JP2018500559A - テザー粒子に基づくバイオセンサ - Google Patents

Abstract

テザー粒子運動を用いて検体をセンシングするための方法を提供する。機能化粒子（５００）は、該粒子が表面に結合された第１の状態（５０４）と、該粒子が前記表面に結合されていない第２の状態（５０２）とを有し、該粒子は、前記検体の存在の有無に応じて前記第１の状態と前記第２の状態との間で切り替わり、これにより、前記検体の存在の有無に応じて機能化粒子の運動特性が変化する。機能化粒子の空間座標パラメータは、検出器（５１６）により測定され、プロセッサ（５１８）は、測定された空間座標パラメータに基づき検体の存在／濃度を判定する。【選択図】図５

Description

本開示は、概して、テザーにより表面に結合した機能化粒子の運動の変化に基づいた検体の存在の検出に基づくバイオセンサ技術に関する。

生化学的マーカーのバイオセンシング理論の大部分は、サンプル（例えば、血液、唾液、尿、粘液、汗、脳脊髄液など）を取得して生体外の人工装置（例えば、プラスチックの使い捨て式）に移して行われるインビトロ診断で使用するために開発されてきた。このようなバイオセンシング分析では、様々なサンプル前処理ステップ（例えば、分離または希釈ステップ）や、様々な試薬が用いられる（例えば、標的増幅、信号増幅、または洗浄ステップのために）。インビトロ・バイオセンシング分析の例としては、免疫学的検定、核酸試験、電解質及び代謝物の試験、電気化学的分析、酵素活性分析、細胞ベース分析などが挙げられる（非特許文献１参照）。

インビボ・バイオセンシングでは、センサシステムの少なくとも一部を、人体、例えば、皮膚の表面、内部、若しくは下側、または人体の他の部位の表面、内部、若しくは下側に接続または挿入したままにする。バイオセンサと生体との間の接触に起因して、インビボ・バイオセンシングでは、生体適合性についての高い要求が設定され（例えば、炎症プロセスは最小限に抑えるべきである）、また、センサシステムは、生体の複雑な環境内で確実に動作しなければならない。モニタリング用途においては、センサシステムは、２以上の測定を経時的に実施できるべきであり、また、センサシステムは、ロバストであり、かつ装着が容易であるべきである。

インビボ生化学センシングの重要な用途は、持続グルコースモニタリング（ＣＧＭ：continuous glucose monitoring）である。市販の持続グルコースモニタリングデバイスは、酵素電気化学センシングに基づいている（例えば、非特許文献２参照）。酵素センシングは、親和性に基づくセンシングよりも一般的ではない。インビボ・グルコースモニタリングの市販システムは、デックスコム・アンド・メドロニック社（Dexcom and Medtronic）から入手可能である。現行のＣＧＭシステムの短所は、センサ応答がドリフトを示すことであり、このため、システムは、インビトロ・血液グルコース試験（レビューに関しては、例えば、非特許文献２参照）による定期的な較正を必要とする。

いくつかの粒子ベース・バイオセンシング技術が当分野において既知であり、例えば、光散乱による検出に基づく技術が挙げられる（例えば、非特許文献３参照）。特許文献１には、粒子ベース・バイオセンシングシステムにおいて、様々な結合タイプを特徴付ける方法が記載されている。非結合粒子が、センシング面に標的依存性の態様で結合し、その後、結合／フリー分離（bound-free separation）が実施される（洗浄ステップ）。その後、結合タイプを特徴付けるために（例えば、特異的な結合粒子と非特異的な結合粒子とを区別するために）、結合粒子から散乱された光の強度の変動を測定する。非結合粒子の使用、及び結合／フリー分離プロセスは、インビトロ診断に有用である。しかしながら、インビボ用途では、非結合粒子は、安全上のリスクをもたらし、また、結合／フリー分離プロセスをインビボ状況において実施することは困難である。

上記の問題点は、テザー粒子運動（ＴＰＭ：tethered particle motion）に基づくバイオセンシング技術によって回避することができる。このＴＰＭ技術は、テザーにより表面に結合した粒子の運動の測定に基づくものである。一例は、非特許文献４であり、これには、タンパク質がどのようにしてＤＮＡの立体構造を変化させるかを明らかにするために、ＤＮＡテザーに結合されたタンパク質についてのＴＰＭ実験が報告されている。このような研究では、テザーを介さずに表面に結合される粒子を避けるための対策が取られる。テザー以外の方法で表面に結合した粒子からは、テザーに関する情報が得られないからである。一例は、非特許文献５である。

表面に結合された機能化テザーを有するバイオセンサが、テザーにより表面に結合した粒子の運動は検体の存在に依存して変化するという理論に基づいて開発されてきた。前記運動は、検体の存在によるテザー自体の構造の変化に起因して変化する。また、テザーにより表面に結合した機能化粒子の、検体の存在に従う運動学的特性の測定により検体を検出する技術も存在する。これらの技術では、表面に結合される粒子を避けることが重要である。立体障害は、検体の影響を受ける感度に影響を及ぼすからである。

米国特許出願第２０１２／１８４０４８号明細書

Tietz, Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 2005 Heo and Takeuchi, Adv.Healthcare.Mat. 2013, vol. 2, p. 43-56 Bruls et al., Lab Chip 2009 Laurens et al., Nucleic Acids Res. Sep 2009; 37(16): 5454-5464 Blumberg et al., Biophysical Journal 2005; 89, 1272-1281

一態様では、本発明は、テザーにより表面に結合した機能化粒子の運動の変化の検出に基づくバイオセンシング技術であって、検体の存在により、粒子が、表面への結合状態及び非結合状態間で変化する技術を提供する。表面への結合が望ましくない既知のテザー粒子ベース・バイオセンシング技術とは対照的に、本発明によれば、検体により、テザー粒子が、表面への結合状態及び非結合状態間で変化する。これは、表面への結合を避けるべきだと明確に教示するテザー粒子運動研究における従来の知見と比べると、驚くほど対照的である。

