CN111693691B - 一种基于卟啉结构的聚合物标签 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于卟啉结构的聚合物标签，所述聚合物标签包括聚合物骨架和至少一个能够结合金属的侧基，所述侧基具有卟啉结构。本发明提供的聚合物标签，其利用金属物质的电化学特性以及电化学法对金属离子发生氧化或还原反应检测的高度灵敏性进行标记物信号检测，可以大大提高检测灵敏度，拓展了基于含有金属的聚合物标签采用电化学检测方法在体外诊断领域中的应用。另外还利用金属元素在微波等离子体炬质谱仪或电感耦合等离子体质谱仪中能够产生强的脉冲信号的特性，拓展了基于含有金属的聚合物标签采用元素分析法在体外诊断领域中的应用。

Description

一种基于卟啉结构的聚合物标签
技术领域
本发明涉及一种用于标记生物分子的聚合物标签，尤其涉及一种基于卟啉结构的聚合物标签。
背景技术
目前，临床上应用的体外诊断方法主要包括放射性免疫法、分子诊断法、酶联免疫法、化学发光法、免疫层析法等，这些都已发展相对成熟，检验医学和卫生经济学的发展催生了对快速、准确的新型检测手段的内在需求。而标记物作为检测方法中的关键物质，也亟待取得新的研究进展，来推动体外诊断领域检测手段的更新换代。
申请号为200780027791.5的中国专利申请“聚合物骨架元素标签”中采用了二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)配体或1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10四乙酸配体作为结合金属的侧基，这些重复的金属结合侧基结构存在亲水性问题，其中螯合结合的重金属离子会因扩散效应，随着时间推移，扩散至水溶液中，由于重金属离子会使蛋白质分子中毒，从而可能进一步导致通过金属聚合物标签标记的抗体失去活性，对免疫反应效果产生影响，从而不能准确通过金属离子含量反映出待检测抗原物质含量。
基于电感耦合等离子体质谱和微波等离子体炬质谱的元素分析法可以用于金属元素的分析，将其应用于体外诊断领域中，具有灵敏度高、检测速度快，线性范围宽，易于推广应用的特点。另外，电化学检测技术是近年来新兴的灵敏分析检测技术，是一种以不同方式的电信号作为激发与检测信号的分析检测技术。电化学检测技术由于其操作简单、灵敏度高和检测速度快等优势而备受青睐，已经在生命科学、生物科学、临床分析、环境监测以及表面科学等领域得到了广泛的研究与应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种基于卟啉结构的聚合物标签。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于卟啉结构的聚合物标签，所述聚合物标签包括聚合物骨架和至少一个能够结合金属的侧基，所述侧基具有卟啉结构。
进一步地，其中所述卟啉结构通过共价键作用、螯合作用或吸附作用结合到聚合物骨架上；所述卟啉结构可具有不同类型的取代官能团，包括但不限于亲水或疏水官能团以及其他长链结构。
进一步地，其中所述侧基含有-NH2、-OH、-COOH、-SH、-SO3H、-CONH-、-CONH2、-COO-、-CH3或烷基链。
进一步地，其中所述侧基为原卟啉IX、原卟啉IX二钠盐、原卟啉二甲醚、尿卟啉八甲酯、卟啉III二盐酸盐、四苯基卟啉、MESO-四苯基卟啉、meso-四(间-苯酚)卟啉、间-四(4-氯苯基)卟啉、间-四(对-溴苯基)卟啉、5,15-二溴-10,20-二苯基卟啉、5,10,15,20-四(4-羟苯基)卟啉、5-(4-氨基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉、粪卟啉I二盐酸盐、粪卟啉I四甲酯、粪卟啉III四甲基酯、中卟啉IX二甲酯、中卟啉IX二盐酸盐、初卟啉I、初卟啉I二氢溴酸、5-溴-10,15,20-三苯基卟啉、尿卟啉I八甲基酯、尿卟啉III八甲酯、次卟啉二甲酯、5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉四(对甲苯磺酸盐)、四(4-磺基苯基)卟啉四钠盐十二水合物、5,10,15,20-四(4-三甲氨基)苯基卟啉四甲苯磺酸盐、5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉、5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉、四-(2-吡啶基)卟啉、5-(4-硝基苯基)-10,15,20-(三苯基)卟啉、5,10,15,20-四(4-甲氧苯基)卟啉、八乙基卟啉、内消旋-四羟乙基(4-甲氧苯基)卟啉、二(丙酸甲基)卟啉二盐酸盐、N-甲基卟啉二丙酸IX、5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉、血卟啉IX二甲酯或2,4-二乙氘卟啉二甲酯。
进一步地，其中所述聚合物骨架为线性结构、鱼骨形结构、星形结构、伞形结构、树枝状结构、毛刷状结构或网状结构。
进一步地，其中所述聚合物骨架为含有丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、N-异丙基丙酰胺或N-羟甲基丙烯酰胺的均聚物或共聚物。
进一步地，其中所述聚合物骨架通过可逆加成断裂(链转移)聚合(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)、阴离子聚合或发散法方式合成。
