CN113412422A - 传感器芯片及其方法 - Google Patents

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CN113412422A CN202080012067.0A CN202080012067A CN113412422A CN 113412422 A CN113412422 A CN 113412422A CN 202080012067 A CN202080012067 A CN 202080012067A CN 113412422 A CN113412422 A CN 113412422A
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张岩
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Abstract

本公开总体涉及用于检测分析物的传感器芯片和方法。具体而言，本公开涉及用于检测患有神经退行性疾病的受试者中的分析物的传感器芯片。传感器芯片包括位于膜支撑层上的导电层，其中多个孔延伸穿过导电层和膜支撑层，并且将其布置以使得对导电层和/或膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。

Description

传感器芯片及其方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年1月31日提交的标题为SENSOR CHIP AND METHODS THEREOF的新加坡临时申请No.10201900937Q号的优先权。
技术领域
本公开总体涉及用于检测分析物的传感器芯片和方法。具体而言，本公开涉及用于检测患有神经退行性疾病和其他疾病(例如淀粉样变性)的受试者中的分析物的传感器芯片。
背景技术
表面等离子体共振(SPR)传感是实验室中广泛使用的技术，用于表征生物分子间的相互作用，例如抗体-抗原间的相互作用。该技术通常基于将配体捕获分子固定在金属表面上，并且测量配体与捕获分子结合时的折射率变化。该技术是一种无标签的技术，其不需要使用专门的标记或染料对分子间的相互作用进行敏感测量。目前正在开发用于实验室诊断患有不同疾病、如阿尔兹海默症、肝炎、糖尿病和癌症的患者。
痴呆症是21世纪的公共健康危机。严重痴呆症的最常见形式、即阿尔兹海默症(AD)的特征是记忆和认知功能的逐渐丧失。受影响的个人在自我照顾、社会和职业功能方面表现出明显的限制。然而，早在这些全面的临床症状出现前，AD分子特征可能已经显现并且发展。其包括细胞外淀粉样蛋白β(Aβ)斑块和细胞内tau神经原纤维缠结。由于复杂和进行性的神经病理学，早期检测和干预被认为是疾病改良疗法成功的关键。
然而，目前的AD诊断和疾病监测是主观的和后期的。其通过使用已公布的标准进行临床和神经心理评估来实现。这些方法缺乏灵敏度和特异性，尤其是在症状较为轻微、并且与各种其他疾病显著重叠的早期阶段。正在开发新的分子诊断测定，包括通过正电子发射断层扫描(PET)进行的脑脊液测量和脑淀粉样斑块成像；然而，因为需要侵入性的腰椎穿刺、或对于更广泛的临床应用而言过于昂贵，这些测试面临限制。其结果是，在寻找用于辅助早期诊断和疾病监测的AD的血清学生物标记物方面存在高度的兴趣。
因此，需要克服或至少缓和上述一个或多个问题。
发明内容
本文中公开了用于通过表面等离子体共振检测分析物的传感器芯片和方法。
在一个方面中，提供了一种传感器芯片，其包括位于膜支撑层上的导电层，其中多个孔延伸穿过导电层和膜支撑层，并且将其布置以使得对导电层和/或膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
在一个方面中，提供了一种成像系统，其包括光源、检测器和本发明所定义的传感器芯片，其中将所述光源布置为照明传感器芯片，并且将所述检测器定位为检测透射传感器芯片的光。
在一个方面中，提供了一种制造传感器芯片的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供顶部膜支撑层；
b)在顶部膜支撑层上沉积导电层；
c)形成延伸穿过膜支撑层的多个孔，所述孔还延伸穿过导电层，并且被将其布置以使得对导电层和/或顶部膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
在一个方面中，提供了一种检测样品中分析物的方法，所述方法包括：
a)将分析物捕获到本发明定义的传感器芯片的表面上；
b)检测第二识别分子与传感器芯片表面上捕获的分析物的结合，其中所述第二识别分子对分析物具有特异性，其中与对照样品相比，所述第二识别分子的结合增加表明样品中存在所述分析物。
在一个方面中，提供了一种试剂盒，其包括本发明所定义的传感器芯片。
在一个方面中，提供了一种检测受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法，所述方法包括：
a)将从受试者获得的样品与本发明定义的传感器芯片的表面接触；
b)检测第二识别分子与在传感器芯片表面上捕获的分析物的结合；
其中所述第二识别分子对所述分析物具有特异性，与从对照受试者获得的样品相比，所述第二识别分子的结合增加表明所述受试者患有神经退行性疾病。
还提供了本发明所述的传感器芯片在检测受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法中的用途。
附图说明
现在将参考附图仅通过非限制性示例的方式描述本发明的一些实施方案，其中：
图1：用于分析循环外泌体结合的Aβ的APEX平台。
(a)外泌体与Aβ蛋白缔合。在AD脑病理学中发现的淀粉样斑块的主要成分Aβ蛋白被释放到细胞外空间。外泌体是哺乳动物细胞主动分泌的纳米级细胞外囊泡。通过其表面糖蛋白和糖脂，外泌体可以与所释放的Aβ蛋白缔合。(b)外泌体结合的Aβ的透射电子显微照片。来源于神经细胞的外泌体(SH-SY5Y)用Aβ42聚集体处理，并且通过Aβ42特异性抗体用金纳米颗粒(10nm)标记。纳米颗粒显示为块状点(由红色箭头指示)。(c)APEX测定示意图。为了能够在纳米尺度上进行灵敏的绘谱，首先将外泌体免疫捕获到等离子体纳米传感器上(在扩增前)。通过原位酶促扩增，在传感器结合的外泌体上(在扩增后)局部形成不溶的光学沉积物。该沉积在空间上被定义用于分子共定位分析，并且改变了用于SPR信号增强的折射率。需要注意的是，为补偿酶促扩增，纳米传感器被背面照明(远离酶活性)，以实现分析稳定性。所述沉积导致通过纳米传感器的透射光产生红移。(d)APEX扩增透射光谱变化的代表性示意图。通过APEX平台，将特异性外泌体结合(前)和随后的扩增绘谱(后)作为透射光谱位移(Δλ)进行监测。a.u.，任意单位。(e)利用APEX平台，在患有阿尔兹海默症(AD)、轻度认知障碍(MCI)的患者和无认知障碍(NCI)的对照的血液样品中测量外泌体结合的Aβ。血液测量与相应的脑淀粉样斑块沉积的PET成像相关。(f)APEX微阵列的照片。每个传感器芯片包含6x 10个传感元件，由均匀制作的等离子体晶格组成，用于多路复用测量。有关传感器制造、表征和设计优化分别见图7-10。
图2：APEX信号扩增和多路复用绘谱。
(a)逐步的APEX透射光谱变化。我们进行了一系列操作，即传感器上的抗体缀合(抗CD63)、外泌体结合、酶标记和酶沉积，并且监测了所造成的的光谱位移。尽管酶标记未引起任何显著变化，但沉积物形成导致～400％的信号增强(****(P<0.0001，n.s.不显著，学生t-检验)。(b)APEX信号扩增和光学沉积面积覆盖率的比较。通过扫描电子显微镜(SEM)分析确定面积覆盖率的增加(****P<0.0001，学生t-检验)。所有数据均以信号扩增前的数据进行标准化。插图(右)显示了APEX扩增前后传感器结合的外泌体的SEM图像。(c)利用背面照明的有限差分时域模拟。APEX传感器设计而非玻璃镀金(gold-on-glass)设计，使得能够通过背面照明产生增强的电磁场。背面照明最大限度地减少了直接入射光对酶活性的影响(发生在传感器顶部)。箭头表示入射照明的方向。(d)APEX扩增动力学的实时传感图。不同浓度的光学底物(3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐；高：1mg/ml，低：0.01mg/ml)用于监测扩增效率。所有数据均以阴性对照进行标准化，用IgG同位素对照抗体实施。(e)APEX、ELISA和蛋白质印迹检测灵敏度的比较。扩增前后的APEX检测限(虚线)是通过滴定已知量的外泌体并且测量其CD63信号来确定的。(f)用于测量靶标蛋白的APEX测定的特异性。对淀粉样β(Aβ42)、淀粉样前体蛋白(APP)、α-突触核蛋白(α-syn)、L1的密切同源物(CHL1)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)和tau蛋白开发了测定。所有测定均证明了特异性检测。热图信号被测定(行)标准化。所有测量一式三份实施，并且数据在a、b、d和e中显示为平均值±s.d.。
图3：Aβ聚集体和外泌体间的优先缔合。
(a)Aβ蛋白聚集示意图。我们改变了聚簇的程度并且使用过滤方法分别制备小Aβ42聚集体和大Aβ42聚集体。(b)Aβ蛋白聚集体的表征。(左)透射电子显微照片显示了所制备的Aβ42聚集体的球形形态。(右)动态光散射分析证实了不同尺寸制备物的单峰尺寸分布。(c)外泌体-Aβ缔合分析示意图。将Aβ42聚集体(小聚集体对大聚集体)固定在APEX传感器上，并且使用等浓度的来自神经细胞的外泌体(SH-SY5Y)进行处理，以确定缔合动力学。所有外泌体结合数据均以固定在传感器上的相应Aβ42聚集表面积进行标准化(详见方法)。(d)外泌体结合动力学的实时传感图。与类似尺寸的牛血清白蛋白(BSA)对照聚集体相比(见图13)，外泌体与Aβ42聚集体更牢固地缔合。重要的是，与外泌体对较小Aβ42聚集体(左)的结合亲和力相比，外泌体对较大Aβ42聚集体(右)显示出更强的亲和力。注意y轴上的比例差异。所有结合亲和力(KD)均由标准化的外泌体结合数据并相对于BSA对照确定。KD(小)/KD(大)＝5.27。(e)多种细胞外囊泡与Aβ42聚集体的差异缔合。囊泡分别来自不同的细胞来源，即神经元、神经胶质细胞、内皮细胞、单核细胞、红细胞、血小板和上皮细胞，并且以等浓度用于结合分析。利用APEX平台，我们首先测量了囊泡与Aβ42功能化传感器的直接结合(直接)。接着，对于每一个细胞来源，我们将结合的囊泡标记为来源特异性标记物(细胞来源特异性标记物)或泛外泌体标记物(即CD63，泛外泌体标记物)，并且测量相关的APEX信号扩增。所有测量均相对于IgG同位素对照抗体进行，一式三份。数据在e中显示为平均值±s.d.。
图4：循环外泌体结合Aβ与脑成像的临床相关性。
(a)来自临床受试者的代表性重建PET脑图像，显示出脑淀粉样斑块负载增加。将特定大脑区域的标准化摄取值比(SUVR)相对于平均小脑灰质强度进行标准化，以确定脑淀粉样斑块负载。(b)不同循环Aβ42群体与整体平均PET脑成像的相关性(n＝72)。使用APEX测定，我们分别测量了患有阿尔兹海默症(AD)、轻度认知障碍(MCI)的患者、以及无认知障碍(NCI)、患有血管性痴呆(VaD)和血管性轻度认知障碍(VMCI)的对照受试者的血液样品中来自外泌体结合的Aβ42(左)、未结合的Aβ42(中)以及总Aβ42(右)的信号。当与脑淀粉样斑块的整体成像数据相关时，与未结合的Aβ42群体(中，R2＝0.0193)或总Aβ42(右，R2＝0.1471)相比，外泌体结合的Aβ42测量表明最佳相关性(左，R2＝0.9002)。(c)在区分不同的临床组方面的不同循环Aβ42群体的分析(n＝84)。只有循环外泌体结合的Aβ42的APEX测量(左)才能区分AD临床组(AD和MCI)以及其他正常(NCI)和临床对照(VaD、VMCI组和急性中风)。未结合的Aβ42测量(中)和总Aβ42测量(右)在不同临床组间均未显示任何统计显著性(**P<0.01，**P<0.0001，n.s.，无显著性，学生t-检验)。所有测量均相对于IgG同型对照抗体进行，一式三份。数据在b-c中显示为平均值±s.d.。
图5：神经元细胞脱落的细胞外囊泡的表征。
(a)神经元细胞(SH-SY5Y)的扫描电子显微照片，显示从细胞中大量释放纳米级细胞外囊泡。(b)所释放的囊泡的高倍图像。(c)通过纳米颗粒追踪分析确定的细胞外囊泡的单峰尺寸分布，显示平均直径为～150nm。(d)囊泡裂解物的蛋白质印迹分析。对囊泡进行裂解，并针对外泌体标记物(LAMP 1、ALIX、HSP90、HSP70、CD63、Flotillin 1、TSG101)、神经元标记物(NCAM)以及包括脂蛋白(APOE)和其他膜室标记物(Calnexin、GRP94)在内的阴性标记物进行免疫印迹。(e)用不同尺寸的金纳米颗粒(CD63，20nm；Aβ42，5nm)进行双重免疫标记的透射电子显微照片证实了两种标记物在同一囊泡上的共定位，说明存在外泌体结合的Aβ。
图6：APEX扩增产物。
APEX传感器的扫描电子显微照片(a)在扩增前，通过抗CD63抗体将外泌体捕获到传感器上，和(b)在扩增后，显示不可溶的光学沉积物从可溶的底物(3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐)局部生长。所得的APEX信号扩增与局部沉积物面积覆盖率的增加密切相关。
图7：APEX微阵列传感器的大规模制造。