本発明は、高感度であり、特異的であり、安定的であり、生体適合性を有し、かつフレキシブルな、インビボ生化学的モニタリングのためのバイオセンシング技術を提供する。このバイオセンシング技術には様々な用途があり、例えば、センサシステムの定期的な再調整を必要としない糖尿病患者のための持続グルコースモニタリング、例えば救命救急診療における電解質及び代謝物が不安定な患者において重要である電解質及び代謝物のモニタリング、例えば心臓病患者における腎機能のモニタリングに有用な電解質測定、心臓機能のモニタリングに有用であり得るタンパク質測定（例えば、ＢＮＰは心不全のキーマーカーである）、薬剤摂取（服薬順守）及び／または薬学動態（薬剤を望ましい濃度ウィンドウ内に保つことを目的とする）のモニタリングに有用な薬剤及び／または薬剤代謝産物の測定、薬剤の有効性をモニタリングするのに有用な薬剤応答測定、並びに、疾病管理、治療制御、服薬順守モニタのためのモニタリングが挙げられる。加えて、本発明に係る方法は、例えばインビトロ診断、ポイントオブケア検査、環境試験、食品試験、フォレンジック（forensics）などの分子バイオセンシングにごく一般的に用いることができる。本発明はまた、生物学的、生体医学的、及び薬学的研究（例えば、生体細胞、組織、器官の分析をモニタするために）に用いることができる。検体は、電解質、小分子、脂質、炭水化物、ペプチド、ホルモン、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであり得る。

一態様では、本発明は、テザー粒子運動を用いて検体をセンシングするための方法を提供する。本方法は、表面とテザー分子とを有するセンサデバイスであって、テザー分子の第１の端部が表面に結合されており、テザー分子の第２の端部が機能化粒子に結合されているセンサデバイスに、検体を含んでいるマトリックスを接触させるステップを有する。機能化粒子は、該粒子が表面に結合された第１の状態と、該粒子が表面に結合されていない第２の状態とを有し、該粒子は、検体の存在の有無に応じて第１の状態及び第２の状態間で遷移し、これにより、検体の存在の有無に応じて機能化粒子の運動特性が変化する。本方法はまた、表面に対する機能化粒子の空間座標パラメータを測定するステップと、測定された空間座標パラメータの変化に基づき検体の存在／濃度を判定するステップとを有する。

空間座標パラメータは、いくつかの実施形態では、機能化粒子及び／または表面を照明し、機能化粒子及び／または表面からの光放射を検出し、光放射に基づき機能化粒子の表面に対する位置、方向、及び／または速度を求めることにより測定される。

空間座標パラメータは、いくつかの実施形態では、機能化粒子及び／または表面の自由電荷キャリアを励起し、機能化粒子及び／または表面からの光放射を検出することにより測定され、励起及び／または検出は、機能化粒子及び／または表面のプラズモン共鳴の近傍の波長で実施される。検体の存在／濃度は、検出された光放射の変化を測定することにより判定される。自由電荷キャリアの励起は、５ｎｍよりも大きい線幅を有する光源または高輝度発光ダイオードからの光線で励起することにより実施される。

いくつかの実施形態では、検体の存在／濃度は、粒子局在の分布の変化、局在パターンの面積の変化、または粒子局在間のステップサイズの変化に基づき判定される。

いくつかの実施形態では、検体の存在／濃度は、背景ノイズを抑制し、特異性を向上させるために、ヒストグラム及び／またはヒストグラム処理を実施することにより判定される。

本発明の一実施形態に係る、テザー粒子バイオセンシング技術の基本的構成要素を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、テザー粒子バイオセンシング技術の非結合状態を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、テザー粒子バイオセンシング技術の結合状態を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、テザー粒子バイオセンシング技術の結合状態を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、テザー粒子バイオセンシング技術の非結合状態を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、テザー粒子バイオセンシング技術の非結合状態を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、テザー粒子バイオセンシング技術の結合状態を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、光学励起を用いた標的検体の存在のセンシング、及びテザーナノ粒子におけるプラズモン共鳴シフトの検出を行うためのシステムを示す概略図 本発明の実施形態に係る、顕微鏡法と分光法とを組み合わせた実施例を示す図 本発明の実施形態に係る、顕微鏡法と分光法とを組み合わせた別の実施例を示す図 本発明の一実施形態に係る、べき乗則による平均結合率と検体濃度とを示すグラフ 本発明の一実施形態に係る、非結合テザー粒子を示す概略図 サンプリング期間中における非結合テザー粒子のｘｙ平面におけるプロット位置を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、結合テザー粒子を示す概略図 サンプリング期間中における結合テザー粒子のｘｙ平面におけるプロット位置を示す概略図 本発明の一実施形態に係る、粒子運動測定のためのバイオセンシング装置を示す図 本発明の一実施形態に係る、粒子運動パターンを検出するために分析される一連の粒子位置の画像を示す図 本発明の一実施形態に係る、非結合状態及び結合状態間の遷移を示す粒子の一連の運動パターンを示す図 本発明の一実施形態に係る、時間に対するステップ（または面積）関数のグラフであり、結合状態及び自由状態間の変化を検出するのに使用される２つの閾値を示す 本発明の一実施形態に係る、様々な時間ウィンドウについての位置点の収集に関連する凸包を示す図

本発明の実施形態は、インビボ用途のバイオセンシングの設計に関連する下記のいくつかの洞察により動機付けされた。（ｉ）粒子は、可検出性、安定性、及び生体機能化オプションを有するため、粒子を使用することは有益である。（ｉｉ）非結合粒子よりもテザー粒子を使用することが有益である。（ｉｉｉ）バイオセンシング技術において、テザー機能と結合機能とが互いに分離されていることは有益であり得る。