进一步地，其中所述金属选自原子序数为3、4、11-13、19-33、37-52、55-84或87-102之一的元素，包括稀土金属、镧系元素、贵金属、金属等，所述金属通过螯合作用或吸附作用结合到卟啉结构上。
进一步地，所述金属为锂Li、钠Na、钾K、铷Rb、铯Se、钫Fr、铍Be、镁Mg、钙Ca、锶Sr、钡Ba、镭Ra、镧La、铈Ce、镨Pr、钕Nd、钷Pm、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、锕Ac、钍Th、镤Pa、铀U、镎Np、钚Pu、镅Am、锔Cm、锫Bk、锎Cf、锿Es、镄Fm、钔Md、锘No、铹L、钪Sc、钛Ti、钒V、铬Cr、锰Mn、铁Fe、钴Co、镍Ni、铜Cu、锌Zn、钇Y、锆Zr、铌Nb、钼Mo、锝Tc、钌Ru、铑Rh、钯Pd、银Ag、镉Cd、铪Hf、钽Ta、钨W、铼Re、锇Os、铱Ir、铂Pt、金Au、汞Hg、铝Al、镓Ga、铟In、锡Sn、铊Tl、铅Pb、铋Bi、Uut、Uuq、Uup或Uuh、硼B、硅Si、锗Ge、砷As、锑Sb、碲Te或钋Po。
本发明还提供一种标记有上述聚合物标签的免疫复合物。
本发明进一步提供标记有上述聚合物标签的免疫复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：聚合物标签标记待测物的一株抗体；
步骤二：采用大纳米微球或磁性微球标记待测物的另一株抗体；
步骤三：将待测物、聚合物标签标记待测物的一株抗体和磁性微球标记待测物的另一株抗体加入到检测池中，进行温浴反应5-30min，形成聚合物标签标记的免疫复合物；
或者为，
步骤一：聚合物标签标记待测物的一株完全抗原；
步骤二：采用大纳米微球或磁性微球标记待测物的一株抗体；
步骤三：将待测物、聚合物标签标记待测物的一株完全抗原和磁性微球标记待测物的一株抗体加入到检测池中，进行温浴反应5—30min，形成聚合物标签标记的免疫复合物；
或者为，
步骤一：聚合物标签标记待测物的一株抗体；
步骤二：采用大纳米微球或磁性微球标记待测物的一株完全抗原；
步骤三：将待测物、聚合物标签标记待测物的一株抗体和磁性微球标记待测物的一株完全抗原加入到检测池中，进行温浴反应5—30min，形成聚合物标签标记的免疫复合物。
进一步地，其中所述所述聚合物标签与待测物抗体或抗原的连接方式具体为：
(1)通过具有特异亲和性的一对连接物进行连接，所述具有特异亲和性的一对连接物为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗；
(2)通过共价结合的方式进行连接，所述共价结合的官能团为羟基、氨基、羧基、醛基、巯基等；
(3)通过非共价结合的方式进行连接，所述非公价结合的方式为电荷吸附。
本发明进一步提供标记有上述聚合物标签的免疫复合物的免疫检测方法，包括如下步骤：
步骤a1，在反应池中制备上述的聚合物标签标记的免疫复合物；
步骤a2，将步骤a1中制备的含有聚合物标签标记的免疫复合物的混合液加入到微波等离子体炬质谱仪或电感耦合等离子体质谱仪中，聚合物标签标记的免疫复合物中的金属物质和混合液中游离的聚合物标签上的金属物质会同时产生强的脉冲信号，仪器中的检测器捕获特征金素元素的脉冲信号，并通过滤除混合液中游离的聚合物标签上的金属物质的脉冲信号获得聚合物标签标记的免疫复合物中的金属物质的脉冲信号，用聚合物标签标记的免疫复合物中的金属物质的脉冲信号的数量与待测物浓度之间用Log-Log或Log-Logit回归方程或四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
本发明又提供上述聚合物标签标记的免疫复合物的免疫检测方法，包括如下步骤：
步骤b1，将电极插入到检测池中，在检测池中制备上述的聚合物标签标记的免疫复合物；
步骤b2，通过离心或磁分离的方式将聚合物标签标记的免疫复合物富集到工作电极表面，移除反应后的液体，向检测池中加入电解液。
步骤b3，将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，聚合物标签标记的免疫复合物上的金属物质在工作电极表面发生氧化反应或还原反应，通过伏安法测定金属物质的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出金属离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Log或Log-Logit回归方程或四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
上述元素分析法或电化学检测方法，其中所述元素分析采用的配套仪器为微波等离子体炬质谱仪或电感耦合等离子体质谱仪；所述电化学检测方法为循环伏安法、微分伏安法、差分脉冲伏安法、交流阻抗谱图法、阳极溶出伏安法或者微分脉冲阳极溶出伏安法(电化学分析首选差分脉冲伏安法)。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的聚合物标签，其通过金属结合侧基螯合重金属离子，并通过共价键、螯合或附着于线性结构、鱼骨形结构、星形结构、伞形结构、树枝状结构、毛刷状结构、网状结构的聚合物骨架上，形成聚合物标签；将该聚合物标签标记待测物抗体或完全抗原应用于免疫反应中，进而应用到体外诊断领域中，拓展了体外诊断领域中标记物的种类。
2.本发明提供的聚合物标签，其采用的卟啉结构的侧基具有疏水性，含有卟啉结构的侧基结合重金属离子后，不会因为亲水性问题导致重金属离子在反应体系溶液中扩散，进而可解决因为重金属离子扩散使标记的免疫活性蛋白失去活性的技术问题，进而提高检测的准确性。