所有APEX传感器均在8英寸的硅(Si)晶片上制造。制造步骤包括：(1)通过热氧化制备10nm二氧化硅(SiO2)层，并且通过低压化学气相沉积(LPCVD)在晶片上沉积145nm氮化硅(Si3N4)。(2)在用光致抗蚀剂涂布后，进行深紫外(DUV)光刻以在抗蚀剂中限定纳米孔阵列图案。该图案通过反应离子蚀刻(RIE)转移至Si3N4膜。(3)在去除光致抗蚀剂后，使用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)在晶片的正面上沉积SiO2的薄保护层(100nm)。为了实现光透射，晶片背面旋涂有光致抗蚀剂；使用光刻法以定义传感区。(4)通过RIE蚀刻Si3N4和SiO2，然后通过氢氧化钾(KOH)和四甲基氢氧化铵(TMAH)蚀刻硅。(5)蚀刻后，用稀氢氟酸(DHF)(1:100)去除SiO2保护层。(6)将Ti/Au(10nm/100nm)沉积在Si3N4膜上。
图8：APEX微阵列传感器的表征。
(a)显示APEX微阵列传感器芯片大规模制造的8英寸晶片照片。每个晶片由>2000个感光元件组成。(b)APEX传感器中高度均匀的纳米孔的扫描电子显微照片。插图显示了纳米孔晶格的放大图。
图9：逐步的光谱变化。
APEX传感器与(a)用于外泌体捕获的抗CD63抗体、或(b)同位素对照抗体缀合。在APEX扩增前，所有传感器均用等浓度的来自神经细胞系(SH-SY5Y)的外泌体处理。虽然传感器显示了相似程度的利用抗体(抗体缀合)的表面功能化，但只有抗CD63功能化的传感器显示了分别与外泌体结合和APEX扩增相关的显著光谱位移。需要注意的是，在对照传感器中，在不存在外泌体结合的情况下，APEX扩增引起的光谱变化可忽略不计。a.u.，任意单位。
图10：APEX传感器性能的优化。
(a)利用背面照明的传感器性能的比较。我们比较了纳米孔直径变化的不同APEX传感器的SPR透射强度、光谱峰的半峰全宽(FWHM)和检测灵敏度。所有传感器均从背面照射，以补偿APEX酶促扩增。优化后的APEX设计具有230nm的纳米孔直径，在氮化硅膜上悬浮的100nm厚的金层中以450nm的规则周期形成图案。这种双层等离子体结构支持通过背面照明的SPR激发。(b)经优化的传感器的透射光谱随着增加的折射率而发生变化。折射率的增加引起了透射光谱的变化，并且将共振峰位移至更长的波长。(c)光谱位移与折射率增加呈线性相关。(d)APEX再现性和可重复性。对同一样品进行APEX酶促扩增，并且在不同用户、传感器芯片和测量时间之间进行测量。测量结果显示以下分析变异系数：组间＝2.76％，组内＝4.14％，总计＝4.59％。所有测量均一式三份或以上实施，数据在(a)中显示为平均值±s.d.。a.u，任意单位，n.s.，不显著，学生t-检验。
图11：APEX工作流程和扩增效率。
(a)用于检测蛋白质(囊外和囊内)和miRNA的APEX工作流程。(b)针对不同分子靶标的APEX扩增效率。为以下靶标获得APEX信号：囊外蛋白、Aβ42蛋白、囊内蛋白、热休克蛋白90；miRNA、miRNA-9。所有信号均以加入光学底物前的信号进行标准化，以确定扩增比。测量一式三份实施，数据在(b)中显示为平均值±s.d.。
图12：由大Aβ聚集体组装而成的原纤维结构。
在制备的大Aβ42聚集体的温育2小时后观察到淀粉样原纤维。所形成的结构通过抗Aβ42抗体用金纳米颗粒(15nm)免疫标记，并且通过透射电子显微镜进行表征。
图13：BSA对照聚集体的制备。
(a)牛血清蛋白聚集体示意图。我们改变了加热时间，以分别制备小BSA对照聚集体和大BSA对照聚集体。(b)牛血清蛋白聚集体的表征。通过动态光散射分析确定BSA聚集体的流体动力学直径。两种聚集体均呈现单峰尺寸分布。小聚集体的直径为～15nm，大聚集体的直径为～100nm。
图14：从不同细胞来源分离的细胞外囊泡。
细胞外囊泡分别来自(a)神经元(SH-SY5Y)、(b)神经胶质细胞(GLI36)、(c)内皮细胞(HUVEC)、(d)单核细胞(THP-1)、(e)红细胞、(f)血小板、(g)前列腺来源的上皮细胞(PC-3)和(h)卵巢来源的上皮细胞(SK-OV-3)。所有囊泡均通过纳米颗粒追踪分析进行表征。
图15：不同循环Aβ群体的APEX测量。
(a)用于在临床血浆样品中表征不同循环Aβ群体的APEX测定配置。从天然血浆中测量外泌体结合的Aβ42和总Aβ42群体，而从血浆滤液中检测未结合的Aβ42群体。(b)纤连蛋白与外泌体结合的Aβ42的温育得到可忽略的APEX信号变化。(c)阴性对照(含Aβ42蛋白的APOE脂蛋白，人血清白蛋白/HSA)显示可忽略的信号，表明APEX测定对外泌体结合的Aβ42的特异性。所有测量一式三份实施，数据显示为平均值±s.d.。
图16：临床样品中Aβ群体的表征。
(a)外泌体结合的Aβ42群体。我们直接从天然血浆样品中富集了Aβ42，并且针对所捕获的Aβ42中的外泌体标记物(CD63、CD81和CD9)和神经元标记物(NCAM、L1CAM和CHL-1)测量了共定位信号的相对水平。所有标记物均可被检测到，CD63是测试的所测试的临床样品中表达最高的标记物。(b)用于表征未结合的Aβ42群体的血浆滤液。为了评价未结合的Aβ42群体，我们使用膜过滤(尺寸截止值＝50nm，Nuclepore，Whatman)制备无囊泡的血浆滤液。如通过纳米颗粒追踪分析所确定的，滤液显示可忽略的囊泡计数。(c)血浆滤液还显示出可忽略的外泌体标记物(CD63)和神经元标记物(NCAM)信号，表明通过过滤有效去除了外泌体。阿尔兹海默症(AD)、轻度认知障碍(MCI)和无认知障碍的健康对照(NCI)。所有测量一式三份，数据显示为平均值±s.d.。
图17：外泌体结合的Aβ42与区域性脑淀粉样蛋白负载的相关性。
我们确定了特定大脑区域的成像SUVR，即受早期AD影响的扣带回区和受晚期AD影响的枕叶区。与受晚期AD影响区域的成像数据(b，R2＝0.6863)相比，外泌体结合的Aβ42的APEX测量结果与受早期AD影响区域的成像数据(a，R2＝0.8808)更一致。阿尔兹海默症(AD，n＝17)、轻度认知障碍(MCI，n＝18)、血管性痴呆(VaD，n＝9)、血管性轻度认知障碍(VMCI，n＝12)、无认知障碍的健康对照(NCI，n＝16)。所有测量一式三份实施，数据显示为平均值±s.d.。
图18：不同诊断的临床受试者中的PET成像比较。
在不同临床诊断的患者(n＝72)：AD(n＝17)、MCI(n＝18)、NCI(n＝16)、VaD(n＝9)和VMCI(n＝12)中进行了脑淀粉样斑块负载的PET成像。整体平均斑块沉积的标准化摄取值比(SUVR)可以区分AD临床组(AD和MCI)以及其他健康受试者(NCI)和临床对照(VaD和VMCI)(**P<0.01、****P<0.0001，学生t-检验)。
图19：临床样品中的细胞外囊泡。
(a)对来自不同临床诊断的受试者(AD＝17、MCI＝18、NCI＝16、VaD＝9、VMCI＝12和急性中风＝12)的血液样品进行细胞外囊泡的代表性分析(通过纳米颗粒追踪分析测量)。比较来自临床血液样品(n＝84)的(b)囊泡尺寸和(c)囊泡浓度。值得注意的是，在不同临床诊断的样品中，未发现囊泡尺寸和浓度存在显著差异(n.s.，不显著，学生t-检验)。
图20：APEX测定技术、传感器设计和制造的比较。
图21显示(a)淀粉形成蛋白聚集的抑制。(b)动态光散射分析证实了在使用和不使用抑制剂对淀粉形成蛋白进行温育时的单峰尺寸分布和尺寸差异。(c)外泌体结合动力学的实时传感图。与较小的Aβ42聚集体(经抑制剂处理)相比，外泌体对较大的Aβ42聚集体(未经处理)显示出更强的亲和力。
图22显示了外泌体结合动力学的实时传感图。与相似尺寸的牛血清白蛋白(BSA)对照聚集体相比，外泌体与淀粉形成蛋白(例如Aβ、APP、α-Syn、IRS-1、Tau、APOE、SOD1、TDP-43、bassoon、纤连蛋白)聚集体更牢固地缔合。
图23显示了用于测量靶标miRNA分子的APEX测定的特异性。对miR-9、miR-15b、miR-29b、miR-29c、miR-107、miR-146a和miR-181c开发了测定。所有测定均显示出特异性检测。热图信号被测定(行)标准化。
具体实施方式
本文中公开了一种用于通过表面等离子体共振检测分析物的传感器芯片和方法。
在一个方面中，提供了一种传感器芯片，其包括位于膜支撑层上的导电层，其中多个孔延伸穿过导电层和膜支撑层，并且被将其布置以使得对导电层和/或膜支撑层的照射产生表面等离子体共振。
在一个实施方案中，多层结构化材料(导电金属和支撑基材)的设计实现了等离子体偶联。该设计可支持表面等离子体共振的双向激发，其中来自双向照明(从顶部或从底部)的SPR性能是可比的。
这里使用的术语“导电层”可以是当被电磁能(例如光波)激发时产生表面等离子体共振的导电材料。所述导电材料可以指例如金属导电材料。此类金属导电材料可以是任何金属，包括贵金属、碱金属、过渡金属和合金。导电材料的示例包括但不限于金、铑、钯、银、铂、锇、铱、钛、铝、铜、锂、钠、钾、镍、金属合金、氧化铟锡、氧化铝锌、氧化镓锌、氮化钛和石墨烯。在一个实施方案中，导电材料是金、银、铝、钠、铟或钛。金属可以是其裸露的形式或涂有额外的保护和增强材料层。
当导电材料在光学区域(紫外-可见-红外光谱，包括约100纳米(nm)至3000nm的波长)中表现出显著的散射强度时，其可以是“光学可见的”。当导电材料在可被人眼检测的约380nm至750nm的波长带(即可见光谱)中表现出显著的散射强度时，其可以是“视觉可见的”。
在一个实施方案中，膜支撑层是结构化膜支撑层。
在一个实施方案中，膜支撑层是氮化硅或二氧化钠(sodium dioxide)。其他支撑材料包括可被图案化以形成偶联多层等离子体结构的基材。
延伸穿过导电层和膜支撑层的多个孔的直径和周期可以变化，以实现不同的共振波长和消逝波的穿透。
多个孔包括对称的圆形孔、空间各向异性形状，例如椭圆形、狭缝，并且还包括三角形、正方形、矩形或多边形的任何孔。还可以使用不同形状孔的组合。所述孔可具有约1500nm或更小、约1400nm或更小、约1300nm或更小、约1200nm或更小、约1100nm或更小、约1000nm或更小、约900nm或更小、约800nm或更小、约700nm或更小、约600nm或更小、约500nm或更小、约450nm或更小、约400nm或更小，约350nm或更小、约300nm或更小、约250nm或更小、约240nm或更小、约230nm或更小、约220nm或更小、约210nm或更小、约200nm或更小、约190nm或更小、约180nm或更小、约170nm或更小、约160nm或更小、约150nm或更小、约140nm或更小、约130nm或更小、约120nm或更小、约110nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约70nm或更小、约60nm或更小、约50nm或更小、约40nm或更小、约30nm或更小、约20nm或更小，或约10nm或更小的尺寸或直径。
在一个实施方案中，所述孔可具有约150nm至约450nm的尺寸或直径。在一个实施方案中，所述孔具有选自150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm或介于两者之间任意处的尺寸或直径。在一个实施方案中，所述孔是洞并且具有230nm的直径。
术语“周期性”是指通过孔在传感器芯片上的定位而以规则间隔出现的孔的重现或重复。因此，术语“周期性”是指相对于彼此的孔的规则预定义图案。
表面等离子体共振传感器芯片可以包括孔的周期性阵列。规则的周期性可以允许共振波长和消逝波的穿透的严格控制。在一个实施方案中，孔具有约250nm至约650nm的周期性。在一个实施方案中，孔具有选自250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、600nm、610nm、620nm、630nm、640nm和650nm或介于两者之间任意处的周期性。在一个实施方案中，孔具有450nm的周期性。
在一个实施方案中，将所述孔布置以使得在照明时产生的表面等离子体共振的衰减长度大约等于所述第一识别分子的靶标的直径。
在一个实施方案中，所述导电层和膜支撑层被设置在基材上，所述基材在与多个孔相邻的区域中具有形成于其中的空隙，以使得在任一方向上对导电层和/或膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
在一个实施方案中，所述传感器芯片包括固定在导电层表面上的第一识别分子。所述第一识别分子可以使用本领域公知的技术固定在表面上。例如，所述第一识别分子可以被吸附在表面上。或者，在固定第一识别分子前，所述表面可以涂布链霉亲和素或亲和素层。所述第一识别分子可以通过链霉亲和素-生物素缀合被生物素化并且固定在表面上。在一个实施方案中，表面可以与聚乙二醇(PEG)分子一起温育。所述表面可与活性(羧化)硫醇-PEG一起温育。然后，所述表面可在溶解于MES缓冲液中的过量NHS/EDC的混合物中通过碳二亚胺交联而被激活，并且与所述第一识别分子缀合。在一个替代的实施方案中，所述表面可与含长活性(羧基化)硫醇-PEG和短无活性的甲基化硫醇-PEG的聚乙二醇(PEG)的混合物一起温育。长活性(羧化)硫醇-PEG与短无活性甲基化硫醇-PEG的比例可以优化，以实现最大的功能结合。然后，所述表面可在溶解于MES缓冲液中的过量NHS/EDC的混合物中通过碳二胺交联而被激活，并且与所述第一识别分子缀合。
术语“识别分子”可指能够与分析物特异性结合的分子。“识别分子”可以是抗体、核酸、肽、适体、小分子或其他合成试剂。
