CN105246682A - 用于化学和生物感测的复合纳米颗粒结构 - Google Patents

用于化学和生物感测的复合纳米颗粒结构 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种纳米颗粒，其增强该纳米颗粒和/或沉积在该纳米颗粒表面上的分子/材料与光的相互作用，该纳米颗粒包括成对的堆叠的金属盘，该成对的金属盘由非金属间隔物分开，其中：(a)所述金属盘及间隔物的尺寸小于所述光的波长；且(b)该纳米颗粒对所述光相互作用的增强是单个金属盘增强的至少3倍。还提供了制造该纳米颗粒的方法以及在多种测定中使用该纳米颗粒的方法。

Description

用于化学和生物感测的复合纳米颗粒结构
关于联邦资助的研究的声明
本发明是在美国政府的支持下由(美国)国防部高级研究计划局(DARPA)授予的基金号FA9550-08-1-0222资助而做出的。美国政府对本发明具有某些权利。
交叉援引
本申请是美国申请序列号2013年3月15日提交的美国申请序列号13/838,600(NSNR-003)的部分继续申请；该13/838,600号申请要求获得2012年4月10日提交的美国临时专利序列号61/622,226的权益，并且是2013年6月13日提交的美国专利申请序列号13/699,270的部分继续申请；该13/699,270号申请是基于US2011/037455根据美国专利法第317条提交的；该US2011/037455于2011年5月20日提交，并要求获得2010年5月21日提交的美国临时申请序列号61/347,178的权益；
本申请还是2013年6月13日提交的美国专利申请序列号13/699,270(NSNR-001)的部分继续申请，该13/699,270号申请是基于国际专利申请序列号US2011/037455根据美国专利法第371条提交的，并要求获得2010年5月21日提交的美国临时专利申请序列号61/347,178的权益；和
本申请还要求获得下述专利申请的权益：2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/801,424(NSNR-004PRV)、2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/801,096(NSNR-005PRV),2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/800,915(NSNR-006PRV),2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/793,092(NSNR-008PRV),2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/801,933(NSNR-009PRV),2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/794,317(NSNR-010PRV),2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/802,020(NSNR-011PRV)和2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/802,223(NSNR-012PRV)，通过援引并入上述全部专利申请用于所有目的。
背景
亟需开发新的纳米颗粒结构、以及用于化学和生物感测应用的新制造方法。本主题纳米颗粒结果可以大大增强(例如放大)布置在纳米颗粒表面上或附近的光信号(尤其是发光(例如荧光))和表面增强拉曼散射(SERS))；改善对布置在纳米颗粒上或附近的分子的化学和/或生物性质的检测灵敏度，改善纳米颗粒穿透生物细胞或材料的性能，及减少生物毒性。本主题的制造方法使得制造这种通过其他方式无法制造或难以制造的新纳米结构成为可能。
常规的纳米颗粒受其制造方法(化学合成)的限制，具有简单的建构(球、杆和壳)、简单和平滑的表面、以及简单的组成(纯粹是电介质、纯粹是金属、或者完全被金属包封的电介质(或反之)。这些都给体内诊断带来了严重的缺点。主要缺点有四个：(a)等离子增强比基片上制造的金簇(Aucluster)或其他等离子结构低；(b)对体内诊断波长(例如对AuNP为300nm)而言颗粒大小偏大；(b)生物不可降解(对于金属颗粒或纳米壳而言)；(d)表面性质在整个表面上相似，而非具有表面位置选择性。它们还具有较大的颗粒大小变化(～15％)。这些缺点导致(i)体内性能差，亮度低(荧光或SERS中的增强低)，体内适宜性差(NP进入细胞慢，进入的数量少)，生物相容性/安全性差(侵入性和颗粒积累)，以及选择性差。
在生物安全的体内基于等离子的诊断和治疗技术中，一个最明显的障碍是如何满足对纳米颗粒大小的两个完全冲突的要求：为了更好的治疗和诊断效率(即等离子有效性和足够的血液保留时间)要求大的大小(超过50nm)，而为了低毒性(即从细胞/身体快速清除，从而零积累)要求极小的大小(低于10nm)。
另一个主要障碍是，常规的纳米颗粒制造方法使得现有的等离子纳米颗粒无法具备为实现超高等离子增强(比现有的高几个数量级)所必需的复杂结构。
例如，为了实现足够的等离子效应和足够的血液保留时间，常规方法利用300nm直径的金球体，60nm直径的纳米壳，和10nm直径及60nm长的纳米杆。这些尺寸比适于细胞或身体中快速清除的尺寸(应在10nm以下)大得多。此外，为了实现超高等离子增强，它需要复杂的颗粒结构，例如纳米间隙(nanogaps)和纳米锐边(nano-sharp-edges)，而这些结构在现有的NP中缺如，使得它们的等离子效力比我们能实现的低几个数量级(见第III节)。很明显，现有的纳米颗粒无法同时满足等离子有效性和生物安全性二者对尺寸的要求，因为这些纳米颗粒不能生物降解，因此不能从等离子效力所需的大尺寸改变为生物清除所需的小尺寸。
总之，所有既往的手段均无法解决这两个主要障碍：由互相冲突的颗粒尺寸要求导致的功效-安全性矛盾，和由于缺乏纳米结构中的复杂性而导致的低等离子效应。
因此，为了推动诊断(体内和体外)和单生物细胞分析的进步，我们需要与常规手段根本不同的新纳米颗粒平台(不同的建构和物理原理)以及新制造方法。这就是本发明的主题。
概要
下文的简短概要不意在包括本发明的所有特征和方面，也不暗示本发明必须包括在该概要中讨论的所有特征和方面。
本发明涉及纳米颗粒结构、制造方法和在化学和生物感测中的应用。本发明中的纳米颗粒具有与常规的金属纳米颗粒非常不同的结构和材料，这使得该新纳米颗粒能够具有许多在感测和诊断技术中期望的独特性质，包括远比常规金属纳米颗粒更有效地增强光信号感测，同时尺寸小得多。小的尺寸对于体内测试和生物安全性是重要的。这些纳米颗粒的独特结构无法通过常规合成方法制作，而是通过模板沉积(templatedeposition)和剥落(exfoliation)制造的。本发明的纳米颗粒也是生物可降解的。具体地，所述的纳米颗粒结构能够大大增强(例如放大)布置于纳米颗粒表面上或附近的光吸收、光散射和光辐射，光信号(尤其是发光(例如荧光)和表面增强拉曼散射(SERS))(纳米颗粒可以在生物细胞和/或人体内部)；改善对布置于该纳米颗粒之上或附近的分子的化学和/或生物性质的检测灵敏度，改善纳米颗粒穿透生物细胞或材料的性能，及降低生物毒性。本制造方法使得制造这样的新纳米结构成为可能，它们用其他方式是不可能制造或难以制造的。功能化的纳米颗粒可以用作生物和化学测定系统来在人和动物的单个细胞中、组织中以及体内检测生物和化学标志物(又称“分析物”)，例如蛋白质、DNA、RNA、以及其他有机和无机分子。
附图简述
本领域技术人员将会理解，如下所述的附图仅用于说明目的。所述附图并不意图以任何方式限制本文教导的范围。有些附图并未依比例给出。
图1.堆叠的纳米颗粒(S-NP)的示意图：(a)被单一电介质盘分隔开的成对金属盘；(b)在顶部有磁性盘的S-NP；(c)具有5个盘的S-NP；(d)通过另一种电介质材料粘合成单一颗粒的4个S-NP。
图2.下列的示意图：(a)DS-NP：具有自组装在侧壁上的金属纳米点的S-NP，和(b)ES-NP(增强的S-NP)，具有两个非金属盘460，其中每个非金属盘均覆盖S-NP的金属盘的外表面：
图3.堆叠的纳米颗粒(S-NP)的生物降解。
图4.涂覆分子粘附层、而后包被捕捉剂的示意图。
图5.一个示例性的抗体检测测定的图示。
图6.一个示例性的核酸检测测定的图示。
图7.另一个示例性的核酸检测测定的图示。
图8.显示了生物可降解电介质的Nano-PrinTED[模板可剥落沉积式纳米印刷(nanoprintbytemplatedexfoliatabledeposition)]和蘸印(Dip-print)的流程图。Nano-PrinTED包括三个关键步骤：(i)提供具有纳米结构化突出部(protrusions)或空洞(hollows)的模板(例如4”晶片上的密集纳米立柱阵列)，(ii)沉积脱模层(任选的)，然后沉积多层复合材料，以在模板的突出部的基座上或空洞内部形成纳米颗粒，和(iii)通过转印(transferprint)或剥离(liftoff)将纳米颗粒从模板剥落。蘸印用于成型生物可降解电介质，因为这样的材料无法热蒸镀。蘸印首先将一薄层具有合适粘度的液体聚合物前体置于板(称为“材料转移板”)上，然后将Nano-PrinTED中使用的模板压住该材料转移板，从而仅让模板的立柱的顶端沾上聚合物前体。然后让聚合物前体固化而形成固体聚合物。被蘸印的聚合物将被用于堆叠层之间的电介质，以及将不同的柱(columns)粘合成单一颗粒的电介质(注意，取决于立柱子之间的间隙大小，将使用不同粘度的液体)。
图9Nano-PrinTED(模板可剥落沉积式纳米印刷)——一种新的纳米颗粒制造技术。下述的示意图：(a)通过光刻(例如NIL(纳米压印光刻))制造的立柱模板；(b)多次沉积和自组装以形成D2颗粒；(c)转印S-NP到另一基片；并置于溶液中。
图10Nano-PrinTED(模板可剥落沉积式纳米印刷)——方法2。示意图：(a)通过光刻(例如NIL)制造的孔模板(聚合物)；(b)多次沉积并自组装以在孔内形成D2颗粒；(c)剥离S-NP周围的聚合物(包括顶部堆叠的平面)，并置于溶液中。
图11.生物可降解电介质的蘸印。示意图：(a)通过光刻(例如NIL)制造的立柱模板；(b)在立柱的顶部沉积薄的金属盘；(c)将一层具有合适粘度的液体聚合物前体置于板(称为“材料转移板”)上；然后用Nano-PrinTED中使用的模板压住材料转移板，(d)让聚合物前体仅沾在模板的立柱的顶部。(e)如果需要，增加另一沉积步骤以形成顶部金属盘，和(f)将S-NP置于溶液中。
图12.“粘合”各立柱的生物可降解电介质的蘸印。与电介质间隔物的蘸印相同，只是可以改变聚合物前体的粘度，以让聚合物前体填充柱之间的间隙。(a)4个封闭的立柱模板，其顶部有4个S-NP。(b)让模板上的S-NP的顶部沾上聚合物前体，填充4个S-NP之间的间隙并粘合这些S-NP。(c)置入溶液中。
图13.下列的扫描电子显微镜(SEM)所见：(a)双金属盘和单电介质(D-颗粒)；(b)三金属(或磁性)电介质-纳米颗粒(TS-NP)；(c)通过“液化自完善”(self-perfectionbyliquefaction)改变两个金属盘之形状后的D-颗粒。(d)模板剥离之后基片上的D-颗粒阵列。
图14.下列的扫描电子显微镜(SEM)所见：(a)转印后基片上的D-颗粒阵列。(b)剥落到溶液中的D-颗粒。