本発明に実施形態によれば、テザー粒子と表面との相互作用が中心的な役割を果たすテザー粒子技術が提供される。テザーの機能は、テザー粒子を表面に接近した状態に保つことであり、これにより、生物学的センシング情報を生成するテザー粒子及び表面間の標的調節相互作用の測定が可能となる。

本発明の一実施形態に係るバイオセンシング技術の基本的構成要素が図１に示されている。バイオセンサデバイスは、標的検体１１０を含むマトリックスに対して露出される表面１００を有する。テザー分子１０２は、その第１の端部が表面１００に結合されており、その第２の端部が、部分１０６により機能化（官能化）された粒子１０４に結合されている。表面１００は、別の部分１０８により機能化（官能化）される。あるいは、部分１０６または部分１０８のいずれかが、テザーと共役され得る。両部分の機能化は、標的検体１１０がそれらと結合するように選択される。前記両部分の粒子及び基板との共役及び連結は、前記両部分が検体特異的な生物学的結合活性を有することによりなされる。図２Ａ−Ｂは、標的検体１１０の存在の有無に応じた、図１のシステムの２つの状態を示す。図２Ａに示した状態では、検体１１０は存在しておらず、テザー粒子１０４は、テザーにより制限された範囲で、自由に動くことができる。図２Ｂに示した状態では、検体１１０は存在しており、部分１０６及び１０８に結合している。これにより、テザー粒子１０４は表面１００に結合される。その結果、機能化粒子１０４の運動は、検体１１０の存在の有無に応じて、結合状態と非結合状態との間で変化する。部分１０６または部分１０８のいずれがテザーに共役されている場合は、検体１１０が部分１０６及び１０８に結合すると、機能化粒子１０４の運動は、運動自由度がより高い状態（「非結合」状態または「粒子が表面に結合されていない」状態と称する）と、運動自由度がより低い状態（「結合」状態または「粒子が表面に結合された」状態と称する）との間で変化する。

この実施形態の実施例では、２つのエピトープを有する標的検体１１０が、粒子１０４及び表面１００に結合された抗体またはその断片により測定される。あるいは、部分１０６及び部分１０８が抗体特異性エピトープ（例えば、ペプチドエピトープ、ミミトープ）または天然タンパク質を表す場合は、抗体はその２つの抗原結合領域が部分１０６または部分１０８に結合することによりサンドイッチ複合体（図２Ｂ）を形成することができるため、これにより、抗体検出が可能である。あるいは、分子対（部分１０６と部分１０８）の結合は、検体により誘導することができる（２つの金属結合領域間の金属結合、または核受容体リガンド結合領域におけるリガンド誘導性補因子補充として）。

本発明の別の実施形態が、図３Ａ−３Ｂに示されている。この実施形態では、図３Ａに示すように、部分１０６及び部分１０８は、標的検体１１０が存在しない場合に互いに結合するように選択される。したがって、図３Ａでは、テザー粒子１０４は、結合状態にある。図３Ｂに示すように、標的検体１１０が存在する場合は、検体との優先結合に起因して、部分１０６及び部分１０８は互いに結合していない。したがって、図３Ｂでは、テザー粒子１０４は、非結合状態にある。部分１０６及び部分１０８は、検体結合分子及び検体類似物であり得る。

この実施形態の実施例では、例えば粒子上の少なくとも１つの特異的捕捉分子と基板上の標的類似体、またはその逆により、１つのエピトープを有する標的検体１１０が測定される。

図４Ａ−４Ｂに示す別の実施形態では、部分１０６は含まれない。この実施形態では、標的検体１１０は、粒子１０４の立体障害の変化を誘導する。図４Ａに示す、検体が存在しない状態では、テザー粒子１０４は、立体障害が小さい状態である。図４Ｂに示す状態では、検体１１０が部分１０８と結合した結果として、テザー粒子１０４は、立体障害が大きい状態となる。この実施形態の変形例では、部分１０８を含まず、その代わりに部分１０６を含んでおり、この場合も同じ動作理論が当てはまる。

この実施形態の実施例では、標的検体１１０は、立体障害を介して測定される。標的の粒子及び／または基板への結合は、粒子によりアクセス可能なパラメータ空間を変化させる。

本発明の任意の実施形態では、検体の検出は、中間反応カスケードを介して、間接的に行ってもよい。例えば、酵素が検体と反応して生成された生成物が、粒子及び／または基板表面上の生化学部分と反応し、それによりコロイド・分子粒子・テザー・表面システムの座標パラメータを変更する。本説明の文脈において、検体の検出は直接的または間接的であり得、間接的な検出の場合は、検体により生成された生成物は、検出される検体としての役割を果たす。

一般的に、本発明の実施形態に係る、流体または他のマトリックス中の検体の検出のためのバイオセンシングデバイスは、少なくとも１つのテザーにより互いに接続された少なくとも２つの物体（すなわち、表面及び粒子。表面は、粒子として具現化されることもある）を含む。テザーは、この２つの物体を互いに接近した状態に維持する。このことは、出会い周波数及び有効濃度、並びに、正確な光検出に有利である。

粒子は、好ましくは、５マイクロメートル（μｍ）未満の最長寸法を有する。より好ましくは、粒子径は、３ｎｍ〜５μｍの範囲である。好ましい粒子は、例えばプラズモン共鳴特性を有する金ナノ粒子または強い蛍光特性または散乱特性を有する粒子などの、強い光学特性を有する粒子である。好適な粒子材料の例は、有機材料（例えばポリマー）、無機材料（例えばシリカ）、金属（例えば金）、またはそれらの組み合わせである。

粒子を使用することの利点としては、安定性及び高強度の光信号が挙げられる。前記２つの物体のうちの少なくとも一方は、その表面に少なくとも１つの生化学部分を備える。生化学部分は、前記物体に対して生化学的特異性を付与する。

