CN116529599A - 用于使用比色免疫传感器检测口腔样品中SARS-CoV-2的体外方法及相关的比色免疫传感器 - Google Patents

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Abstract

本文描述了一种用于使用比色免疫传感器检测选自唾液和痰的口腔生物样品中的SARS‑CoV‑2病毒体的体外测定方法，以及相关的试剂盒。本发明的方法和试剂盒基于金捕获纳米颗粒的使用，该金捕获纳米颗粒在其表面上携带至少一种能够与SARS‑CoV‑2表面抗原结合的抗体。

Description

用于使用比色免疫传感器检测口腔样品中SARS-CoV-2的体外 方法及相关的比色免疫传感器
本发明的领域
本发明涉及一种用于通过使用比色免疫传感器检测口腔生物样品中SARS-CoV-2的体外方法及相关的比色免疫传感器。
技术的陈述
在研究和诊断领域中，比色法类光学生物传感器由于其通用性、易用性和能够达到分析物的极低检测极限(limit of detection，LOD)而变得越来越重要。
在光学生物传感器中已知基于金纳米颗粒的比色生物传感器称为局域表面等离子体共振(Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR)，以监测在待检测的分析物与金纳米颗粒之间的相互作用之后形成不同尺寸的簇时的颜色变化，该比色生物传感器利用金纳米颗粒的物理性质。
光学转导物(transducer)对于微生物的直接检测(无标记)是特别令人感兴趣的。这些传感器被设计成检测当细胞附着到固定在转导物表面上的受体时发生的折射率或厚度的最小转换，将分子的浓度、质量或数量的变化与光特性的直接变化相关联。传感机制是基于将与待检测靶标结合产生的信号转换成可被放大和检测的物理信号。纳米材料的特征在于尺寸极小，并且可以对纳米材料进行合适的表面修饰，该纳米材料允许与生物分子靶标的高度特异性相互作用，从而在生物检测领域中显示出巨大的潜力。
更一般地，金纳米颗粒在广泛的学科中得到应用，这些学科包括磁性流体、催化、生物技术/生物医学、磁共振成像和环境修复。在大多数这些应用中，当这些纳米颗粒的尺寸小于临界值时，观察到它们具有更好的功能性，该临界值取决于材料，但通常约为10-20nm。
基于抗原与相应抗体之间相互作用的特异性的、用于测定目标分析物的生物传感器通常被称为免疫传感器。抗体固定化程序是这些设备的构造中的关键步骤，因为电极表面上的抗体分子的取向显著影响生物传感器的性能。事实上，形成具有其结合位点良好取向并面向抗原的抗体层改善了生物传感器的效率，使固定化方法的选择成为构建免疫传感器时要考虑的最重要方面之一。通常，抗体固定方法涉及这些分子的物理或化学吸附。
在最简单的吸附程序中提及使用抗体与表面之间的离子或静电键、疏水相互作用和范德华键、且不需要对蛋白质进行化学修饰的方法(Sharma、Byrne和Kennedy，2016；Um等人，2011)。上述方法的主要缺点是抗体是随机取向的，且因此可能不能适当地暴露抗原结合位点。
固定抗体的更有效的方法是基于在抗体于金表面之间形成共价键(Alves、Kiziltepe和Bilgicer，2012；Ho等人，2010；Vashist等人，2011；Rahman等人，2007)。例如，生物素化的抗体可以固定在用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白修饰的表面上(Barton等人，2009；Ouerghi等人，2002)或者抗体可以固定在用蛋白质(诸如，蛋白质A或蛋白质G)修饰的表面上(J.E.Lee等人，2013；Inkpen等人，2019；Sharafeldin和Rusling，2019；Fowler、Stuart和Wong，2007)。最后，在过去十年中已经开发了涉及在聚合物基质中捕获的抗体的固定化方法(Sun等人，2011；Bereli等人，2013；Moschallski等人，2013；Yamazoe，2019)。
