KR102048987B1 - 신경퇴행성 장애의 진단을 위한 정보 제공 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신경퇴행성 장애의 진단을 위한 정보 제공 방법에 대한 것으로, (i) 대상체로부터 소포체(vesicles)를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (ii) 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체를 이용하여, 상기 생물학적 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 측정된 수준을 기 준비된 대조군 샘플의 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 것이 특징이다.

Description

신경퇴행성 장애의 진단을 위한 정보 제공 방법{Information providing method for identification of neurodegenerative disorder}
본 발명은 신경퇴행성 장애의 진단을 위한 정보 제공 방법에 대한 것으로, 더욱 자세하게는 알츠하이머병의 진단 방법, 진단 키트 및 진단 장치에 관한 것이며, 특히 신경 엑소좀에서 추출된 아밀로이드 베타의 분석을 통한 알츠하이머병의 진단에 관한 것이다.
알츠하이머병은 세포막의 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein)이 잘리면서 알츠하이머병을 유발시키는 아밀로이드 베타(amyloid-β, Aβ)가 축적되고, 축적된 Aβ는 미토콘드리아의 분열을 활성화시켜 활성산소(ROS, reactive oxygen species)를 발생시키고, 이는 알츠하이머병을 유발시키는 BACE1(beta-amyloid converting enzyme 1) 단백질의 작용을 활성화시키며, BACE1 작용의 활성화로 인해 신경세포 손상이 발생하게 되고, 기억력과 언어능력의 손실이 발생하게 되어 뇌기능의 장애를 유발시키는 질병으로서, 뇌기능의 장애와 더불어, 심각하게는 사망에까지 이르게 하는 것으로 알려져있다.
기존의 알츠하이머병 진단을 위해서는 주로 아밀로이드 베타 중 Aβ1 -42, 또는 Aβ1-40 의 양을 측정하였고, 상기 물질의 양을 측정하기 위해서는 ELISA 방법을 사용하였다. ELISA의 경우 기판에 N 터미널 (혹은 C-터미널)을 잡을 수 있는 포획 항체를 위치시키고, C-터미널(혹은 N-터미널) 검출항체를 결합시킨 후 아밀로이드 베타의 농도를 측정하게 되는데, 알츠하이머병과 관련되었다고 생각되는 다량체 아밀로이드 베타의 경우, C-터미널을 기준으로 모이는 현상이 있어, 기존 방법으로 알츠하이머병을 진단하게 되면, 다량체 아밀로이드 베타와 C-터미널이 반응하는 검출 항체의 반응이 매우 작아지는 문제가 발생하게 된다. 이는 아밀로이드 베타가 다량체가 될수록 외부와 반응할 수 있는 C-터미널이 감소하기 때문에 일어나는 현상이다. 따라서, 실제 검출 신호에서는 전체 아밀로이드 베타의 농도가 동일하더라도 다량체의 양에 따라 측정되는 값이 변동되어 정확한 아밀로이드 베타의 농도가 검출에 불리한 점이 있었다.
상기의 문제를 해결하기 위해서는 C-터미널에 의존하는 항체와의 반응을 이용하지 않는 것이 좋으나, 기존의 ELISA 또는 일부 전기화학센서에서는 검출 항체에 표시 지표를 붙이고 이를 측정하는 방식이므로, C-터미널 사용이 반드시 필요하게 되어 있다. 또한, C-터미널을 사용하지 않고 N-터미널만 이용한다는 일부 전기화학 센서에서는 Aβ1 -x 가 반응하게 되며, 이를 이용한 기존의 혈장(plasma)에서의 검출 결과는 알츠하이머 병의 진단에 부정확하다는 문제점이 있었다.
1. 한국등록특허 제100595494호
본 발명은 알쯔하이머병을 비롯해서 다른 신경퇴행성 장애를 진단하기 위한 정보를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나 예측하거나, 또는 치료하는 신규한 방법, 바이오마커, 키트 및 장치도 제공하는 것이 목적이다.
본 발명의 일 실시형태는, (i) 대상체로부터 소포체(vesicles)를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (ii) 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체를 이용하여, 상기 생물학적 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 측정된 수준을 기 준비된 대조군 샘플의 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 신경퇴행성 장애의 진단을 위한 정보 제공 방법이다.
본 발명은 (iv) 상기 대조군 샘플에 비해 상기 생물학적 샘플의 아밀로이드 베타의 증가된 수준을 검출함으로서, 상기 대상체가 신경퇴행성 장애를 갖는지를 확인하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 수득한 생물학적 샘플로부터 소포체(vesicle)를 단리하는 단계;를 더 포함하는 것도 가능하다.
상기 소포체(vesicle)는 엑소좀(exosome), 미세입자, 미세소포, 나노좀(nanosome), 세포외 소포 및 엑토좀(ectosome)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 가능하다.
상기 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 가능하다.
상기 엑소좀은 신경-유래 엑소좀(neuronal exosome)인 것이 바람직하다.
상기 N-터미널에 특이성이 있는 항체는, 아밀로이드 베타의 N-터미널과 결합하는 것일 수 있다.
상기 N-터미널에 특이성이 있는 항체는, 아밀로이드 베타의 N-터미널측 1번 내지 16번 염기서열 전체 또는 일부와 결합하는 것이 가능하다.
상기 아밀로이드 베타의 수준은, 아밀로이드 베타의 단백질, 인산화된 단백질, mRNA 또는 miRNA 수준인 것일 수 있다.
상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 타액 및 소변으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 것이 가능하다.
상기 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매(tangle-predominant senile dementia), 픽병(Pick'sdisease)(PiD), 호은 과립(argyrophilic grain) 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌(Guam) 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병(Lytico-Bodig disease), 다발성 경화증, 외상성 뇌손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된 것이 가능하다.
상기 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD)인 것이 바람직하다.
상기 항체는 바이오 센서에 고정된 것이 가능하다.
상기 바이오 센서는 EIS(Electrochemical impedance spectrometry) 센서 어레이, 비드 기반 EIS 센서, ELISA(enzyme linked immunoassay), SPR(Surface Plasmon Resonance) 기반 분석 센서 및 FET(Field-effect transistor) 형 바이오 센서로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 생물학적 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하는 것은, 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체가 상기 생물학적 샘플에 포함된 아밀로이드 베타와 반응한 후의, 임피던스(impedance) 변화 또는 전류(current) 변화를 측정하는 것이 가능하다.
상기 임피던스 변화의 비율이 40% 내지 80% 이면, 상기 대상체가 신경퇴행성 장애를 갖는 것으로 확인하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 전류 변화의 비율이 1 내지 20% 이면, 상기 대상체가 신경퇴행성 장애를 갖는 것으로 확인하는 단계;를 포함하는 것이 가능하다.