実施の際は、前記２つの物体の互いに対する相対位置を代表する座標パラメータが測定される。一般性を失うことなく、本発明の実施形態は、一方の物体（すなわち表面）を静止座標とし、それに対して他方の物体（すなわち粒子）が運動するものとして説明する。
表面はまた、曲面、凸面、または凹面であってもよい（例えば、粒子の表面）。検体は（存在する場合）、前記２つの物体の一方または両方に結合し、それにより、テザー粒子の運動を変化させる。その結果、検体の存在下では、空間座標パラメータの性質が変化する。したがって、測定された座標パラメータの性質の変化に基づき、検体の存在及び／または濃度を判定することができる。

空間座標パラメータは、例えば、空間（ｘｙｚ）内の粒子の位置、表面に対する粒子の方向、及び／または、それらの時間依存性（それらの時間導関数、例えば粒子の角速度や線速度などを含む）であり得る。座標パラメータの特性は、例えば、空間及び／または速度分布関数の特性であり得る。好ましくは、前記少なくとも２つの物体の互いに対する座標パラメータと、その座標パラメータの変化とが光学的に測定される。

様々な粒子の時間依存性挙動を粒子毎に測定できるように、検出は単一粒子分解能で実施されることが好ましい。このことは、個々の粒子に対して信号処理を実施し（例えば、結合状態及び非結合状態のヒストグラムを作成するために）、高統計量のフィルタアルゴリズムを提供する（例えば、特異的結合と非特異的結合とを区別するために）ことを可能にする。単一分子分解能は、高感度及び低濃度検出を可能にする。基本的単一分子限界に達すると、分子結合及び／または変換プロセスから最大データが収集され、最適な統計及び最適な精度が得られる。

本発明に係るデバイスは、統計データを収集し、それにより、信頼性、感度、及び速度を向上させるために、同一表面上にテザー粒子のアレイを含むことが好ましい。

本発明の実施形態はまた、防汚コーティング、ゲルバイオセンシング、中和層、フィルタ機能、選択的透過層、空間多重化、粒子ベース多重化、較正、制御、光学検出の可能性を含み得る。本発明の実施形態は、望ましくないプロセスを阻止及び低減させるための対策、及び、信号生成の効率、安定性、及び特異性を向上させるための対策を含み得る。

本発明の実施形態は、複合流体（例えば、血液、唾液、皮膚間質液）中の検体濃度のリアルタイムな測定を可能にする。高分析感度のために、単一分子分解能を実現すべきである。さらに、非特異性相互作用と特異的相互作用とを区別することにより、高い特異性が達成され得る。このことにより、理想的にはサンプル取得または中間のフィルタステップを繰り返すことなく、複合流体の直接的かつリアルタイムな一連の測定が可能となる。

提案されたバイオセンサの重要な利点は、生化学的な親和性に基づいていることであり、これにより、一般的に使用することや、幅広い様々な分析が可能となる。

特定の一実施例では、本発明に係るセンシングシステムは、例えば粒子または基板上のグルコース結合タンパク質を有する競合フォーマットにおける、例えばグルコースモニタリングなどの連続的な検体モニタリングを実施するために使用される（例えば、アポグルコースオキシダーゼ、ペリプラズム輸送タンパク質、または他のグルコース結合分子）。

本発明の商業用途には、インビボ・バイオセンシングが含まれるが、インビトロ・バイオセンシングも含まれる。本発明の実施形態は、粒子ラベルに基づく、かつ単一粒子及び単一分子分解能を有する次世代のバイオセンサの開発に利用することができる。

あるいは、本発明に係るセンシングデバイスは、医療処置中のフィードバックシステムの一部であり得る（例えば、内視鏡、チューブ、ニードル、ファイバ、カテーテル、パッチのためのセンサ）。

本発明に係るバイオセンシング技術はまた、とりわけポイントオブケア検査のための、インビトロ診断検査に関連する。これは、特定の分子結合プロセスにより光学手段（少しの化学的／生化学的／流体的処理をさらに含み得る）で検出可能な信号が生成される場合に有利である。

本発明の別の態様では、本発明に係るセンシング技術は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロの用途に使用される。本発明の別の態様では、本発明に係るセンシング技術は、ヒト対象、または非ヒト対象の用途に使用される（例えば、獣医学的用途に、または他の生物系の試験のための）。本発明の別の態様では、本発明に係るセンシング技術は、対象または生物系と接触させて使用する使い捨て式のプローブの一部である。

本発明の別の態様では、センシング技術は、使い捨て式のカートリッジ（例えば、ラボオンチップ（lab-on-a-chip）カートリッジ、または実験室ベースの試験で使用される使い捨て式カートリッジ）、または他の使い捨てのチューブ、ニードル、カテーテル、パッチを含む。本発明の別の態様では、使い捨て式のプローブまたはカートリッジは、電力供給、駆動、情報読み取りのために、機器または分析装置に取り付けられる。本発明の別の態様では、前記機器は、前記プローブまたはカートリッジからの信号の処理、前記機器と前記プローブまたはカートリッジとの間のデータ通信、及び／または、前記機器と例えば情報システムまたは通信ネットワークとの間のデータ通信を行うのに適している。

本発明に係るセンシングシステムは、（生）化学的及び／または物理的センシングを含む疾病管理システム、データの収集及び処理用のシステム、及び物理的及び／または（生）化学的駆動用のシステムの一部であり得る。本発明に係るシステムは、治療システム、例えば、薬剤（糖尿病の場合はインスリン）を投与するデバイス、または別の方法で身体に影響を与えるデバイス（例えば、器官に対して物理的な刺激（例えば電気的刺激）を提供するデバイス）と、閉ループフォーマットで接続され得る。

図５は、テザー粒子５００の空間座標パラメータを光学的に励起及び検出するためのデバイス及び技術を示す概略図である。テザー粒子５００の空間運動特性は、標的検体の存在の有無に応答して、非結合状態５０２と結合状態５０４との間で変化する。