3.本发明提供的聚合物标签，其聚合物骨架具有比表面积大的特点，其骨架上能够结合大量的可结合金属的侧基，保证了聚合物标签中能够结合大量的含有金属的物质，进而能够极大地提高标记物的信号，以提高检测灵敏度。
4.本发明提供的聚合物标签，其利用金属元素在微波等离子体炬质谱仪或电感耦合等离子体质谱仪中能够产生强的脉冲信号的特性，采用元素分析方法进行标记物信号检测，该方法稳定性高、重复性好、结果准确可靠，实现了快速、灵敏检测的目的。
5.本发明提供的聚合物标签，其利用金属物质的电化学特性以及电化学法对金属离子发生氧化或还原反应检测的高度灵敏性进行标记物信号检测，可以大大提高检测灵敏度，拓展了基于含有金属的聚合物标签采用电化学检测方法在体外诊断领域中的应用。
附图说明
图1为本发明的聚合物标签的结构通式，1-聚合物骨架，2-含有卟啉结构的侧基；
图2为本发明的聚合物标签标记抗体的结构通式，1-聚合物骨架，2-含有卟啉结构的侧基，3-连接物，4-待测物抗体；
图3为本发明实施例1中带有卟啉结构的P(NAS-co-DMA)共聚物的合成以及螯合金属离子示意图；
图4为本发明实施例2中PAMAM树枝状大分子的合成示意图；
图5为本发明实施例2中带有卟啉结构PAMAM树枝状大分子的合成示意图；
图6为本发明实施例2中有卟啉结构的PAMAM树枝状大分子螯合金属离子示意图；
图7为本发明实施例3中AFP的标准曲线；
图8为本发明实施例4中检测不同浓度的FT3校准品后测得的Cu2+的伏安曲线图，0pg/mL，1.8pg/mL，4.5pg/mL，7.5pg/mL，12pg/mL，40pg/mL；
图9为本发明实施例4中FT3的标准曲线；
图10为本发明实施例5中Fer的标准曲线；
图11为本发明实施例6中检测不同浓度25-OH-D校准品后测得的Cd2+的伏安曲线图，a-0ng/mL、b-5ng/mL、c-15ng/mL、d-30ng/mL、e-60ng/mL、f-120ng/mL；
图12为本发明实施例6中25-OH-D的标准曲线。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明采用聚合物骨架和含有卟啉结构的侧基构建聚合物标签，聚合物标签的通式结构如图1所示。然后将聚合物标签标记抗体，应用于待测物的检测，聚合物标签标记抗体的结构通式如图2所示。
实施例1
本实施例以偶氮二异戊腈(AMBN)为引发剂，以二硫代苯甲酸叔丁酯(t-BDB)为链转移剂，采用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)方法合成NAS/DMA(N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺/N，N-二甲基丙烯酰胺)共聚物，然后将共聚物与5-(4-氨基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉反应制备带有卟啉结构的P(NAS-co-DMA)共聚物，在与金属离子(M++)进行螯合作用制备聚合物标签，其反应机理如图3所示。由于RAFT聚合是活性/可控的自由基聚合方法，因此得到的共聚物的分子量可控、共聚物中NAS的含量可控。共聚物中NAS的含量将决定卟啉环的含量。共聚单体N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)及其聚合物可溶于水，因此，NAS/DMA共聚物与5-(4-氨基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉反应形成的功能聚合物仍可溶于水，而大侧基卟啉基团为疏水基，更有利于与金属离子络合。
1.P(NAS-co-DMA)共聚物的合成
将N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)(0.99g，10mmol)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)(1.69g，10mmol)、偶氮二异戊腈(AMBN)、硫代苯甲酸叔丁酯(t-BDB)、40mL二噁烷(1，4-二氧六烷)加入到100mL的单口圆底烧瓶中，通氮气60min，然后将圆底烧瓶置于预先加热的80℃的油浴锅中反应12h。反应冷却后，将反应后的产物用旋转蒸发仪在30℃下浓缩8h，然后置于10mL的乙醚中沉降，抽滤，重复沉降三次，最后置于30℃的真空干燥箱中干燥36h，获得淡黄色粉末状的P(NAS-co-DMA)共聚物，干燥后测得共聚物的产率为79.2％。
将该共聚物的产物用凝胶渗透色谱(GPC)进行测定，得到数均分子量为21500kg/moL，分子量分布(PDI)为1.13。
2.带有卟啉结构的P(NAS-co-DMA)共聚物的合成
取50mg的P(NAS-co-DMA)共聚物加入到5mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中搅拌均匀，取50mg的5-(4-氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉加入到5mL的DMF溶剂中搅拌均匀，然后将两种溶液混合，在氩气的环境中以480r/min的转速搅拌12h后，在25℃±5℃下真空干燥36h后，得到带有卟啉结构的P(NAS-co-DMA)共聚物，记作卟啉-P(NAS-co-DMA)。
3.结合Cu2+的卟啉-P(NAS-co-DMA)聚合物标签的制备