术语“分析物”指在传感器芯片上待检测或测量的样品中存在的物质。“分析物”可包括细胞、病毒、核酸、脂质、蛋白质、肽、糖肽、纳米囊泡、微囊泡、外泌体、细胞外囊泡、糖、代谢物或其组合或组织状态。“分析物”可以是例如与外泌体结合或相关的肽或核酸(例如miRNA)生物标记物。“分析物”还可以是例如细胞和蛋白质间的复合物、或蛋白质和核酸间的复合物。
在一个实施方案中，所述第一识别分子是抗体或其片段。例如，所述抗体可以是识别泛外泌体标记物的抗体或与外泌体相关的或结合的标记物。例如，所述抗体可以是对在外泌体中丰富且具有特征性的CD63、CD9或CD81具有特异性的抗体。所述抗体还可以对细胞特异性来源的标记物(例如CHL1、L1CAM或NCAM)具有特异性。所述抗体还可以识别与外泌体相关的或结合的生物标记物。例如，所述抗体可以是识别Aβ的抗Aβ抗体，或识别与外泌体结合或相关的的APP、α-syn或Tau的抗体。
如本发明所用，术语“抗体”包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、Fab片段、F(ab')片段、二硫连接Fvs(sdFv)(包括双特异性sdFvs)和抗独特型(抗Id)抗体，以及上述任何一种的表位结合片段。本发明提供的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更大的多特异性。多特异性抗体可以对多肽的不同表位或可以对多肽以及异源表位、例如异源多肽或固体支撑材料具有特异性。
术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且是指通过肽键或经修饰的肽键连接的任何氨基酸聚合物(二肽或更大)。少于约10-20个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。本发明的多肽可包含非肽成分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其他非肽取代基可由在其中产生多肽的细胞而添加到多肽中，并且随细胞类型而变化。多肽在本发明中根据其氨基酸骨架结构进行定义；取代基如碳水化合物基团通常没有规定，但仍然可以存在。
如本发明所述，“核酸”可以是RNA或DNA，可以是单链或双链，并且可以是例如编码感兴趣的蛋白质的核酸、多核苷酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如肽-核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)等。此类核酸序列包括例如但不限于，编码蛋白质的核酸序列，例如充当转录阻遏物、反义分子、核酶、小抑制性核酸序列，例如但不限于，RNAi、shRNAi、siRNA、微RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。
如本发明所用，“纳米囊泡”可指天然存在的或合成的囊泡，其内部包括空腔。纳米囊泡可包括包裹内部空腔内容物的脂质双层膜。纳米囊泡可包括脂质体、外泌体、细胞外囊泡、微囊泡、凋亡囊泡(或凋亡体)、液泡、溶酶体、转运囊泡、分泌囊泡、气体囊泡、基质囊泡或多囊体。纳米囊泡可具有约1000nm或更小、约900nm或更小、约800nm或更小、约700nm或更小、约600nm或更小、约500nm或更小、约450nm或更小、约400nm或更小、约350nm或更小、约300nm或更小、约250nm或更小、约240nm或更小、约230nm或更小、约220nm或更小，约210nm或更小、约200nm或更小、约190nm或更小、约180nm或更小、约170nm或更小、约160nm或更小、约150nm或更小、约140nm或更小、约130nm或更小、约120nm或更小、约110nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约70nm或更小、约60nm或更小，约50nm或更小、约40nm或更小、约30nm或更小、约20nm或更小，或约10nm或更小的尺寸。
外泌体是一种纳米囊泡，在本领域中还称为细胞外囊泡、微囊泡或微粒。这些囊泡由真核细胞脱落，或从质膜上脱落至细胞外部。这些膜囊泡尺寸不一，直径为约10至约5000nm。通过胞内多囊体胞吐释放的小囊泡(直径约10-1000nm，优选30-100nm)在本领域中称为“外泌体”。本发明所述的方法和组合物同样适用于所有尺寸的其他囊泡。
术语“样品”指包含分析物或正在测试分析物存在的任何样品。所述样品包括来源于或包含细胞、生物(细菌、病毒)、裂解的细胞或生物、细胞提取物、核提取物、细胞或生物的组分、细胞外液、体外培养细胞或生物的培养基、血液、血浆、血清、胃肠道分泌物、尿液、腹水、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰、囊液、羊水、脑脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液、胸腔积液、乳头抽吸物、母乳、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、和前列腺液。样品可以是病毒或细菌样品、从环境来源获得的样品(例如污染水体、空气样品或土壤样品)、以及食品工业样品。样品可以是生物样品，其是指来源于或获得于活的生物。所述生物可以是体内的(例如完整的生物)，还可以是体外的(例如在培养物中生长的细胞或器官)。“生物样品”还指来自受试者的细胞或细胞群、或一定量的组织或液体。最常见的情况是从受试者体内取出样品，但术语“生物样品”还可以指在体内分析的细胞或组织，即不从受试者体内取出。“生物样品”通常包含来自受试者的细胞，但所述术语还可指非细胞生物材料，例如血液、唾液或尿的非细胞部分。生物样品可以来自原发性、继发性或转移性肿瘤的切除、支气管镜活检或空心针活检，或者来自胸腔积液的细胞块。另外，细针吸取生物样品也很有用。在一个实施方案中，生物样品是原代腹水细胞。生物样品还包括来自患者组织的外植体和原代和/或转化细胞培养物。生物样品可通过从受试者体内取出细胞样品来提供，但还可通过使用先前分离的细胞或细胞提取物(例如，由另一人在另一时间分离，和/或用于另一目的)来实现。还可以使用档案组织，例如具有治疗或结果历史的组织。生物样品包括但不限于组织活检、擦伤(例如口腔擦伤)、全血、血浆、血清、尿液、唾液、细胞培养物或脑脊液。通过本发明所述的组合物和方法分析的样品可能已被处理以纯化或富集其中包含的外泌体。在一个实施方案中，样品是血液。
在一个方面中，提供了一种成像系统，其包括光源、检测器和本发明所定义的传感器芯片，其中检测器定位为检测由光源产生的透射传感器芯片的光。
在一个方面中，还提供了一种试剂盒，其包括本发明所定义的传感器芯片。
所述试剂盒可进一步包括第二识别分子，所述第二识别分子对传感器芯片表面上捕获的分析物或与捕获的分析物缔合的分析物具有特异性。所述试剂盒可包含一种或多种第二识别分子，每种第二识别分子均对一种或多种分析物具有特异性，从而可检测一种或多种分析物。
所述第二识别分子可允许1)信号扩增，2)共定位分析(例如，检测在同一囊泡中同时发现的不同靶标)，以及3)基于分子和组织差异分析物亚群的差异化。
所述第二识别分子可与信号扩增部分偶联，其中信号扩增部分能够诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体，并且增加所测量的表面等离子体共振信号。例如，所述试剂盒可包含第二识别分子，其为抗体(例如对Aβ42具有特异性的抗体)。所述第二识别分子可以与辣根过氧化物酶缀合。所述试剂盒可进一步包含酶底物。因此，辣根过氧化物酶能够在传感器芯片表面诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体。
术语“信号扩增分子”指能够在传感器芯片表面诱导形成不溶聚集体，从而相对于所捕获的分析物而言增加光密度的分子。当第二识别分子与传感器芯片表面的分析物结合时，这将导致透射波长(光谱位移)或透射强度的更大变化，从而有助于增加传感器芯片的灵敏度。所述“信号扩增分子”可以是例如酶，例如辣根过氧化物酶，其与酶底物反应，在传感器芯片表面形成不可溶的聚集体。所述“信号扩增分子”还可以是与传感器芯片表面上的第二识别分子结合并且形成聚集体的二级抗体。所述二级抗体可进一步与酶、金颗粒或大分子偶联，从而有助于形成更大的聚集物以增加光密度。
在一个实施方案中，本发明涉及一种高度敏感的分析平台，即扩增等离子体外泌体(APEX)，用于直接从阿尔兹海默症(AD)患者的血液样品中检测与外泌体结合的淀粉样蛋白β(Aβ)。所述分析方法可利用透射表面等离子体共振(SPR)和光学产物的原位酶促转化进行多路复用群体分析。所述APEX技术可实现外泌体内容物(例如，蛋白质和miRNA)的多参数原位绘谱。APEX平台可用于测量循环Aβ的不同群体(外泌体结合的、未结合的、和总的)以及循环Aβ的不同组织状态，并且将这些血液测量与脑淀粉样斑块负载的PET成像相关联。
在一个方面中，提供了一种制造传感器芯片的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供顶部膜支撑层；
b)在顶部膜支撑层上沉积导电层；
c)形成延伸穿过膜支撑层的多个孔，所述孔还延伸穿过导电层，并且将其布置以使得对导电层和/或顶部膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
所述方法可包括：
在硅基材的顶面和底面上涂布顶部膜支撑层和底部膜支撑层；
在顶部膜支撑层上提供光致抗蚀剂层，以及
通过深紫外光刻(DUV)在光致抗蚀剂中限定多个孔，并且通过反应离子蚀刻(RIE)将多个孔的图案转移至顶部膜支撑层。
所述方法还可包括以下步骤：
去除顶部膜支撑层上的光致抗蚀剂，并且在顶部膜支撑层表面上涂布二氧化硅保护层；
在底部膜支撑层上涂布光致抗蚀剂层；
通过光刻在所述光致抗蚀剂中限定传感区；以及通过反应离子蚀刻(RIE)将传感区的图案转移至底部膜支撑层；
将传感区的图案转移至硅基材；
用稀氢氟酸去除顶部膜支撑层表面上的保护层；
以及在顶部膜支撑层上沉积导电层。
这里使用的术语“传感区”指传感器芯片中包括多个孔的区域，这些孔被布置以使得等离子体层和/或膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
如本发明所用，术语“抗蚀剂”指用于将图像或图案转移至其所沉积的基材的薄层。可通过光刻对抗蚀剂进行图案形成，以形成(亚)微米级的临时掩模，所述掩模在后续处理步骤(通常为蚀刻)中保护下方基材的选定区域。用于制备薄层的材料(通常为粘性溶液)也被术语抗蚀剂涵盖。抗蚀剂通常是聚合物或其前体与其他小分子(例如光致产酸剂)的混合物，其被专门配置用于给定的光刻技术。例如，在光刻中使用的抗蚀剂称为“光致抗蚀剂”。电子束光刻过程中使用的抗蚀剂称为“电子束抗蚀剂”。
在一个方面中，提供了一种检测样品中分析物的方法，所述方法包括：
将分析物捕获到本发明定义的传感器芯片的表面上；和
检测第二识别分子与传感器芯片表面上捕获的分析物的结合，其中所述第二识别分子对分析物具有特异性，其中与对照样品相比，所述第二识别分子的结合增加表明样品中存在所述分析物。
所述方法可包括检测对一种或多种分析物具有特异性的一种或多种第二识别分子(顺序或同时)的结合。这允许检测、定量和分析样品中多种分析物或生物标记物的组织状态(例如，共定位)。每种分析物可被不同的第一和第二识别分子的集合识别。第一和第二识别分子可以分别识别相同的分析物或不同的分析物。第一和第二识别分子的不同组合可允许检测分析物的共定位。这可以允许同时检测多种分析物，并且可以允许检测这些分子的共定位。
在一个实施方案中，所述方法包括检测样品中共定位的两种或多种分析物。两种或多种分析物可以例如存在于细胞内或细胞上。或者，两种或多种分析物可以例如结合到同一外泌体上。
在一个实施方案中，第一识别分子是识别Aβ42的抗体，并且第二识别分子是识别Aβ42的另一种抗体。
在一个实施方案中，第一识别分子是识别Aβ42的抗体，并且第二识别分子是识别CD63的抗体，其用于检测Aβ42和CD63的共定位。
第二识别分子与传感器芯片表面上捕获的分析物的“结合”的检测可以通过光谱位移(透射波长的变化)或固定波长下透射强度的变化进行。例如，在传感器芯片表面捕获的分析物将具有初始参考波长。在结合第二识别分子后，透射波长可能位移至更长的波长。
可以将样品中透射共振波长的变化(或以(△λ)表示的光谱位移)或固定波长下透射强度的变化与对照样品中观察到的变化进行比较。例如，这可用于确定第二识别分子与所捕获的分析物的结合是否增加。
与对照样品相比，样品中“第二识别分子的结合增加”可通过比较在样品和对照样品之间在结合第二识别分子后的光谱位移变化或固定波长下的透射强度变化来确定。光谱位移的增加或透射强度的改变可能表明第二识别分子与分析物的结合增加。
在一个实施方案中，光谱位移或透射强度的增加可能指在受试者和对照受试者之间1.2倍或更大的增加。所述术语还可以指选自1.1倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍和100倍的增加。
所述第二识别分子可以是对分析物特异性的分子。所述第二识别分子可以与信号扩增部分偶联，并且其中信号扩增部分能够诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体。例如，在传感器芯片表面捕获的分析物将具有初始参考波长。在结合第二识别分子后，透射波长可能位移至更长的波长。当第二识别分子与信号扩增部分偶联时，由于光密度的增加，透射波长可能会位移至更长的波长。