本発明に係るデバイスは、様々な形態を示すことができる。例えば、（ｉ）プラズモン粒子が基板にテザーにより結合した形態であり、プラズモン粒子のプラズモン共鳴は、基板に対する座標パラメータの関数として変化する。（ｉｉ）散乱粒子が、基板に強固に結合したプラズモン粒子にテザーにより結合した形態であり、プラズモン共鳴は、プラズモン粒子に対する散乱粒子の座標に従って変化する。また、プラズモン粒子がプラズモン粒子にテザーにより結合した形態も可能な実施例であり、プラズモン共鳴は、この２つの粒子間の空間座標の変化に応じて変化する。

以下では、ガラス基板に結合したプラズモンナノロッドに対する抗体の結合により、ナノロッドのプラズモン共鳴が変化するデータについて説明する。このデータは、単一の結合事象（抗体、溶液中で自由な他の粒子、またはテザー粒子についての）がどのようにして記録され、いくつのセンサが平行して経時的にモニタリングされるかを説明するためのものである。

テザー粒子５００が、フローセル５０８内のカバーガラス（カーバースリップ）上に固定される。レーザ５１２からの照明ビーム５１０が、フローセル５０８の壁内で全内部反射を受け、粒子５００のプラズモンを励起する。テザーナノ粒子の光散乱信号５１４が、暗い背景上に表示することにより高い信号／ノイズ比を確実にする光学検出器５１６に導かれる。その後、プラズモンシフトにより、検出される信号強度が変化する。プロセッサ５１８は、検出器５１６からの信号を分析して、標的検体の存在を示す、標的検体の空間座標パラメータを求める。

検出器５１６は、多数の個々のテザー粒子を画像化することができる電子倍増型電荷結合素子（ＥＭ−ＣＣＤ）であり得る。あるいは、マイクロ秒の積分時間を達成するために、単一のテザー粒子の散乱強度が、アナログのフォトダイオード上に投影され得る。

本発明に係る検体バイオセンシング技術は、非常に小さい標的濃度の高感度な検出を可能にする。この技術は、単一分子の検出を可能にすることにより、非常に高い感度を有することとなる。この技術の感度は、アンサンブル平均法よりも非常に高い。単一分子分解能は、分子毎の、特異的（強く長い）な相互作用と、非特異的（弱く短い）な相互作用との区別を可能にするからである。

本発明の実施形態は、暗視野散乱分光法の技術を用いることができる。特に、プラズモン粒子のプラズモン共鳴ピークの変化を動的に測定するために、好ましくは５ｎｍよりも大きい線幅を有する、明るい低時間的コヒーレンス光源（例えば、高輝度発光ダイオード）を使用する技術を用いることができる。

例えば金属ナノ粒子などの散乱物体の検出方法の大部分は、物体が背景よりも高い強度を有する画像を得るために、暗視野照明を用いる。小粒子（金の場合は直径が１００ｎｍ未満）の場合、散乱信号は、半径の６乗で減少し、背景により迅速に埋没する。そのため、小物体の画像化は、十分な信号を得るために高い放射照度を必要とする。

散乱物体の画像化及び／または分光法は、通常は、非コヒーレント白色光源により実施される（放射帯域＞１０００ｎｍ）。これは、一様な低い背景に対しての散乱物体の画像化を可能にし、同一の照明装置を使用して様々な波長で散乱信号を測定することにより広帯域の散乱スペクトルを抽出するのに使用することができる。一般的に使用される光源は、白熱灯（例えばハロゲン）、またはアーク放電源（例えばキセノン）である。これらの光源の主な短所は、放射面積が広く（＞１ｍｍ^２）、サンプルの高い放射照度を実現する光線のタイトな焦点合わせができないことである。

このことを解決する方法の１つは、例えばレーザなどの狭帯域のコヒーレント光源を使用することである。高コヒーレント及び低帯域幅（一般的には＜１ｎｍ）は、サンプルの高い放射照度を実現する光線のタイトな焦点合わせを可能にする。しかしながら、コヒーレントレーザ照射には限界があった。（１）干渉縞により、不均一な照明パターンが生じ、（２）小さいスプリアス反射及び／または光学装置における光漏れにより、画像における背景アーチファクトが生じるからである。このようなアーチファクトは、信号／ノイズ比を著しく減少させ、また、光学装置の振動及び熱ドリフトに起因して経時的に変化する。

このようなバイオセンシング用途では、白色光源またはレーザが、スペクトルシフトの測定に有用であることが知られている。白色光源は、ナノ粒子の線幅Гよりもはるかに大きいスペクトル幅Ｂを示すので（すなわち、Ｂ＞＞Г）、分光計を使用して、全スペクトルを一度に測定することができる。そして、スペクトルのシフトは、その後のスペクトルを分析することにより抽出される。一方、スペクトルシフトはまた、ナノ粒子の線幅よりもはるかに狭い光源、例えばレーザ（Ｂ＜＜Г）を使用して測定することもできる。時間依存性の散乱信号は、物体のスペクトルがシフトしたときに変化する。しかしながら、高輝度発光ダイオード（ＳＬＤ）は、ナノ粒子の線幅と同様のスペクトル幅を示すので（すなわち、Ｂ〜Г）、ナノ粒子のスペクトルシフトを動的に測定するためのＳＬＤの使用は予期されるものではない。光学的コヒーレンストモグラフィは照明のためにＳＬＤも使用するが、サンプルのスペクトル変化を測定することは意図していない。また、様々なプラズモン共鳴を有する粒子が使用されるが、共鳴波長は一定であり、経時的に変化しない。したがって、ＳＬＤを使用したプラズモンの動的挙動の測定は、予期されるものではない。測定される共鳴の線幅よりもわずかに狭い帯域幅を有する光源を選択することは、直感的ではないからである。

金属ナノ粒子の線幅は、一般的に、４０−５０ｎｍである。ハロゲンランプなどの白色光源は、ナノ粒子よりもはるかに広い線幅を有する。レーザはナノ粒子よりもはるかに狭い線幅を有する。一方、一般的なＳＬＤの線幅は、発光波長に応じて通常は１５−３０ｎｍであり、ナノ粒子の線幅に相当する。