본 발명의 다른 실시형태는, 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 방법으로서, (i) 대상체로부터 소포체(vesicles)를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (ii) 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체를 이용하여, 상기 생물학적 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 측정된 수준을 기 준비된 대조군 샘플의 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 방법이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 대상체의 신경퇴행성 장애 진단을 위한 바이오마커 세트로서, 상기 대상체의 소포체(vesicles)를 함유하는 생물학적 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하기 위하여, 상기 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 세트이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 대상체의 신경퇴행성 장애 진단을 위한 키트로서, 상기 대상체의 소포체(vesicles)를 함유하는 생물학적 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하기 위하여, 상기 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, (i) 대상체로부터 소포체(vesicles)를 함유하는 생물학적 샘플이 유입되는 유입구; (ii) 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체를 포함하고, 상기 항체와 상기 유입구에서 유입된 생물학적 샘플이 반응하는 반응부; 및 (iii) 상기 반응부에서의 반응정도에 따라, 상기 생물학적 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하는 측정부;를 포함하는 신경퇴행성 장애 진단 장치이다.
본 발명은 알쯔하이머병을 비롯해서 다른 신경퇴행성 장애를 진단하기 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명은 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나 예측하거나, 또는 치료하는 신규한 방법, 바이오마커, 키트 및 장치도 제공할 수 있다.
도 1은 비드 또는 나노입자 표면에 항체를 고정시킨 후, 전기화학 센서를 이용하여 신경 엑소좀 유래의 아밀로이드 베타의 양을 측정하는 방법에 대한 개요도를 나타낸 것이다.
도 2는 저항/전류 기반의 전기화학 센서 표면에 항체를 고정하여 신경 엑소좀 유래의 아밀로이드 베타의 양을 측정하는 방법에 대한 개요도를 나타낸 것이다.
도 3은 패터닝된 microwell에 1개 이상의 비드를 포획하여 microwell 내에 위치하게 한다는 개념도를 나타낸 것이다.
도 4는 패터닝된 microwell에 항체가 부착된 실제 소자를 나타낸 것이다.
도 5는 아밀로이드 베타를 비드에 존재하는 항체와 반응시킨 후, 임피던스를 측정한다는 개념도를 나타낸 것이다.
도 6는 혈장(plasma), 엑소좀 및 신경엑소좀 유래의 아밀로이드 베타의 구분을 확인하기 위하여 비드 표면에 항체가 처리된 소자를 이용하여 소자 내의 임피던스 변화를 측정한 값을 나타낸 결과이다.
도 7은 47개의 샘플에서 임피던스 변화를 측정한 값(왼쪽 패널) 및 ROC 차트를 이요하여 민감도 및 특이도를 측정한 값(오른쪽 패널)을 나타낸 결과이다.
도 8은 항체가 고정된 환원된 GO(reduced graphene oxide) 표면에 엑소좀 유래의 아밀로이드 베타 펩타이드가 결합하는 방법에 대한 개념도를 나타낸 것이다.
도 9는 대상체에서 시료를 채취하고 인간의 혈장(plasma)에서 엑소좀을 추출하여 엑소좀을 분해시켜 아밀로이드 베타를 추출하여 항체가 고정된 환원된 GO에 반응시켜 아밀로이드 베타의 양을 측정하는 방법에 대한 개요도를 나타낸 것이다.
도 10은 환원된 GO 센서를 이용하여 저항을 측정한 값을 나타낸 결과이다.
본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 분석 및 시약이 변경될 수 있기 때문에, 본 발명은 이들로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 본 발명의 특정 실시양태들을 기술하기 위한 것이고 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 결코 아니라는 것도 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수형은 복수 지시대상을 포함한다는 것을 인지해야 한다. 따라서, 예를 들면, "단편"의 언급은 복수의 이러한 단편들을 포함하고, "항체"의 언급은 하나 이상의 항체 및 당분야에서 숙련된 자에게 공지된 이의 균등물의 언급이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해된 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이하 기재되어 있다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌들은 본 발명과 관련하여 사용될 공개문헌들에서 보고된 방법, 시약 및 수단을 기술하고 개시할 목적으로 전체로서 본원에 참고로 도입된다. 본원에서 어느 것도 본 발명이 선행 발명을 통해 이러한 개시를 예상할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
달리 표시되어 있지 않는 한, 본 발명의 실시는 당분야의 기술 내에서 화학, 생화학, 분자생물학, 세포생물학, 유전학, 면역학 및 약학의 통상적인 방법을 이용할 것이다.
본 발명은 부분적으로 소포체(vesicles) 바이오마커 또는 엑소좀 바이오마커를 분석하여, 예를 들면, 알쯔하이머병(AD), 다발성 경화증(MS) 및 전두측두엽 치매(FTD)를 포함하는 신경퇴행성 장애를 갖거나 발생시킬 가능성이 있는 대상체를 확인할 수 있다는 발견에 관한 것이다.
본 발명은 부분적으로 신경퇴행성 질환(예를 들면, 알쯔하이머병)을 가진 대상체의 순환계에 존재하는 신경-유래 엑소좀에서 특정 바이오마커(예를 들면, 아밀로이드 베타)의 예상되지 않은 증가의 발견에 근거한다. 본 발명은 이 바이오마커들의 엑소좀 수준을 분석하여 신경퇴행성 질환을 가진 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단할 수 있다는 것을 입증한다.
본 발명은 대상체로부터의 신경-유래 엑소좀에서의 특정 바이오마커의 측정을 이용하여 신경퇴행성 질환의 후속 발생을 예측(예를 들면, 신경퇴행성 장애를 발생시킬 위험에 있는 대상체를 확인)할 수 있다는 것도 보여준다.
본 발명자들은 알츠하이머병 환자들의 샘플을 대상으로 아밀로이드 베타의 양을 측정하던 중, 상기 샘플의 종류에 따라 환자와 정상인 간의 구분이 달라진다는 것을 알게되었다. 즉, 샘플이 플라즈마(plasma)인 경우보다 엑소좀인 경우 환자와 정상인 간의 구별이 명확했고, 특별히 신경 엑소좀인 경우 보다 더 명확한 구분이 가능함을 확인 한 후, 본 발명을 완성하였다(도 6 참조). 다시 말해서, 아밀로이드 베타의 양을 측정하기 위한 샘플로서 플라즈마를 이용하는 것보다, 샘플로서 엑소좀(또는 신경 엑소좀)을 이용하면 그 안에 포함되어 있는 아밀로이드 베타의 양만으로도 환자와 정상인을 구별할 수 있는 것이다.
엑소좀 안에 포함된 아밀로이드 베타의 양에 따라 환자와 정상인의 구별이 가능하기 때문에, 본 발명은 엑소좀 안에 포함된 아밀로이드 베타의 양을 측정하고, 상기 측정된 양을 미리 준비된 기준 레퍼런스(reference)와 비교함으로서, 환자와 정상인을 구별할 수가 있다.