取0.672g无水氯化铜加入到10mL的无水乙醇中，制备0.5mol/L的氯化铜溶液备用。然后取50mg的卟啉-P(NAS-co-DMA)聚合物加入到2mL的0.5mol/L的氯化铜溶液中，在额定频率40Hz下超声吸附2h。然后将吸附后的材料用10mL无水乙醇洗涤3次，真空30℃下干燥24h，获得结合铜离子的卟啉-P(NAS-co-DMA)聚合物标签，记作聚合物标签a。
实施例2
本实施例通过采用丙烯酸甲酯(MA)和乙二胺(EDA)通过发散法制备聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子，以乙二胺为核，在甲醇溶液中与丙烯酸甲酯进行重复的Michael加成和酰胺化的叠代反应合成获得，反应机理如图4所示。然后PAMAM树枝状大分子与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉反应制备带有卟啉结构聚酰胺-胺树枝状大分子，反应机理如图5所示。再与金属离子(M++)螯合制备聚合物标签，反应机理如图6所示。
1.聚酰胺-胺树枝状大分子的合成
(1)将12.02g(0.2moL)的乙二胺和48.06g(1.5moL)的甲醇加入到带有回流冷凝的反应容器中，在氩气保护下以180r/min的转速进行搅拌，向反应容器中滴加129.13g(1.5moL)的丙烯酸甲酯，在25℃下反应24h。在20℃、135Pa下进行减压蒸馏，除去溶剂甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到淡黄色的粘稠液体，在25℃±5℃下真空干燥36h后，得到0.5代PAMAM，产率为99.5％。
(2)取21g(0.05moL)的0.5代PAMAM和64.08g(2moL)甲醇加入到带有回流冷凝的反应容器中，在氩气保护下以180r/min的转速进行搅拌，向反应容器中滴加72g(1.2moL)的乙二胺，在25℃下反应24h。在72℃、266Pa下进行减压蒸馏，除去溶剂甲醇和过量的乙二胺，然后在25℃±5℃下真空干燥36h后，得到1代PAMAM，产率为99.6％。
(3)分别按照步骤(1)和步骤(2)的试验方法和加料比例，分别制备1.5代、2.5代的PAMAM，产率均超过90％。
2.带有卟啉结构的PAMAM树枝状大分子的合成
取50mg的PAMAM树枝状大分子将入到5mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中搅拌均匀，取50mg的5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉加入到5mL的DMF溶剂中搅拌均匀，然后将两种溶液混合，在氩气的环境中以480r/min的转速搅拌12h后，在25℃±5℃下真空干燥36h后，得到带有卟啉结构的聚酰胺-胺树枝状大分子，记作卟啉-PAMAM。
3.络合Cd2+的卟啉-PAMAM聚合物标签的制备
取0.916g无水氯化镉加入到10mL的无水乙醇中，制备0.5mol/L的氯化镉溶液备用。然后取50mg的卟啉-PAMAM加入到2mL的0.5mol/L的氯化镉溶液中，在额定频率40Hz下超声吸附2h。然后将吸附后的材料用10mL无水乙醇洗涤3次，真空30℃下干燥24h，获得结合镉离子的卟啉-PAMAM聚合物标签，记作聚合物标签b。
实施例3以检测甲胎蛋白(AFP)为例(夹心法-元素分析法)
1.聚合物标签a标记一株鼠抗人AFP单克隆抗体
(1)链酶亲和素标记的聚合物标签a的制备
取0.05g的聚合物标签a用2mL的PBST缓冲溶液洗涤三次，移除上层清液，然后向反应容器中加入5mL 50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)和5mL50mg/mL的N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，室温(25℃±5℃)下搅拌1h，然后用PBS缓冲溶液洗涤、离心3次，移除上清液。洗涤后，继续加入500μL，1mg/mL链酶亲和素的溶液，在室温(25℃±5℃)下以300r/min的转速搅拌6h，用PBS缓冲溶液以8000r/min的转速离心洗涤2次，然后用1mL封闭液进行封闭，继续用PBS缓冲溶液离心洗涤2次，获得链酶亲和素标记的聚合物标签a，最后用500μL甘油-20℃保存。
(2)生物素标记一株鼠抗人AFP单克隆抗体
先用碳酸钠缓冲液将一株鼠抗人AFP单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光以180r/min的转速搅拌4小时后透析；随后用N，N-二甲基酰胺(DMF)将6-氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL一株鼠抗人AFP单克隆抗体溶液中加入100μL上述DMF溶液，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌2小时；加入1mol/L氯化铵溶液9.6μL，室温(25℃±5℃)避光以180r/min的转速搅拌10分钟；然后将混合溶液转入透析袋，用磷酸(PBS)缓冲液4℃透析过夜，获得生物素标记的一株鼠抗人AFP单克隆抗体，最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
(3)取1mL的链酶亲和素标记的聚合物标签a和1mL的生物素标记一株鼠抗人AFP单克隆抗体于反应容器中，在室温(25℃±5℃)额定功率40Hz下震荡20min，反应后形成聚合物标签a标记的一株鼠抗人AFP单克隆抗体，并置于4℃下保存备用。