在可能的固定化策略中，自组装单层(self-assembled monolayer，SAM)的形成是用于构建免疫传感器最广泛使用的方法之一。例如，抗体在电极的金表面上的取向固定化可以通过利用硫醇羧酸的SAM的形成(Barreiros dos Santos等人，2013；Malvano、Pilloton和Albanese，2018；Wan等人，2016)或通过将抗体固定在电化学沉积的半胱胺层上(Malvano、Pilloton和Albanee，2018)来实现。此外，最近也报道了使用交联剂(诸如戊二醛)，特别是用于在聚苯胺基底上固定抗大肠杆菌抗体，在检测这种细菌中具有令人感兴趣的结果(Chodwhury等人，2012)。因此，SAM被广泛用作以取向方式将抗体固定在金表面上的连接物，尽管它们在各种应用中显示出许多优点，但是为了理解和控制它们的物理和化学性质，仍然存在几个方面需要考虑(Vericat等人，2010；Mandler和Kraus-Ophir，2011；Chaki和Vijayamohanan，2002)。金表面上的自组装单层通常表示为其中分子处于完美包装构型(packed configuration)的完美单层。实际上，这种想法与现实相差甚远，并且SAM的质量控制在许多应用中是关键点。良好组装的单层的构造强烈依赖于所用化学试剂和溶液的纯度，并且甚至存在最小量污染物，例如作为硫醇化合物中典型杂质的硫醇化分子也可能导致不均匀并因此是不理想的层(C.Y.Lee等人，2005)。
近年来，在文献中发表的研究中描述了不同类型的免疫传感器。
Iarossi,M等人(2018)(“Colorimetric Immunosensor by Aggregation ofPhotochemically Functionalized Gold Nanoparticles”ACS Omega 3,4,3805–3812)描述了一种利用金纳米颗粒的表面等离子体共振现象的比色免疫传感器，以及这种系统用于检测人IgG免疫球蛋白中的应用。
Liu Y等人(2015)(“Colorimetric detection of influenza A virus usingantibody-functionalized gold nanoparticles”Analyst 140(12)3989-3995)研究了基于用抗血凝素单克隆抗体修饰的金纳米颗粒的比色免疫传感器测定甲型流感病毒的用途。然而，在该文件中没有提供免疫传感器的临床疗效的证据。
在Della Ventura B等人(2020)(“Colorimetric Test for Fast Detection ofSARS-CoV-2in Nasal and Throat Swabs”MedRixv doi:https://doi.org/10.1101/ 2020.08.15.20175489和ACS Sensors 5,3043–3048)描述的研究涉及比色免疫传感器用于检测鼻咽拭子中的SARS-CoV-2冠状病毒的用途。
由新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的正在持续的严重流行病在许多国家已经造成了主要的公共健康挑战。由于称为COVID-19的新冠状病毒引起的严重疾病的症状缺乏特异性，因此诊断的确认需要对来自患者的呼吸道和/或血清样品执行实验室测试。大规模诊断测试在隔离无症状的COVID-19患者以试图阻止感染传播方面也起关键作用。
在目前用于诊断SARS-CoV-2冠状病毒感染的程序中，基于逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法起主要作用。这种方法允许鉴定来自上呼吸道的样品(特别是使用鼻咽拭子获取的样品)中的病毒基因组。然而，PCR的诊断应用由于执行和计时的复杂性以及需要专用仪器和受过训练的人员而具有主要限制。
已经开发的用于诊断COVID-19的免疫学方法也表现出明显的问题。例如，侧流免疫层析测定在允许快速分析许多样品的情况下、以低灵敏度为特征。
与旨在诊断SARS-CoV-2感染的方法论相关的其它问题涉及选择最合适的样品来寻找病毒颗粒，更具体地说是完整的颗粒。在它们中，目前所选择的样品由呼吸道样品代表，特别由鼻咽拭子代表。然而，这种取样需要精确的操作程序，也就是说，为了有效，从鼻取样必须通过向下推动拭子以到达咽而不是朝向鼻腔来执行。