상기 엑소좀은 생물학적 시료에서 추출하는 것일 수 있다. 그리고, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 타액 및 소변으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 엑소좀은 신경 엑소좀(neural exosome)인 것이 더욱 바람직하다. 이 경우, 아밀로이드 베타의 양을 측정함에 있어서, 환자와 정상인 간의 구별이 더욱 명확하다.
본 발명은 대상체의 신경퇴행성 상태를 평가하기 위한 바이오마커 세트를 제공한다. 이 실시양태에서, 바이오마커 수준이 분석된다. 본 발명은 엑소좀 안에 포함된 아밀로이드 베타의 양을 측정하는 것이 특징이고, 상기 아밀로이드 베타의 양을 측정하는 방법은 특별히 제한되지는 않지만, 항체와의 반응 후 발생하는, 임피던스 변화 또는 전류 변화를 측정하는 것이 가능하다(도 6 및 도 7 참조).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 임피던스 변화가 20% 내지 90%, 또는 30% 내지 80%, 또는 40% 내지 80%, 또는 40% 내지 70%, 또는 50% 내지 60%, 또는 55% 내지 70%이면 알츠하이머병인 것일 수 있고, 바람직하게는 60 내지 65%이면 알츠하이머병인 것일 수 있다. 또한, 상기 전류 변화가 0.1% 내지 20%, 또는 0.1% 내지 10%, 또는 1% 내지 9%, 또는 2% 내지 8%, 또는 3% 내지 7%, 또는 4% 내지 6%이면 알츠하이머병인 것일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 5%이면 알츠하이머병인 것일 수 있다. 본 발명자들은 후술하는 실시예 및 실험예를 통하여, 이러한 수치 범위를 확인하였다.
본 발명은 본원에 기재된 방법에서 사용될 조성물도 제공한다. 이러한 조성물은 소분자 화합물; 항체 또는 이의 기능적 활성 단편을 포함하는 펩타이드 및 단백질; 및 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임 및 안티-센스 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다(예를 들면, 문헌[Zeng (2003) ProcNatl Acad Sci USA 100:9779-9784]; 및 문헌[Kurreck (2003) Eur J Biochem 270:1628-1644] 참조).
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 키트도 제공한다. 이 실시양태들에서, 키트는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 바이오마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 생물학적 샘플을 수집하고/하거나 보유하기 위한 하나 이상의 용기, 및 키트 사용을 위한 설명서를 포함한다.
단락 제목은 조직화 목적만을 위해 본원에서 사용되고, 본원에 기재된 보호대상을 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
생물학적 샘플
본 발명은 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 바이오마커 및 진단 및 예후 방법을 제공한다. 바이오마커 수준은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정된다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 생물학적 샘플은 혈액으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 약 1 내지 10 ㎖의 혈액이 대상체로부터 채취된다. 다른 실시양태에서, 약 10 내지 50 ㎖의 혈액이 대상체로부터 채취된다. 혈액은 팔, 다리, 또는 중심 정맥 카테터를 통해 접근될 수 있는 혈액을 포함하는, 신체의 임의의 적합한 영역으로부터 채취될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 혈액은 치료 또는 활동 후에 채취된다. 예를 들면, 혈액은 의학적 검사 후에 채취될 수 있다. 채취 시기도 샘플에 존재하는 엑소좀의 수 및/또는 조성을 증가시키도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 혈액은 혈관 팽창을 유도하는 운동 또는 치료 후에 채취될 수 있다.
혈액은 후속 기법들을 위해 샘플을 보존하거나 준비하기 위해 채취 후에 다양한 성분들과 조합될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태들에서, 혈액은 채취 후에 항응고제, 세포 고정제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 단백질, DNA 또는 RNA 보존제로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 혈액은 항응고제, 예컨대, EDTA 또는 헤파린을 함유하는 진공 채취 튜브를 이용함으로써 정맥천자를 통해 채취된다. 혈액은 헤파린-코팅된 주사기 및 피하 바늘을 이용함으로써 채취될 수도 있다. 혈액은 세포 배양에 유용할 성분과 조합될 수도 있다. 예를 들면, 일부 실시양태들에서, 혈액은 세포 배양 배지 또는 보충된 세포 배양 배지(예를 들면, 사이토카인)와 조합된다.
생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부, 뇌척수액, 또는 예를 들면, 뇌 조직을 포함하는 다른 조직을 포함하는, 당분야에서 공지된 다른 공급원으로부터 수득될 수도 있다.
소포( 엑소좀 , 미세입자, 미세소포, 나노좀 , 세포외 소포 및 엑토좀 )의 농축 또는 단리
샘플은 양성 선별, 음성 선별, 또는 양성 선별과 음성 선별의 병용을 통해 소포에 대해 농축될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 소포는 직접적으로 포획된다. 다른 실시양태에서, 혈액 세포는 포획되고, 소포는 남은 생물학적 샘플로부터 수집된다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플에서 농축된 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 또는 엑토좀이다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플에서 농축된 소포는 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀이다.
샘플은 소포의 생화학적 성질에서의 차이에 근거하여 소포에 대해 농축될 수도 있다. 예를 들면, 샘플은 항원, 핵산, 대사, 유전자 발현 또는 후성적(epigenetic) 차이에 근거하여 소포에 대해 농축될 수 있다. 항원 차이에 근거한 실시양태들 중 일부에서, 유동 세포측정과 함께 자기장 구배 내의 항체-접합된 자성 또는 상자성 비드 또는 형광 표지된 항체가 이용된다. 핵산 차이에 근거한 실시양태들 중 일부에서, 유동 세포측정이 이용된다.
대사 차이에 근거한 실시양태들 중 일부에서, 유동 세포측정 또는 또 다른 분류 기술에 의해 측정되는 염료 섭취/배제가 이용된다. 유전자 발현에 근거한 실시양태들 중 일부에서, 사이토카인을 사용한 세포 배양이 이용된다. 샘플은 당분야에서 공지된 다른 생화학적 성질에 근거하여 소포에 대해 농축될 수도 있다. 예를 들면, 샘플은 pH 또는 이동성에 근거하여 소포에 대해 농축될 수 있다. 추가로, 일부 실시양태들에서, 하나 초과의 방법이 소포를 농축하는 데에 이용된다. 다른 실시양태에서, 샘플은 항체, 리간드 또는 가용성 수용체를 사용함으로써 소포에 대해 농축된다.