2.磁性微球标记另一株鼠抗人AFP单克隆抗体
取100μL羧基修饰的磁性微球悬浮液(2μm，购自江苏福隆生物技术有限公司)于反应池中，先用PBS缓冲溶液洗涤3次，然后加入200μL的0.5mol/L EDC溶液和200μL的0.5mol/L NHS溶液，室温(25℃±5℃)下以180r/min的转速搅拌2h活化磁性微球表面的羧基，经磁分离后，再用PBS缓冲溶液洗涤3次，得到活化的磁性微球。取250μL另一株鼠抗人AFP单克隆抗体加到上述活化的磁性微球中，室温(25℃±5℃)下孵育24h。加入250μL封闭液，室温(25℃±5℃)下孵育12h，封闭磁性微球未结合抗体的位点，用PBS缓冲溶液洗涤，然后将洗涤后的产物用PBS缓冲液稀释至200μL，即制得磁性微球标记另一株鼠抗人AFP单克隆抗体。
3.检测过程
(1)将10μL待测样本、10μL聚合物标签a标记一株鼠抗人AFP单克隆抗体和10μL磁性微球标记另一株鼠抗人AFP单克隆抗体加入到检测池中，在37℃下温育反应20min，形成聚合物标签a标记的AFP免疫复合物；
(2)将步骤(1)中制备的含有聚合物标签a标记的AFP免疫复合物的混合液加入到电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)中进行检测，聚合物标签a标记的AFP免疫复合物中的Cu2+和混合液中游离的聚合物标签a上的Cu2+会同时产生强的脉冲信号，仪器中的检测器捕获Cu2+的脉冲信号，并通过滤除混合液中游离的聚合物标签a上的Cu2+的脉冲信号获得聚合物标签a标记的AFP免疫复合物中的Cu2+的脉冲信号，用聚合物标签a标记的AFP免疫复合物中的Cu2+的脉冲信号的数量与待测物浓度之间用Log-Log进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
4.标准曲线的建立
配置浓度为0、5、15、50、150、600ng/mL的AFP校准品用于建立AFP标准曲线，检测灵敏度为5ng/mL，检测范围为5～600ng/mL，检测结果如表1所示，标准曲线方程为：Log(Y)＝3.1671+0.9298Log(X)，r＝0.9994，标准曲线如图7所示，Cu2+脉冲信号数量与校准品在浓度为5～600ng/mL的范围内具有良好的相关性。根据标准曲线计算得到的最低检测限为2.5ng/mL，表明该聚合物标签配合元素分析法具有较高的灵敏度。
表1
实施例4以检测游离三碘甲腺原氨酸(FT3)为例(竞争法-电化学检测法)
1.聚合物标签a标记一株FT3完全抗原
(1)链酶亲和素标记的聚合物标签a的制备
制备过程同实施例3中“(1)链酶亲和素标记的聚合物标签a的制备”过程相同
(2)生物素标记一株FT3完全抗原
先用碳酸钠缓冲液将一株FT3完全抗原稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时后透析；随后用N，N-二甲基酰胺(DMF)将6-氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL一株FT3完全抗原溶液中加入100μL上述DMF溶液，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌2小时；加入1mol/L氯化铵溶液9.6μL，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜，获得生物素标记的一株FT3完全抗原，最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
(3)取1mL的链酶亲和素标记的聚合物标签a和1mL的生物素标记一株FT3完全抗原于反应容器中，在室温(25℃±5℃)下震荡20min，反应后形成聚合物标签a标记的一株FT3完全抗原，并置于4℃下保存备用。
2.磁性微球标记一株鼠抗人FT3单克隆抗体
取100μL羧基修饰的磁性微球悬浮液(2μm，购自江苏福隆生物技术有限公司)于反应池中，先用PBS缓冲溶液洗涤3次，然后加入200μL的0.5mol/L EDC溶液和200μL的0.5mol/L NHS溶液，室温(25℃±5℃)下搅拌2h活化磁性微球表面的羧基，经磁分离后，再用PBS缓冲溶液洗涤3次，得到活化的磁性微球。
取250μL一株鼠抗人FT3单克隆抗体加到上述活化的磁性微球中，室温(25℃±5℃)下孵育24h。加入250μL封闭液，室温(25℃±5℃)下孵育12h，封闭磁性微球未结合抗体的位点，用PBS缓冲溶液洗涤，然后将洗涤后的产物用PBS缓冲液稀释至200μL，即制得磁性微球标记一株鼠抗人FT3单克隆抗体。
3.检测过程
(1)将电极插入到检测池中，在检测池中加入10μL待测样本、10μL聚合物标签a标记的一株FT3完全抗原和10μL磁性微球标记一株鼠抗人FT3单克隆抗体，在37℃下温育反应20min，形成聚合物标签a标记的FT3免疫复合物；
(2)磁分离的方式将聚合物标签标记的免疫复合物富集到工作电极表面，移除反应后的液体，向检测池中加入100μL柠檬酸电解液。
(3)将工作电极(石墨电极)、对电极(铂电极)和参比电极(Ag/AgCl)连接到电化学工作站上，聚合物标签a标记的FT3免疫复合物上的Cu2+在工作电极表面发生还原反应，通过伏安法测定Cu2+的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出Cu2+的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与FT3浓度之间用四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算FT3的含量。