因此，需要提供诊断测试，该诊断测试允许在保持高特异性和灵敏度参数的情况下，通过简单的程序快速鉴定SARS-CoV-2病毒。
这些和其它目的通过如所附独立权利要求中定义的体外方法和相关试剂盒实现，所述方法和相关试剂盒适用于检测受试者的口腔生物样品中的SARS-CoV-2病毒体(virion，病毒粒子)。
本发明的附加特征在从属权利要求中确定，其形成说明书的整体部分。
从下面的详细描述中可以清楚地看出，根据本发明的体外方法允许在非常短的时间内、在微小的范围内获得诊断结果，并且需要在约一毫升体积的范围内的最少量的待分析样品，这非常易于收集。这种程序特别简单、不需要任何复杂的仪器，这也允许成本显著降低。
因此，本发明的第一个目的是一种用于检测受试者的口腔生物样品中SARS-CoV-2病毒体的体外方法，该口腔生物样品选自唾液和痰，该方法包括以下步骤：
a)使生物样品与金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液接触，从而获得反应混合物，该金捕获纳米颗粒在其表面上携带至少一种能够与SARS-CoV-2表面抗原结合的抗体，该抗原选自由以下构成的组：膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)、刺突蛋白(S)及它们的任何组合；
(b)测定反应混合物中在SARS-CoV-2病毒体表面上金纳米颗粒簇的形成，所述簇由抗体与抗原之间的相互作用产生，测定通过检测反应混合物的光学参数的变化来进行，反应混合物的光学参数的所述变化指示口腔样品中SARS-CoV-2病毒体的存在。
在本说明书的范围内，术语“病毒体”是指成熟病毒颗粒，包括其基因组、核壳(nucleocapsid)和包膜。
根据本发明的方法基于局域表面等离子体共振(LSPR)物理原理，该物理原理在于在用电磁波照射后在金属颗粒中自由电子发生了相干和非传播振荡，该电磁波的频率与表面等离子体共振。表面等离子体的共振(其赋予胶体溶液颜色)取决于各种因素(诸如，纳米颗粒的尺寸)，并且在纳米颗粒彼此接触时或在任何情况下、在比它们自身直径小得多的距离处，表面等离子体的共振可以发生显著变化。通常，金属纳米颗粒(诸如，金纳米颗粒)在胶体悬浮液中彼此的偶联通过形成二聚体、三聚体或更大的链、直至形成簇而发生，并且涉及等离子体共振的变化，并且因此涉及溶液颜色的变化，这种溶液颜色的变化甚至可以用肉眼检测。
根据本发明，反应混合物中发生金纳米颗粒的簇集(clustering，聚集)由生物学机制介导，该生物学机制在于在所述捕获纳米颗粒表面上固定的抗体与在SARS-CoV-2病毒表面上存在的相应抗原之间的特异性相互作用。因此，只有当SARS-CoV-2病毒颗粒存在于测试样品中时才发生簇集，因此为本发明的方法提供了极大的特异性。
适用于本发明方法的口腔样品选自唾液和痰。
如在以下实验部分中更详细地说明的，本发明人惊奇地发现本发明的方法允许检测受试者的唾液或痰中的SARS-CoV-2病毒。尽管这种类型的样品的取样容易性具有毋庸置疑的优势，但是到目前为止，如果可能的话，它们在如前所定义的方法中的使用是特别困难的，这不仅是由于这些样品中会引起金纳米颗粒的非特异性簇集的高盐浓度而使生物传感器不可用，而且还由于粘液(mucus)的存在。后者虽然不影响簇集的动力学，但含有改变吸收光谱的不透明物质。不幸的是，粘膜浓度的变化性(不仅在人中，而且对于同一人而言随时间的变化)使得不可能使粘液对光学读数的贡献标准化。此外，唾液含有高浓度的可能干扰抗原-抗体相互作用的蛋白质。与其它含有病毒体的溶液(例如，由病毒运输媒介(VirusTransport Medium，VTM)构成的溶液)相比，所有这些考虑因素突出了唾液基质的特性。为了证明每个基质的特性的重要性，这使得几乎不可能立即将分析技术从一个基质扩展到另一个基质，足以认为由RT-PCR给出的“金标准”技术对唾液基质无效，而是需要将鼻咽拭子浸没在VTM中。
如上所述，根据本发明的方法中使用的金属纳米颗粒是金纳米颗粒。
优选地，金纳米颗粒具有1nm至100nm、更优选2nm至40nm范围内的直径。最优选的是具有20nm直径的金纳米颗粒。
在根据本发明的方法中，捕获金纳米颗粒表面上的至少一种抗体能够结合选自由以下构成的组的SARS-CoV-2表面抗原：膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)、刺突蛋白(S)及它们的任何组合。