다른 실시양태에서, 표면 마커가 샘플에서 소포를 양성적으로 농축하는 데에 사용된다. 일부 실시양태들에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 또는 엑토좀이다. 다른 실시양태에서, NCAM, CD171, CD9, CD63, CD81, 다양한 신경 또는 성상세포 부착 단백질들, 미세아교세포 CD18/11, 또는 CD3 T 세포 막 세포 표면 마커가 엑소좀을 농축하는 데에 사용된다. 일부 실시양태들에서, 소포 집단 상에서 발견되지 않는 세포 표면 마커는 세포 집단을 고갈시킴으로써 소포를 음성적으로 농축하는 데에 사용된다. 유동 세포측정 분류도 형광 표지에 접합된 세포 표면 마커 또는 세포내 또는 세포외 마커를 사용하여 엑소좀을 더 농축하는 데에 사용될 수 있다. 세포내 마커 및 세포외 마커는 소포에서 우선적으로 발현된 세포내 또는 세포외 단백질에 대한 핵염료 또는 항체를 포함할 수 있다. 세포 표면 마커는 엑소좀 상에서 우선적으로 발현되는 세포 표면 항원(예를 들면, NCAM)에 대한 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 세포 표면 마커는 예를 들면, NCAM 또는 CD171을 포함하는 신경-유래 엑소좀 표면 마커이다. 일부 실시양태들에서, 단일클론 NCAM, CD9, CD63, CD81 또는 CD171 항체는 샘플로부터 엑소좀을 농축하거나 단리하는 데에 사용된다. 특정 양태에서, NCAM, CD9, CD63, CD81 또는 CD171 항체는 바이오티닐화된다. 이 실시양태에서, 바이오티닐화된 NCAM 또는 CD171 항체는 스트렙타비딘-아가로스 수지 또는 비드를 사용함으로써 후속적으로 단리될 수 있는 항체-엑소좀 복합체를 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, NCAM, CD9, CD63, CD81 또는 CD171 항체는 단일클론 항-인간 NCAM, CD9, CD63, CD81 또는 CD171 항체이다.
일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플로부터 농축된 소포는 특정 유형의 소포에 대해 후속적으로 농축된다. 예를 들면, 생물학적 샘플은 엑소좀에 대해 농축되고, 그 후 농축된 엑소좀은 신경-유래 엑소좀에 대해 후속적으로 농축된다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플은 소포의 개별 신경 세포 공급원에 대해 농축된다. 특정 양태에서, 소포의 신경 세포 공급원은 미세아교세포, 신경 또는 성상세포이다.
다른 실시양태에서, 소포는 생물학적 샘플에 존재하는 소포가 제제에 결합하여 소포-제제 복합체를 형성하는 조건 하에서 상기 생물학적 샘플을 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및 상기 소포-제제 복합체로부터 상기 소포를 단리하여 상기 소포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생물학적 샘플로부터 단리되거나 농축되고, 이때 상기 샘플에 존재하는 소포의 순도는 상기 생물학적 샘플에 존재하는 소포의 순도보다 더 크다.
특정 실시양태에서, 상기 제제는 항체 또는 렉틴이다. 소포-렉틴 복합체를 형성하는 데에 유용한 렉틴은 미국특허출원 공개 제2012/0077263호에 기재되어 있다. 일부 실시양태들에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 또는 엑토좀이다. 일부 실시양태들에서, 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 또는 미세아교세포-유래 엑소좀이다. 일부 실시양태들에서, 다수의 단리 또는 농축 단계들이 수행된다. 본 실시양태의 특정 양태에서, 제1 단리 단계는 혈액 샘플로부터 엑소좀을 단리하기 위해 수행되고, 제2 단리 단계는 다른 엑소좀으로부터 신경-유래 엑소좀을 단리하기 위해 수행된다. 다른 실시양태에서, 소포-제제 복합체의 소포 부분은 용해 시약을 사용함으로써 용해되고, 용해된 소포의 단백질 수준이 분석된다. 일부 실시양태들에서, 항체-소포 복합체는 고체상 상에서 생성된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 항체-소포 복합체로부터 소포를 방출시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 고체상은 비-자성 비드, 자성 비드, 아가로스 또는 세파로스이다. 다른 실시양태에서, 소포는 항체-소포 복합체를 3.5 내지 1.5의 낮은 pH에 노출시킴으로써 방출된다. 다른 실시양태에서, 방출된 소포는 높은 pH 용액을 첨가함으로써 중화된다. 다른 실시양태에서, 방출된 소포는 방출된 소포를 용해 용액과 함께 항온처리함으로써 용해된다.
다른 실시양태에서, 용해 용액은 프로테아제 및 포스파타제에 대한 억제제를 함유한다.
신경퇴행성 장애
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 의사로 하여금 대상체에서 하나 이상의 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하게 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 의사로 하여금 진단 가능성으로서 하나 이상의 신경퇴행성 질환을 배제하거나 제거하게 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 의사로 하여금 신경퇴행성 장애를 발생시킬 위험에 있는 대상체를 확인하게 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 의사로 하여금 대상체가 신경퇴행성 장애를 나중에 발생시킬지를 예측하게 할 수 있다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 의사로 하여금 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하게 할 수 있다.
바이오마커
바이오마커 수준은 신경퇴행성 장애(예를 들면, 알쯔하이머병)를 갖거나 가질 위험에 있는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 분석된다. 일부 실시양태들에서, 바이오마커는 아밀로이드 베타이다. 그 중에서도 본 발명은 아밀로이드 베타의 N-터미널을 바이오마커로 할 수 있다. 본 명세서(도면 포함)에서 "Abeta 1-x"는 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체에 붙는 Abeta를 의미한다. 아밀로이드 베타(Abeta)의 앞부분 1-16번까지가 모두 N-터미널로 작용할 수　있다. 예를 들어 Abeta가 중간에 끊어셔저 3번이 나와도 앞에 나온 3번이 N-터미널로 작용 가능하다. 뒤에도 끊어져서 6-39가 되면 6번은 N 터미널로 작용하고, 39번 C-터미널로 작용하게 될 수 있다.
다른 실시양태에서, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171이다.
일부 실시양태들에서, 본 발명의 바이오마커 수준은 바이오마커의 유전자 발현을 측정함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현 변화는 아밀로이드 베타의 발현 수준을 측정함으로써 측정된다. 특정 양태에서, 바이오마커의 유전자 발현은 PCR, 마이크로어레이 또는 서열결정을 이용함으로써 측정된다. 일부 실시양태들에서, 바이오마커의 발현 수준은 바이오마커의 mRNA 또는 miRNA 수준을 측정함으로써 측정된다.
당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 마커의 검출 및 분석을 위해 이용될 수 있는 여러 방법들 및 장치들을 알고 있다. 환자 시험 샘플 중의 폴리펩타이드 또는 단백질에 대하여, 면역분석 장치들 및 방법들이 종종 이용된다. 이 장치들 및 방법들은 다양한 샌드위치, 경쟁적 또는 비-경쟁적 분석 포맷들에서 표지된 분자를 이용하여 관심있는 분석물의 존재 또는 양과 관련되어 있는 신호를 생성할 수 있다. 추가로, 특정 방법들 및 장치들, 예컨대, 바이오센서 및 광학 면역분석이 표지된 분자에 대한 필요성 없이 분석물의 존재 또는 양을 측정하는 데에 이용될 수 있다.