图15.Nano-PrinTED(模板可剥落沉积式纳米印刷)——一种新的纳米颗粒制造技术。上排：示意图。下排：实验结果的扫描电子显微镜(SEM)所见。(a)通过光刻(例如NIL)制造的立柱模板；(b)多次沉积和自组装以形成D-颗粒；(c)转印DP到另一基片；(d)置入溶液。(e-h)，SEM图像。
图16.Nano-PriTED和蘸印控制纳米颗粒结构尺寸(包括每个个别组成部分的尺寸和形状，它们的间距，以及最终的颗粒)的精度好得多。(a)脱模前的D2-P的SEM照片，(b)测得的大小分布。测得的通过Nano-PrinTED制造的D2-颗粒的大小变化(<5％)比通过化学合成制备的金纳米颗粒(AuNP)(>15％)低3倍。
图17具有5nm至30nm的二氧化硅层厚度和20nm的恒定金层厚度的D2-颗粒的消光光谱的测量。等离子共振峰波长随着SiO2层厚度的增加发生红移。
图18.对于相同的800nm共振波长，具有不同建构的纳米颗粒所需要的大小的模拟。其清楚地显示：对于给定的共振波长，S-NP比常规的金属球和盘的颗粒尺寸小得多。
图19(a)测得的BPE的表面增强拉曼光谱(SERS)信号，和(b)IR-800染料与单一D2-颗粒和金纳米颗粒的荧光信号。单一D2-颗粒所具有的SERS/荧光增强高于具有相似直径的金纳米颗粒超过100/30倍。
相应的附图标记在附图的全部若干图面中均指示相应的部件。应当理解的是，附图用于示出本公开中给出的构思，并且不是依比例给出的。
在详细解释本发明的任何实施方案之前应当理解的是，本发明的应用不限于下文描述中陈述的或附图中图示的构造细节和部件布置。
定义
在更详细地描述例示性实施方案之前，列出下述定义，以说明并界定说明书中使用的术语的含义和范围。
术语“分子粘附层”是指具有限定厚度的一层或多层分子，其包括附接于S-NP的内表面，和能够与捕捉剂结合的外(外部)表面。
术语“捕捉剂反应性基团”指分子中具有化学功能的部分，其对捕捉剂具有反应性，即，能与捕捉剂中的部分(例如羟基、硫氢基、羧基或胺基团)反应生成稳定的强(例如共价)键。
如本文中使用的，术语“捕捉剂”指经由相互作用结合靶分析物的作用剂，该相互作用足以允许该作用剂结合该靶分子并从不同分子的异质混合物中浓缩该靶分子。结合相互作用通常由捕捉剂的亲和力区介导。典型的捕捉剂包括任何能特异性结合靶分析物的部分。某些捕捉剂以小于约10-6M(例如小于约10-7M、小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M、小于约10-12M、至低达10-16M)的解离常数(KD)特异性结合靶分子，而与其它分子没有显著结合。例示性捕捉剂包括但不限于蛋白质(例如抗体)和核酸(例如寡核苷酸、DNA、RNA，包括适体)。
术语“纳米传感器”是指用捕捉剂功能化的纳米颗粒。
术语“特异性结合”和“选择性结合”指捕捉剂优先结合存在于不同靶分子的异质混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用会区分样品中想要的(例如有活性的)和不想要的(例如无活性的)靶分子，通常大于约10至100倍或更多(例如大于约1000或10,000倍)。
术语“蛋白质”指任何长度的氨基酸聚合物形式，即大于2个氨基酸、大于约5个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基酸、大于约200个氨基酸、大于约500个氨基酸、大于约1000个氨基酸、大于约2000个氨基酸，通常不大于约10,000个氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸，和具有经过修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源或同源前导序列、带有或不带有N端甲硫氨酸残基的融合物；带免疫学标签的蛋白质；具有可检测的融合配偶的融合蛋白，例如包含荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶的融合蛋白；等等。这些术语还包括在细胞中经过翻译后修饰(例如糖基化、切割、分泌、异戊二烯化、羧基化、磷酸化、等)的多肽，具有二级或三级结构的多肽，和与其它部分(例如其它多肽、原子、辅因子等)强结合(例如共价或非共价)的多肽。
术语“抗体”意图指免疫球蛋白或其任何片段，包括能够结合抗原的单链抗体和噬菌体展示抗体。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，描述由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任何长度的聚合物，或合成生成的、能够与天然存在的核酸以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式杂交(例如能参与Watson-Crick碱基配对相互作用)的化合物(例如美国专利No.5,948,902及其引用的参考文献中记载的PNA)。
如本文中使用的，术语“互补”指核苷酸序列通过氢键与感兴趣的靶核酸碱基配对。在规范的Watson-Crick碱基配对中，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)替换。如此，A与T互补，而G与C互补。通常，“互补”指核苷酸序列与感兴趣的靶完全互补，使得序列中的每一个核苷酸与靶核酸中对应的位置上的每一个核苷酸互补。当核苷酸序列与非靶序列不是完全互补(100％互补性)，但由于核苷酸序列的某些区段与非靶序列的互补性而仍然可以与非靶序列进行碱基配对时，可以计算百分比互补性以评估非特异性(脱靶)结合的可能性。一般而言，50％或更低的互补性不引起非特异性结合。另外，70％或更低的互补性在严格杂交条件下可能不引起非特异性结合。
如本文中使用的，术语“核糖核酸”和“RNA”表示由核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文中使用的，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”表示由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文中使用的，术语“寡核苷酸”表示长约10个至200个核苷酸，直至300个核苷酸或更长，例如长至500nt或更长的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的，而且在某些实施方案中，长度小于300个核苷酸。
如本文中使用的，术语“附接”指一个分子与另一个分子的强(例如共价或非共价)键连接。
如本文中使用的，术语“表面附接”指分子强附接于表面。
如本文中使用的，术语“样品”涉及含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材料混合物。在特定实施方案中，样品可以是自生物学样品获得的，生物学样品例如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕(nasaldrainage)和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液(rheum)、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。在特定实施方案中，样品可以是自受试者(例如人)获得的，而且可以在用于主题测定法之前进行加工。例如，在分析之前，可以在使用之前自组织样品提取蛋白质/核酸，提取方法是已知的。在特定实施方案中，样品可以是临床样品，例如自患者收集的样品。
术语“分析物”指能被捕捉剂结合和检测的分子(例如蛋白质、核酸、聚合物或其它分子、它们的复合物或颗粒)。
术语“测定”指测试样品以检测分析物的存在和/或丰度。
如本文中使用的，术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，包括定量和定性测定二者。
如本文中使用的，术语“发光标记物”指当处于外部激发下时能发出光的标记物。这可以是冷发光(luminescence)。荧光标记物(其包括染料分子或量子点)和冷发光标记物(例如电致发光或化学发光标记物)是发光标记物的类型。外部激发对于荧光而言是光(光子)、对于电致发光而言是电流，对于化学发光而言是化学反应。外部激发可以是上述的组合。
短语“带标记的分析物”指这样的分析物，该分析物被发光标记物可检测地标记，使得该分析物能够通过评估该标记物的存在来加以检测。带标记的分析物可以是被直接标记的(即，可以将分析物自身直接缀合于标记物，例如通过强的键，如共价或非共价键直接缀合于标记物)，或者，带标记的分析物可以是被间接标记的(即，分析物被次级捕捉剂所结合，而次级捕捉剂是被直接标记的)。
术语“杂交”指核酸与互补核酸经Watson-Crick碱基配对的特异性结合。因而，术语“原位杂交”指核酸与中期或间期染色体的特异性结合。
就核酸而言，术语“杂交”和“结合”可互换使用。
术语“捕捉剂/分析物复合物”是捕捉剂与分析物的特异性结合所导致的复合物。捕捉剂和该捕捉剂所针对的分析物通常会在“特异性结合条件”或“适合于特异性结合的条件”下彼此特异性结合，其中此类条件为那些容许捕捉剂和溶液中要结合的分析物之间发生结合的条件(在盐浓度、pH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等方面)。此类条件(特别是就抗体及其抗原和核酸杂交而言)是本领域公知的(参见例如HarlowandLane(Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和Ausubel,etal,ShortProtocolsinMolecularBiology,5thed.,Wiley&Sons,2002)。
如本文中使用的，术语“特异性结合条件”指生成包含彼此特异性结合的成对分子的核酸双链体或蛋白质/蛋白质(例如抗体/抗原)复合物，同时不利于并非彼此特异性结合的分子之间形成复合物的条件。特异性结合条件是杂交和清洗条件二者的总和或组合(全体)，而且在必要时可以包括清洗和封闭步骤。
对于核酸杂交，特异性结合条件可以如下实现：于42℃在50％甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖酐、和20μg/ml经变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育，接着于约65℃在0.1xSSC中清洗滤膜。
对于抗体结合抗原，特异性结合条件可以如下实现：在封闭溶液(例如含3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭含有抗体的基片，接着与在封闭缓冲液中稀释的含有分析物的样品一起温育。在该温育之后，在清洗溶液(例如PBS+TWEEN20)中清洗基片并与捕捉第二抗体(检测抗体，它识别抗原中的另一位点)一起温育。捕捉第二抗体可以缀合有光学可检测标记物，例如荧光团，诸如IRDye800CW、Alexa790、Dylight800。再次清洗之后，可以检测结合的捕捉第二抗体的存在。本领域技术人员会知道可加以修改以提高检测到的信号及降低背景噪声的参数。
术语“次级捕捉剂”(也可称作“检测剂”)指对抗原具有高度特异性亲和力的一组生物分子或化合物。次级捕捉剂可以与光学可检测标记物，例如酶、荧光标记物等强连接，或者次级捕捉剂自身可以被另一通过生物缀合而连接有光学可检测标记物的检测剂所检测(Hermanson,“BioconjugateTechniques”AcademicPress,2ndEd.,2008)。