如本领域所已知的，上述病毒蛋白一起有助于形成外病毒包膜。其中，刺突蛋白通过促进病毒包膜与细胞膜的融合而使SARS-CoV-2与宿主细胞的结合。
在适用于根据本发明方法的抗体分子中，作为非限制性实施例，提及了单克隆或多克隆抗体、单体(Fab)或二聚体(F(ab')2)抗体片段、单链抗体片段(single chainantibody fragment，scFv)或衍生自抗体支架(antibody scaffold)的任何结合蛋白。
根据本发明，考虑如上定义的抗SARS-CoV-2抗体可以以任何可能的组合存在于捕获金纳米颗粒上。所述抗体与金纳米颗粒表面的接近度允许簇的纳米颗粒之间的距离最小化，从而允许发生LSPR现象。
本领域已知适用于实现在紧邻金纳米颗粒表面固定一个或多个抗体分子的方法，即使它们本质上局限于物理吸附或光化学技术(光化学固定化技术，PIT)，这种光化学技术通过用紫外光照射这些分子来实现以正确取向在金表面上固定抗体[Della Ventura B.etal.(2019)“Biosensor surface functionalization by a simple photochemicalimmobilization of antibodies:experimental characterization by massspectrometry and surface enhanced Raman spectroscopy”.Analyst 144,6871-6880]。
与物理吸附不同，PIT方法允许稳健和持久的官能化(functionalization)，允许这种方法的工业应用。
在本发明范围内选择最合适的抗体固定化方法完全属于本领域普通技术人员的技能。
优选地，基于悬浮液的总体积，胶体悬浮液中如上定义的金捕获纳米颗粒的量在1至1020纳米颗粒(np)/ml的范围内，更优选10至1015np/ml。在甚至更优选的实施方案中，基于悬浮液的总体积，金捕获纳米颗粒的量为1010np/ml。
有利地，由于携带特异性针对病毒表面蛋白的抗体的金纳米颗粒通过保持彼此非常接近并在颗粒周围形成层而在病毒体表面上簇集的能力，根据本发明的方法允许在测试样品中完整地检测SARS-CoV-2病毒颗粒。因此，由于活性病毒颗粒的特异性测定，根据本发明的方法特别适合于鉴定其中SARS-CoV-2感染仍然在进行的病例。
根据一实施方案，本发明的方法还包括通过使用过滤器元件过滤步骤a)中获得的反应混合物的步骤，该过滤器元件具有直径为35至65微米(μm)、优选40至60μm、更优选45至55μm的孔，例如具有直径为45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55μm的孔。
在本发明的范围内，上述过滤步骤除去或明显减少了存在于反应混合物中的唾液或痰样品的粘膜组分，从而增加了本发明方法的灵敏度和特异性。
如上所述，在根据本发明的方法中，通过检测反应混合物的光学参数的变化来确定金纳米颗粒在SARS-CoV-2病毒体表面上的簇集。
在本发明方法的一实施方案中，检测到的光学参数的变化是肉眼可检测的反应混合物的颜色变化。
在这个实施方案中，进一步任选的步骤在于将反应混合物的所检测到的颜色与比色标度(colorimetric scale)进行比较。这个步骤提高了结果的解释质量(interpretative quality)。
同样重要且有利的是，上述实施方案不需要使用仪器。
在本发明的另一实施方案中，检测到的光学参数的变化是在可见光范围内的预定波长(优选560nm)下测得的反应混合物的透射率值(transmittance value)的降低。
在本说明书的范围内，表述“可见光范围内的波长”是指在约390nm与约760nm之间的波长。
根据上述实施方式，反应混合物的透射率值的测量可以通过使用光度计或比色计仪器进行，该光度计或比色计仪器优选地用具有100％透射率值的标准溶液校准。
在本发明的又一实施方案中，检测到的光学参数的变化是在预定的可见光范围内的波长(优选在560nm)下测得的反应混合物的吸光度值的增加。用于进行上述吸光度测量的合适仪器是分光光度计，例如，该分光光度计可以是便携式分光光度计或台式分光光度计。