다른 방법들(예를 들면, 마커 RNA 수준의 측정)이 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있지만, 바람직하게는 마커는 면역분석을 이용함으로써 분석된다. 마커의 존재 또는 양은 일반적으로 각각의 마커에 대해 특이적인 항체를 사용하고 특이적 결합을 검출함으로써 확인된다. 임의의 적합한 면역분석, 예를 들면, 효소-연결된 면역분석(ELISA), 방사면역분석(RIA), 경쟁 결합 분석, 평면 도파관(planar waveguide) 기술 등이 이용될 수 있다. 항체와 마커의 특이적 면역학적 결합은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 직접적인 표지는 항체에 부착된 형광 또는 발광 태그, 금속, 염료, 방사성핵종 등을 포함한다. 간접적인 표지는 당분야에서 잘 공지된 다양한 효소들, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 호스라디쉬 퍼록시다제 등을 포함한다.
마커에 대해 특이적인 고정된 항체의 사용도 본 발명에 의해 고려된다. 항체는 다양한 고체 지지체들, 예컨대, 자성 또는 크로마토그래피 매트릭스 입자, 분석 장소(예컨대, 마이크로타이터 웰)의 표면, 고체 기판 물질(예컨대, 플라스틱, 나일론, 종이)의 조각 등 상에 고정될 수 있다. 분석 스트립은 항체 또는 복수의 항체들을 고체 지지체 상에 어레이로 코팅함으로써 제조될 수 있다. 그 다음, 이 스트립은 검사 샘플 내로 침지된 후 세척 및 검출 단계를 통해 신속히 프로세싱되어 측정가능한 신호, 예컨대, 착색된 스폿(spot)을 생성할 수 있다.
복수의 마커들의 분석은 한 시험 샘플과 별도로 또는 동시에 수행될 수 있다. 여러 마커들이 다수의 샘플들의 효율적인 프로세싱을 위해 한 시험으로 조합될 수 있다. 또한, 당분야에서 숙련된 자는 동일한 개체로부터 (예를 들면, 연속적인 시점들에서) 다수의 샘플들을 시험할 가치를 인식할 것이다. 일련의 샘플들의 이러한 시험은 시간의 경과에 따라 마커 수준에서의 변화를 확인할 수 있게 할 것이다. 마커 수준에서의 증가 또는 감소뿐만 아니라 마커 수준에서의 변화의 부재도 사건(event) 시작으로부터의 대략적인 시간의 확인, 구조할 수 있는 (salvageable) 조직의 존재 및 양, 약물 치료의 타당성, 다양한 치료들의 효과, 사건의 중증도의 확인, 질환 중증도의 확인, 및 장래 사건의 위험을 포함하는 환자의 결과의 확인을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 질환 상태에 대한 유용한 정보를 제공할 것이다.
본 발명에서 언급된 마커들의 조합물로 구성된 분석을 구축하여 상이한 진단과 관련된 적절한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 패널은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 또는 20개 이상의 개별 마커들을 사용함으로써 구축될 수 있다. 단일 마커, 또는 보다 더 큰 패널의 마커들을 포함하는 마커 서브세트의 분석을 본 발명 내에 기재된 방법에서 수행하여 다양한 임상적 상황들에서 임상적 민감성 또는 특이성을 최적화할 수 있다. P-S312-IRS-1과 P-panY-IRS-1의 비(R 또는 인슐린 내성 지수)를 이용하여 신경퇴행성 장애의 위험 또는 진단을 예측할 수 있다.
마커의 분석도 다양한 물리적 포맷들로 수행될 수 있다. 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트 또는 자동화를 이용하여 많은 수의 시험 샘플들의 프로세싱을 용이하게 할 수 있다. 대안적으로, 단일 샘플 포맷을 개발하여 예를 들면, 외래 수송실 또는 응급실 환경에서 시기적절한 방식으로 즉각적인 치료 및 진단을 용이하게 할 수 있다. 특히 유용한 물리적 포맷은 복수의 상이한 분석물들의 검출을 위한 복수의 분리된 주소지정가능한 (addressable) 위치들을 가진 표면을 포함한다. 이러한 포맷은 단백질 마이크로어레이, 또는 "단백질 칩" 및 모세관 장치를 포함한다.
본 발명의 바이오마커는 신경퇴행성 장애(예를 들면, 알쯔하이머병)의 초기 검출 및 모니터링에서 중요한 역할을 수행한다. 이러한 장애의 마커는 전형적으로 측정될 수 있는 신체 샘플에서 발견된 물질이다. 측정된 양은 기저 장애 또는 질환 병리생리학, 신경퇴행성 장애의 존재 또는 부재, 향후 신경퇴행성 장애의 가능성과 상관관계를 가질 수 있다. 그의 상태에 대해 치료를 받고 있는 환자에서 측정된 양은 치료에 대한 반응과도 상관관계를 가질 것이다.
일부 실시양태들에서, 바이오마커는 면역조직화학, 면역세포화학, 면역형광, 면역침전, 웨스턴 블롯팅 및 ELISA로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 측정된다.
임상적 분석 성능
본 발명의 방법은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하고/하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하고/하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 임상적 분석에서 이용될 수 있다. 임상적 분석 성능은 분석의 민감성, 특이성, ROC 곡선하면적(AUC), 정확도, 양성 예측 값(PPV) 및 음성 예측 값(NPV)을 측정함으로써 평가될 수 있다. 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 분석이 본원에 개시되어 있다.
상기 분석의 임상적 성능은 민감성에 근거할 수 있다. 본 발명의 분석의 민감성은 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%일 수 있다. 상기 분석의 임상적 성능은 특이성에 근거할 수 있다. 본 발명의 분석의 특이성은 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%일 수 있다. 상기 분석의 임상적 성능은 ROC 곡선하면적(AUC)에 근거할 수 있다. 본 발명의 분석의 AUC는 적어도 약 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9 또는 0.95일 수 있다. 상기 분석의 임상적 성능은 정확도에 근거할 수 있다. 본 발명의 분석의 정확도는 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%일 수 있다.
조성물
본 발명의 방법에서 유용한 조성물은 신경퇴행성 장애와 관련된 바이오마커를 특이적으로 인식하는 조성물을 포함하되, 상기 바이오마커는 아밀로이드 베타이다.
일부 실시양태들에서, 상기 조성물은 하나 이상의 아밀로이드 베타의 활성을 향상시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 아밀로이드 베타의 활성을 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 펩타이드, 핵산, 항체 및 소분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 신경퇴행성 장애와 관련된 바이오마커를 특이적으로 검출하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태들에서, 조성물은 항체를 포함하되, 상기 항체는 본 발명의 바이오마커 또는 소포에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 바이오마커로서 아밀로이드 베타를 이용하고, 그 중에서도 아밀로이드 베타의 N-터미널을 바이오마커로 하는 것이 특징이다. 이를 위하여, 상기 항체는 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 것이 바람직하다. 즉, 상기 항체는 아밀로이드 베타의 N-터미널과 결합하는 것이 가능하다.