术语“生物素部分”指包含生物素或生物素类似物如脱硫生物素、氧代生物素、2’-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等的亲和剂。生物素部分以至少10-8M的亲和力结合链霉亲合素。生物素亲和剂还可以包含接头，例如─LC-生物素、─LC-LC-生物素、─SLC-生物素或─PEGn-生物素，其中n为3-12。
术语“链霉亲合素”指链霉亲合素和亲合素二者，以及它们的任何以高亲和力结合生物素的变体。
术语“标志物”指这样的分析物，它在生物学样品中的存在或丰度与某种疾病或状况相关。
术语“键”包括共价和非共价键，包括氢键、离子键和由范德华力生成的键。
术语“放大”指信号的量级(magnitude)的增大，例如信号增大至少10倍、增大至少100倍、、增大至少1,000倍、增大至少10,000倍、或增大至少100,000倍。
术语“局部”指“在某一位置”。
其他具体的结合条件是习知的，也可以在本文中使用。
必须注意，如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”和“该”包括复数指称，除非上下文另外明确指明，例如在使用词语“单个/单种”时。例如，提到“一种分析物”包括单种分析物和多种分析物，提到“一种捕捉剂”包括单种捕捉剂和多种捕捉剂，而提到“一种检测剂”包括单种检测剂和多种检测剂。
示例实施方案的详述
下面详细的描述以举例的方式而不是以限制的方式示出了本发明的一些实施方案。
本发明涉及纳米颗粒结构、制造方法以及在化学和生物感测中的应用。本发明的纳米颗粒具有与常规金属纳米颗粒非常不同的结构和材料，使得该新纳米颗粒能够具有在感测和诊断技术中期望的许多独特性质，包括增强感测光信号的有效性相比常规金属纳米颗粒大大提高，而尺寸小得多。小尺寸对体内测试和生物安全性是重要的。这些纳米颗粒的独特结构无法通过常规合成方法制造，而是通过模板沉积和剥落来制造的。本发明的纳米颗粒还可以是生物可降解的。尤其是，纳米颗粒结构能够大大增强(例如放大)布置于纳米颗粒表面上或附近的光吸收、光散射和光辐射，光信号(尤其是发光(例如荧光)和表面增强拉曼散射(SERS))(纳米颗粒可以在生物细胞和/或人体内部)；改善对布置于该纳米颗粒之上或附近的分子的化学和/或生物性质(例如蛋白质、DNA、RNA和其他有机和无机分子)的检测的灵敏度，改善纳米颗粒穿透生物细胞或材料及降低生物毒性的性能。本主题的制造方法使得制造这种通过其他方式无法制造或难以制造的新纳米结构成为可能。
本发明覆盖四个领域：(1)纳米颗粒结构；(2)制造方法；(3)表面功能化(surfacefunctioning)；和(4)在化学和生物感测中的应用。
本发明中使用的某些物理原理和某些材料、尺度和间隙与位于固体支持物上的“盘耦合柱上点天线阵列”(D2PA)相似(如WO2012/024006和WO2013154770描述的，通过援引并入之)。
纳米颗粒结构和材料
基本结构
在本发明的一个实施方案中，如图1所示，纳米颗粒100称为堆叠纳米颗粒(S-NP)，其增强该纳米颗粒与光的相互作用和/或沉积在该纳米颗粒表面上的分子/材料与光的相互作用，该颗粒包含至少一对堆叠的金属盘110和120，二者被非金属间隔物130分隔，其中(a)所述盘和间隔物的尺寸小于所述光的波长；且(b)所述纳米颗粒可增强光相互作用至所述每个金属盘的增强的至少3倍。金属盘110和120可以用相同或不同材料制成，并且可以有相同或不同的厚度。此外，两个相邻的盘之间可以有薄的粘附层。
非金属间隔物130可以是生物可降解的，即，其在生物环境中可以溶解。如图3所示，当间隔物被降解时，S-NP破碎为小碎片。破碎为小碎片在体内应用中是有好处的；小碎片从生物细胞和人体脱离比大碎片快得多，从而避免了积累。由于空间没有被金属盘(非生物可降解的)完全封闭，流体可以从间隔物的侧面达到间隔物。生物降解时间可以通过生物可降解材料和它们的尺寸来控制。
光相互作用包括光吸收、光散射、光辐射、拉曼散射、色度、和发光，发光包括荧光、电致发光、化学发光和电致化学发光。
能够被S-NP增强的光的优选波长范围为约20nm至10微米。另一个优选的波长范围是约300nm至4000nm。对于体内应用，对良好的生物组织光穿透而言优选的波长范围(窗口)为约630nm至1316nm。
沉积在S-NP上的分子/材料包括要加以感测的分子/材料，诸如分析物和/或它们的标记物，包括蛋白质、DNA、RNA，以及单细胞、组织、以及人和动物体内的其他有机和无机分子。
本发明中“金属(的)”意味着对于给定的光波长，材料中的电子能够产生等离激元。例如，金具有大约560nm的等离激元波长；对于长于560nm的波长，金对光的行为如“金属”一样，对于显著短于560nm的波长，金对光的行为如非金属一样。
感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、以及感测的信号变化的减小(误差棒更小)。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、以及确定目标分析物的状态。所述分析物包括蛋白质、DNA、RNA、以及其他有机和无机分子。该方法可用于体外或体内的感测。
S-NP相对于常规NP以更小的尺寸实现更好的增强的关键原因是不同的物理学。常规的NP周围全是金属，遵循双曲线函数或分散关系其中ε1和ε2为两个正交方向上的介电常数(电容率)，对于常规NP而言，它们具有相同的符号。因此，它们的等频曲线是椭圆，导致有界的波矢k，以及相对长的波长。但对于具有双极性电容率(令ε1＝εp且ε2＝-εv,具有相反的符号，而εp与εv为正值)的S-NP，该方程变为是一双曲线，表明波矢k在两个方向上都是无界的，而且可以非常巨大。这容许在颗粒内有非常短的波长(在颗粒外波长仍然是800nm)，因而对于大的光信号颗粒大小可以很小。此外，一对盘为光形成共振空穴。
如图4中所示，当S-NP100的表面被功能化时，它变成用于在生物和化学检测中感测分析物的纳米传感器200。如后文讨论的，这种表面功能化可以采取许多方式，包括附接选择性结合目标分析物的捕捉剂。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中，或者在空气或气相中。感测包括光吸收、光散射、光辐射、拉曼散射、色度、发光(包括荧光，电致发光、化学发光、和电致化学发光)。感测特性包括感测信号强度、感测信号谱、检测限、检测动态范围、和感测的信号变化减少(更小的误差棒)。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、和确定目标分析物的状态。该方法可以在体外或者体内的感测中使用。
NP结构变化和改进
侧壁上点(Dots-on-sidewall)S-NP(DS-SP)。S-NP的一个实施方案(图1b)称为“侧壁上点S-NP”(DS-SP)400，包含位于间隔物和/或金属盘之侧壁上的金属纳米点，其可具有比没有这些纳米点的S-NP更高的光信号增强。对于800nm波长，纳米点的直径为3-15nm。
磁性/可磁化S-NP(MS-NS).可以使S-NP为磁性/可磁化的，以便它们能够被磁铁吸引，这样的S-NP称作MS-NP。MS-NP的一个实施方案包括这样的S-NP，具有至少一个堆叠在普通S-NP之上的磁性/可磁化盘140，如图1b所示。
增强的S-NP(ES-NP).可以进一步增加S-NP光信号增强。对于S-NP而言，其表面上的光信号增强不是均一的：金属材料的具有尖锐(即小曲率)的边缘的区域，以及两个金属材料之间的小间隙，是高增强区域，而其他区域是低增强区域(例如，金属盘的扁平外表面)。高增强区域意味着附接于该区域的分子或材料对光信号的放大会比附接于低增强区域的放大要多。例如，附接于高增强区域的荧光团(如荧光分子)在光激发下将具有比附接于低增强区域的荧光团更高的荧光信号。
本发明的一个实施方案是选择性地掩蔽低增强区域使其不被分子结合，并选择性地将其光信号会被放大的分子(例如，结合具有光标记物的分析物的捕捉剂)附接到高增强区域。实现这一点的方式之一是加入两个非金属盘作为掩蔽盘，S-NP的每一侧各一个盘，以掩蔽S-NP的金属盘的外表面使其不被分子附接，如图1c的150和160，以及图2的460所示。这样的颗粒400称为ES-NP(增强的S-NP)，具有5个盘(2个金属盘和3个非金属盘)。例如，可使用3nm厚的SiO2盘作为掩蔽盘，且分子是DSU，其仅附接于金属。当然，可选择掩蔽盘的一侧或者两侧都掩蔽。掩蔽盘可使用不同厚度和不同材料。对于某些应用，还掩蔽盘边缘的一部分。一些其他细节已在2014年3月15日提交的PCT/US14/29979和2013年3月15日提交的61/801,424中公开，在此通过提述并入它们。
具有更多的堆叠金属盘的S-NP。在某些实施方案中，S-NP具有超过3个盘；其可以具有4、5、6个或更多个盘，数量根据感测的需要。金属盘也可以多于一对。
成束(Bundled)的S-NP(BS-NP)(具有多个柱的S-NP)。S-NP的一个实施方案是利用生物可降解的电介质材料胶将数个S-NP包装在一起形成一个较大的颗粒(束)(图1D)。理由是这样的束可以与相同大小的单一S-NP具有相同或相似的光信号增强，但在生物降解之后，束的碎片小得多，因此易于从生物细胞和人体清除。
盘形状和尺寸
S-NP的盘的横向形状可以选自圆形、方形、矩形、多边形、椭圆形、长条形、多边形、其他类似的形状，或其组合。一般而言，每个盘都可以有与其他盘不同的横向形状和尺寸。在某些情况下，如后文中讨论的，一种制造S-NP的方法是通过利用模板，沉积、剥落；这样的制造导致给定的S-NP中的所有盘均具有类似的横向形状和尺寸。但是通过使用不同的模板，每个S-NP可以具有许多不同的横向形状。
盘的顶面和底面的形状可以不同，可以是平坦的，但也可以是凸出的，或者是半球形。图13、14、和15给出了制造用于800nm光波长的S-NP的一个例子。
S-NP的金属盘和间隔物的尺寸应该小于S-NP所增强的光的波长。对于给定的波长，光增强取决于S-NP大小和共振峰(相对于大小)。成对的金属盘之间的间隔物具有0.3nm至50nm的厚度。该间隔物的厚度在间隙的决定中起重要作用。一般而言间隙越小越好，但小的间隙也改变共振波长。
盘直径往往由光信号增强与体内应用中的其他要求之间的平衡来决定。例如，为了容易地穿透和脱离生物细胞和生物材料，以及为了生物安全性，颗粒大小应该尽可能小，但如果颗粒大小过小，会减少光增强因子。本发明的一个实施方案是可同时优化这两个要求的S-NP。
作为用于800nm波长的DS-NP的一个例子，盘是圆形，具有30nm至100nm的直径，顶部金属盘厚度为5nm至30nm，间隔物厚度为2至30nm，底部金属盘厚度为5nm至30nm，自组装的点直径为5nm至15nm，磁性盘厚度为5至30nm，且盘之间的粘附层是厚度为0.5nm-1nm的钛或者铬(Cr)。制成的盘的实例在图13-16中显示。
在一种优选的在800nm波长左右具有光共振吸收的DS-NP结构中，盘是具有70nm直径的圆形，顶部金属(金)盘厚度15nm，间隔物(二氧化硅)厚度20nm，底部金属(金)盘厚度15nm，自组装的金点直径为10nm左右，盘之间的粘附层为0.5nm厚度的钛。
金属材料
用于S-NP中的金属组件(例如盘和点)的材料从在工作光子波长中呈金属性的材料中选择。例如，金属材料可以选自金、铜、银、铝、它们可见光范围和更长波长的混合物、合金和多分子层，以及对于近红外或中红外波长，某些金属氧化物(例如氧化铟锡，氧化锌)，以及对于特定波长范围，半导体(例如硅或砷化镓)。可以使用单一金属或者金属的组合。