根据另一实施方案，检测到的光学参数的变化是在200nm与700nm之间的波长范围内反应混合物的吸收光谱下的面积的增加。
在这个实施方案中，根据本发明的方法允许定量测定，这是测试样品中SARS-CoV-2病毒载量的指示。根据这个实施方案，额外使用标准曲线还可以获得病毒载量的“绝对”量度。
在又一实施方案中，本发明的方法处于竞争性形式，其中光学参数的变化是在600nm至700nm范围内的波长下测量的反应混合物的吸光度值的增加。
这种竞争性实施方案涉及使用高盐，且因此是特别不稳定的金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液。更具体地，根据这种实施方案，胶体悬浮液包含选自由以下组成的组的盐：柠檬酸钠、氯化钠、磷酸钾、磷酸钠、氯化钙、氯化钾及它们的任何组合，并且上述盐以150毫摩尔(mM)至250mM范围内的浓度存在于胶体悬浮液中。
在本发明的范围内，优选地，盐是柠檬酸钠，更优选地，是以160mM的浓度存在于胶体悬浮液中的柠檬酸钠。
盐的存在导致添加不含SARS-CoV-2病毒并因此不被SARS-CoV-2病毒感染的唾液，以诱导金捕获纳米颗粒以簇的形式彼此簇集，导致在反应混合物中肉眼可见的颜色变化。另一方面，如果唾液含有SARS-CoV-2病毒颗粒，在病毒体表面上形成官能化金纳米颗粒的簇防止所述纳米颗粒彼此簇集。由于金纳米颗粒在病毒体表面上的簇集导致反应混合物的吸收光谱中的共振峰的位移不同于在不存在病毒颗粒的条件下由盐诱导的簇集所导致的位移，更准确地，从约560nm的波长到600至700nm范围内的波长，因此与在不存在病毒体的条件下观察到的非常明亮的颜色变化相比，口腔样品中病毒体的存在包括颜色的轻微变化。
如前所述，包括适于执行根据本发明的方法的工具(means，部件)的试剂盒也包括在本发明的范围内。
因此，本发明的第二方面是用于检测受试者的口腔生物样品中SARS-CoV-2病毒体的诊断试剂盒，该口腔生物样品选自唾液和痰，该诊断试剂盒包含金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液，该金捕获纳米颗粒在其表面上携带至少一种能够与SARS-CoV-2表面抗原结合的抗体，该抗原选自由以下构成的组：膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)、刺突蛋白(S)及它们的任何组合。
根据一实施方案，金捕获纳米颗粒的胶体混合物包含选自由以下组成的组的盐：柠檬酸钠、氯化钠、磷酸钾、磷酸钠、氯化钙、氯化钾及它们的任何组合，所述盐以150毫摩尔(mM)至250mM范围内的浓度存在于胶体悬浮液中。
在本发明的范围内，优选地，盐是柠檬酸钠，更优选地，以160mM的浓度存在于胶体悬浮液中的柠檬酸钠。
在一实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包括含有比色标度的支承物，例如比色条。
在另一实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包括便携式比色计或光度计。
优选地，便携式光度计配备有钨丝灯和能够隔离560nm处的波长的单色仪(monochromator)。
优选地，便携式比色计配备有能够在560nm发光的二极管。
在适用于本发明试剂盒的便携式仪器中，提及了作为实施例的都是哈纳仪器公司(Hanna Instruments)的便携式型号HI96759光度计和便携式型号HI759比色计。
在本发明的诊断试剂盒中，包含金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液可以被分配到多个单个一次性试管(single disposable test tubes)中。
替代地，所述胶体悬浮液可以以单个包装提供，例如在专用滴管设备中。
在另一实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包括如前文关于本发明的方法所限定的过滤器元件。
根据该实施方案，过滤器元件可以容纳在一次性试管内部，优选地在试管的本体的、与引入胶体悬浮液的端部相对的一个端部附近。