所述第二识别分子可与信号扩增部分融合。或者，所述第二识别分子可以与信号扩增部分缀合。
所述信号扩增部分可以是酶。在一个实施方案中，信号扩增部分是酶。所述酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-内酰胺酶或β-半乳糖苷酶或其酶片段。在一个实施方案中，所述酶是辣根过氧化物酶。在一个实施方案中，所述第一生物识别分子与信号扩增部分融合。例如，所述第一生物识别分子可以是与辣根过氧化物酶共价融合的抗体，所述酶使用本领域公知的技术与所述抗体共价连接。
所述方法可进一步包括使酶与酶底物接触。酶底物可以是在存在酶的情况下或在酶的作用下能够形成不可溶产物的酶。对于辣根过氧化物酶(HRP)，可以使用3-氨基-9-乙基咔唑、3,3',5,5'-四甲基联苯胺或氯萘酚、4-氯-1-萘酚等制剂。在HRP的酶促反应后，这些底物能够转化为不可溶产物。在一个实施方案中，酶底物是3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐。
在一个替代的实施方案中，所述信号扩增部分可以是能够结合所述第二识别分子的二级抗体。所述二级抗体与第二识别分子的结合可诱导形成不可溶聚集体。
在一个实施方案中，所述第一识别分子固定在表面等离子体共振传感器芯片的表面上，其中第一识别分子能够捕获传感器芯片表面上的分析物。所述分析物可以是外泌体结合的或相关的生物标记物。所述分析物可以是外泌体结合的或相关的聚集生物标记物。所述第一识别分子可以对所述分析物是特异性的。
在一个实施方案中，所述第一识别分子是抗体。例如，所述抗体可以是识别泛外泌体标记物的抗体或与外泌体相关的或结合的标记物。例如，所述抗体可以是对在外泌体中丰富且具有特征性的CD63、CD9或CD81具有特异性的抗体。所述抗体还可以对细胞特异性来源标记物(例如CHL1、L1CAM或NCAM)具有特异性。所述抗体还可以识别与外泌体相关的或结合的生物标记物。例如，所述抗体可以是识别Aβ的抗Aβ抗体，或识别与外泌体结合的或相关的APP、α-syn或Tau的抗体。
术语“对照样品”指不包含分析物的样品。所述“对照样品”可用作与样品的比较，以确定样品是否包含感兴趣的分析物。
本申请中使用的术语“生物标记物”应理解为其存在或水平与感兴趣事件相关的试剂或实体。生物标记物可以是细胞、蛋白质、核酸、肽、糖肽、外泌体或其组合。例如，生物标记物是Aβ42或Tau肽，其存在或水平表明受试者是否患有神经退行性疾病或淀粉样变病，或有发展成其的风险。在另一个示例中，生物标记物是外泌体结合或外泌体缔合的Aβ42或Tau肽，其存在或水平表明受试者是否患有神经退行性疾病或淀粉样变病，或有发展成其的风险。
在一个实施方案中，提供了本发明定义的传感器芯片用于检测分析物的用途。
在一个方面中，提供了一种检测受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法，所述方法包括：
a)使样品与本发明定义的传感器芯片的表面接触；和
b)检测第二识别分子与在传感器芯片表面上捕获的分析物的结合。
其中所述第二识别分子对所述分析物具有特异性，与对照受试者相比，所述第二识别分子的结合增加表明所述受试者患有神经退行性疾病或淀粉样变性。
术语“受试者”指任何动物，包括任何脊椎动物或哺乳动物，特别是人，还可指例如个人或病人。
术语“对照受试者”指已知未患神经退行性疾病或淀粉样变性的受试者，或无患神经退行性疾病或淀粉样变性风险的受试者。“对照受试者”还可以是健康受试者。“对照受试者”可以是无认知障碍的受试者(NCI)。所述术语包括从对照受试者中获得的样品。
在一个实施方案中，生物标记物是外泌体结合或外泌体相关的生物标记物。在一个实施方案中，生物标记物是外泌体结合的聚集生物标记物。生物标记物可选自但不限于Aβ、APP、α-Syn或Tau。在一个实施方案中，所述Aβ为Aβ42。在另一个实施方案中，所述Aβ为Aβ40。在一个实施方案中，所述生物标记物为Tau。在一些实施方案中，生物标记物选自Aβ、APP、α-Syn、CD9、CD63、CD81、ALIX、TSG101、Flotilin-1、Flotilin-2、LAMP-1、HSP70、HSP90、CHL1、IRS-1、L1CAM、NCAM、Tau、APOE、SOD1、TDP-43、bassoon、纤连蛋白、DNA和RNA或其组合和相关的复合物。
神经退行性疾病可选自阿尔兹海默症和轻度认知障碍。
所述方法可进一步包括治疗被发现患有神经退行性疾病或淀粉样变性的受试者。
本发明使用的术语“治疗”可指(1)预防或延缓疾病的一种或多种症状的出现；(2)抑制疾病或疾病的一种或多种症状的发展；(3)减轻疾病，即引起疾病或至少一种或多种疾病症状的消退；和/或(4)引起疾病的一种或多种症状的严重程度降低。
在一个实施方案中，术语“治疗”指给与药物以减缓神经退行性疾病或淀粉样变性的进展。
本发明提供了一种检测受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法，所述方法包括检测从受试者获得的样品中的外泌体结合生物标记物的水平，其中与参考相比，外泌体结合的生物标记物的水平增加表明受试者患有神经退行性疾病或淀粉样变性。
在一个方面中，提供了一种检测受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法，所述方法包括检测从受试者获得的样品中与外泌体结合的聚集生物标记物的水平，其中与参考相比，外泌体结合的聚集生物标记物的水平增加表明受试者患有神经退行性疾病或淀粉样变性。
所述方法可包括检测样品中的一种或多种外泌体结合的生物标记物。这允许检测在同一外泌体上存在的多个生物标记物的共定位或存在。
生物标记物可选自但不限于Aβ、APP、α-Syn或Tau。
所述方法可包括检测外泌体结合的生物标记物的分子亚型的水平。
在一个实施方案中，所述Aβ为Aβ42或Aβ40。
在一个实施方案中，所述Aβ是前体原纤维(prefibrillar)聚集体。发现前体原纤维Aβ聚集体优先与外泌体结合。增强Aβ间的结合在一个实施方案中，本发明定义的方法包括检测结合于前体原纤维Aβ聚集体的外泌体。
在一个实施方案中，聚集生物标记物是前体原纤维聚集体。聚集生物标记物可以是Aβ的前体原纤维聚集体。或者，聚集生物标记物可以是APP、α-Syn或Tau的前体原纤维聚集体。
在一个实施方案中，参考对照受试者。
在一个实施方案中，提供了一种测量外泌体缔合作为替代以确定蛋白质聚集体的前体原纤维组织状态的方法，其中与对照相比，处于预纤维化组织状态的蛋白质聚集体水平的增加表明受试者患有神经退行性疾病或淀粉样变性。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括检测选自CD63、CD9和CD81的外泌体生物标记物，其中外泌体生物标记物与外泌体结合生物标记物共定位。在一些实施方案中，外泌体生物标记物选自Aβ、APP、α-Syn、CD9、CD63、CD81、ALIX、TSG101、Flotilin-1、Flotilin-2、LAMP-1、HSP70、HSP90、CHL1、IRS-1、L1CAM、NCAM、Tau、APOE、SOD1、TDP-43、bassoon、纤连蛋白、DNA和RNA或其组合和相关的复合物。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括检测神经生物标记物，其包括NCAM、L1CAM和CHL-1，其中所述神经生物标记物与外泌体结合生物标记物共定位。
在一个实施方案中，提供了一种测量生物标记物的不同组织和分子亚群的方法。例如，所述方法可包括测量外泌体结合生物标记物、游离(未结合)生物标记物和总(外泌体结合和未结合)生物标记物。所述方法还可包括测量不同生物标记物的相对浓度，以更好地预测疾病。
在一个实施方案中，神经退行性疾病选自阿尔兹海默症、轻度认知障碍、血管性痴呆和血管性轻度认知障碍。
在一个实施方案中，神经退行性疾病选自阿尔兹海默症和轻度认知障碍。
所述方法可进一步包括治疗患有神经退行性疾病或淀粉样变性的受试者。
所述方法可进一步与脑成像研究(例如PET成像)相关联。这包括与特定大脑区域成像的相关性。在一个实施方案中，提供了一种识别和测量与脑成像(PET)相关的循环生物标记物的方法。在一个实施方案中，提供了一种识别和测量循环生物标记物的方法，所述循环生物标记物与特定大脑区域(PET)的成像相关。
本发明基于以下发现：1)生物标记物(包括共定位的不同标记物)可用于测量和表征循环Aβ的不同分子、生物物理和组织亚群，2)血液中的循环外泌体结合的Aβ可跨不同患者群体与Aβ沉积的PET成像(整体平均值)密切相关；3)血液中的循环外泌体结合的Aβ可跨不同患者群体与Aβ(早期AD区、扣带回区)的PET成像密切相关；4)循环外泌体结合的Aβ可区分临床亚组(如阿尔兹海默症、轻度认知障碍、无认知障碍、血管性痴呆、血管性轻度认知障碍和急性中风)。
所述方法可包括向需要治疗的受试者给与治疗有效量的药物。例如，所述药物可以是胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐、利伐斯的明或加兰他敏。所述药物还可以是NMDA受体拮抗剂，例如美金刚胺。所述药物可以是胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂的组合，例如多奈哌齐和美金刚胺的组合。所述药物可以是BACE1抑制剂，例如AZD3293；或抗体，例如抗淀粉样蛋白抗体，例如Aducanumab。所述药物还可以是抗tau药物，例如TRx0237(LMTX)。在一些实施方案中，可向需要治疗的受试者给与治疗有效量的一种或多种本发明所述的药物、或两种或多种本发明所述药物的组合。
在一些实施方案中，能够有效减少淀粉形成蛋白聚集体数量的分子可能是治疗的潜在候选分子。因此，在一些实施方案中，所述方法可包括向需要治疗的受试者给与一种或多种以下分子(药物)、或两种或多种以下分子(药物)的组合：亚甲蓝、无色甲基硫堇鎓双(氢甲磺酸盐)、姜黄素、酸性品红、表没食子儿茶素没食子酸酯、safranal、刚果红、芹菜素、天青C、碱性蓝41、(反式,反式)-1-溴-2,5-双-(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(BSB)、芝加哥天蓝6B、环糊精、盐酸道诺霉素、二甲基黄、直接红80、2,2-二羟基二苯甲酮、十六烷基三甲基溴化铵(C16)、氯化血红素、血红素、消炎痛、胡桃酮、间苯二酚蓝、甲氯环素磺基水杨酸盐、褪黑素、杨梅素、1,2-萘醌、去甲二氢愈创木酸、R()-去甲吗啡氢溴酸盐、橙色G、邻香兰素(2-羟基-3-甲氧基苯甲醛)、吩嗪、酞菁、利福霉素SV、酚红、罗利四环素、奎纳克林芥二盐酸盐、硫代黄素S、ThT和三甲基(十四烷基)溴化铵(C17)、二烯丙基酒石酸、曙红Y、非诺贝特、亚铜灵、制霉菌素、十八烷基硫酸盐和罗丹明B。
外泌体结合的生物标记物的增加水平可指受试者和对照受试者之间的水平为1.2倍或更高的增加，术语“增加水平”还可指选自1.1倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍，10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍和100倍的增加。
在一个方面中，提供了一种检测有发生神经退行性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括检测从所述受试者获得的样品中的外泌体结合的生物标记物的水平，其中与对照受试者相比外泌体结合的生物标记物水平的增加表明所述受试者患有神经退行性疾病。
在一个方面中，提供了一种检测和治疗受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法，所述方法包括：
a)检测从受试者获得的样品中的外泌体结合的聚集生物标记物的水平，与参考相比，外泌体结合的聚集生物标记物的水平增加表明受试者患有神经退行性疾病或淀粉样变性；和b)治疗患有神经退行性疾病或淀粉样变性的受试者。
在一个方面中，提供了一种治疗受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法，所述方法包括：
a)检测从受试者获得的样品中的外泌体结合的聚集生物标记物的水平，与参考相比，外泌体结合的聚集生物标记物的水平增加表明受试者患有神经退行性疾病或淀粉样变性；和b)治疗患有神经退行性疾病或淀粉样变性的受试者。
在一个实施方案中，提供了一种检测和减缓受试者中神经退行性疾病或淀粉样变性进展的方法，所述方法包括：
a)检测从受试者获得的样品中的外泌体结合的聚集生物标记物的水平，与参考相比，外泌体结合的聚集生物标记物的水平增加表明受试者患有神经退行性疾病或淀粉样变性；和b)治疗患有神经退行性疾病或淀粉样变性的受试者。
在一个方面中，提供了一种确定样品中生物标记物的聚集状态的方法，所述方法包括检测样品中的外泌体结合的生物标记物的水平，与参考相比，外泌体结合的生物标记物的水平的增加表明生物标记物的聚集程度。
所述方法可包括在检测外泌体结合的生物标记物的水平前，使样品与外泌体群接触的步骤。
在一个实施方案中，与非聚集生物标记物相比，所述样品中的聚集生物标记物优先结合外泌体。
所述样品可从受试者处获得。
在一个实施方案中，与参考相比，生物标记物的聚集程度增加表明受试者存在神经退行性疾病或淀粉样变性。
所述方法可进一步包括治疗患有神经退行性疾病或淀粉样变性的受试者。