用于非金属间隔物的材料
用于S-NP中的非金属间隔物和非金属掩蔽层的材料从电介质材料和/或半导体中选择。材料可以是生物可降解的或者非生物可降解的。选择这些材料的一个重要条件是它们对S-NP的光增强的影响。在许多实施方案中，这样的增强应该在允许范围内尽可能高。
电介质材料可以是无机物或有机物，可以是晶体、多晶体、无定型或不均一混合物(hetero-mixture)，以及上述一种或多种形式的组合，取决于其应用。例如，无机电介质组分可以选自二氧化硅、金刚石、石墨、二氧化钛、某些其他金属氧化物，和处于小于其能带隙的光波长范围内的无机化合物。有机电介质组分可选自聚合物，如对于某些应用的生物可降解聚合物(如前文所列)，其他聚合物如生物聚合物(例如多核苷酸，纤维素)，共聚物(例如苯乙烯-异戊烯-苯乙烯)，导电聚合物(例如聚(对苯撑乙烯))，含氟聚合物，聚萜烯，酚醛树脂，聚酸酐，聚酯，聚烯烃，橡胶，高吸水树脂，烯类聚合物，等等；或选自小分子，如富勒烯衍生物，苯衍生物，等等。半导体材料可以是无机物或有机物，可以是晶体、多晶体、无定型或不均一混合物，以及上述一种或多种形式的组合，取决于其应用。可以使用单一材料或它们的组合。
生物可降解材料
用于S-NP的生物可降解聚合物是一类特定的聚合物，它们具有足以用于其预定应用的稳定性和耐久性，并在其降解后容易分解(形成气体，盐或生物质)。
这些生物可降解聚合物包括两个主要类别：农业聚合物(源自生物质，例如多糖，如木中的淀粉，纤维素，壳聚糖，蛋白质)，和生物聚酯(源自微生物或从天然或人造单体合成而来，例如聚羟基丁酸和聚乳酸)。大多数生物可降解聚合物由酯、酰胺或其他键构成。这些生物可降解聚合物的更多例子包括：基于聚交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)、和它们的共聚物的聚(酯)，PHB-PHV类的聚(羟基链烷酸)，其他可水解降解的聚合物(例如聚氨酯、聚(酯酰胺)，聚(原酸酯)，聚酸酐，酸酐酰亚胺共聚物(poly(anhydride-co-imide))，伪聚氨基酸(pseudopoly(aminoacide))，聚氰基丙烯酸烷基酯(poly(alkylcyanoacrylates))，等等)，其他可酶促降解的聚合物(蛋白质如(胶原，弹性蛋白)，聚氨基酸，多肽，等等)，和其他天然聚合物。可以使用单一材料或它们的组合。
磁性/可磁化材料
磁性/可磁化材料是那些在磁场中会经受磁力的材料。它们可以选自：铁磁体(例如铁、钴、镍，某些稀土金属(钆、镝等等)，亚铁磁体(例如铁(II,III)氧化物，钇铁石榴石，由铁氧化物和其他元素如铝、钴、镍、锰和锌构成的立方铁素体，六角形铁素体，和磁黄铁矿，等等)，超顺磁体，和其他适宜的磁性材料包括氧化物，例如铁素体，钙钛矿，铬铁矿和磁铁铅矿，稀土/钴合金和任何其他具有铁磁/亚铁磁性质的无机/有机化合物。可以使用单一材料或它们的组合。
一些关键的优势是：S-NP具有对高效体内等离子增强诊断和治疗技术而言适宜的(大的)颗粒大小和复杂的形状，而随后(在受控的时间)能够生物降解为10nm以下的颗粒，其体积仅为原S-NP的10％至1％，便于迅速的细胞/体内清除。此外，S-NP可提供比所有现有的NP高几个数量级的等离子增强。
为了设计不仅在体内诊断和治疗中有效，而且具有生物安全性的不同生物相容性和生物可降解性S-颗粒，我们需要控制不同S-NP的建构、材料、尺寸和形状。
1.基于等离子的体内治疗与诊断的功效对颗粒大小的要求
决定大小的两个因素：(a)等离子效应的有效性，和(b)血液保留时间—在血液中充分循环以将合适剂量的纳米颗粒递送到特定部位所需的时间。
等离子有效性需要两点：第一，纳米颗粒大小需要与入射的波长谐振；第二，要有小的间隙和尖锐的边缘。对于第一个等离子要求，例如，在800nm的体内穿透光波长(整个窗口是NIR(670至890nm))，常规方法使用直径300nm的金球，直径60nm的金纳米壳，以及直径10nm、长度60nm的金纳米杆来实现足够的等离子效应和足够的血液保留时间。小于上述的尺寸会大大降低这些颗粒的等离子有效性。
对于第二个等离子要求，常规的颗粒不具有复杂的结构(纳米间隙和纳米边缘)，因此比具有这样的结构者差得多(差几个数量级)，这一点已得到了我们用S-颗粒进行的实验的证明。
为了有充分的血液保留时间，NP的大小应该在～50至200nm的范围，也不能太小。太小的颗粒大小会让颗粒迅速从细胞和身体清除出去(见下文)，从而无法投递合适的剂量，除非静脉施用大剂量的纳米颗粒或重复剂量的纳米颗粒，这样会变得不安全，并导致免疫原性应答。
2.生物安全性对颗粒大小的要求.两种颗粒大小在体内诊断的生物安全性中是非常重要的：(a)安全颗粒投递大小，这是在假定低NP剂量，无NP积累的条件下，能够被安全投递到特定部位而不导致免疫原性应答或任何毒性反应的纳米颗粒大小，和(b)颗粒清除大小，具有这样的大小的NP能够容易地从细胞/身体清除。如图11中所示，颗粒的安全颗粒投递大小有数条带，且颗粒清除大小应该<10nm(<6nm更好)。
3.颗粒大小要求的冲突.显然，两个大小要求是冲突的。常规的等离子颗粒一旦被放入体内就无法改变其大小，对于它们来说，解决这种大小要求冲突的唯一办法是让效力和生物安全性都打折扣，选取居中的颗粒大小，以求在等离子增强和体内循环与纳米颗粒脱离身体的能力之间取得平衡。
这些组件的确切尺寸取决于光波长和材料。在某些波长为～800nm、金属材料为金、电介质为二氧化硅的特定情况下，组件的尺寸可以在4nm至1500nm，盘的厚度可以为1nm至500nm，取决于在感测中要用到的确切波长。组件之间的间隙(例如金属盘之间的间隙)可以在0.5nm至200nm的范围。对于许多应用，可以用小的间隙(5nm至50nm的范围)来增强光信号。
这是基于等离子的颗粒在体内的最大的难题之一。先前的手段取得的成功极为有限。例如，纳米颗粒如PEG钝化的金纳米颗粒，纳米壳以及金纳米杆。这些纳米颗粒利用表面涂层或特异形状来在所需的血液保留时间内实现优化的光共振，同时保持合适的大小(<100nm)。然而，它们调谐光响应的能力仍然有限，因此光场增强仍然较弱。此外，这些颗粒的大小远大于清除大小，因此会在体内积累，产生毒性。
S-NP制造方法
Nano-PrinTED-1(突出模板)。如图8和9所示，制造方法的一个实施方案，称为使用突出模板1010的Nano-PrinTED，包括三个关键步骤：(i)提供具有纳米结构化突出部1010的模板(例如，4”晶片上的密集纳米立柱阵列(每个立柱具有选自5nm至100nm的相同或相似直径))，(ii)沉积脱模层(任选的)，然后在模板的突出部的基座上(每个纳米颗粒的大小由模板纳米立柱的直径所决定)和槽的内部均沉积多层形成纳米颗粒所需的材料1020，和(iii)从模板剥落纳米颗粒100。
溶剂溶解/超声剥落
将带有S-NP的模板置入装有特定溶剂的容器中以溶解S-NP之下的脱模层。可以将该容器置入超声仪中以加速剥落过程。S-NP会剥落在所述溶剂中。
剥落可以通过若干方式进行：(1)转印剥落：将带有S-NP的模板印到带有薄粘附层1030(例如特定的聚合物薄膜)的另一基片上。颗粒与该粘附层之间的更大的粘附力将所有的S-NP剥落到该新基片上。可以通过用与前述方法类似的方法溶解该新基片上的粘附层将S-NP进一步释放到溶液中。(2)旋涂剥离剥落(Spin-onpeel-offexfoliation)：将一种粘附薄膜(例如特定的聚合物)旋涂在带有S-NP的模板上。固化膜之后，S-NP粘附在粘附层中，然后通过剥离过程剥落所有的S-NP。可以通过用与前述方法类似的方法溶解粘附膜来将S-NP进一步释放到溶液中。(3)洗涤剥落：在烧杯(或其他容器)的上方将带有S-NP的模板倾斜，用特定溶液洗涤(用喷枪)。在湍流溶液的力量下，S-NP会从模板剥落并进入溶液中。
在特定的实施方案中，对1020的相同金属沉积也在盘侧壁上形成纳米点，从而形成S-NP，原因是侧壁上的薄金属自组装成纳米点，如图13、14和15中的实验结果所示。
在沉积(ii)中，沉积利用成束的(beamed)材料(即材料在一个方向上沉积而在其他方向上不沉积)，并以对模板表面基本上成法向的角度进行。由于立柱的高度，沉积在立柱底部的材料与沉积在立柱顶部(即立柱的基座)的材料不相连，使得沉积在立柱基座的材料形成S-NP。剥落使得这些S-NP从模板游离出来。模板可以重复使用直到立柱之间的槽被材料充满。当这种情况发生时，可以利用清洗步骤来去除沉积的材料，然后可以重新使用模板。
Nano-PrinTED-2(凹模板).如图10所示，制造方法的一个实施方案，称为使用凹模板的Nano-PrinTED，包括三个关键步骤：(i)提供具有纳米结构化孔1100的模板，(ii)沉积脱模层(任选的)，然后在模板的突出部的孔中沉积多层形成纳米颗粒所需的材料1120(每个纳米颗粒尺寸由孔的直径所决定)，和(iii)从模板剥落纳米颗粒100。由于孔的深度，沉积在孔底部的材料与沉积在模板顶面的材料不相连，使得沉积在孔内部的材料形成S-NP。
所有的模板均可呈板(plate)、滚筒(roller)、卷(roll)或片层(sheet)的形式，可以是刚性材料或者是柔性的。模板材料可以是任何具有足以充当模板的机械强度和足够的化学惰性的材料。
沉积方法.遮蔽沉积材料的方法可以是任何方法，只要该方法有一定程度的定向性，且能够蒸镀目标材料。沉积方法包括蒸镀、溅射、和化学或分子束(beams)。蒸镀进一步包括通过化学蒸镀、分子束(molecularbeams)、电子束加热(electronbeamheating)、热力加热(thermalheating)，激光加热(laserheating)和其他加热方法的蒸镀。溅射包括通过离子、电子、等离激元、光子(即激光)和其他高能粒子的溅射。
蘸印(dip-print).蘸印制造方法用于成型生物可降解电介质，因为这样的材料无法热蒸镀。蘸印制造方法，如图12所示，首先将一薄层具有合适粘度的液体聚合物前体置于板上(称为“材料转移板”)；然后用Nano-PrinTED中使用的模板压住该材料转移板，仅使模板的立柱的顶部沾上所述聚合物前体。然后，让聚合物前体固化形成固体聚合物。蘸印的聚合物被用于堆叠层之间的电介质，以及用于将不同的柱粘合成单一颗粒的电介质(注意，取决于立柱子与柱之间的间隙尺寸，会使用不同粘度的液体)。
这种新制造工艺的关键优势是(a)形成为增强等离子效应所需要的、但通过常规制造方法无法形成的复杂结构；(b)控制纳米颗粒结构尺寸(包括每个组件的大小和形状，它们的间距，以及最终的颗粒)的精度好得多；(c)解决生物可降解材料的成型中的问题的新途径，和(d)可放大到大体积，且成本低(例如，如已经证明的，制造速度是每个4”晶片每次运行2x10^11个颗粒，且可以通过卷对卷技术将生产量放大超过3个数量级)。(ii)制造：推动新的纳米颗粒制造方法nano-PrinTED和蘸印的进步，并将它们与高分子化学一起使用，以高精度产生具有期望的建构、形状、尺寸和材料的S-颗粒。一个主要目标是对直径6nm或更小的立柱(意味着生物降解后尺寸小于6nm的颗粒)实现这样的精密制造。
用于感测的表面功能化
S-NP100在表面功能化之后成为纳米传感器200。S-NP的表面功能化是为了改变S-NP表面的性质，以控制五种关键的表面性质：表面形状、化学键合、表面电荷、疏水和亲水性质、以及主动靶向(activetargeting)(图12)。
表面形状.纳米颗粒的形状对纳米颗粒进出生物材料(如细胞和细胞核)的能力有影响。一个实施方案是在制造之后根据需要将S-NP的形状改变为期望的形状。改变形状的方法包括涂覆聚合物或多层聚合物、以及生物可降解材料。