図６Ａ及び図６Ｂは、散乱物体６０２の時間依存性画像化のための、明るい低コヒーレンス光源である高輝度発光ダイオード（ＳＬＤ）６００を使用する顕微鏡検査及び分光法の組み合わせの２つの実施例を示す。本発明の実施形態のバイオセンシング技術では、時間依存性信号は、検体の存在を示す散乱物体のプラズモン共鳴ピークのシフトを表す。レーザ光と比較してコヒーレンス長さが短いＳＬＤ光６０４は、干渉に起因するアーチファクトを大幅に低減させる。一方、ＳＬＤの輝度は、一般的なダイオードレーザと同様である。

このビームの低コヒーレンス及び中間帯域幅（例えば、近赤外波長で１５−３０ｎｍ）は、均一な照明及び低背景強度をもたらす。高輝度及び小さい放射面積（例えば、単一モードファイバーに結合した場合は３０μｍ^２未満）は、高放射照度を確実にする。高輝度発光ダイオードで照射された物体からの散乱信号は、背景と比較して高強度であり、短い時間スケールでも長い時間スケールでも安定的である。

図６Ａでは、ＳＬＤ６００は、流体セル６０６のガラス／水界面での全内部反射の角度よりも大きい角度で、サンプル６０２を照射する。この実施例では、光６０４は、ガラスプリズム６０８を介して、サンプル６０２に入射する。図６Ｂに示す別の実施例では、光６０４は、対物レンズ６１０の後側開口を介して、サンプル６０２に入射する。図６Ａの実施例では、励起及び照射の光経路は別々であるため、図６Ｂの実施例と比較して、より低い背景強度、及びより高い信号／ノイズ比が得られる。図６Ｂの実施例は、サンプルの上方の空間が例えば温度調節のための技術的構成要素などの他の目的に使用される場合に有用である。両方の実施例において、照明角度は、セル６０６のガラス／水界面での全内部反射の角度よりも大きいため、励起光は全て反射される。粒子６０２の存在は、全内部反射を乱すので、対物レンズにより部分的に収集され、画像センサ６１４に送られる散乱光６１２に特定の強度をもたらす。反射ビームは、ビームブロックにより遮られ、残りの散乱光は、画像検出器６１４、好ましくは単一分子分解能を実現するのに十分なダイナミックレンジ及び波長感度を有するカメラに送られる。別の実施形態では、サンプル６０２は、複雑な生物環境において測定を直接的に実施することを可能にするために、光学プローブ（例えば、光学ファイバまたは導波管）上に載置される。検出器６１４からの信号は、その後、標的検体の存在を検出するために、プロセッサ６１６で分析される。

分析は、例えば、結合分析、競合分析、置換分析、サンドイッチ分析、酵素分析、標的及び／または信号増幅による分析、多段階分析、分子カスケードによる分析などを含む。分析は、様々な性質、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物などの部分の認識を含む。本発明の実施形態は、様々な較正方法、制御、多重化などを含む。本発明の実施形態は、望ましくないプロセス（例えば、背景信号を生成する非特異的プロセス）を阻止及び低減させ、信号生成の効率、安定性、及び特異性を向上させるための対策を含む。

本発明の実施形態は、検体の存在の有無に応じて光学特性が個別に変化する多数のナノスケール検出器を使用して、マトリックス中の検体をバイオセンシングするためのシステム及び技術を含む。好ましい実施形態では、例えば、単一分子感受性を各々有する数百個の金テザーナノ粒子に基づくプラズモンバイオセンサが、暗視野顕微鏡装置によりリアルタイムで同時にモニタされる。

プラズモンバイオセンサは、暗視野顕微鏡装置によりリアルタイムで同時にモニタされる、単一分子感受性を各々有する数百個の金テザーナノ粒子を含む。このアプローチは、検体のラベル付けを必要とせずに、単一分子の相互作用の統計的分析を可能にする。待ち時間の分布は、濃度依存性であり、ポアゾン統計に従う。一実施形態では、数百個のナノ粒子を同時に測定する能力は、センサに、濃度においての７０倍のダイナミックレンジを提供し、分子間相互作用の不均一性の研究を可能にする。

単一分子の検出は、平均の代わりに分子特性の統計的分布が得られ、まれな事象や非同期的な事象を明らかにするので、アンサンブル平均技術に対して明白な利点を有する。本発明の好ましい実施形態は、標準的な顕微鏡装置における全内部反射励起を使用した、数百個の単一分子プラズモンテザーナノ粒子をリアルタイムでモニタリングするための技術を含む。

図６Ａ及び図６Ｂに示した実施形態の一実施例では、高輝度発光ダイオードは、７９５ｎｍの中心波長、１４ｎｍの帯域幅、３５ｍＷの最大出力を有するスーパールム（Superlum）である。検出器６１４は、例えばサンプル表面上に５０×５０μｍ^２の面積を有する電荷結合素子（ＣＣＤ）である。

基板上の粒子の密度は、顕微鏡の１００×１００μｍ^２の視野内に１５０−２５０粒子が存在するように、スピンコーティング中の濃度により制御することができる。各粒子部位は、（ａ）照射波長における様々な散乱断面をもたらす粒子量及びアスペクト比の避けられないばらつき、及び（ｂ）部分的に偏光されたエバネッセント場における各粒子の様々な向きに起因する、様々な散乱強度を示す。この技術で信号ナノロッドを測定できることを確認するために、全ての粒子の白色散乱スペクトルを記録した。粒子の１０％未満が、クラスタ状態であり、分析から除外した。

光源としての高輝度発光ダイオード（ＳＬＤ）を使用することは、十分な信号／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を実現するために重要である。白色灯からの光の低空間的コヒーレンスは、小粒子を画像化するのには、強度が不十分である。一方、レーザ照明の高時間的コヒーレンスは、信号変動を誘起する干渉アーチファクトをもたらす。ＳＬＤは、増幅された自然放出を生成する高ゲイン半導体デバイスである。この用途では、ＳＬＤの低時間的コヒーレンスは、干渉アーチファクトを著しく減少させ、一方、高空間的コヒーレンスは、高い照明強度を確実にする。これにより、１００ｍｓの積分時間について、ショットノイズ限界信号が得られる。