4.标准曲线的建立
配置浓度为0、1.8、4.5、7.5、12、40pg/mL的FT3校准品用于建立FT3标准曲线，检测灵敏度为1.8pg/mL，检测范围为1.8～40pg/mL。检测不同浓度的FT3校准品后测得的Cu2+的伏安曲线如图8所示，检测结果如表2所示，四参数线性拟合方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中A＝467.43923，B＝1.46793，C＝2.54476，D＝20.08438，R2＝0.99968，标准曲线如图9所示，T/C值与校准品在浓度为1.8～40pg/mL的范围内具有良好的相关性。根据标准曲线计算得到的最低检测限为0.9pg/mL，表明该聚合物标签配合电化学检测法具有较高的灵敏度。
表2
标准浓度(pg/mL) 积分面积
0 467.12
1.8 301.04
4.5 150.78
7.5 98.45
12 64.96
40 25.37
实施例5以检测铁蛋白(Fer)为例(夹心法-元素分析法)
1.聚合物标签b标记一株鼠抗人Fer单克隆抗体
(1)链酶亲和素标记的聚合物标签b的制备
取0.05g的聚合物标签b用2mL的PBST缓冲溶液洗涤三次，移除上层清液，然后向反应容器中加入5mL 50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)和5mL50mg/mL的N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，室温(25℃±5℃)下搅拌1h，然后用PBS缓冲溶液洗涤、离心3次，移除上清液。洗涤后，继续加入500μL，1mg/mL链酶亲和素的溶液，在室温(25℃±5℃)下以300r/min的转速搅拌6h，用PBS缓冲溶液以8000r/min的转速离心洗涤2次，然后用1mL封闭液进行封闭4h，继续用PBS缓冲溶液以8000r/min的转速离心洗涤2次，获得链酶亲和素标记的聚合物标签b，最后用500μL甘油-20℃保存。
(2)生物素标记一株鼠抗人Fer单克隆抗体
先用碳酸钠缓冲液将一株鼠抗人Fer单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光以180r/min的转速搅拌4小时后透析；随后用N，N-二甲基酰胺(DMF)将6-氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL一株鼠抗人Fer单克隆抗体溶液中加入100μL上述DMF溶液，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌2小时；加入1mol/L氯化铵溶液9.6μL，室温(25℃±5℃)避光以180r/min的转速搅拌10分钟得到混合溶液；然后将该混合溶液转入透析袋，用磷酸(PBS)缓冲液4℃透析过夜，获得生物素标记的一株鼠抗人Fer单克隆抗体，最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
(3)取1mL的链酶亲和素标记的聚合物标签b和1mL的生物素标记一株鼠抗人Fer单克隆抗体于反应容器中，在室温(25℃±5℃)额定功率40Hz下震荡20min，反应后形成聚合物标签b标记的一株鼠抗人Fer单克隆抗体，并置于4℃下保存备用。
2.磁性微球标记另一株鼠抗人Fer单克隆抗体
取100μL羧基修饰的磁性微球悬浮液(2μm，购自江苏福隆生物技术有限公司)于反应池中，先用PBS缓冲溶液洗涤3次，然后加入200μL的0.5mol/L EDC溶液和200μL的0.5mol/L NHS溶液，室温(25℃±5℃)下以180r/min的转速搅拌2h活化磁性微球表面的羧基，经磁分离后，再用PBS缓冲溶液洗涤3次，得到活化的磁性微球。取250μL另一株鼠抗人Fer单克隆抗体加到上述活化的磁性微球中，室温(25℃±5℃)下孵育24h。加入250μL封闭液，室温(25℃±5℃)下孵育12h，封闭磁性微球未结合抗体的位点，用PBS缓冲溶液洗涤，然后将洗涤后的产物用PBS缓冲液稀释至200μL，即制得磁性微球标记另一株鼠抗人Fer单克隆抗体。
3.检测过程
(1)将10μL待测样本、10μL聚合物标签b标记一株鼠抗人Fer单克隆抗体和10μL磁性微球标记另一株鼠抗人Fer单克隆抗体加入到检测池中，在37℃下温育反应20min，形成聚合物标签b标记的Fer免疫复合物；
(2)将步骤(1)中制备的含有聚合物标签b标记的Fer免疫复合物的混合液加入到电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)中进行检测，聚合物标签b标记的Fer免疫复合物中的Cd2+和混合液中游离的聚合物标签b上的Cd2+会同时产生强的脉冲信号，仪器中的检测器捕获Cd2+的脉冲信号，并通过滤除混合液中游离的聚合物标ba上的Cd2+的脉冲信号获得聚合物标签b标记的Fer免疫复合物中的Cd2+的脉冲信号，用聚合物标签b标记的Fer免疫复合物中的Cd2+的脉冲信号的数量与待测物浓度之间用Log-Log进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
4.标准曲线的建立