在本发明的范围内，试剂盒中的过滤器元件优选地是亲水性聚乙烯过滤器。
提供以下实验实施例仅用于说明性目的。在此，参考了附图，其中：
-图1是用G型免疫球蛋白官能化的金纳米颗粒表面的方法(光化学固定化技术，PIT)的示意图。用适当功率的灯、利用紫外线照射IgG抗体，使抗体的轻链恒定部的特定位置处的二硫键(disulfide bridge)还原。硫醇的产生允许在抗体与金纳米颗粒表面之间形成共价键，使抗体的两个抗原识别部的一者游离。
-图2是本发明的方法的示意图。将用抗SARS-CoV-2抗体官能化的金纳米颗粒的胶体悬浮液与含有病毒的样品接触，从而形成反应混合物。在官能化金纳米颗粒簇集在病毒颗粒周围之后，反应混合物改变颜色。随着病毒颗粒浓度的增加，朝向蓝色的位移增加。
实验部分
实施例1：胶体金溶液的制备(纳米颗粒的合成)
对于它们的实验，本发明人使用本领域已知的方案(Turkevich方法)的变体获得了约20nm直径的金纳米颗粒的合成。根据这个方案，首先将四氯金酸溶解在水中并添加柠檬酸钠来引起金的还原，使得产生金种子，并且随后金在该金种子周围生长。合成反应包括在100mL MilliQ(超纯)水中混合1mL的HAuCl4(10mg/mL)和2mL柠檬酸钠二水合物(25mg/mL)。在温和搅拌下，将操作温度保持在90℃。金纳米颗粒的形成是通过溶液颜色从黄色到橙色的剧烈变化来鉴定。
在合成结束时，将溶液在6G下离心30分钟，从而获得待官能化的金纳米颗粒。
实施例2：官能化
通过使用如图1所述的称为光化学固定化技术(PIT)的机理，将金纳米颗粒的表面官能化。
简而言之，使用针对SARS-CoV-2病毒的膜蛋白(膜，M)、包膜蛋白(包膜，E)和刺突蛋白(S)的IgG抗体(0.1mg/mL)。
将含有1μg/mL浓度的抗体溶液的石英比色皿插入专门设计的UV灯中，并用UV射线照射30秒，以便还原抗体特定位置上的一些二硫键。随后，将具有直径为20nm大小的金纳米颗粒官能化，获得抗包膜抗体的纳米颗粒浓度为1010纳米颗粒(np)/mL、抗刺突抗体的纳米颗粒浓度为1010np/mL和抗膜抗体的纳米颗粒浓度为1010np/mL。然后，通过使用含有BSA(50μg/mL)的溶液封闭金纳米颗粒上留下的任何空的空间。
最后，将含有三种不同抗体的胶体悬浮液以1:1的比例混合在一起，以获得携带三种抗SARS-CoV-2抗体的金纳米颗粒的单个悬浮液，从而显著增加系统的特异性。
通过在6G离心10分钟来进行所得样品的纯化。
实施例3：样品制备
使用拭子收集唾液样品并立即转移到体积为0.5ml的官能化金纳米颗粒的胶体悬浮液中。通过在悬浮液中围绕拭子自身轴剧烈旋转拭子约10秒来释放拭子上的任何病毒体。本发明人发现，与现有技术测定不同，根据本发明的方法令人惊讶地不需要在取样后将唾液样品重悬于缓冲溶液中。本发明人还发现，其它搅拌方法(例如，以不协调的方式上下搅拌试管)在相同的时间内不能获得相同的结果，也表现出缺乏可重复性和可再现性。
任选地，为了除去样品中存在的粘膜组分，使由将唾液或痰样品与金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液混合获得的反应混合物通过直径为50微米的孔的亲水性聚乙烯过滤器滴落并收集在下面的比色皿中。根据唾液的粘度，该过程所花费的时间在3-10分钟的间隔内变化。过滤后，读取反应混合物。
实施例4：检测
如上所述制备和官能化的金捕获纳米颗粒用于SARS-CoV-2病毒检测实验。
简而言之，在将唾液或痰样品与金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液混合后，在反应混合物中发生颜色变化，从橙色到蓝色再到紫色。具体地，随着病毒浓度的增加，朝向蓝色的移动增加。将其中没有看到颜色变化的简单缓冲溶液用作阴性对照。
为了进行透射率或吸收度分析，在重悬之后，通过无菌一次性巴斯德吸管(Pasteur pipette)将确定体积的唾液或痰样品置于已经含有金捕获纳米颗粒悬浮液的试管(惠顿型，Wheaton型)中。
替代地，将确定体积的测试样品和金捕获纳米颗粒悬浮液一起分配到供应的比色皿中。