在一个实施方案中，提供了一种确定样品中生物标记物聚集状态的方法，所述方法包括将样品与外泌体群接触并且检测样品中外泌体结合的生物标记物的水平，与参考相比，结合外泌体生物标记物的水平增加指示生物标记物的聚集程度。
本领域技术人员将理解，除了这些具体描述的以外，本文描述的发明内容易于进行变化和修改。应当理解，本发明包括落入精神和范围内的所有此类变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
在本说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变化应被理解为包含所述的整体或步骤或整体组或步骤组，但不排除任何其他整体或步骤或整体组或步骤组。
本说明书中对任何在先的出版物(或由其衍生的信息)或任何已知的事项的参照不是、也不应被视为承认或认可或任何形式的暗示在先的出版物(或由其衍生的信息)或已知事项构成本说明书所涉领域的公知常识的一部分。
现在将参考以下实施例描述本发明的某些实施方案，这些实施例仅用于说明的目的，并且不旨在限制上文所述的一般性范围。
实施例
本说明书中对任何在先的出版物(或由其衍生的信息)或任何已知的事项的参照不是、也不应被视为承认或认可或任何形式的暗示，即所述在先的出版物(或由其衍生的信息)或已知的事项构成本说明书所涉领域的公知常识的一部分。
材料和方法
细胞培养。人体细胞系SH-SY5Y(神经细胞)、HUVEC(脐静脉内皮细胞)、THP-1(单核细胞)、PC-3(前列腺上皮细胞)和SK-OV-3(卵巢上皮细胞)从American Type CultureCollection获得。GLI36(glia)和SK-OV-3在Dulbecco改良基本培养基(DMEM，Gibco)中生长。SH-SY5Y在Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物F-12培养基(DMEM/F12 Gibco)中培养。PC-3、THP-1和HUVEC分别在F-12K、RPMI-1640和EGM-2培养基中生长。除了补充5％胎牛血清(FBS)的EGM-2外，所有其他培养基均补充10％FBS和青霉素-链霉素。
外泌体分离和定量。在收集囊泡前，将第1-15代的细胞在去除囊泡的培养基(含5％去除的FBS)中培养48h。所有含有外泌体的培养基均通过0.2μm的膜过滤器(Millipore)过滤，通过差速离心(首先10,000g，随后100,000g)分离，并且用于利用APEX平台的外泌体分析。对于从血细胞和血小板中分离出的外泌体，血细胞来自血液分级，并且血小板来自血小板富集的血浆。将这些组分在HEPES缓冲盐水中洗涤，并且在37℃下与2mM氯化钙和2μM钙离子载体(A23187)一起温育，以刺激外泌体的产生。然后如前所述收集所有囊泡。为了独立量化外泌体浓度，使用了纳米粒子跟踪分析(NTA)系统(NS300，Nanosight)。调整外泌体浓度以在视野中获得～50个囊泡，从而实现最佳计数。所有NTA测量均采用相同的系统设置，以确保一致性。
APEX传感器制造。APEX传感器在8英寸硅(Si)晶片上制造。简而言之，通过热氧化制备10nm二氧化硅(SiO2)层，并且通过低压化学气相沉积(LPCVD)在晶片上沉积145nm氮化硅(Si3N4)。在用光致抗蚀剂涂布后，进行深紫外(DUV)光刻以在抗蚀剂中限定纳米孔阵列图案。该图案通过反应性离子蚀刻(RIE)转移至Si3N4膜。在去除光致抗蚀剂后，使用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)在晶片的正面沉积一层薄的SiO2保护层(100nm)。为了实现光透射，晶片背面旋涂了光致抗蚀剂；使用光刻法以定义传感区。Si3N4和SiO2通过RIE蚀刻，然后通过氢氧化钾(KOH)和氢氧化四甲铵(TMAH)蚀刻Si。蚀刻后，使用稀氢氟酸(DHF)(1:100)去除SiO2保护层。最后，Ti/Au(10nm/100nm)沉积在Si3N4膜上。所有纳米孔尺寸和传感器均匀性通过扫描电子显微镜(JEOL 6701)进行表征。
通道组装。标准软光刻用于制造多通道流通池。使用SU-8负性抗蚀剂(SU8-2025，Microchem)准备模具。将光致抗蚀剂以2000rpm的速度在硅片上旋涂30s，并且分别在65℃和95℃下烘烤2min和5min。在UV光曝光后，抗蚀剂在搅拌下在显影前再次烘烤。经显影的模具在后续使用前在干燥器中用三氯硅烷蒸气进行化学处理15min。聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)和交联剂以10:1的比例混合，并且浇注到SU-8模具上。在65℃下固化4h后，从模具上切下PDMS层并且将其组装到APEX传感器上。所有入口和出口均采用1.1mm活检穿孔机进行样品处理。
光学设置和光谱分析。卤钨灯(StockerYale Inc.)用于通过10X显微镜物镜照明APEX传感器。透射光由光纤收集并且输入光谱仪(Ocean Optics)。所有测量均于室温下在封闭的盒子中进行，以消除环境光干扰。透射光强度对波长(330nm-1600nm)以计数进行数字记录。对于光谱分析，通过使用局部回归方法拟合透射峰，使用定制的R程序确定光谱峰。所有拟合均在局部完成。也就是说，对于点x处的拟合，使用x点附近的点进行拟合，并且通过它们与x的距离加权。与多阶多项式曲线拟合相比，所述方法可以消除由于所分析的数据点数和数据范围而引起的结果变化。在确定最佳传感器几何形状时(图10)，分别使用光谱变化来量化响应于折射率变化的峰值透射强度、峰值形状(半峰全宽，FWHM)和检测灵敏度。测量的透射光谱在不同传感器间表现出一致性，基线光谱峰值位置的s.d.为0.03nm。所有光谱位移(△λ)均被确定为透射光谱峰值的变化，并且相对于适当的对照实验进行计算(详见下文)。
传感器表面功能化。为了赋予APEX传感器分子特异性，首先将制备的Au表面与含长活性(羧基化)硫醇-PEG和短无活性的甲基化硫醇-PEG的聚乙二醇(PEG)的混合物(Thermo Scientific)(1:3活性:无活性，在PBS中10mM)在室温下温育2h。洗涤后，在溶解在MES缓冲液中的过量NHS/EDC混合物中，将表面通过碳二亚胺交联激活，并且与特定的探针和配体(例如，抗体和Aβ42聚集体)缀合。所有探针信息见表1。过量的未结合的探针通过PBS洗涤去除。缀合的传感器储存在4℃的PBS中，以备后续使用。对所有传感器表面改性进行光谱监测，以确保功能化均匀。
表1.用于绘谱的标记物及其探针列表。
Figure BDA0003190284720000311
Figure BDA0003190284720000321
Figure BDA0003190284720000322
Figure BDA0003190284720000331
APEX信号扩增。为了建立APEX扩增，并入了用于信号增强的不可溶光学产物的酶促生长，并且优化了建立平台的光学底物浓度和反应持续时间。简而言之，外泌体与CD63功能化的APEX传感器(BD Biosciences)一起温育10min。然后用生物素化的抗CD63抗体(Ancell，10min)标记所结合的囊泡。作为对照实验，在所结合的囊泡上使用等量的生物素化的IgG同位素对照抗体(Biolegend)以确定扩增效率。洗涤未结合的抗体后，在引入不同浓度的3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(Life Technologies)作为光学底物前，使与中性亲和素(Thermo Scientific)缀合的高灵敏度辣根过氧化物酶与所结合的囊泡反应。监测实时光谱变化，以确定最佳底物浓度和反应持续时间。经优化的条件为1mg/mL，3min。温育和洗涤的所有流速分别保持在3μl/min和10μl/min。通过扫描电子显微镜证实了不可溶光学产品的局部沉积。该经优化的工作流程在图11a中示出。
使用这组条件，进一步滴定已知量的外泌体，并且测量其相关的APEX信号。APEX检测限被确定为能够产生检测信号的最低靶标浓度＝3x(对照背景信号的s.d.)。
APEX蛋白检测。所有传感器表面均被2％w/v牛血清白蛋白(BSA)封闭，以减少非特异性蛋白结合。将外泌体引入功能化的传感器，在室温下温育10min以捕获外泌体，并且用PBS洗涤以去除未结合的外泌体。如上所述，对于囊外蛋白靶标，用用于APEX扩增的检测抗体直接标记外泌体。对于囊内蛋白靶标，在用检测抗体标记前，使外泌体进行额外的固定和渗透(eBioscience)。在APEX扩增前后进行光谱测量，并且通过定制的R程序进行分析。
APEX miRNA检测。APEX传感器通过其甲壳素结合结构域用p19蛋白(New EnglandBiolabs)功能化，并且用2％w/v BSA封闭。为了检测miRNA，将外泌体裂解物与生物素化的RNA探针(350nM)温育15min，以与靶标miRNA链杂交。将所述混合物引入在结合缓冲液(1×p19结合缓冲液，pH 7.0，40U RNase抑制剂，0.1mg/mL BSA)中的功能化传感器上，使p19能够捕获杂交的miRNA靶标/RNA探针双链体。将与中性亲和素(Thermo Scientific)缀合的高灵敏度辣根过氧化物酶引入结合的生物素化双链体中，进行APEX扩增。进行光谱测量并通过定制的R程序分析。
酶联免疫吸附测定(ELISA)。将捕获抗体(5μg/ml)吸附在ELISA板(ThermoScientific)上，并且在与样品一起温育前用Superblock(Thermo Scientific)封闭。用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗涤后，加入检测抗体(2μg/ml)并且在室温下温育2h。在与辣根过氧化物酶缀合的二级抗体(Thermo Scientific)和化学发光底物(ThermoScientific)温育后，测量化学发光强度用于蛋白质检测(Tecan)。
蛋白质印迹法。通过超速离心分离的外泌体在含有蛋白酶抑制剂(ThermoScientific)的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液中裂解，并使用二辛可宁酸测定(BCA测定，Thermo Scientific)进行定量。蛋白质裂解产物通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF，Invitrogen)上，并且用针对蛋白质标记物的抗体进行免疫印迹：HSP90(Cell Signaling)、HSP70(BioLegend)、Flotilin 1(BDBiosciences)、CD63(Santa Cruz)、ALIX(Cell Signaling)、TSG101(BD Biosciences)、LAMP-1(R&D系统)和神经元标记物NCAM(R&D Systems)。在与辣根过氧化物缀合的二级抗体(Cell Signaling)温育后，增强的化学发光被用于免疫检测(Thermo Scientific)。
蛋白质聚集。将冷冻干燥的经NH4OH处理的Aβ42蛋白(rPeptide)重新悬浮于NaOH(60mM，4℃)中，在PBS34中进行超声处理并且将pH值调整至pH 7.4。立即通过0.2μm的膜过滤器(Millipore)过滤蛋白质，并且将滤液用作较小的Aβ42聚集体。为了制备更大的Aβ42聚集体，按上述方法处理蛋白质，并且在通过0.2μm膜过滤器(Millipore)过滤前，在搅拌下温育1h以诱导进一步聚集。滤液被用作大的Aβ聚集体。为制备类似尺寸的BSA聚集体作为对照，将2％w/vBSA溶解于PBS中，在80℃下加热1h和2h，以分别诱导大对照聚集体和小对照聚集体的聚集。
聚集物尺寸的确定。通过动态光散射分析确定Aβ42和BSA聚集体的动力学直径(Zetasizer Nano ZSP，Malvern)。在4℃下进行3×14次测量。分析Z均直径和多分散性。对于每一次测量，均监测自相关函数和多分散指数，以确保尺寸测定的样品品质。
外泌体-Aβ缔合的表征。所制备的蛋白质聚集体(Aβ42和BSA对照)被用于通过前述的EDC/NHS偶联在APEX传感器上进行表面功能化。未结合的蛋白质聚集体用PBS洗去。缀合的蛋白质的量由所得的透射光谱位移测量。该信息用于对外泌体结合确定缀合蛋白质聚集体的数量及其相关的总蛋白表面积(详见下文)，从而对结合亲和力标准化。在用蛋白质聚集体进行表面功能化后，将外泌体(1010/ml)引入传感器上。在480s的总时长内，每3s测量一次光谱变化，以构建实时动力学传感图。确定了不同尺寸的蛋白质聚集体的外泌体缔合动力学和结合亲和力。
考虑到蛋白质聚集体尺寸差异以及与SPR相关的灵敏度指数衰减(随着距离传感表面的距离增加)，使用以下公式
Figure BDA0003190284720000351
以计算与外泌体相互作用的缀合聚集体的总表面积：其中S为信号，z为距传感器表面的距离，E为z＝0时的电场且在此情况下为常数，ld为衰减长度且在当前传感器设计中设定为200nm，r为缀合蛋白质聚集体的半径。
所有蛋白质聚集体均近似为球形，由透射电子显微照片(图3b，左)支持，其r由动态光散射分析确定。上述公式用于确定缀合到传感器上的蛋白质聚集体的数量及其各自的总表面积，以估算与外泌体相互作用的可用结合位点的数量。所有外泌体结合数据(△λ)均对其各自的蛋白结合位点进行标准化。标准化的Aβ42结合数据是相对于类似尺寸的BSA对照制作，并且进行拟合以确定结合亲和力常数KD。