化学键合.最重要的表面化学改性之一是提供接头——将不同种类的生物化学试剂(例如靶向剂)连接到纳米颗粒之上的物质。生物相容性的嵌段共聚物涂层，例如聚乙二醇(PEG)，在这项建议的研究中将用作交联剂(cross-linker)。我们会考察数种组装方法，尤其是两种。一种是用硫醇基团将聚合物配体的一端功能化，以形成对纳米颗粒的金表面的强键合，且用NHS-基团将接头的另一端功能化，以对抗体或蛋白质的伯胺位点形成强共价键。我们还会尝试用硅烷代替硫醇末端，以使得交联剂可以高效地连接到电介质表面，如二氧化硅。另一种方法是使用生物亲和性反应，例如亲和素-生物素键合。其他接头在“分子粘附层”一节中讨论。
表面电荷和润湿性质.高分子纳米颗粒的理化特性，如表面电荷和功能基团，可影响细胞对其的摄取。对于吞噬系统(phagocyticsystem)而言，公认带正电的纳米颗粒相比于电中性或带负电的制剂有更高的细胞摄取速度(由于细胞质膜带负电的性质)。纳米颗粒上用于正电的涂层一般基于(或者涂覆有)阳离子性聚合物(例如最广泛使用的是多糖壳聚糖)。此外，我们需要进一步考虑涂层材料的表面润湿性质，因为对于易化生物降解的生物相容性材料而言，优选的是涂层是亲水性且可溶于水的。我们会分别选择PEG和PGA作为正电和负电表面。这两种材料都是可溶于水、无毒、生物可降解的，而且久已用于钝化胶体金纳米颗粒以易化体内的渗透和保留[13,14]。我们会在细胞水平和生物体水平两个水平上测试电荷对S-纳米颗粒的生物分布和清除的影响。
主动靶向的影响.我们会使用主动靶向方法，其中我们通过将靶向性配体偶联到纳米颗粒的表面来进一步增强递送特异性。这些配体可包括抗体、工程化抗体片段、蛋白质、肽、小分子、和DNA或RNA适体。我们会在细胞水平和生物体水平两个水平上研究主动靶向的影响。
分子粘附层
针对目标分析物的捕捉剂或是直接固定化在S-NP100上，或者通过分子粘附/间隔物层(MAL)160固定化。如图6中所示，S-NP100包括分子粘附层160，后者覆盖下面的S-NP的金属表面的至少一部分。分子粘附层具有两个目的。首先，分子粘附层充当间隔物。为了获得最优的荧光，发光标记物(例如荧光团)不能距金属表面过近，因为非辐射过程会淬灭荧光。发光标记物也不能距金属表面过远，因为那样会降低放大作用。理想的是，发光标记物应距金属表面一段最优的距离。第二，分子粘附层提供将捕捉剂附接到S-NP的良好粘附作用。该良好的粘附作用是由于分子粘附层的分子中具有活性基团，这些活性基团对一侧的粘附剂和对另一侧的S-NP均有高度的亲和力。
分子粘附层(MAL)160可以有许多不同的构造，包括(a)交联分子的自组装单层(SAM)，(b)多分子层薄膜，(c)(a)和(b)的组合，和(d)捕捉剂本身。
在MAL的实施方案(a)中，其中分子粘附层136是交联分子或配体的自组装单层(SAM)，SAM的每个分子由三部分组成：(i)头部基团(headgroup)，其与S-NP’s的表面具有特异性的化学亲和力，(ii)末端基团，其与捕捉剂具有特异性的亲和力，和(iii)分子链，它是连接头部基团与末端基团的长分子系列，并且其长度(该长度决定金属与捕捉剂间的平均间距)可以影响S-NP’s的光放大。这样的SAM如图3所示。
在许多实施方案中，附接在金属表面的头部基团属于硫基，即-SH。附接于金属表面的头部基团的其它的选择是羧酸(-COOH)、胺(C＝N)、硒醇(-SEH)或膦(-P)。其他的头部基团，如硅烷(SiO)，可以使用，如果要在电介质材料或半导体(如硅)上涂覆单层的话。
在许多实施方案中，末端基团可包括各种捕捉剂反应性基团，包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤素取代的苯酚酯、五氟苯酚酯、硝基取代的苯酚酯、酸酐、异氰酸盐或酯、异硫氰酸盐或酯、亚氨酸酯、马来酰亚胺、碘乙酰基、酰肼、醛、或环氧化物。其他合适的基团在本领域是已知的，并可例如Hermmanson,“BioconjugateTechniques”AcademicPress,2ndEd，2008中所描述的。末端基团可在它们组装到S-NP’s表面之后化学附接到分子链，或在它们组装到表面之前与分子链在一起合成。
其他的末端基团是羧基-COOH基团(用EDC/NHS活化以与配体上的–NH2形成共价结合)；胺，-NH2，基团(通过用EDC/NHS活化的酰胺键与配体上的-羧基形成共价结合)；环氧，与–NH2反应(不需要交联剂的配体)；醛，(与配体上的–NH2反应而不需要交联剂)；硫醇，-SH，(通过类似SMCC的生物缀合手段连接配体上的–NH2)；以及谷胱甘肽，(GHS)(理想地用于捕捉GST标记蛋白质)。
分子链可以是碳链，可以调整其长度来改变发光标记物与金属之间的距离，以便优化光信号。在一个实施方案中，如将在例子中详细描述的，SAM层是二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)，其头部基团是通过硫金键与金表面结合的–SH，而末端基团是结合捕捉剂的伯胺位点的NHS酯，以及长度1.7纳米的分子烷烃链。
在许多实施方案中，连接头部基团和末端基团的分子链是烷烃链，其仅由碳原子和氢原子组成，所有的键均是单键，并且碳原子不联合成环状结构，而是形成简单的线性链。分子链的其它选择可以是来自聚合物，如聚(乙二醇)(PEG)、聚(乳酸)(PLA)等等的配体。分子链与头部基团所附接的金属表面以及末端基团所附接的捕捉剂均无化学反应性。链的长度，其决定分析物与S-NP’s的距离，可以加以优化以获得最大的信号放大。如下面将更详细地描述的那样，分子链可具有例如0.5纳米到50纳米的厚度。
在主题S-NP中使用的分子粘附层可以由这样的自组装单层(SAM)组成，其一侧牢固地附接到金属(通过例如硫原子)并且在另一侧(外部)以捕捉剂反应性基团为末端，所述捕捉剂反应性基团例如胺反应性基团、硫醇反应性基团、羟基反应性基团、咪唑反应性基团和胍基反应性基团。单层可具有疏水性或亲水性表面。最常用的捕捉剂反应性基团是NHS(其为胺反应性)和马来酰亚胺(其为巯基反应性)，但许多其他的也可使用。
在一些实施方案中，分子粘附层可以是烷硫醇的自组装单层(见，例如，KatoJournalofPhysicalChemistry2002106:9655-9658)，聚乙二醇硫醇(见，例如，ShenoyetalInt.J.Nanomedicine.20061:5157)，芳香硫醇，或某些其他的以硫醇为末端的链。
硫醇基可以使用的原因是(a)硫醇硫与金及其他金属相互作用以形成牢固和稳定的键(见，例如，Nuzzoetal.,J.AM.Chem.Soc.1987109:2358-2368)；和(b)范德华力使烷烃与其他链堆叠，导致SAM自发组织(见，例如，Loveetal.，Chem.Rev.2006105:1103-1169)。此外，末端基团可供用于直接附接捕捉分子或进一步的化学修饰。
在一些实施方案中，可以使用烷硫醇。据估计，在烷硫醇的拥挤单层中有4×1014个烷硫醇分子/cm2(Nuzzo等人，J.Am.Chem.Soc.1987109:733-740)，这大约相当于对底下的表面上的每个金原子一个烷硫醇键。由烷硫醇组成的自组装单层可通过将金基片浸泡在烷硫醇溶液中来产生(见，例如，Leeetal.Anal.Chem.2006,78:6504-6510)。金与还原的烷硫醇(SH基团)和烷基二硫化物(-S-S-)均能够反应(见，例如，Loveetal.Chem.Rev.2005,105:1103-1169)。
一旦制得聚乙二醇硫醇或烷硫醇的自组装单层膜，则有多种策略可以用来将捕捉剂连接到自组装单层。在一个实施方案中，捕捉剂，如链霉亲和素(SA)，可以附接到SAM，用来固定生物素化捕捉剂。
在一个实施方案中，链霉亲和素(SA)本身可以用作SAM的功能基团(如末端基团)，以交联与SA具有高亲和力的捕捉剂分子，如生物素分子，包括肽、寡核苷酸、蛋白质和糖。
亲合素、链霉亲合素的功能基团与生物素基团具有很高的亲和力，形成亲合素-生物素。这样的高亲和力使亲合素/链霉亲合素能够良好地充当功能基团、且生物素基团充当互补功能基团结合。这些功能基团可以将分子粘附层结合到S-NP’s、在分子粘附层和捕捉剂之间结合并将发光标记物结合到次级捕获剂。在一个实施方案中，含巯基反应性基团的分子粘附层可通过将金表面连接到胺末端的SAM，并使用磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸(磺基SMCC)进一步修饰所述胺基团产生马来酰亚胺活化表面。马来酰亚胺活化的表面是反应性硫醇基团，而且可用于连接含有硫醇(例如半胱氨酸)基团的捕捉剂。
在另一个实施方案中，可以通过例如在琥珀酰亚胺基烷基二硫化物，诸如二硫代双-磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯(DSP)或二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)的1-10mM溶液中浸泡金基片来生成含有胺反应性基团(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))的分子粘附层(参见例如PeelenetalJ.ProteomeRes.20065:1580-1585和StorrietalBiosens.Bioelectron.199813:347-357)。
在另一个实施方案中，可使用以羧基为末端的SAM诸如12-羧基-1-十一烷硫醇来生成含有胺反应性基团(NHS)的分子粘附层。在这种情况中，可以在1-乙基-3(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl(EDC)存在下将SAM的表面连接至NHS以生成与伯胺形成稳定酰胺键的中间体(参见例如JohnssonetalAnal.Biochem.1001,198:268-277)。
在另一个实施方案中，分子粘附层可含有蛋白A，蛋白A以高亲和力结合IgG，其它免疫球蛋白形式(例如IgE)的Fc区。
在另一个实施方案中，可以通过与具有羧基末端的SAM与1,1’-羰基二吲哚(CDI)反应来添加吲哚基团(其与胺也有反应性)。
在另一个实施方案中，可使用具有醛末端的链烷硫醇单层来固定化蛋白质和具有胺为末端的DNA寡核苷酸二者，而且可以在氮川三乙酸(NTA)修饰的金表面上固定化带his标签的融合蛋白。
可以将硫醇反应性基团连接至合成的DNA和RNA寡核苷酸，包括适体；具有硫醇末端的适体能容易地商业合成。也可以将硫醇反应性基团连接至含有半胱氨酸基团的蛋白质，例如抗体。可以将硫醇化分子附接于马来酰亚胺修饰的表面(参见例如SmithetalLangmuir2002,19:1486-1492)。在某些情况下，可以使用插在末端Cys后面的氨基酸间隔物(例如Ser-Gly-Ser-Gly)，其相对于缺乏间隔物的肽提高结合的量。对于寡核苷酸，可使用烷烃间隔物。按照相同方式可以将合成的含有末端硫醇的碳水化合物与金拴系。
胺反应性基团能与伯胺(诸如赖氨酸残基上的游离胺)形成键。除蛋白质以外，胺反应性表面还可用来固定化其它生物分子，包括含有赖氨酸残基的肽和合成具有胺末端的寡核苷酸。