通过搅拌试管/比色皿、或通过移液混合用上述制备方法获得的反应混合物，从而允许在SARS-CoV-2病毒体的表面上形成官能化金纳米颗粒的簇。
随后，任选地在过滤后，将试管或比色皿置于所提供的便携式读数器中，该读数器提供了指示样品阳性/阴性的吸光度或透射率值，即，存在或不存在SARS-CoV-2病毒颗粒。
在本发明人进行的实验中，使用配备有钨灯和单色仪的便携式光度计，该单色仪能够在用标准品适当校准后隔离560nm处的波长。简单的“空白”(即，指定100％透射率或0％吸光度的样品)用作标准品。含有反应混合物的一次性比色皿用于光度分析。
在它们的实验中，本发明人可选地使用配备有二极管的比色计设备，该二极管能够在560nm处发光、且与上述设备类似地返回透射率值。在该程序模式中，在重悬之后，唾液或痰样品直接在预封装有金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液的一次性反应管中进行分配和测定。
在上述实验中测量的透射率值指示了存在于测试样品中的SARS-CoV-2病毒颗粒的量。
为了测量反应混合物的吸光度，发明人还使用了台式分光光度计仪器，该分光光度计仪器能够在例如200nm至700nm范围的宽光谱波长中发射。在不同波长下进行的吸光度测量允许计算吸收光谱下的面积，从而提供病毒载量的“相对”定量测定。通过所描述的技术的校准，病毒载量测量可以变成“绝对的”。
下面的表1示出了并行使用PCR方法和本发明的方法获得的6名患者(3名阳性和3名阴性)的结果。对于PCR分析，数据表示为循环阈值(cycle threshold，Ct)，该循环阈值对应于其中发射的荧光超过阈值的PCR反应循环。对于根据本发明方法的分析，数据表示为吸光度值(Abs)。术语“X”表示阴性样品。
表1
PCR阈值(Ct) 560nm处的Abs
18 0.325
22 0.294
35 0.224
x 0.171
x 0.195
x 0.176
表1示出了阴性样品给出0.18±0.01的吸光度值。即使考虑3SD标准，具有最低病毒载量(Ct＝35)的样品清楚地与阴性样品区分开来。事实上，高于35的PCR阈值被认为是阴性的。这些结果证明根据本发明的方法具有与PCR相当的检测极限。
实施例5：具有竞争性配置的本发明的方法
对于使用本发明的方法具有竞争性配置进行的实验，产生捕获纳米颗粒的特别不稳定的胶体悬浮液。为此，进行以下两个步骤：1)在水中生产的步骤期间使用160mM浓度的柠檬酸钠；2)通过在4.5G离心30分钟除去过量的试剂，并将沉淀物重悬于含有160mM柠檬酸钠的水溶液中。随后，将含有SARS-CoV-2病毒颗粒的唾液加入到如上所描述获得的捕获纳米颗粒的胶体悬浮液中，使得反应混合物的吸收光谱中的共振峰的偏移不同于由加入未感染唾液的反应混合物所导致的偏移，因此，其中纳米颗粒的簇集仅由盐诱导。事实上，本发明人在不存在病毒体的条件下反应混合物观察到非常明亮的颜色变化，而它们证明了在存在病毒的条件下轻微的颜色变化。
在如实施例4所述的直接配置的本发明方法中，在约560nm的波长处观察到反应混合物的吸收峰，而在竞争性配置的本发明方法中，在600-700nm的可见光范围内的波长处观察到大得多的反应混合物的峰。
下面的表2示出了并行使用PCR方法和本发明的方法获得的6名患者(3名阳性和3名阴性)的结果。数据如上所述参考表1表示。术语“x”表示阴性样品。
表2
PCR阈值(Ct) 560nm处的Abs 600nm的Abs
15 0.274 0.157
19 0.252 0.133
22 0.214 0.122
x 0.199 0.046
x 0.187 0.052
x 0.192 0.064
表2中所示的结果表明，在含有SARS-CoV-2的样品(阳性病例)与不含病毒的样品(阴性病例)之间存在可测量的差异。

Claims (16)

1.一种用于检测受试者的口腔生物样品中SARS-CoV-2病毒体的体外方法，所述口腔生物样品选自唾液和痰，所述方法包括以下步骤：
a)使所述生物样品与金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液接触，从而获得反应混合物，所述金捕获纳米颗粒在其表面上携带至少一种能够结合SARS-CoV-2表面抗原的抗体，所述抗原选自由以下构成的组：膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)、刺突蛋白(S)及它们的任何组合；以及