본원에서 사용되고 이하에 더 논의된 용어 "항체"는 바이오마커 또는 소포(예를 들면, 엑소좀)와도 특이적으로 반응하는 그의 단편을 포함하기 위한 것이다. 항체는 통상적인 기법을 이용함으로써 단편화될 수 있고, 단편은 전체 항체에 대해 전술된 바와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, F(ab)2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab)2 단편은 다이설파이드 가교를 환원시켜 Fab 단편을 생성하도록 처리될 수 있다. 항원 결합 부분도 재조합 DNA 기법, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항원 결합 부분은 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 쇄 항체(scFv), 단일 도메인 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 디아바디, 및 특이적 항원 결합을 폴리펩타이드에 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 그에 부착되어 검출될 수 있는 표지(예를 들면, 표지는 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있음)를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이고, 특정 실시양태에서 본 발명은 본 발명의 바이오마커 또는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 생성하는 방법을 이용가능하게 만든다. 예를 들면, 바이오마커 또는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 방법은 바이오마커 또는 엑소좀, 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물을, 검출가능한 면역 반응을 자극하기에 효과적인 양으로 마우스에게 투여하는 단계, 항체 생성 세포(예를 들면, 비장으로부터의 세포)를 마우스로부터 수득하고 상기 항체 생성 세포를 골수종 세포와 융합시켜 항체 생성 하이브리도마를 수득하는 단계, 및 상기 항체 생성 하이브리도마를 시험하여 바이오마커 또는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일단 수득되면, 하이브리도마는 임의적으로 하이브리도마-유래 세포가 바이오마커 또는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 배양 조건에서 세포 배양물에서 증식될 수 있다. 단일클론 항체는 세포 배양물로부터 정제될 수 있다.
항체의 언급에서 사용된 용어 "특이적으로 반응하는"은 당분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이 항체가 관심있는 항원(예를 들면, 바이오마커 또는 엑소좀)과 관심없는 다른 항원 사이에 충분히 선택적이라는 것을 의미하기 위한 것이다. 항체를 사용하는 특정 방법, 예컨대, 치료 적용에서, 결합에서의 보다 더 높은 특이성 정도가 바람직할 수 있다. 단일클론 항체는 일반적으로 (다중클론 항체에 비해) 원하는 항원과 교차반응 폴리펩타이드를 효과적으로 식별하는 보다 더 큰 경향을 가진다. 항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 미치는 한 특성은 항원에 대한 항체의 친화성이다. 원하는 특이성이 다양한 상이한 친화성으로 도달될 수 있지만, 일반적으로 바람직한 항체는 약 10-6, 10-7, 10-8 또는 10-9 이하의 친화성(해리 상수)을 가질 것이다.
항체는 예를 들면, 신경-유래 엑소좀, 아밀로이드 베타를 포함하는, 본 발명의 엑소좀 또는 바이오마커의 에피토프에 특이적으로 결합하도록 생성될 수 있다.
추가로, 바람직한 항체를 확인하기 위해 항체를 스크리닝하는 데에 이용된 기법은 수득된 항체의 성질에 영향을 미칠 수 있다. 다양한 상이한 기법들이 항체와 항원 사이의 상호작용을 시험하여 특히 바람직한 항체를 확인하는 데에 이용될 수 있다. 이러한 기법들은 ELISA, 표면 플라스몬 공명 결합 분석(예를 들면, 비아코어(Biacore) 결합 분석, 비아코어 아베(Biacore AB)(스웨덴 업살라 소재)), 샌드위치 분석(예를 들면, 아이쥐이엔 인터내셔날 인코포레이티드(IGEN International, Inc.)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)의 상자성 비드 시스템), 웨스턴 블롯, 면역침전 분석, 면역세포화학 및 면역조직화학을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 신경퇴행성 장애를 치료하거나 예방하는 데에 사용되는 조성물에 관한 것이다.
본원의 다른 곳에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 아밀로이드 베타가 다양한 신경퇴행성 장애들, 예를 들면, 알쯔하이머병의 병리와 연관되어 있다는 발견에 근거한다.
치료 방법
본 발명은 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 신경퇴행성 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 조성물이 아밀로이드 베타의 수준을 감소시키는, 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 아밀로이드 베타의 활성을 향상시킨다. 다른 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 아밀로이드 베타의 활성을 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 조성물은 펩타이드, 핵산, 항체 및 소분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
키트
본 발명의 또 다른 양태는 대상체에서 신경퇴행성 장애를 검출하거나 모니터링하는 키트를 포괄한다. 상이한 성분들을 가진 다양한 키트들이 본 발명에 의해 고려된다. 일반적으로 말하면, 상기 키트는 대상체에서 하나 이상의 바이오마커를 정량하는 수단을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 키트는 생물학적 샘플을 수집하는 수단, 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 정량하는 수단, 및 키트 내용물의 사용을 위한 설명서를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 엑소좀을 농축하거나 단리하는 수단을 포함한다. 추가 양태에서, 엑소좀을 농축하거나 단리하는 수단은 생물학적 샘플로부터 엑소좀을 농축하거나 단리하기 위해 필요한 시약을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 키트는 바이오마커의 양을 정량하는 수단을 포함한다. 추가 양태에서, 바이오마커의 양을 정량하는 수단은 바이오마커의 양을 검출하기 위해 필요한 시약을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 엑소좀 샘플 준비
1.1. 혈액에서의 엑소좀 ( exosome ) 추출법
혈액에서 엑소좀을 추출하기 위하여, 우선 혈구를 제거한 혈장을 칼슘 재침착 시약과 1:3의 비율로 섞고, 혈장 내의 섬유소의 제거를 위해 트롬빈 용액과 상기 칼슘 재침착 시약과 반응한 혈장을 혼합하였다. 이로부터 얻어진 용액은 원심분리하여 섬유소는 침전시키고, 섬유소가 제거된 상청액(supernatant)은 PBS로 희석하였다. 상기 희석된 상청액에서 엑소좀만을 분리하기 위해서는 희석한 용액에 ExoQuickTM 용액을 혼합하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 원심분리를 하여 상청액을 제거하여 펠렛(pellet)에서 엑소좀을 얻었다. 추출한 엑소좀은 PBS 용액을 넣은 후 보관하여 사용하였다.