在MAL(b)的实施方案中，其中分子粘附层136是多分子层薄膜，该分子可以通过物理吸附或强结合而涂覆在S-NP’s上。在一个例子中，可以将蛋白A涂覆在S-NP’s表面的全部或部分区域上，在这种情况下，蛋白A可以通过物理吸附过程沉积，具有4纳米到5纳米的厚度。在另一个例子中，该层可为聚合物的薄膜，所述聚合物如聚乙二醇(PEG)，其在一端具有功能性头部基团，如巯基(-SH)。该功能PEG分子层与S-NP’s的表面形成强键。PEG分子层的厚度可以通过改变PEG聚合物链的长度来调整。另一个例子是无定形的SiO2薄膜，其使用物理或化学沉积方法(例如蒸镀、溅射、溶胶-凝胶法)附接到S-NP’s表面。在沉积过程中可以精确控制SiO2薄膜的厚度。
在MAL(c)的实施方案中，其中分子粘附层136是多分子层薄膜和SAM的组合，可以首先沉积SAM层，再沉积多分子层。
在一个例子中，分子粘附层可首先含有链霉亲合素单层，接着是与链霉亲合素具有高结合亲和力的分子的其它层，所述分子诸如生物素、生物素化分子，包括肽、寡核苷酸、蛋白质、和糖。
在一个例子中，分子粘附层可含有SAM层二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)(DSU)和蛋白A层。DSUSAM层通过硫-金键结合S-NP’s的金属表面，而且具有NHS-酯末端基团，后者结合蛋白A上的伯胺位点。在特定情况中，捕捉抗体通过它们的Fc区与DSU顶上的此类蛋白A双层接合。蛋白A能确保抗体的取向，以改善捕捉效率。
在MAL(d)的实施方案中，其中分子粘附层160本身是捕捉剂，捕捉剂具有这样的头部基团，该头部基团与主题S-NP’s的金属或突出部侧壁具有高亲和力。常用头部基团之一是硫醇反应性基团。硫醇反应性基团可以连接至合成的DNA和RNA寡核苷酸，包括适体；具有硫醇末端的适体能容易地从商业渠道获得。硫醇反应性基团也可以连接至含有半胱氨酸基团的蛋白质，例如抗体。使用MAL自身作为捕捉剂的另一个例子是抗体片段层，例如半IgG、Fab、F(ab’)2、Fc。抗体片段通过位于铰链区中的硫醇-内肽酶直接与金属表面接合。该实施方案在图48中示出。在这个实施方案中，核酸包括直接结合到S-NP的头部基团。其余的步骤如描述在图7中的那样进行。
分子吸附层厚度应在0.5纳米到50纳米范围内，例如，1纳米到20纳米。分子粘附层的厚度可以针对特定的应用来优化，通过例如增加或减少使用的SAM的接头(烷烃或聚(乙二醇)链)的长度来优化。假设接头中的每个键为0.1到0.15纳米，那么最优的SAM可包含5至50个碳原子(例如，在某些情况下，10至20个碳原子)的聚合物接头。
可通过捕捉剂与分子粘附层表面上的捕捉剂反应性基团之间的反应将捕捉剂附接到分子粘附层，来制作S-NP。
可以通过任何方便的方法，如上面所讨论的那些方法，来将捕捉剂附接到分子粘附层。在许多情况下，可通过高亲和力强相互作用，如生物素和链霉亲和素之间高亲和力强相互作用，来将捕捉剂附接于分子粘附层。因为链霉亲和素是蛋白质，可以使用任何上述的胺反应性方法将链霉亲和素连接到分子粘附层的表面。可以通过将生物素化的捕捉剂点样到链霉亲和素上而将它们固定。在其它实施方案中，可以通过形成强键的反应，例如蛋白质的赖氨酸残基中的胺基团或胺化寡核苷酸与NHS酯在捕捉剂和分子粘附层之间产生酰胺键的反应，将捕捉剂附接于分子粘附层。在其它实施方案中，可以通过蛋白质的半胱氨酸残基中的巯基或巯基-寡核苷酸与分子粘附层上的巯基反应性马来酰亚胺之间的反应将捕捉剂附接于分子粘附层。将捕捉剂与各种反应性基团连接的规程是本领域众所周知的。
在一个实施方案中，捕捉剂可以是捕捉蛋白的核酸，或捕捉剂可以是捕捉核酸(例如，DNA，RNA)的蛋白质。核酸能经由序列特异性(紧密)或非序列特异性(松散)的键来结合蛋白。
在某些情况下，可以使用如下方法制造主题S-NP：(a)在基片的顶面上成型至少一个立柱；(b)沉积顶面的金属材料层；(c)让沉积在突出部顶上的金属材料形成盘，沉积在立柱底部的金属材料形成金属底板，沉积在侧壁上的金属材料形成至少一个金属点结构；而且，如上所述，(d)在沉积的金属材料的顶上沉积分子粘附层，其中分子粘附层覆盖金属点结构、金属盘和/或金属底板的至少一部分，其中分子粘附层的外表面包括捕捉剂反应性基团。
此外，(a)中的成型包括直接压印(模压)材料，所述材料的电性质可以是为电介质或半导体，并可以是聚合物或由单体或低聚物固化形成的聚合物，或无定形无机材料。该材料可以是厚度从10纳米到10毫米的薄膜，或带有基片的多层材料。压印(即模压)意指：模具在其表面上具有结构，将模具压入要压印的材料中，在该材料中形成该结构的反向结构(inverse)。基片或顶上的压印层可以是塑料(即聚合物)，例如聚苯乙烯(PS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、其他的丙烯酸树脂和相似材料。压印可以使用滚筒刻印机通过筒对筒的技术完成。这样的处理，具有很大的经济优势，从而降低成本。
感测系统
还提供了系统，其包括：主题纳米传感器、用于纳米传感器的保持件、从标记物(即发光标记物)诱发光信号的激发源；和适于读取光信号的读取器(例如光检测器、CCD照相机、CMOS照相机、分光计或能够产生S-NP的表面的二维光谱图的成像装置)。容易想到的是，该系统还可以具有放大、过滤、调节、控制和存储来自读取器的电信号并控制读取器和样本保持件的位置的电子器件、计算机系统、软件和其它硬件。样品保持件的位置可以沿一个或所有三个正交方向移动，以容许读取器扫描来自样品的不同位置的光信号。
激发源可以是(a)光源，例如，波长适于激发特定荧光团的激光器和带有用于选择波长的滤光器的灯或发光二极管；或(b)电源，用于提供电流，以从S-NP激发出光(当使用电致化学发光标记物时可采用)。图6和7中示出了一个示例性系统。
在特定情况下，激光带通滤波器过滤掉波长与激光器不同的光，且长波通滤波器将会仅允许从光学可检测标记物发出的光穿过。由于不同的荧光标记物吸收处于不同的光谱范围的光，应选择荧光标记物使其峰值吸收波长与激光激发波长匹配，以达到最佳的量子效率。在许多实施方案中，从S-NP上的荧光标记物发出的光信号的波长比激光器波长长至少20纳米。因此应该调谐S-NP的等离激元共振以覆盖荧光标记的吸收峰、发射峰和激光激发波长。在一些实施方案中，激发和荧光的波长范围可以从100纳米至20000纳米。优选的范围是从300纳米到1200纳米。600-850纳米的范围是优选的，原因是背景噪声低。
显然还有其他的方式实现光激发和读取的功能。
如从上文可以显见的，某些纳米传感器可以以多孔格式实现。在这些实施方案中，所述台可以移动，使得读取器可以独立地读取来自多孔板的每个孔的光信号。
在化学和生物感测测定方法中的应用
功能化的S-颗粒可以用于单个细胞、组织、和人与动物体内的生物和化学感测，包括检测生物和化学标志物，如蛋白质、DNA、RNA，和其他有机和无机分子，以及诊断。
这里“诊断”是指通过定量检测特定的生物标志物或生物分子来评估特定疾病或病况的状态。这样的利用S-NP的诊断包括检测蛋白质、核酸、微生物(病毒、细菌等)，和小分子(激素等)。
借助S-NP的诊断方法包括体内检测、基于荧光的检测、均相荧光免疫测定(Alpha-LISA)、基于流式细胞术的检测、比色检测、生物条形码测定、基于SERS的检测、SERS标记物均相免疫测定、多重SERS标记物、体内检测、荧光成像(例如肿瘤细胞)、光学层析成像和MRI。
主题纳米传感器可以用于检测样品中的分析物。这种方法可包括：(a)将包含分析物的样品与纳米传感器在适合于样品中的分析物与捕捉剂特异性结合的条件下接触；和(b)读取来自纳米传感器的光学可检测信号，其中该光学可检测信号指示所述分析物结合于所述捕捉剂。在上述步骤(a)中，在结合于捕捉剂之前，分析物可以用发光标记物标记也可以不标记(又称直接或间接标记)。在结合之前不用发光标记物标记分析物的实施方案中，分析物在结合于捕捉剂之后，可以结合自身被光学标记的第二捕捉剂(即检测剂)(例如第二抗体或另一种核酸)、标记的第二捕捉剂或标记的检测剂(该过程也称为分析物的间接标记)。在使用间接标记的感测中，未与分析物结合的标记的第二捕捉剂在上述读取步骤(b)之前被移除。在使用直接标记的感测中，未与分析物结合的光学标记物在上述读取步骤(b)之前被移除。
在读取测定上的发光标记物的过程中，对发光标记物施加激发(光、电、化学或其组合)，并检测光的特性，包括强度、波长、和位置。
在某些实施方案中，该方法包括将捕捉剂附接于主题S-NP的分子粘附层以生成纳米传感器，其中该附接是通过如上文描述的捕捉剂与分子粘附层上的分子中的捕捉剂反应性基团的化学反应进行的。接下来，该方法包括使含有靶分析物的样品与纳米传感器接触，该接触是在适合于特异性结合的条件下进行的，靶分析物特异性结合捕捉剂。这个步骤之后，该方法包括去除任何未结合于捕捉剂的靶分析物(例如通过在结合缓冲液中清洗纳米传感器的表面)；然后，添加缀合有光学可检测标记物的检测剂以检测靶分析物。去除未结合靶分析物的检测剂之后，可以将纳米传感器与读取系统一起使用，以读取来自保持结合于纳米传感器的检测剂的光信号(例如波长在300纳米至1200纳米的范围中的光)。容易想到的是，该方法进一步包括用发光标记物标记靶分析物。这可以在接触步骤之前或之后进行，即在分析物结合于捕捉剂之后。在某些实施方案中，在使分析物与纳米传感器接触之前标记分析物。在其它实施方案中，在分析物结合纳米传感器的捕捉剂之后标记分析物。而且，如上文提到的，可以直接标记分析物(在这种情况中，可以在该方法开始时将分析物强连接于发光标记物)或间接标记分析物(即通过使靶分析物结合第二捕捉剂，第二捕捉剂特异性结合靶分析物且连接有发光标记物，例如经过标记的第二抗体或经过标记的核酸)。在一些实施方案中，该方法可包括在接触步骤(b)之前封闭纳米传感器，由此防止捕捉剂非特异性结合非靶分析物。
适合于特异性结合和靶分析物特异性结合捕捉剂的条件包括恰当的温度、时间、溶液pH水平、环境光水平、湿度、化学试剂浓度、抗原-抗体比、等。
在某些实施方案中，可使用核酸捕捉剂来捕捉蛋白质分析物(例如DNA或RNA结合蛋白)。在备选实施方案中，可使用蛋白质捕捉剂(例如DNA或RNA结合蛋白)来捕捉核酸分析物。
样品可以是液体样品，而且，在某些实施方案中，样品可以是来源于细胞、组织、或体液的临床样品。感兴趣体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。
测定的一些步骤显示于图7和8。捕捉剂和它们的结合配偶(包括分析物)之间的分子相互作用的方法的通用方法是本领域公知的(参见例如Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,FirstEdition(1988)ColdspringHarbor,N.Y.和Ausubeletal.,ShortProtocolsinMolecularBiology,3rded.,Wiley&Sons,1995)。图4和5中显示的方法是例示性的；那些图中描述的方法并非实施测定法的唯一方式。
一种例示性抗体结合测定法的一些步骤显示于图5。在这种测定中，依照上文描述的方法将S-NP100连接于抗体以生成纳米传感器200，其包含连接于S-NP的分子粘附层的抗体202。在生成纳米传感器200之后，在适合于特异性结合的条件下使纳米传感器与含有靶分析物(例如靶蛋白质)的样品接触。抗体202特异性结合样品中的靶分析物204。在自纳米传感器清洗掉未结合的分析物之后，在适合于特异性结合的条件下使纳米传感器与用发光标记物208标记的第二抗体206接触。在自纳米传感器去除未结合的第二抗体之后，可以读取纳米传感器以鉴定和/或定量初始样品中分析物204的量。