(b)测定所述反应混合物中在所述SARS-CoV-2病毒体表面上金纳米颗粒簇的形成，所述簇由所述抗体与所述抗原之间的相互作用产生，所述测定通过检测所述反应混合物的光学参数的变化来进行，所述反应混合物的光学参数的所述变化指示所述口腔生物样品中所述SARS-CoV-2病毒体的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光学参数的变化是通过肉眼能够检测的所述反应混合物的颜色变化。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括将所述反应混合物的检测到的颜色与比色标度进行比较的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光学参数的变化是在可见光范围内的预定波长下、优选在560nm下测量的所述反应混合物的透射率值的降低。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光学参数的变化是在可见光范围内的预定波长下、优选在560nm下测量的所述反应混合物的吸光度值的增加。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光学参数的变化是在200nm与700nm之间的波长范围中所述反应混合物的吸收光谱下的面积的增加。
7.根据权利要求1所述的方法，所述方法处于竞争性形式，
其中，所述金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液包含选自由以下构成的组的盐：柠檬酸钠、氯化钠、磷酸钾、磷酸钠、氯化钙、氯化钾及它们的任何组合，所述盐以150毫摩尔(mM)至250mM范围内的浓度存在于所述胶体悬浮液中，并且
其中，所述光学参数的变化是在600nm至700nm范围内的波长下测量的所述反应混合物的吸光度值的增加。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包括通过使用过滤器元件过滤在步骤a)中获得的所述反应混合物的步骤，所述过滤器元件具有直径为35至65微米(μm)范围内的孔。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中，所述光学参数的变化是借助于比色计或光度计来检测的。
10.一种用于检测受试者的口腔生物样品中SARS-CoV-2病毒体的诊断试剂盒，所述口腔生物样品选自唾液和痰液，所述诊断试剂盒包括金捕获纳米颗粒的胶体悬浮液，所述金捕获纳米颗粒在其表面上携带至少一种能够结合SARS-CoV-2表面抗原的抗体，所述抗原选自由以下构成的组：膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)、刺突蛋白(S)及它们的任何组合。
11.根据权利要求10所述的诊断试剂盒，其中，胶体混合物包含选自由以下构成的组的盐：柠檬酸钠、氯化钠、磷酸钾、磷酸钠、氯化钙、氯化钾及它们的任何组合，所述盐以150毫摩尔(mM)至250mM范围内的浓度存在于所述胶体悬浮液中。
12.根据权利要求10或11所述的诊断试剂盒，其中，所述胶体悬浮液被分配到多个单个一次性试管中。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒还包括含有比色标度的支承物。
14.根据权利要求10至12中任一项所述的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒还包括便携式比色计或便携式光度计。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒还包括过滤器元件，所述过滤器元件具有直径为35至65微米(μm)范围内的孔。
16.根据权利要求15所述的诊断试剂盒，其中，所述过滤器元件是亲水性聚乙烯过滤器。
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