配置浓度为0、10、40、100、250、500ng/mL的Fer校准品用于建立Fer标准曲线，检测灵敏度为10ng/mL，检测范围为10～500ng/mL，检测结果如表3所示，标准曲线方程为：Log(Y)＝2.7703+1.0073Log(X)，r＝0.9994，标准曲线如图10所示，Cd2+脉冲信号数量与校准品在浓度为10～500ng/mL的范围内具有良好的相关性。根据标准曲线计算得到的最低检测限为5ng/mL，表明该聚合物标签配合元素分析法具有较高的灵敏度。
表3
Fer校准品(ng/mL) 0 10 40 100 250 500
Cd2+脉冲信号数量(cps) 1893 5766 25064 65126 144150 308300
实施例6以检测25-羟基维生素D(25-OH-D)为例(竞争法-电化学检测法)
1.聚合物标签b标记一株25-OH-D完全抗原
(1)链酶亲和素标记聚合物标签b的制备
同实施例5中“(1)链酶亲和素标记聚合物标签b的制备”过程相同
(2)生物素标记一株25-OH-D完全抗原
先用碳酸钠缓冲液将一株25-OH-D完全抗原稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光以180r/min的转速搅拌4小时后透析；随后用N，N-二甲基酰胺(DMF)将6-氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL一株25-OH-D完全抗原溶液中加入100μL上述DMF溶液，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌2小时；加入1mol/L氯化铵溶液9.6μL，室温(25℃±5℃)避光以180r/min的转速搅拌10分钟得到混合溶液；然后将该混合溶液转入透析袋，用磷酸(PBS)缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
(3)取1mL的链酶亲和素标记的聚合物标签b和1mL的生物素标记一株25-OH-D完全抗原于反应容器中，在室温(25℃±5℃)额定功率40Hz下震荡20min，反应后形成聚合物标签b标记的一株25-OH-D完全抗原，并置于4℃下保存备用。
2.磁性微球标记一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体
取100μL羧基修饰的磁性微球悬浮液(2μm，购自江苏福隆生物技术有限公司)于反应池中，先用PBS缓冲溶液洗涤3次，然后加入200μL的0.5mol/L EDC溶液和200μL的0.5mol/L NHS溶液，室温(25℃±5℃)下以180r/min的转速搅拌2h活化磁性微球表面的羧基，经磁分离后，再用PBS缓冲溶液洗涤3次，得到活化的磁性微球。取250μL一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体加到上述活化的磁性微球中，室温(25℃±5℃)下孵育24h。加入250μL封闭液，室温(25℃±5℃)下孵育12h，封闭磁性微球未结合抗体的位点，用PBS缓冲溶液洗涤，然后将洗涤后的产物用PBS缓冲液稀释至200μL，即制得磁性微球标记一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体。
3.检测过程
(1)将电极插入到检测池中，在检测池中加入10μL待测样本、10μL聚合物标签a标记的一株25-OH-D完全抗原和10μL磁性微球标记一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体，在37℃下温育反应20min，形成聚合物标签a标记的25-OH-D免疫复合物；
(2)磁分离的方式将聚合物标签标记的免疫复合物富集到工作电极表面，移除反应后的液体，向检测池中加入100μL柠檬酸电解液。
(3)将工作电极(石墨电极)、对电极(铂电极)和参比电极(Ag/AgCl)连接到电化学工作站上，聚合物标签a标记的25-OH-D免疫复合物上的Cd2+在工作电极表面发生还原反应，通过伏安法测定Cd2+的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出Cd2+的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与25-OH-D浓度之间用四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算25-OH-D的含量。
4.标准曲线的建立
配置浓度为0、5、15、30、60、120ng/mL的25-OH-D校准品用于建立25-OH-D标准曲线，检测灵敏度为5ng/mL，检测范围为5～120ng/mL，检测获得的镉离子的伏安曲线图如图11所示，检测结果如表4所示，四参数线性拟合方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中A＝280.4951，B＝0.8963，C＝1.6217，D＝23.0958，R2＝0.99258，标准曲线如图12所示，T/C值与校准品在浓度为0.5～200ng/mL的范围内具有良好的相关性。根据标准曲线计算得到的最低检测限为0.25ng/mL，表明该聚合物标签配合电化学检测法具有较高的灵敏度。
表4
附：所需溶液配制
(1)PBS缓冲溶液
(2)碳酸钠缓冲溶液
碳酸钠 4.33g
碳酸氢钠 2.96g
纯化水定容至1000mL；
(3)磷酸缓冲溶液
磷酸二氢钠 0.99g
磷酸氢二钠 5.16g