一种例示性核酸结合测定的一些步骤显示于图6和7。在这种测定中，依照上文描述的方法将S-NP-100连接于核酸(例如寡核苷酸)以生成纳米传感器300，其包含连接于分子粘附层的核酸分子302。在生成纳米传感器300之后，使纳米传感器与含有靶核酸304的样品在适合于靶核酸304和核酸捕捉剂302特异性杂交的条件下接触。核酸捕捉剂304特异性结合样品中的靶核酸304。在自纳米传感器清洗掉未结合的核酸之后，在适合于特异性杂交的条件下使纳米传感器与用发光标记物308标记的次级核酸506接触。在自纳米传感器去除未结合的次级核酸之后，可以读取纳米传感器以鉴定和/或定量初始样品中核酸304的量。
可使用主题装置实施的增强型DNA杂交测定的一个例子是夹心杂交测定。捕捉DNA为在其3’端用硫醇功能化的单链DNA。检测DNA为在其3’端用荧光标记物(例如IRDye800CW)功能化的单链DNA。捕捉和检测DNA均具有20bp的长度。它们是以不同序列合成的，与靶定DNA的不同区域形成互补结合。首先，通过硫-金反应在S-NP的金属表面上固定化捕捉DNA。然后，将靶定DNA添加至S-NP，以供捕捉DNA捕捉。最后，将经过荧光标记的检测DNA添加至纳米传感器以检测固定化的靶定DNA。在清洗掉未结合的检测DNA之后，测量从S-NP表面发出的荧光信号，用于检测和定量靶DNA分子。
在图5和6中显示的实施方案中，可以使用次级捕捉剂(即“检测剂”)来检测结合的分析物，次级捕捉剂可缀合有荧光团或催化合成可目测或用成像系统检测的生色化合物的酶。在一个实施方案中，可以使用辣根过氧化物酶(HRP)，它能将生色底物(例如TMB、DAB、或ABTS)转变成有色产物，或者，在使用化学发光底物时生成冷发光产物。在特定实施方案中，由标记物生成的光信号具有300纳米至900纳米范围的波长。在某些实施方案中，标记物可以是电致化学发光的，因此，可以通过给传感器提供电流来生成光信号。
在一些实施方案中，次级捕捉剂(即检测剂)，例如第二抗体或次级核酸，可以连接有荧光团，例如呫吨染料，例如荧光素和罗丹明染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常以其缩写FAM和F指称)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE或J)，N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)，6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)，5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)，6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)，和罗丹明110；花青染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙啡啶染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲川染料，例如花青染料，诸如Cy3、Cy5、等；BODIPY染料和喹啉染料。主题应用中通常使用的具体的感兴趣的荧光团包括：芘，香豆素，二乙基氨基香豆素，FAM，氯三嗪基荧光素，荧光素，R110，曙红，JOE，R6G，四甲基罗丹明，TAMRA，丽丝胺，ROX，萘荧光素，德克萨斯红，萘荧光素，Cy3，和Cy5，IRDye800，IRDye800CW，Alexa790，Dylight800，等。
初级和次级捕捉剂应当以高特异性亲和力结合靶分析物。然而，初级和次级捕捉剂不能是相同分子，因为它们需要结合抗原中的不同位点。一个例子是抗人β-淀粉状蛋白捕捉抗体6E10和检测G210，在这种情况中6E10只结合人β-淀粉状蛋白肽上的第10个胺位点，而G210只结合第40个胺位点。捕捉剂和次级捕捉剂彼此不反应。另一个例子使用家兔抗人IgG作为捕捉抗体和驴抗人IgG作为检测抗体。因为捕捉和检测剂来源于不同宿主物种，所以它们彼此不反应。
用荧光团标记物蛋白质(例如第二抗体)和核酸的方法是本领域公知的。化学发光标记物包括吖啶酯和磺酰胺，鲁米诺和异鲁米诺；电致化学发光标记物包括钌(II)螯合物，其它的也是已知的。
应用
本主题方法和组合物可用于多种应用，此类应用一般是分析物检测应用，其中至少定性地(即使不是定量地)检测给定样品中特定分析物的存在。用于进行分析物检测测定的方案是本领域技术人员公知的，不需要在本文中铺陈。通常，怀疑含有感兴趣分析物的样品与主题纳米传感器的表面在足以令分析物结合其相应捕捉剂(捕捉剂拴系于传感器)的条件下使接触。捕捉剂对靶定的感兴趣分子具有高特异性亲和力。此亲和力可以是抗原-抗体反应，其中抗体结合抗原上的特定表位，或者可以是两条或更多条互补核酸链之间的序列特异性的DNA/RNA或DNA/RNA杂交反应。因此，如果感兴趣分析物存在于样品中，那么它很可能结合于传感器上捕捉剂的部位，并在传感器表面上形成复合物。就是说，捕捉到的分析物固定化在传感器表面。在去除未结合的分析物之后，接下来检测传感器的表面上这种结合复合物的存在(即固定化的感兴趣分析物)，例如使用经过标记的次级捕捉剂。
感兴趣的特定分析物检测应用包括杂交测定，其中采用核酸捕捉剂，和蛋白质结合测定法，其中采用多肽，例如抗体。在这些测定法中，首先制备样品，并在样品制备后，在特异性结合条件下使样品与主题纳米传感器接触，由此在与附接于传感器表面的捕捉剂互补的靶核酸或多肽(或其它分子)之间形成复合物。
在一个实施方案中，捕捉寡核苷酸为合成单链DNA，长20-100个碱基，一端硫醇化。这些分子固定化在S-NP的表面上，用于捕捉具有与固定化的捕捉DNA互补的序列的靶定单链DNA(其长度可为至少50bp)。在杂交反应之后，加入其序列与靶定DNA的未被占据的核酸互补的检测单链DNA(可以长20-100bp)以与靶杂交。检测DNA的一端缀合有荧光标记物，其发射波长在S-NP的等离子激元共振以内。因此，通过检测从S-NP表面发出的荧光辐射，能精确检测和定量靶单链DNA。捕捉和检测DNA的长度决定解链温度(在解链温度以上核苷酸链会分开)、错配的程度(链越长，相同那个错配对数的情况下，错配比例越低)。选择互补结合的长度的关注点之一取决于最小化错配同时保持尽可能高的解链温度的需求。另外，确定杂交长度的总长度以实现最佳信号放大。
主题传感器可用于诊断疾病或状况的方法，其包括：(a)从怀疑具有疾病或状况的患者获得液体样品，(b)使样品与主题纳米传感器接触，其中纳米传感器的捕捉剂特异性结合疾病的生物标志物，且其中接触是在适合于生物标志物特异性结合捕捉剂的条件下进行的；(c)去除未结合于捕捉剂的任何生物标志物；并(d)读取来自保持结合于纳米传感器的生物标志物的光信号，其中光信号指示患者具有疾病或状况，其中该方法进一步包括在生物标志物结合捕捉剂之前或之后用发光标记物标记生物标志物。正如下文会更详细描述的，患者可能被怀疑患有癌症，且抗体结合癌症生物标志物。在其它实施方案中，患者被怀疑具有神经病学病症，且抗体结合神经病学病症生物标志物。
主题传感器的应用包括但不限于：(a)检测、纯化和定量与某些疾病(例如感染性和寄生虫疾病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神病症和器官疾病，例如肺病、肾病)的阶段相关的化合物或生物分子；(b)检测、纯化和定量来自环境(例如水、土壤、或生物学样品，例如组织、体液)的微生物，例如病毒、真菌和细菌；(c)检测、定量对食品安全或国家安全造成威胁的化合物或生物学样品，例如有毒废物、炭疽；(d)定量医学或生理学监控器中的生命参数，例如葡萄糖、血氧水平、总血细胞计数；(e)检测和定量来自生物样品(例如细胞、病毒、体液)的特定DNA或RNA；(f)测定和比较染色体和线粒体中的DNA中的遗传序列用于基因组分析；或(g)检测反应产物，例如在药品合成或纯化过程中。
可以在各种样品基质中进行检测，诸如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。
在一些实施方案中，主题生物传感器可用于通过检测样品中来自病原体的靶核酸来诊断病原体感染。例如，靶核酸可以来自选自下组的病毒：人免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2)，人T-细胞白血病病毒1和2(HTLV-1和HTLV-2)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒，乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，人乳头瘤病毒(HPV)，水痘带状疱疹病毒(VZV)，巨细胞病毒(CMV)，单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)，人疱疹病毒8(HHV-8，也称作卡波西肉瘤疱疹病毒)和黄病毒，包括黄热病毒、登革病毒、日本脑炎病毒和西尼罗病毒。然而，本发明不限于检测来自上述病毒的DNA序列，而是可以没有问题地应用于在兽医和/或人医中重要的其它病原体。
基于它们的DNA序列同源性，人乳头瘤病毒(HPV)进一步细分成超过70种不同类型。这些类型引起不同的疾病。1、2、3、4、7、10和26-29型HPV引起良性疣。5、8、9、12、14、15、17和19-25和46-50型HPV在免疫系统削弱的患者中引起损害。6、11、34、39、41-44和51-55型在生殖器区和呼吸道的粘膜上引起良性尖形疣。16和18型HPV是医学上特别令人关注的，因为它们引起生殖器粘膜的上皮发育异常且与子宫颈、阴道、阴门和肛管浸润性癌的高比例有关。据信人乳头瘤病毒的DNA的整合在子宫颈癌的致癌作用中是决定性的。例如，人乳头瘤病毒可以通过它们的衣壳蛋白L1和L2的DNA序列来检测。相应地，本发明的方法尤其适合于检测组织样品中16和/或18型HPV的DNA序列，用于评估癌发生的风险。
在一些情况中，纳米传感器可用于检测以低浓度存在的生物标志物。例如，纳米传感器可用于检测容易获取的体液(例如血、唾液、尿、泪、等)中的癌抗原，检测容易获取的体液中的组织特异性疾病的生物标志物(例如神经病学病症(例如阿尔茨海默氏抗原)的生物标志物)，检测感染(特别是检测低滴度潜伏病毒，例如HIV)，检测母血中的胎儿抗原，及检测例如受试者血流中的外源化合物(例如药物或污染物)。
下表提供可使用主题纳米传感器(与适宜的单克隆抗体联合使用时)来检测的蛋白质生物标志物及其相关疾病的清单。表中还指出生物标志物的一种潜在来源(例如“CSF”；脑脊液)。在许多情况中，主题生物传感器能在与所标示的体液不同的体液中检测那些生物标志物。例如，在CSF中找到的生物标志物能在例如尿、血或唾液中鉴定到。
如上所述，主题纳米传感器可用于检测样品中的核酸。除了上文描述的诊断应用之外，主题纳米传感器还可用于各种药物发现和研究应用。例如，主题纳米传感器可用于多种应用，包括但不限于疾病或状况的诊断或监测(其中核酸的存在提供疾病或状况的生物标志物)、药物靶的发现(其中例如核酸在疾病或状况中差异表达，且可以作为药物治疗的靶)、药物筛选(其中通过评估核酸水平来监测药物的效果)、药物易感性测定(其中药物易感性与特定核酸谱有关)和基础研究(其中期望鉴定样品中核酸的存在，或者，在某些实施方案中，两份或更多份样品中特定核酸的相对水平)。
在某些实施方案中，可以使用上述方法获得两份或更多份不同核酸样品中核酸的相对水平，并进行比较。在这些实施方案中，通常将自上文描述的方法获得的结果相对于样品中核酸的总量(例如组成性RNA)标准化，并进行比较。这可以通过比较比率或通过任何其它手段来实现。在特定实施方案中，可以比较两份或更多份不同样品的核酸谱以鉴定与特定疾病或状况有关的核酸。