1.2. 신경 엑소좀 (neural exosome ) 추출법
상기 1.1. 에서 추출한 엑소좀은 다양한 세포에서 유래된 것이므로, 신경 엑소좀만을 추출하기 위해서 2차 정제 과정을 진행하였다. 상기 1.1. 에서 준비한 엑소좀 용액은 3% BSA(Bovine Serum Albumin)가 섞인 PBS 용액에 희석하였고, 바이오틴 처리된(Biotinylated) 신경세포막특이단백질 반응 항체 용액을 희석한 엑소좀 용액과 반응시켰다. 신경세포막특이단백질 반응 항체는 신경 엑소좀을 선택적으로 잡기 위해 사용된 것이다. 이후, 40μl의 3% BSA 용액과 20μl의 스트렙타비딘-아가로스 수지(Streptavidin Agarose Resin)로 만들어진 용액을 넣고, 4℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응한 용액은 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 바이오틴-스트렙타비딘-아가로스 수지에서 엑소좀을 분리하기 위해 글리신-염산 완충액 (Glycine-HCl buffer solution, 50 mM, pH 3.0) 을 첨가하여 pH 를 낮춘 후, 상온에서 볼텍서(Vortexer)로 충분히 섞어준 뒤 원심분리하였다. 엑소좀이 존재하는 상청액을 새로운 용기에 옮기고, 트리스-염산 완충액(Tris-HCl buffer solution, 1M, pH 8.6)을 첨가하여 용액을 중성화하였다. 상기 과정에 의해 정제된 신경 엑소좀 용액은 PBS 용액을 넣은 후 80 ℃에서 보관한 후 실험에 사용하였다.
1.3. 신경 엑소좀에서 Aβ1 - x 를 추출하는 방법
아밀로이드 베타(Aβ)의 경우 변성의 우려가 있으므로 측정 직전에 추출하여 사용하였다. 우선, 80 ℃에서 보관된 신경 엑소좀 용액은 4 ℃에서 약 10분 동안 녹였고, 녹은 엑소좀 용액에 RIPA 완충액을 1:1의 비율로 첨가한 후 4 ℃를 유지하면서 1분 동안 초음파분해하였다. 상기 과정에 의하여 엑소좀 막이 분해되면서 Aβ1-x 가 추출된 혼합 용액을 얻을 수 있었다.
실시예 2. 비드 또는 나노입자 표면에 항체 처리한 소자를 이용하여 신경 엑 소좀에서 추출된 Aβ 1-x 검출
2.1. 비드를 이용한 센서의 제작
본 발명자들은 비드를 이용한 센서를 제작하기 위하여, 우선, i) 이산화규소층을 산화막이 있는 실리콘 기판에 광식각 공정을 사용하여 전극 형상을 패터닝하고, ii) 전자빔 증착법을 사용하여 티타늄-백금 전극을 올리고 남은 부분은 리프트오프 공정으로 제거하였다. iii) 이후, 전극을 올린 후 Su8 계열의 포토레지스트를 활용하여 향후 비드를 가두어 두기 위한 Microwell을 패터닝하여 하판 센서 구조부를 완선하고, iv) 외부의 샘플 유입을 위한 PDMS well의 형성을 위하여 PDMS를 약 2 mm 두께로 형성시킨 후 펀처로 2 ~ 3 mm의 구멍을 만들었다. v) PDMS well과 소자의 본딩을 위하여 산소플라즈마 처리 후, 하판 센서 구조부와 PDMS well을 본딩하여 소자를 완성하였다. 도 3은 패터닝된 microwell에 1개 이상의 비드를 포획하여 microwell 내에 위치하게 한다는 개념도이고, 도 4는 실제 소자를 나타낸 것이다.
2.2. 방법
표면이 항체와 반응할 수 있는 작용기로 활성화된 마이크로비드 (M-280 Tosylactivated 자성비드, Dynabeads 사) 용액(200 μl)을 상온에서 원심분리시켜 비드를 가라앉힌 후, 비드를 자석으로 고정시키고 상청액을 제거하였다. 0.1 mM 인산염 완충액을 0.2 μm 직경의 다공성막을 지닌 필터에 거르고, 1 ml 의 완충액을 남은 비드에 첨가하였다. 상기 과정은 워싱과정으로서 비드 외의 잔류물을 없애기 위한 것이다. 3번의 워싱을 반복한 후 상청액을 제거하고, 720 μl 의 0.1 mM 인산염 용액과 80 μl의 항체 용액을 첨가하고 충분히 섞이게 하였다. 상기 과정으로 얻어진 비드 용액은 37 ℃에서 24 시간 동안 반응시키고, 이후 비드 용액을 두 종류의 완충액을 사용하여 워싱하였다. 상기 두 종류의 완충액은 같은 종류의 필터에 걸러 준비된 PBS 완충액과 Tris 완충액이며, 준비된 비드용액에 상청액을 제거한 뒤, 전자의 PBS 완충액을 첨가하여 5 분 동안 상온에서 잘 섞이게 하였고, 후자의 Tris 완충액을 사용하여 워싱한 후 37 ℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 워싱된 비드용액의 상청액은 다시 제거하였고, 남은 비드를 200 μl 의 필터된 PBS 용액에 넣고 4 ℃에서 보관하였다.
비드 용액은 PBS 완충 용액에 1:150의 비율로 희석하여 준비하였고, 실시예 1에서 추출한 Aβ1-x 용액에 준비한 상기 비드 용액을 1:2의 비율로 40분 동안 반응시켰다. 반응 후 비드를 자석으로 고정시키고 상청액은 제거하였다. 이후, PBS 완충 용액으로 한 번 워싱하여 잘 섞이게 하였고, PBS 용액 만으로 3번 더 워싱하여 측정 전 비드 준비를 완료하였다.
비드 용액은 소자에 떨어뜨리기 위하여, 패터닝된 microwell의 하부에 위치한 자석을 이용하여 비드를 각각 미리 패턴된 microwell에 넣었다. 이후, 전기 화학을 측정할 수 있는 장비(Autolab PGSTAT302N)를 이용하여 소자내 임피던스의 변화를 측정하였다.
2.3. 결과
엑소좀 및 신경엑소좀의 유용성을 확인하기 위하여, Aβ를 혈장(plasma), 엑소좀 및 신경 엑소좀에서 추출하여 엑소좀 및 신경 엑소좀 유래에 대한 Aβ의 구분이 가능한지 확인하는 실험을 진행하였다. 혈장(plasma)에서 추출된 Aβ의 경우 임피던스의 변화에 있어 대조군과 차이가 없음을 확인하였고, 엑소좀 유래의 Aβ의 경우 알츠하이머병을 가진 환자에서 임피던스 변화가 증가됨을 알 수 있었다. 그런데, 신경 엑소좀 유래의 Aβ의 경우에는 엑소좀 유래의 Aβ에 비하여 확연하여 알츠하이머병을 가진 환자에서는 겹치는 구간없이 명확하게 임피던스 변화에 차이가 있음을 확인하였다(도 6).