扫描电子显微镜。所有样品均用半量Karnovsky固定液固定，并且用PBS洗涤两次。在一系列增加的乙醇浓度中脱水后，样品被转移至临界干燥(Leica)，随后在扫描电子显微镜(JEOL 6701)成像前用金(Leica)进行溅射涂布。
透射电子显微镜。外泌体用金纳米颗粒(15nm，Ted Pella)进行免疫标记，用2％多聚甲醛固定并且转移到铜网上(Ted Pella)。结合的囊泡用草酸铀酰和甲基纤维素混合物洗涤和对比染色。干燥的样品用透射电子显微镜(JEOL 2200FS)成像。
临床样品收集。所述研究获得了NUH和NUS机构审查委员会的批准(2015/00441、2015/00406和2016/01201)。所有受试者均根据机构审查委员会批准的协议招募，并且获得知情同意。所有招募的受试者均在新加坡国立大学医院(NUH)接受了多项神经心理学评估，包括用于认知评估的迷你精神状态检查(MMSE)、蒙特利尔认知评估(MoCa)和血管性痴呆电池(VDB)。AD、MCI或NCI的临床诊断通过神经心理学评估以及临床特征和血液调查的评价进行。VaD和VMCI的临床诊断是由神经心理评估、中风的临床病史和通过磁共振成像(MRI)观察到的脑血管疾病程度的组合进行的。所有临床评估和分类均根据公布的标准46-48进行，且独立于APEX测量。在被诊断为中风的患者住院后24h内收集其急性中风血浆样品。在为期一年的随访过程中，收集了患者的纵向血浆样品，但未进行PET脑成像。就血浆收集而言，在注入PET放射性示踪剂(如适用)之前，从受试者中抽取静脉血(5ml)至EDTA管中，并且立即进行处理。简而言之，所有血液样品以400g(4℃)离心10min。在不干扰血沉棕黄层的情况下转移血浆，并且以1100g(4℃)再次离心10min。在使用APEX平台进行测量前，所有的血浆样品均已进行去标识化处理并且储存在-80℃。所有APEX测量均在PET成像结果和临床诊断未知的情况下进行。
临床APEX测量。所有血浆样品均根据补充图15a中概述的测定配置进行测量。简而言之，为了测量外泌体结合的Aβ42群体，我们直接使用天然血浆样品，通过Aβ42捕获和CD63检测(Aβ42+CD63+)，而无需任何囊泡纯化或分离。为了说明血浆样品中存在未结合的Aβ42群体，我们使用尺寸排阻过滤(尺寸截止值＝50nm，Whatman)去除大尺寸滞留物。这是必要的，因为基于Aβ42捕获和Aβ42检测的测定配置无法区分未结合的和总的Aβ42。为了测量未结合的Aβ，我们通过Aβ42捕获和Aβ42检测(Aβ42+Aβ42+)评价了血浆滤液。值得注意的是，该过滤仅为了证明存在未结合的Aβ42群体而实施；在仅会从天然血浆样品中直接测量更具反射性的外泌体结合的Aβ42的临床环境下是不必要的。为了测量总Aβ42，我们通过Aβ42捕获和Aβ42检测(Aβ42+Aβ42+)直接评价天然血浆样品。对于所有测量，我们使用5％的BSA作为APEX传感器的封闭剂。我们还包括样品匹配的阴性对照，其中我们将相同的样品在用IgG同型对照抗体功能化的对照传感器上温育。所有测量均相对于所述IgG对照进行，以说明样品匹配的非特异性结合。
正电子发射断层(PET)成像。抽血后，受试者使用Siemens 3T Biograph mMR系统(Siemens Healthineers)进行扫描，以同时采集PET和MR图像。在静脉注射370MBq的11C-匹兹堡化合物B(PiB)后40-70min采集PET数据。MR数据使用12通道头接收线圈采集，并且由用于PET衰减校正的超短回波时间(UTE)图像和T1加权磁化准备梯度回波(MPRAGE)图像(1mm各向同性分辨率，TI/TE/TR＝900/3.05/1950ms)组成。
PET数据分析。使用Freesurfer(5.3.0)处理T1加权MPRAGE图像，以产生用于PET数据分析的皮质分割。PET图像使用普通泊松有序子集期望最大化(OP-OSEM)算法重建，并且使用4mm高斯滤波器平滑。使用基于μ-map的UTE对数据进行衰减。随后，使用高级标准化工具(ANTs)将所得衰减校正的标准化摄取值(SUV)图像与MPRAGE图像共同配准，并且使用受试者特定的Freesurfer分割计算相对于平均小脑灰质强度的标准化摄取值比(SUVR)。计算特定区域的平均SUVR，并且通过平均所有大脑区域的SUVR计算每个患者的整体平均SUVR。
统计分析。所有测量一式三份，数据显示为平均值±s.d.。显著性检验通过双侧学生t-检验进行。对于样品间比较，对多组样品均进行了检验，并且使用Bonferroni校正对所得P值进行了多项假设检验调整。调整后P<0.05的值确定为显著。使用单向成对ANOVA检验确定分析和生物变异系数(即组内、组间和总)。对于临床研究，通过线性回归进行相关性分析，以确定拟合优度(R2)。所有统计分析均使用R包(版本3.4.2)和Graphpad Prism 7进行。
实施例1
外泌体结合的Aβ的扩增等离子体分析
AD最早的病理特征之一是Aβ的脑沉积。这些斑块是由异常淀粉样蛋白片段、主要是疏水性剪接变体Aβ42聚簇形成的。Aβ蛋白被释放到细胞外空间，并且可在血液中循环。在细胞外空间还发现，外泌体是哺乳动物细胞通过多囊泡内体与质膜融合分泌的纳米级膜囊泡。在此外泌体生物发生过程中，糖蛋白和糖脂被并入到内陷质膜中，并且被分到新形成的外泌体10、11中。通过这些表面标记物，外泌体可以与细胞外Aβ蛋白缔合并结合(图1a)。来源于神经元来源(SH-SY5Y细胞)的细胞外囊泡的多模式表征证实了其外泌体形态、尺寸分布和分子组成(图5)。囊泡的透射电子显微镜分析进一步揭示了其与Aβ42蛋白聚集体结合的能力(图1b和图5)。
为评价外泌体-Aβ缔合，开发了用于外泌体分子共定位的扩增、多参数绘谱的APEX平台。所述系统通过在双层光子结构中图案化的等离子体纳米孔的周期性阵列测量透射SPR，并且使用原位酶促转化，以在结合的外泌体上快速生长不可溶的光学产物(图1c)。为了补偿APEX酶促沉积(发生在传感器顶部)，尺寸匹配的等离子体纳米孔在偶联的双层光子系统中形成图案，以通过背面照明(远离酶活性，图20)增强SPR测量。所得酶促沉积不仅稳定地改变了用于SPR信号扩增的折射率，如透射光谱中的红移(光谱位移△λ，图1d)所示，而且在空间上进行限定用于分子共定位分析。在APEX扩增前后，传感器结合的外泌体的扫描电子显微照片证实了酶促转化后光学沉积物的局部生长(图6)。
因此，使用所开发的APEX平台，直接从AD患者和对照受试者的临床血液样品中测量Aβ蛋白与外泌体的缔合，并且将测量与整体和区域脑斑块沉积的PET成像相关联(图1e)。对于高通量、多路复用临床分析，采用先进的制造方法(即深紫外光刻，图7)在8英寸晶片上制备传感器微阵列；每个晶片可以容纳超过40个微阵列芯片，具有>2000个感光元件(图8a)。图1f显示了本研究中用于并行测量的所开发的APEX微阵列芯片的照片。所开发传感器的扫描电子显微照片显示出高度均匀的制造(图8b)。
优化的信号扩增以实现多路复用绘谱
首次开发了酶促APEX扩增。进行了一系列传感器功能化，即抗体缀合、外泌体结合、酶标记和光学产物扩增，并且测量了逐步总光谱位移(累积△λ，图2a)。将传感器使用针对CD63(在外泌体中富含并且具有特征性的III型溶酶体膜蛋白)的抗体功能化，以捕获来自神经细胞(SHSY5Y)的囊泡。为了促进不可溶光学产物的局部沉积，辣根过氧化物酶作为级联酶被引入，并且被用于催化其可溶底物(3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐)的转化。传感器结合的囊泡通过另一种抗CD63抗体进行酶标记。尽管酶标记没有引起任何显著的光谱变化，但光学产物的形成导致了～400％的信号增强。相比之下，用IgG同位素对照抗体进行的对照实验显示出的最小的背景变化(图9)。重要的是，正如扫描电子显微镜所证实的，这种SPR信号扩增与高度局部化的光学沉积物面积覆盖率的增加密切相关(图2b)。
为补偿酶促扩增(发生在传感器顶部)，优化了APEX传感器设计以提高其分析性能和稳定性。与已建立的仅支持正面照明的玻璃镀金设计(图20)相比，APEX的双层等离子体结构使得能够通过背面照明实现SPR激发(图2c)。新的优化设计不仅通过背面照明表现出强的透射SPR(图10a-c)，还显示出分析稳定性(图10d)，这可能是由于减少的对酶活性的直接入射照明(即温度波动)。通过优化酶底物浓度和反应持续时间进一步建立了APEX测定(图2d)。通过持续的背面照明，监测了与不同底物浓度相关的实时光谱变化，发现在<10min内可实现显著的信号扩增，从而使整个APEX工作流程在<1h内完成。
在这些优化的条件下，下一步测量APEX的检测灵敏度，用于外泌体定量。通过标准纳米颗粒追踪分析对神经元衍生的囊泡(SH-SY5Y)进行量化。使用抗CD63抗体，我们进行了滴定实验(图2e)。已确定优化后的APEX扩增可将检测灵敏度提高10倍，确立的检测限(LOD)为～200个外泌体。该观察到的灵敏度是迄今为止报道的用于大量外泌体测量的最佳LOD，并且分别比蛋白质印迹法和化学发光ELISA好105倍和103倍。
使用微阵列APEX平台，进一步开发了分析与神经退行性疾病相关的多种标记物的方法。针对以下蛋白标记物(图2f)建立了特异性测定：淀粉样β(Aβ42)、淀粉样前体蛋白(APP)、α-突触核蛋白(α-syn)、L1密切同源物(CHL1)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)和tau蛋白。重要的是，通过进一步开发APEX测定工作流程(图11a)，所述平台显示出检测囊外和囊内蛋白以及外泌体miRNAs的信号扩增能力(图11b)。用于测定开发的所有检测探针见表1。
Aβ聚集体与外泌体间增强的结合
使用所开发的APEX平台，接着评价外泌体与不同结构形式的病理性Aβ蛋白的缔合。为了模拟淀粉样蛋白接种和原纤维化的不同阶段，制备了不同尺寸的Aβ42聚集体，其为淀粉样蛋白斑块的主要成分。改变聚簇程度以形成不同尺寸的Aβ42聚集体(图3a，实验细节参见方法)，并通过透射电子显微镜和动态光散射分析证实了其球形形态和单峰尺寸分布(图3b)。还需要注意到较大的Aβ42聚集体显示出形成原纤维结构的强烈倾向(图12)。
为了确定外泌体-Aβ缔合的动力学，将制备的Aβ42聚集体固定在APEX平台上，并且将传感器与等浓度的来自神经元的外泌体一起温育(图3c)。相比之下，在对照实验中，制备并且表征了类似尺寸的牛血清白蛋白(BSA)聚集体(图13)。通过测量实时外泌体结合证明，与类似尺寸的BSA对照相比，无论外泌体的尺寸如何，外泌体与Aβ42聚集体的缔合更强(图3d)。更重要的是，与其对较小的Aβ42聚集体的结合亲和力相比(图3d，左)，囊泡对较大的Aβ42聚集体表现出明显更高的结合亲和力(>5倍)(图3d，右)。所有亲和力均对Aβ42聚集体表面积进行标准化，并且相对于相应的BSA对照进行(详见方法)。
接着，使用来自不同细胞来源的细胞外囊泡，利用APEX平台测量其各自与较大的Aβ42聚集体的缔合(图3e)。将通过纳米颗粒追踪分析(图14)确定的来自不同细胞来源的等浓度的囊泡与Aβ42功能化传感器一起温育。值得注意的是，在所有测试的细胞来源中，来自神经元、红细胞、血小板和上皮细胞的囊泡显示出与Aβ42聚集体更强的缔合，而来自神经胶质和内皮细胞的囊泡显示出可忽略的结合。接着，一组针对这些各自细胞来源的特异性标记物以及泛外泌体标记物(即CD63)被用于结合囊泡的APEX信号扩增。CD63在所有测试囊泡的信号增强方面表现一致。通过这种标记物鉴定，CD63因此被用于开发APEX测定，以鉴定和测量与外泌体结合的Aβ(定义为Aβ42+CD63+；图15)。
血液外泌体结合的Aβ显示的脑斑块负载
鉴于外泌体和前体原纤维Aβ聚集体(淀粉样斑块的构建模块)间增强的结合，假设外泌体结合的Aβ可作为反映脑斑块负载的循环生物标记物。为了检验这一假设，使用不同的抗体开发了不同的APEX测定，以评价来自临床血液样品的循环Aβ42的不同群体(图15a)。具体而言，为表征与外泌体结合的Aβ42群体，设计APEX测定以直接从天然血浆中富集Aβ42，并且测量与捕获的Aβ42缔合的CD63的相对量。该测定配置不仅显示了对Aβ42+CD63+群体的特异性检测(图15b-c)，还反映了功能相关性：随着前体原纤维Aβ聚集体和外泌体间结合的增强，缔合的CD63信号可被视为测量总循环Aβ42中前体原纤维中Aβ42相对量的替代指标。为了说明未结合的Aβ42群体的存在，在测量血浆滤液中的Aβ42前，使用尺寸排阻过滤去除血浆中的大尺寸滞留物(例如外泌体)。最后，为了测量总循环Aβ42，通过直接Aβ42富集和Aβ42检测评价天然血浆。
接着，我们进行了一项可行性临床研究，旨在解决以下关键问题：(1)APEX能否直接从血液样品中测量循环Aβ42；(2)不同血源性Aβ42群体与脑斑块负载间的相关性如何；(3)循环Aβ42的特异性群体能否区分不同的临床组？
为实现这些目标，招募了年龄匹配的受试者(n＝84)，其被诊断为AD(n＝17)、轻度认知障碍(MCI，n＝18)、无认知障碍的健康对(NCI，n＝16)、以及血管性痴呆(VaD，n＝9)和神经血管损害(即血管性轻度认知障碍，VMCI，n＝12)的临床对照；和急性中风，n＝12)。所有临床信息见表2。招募的所有受试者进行血液取样和APEX分析。除了急性中风患者外，所有受试者均同意同时进行脑淀粉样斑块的PET成像。在即将注入匹兹堡化合物B(PiB)放射性示踪剂进行PET成像前，收集了血浆样品。在成像的临床组之间和之内，PET成像显示了广泛的脑斑块负载(图4a)，并证明了脑区域变化(表2)，与其他已公开的临床研究一致。