在一些例子中，不同样品可以由“实验”样品(即感兴趣样品)和“对照”样品(实验样品可以与其比较)组成。在许多实施方案中，不同样品是成对的细胞类型或其级分，一种细胞类型是感兴趣的细胞类型，例如异常细胞，而另一种是对照，例如正常细胞。如果比较两个细胞级分，这些级分通常是来自两种细胞中每一种的相同级分。然而，在某些实施方案中，可以比较同一细胞的两个级分。例示性的成对细胞类型包括，例如，从组织活检(例如具有疾病，如结肠、乳腺、前列腺、肺、皮肤癌等，或受到病原体感染等等的组织)分离的细胞，与来自相同组织(通常来自同一患者)的正常细胞；在组织培养中培养的永生的(例如具有增殖突变或永生化转基因的细胞)、受到病原体感染的、或经过处理(例如用环境或化学剂，诸如肽、激素、改变的温度、生长条件、生理应激、细胞转化等)的细胞，与正常细胞(例如除了不是永生的、未受感染、或未经处理等等之外，在其它方面与实验细胞相同的细胞)；从具有癌症、疾病的哺乳动物、衰老的哺乳动物、或暴露于某种条件的哺乳动物分离的细胞，和来自属于同一物种(优选属于同一家族)的健康或年轻的哺乳动物的细胞；及来自同一哺乳动物的已分化细胞和未分化细胞(例如一种细胞是另一种细胞的祖细胞)。在一个实施方案中，可采用不同类型的细胞，例如神经元和非神经元细胞，或者不同状态(例如对细胞施加刺激之前和之后)的细胞。在本发明的另一个实施方案中，实验材料是对病原体(诸如病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)等)感染易感的细胞，而对照材料是对病原体感染有抗性的细胞。在本发明的另一个实施方案中，成对样品由未分化细胞(例如干细胞)与已分化细胞代表。
尽管为了清楚理解起见已经通过举例说明较为详细地描述了上述实施方案，但本领域普通技术人员根据上述教导容易想到可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
实施例
已经用Nano-PrinTED和蘸印制造了多种S-NP颗粒并测试了它们对SERS和荧光的增强(以～800nm波长测试)。下面给出了示例的结果。
对于在大约800nm波长有光共振吸收的S-NP结构，盘具有直径70nm的圆形，顶部金属(金)盘厚度为15nm，间隔物(二氧化硅)厚度为20nm，底部金属(金)盘厚度15nm，自组装的金点直径为10nm左右，盘之间的粘附层是厚度为0.5nm的钛。
在制造中，首先，在4英寸基片上通过纳米压印光刻和反应离子刻蚀(RIE)成型密集纳米结构化突出部模板。立柱高度或刻蚀深度由RIE精密控制(图15a)。模具可以是主模通过纳米压印复制而成的子模，主模是利用干涉光刻、电子束光刻、球光刻(spherelithography)和其他技术制造的。然后，如图15b所示，将多个沉积层：脱模层、多个金属层(例如金)、多个粘附层(例如钛)，多个电介质层(例如二氧化硅)，通过蒸镀沿着对表面的法线方向按顺序沉积到突出部模板上。在突出部的引导下，沉积在顶部的材料形成DS-NP阵列，而在立柱底部，还形成了一多层纳米孔底板(multi-layernano-holebackplane)，二者不相连。第三，转印S-NP到另一基片(图15c)，提供了已被转移到另一基片上的S-NP阵列的示意图。在转移之前，在基片上旋涂一薄层(约50-100nm)的缓冲层以充当粘附层。转移过程在低压(例如50PSI)和室温下进行，因此不损伤基片或D2-颗粒阵列。然后模板将S-NP从模板剥离。第四，用溶剂溶解缓冲层并将S-NP释放到溶液中，以制备S-NP(图15d)。
图13显示下列的扫描电子显微镜(SEM)所见：(a)双金属盘和单电介质(D-颗粒)；(b)三金属(或磁性)电介质-纳米颗粒(TS-NP)；(c)通过“液化自完善”(self-perfectionbyliquefaction)改变两个金属盘的形状后的D-颗粒。(d)模板剥离之后基片上的D-颗粒阵列。
图14显示下列的扫描电子显微镜(SEM)所见：(a)转印后基片上的D-颗粒阵列。(b)剥落到溶液中的D-颗粒。
图15显示Nano-PrinTED(模板可剥落沉积式纳米印刷)制造S-NP的每个步骤。上排：示意图。下排：实验结果的扫描电子显微镜所见。(a)通过光刻(例如NIL)制造的立柱模板；(b)多次沉积和自组装以形成D2-颗粒；(c)转印DP到另一基片；(d)置入溶液。(e-h)，SEM图像。
如图16所示，Nano-PriTED和蘸印控制纳米颗粒结构大小(包括每个单独组件的大小和形状，它们的间距，以及最终的颗粒)的精度好得多。(a)脱模前的D2-颗粒的SEM照片，(b)测得的大小分布。测得的通过Nano-PrinTED制造的D2-颗粒的大小变化(<5％)比通过化学合成制备的金纳米颗粒(AuNP)(>15％)低3倍。
图17显示具有5nm至30nm的二氧化硅层厚度和20nm的恒定金层厚度的D2-颗粒的消光光谱的测量。等离子共振峰波长随着SiO2层厚度的增加发生红移。
图18.对于相同的800nm共振波长具有不同建构的纳米颗粒所需要的尺寸的模拟。其清楚显示，对于给定的共振波长，S-NP比常规的金属球和盘的颗粒尺寸小得多。
如图19所示，(a)测得的BPE的表面增强拉曼光谱(SERS)信号，和(b)IR-800染料与单一D2-颗粒和金纳米颗粒的荧光信号。单一D2-颗粒所具有的SERS/荧光增强比具有相似直径的单一金纳米颗粒高超过100/30倍。PDS-NP的复杂建构容许同时改善等离子增强的全部三个关键因素，从而实现最终的大大增强。在PDS-NP中，金属盘(20-60nm直径)形成了良好地吸收激发光并发射生成的光信号的天线，而较小的间隙(在盘之间或者其他的纳米点之间)和尖锐的边缘提供了大的局部场增强。

Claims (30)

1.一种纳米颗粒，其增强该纳米颗粒与光的相互作用和/或沉积在该纳米颗粒的表面上的分子/材料与光的相互作用，该颗粒包括成对的堆叠的金属盘，所述成对的金属盘由非金属间隔物分开，其中：
(a)所述金属盘及间隔物的尺寸小于所述光的波长；且
(b)该纳米颗粒对所述光相互作用的增强是单个金属盘增强的至少3倍。
2.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述光相互作用包括光吸收、光散射、光反射和光辐射。
3.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述光信号包括拉曼散射、生色、和发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。
4.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述光相互作用包括光与沉积在所述纳米颗粒上的材料或分子的相互作用。
5.权利要求4的纳米颗粒，其中所述分子是已被捕捉在所述纳米颗粒表面上的分析物。
6.权利要求4或5的纳米颗粒，其中所述分析物选自蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、以及具有不同形状的纳米颗粒。
7.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒还包括两个掩蔽层，所述掩蔽层覆盖所述金属盘的外表面，以及所述盘的边缘的一部分。
8.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒还包括能够被磁铁吸引的磁性或可磁化的盘。
9.权利要求8的纳米颗粒，其中所述磁性或可磁化的盘具有5-50nm范围的厚度。
10.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒还包括位于所述间隔物和/或所述金属盘的边缘上的至少一个金属纳米点。
11.权利要求10的纳米颗粒，其中所述纳米点的直径在5nm至15nm的范围。
12.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述盘具有选自下列的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。
13.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述金属盘和所述间隔物具有相同或相似的横向尺寸。
14.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中，对于800nm波长或附近区域中的光增强，所述盘具有直径为30nm至100nm的显著圆的形状，顶部金属盘厚度为5nm至30nm，间隔物厚度为2nm至30nm，且底部金属盘厚度为5nm至30nm。
15.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒还包括能够被磁铁吸引的磁性或可磁化的盘。
16.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中，所述堆叠的金属盘是由相同或不同的材料制成的。
17.任一前述权利要求的纳米颗粒，其中所述金属盘的材料选自下组：金、银、铜、铝、它们的合金，以及它们的组合。
18.任一前述权利要求的纳米器件，其中对于800nm及800nm左右的光波长而言，成对的金属盘之间的距离在0.1nm至20nm的范围。
19.任一前述权利要求的纳米器件，其中所述金属盘的横向尺寸在5nm到150nm的范围。
20.任一前述权利要求的纳米器件，其中所述金属盘与金属底板相隔0.1nm至60nm的范围的距离。
21.任一前述权利要求的纳米器件，其中所述至少一个金属点结构具有1nm至25nm范围的尺寸。
22.任一前述权利要求的纳米器件，其中所述金属点结构与所述金属盘之间的距离，以及所述金属点结构与所述金属底板之间的距离均在0.5nm至50nm的范围。
23.一种对自支持纳米颗粒进行掩蔽的方法，包括：
(a)获得在表面上包含多个立柱的模板，其中所述立柱的高度大于要沉积的材料的厚度；
(b)利用材料的束将一种或多种材料沿着与模板表面基本上成法向的方向沉积在立柱的顶面上，
(c)将立柱顶部沉积的材料与立柱分离，从而产生所述纳米颗粒。
24.权利要求23的方法，其中所述立柱具有呈选自下组的形状的顶部区域：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。
25.权利要求23或24的方法，其中所述方法包括在步骤b)中产生的堆叠体上沉积磁性层或可磁化层的步骤。
26.一种用于检测分析物的测定，包括：
(a)使分析物与自支持纳米颗粒接近或接触，所述自支持纳米颗粒包括成对的堆叠的金属盘，所述成对的金属盘由非金属间隔物分开；
(b)用波长大于所述盘和间隔物的尺寸的光照亮所述自支持纳米颗粒，
(c)检测从所述分析物和/或自支持纳米颗粒放出的信号。
27.权利要求26的测定，其中所述信号选自光吸收、光散射、光反射和光辐射。
28.权利要求26或27的测定，其中所述检测是通过检测拉曼散射、生色、和/或发光而实现的，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光和电致化学发光。
29.权利要求26-28中任一项的测定，其中所述分析物被所述纳米颗粒表面上的捕捉剂所结合。
30.权利要求26-29中任一项的测定，所述分析物选自蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、以及具有不同形状的纳米颗粒。
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