본 발명자들은 상기의 결과를 보다 명확히 확인하기 위하여 엑소좀의 샘플수를 47개로 증가시켜 상기와 같은 과정을 통해 측정하였다. 그 결과, 상기의 결과와 마찬가지로 임피던스의 변화가 대조군(NC)과 알츠하이머병 환자(AD)에서 구분이 명확함을 확인하였다(도 7의 왼쪽 패널). 이는 기존의 혈액 기반의 방법에 비하여 매우 높은 정확성을 나타내는 것으로서, ROC 차트를 이용하여 민감도 및 특이도를 측정한 결과 각각 100 % 및 90 % 인 것으로 확인되었다(도 7의 오른쪽 패널).
따라서, 신경 엑소좀에서 아밀로이드 베타를 추출하여 항체가 부착된 비드 또는 나노입자와 반응시켜 임피던스 변화를 측정함으로써 높은 정확도로 알츠하이머병 환자의 진단이 가능함을 확인하였다.
실시예 3. 저항/전류 기반의 전기화학센서 - FET 및 저항형 센서를 이용
3.1. 환원된 GO (reduced graphene oxide, rGO )를 이용하는 센서의 준비 - rGO 박막 코팅 및 센서 제작법
GO(graphene oxide)는 Modified Hummers method 에 따라 제작되며 초음파 분해법으로 미세한 조각판으로 박리되었다. 상대적으로 큰 조각은 원심분리법으로 가라앉히고, 상대적으로 더욱 얇은 조각들만을 사용하였으며, 초순수의 Milli-Q 물에 보관하였다. GO 박막은 MDD(Meniscus-dragging Deposition) 방법으로 이산화규소층을 산화막으로 가지는 실리콘 기판에 코팅되었다. 먼저, 피라냐 처리로 표면에 잔여물이 없게 한 유리판을 준비하였고, 준비한 GO 용액을 상기 실리콘 기판에 떨어뜨리고 유리판을 기판과 용액에 가져다 대고, 30도의 각도를 유지하게 하면서 일정한 속도(20 mm/s)로 움직이게 하였다. 상기 과정은 20회 이상 반복하였으며, 상기에 의해 만들어진 GO 박막에 기체상태의 요오드화수소산을 80 ℃ 에서 3시간 동안 가하여 GO를 환원시켜 rGO 박막을 얻었다. 이후, 광식각 공정을 이용해 rGO 박막에 포토레지스트 마스크를 만들고 나머지 부분은 산소 플라즈마를 이용한 반응성 이온 식각법으로 제거하였다(300 W, 30 sec). 식각 후 남은 마스크는 리프트오프 공정으로 제거하였고, 남은 rGO 박막 양단에 다시 한번 광식각 공정으로 크롬-골드 전극을 연결하기 위한 패턴을 만들었다. 상기한 전극을 전자빔 증착법으로 올리고 남은 부분을 리프트오프하여 없앴다. 만들어진 rGO 소자에 산소플라즈마 처리를 하여 rGO 박막에 항체가 붙을 작용기를 다시 활성화시켰다.
3.2. 환원된 GO (reduced graphene oxide, rGO )를 이용하는 센서의 준비 - 표면 처리법
만들어진 소자의 rGO 박막 부분을 20μl의 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-carbodiimide, 2 mM, Sigma Aldrich, USA) 용액, NHS(N-succinimide, 8 mM, Sigma Aldrich, USA) 용액, 10 mM의 PBS 용액에 1시간 동안 노출시켰다. 이후 항체 용액 (Aβ1-x 를 잡을 수 있는 항체, 6E10 항체, Abcam 사)과 EDC, NHS 혼합용액을 사용하여 2 시간 동안 rGO 표면에 반응시켜 항체를 붙였다.
3.3. 방법
실시예 1에서 준비한 신경 엑소좀에서 추출한 Aβ1-x 샘플을 준비하였고, 실시예 3.1 및 3.2에서 준비한 rGO 센서를 준비하여, 준비된 Aβ1-x 샘플을 센서 표면에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, Semiconductor parameter analyzer 장비를 이용하여 저항을 측정하였다.
3.4. 결과
30개의 샘플에서 신경 엑소좀을 추출하고, 신경 엑소좀에서 추출된 Aβ를 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과, 알츠하이머병 환자(AD)에서는 대조군에 비하여 저항 변화(resistance change)의 퍼센트가 높았음을 확인하였다.
따라서, 신경 엑소좀에서 아밀로이드 베타를 추출하여 항체가 고정된 rGO 센서에 반응시켜 저항 변화를 측정함으로써 알츠하이머병의 진단이 가능함을 확인하였다.

Claims (21)

  1. (i) 바이오센서의 표면에 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체를 고정시키는 단계;
    (ii) 상기 고정된 항체에 대상체의 혈액으로부터 얻은 신경-유래 엑소좀(neuronal exosome) 샘플을 반응시키고, 임피던스(impedance) 변화 또는 전류(current) 변화를 측정함으로서, 상기 엑소좀 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하는 단계;
    (iii) 상기 측정된 수준을 기 준비된 대조군 샘플의 수준과 비교하는 단계; 및
    (iv) 상기 대조군 샘플에 비해 상기 엑소좀 샘플의 아밀로이드 베타의 증가된 수준을 검출함으로서, 상기 대상체가 알쯔하이머병(AD)을 갖는지를 확인하는 단계;로 이루어지고,
    상기 N-터미널에 특이성이 있는 항체는, 아밀로이드 베타의 N-터미널측 1번 내지 16번 염기서열 전체 또는 일부와 결합하는 것을 특징으로 하는, 알쯔하이머병(AD)의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  2. 삭제
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  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. (i) 아밀로이드 베타의 N-터미널에 특이성이 있는 항체를 비드에 고정시키는 단계;
    (ii) 상기 항체가 고정된 비드에 대상체의 혈액으로부터 얻은 신경-유래 엑소좀(neuronal exosome) 샘플을 반응시킨 후, 바이오센서 표면에 위치시킨 다음, 임피던스(impedance) 변화 또는 전류(current) 변화를 측정함으로서, 상기 엑소좀 샘플에 포함된 아밀로이드 베타의 수준을 측정하는 단계;
    (iii) 상기 측정된 수준을 기 준비된 대조군 샘플의 수준과 비교하는 단계; 및
    (iv) 상기 대조군 샘플에 비해 상기 엑소좀 샘플의 아밀로이드 베타의 증가된 수준을 검출함으로서, 상기 대상체가 알쯔하이머병(AD)을 갖는지를 확인하는 단계;로 이루어지고,
    상기 N-터미널에 특이성이 있는 항체는, 아밀로이드 베타의 N-터미널측 1번 내지 16번 염기서열 전체 또는 일부와 결합하는 것을 특징으로 하는, 알쯔하이머병(AD)의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  15. 삭제
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 임피던스 변화의 비율이 40% 내지 80% 이면, 상기 대상체가 알쯔하이머병(AD)을 갖는 것으로 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 알쯔하이머병(AD)의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 전류 변화의 비율이 1 내지 20% 이면, 상기 대상체가 알쯔하이머병(AD)을 갖는 것으로 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 알쯔하이머병(AD)의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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