一般的な、単一分子実験では、検体は、シリンジプンプを使用してフローセル中に導入される。ＣＣＤカメラを使用して、時間依存性の散乱信号（各フレームにおける各スポットの２次元ガウスフィットにより求められる）が記録される。テザーナノ粒子運動の変化に関連するプラズモンシフトが、その後、ステップ解析アルゴリズムを使用して時間の関数として正規化された散乱強度における階段状変化として観察される。信号における階段状変化は、単一抗体の確率論的な結合を示す（抗体濃度１０ｎＭ）。階段状変化のサインは、照射源の波長に対するプラズモン波長に依存する。ステップの大きさは、１％から５％へ変化する。ステップサイズの変化は、位置及び向きの差異を示す。検体結合に起因する信号のサインは、ＳＬＤ波長に対するプラズモン波長に依存する。プラズモン波長がＳＬＤ波長よりも短い粒子の場合、プラズモンのレッドシフトが、散乱信号の増加を引き起こし、プラズモン波長がＳＬＤ波長よりも長い粒子の場合は、反対の挙動を示す。粒子の断片は、プラズモン波長がＳＬＤ波長に近いので、信号の階段状変化は示さない。この理由により、分析は、７７５−８１５ｎｍのプラズモン共鳴を有する粒子を除外して行う。また、背景、または粒子の近傍のグラス表面に結合した検体のドリフトの結果であると考えられるＳ／Ｎが２未満のステップ（検体注入前の信号のステップサイズと標準偏差との比として定義される）も除外する。

データに対するフィットを探すステップから、プロセッサは、ステップ間の平均待ち時間であるτの値を推定することができる。図７のグラフに示すように、待ち時間の分布は、べき乗則に従った検体濃度に依存する平均結合割合とともに、ポアソン統計に従う。

検出された散乱強度は、各フレームにおける粒子の回折限界スポットを２次元ガウス分布でフィッティングすることにより得られる。より明るい粒子の場合、Ｓ／Ｎ（１５０秒間での信号の平均と標準偏差との比として定義される）は増加する。このＳ／Ｎは、ショットノイズ限界を、ＳＬＤ強度の変動及びサンプルの若干の物理的シフトによって生じ得る過剰雑音に接近させる。これらの測定から、１０５カウント／秒を超える積分強度を有する粒子については、１％の階段状の信号変化を、３−５のＳ／Ｎで検出できると結論付けられる。

検体濃度の測定精度は、計数統計により制限される。例えば、約１／√１００＝１０％の濃度測定精度を得るためには、規定の時間ウィンドウ内で少なくとも１００個の粒子を検出する必要がある。小粒子は、その表面に有するレセプター分子の数が限られているため、個々の粒子は、限られた数の検体粒子しか捕捉できない。さらに、検体濃度が非常に低い場合は、培養時間が長くても、単一粒子が、単一の検体分子さえも捕捉できない可能性が高い。この問題を解決するために、本発明の好適な実施形態に係るバイオセンシングシステムは、少なくとも１００個のテザー粒子を有し、個々の粒子についてタイムトレースが記録される。各粒子のデータは、検体濃度を測定するために、プロセッサにより組み合わされる。検体濃度が低い場合は、好ましくは少なくとも１０００個の粒子のデータ、より好ましくは少なくとも１００００個の粒子のデータが組み合わされる。

ナノ粒子の製造プロセス中のばらつきに起因して、ナノ粒子は様々なサイズを有し得、それにより、スペクトル特性にばらつきが生じる。この問題を解決するために、例えば金両錐体などの、プラズモン共鳴の分布が本質的に狭い粒子を使用することが好ましい。本発明は、金ナノロッドのアンサンブル線幅（ensemble line-width）は、通常は２００ｎｍ以下であるのに対して、両錐体の溶液の消衰スペクトルのアンサンブル線幅は、５０ｎｍの単一粒子線幅に達することを見出した。このことは、個々の両錐体が、光学的により均一であることを示す。この問題を解決するために、多波長を有するバイオセンシングシステムを使用することが好ましい。好ましい解決法は、例えば波長可変の高輝度発光ダイオードを使用して、様々な波長のタイムトレースを記録することである。

多数の粒子を有するバイオセンシングシステムを持つことが有利である。しかしながら、小型化されたシステムでは、利用可能な表面積は限られている。さらに、光学システムは個々の物体のタイムトレースを記録できる必要があるため、表面上の粒子密度も限られている。この問題を解決するためには、予め定められた割合以上の粒子が、少なくとも光学システムの回折限界によって最隣接粒子から分離されるシステムを持つことが好ましい。この問題を解決するための別の方法は、表面上の粒子を、ランダムではなく、規則的なパターンで分布させることである。表面上の粒子のパターンは、デジタルカメラチップ上のピクセルのパターンと同様のパターンであることが好ましい。長方形のピクセルを有するカメラチップの場合、デジタルカメラは一般的に長方形のピクセルを有し、粒子は長方形格子上に配置されることが好ましい。この問題を解決するための別の方法は、単一粒子がデジタルカメラチップの単一ピクセル上にマップされる光学システムを使用することである。好ましくは、単一粒子は、最隣接粒子により生じるピクセル上の信号よりも少なくとも５倍大きい信号を、単一のピクセルに送る。この問題を解決するための別の方法は、回折限界よりも低い最小間隔で、表面上に別な方法でパターン配置された様々なスペクトル特性を有する粒子を使用することである。様々なスペクトル特性により、粒子の部分母集団を、たとえそれらが回析長さ未満で離間していても選択することができ、単一粒子分解能により様々な部分母集団にタイムトレースを記録することができる。