表2临床信息和PET成像标准摄取值比(SUVR)。
Figure BDA0003190284720000421
Figure BDA0003190284720000431
AD：阿尔兹海默症，MCI：轻度认知障碍，NCI：无认知障碍，VaD：血管性痴呆，VMCI：血管性轻度认知障碍。
使用所开发的APEX测定(图11a)，我们评价了这些临床血浆样品中循环Aβ42的不同群体，即外泌体结合的Aβ42、未结合的群体以及总循环Aβ42(图4b)。与外泌体结合的Aβ42群体显示出与外泌体标记物(即CD63、CD9和CD81)和神经元标记物(即NCAM、L1CAM和CHL-1)的强共定位信号，表明神经元外泌体可能构成群体的实质性部分(图16a)。由于未结合的Aβ42测量是从血浆滤液进行的，我们进一步对这些过滤液进行了表征，并且确认了其可忽略的囊泡数量以及与外泌体和神经元标记物的最小共定位信号(图16b-c)。当与整体PET淀粉样蛋白成像相关时，与未结合的Aβ42(图4b，中，R2＝0.0193)或总Aβ42(图4b，右，R2＝0.1471)相比，外泌体结合的Aβ42测量显示出最佳相关性(图4b，左，R2＝0.9002)。有趣的是，与总Aβ42测量(如本研究和其他已公开的报告所示)显示的差的和负的关联不同，来自外泌体结合的Aβ42群体的相关CD63测量显示了与脑淀粉样斑块的PET成像高度相关和正的关联。我们将这一发现归因于外泌体和PET示踪剂对Aβ42的类似结合偏好：(1)外泌体显示出与前体原纤维Aβ42聚集体、特别是易于形成原纤维的较大聚集体的增强缔合(图3d)；以及(2)PET示踪剂与较大的淀粉样原纤维紧密结合，但与较小的聚集体结合很少。值得注意的是，这种优越的相关性还证明了大脑区域的特异性；外泌体结合的Aβ42测量显示扣带回区(早期AD影响区，图17a)与脑斑块负载的相关性强于枕叶区(晚期AD影响区，图17b)。
在区分临床诊断时，仅外泌体结合的Aβ42的APEX分析测定显示出良好的特异性，而非未结合的Aβ42群体或总Aβ42群体的APEX分析(图4d)。特别是，外泌体结合的Aβ42测量不仅可以区分AD临床组(即AD和MCI，P<0.01)，还可以区分其他健康和临床对照(P<0.0001，学生t-检验)。在区分不同临床组时，该经证明的特异性与PET脑淀粉样蛋白成像的特异性相当(图18)。另一方面，对血浆细胞外囊泡的纳米颗粒追踪分析未显示所有临床组的囊泡尺寸或浓度存在任何显著差异(图19)。
实施例2
AD是最常见的严重痴呆症。由于其复杂和渐进的神经病理学，早期检测和及时干预对于疾病改良疗法的成功至关重要。尽管对寻找AD的血清学生物标记物有着浓厚的兴趣，但其开发受到了多项挑战的困扰。首先，与脑脊液中的对应物不同，循环中的病理性AD分子显示出更低的浓度。血浆Aβ水平往往接近常规ELISA的检测下限；这一限制可能导致已公开的报告中出现多项相互冲突的发现。其次，血浆Aβ分析与脑斑块沉积(AD最早的病理标志)间几乎没有相关性。其中一个可能的原因可能来自不同的测量方法。通常用于确定脑淀粉样蛋白负载的PET成像探针优先测量不可溶原纤维沉积，而常规的ELISA测量血浆中的可溶Aβ。另外，基于血液的测量结果与脑病理的潜在相关性可能已被先前的全血测量结果掩盖。然而，这种差异值得提出一个更为根本的问题——是否存在循环Aβ蛋白亚群能够更好地反映大脑中的原纤维病理。
开发了一个专用分析平台(APEX)用于直接从血浆中对外泌体结合的Aβ、未结合的Aβ和总Aβ进行多参数分析，以区分循环Aβ的不同群体。具体而言，其利用传感器设计、设备制造和测定开发方面的新进展来实现增强的光学性能和检测能力(图20)。就传感器设计和制造而言，APEX平台由金纳米孔的周期性阵列构成，其悬浮在图案化的氮化硅膜上，并且通过深紫外光刻技术(用于大规模精确纳米图案化的最先进制造工艺)制造。这些进步推动APEX技术实现了1)提高的光学性能(即，增强的透射强度，以通过双向光照明实现SPR检测)和2)可靠的大规模生产。就测定技术而言，APEX平台利用快速的原位酶促转化以实现高度定位、扩增的信号。该开发不仅能够灵敏地检测不同的靶标(例如，囊内蛋白质和RNA靶标)，而且有助于进行多参数群体研究的外泌体共定位分析，因为只有在外泌体中同时发现多个靶标时，不可溶沉积物才会在局部形成。通过这些综合进展，所观察到的APEX灵敏性是迄今为止关于外泌体分析报告中最好的，并且超过了标准的ELISA测量几个数量级。使用所开发的APEX平台，我们证明了外泌体与较大的前体原纤维Aβ(原纤维淀粉样斑块的关键构建模块)间增强的结合。在不同临床群体(即AD、MCI、认知正常对照和其他神经退化和神经血管疾病的临床对照)的临床血浆样品中进一步鉴定和量化了与外泌体结合的淀粉样蛋白(CD63+Aβ42+)的亚群，发现所述亚群与脑淀粉样蛋白斑块负载高度相关。
评价循环Aβ的不同群体可能导致AD研究和临床护理的范式转变。越来越多的证据表明，前体原纤维Aβ聚集体可能是AD神经变性的毒性驱动因素。它们与外泌体的优先缔合，以及最近关于人类淀粉样蛋白斑块中外泌体标记物富集的发现，不仅阐明了可能的斑块接种新机制，还表明了外泌体结合的Aβ作为复杂AD病理学更具反射性的循环生物标记物的重要性。因此，可以预见，本研究可以补充其他临床前和临床研究，包括关于的技术开发和生物标志细化。在技术开发方面，例如，尽管IP-质谱法能够实现无偏倚的分子筛查，并且对于生物标记物的发现非常有价值，尤其是在检测不同的分子同种异构体和变体(例如(APP)669–711和Aβ1–40)方面，APEX技术提供了快速、灵敏地从天然血浆样品中读取数据，而无需进行质谱测量通常需要的大量样品处理，因此适用于有针对性的临床测量。在生物标记物的改进方面，正如当前研究所证明的，对不同循环Aβ群体的分析可以揭示先前被全血测量掩盖的新的相关性，并且推进未来基于血液的AD临床管理。重要的是，目前有超过400项AD临床试验，进一步设想可以加强已开发的方法，以重新定义当前的患者护理标准。通过额外的技术创新，例如芯片上外泌体处理、其他AD标记物的组合分析以及纵向临床队列验证，所开发的技术能够提供综合能力，以促进微创早期检测、分子分层和系列监测，所有这些对于在临床试验的不同阶段客观评价疾病改良疗法至关重要。
实施例3
该实施例表明，将淀粉样蛋白聚集体与抑制剂一起温育减少了自发蛋白质聚集。
方法
聚集物尺寸的确定。通过动态光散射分析(Zetasizer Nano ZSP，Malvern)确定淀粉形成蛋白和BSA聚集体的动力学直径。在4℃下进行3×14次测量，分析Z均直径和多分散性。对于每一次测量，均监控其自相关函数和多分散指数，以确保尺寸确定的样品品质。
蛋白质聚集。将冷冻干燥的淀粉形成蛋白重新悬浮于NaOH(60mM，4℃)中，超声处理，并且在PBS中将pH值调节至pH 7.4。立即通过0.2μm的膜过滤器(Millipore)过滤蛋白质，并且将滤液用作小的初始聚集体。为了制备更大的聚集体，如上所述处理蛋白质，并且在搅拌下温育1h以诱导进一步的聚集。对于利用抑制剂的处理，在温育前向蛋白质中加入10μM的抑制剂(例如亚甲蓝)。在孵化结束时进行聚集体尺寸测定。
光学分析。为了进行实验分析，使用卤钨灯(StockerYale Inc.)，通过×10显微镜物镜对APEX传感器背面照明。透射光由光纤收集并且输入光谱仪(Ocean Optics)。所有测量均于室温下在封闭的盒子中进行，以消除环境光干扰。透射光强度以计数对波长进行记录。对于光谱分析，通过使用局部回归方法拟合透射峰，使用定制的R程序确定光谱峰。所有拟合均在局部完成。也就是说，对于点x处的拟合，使用x点附近的点进行拟合，并且通过它们与x的距离加权。与通过多阶多项式曲线拟合相比，该方法可以消除由于所分析的数据点数和数据范围而引起的结果变化。所有光谱位移(△λ)均被确定为透射光谱峰值的变化，并且相对于适当的对照实验进行计算。
外泌体-蛋白质缔合的表征。所制备的蛋白质聚集体(Aβ42和BSA对照)通过前述的EDC/NHS偶联，用于APEX传感器的表面功能化。未结合的蛋白质聚集体用PBS洗去。由所得的透射光谱位移测量缀合蛋白质的量。我们使用此信息，针对外泌体结合确定缀合蛋白质聚集体的数量及其相关的总蛋白表面积(详见下文)，以对结合亲和力进行标准化。在用蛋白质聚集体进行表面功能化后，外泌体被引入传感器。在480s的总时长内，每3s测量一次光谱变化，以构建实时动力学传感图。确定了不同尺寸的蛋白质聚集体的外泌体缔合动力学和结合亲和力。
考虑到蛋白质聚集体尺寸差异以及与SPR相关的灵敏度指数衰减(随着距传感器表面的距离的增加)，使用以下公式计算与外泌体相互作用的缀合聚集体的总表面积：
Figure BDA0003190284720000471
其中S为信号，z为距传感器表面的距离，E为z＝0时的电场且在此情况下为常数，ld为衰减长度且在当前传感器设计中设置为200nm，r为缀合蛋白质聚集体的半径。
所有蛋白质聚集体均近似为球形，其r由动态光散射分析确定。我们使用上述公式来确定缀合到传感器上的蛋白质聚集体的数量及其各自的总表面积，以估算与外泌体相互作用的可用结合位点的数量。所有外泌体结合数据(△λ)均根据其各自的蛋白结合位点进行了标准化。标准化的Aβ42结合数据是相对于类似尺寸的BSA对照进行的，并且拟合以确定结合亲和力常数KD。
miRNA分析。将外泌体裂解物与生物素化的RNA探针一起温育，然后在p19功能化的APEX传感器上进行RNA双重捕获和APEX信号扩增。
结果
多种神经退行性疾病(阿尔兹海默症、帕金森氏病和肌萎缩侧索硬化)的病理学涉及错误折叠的淀粉样蛋白的聚集。针对蛋白质聚集的治疗涉及清除聚集的淀粉样蛋白的各种策略，包括分解淀粉样蛋白的聚集物或抑制淀粉样蛋白的聚集。经证明可有效减少淀粉样蛋白聚集体数量并且因此可用于疾病改良疗法的潜在候选分子包括亚甲蓝、无色甲基硫堇鎓双(氢甲磺酸盐)、姜黄素、酸性品红、表没食子儿茶素没食子酸酯、safranal、刚果红、芹菜素、天青C、碱性蓝41、(反式,反式)-1-溴-2,5-双-(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(BSB)、芝加哥天蓝6B、环糊精、盐酸道诺霉素、二甲基黄、直接红80、2,2-二羟基二苯甲酮、十六烷基三甲基溴化铵(C16)、氯化血红素、血红素、消炎痛、胡桃酮、间苯二酚蓝、甲氯环素磺基水杨酸盐、褪黑素、杨梅素、1,2-萘醌、去甲二氢愈创木酸、R()-去甲吗啡氢溴酸盐、橙色G、邻香兰素(2-羟基-3-甲氧基苯甲醛)、吩嗪、酞菁、利福霉素SV、酚红、罗利四环素、奎纳克林芥二盐酸盐、硫代黄素S、ThT和三甲基(十四烷基)溴化铵(C17)、二烯丙基酒石酸、曙红Y、非诺贝特、亚铜灵、制霉菌素、十八烷基硫酸盐和罗丹明B。
由于没有动物模型被证明表现出反映人类大脑中AD病理学的准确病理学，我们利用体外实验对疾病改良治疗在抑制淀粉形成蛋白聚集方面的效果进行造模。在用或不用抑制剂温育等份蛋白质前，通过动态光散射分析确认淀粉形成蛋白的初始尺寸。在没有抑制剂的情况下，由于淀粉形成蛋白的自发聚集，蛋白聚集体的尺寸随着温育时间的增加而生长。然而，在存在抑制剂的情况下，由于自发蛋白质聚集而导致的增加尺寸最小，导致形成较小的蛋白质聚集体。
温育后，在与神经元外泌体一起温育前，淀粉形成蛋白在传感器芯片表面被功能化。观察到神经元外泌体与较大的蛋白质聚集体间存在优先缔合，如结合亲和力的差异所示，并且表明与经抑制剂处理的较小的蛋白质聚集体的结合减少。由于外泌体与蛋白质的缔合可以作为蛋白质生物物理和/或生物化学性质的替代指标(受疾病改良疗法影响的性质)，因此APEX平台能够对疾病改良治疗进行功效评估。
已经描述了几个实施例配置，在不脱离本公开的精神的情况下，可以使用各种修改、替代结构和等同物。例如，上述元素可以是更大系统的组件，其中其他规则可以优先于或以其他方式修改本发明的应用。此外，可以在考虑上述因素前、期间或后采取若干步骤。
本发明引用的所有出版物、序列号、专利和专利申请出于所有目的在此以其整体并入作为参考。
本公开的示例性实施方案
在一些方面和实施方案中，本发明描述的是：
一种传感器芯片，其包括位于膜支撑层上的导电层，其中多个孔延伸穿过导电层和膜支撑层，并且将其布置以使得对导电层和/或膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
在一些实施方案中，所述导电层是金、银、铝、钠、铟或钛。
在一些实施方案中，所述膜支撑层是氮化硅或二氧化硅。
在一些实施方案中，所述孔具有约150nm至450nm的直径。
在一些实施方案中，将所述孔周期性地布置。
在一些实施方案中，所述孔具有约250nm至约650nm的周期性。
在一些实施方案中，将第一识别分子固定在导电层的表面上。
在一些实施方案中，将所述孔布置以使得在照明时产生的表面等离子体共振的衰减长度大约等于所述第一识别分子的靶标的直径。
在一些实施方案中，所述导电层和膜支撑层被设置在基材上，所述基材在与多个孔相邻的区域中具有形成于其中的空隙，以使得在任一方向上对导电层和/或膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
在另一个方面中，本发明描述的是一种成像系统，其包括光源、检测器和1-9中任一项所述的传感器芯片，其中将光源设置为照明所述传感器芯片，并且将所述检测器定位为检测透射传感器芯片的光。
在另一个方面中，本发明描述了一种制造传感器芯片的方法，所述方法包括以下主要步骤：a)提供顶部膜支撑层；b)在顶部膜支撑层上沉积导电层；形成延伸穿过膜支撑层的多个孔，所述孔还延伸穿过导电层，并且将其布置以使得对导电层和/或顶部膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