纯化水定容至1000mL；
(4)PBST
(5)封闭液
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (11)

1.一种用于对待测物起到标记物作用的基于卟啉结构的聚合物标签，其特征在于，所述聚合物标签包括聚合物骨架和至少一个能够结合金属的侧基，所述侧基具有卟啉结构；
所述金属为铜或镉；所述卟啉结构为5-(4-氨基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉或5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉。
2.如权利要求1所述的基于卟啉结构的聚合物标签，其特征在于，所述卟啉结构通过共价键作用、螯合作用或吸附作用结合到聚合物骨架上。
3.如权利要求1所述的基于卟啉结构的聚合物标签，其特征在于，所述聚合物骨架为线性结构、鱼骨形结构、星形结构、伞形结构、树枝状结构、毛刷状结构或网状结构。
4.如权利要求1所述的基于卟啉结构的聚合物标签，其特征在于，所述聚合物骨架为含有丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、N-异丙基丙酰胺或N-羟甲基丙烯酰胺的均聚物或共聚物。
5.如权利要求1所述的基于卟啉结构的聚合物标签，其特征在于，所述聚合物骨架通过可逆加成断裂聚合、原子转移自由基聚合、阴离子聚合或发散法方式合成。
6.如权利要求1所述的基于卟啉结构的聚合物标签，其特征在于，所述金属通过螯合作用或吸附作用结合到卟啉结构上。
7.一种标记有权利要求1-6任一项所述的聚合物标签的免疫复合物。
8.一种权利要求7所述的标记有聚合物标签的免疫复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：聚合物标签标记待测物的一株抗体；
步骤二：采用大纳米微球或磁性微球标记待测物的另一株抗体；
步骤三：将待测物、聚合物标签标记待测物的一株抗体和磁性微球标记待测物的另一株抗体加入到检测池中，进行温浴反应5-30min，形成聚合物标签标记的免疫复合物；
或者为，
步骤一：聚合物标签标记待测物的一株完全抗原；
步骤二：采用大纳米微球或磁性微球标记待测物的一株抗体；
步骤三：将待测物、聚合物标签标记待测物的一株完全抗原和磁性微球标记待测物的一株抗体加入到检测池中，进行温浴反应5-30min，形成聚合物标签标记的免疫复合物；
或者为，
步骤一：聚合物标签标记待测物的一株抗体；
步骤二：采用大纳米微球或磁性微球标记待测物的一株完全抗原；
步骤三：将待测物、聚合物标签标记待测物的一株抗体和磁性微球标记待测物的一株完全抗原加入到检测池中，进行温浴反应5—30min，形成聚合物标签标记的免疫复合物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物标签与待测物抗体或抗原的连接方式具体为：
(1)通过具有特异亲和性的一对连接物进行连接，所述具有特异亲和性的一对连接物为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗；
(2)通过共价结合的方式进行连接，所述共价结合的官能团为羟基、氨基、羧基、醛基、巯基等；
(3)通过非共价结合的方式进行连接，所述非共价结合的方式为电荷吸附。
10.一种权利要求9所述的标记有所述聚合物标签的免疫复合物的免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤a1，在反应池中制备所述的聚合物标签标记的免疫复合物；
步骤a2，将步骤a1中制备的含有聚合物标签标记的免疫复合物的混合液加入到微波等离子体炬质谱仪或电感耦合等离子体质谱仪中，聚合物标签标记的免疫复合物中的金属物质和混合液中游离的聚合物标签上的金属物质会同时产生强的脉冲信号，仪器中的检测器捕获特征金素元素的脉冲信号，并通过滤除混合液中游离的聚合物标签上的金属物质的脉冲信号获得聚合物标签标记的免疫复合物中的金属物质的脉冲信号，用聚合物标签标记的免疫复合物中的金属物质的脉冲信号的数量与待测物浓度之间用Log-Log或Log-Logit回归方程或四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
11.一种权利要求9所述的标记有所述聚合物标签的免疫复合物的免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤b1，将电极插入到检测池中，在检测池中制备所述的聚合物标签标记的免疫复合物；
步骤b2，通过离心或磁分离的方式将聚合物标签标记的免疫复合物富集到工作电极表面，移除反应后的液体，向检测池中加入电解液；
步骤b3，将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，聚合物标签标记的免疫复合物上的金属物质在工作电极表面发生氧化反应或还原反应，通过伏安法测定金属物质的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出金属离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Log或Log-Logit回归方程或四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
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