中掩蔽是使用PMMA、聚苯乙烯、嵌段共聚物、二氧化硅或氮化硅完成的。
10.任一前述权利要求的方法，其中所述方法还包括将捕捉剂附接于高放大区域，其中该捕捉剂选择性地结合所述分析物。
11.任一前述权利要求的方法，其中所述分析物选自蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、和具有不同形状的纳米颗粒。
12.任一前述权利要求的方法，其中在目标分析物与所述高放大区域结合之前或之后，用标记物标记目标分析物。
13.任一前述权利要求的方法，其中被放大的信号为拉曼散射、色度、发光、荧光、电致发光、化学发光、和/或电致化学发光。
14.任一前述权利要求的方法，其中选择性掩蔽增强下述的一者或多者：信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(误差棒更小)。
15.任一前述权利要求的方法，其中所述检测包括(a)测量在某一区域上的信号的总和，或(b)对图像中某一区域中的各个结合事件进行计数，由此提供对所述样品中的一种或多种分析物的量的估计。
16.任一前述权利要求的方法，其中所述信号放大层是D2PA。
17.任一前述权利要求的方法，其中所述信号放大层包括一个或多个金属盘和显著连续的金属膜，其中所述金属盘的主要部分与所述金属膜是分开的。
18.权利要求17的方法，其中所述金属盘具有选自以下形状组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。
19.权利要求17的方法，其中所述金属盘与所述金属膜分开的距离是0.5到30nm的范围，并且所述盘的平均横向尺寸在20nm到250nm的范围。
20.任一前述权利要求的方法，其中所述信号放大层包括一个或多个金属盘，所述金属盘具有选自下组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合，其中所述盘的平均横向尺寸在20nm到250nm的范围，并且邻近的盘之间的间隙在0.5到30nm的范围。
21.任一前述权利要求的方法，其中所述高放大区域包括所述表面。
22.任一前述权利要求的方法，其中所述高放大区域是具备具有尖锐曲率的金属纳米结构的区域，或者两个金属结构之间的小间隙的区域。
23.任一前述权利要求的方法，其中所述选择性掩蔽包括以朝向放大表面的一个方向沉积大致呈束的形式的掩蔽材料。
24.权利要求23的方法，其中，取决于掩蔽区域，所述方向与放大表面成不同的角度。
25.权利要求23的方法，其中定向沉积可以是采取不同角度的多次沉积。
26.任一前述权利要求的方法，其中所述掩蔽材料是PMMA、聚苯乙烯、嵌段共聚物、二氧化硅或氮化硅。
27.任一前述权利要求的方法，其中掩模具有1nm到10nm的厚度。
28.任一前述权利要求的方法，其中所述信号放大层在微流体通道的内部。
29.一种传感基片，其包括位于表面上的信号放大层，其中所述信号放大层包括高放大区域和低放大区域，其中高放大区域比低放大区域更多地放大所述表面处的信号，其中该基片的低放大区域已经被选择性地掩蔽，由此增加分析物会与高放大区域结合并被检测到的概率。
30.权利要求29的传感基片，其中所述掩模材料是PMMA、聚苯乙烯、嵌段共聚物、二氧化硅或氮化硅。
31.权利要求29或30的传感基片，其中掩模具有1nm到10nm的厚度。
32.权利要求29-31中任一项的传感基片，其中所述高放大区域具有结合到其上的捕捉剂。
33.权利要求29-32中任一项的传感基片，其中所述信号放大层是D2PA。
34.权利要求29-32中任一项的传感基片，其中所述信号放大层包括一个或多个金属盘和显著连续的金属膜，其中所述金属盘的主要部分与所述金属膜是分开的。
35.权利要求34的传感基片，其中所述金属盘具有选自以下形状组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。
36.权利要求34的传感基片，其中所述金属盘与所述金属膜分开的距离为0.5到30nm的范围，并且所述盘的平均横向尺寸在20nm到250nm的范围。
37.权利要求29-32中任一项的传感基片，其中所述信号放大层包括一个或多个金属盘，所述金属盘具有选自下组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合，其中所述盘的平均横向尺寸在20nm到250nm的范围，并且邻近的盘之间的间隙在0.5到30nm的范围。
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