在一些实施方案中，所述方法包括：在硅基材的顶面和底面上涂布顶部膜支撑层和底部膜支撑层；在顶部膜支撑层上提供光致抗蚀剂层，并且通过深紫外光刻(DUV)在光致抗蚀剂中限定多个孔，并且通过反应离子蚀刻(RIE)将多个孔的图案转移至顶部膜支撑层。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：去除顶部膜支撑层上的光致抗蚀剂，并且在顶部膜支撑层的表面上涂布二氧化硅保护层；在底部膜支撑层上涂布光致抗蚀剂层；通过光刻在所述光致抗蚀剂中限定传感区；以及通过反应离子蚀刻(RIE)将传感区的图案转移至底部膜支撑层；将传感区的图案转移至硅基材；用稀氢氟酸去除顶部膜支撑层表面上的保护层；以及在顶部膜支撑层上沉积导电层。
在另一个方面中，本发明描述了一种检测样品中分析物的方法，所述方法包括：a)将分析物捕获到1-9中任一项所述的传感器芯片的表面上；和b)检测第二识别分子与传感器芯片表面上捕获的分析物的结合，其中所述第二识别分子对分析物具有特异性，其中与对照样品相比，所述第二识别分子的结合增加表明样品中存在所述分析物。
在一些实施方案中，所述第二识别分子对分析物是特异性的，所述第二识别分子与信号扩增部分偶联，并且所述信号扩增部分能够诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体。
在一些实施方案中，所述第二识别分子与所述信号扩增部分融合。
在一些实施方案中，所述信号扩增部分是酶。
在一些实施方案中，所述酶是辣根过氧化物酶。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述酶与酶底物接触。
在一些实施方案中，所述信号扩增部分是能够结合第二识别分子的二级抗体。
在一些实施方案中，将第一识别分子固定在表面等离子体共振传感器芯片的表面上，所述第一识别分子能够在传感器芯片表面上捕获分析物。
在一些实施方案中，所述分析物是外泌体结合的生物标记物。
在一些实施方案中，所述方法包括检测样品中共定位的两种或多种分析物。
在另在一个方面中，本发明描述了一种试剂盒，包括本发明中的传感器芯片。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于检测在传感器芯片表面上捕获的分析物的第二识别分子。
在一些实施方案中，所述第二识别分子与信号扩增部分偶联，并且信号扩增部分能够诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体。
在另在一个方面中，本发明描述了一种检测受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法，所述方法包括：a)将从受试者获得的样品与1-9中任一项所述的传感器芯片的表面接触；和b)检测第二识别分子与在传感器芯片表面上捕获的分析物的结合，所述第二识别分子对分析物具有特异性，与对照样品或对照受试者相比，所述第二识别分子的结合增加表明所述受试者患有神经退化疾病。
在所述方法的一些实施方案中，所述第二识别分子与信号扩增部分偶联，并且信号扩增部分能够诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体。
在一些实施方案中，所述分析物是外泌体相关的生物标记物。
在一些实施方案中，所述分析物是外泌体相关的生物标记物或包含在外泌体中的生物标记物。
在一些实施方案中，所述生物标记物选自Aβ、APP、α-Syn、CD9、CD63、CD81、ALIX、TSG101、Flotilin-1、Flotilin-2、LAMP-1、HSP70、HSP90、CHL1、IRS-1、L1CAM、NCAM、Tau、APOE、SOD1、TDP-43、bassoon、纤连蛋白、DNA和RNA或其组合和相关的复合物。
在一些实施方案中，所述Aβ为Aβ42、Aβ40、Aβ39或Aβ38。
在一些实施方案中，所述神经退行性疾病选自阿尔兹海默症、轻度认知障碍、血管性痴呆、痴呆、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、进行性核上性麻痹、tau蛋白病和血管性轻度认知障碍。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括治疗被发现患有神经退化疾病的受试者。
在一些实施方案中，所述治疗包括向受试者给与治疗有效量的一种或多种药物或其组合。
在一些实施方案中，所述药物选自胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐、利伐斯的明或加兰他敏；NMDA受体拮抗剂，如美金刚胺；胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂的组合，如多奈哌齐和美金刚胺的组合；BACE1抑制剂，例如AZD3293；抗体，如阿杜卡努单抗；或抗-tau药物，如TRx0237(LMTX)。
在一些实施方案中，所述药物选自亚甲蓝、无色甲基硫堇鎓双(氢甲磺酸盐)、姜黄素、酸性品红、表没食子儿茶素没食子酸酯、safranal、刚果红、芹菜素、天青C、碱性蓝41、(反式、反式)-1-溴-2，5-双-(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(BSB)、芝加哥天蓝6B、环糊精、盐酸道诺霉素、甲基黄、直接红80、2,2-二羟基二苯甲酮、十六烷基三甲基溴化铵(C16)、氯化血红素、血红素、消炎痛、胡桃酮、间苯二酚蓝、甲氯环素磺基水杨酸盐、褪黑素、杨梅素、1,2-萘醌、去甲二氢愈创木酸、R()-去甲吗啡氢溴酸盐、橙色G、邻香兰素(2-羟基-3-甲氧基苯甲醛)、吩嗪、酞菁、利福霉素SV、酚红、罗利四环素、奎纳克林芥二盐酸盐、硫代黄素S、ThT和三甲基(十四烷基)溴化铵(C17)、二烯丙基酒石酸、曙红Y、非诺贝特、亚铜灵、制霉菌素、十八烷基硫酸盐和罗丹明B。

Claims (34)

1.一种传感器芯片，其包括位于膜支撑层上的导电层，其中多个孔延伸穿过导电层和膜支撑层，并且将其布置以使得对导电层和/或膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
2.根据权利要求1所述的传感器芯片，其中所述导电层是金、银、铝、钠、铟或钛。
3.根据权利要求1或2所述的传感器芯片，其中所述膜支撑层是氮化硅或二氧化钠。
4.根据权利要求1所述的传感器芯片，其中所述孔具有约150nm至约450nm的直径。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的传感器芯片，其中将所述孔周期性地布置。
6.根据权利要求5所述的传感器芯片，其中所述孔具有约250nm至约650nm的周期性。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的传感器芯片，其包括固定在所述导电层表面上的第一识别分子。
8.根据权利要求7所述的传感器芯片，其中，将所述孔布置以使得在照明时产生的表面等离子体共振的衰减长度大约等于所述第一识别分子的靶标的直径。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的传感器芯片，其中，所述导电层和所述膜支撑层被设置在基材上，所述基材在与多个孔相邻的区域中具有形成于其中的空隙，以使得在任一方向上对导电层和/或膜支撑层的照明能够产生表面等离子体共振。
10.一种成像系统，其包括光源、检测器和根据权利要求1-9中任一项所述的传感器芯片，其中，将所述光源布置为照明所述传感器芯片，并且将所述检测器定位为检测透射传感器芯片的光。
11.一种制造传感器芯片的方法，所述方法包括以下主要步骤：
a)提供顶部膜支撑层；
b)在顶部膜支撑层上沉积导电层；
c)形成延伸穿过膜支撑层的多个孔，所述孔还延伸穿过导电层，并且将其布置以使得对导电层和/或顶部膜支撑层的照明产生表面等离子体共振。
12.根据权利要求11所述的方法，其包括：
在硅基材的顶面和底面上涂布顶部膜支撑层和底部膜支撑层；
在顶部膜支撑层上提供光致抗蚀剂层；以及
通过深紫外光刻(DUV)在光致抗蚀剂中限定多个孔，并且通过反应离子蚀刻(RIE)将多个孔的图案转移至顶部膜支撑层。
13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括以下步骤：
去除顶部膜支撑层上的光致抗蚀剂，并且在顶部膜支撑层表面上涂布二氧化硅保护层；
在底部膜支撑层上涂布光致抗蚀剂层；
通过光刻在所述光致抗蚀剂中限定传感区；
以及通过反应离子蚀刻(RIE)将传感区的图案转移至底部膜支撑层；
将传感区的图案转移至硅基材；
用稀氢氟酸去除顶部膜支撑层表面上的保护层；
以及在顶部膜支撑层上沉积导电层。
14.一种检测样品中分析物的方法，所述方法包括：
a)将分析物捕获到权利要求1-9中任一项的传感器芯片的表面上；和
b)检测第二识别分子与传感器芯片表面上捕获的分析物的结合，其中所述第二识别分子对分析物具有特异性，其中与对照样品相比，所述第二识别分子的结合增加表明样品中存在所述分析物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二识别分子对分析物具有特异性，所述第二识别分子与信号扩增部分偶联，并且所述信号扩增部分能够诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述第二识别分子与所述信号扩增部分融合。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述信号扩增部分是酶。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述酶与酶底物接触。
20.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述信号扩增部分是能够结合第二识别分子的二级抗体。
21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中将第一识别分子固定在表面等离子体共振传感器芯片的表面上，所述第一识别分子能够在传感器芯片表面上捕获分析物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述分析物是外泌体结合的生物标记物。
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法包括检测样品中共定位的两种或多种分析物。
24.一种试剂盒，其包括根据权利要求1-9中任一项所述的传感器芯片。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于检测在传感器芯片表面上捕获的分析物的第二识别分子。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述第二识别分子与信号扩增部分偶联，并且所述信号扩增部分能够诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体。
27.一种检测受试者中的神经退行性疾病或淀粉样变性的方法，所述方法包括：
a)将从受试者获得的样品与权利要求1-9中任一项的传感器芯片的表面接触；和
b)检测第二识别分子与在传感器芯片表面上捕获的分析物的结合，所述第二识别分子对分析物具有特异性，与对照样品或对照受试者相比，所述第二识别分子的结合增加表明所述受试者患有神经退行性疾病。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第二识别分子与信号扩增部分偶联，并且所述信号扩增部分能够诱导形成相对于所捕获的分析物而言光密度增加的不可溶聚集体。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述分析物是外泌体相关的生物标记物。
30.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述分析物是外泌体相关的生物标记物或包含在外泌体中的生物标记物。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述生物标记物选自Aβ、APP、α-Syn、CD9、CD63、CD81、ALIX、TSG101、Flotilin-1、Flotilin-2、LAMP-1、HSP70、HSP90、CHL1、IRS-1、L1CAM、NCAM、Tau、APOE、SOD1、TDP-43、bassoon、纤连蛋白、DNA和RNA或其组合和相关的复合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述Aβ为Aβ42、Aβ40、Aβ39或Aβ38。
33.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自阿尔兹海默症、轻度认知障碍、血管性痴呆、痴呆、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、进行性核上性麻痹、tau蛋白病和血管性轻度认知障碍。
34.根据权利要求28-32所述的方法，其中所述方法进一步包括治疗被发现患有神经退行性疾病的受试者。
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