単一粒子分解能を有する光学検出による粒子ベースのバイオセンシング技術では、ノイズ源となる所望しない粒子様物体を識別して無視することが重要である。この種の粒子様物体は、サンプル汚染またはサンプルの凝集に関連するか、センシング粒子の生化学的性質（例えば、表面機能化）、粒子特性（例えば、形状、光学特性）に起因するか、または、粒子と別の粒子との形態（例えば、複数粒子の凝集、または光学的に解像されない近接する複数の粒子）に起因する。この問題を解決するために、これらの粒子のスペクトル特性は記録され、参照データと比較される。スペクトル特性は、例えば、広帯域光源及び調節可能フィルタ、または波長を調節可能な光源を使用して記録することができる。スペクトル信号は、例えば粒子性質（例えば形状）や粒子形態（例えば粒子のクラスタ）に起因する信頼できない物体を識別するために使用することができる。個々のテザーナノ粒子は、単一の狭いローレンツスペクトルによって特徴付けられ、これにより、スペクトルの線形状及び線幅に基づいてクラスタを除外することが可能となる。また、ナノ粒子のクラスタの散乱スペクトルは、二重のピークを示すか、または明らかなピークを全く示さない。これらのクラスタは、個々の粒子のスペクトルと容易に区別することができ、データ分析から除外される。

この問題を解決するための別の技術は、個々の物体の信号タイムトレースを、複数の他の物体のタイムトレースと比較することである。例えば、ノイズ特性、ドリフト、ステップサイズ、ステップ数、長期間の累積信号に基づき、複数の他の物体と大幅に異なる特徴を有する物体が除外される。

センサのダイナミックレンジは、低濃度限界及び高濃度限界を有する。低濃度限界は、結合率が低いので、統計値を制限する。低濃度については、アクセス可能な最小濃度は、視野内の粒子数により決定される。現行の２次元ガウスフィッテングアルゴリズムでは、６０倍の倍率のための正確なフィットを得るためには、１０×１０ピクセルの関心領域が必要である。５メガピクセル以上の解像度を有するハイエンドのサイエンティフィックカメラでは、最適条件下で、視野内に５０個の粒子の推定数を有する。最も低いアクセス可能濃度は、ｃ〜０．５ｐＭである。より高い検体濃度は、結合の増加割合を示し、全ての単一分子結合事象を解像するのにより高いフレームレート（すなわち、より短い積分時間）を必要とする。ポアソン分布に従う待ち時間に基づき、５０／τのフレームレートが、短時間の分布も解像することを可能にする。入射強度を６４Ｗ／ｃｍ^２から１ｋＷ／ｃｍ^２へ増加させることにより、Ｓ／Ｎをわずかに減少させるだけで、積分時間を６ｍｓへ減少させることができる。達成可能な最大フレームレートは、基本的には、ナノ粒子の光熱加熱により制限される。生化学サンプルの研究については、許容可能な最大温度上昇は約１０Ｋであり、これにより、１０ｋＷ／ｃｍ^２の入射強度が得られると推定される。これは、検体の熱損傷を引き起こすことなく、２０ｆｐｓのフレームレートが実現されることを意味する。このような高いフレームレートは、低親和性相互作用、または約５μＭの検体濃度へのアクセスを可能にする。

単一分子解像能を有するバイオセンシングのためのプローブ（例えば、金属ナノ粒子、誘導体共振器、固体ナノ細孔）は一般的に、プローブあたりの結合部位数の少なさに起因してダイナミックレンジが限定されており、低検体濃度での十分な統計量の蓄積を妨げる。この制限は、本発明の実施形態では、多数のセンサによる並列的な測定により克服することができ、濃度において７０倍の驚くべき推定ダイナミックレンジが得られる。分子の相互作用パラメータの分布を抽出する能力は、ラベル付けされていない分子の集団における不均一性の測定を可能にする。この単純で安価な光学的レイアウトは、センサを、顕微鏡とともに容易に実装することを可能にする。

高検体濃度は、高結合率の結合事象を生じさせる。これは、測定されたタイムトレースで個々の結合事象を解像することを困難にする。また、低親和性相互作用は、解像が困難な短命状態を生じさせる。この問題を解決するためには、高フレームレートを有する光学システムを使用することが好ましい。フレームレート、または積分時間の逆数は、１００ｓ^−１よりも大きいことが好ましく、１０００ｓ^−１よりも大きいことがより好ましい。

粒子の温度は極めて重要である。タンパク質の構造及び活性は、タンパク質が長時間加熱された場合に損なわれるからである。球状タンパク質の大部分は、ｐＨ及び緩衝液条件に応じて、４０℃〜８０℃の範囲の溶融温度を示す。理論モデルに基づいて、粒子温度を１０Ｋ以上上昇させるためには、１０ｋＷｃｍ^−２を超える入射強度が必要であると推定される。

高い信号／ノイズ比及び高フレームレートは、高出力を有する光源を使用することにより実現することができる。しかし、高い光学出力は、サンプル流体において、生化学的物質に影響を与える許容できない温度上昇を生じさせる。この潜在的な問題をモニタするために、システムに光学温度計が一体化され得る。例えば、位相感応カメラの使用や、金属粒子から放射されるブルーシフトのモニタリングが実施される。許容可能な温度を維持するために、入射出力が調節される。

結合事象及び非結合事象に起因する粒子からの光信号のドリフトは、信号の観察を困難にする。この問題を解決するためには、安定的な光散乱信号を生成するが共鳴特性及び分子結合に対する感度を有していない内部基準、例えば表面上で光学活性を有する粒子または別の基準物体を用いて、光信号を連続的または定期的に較正することが好ましい。基準粒子からの信号は、システムの照明状態及び検出状態のための光学基準として用いられる。この基準信号は、光学システムの構成要素のドリフト及び光源の強度の変動により生じた、バイオセンシング粒子からの光信号の変動を補正するために、プロセッサで使用される。表面上の複数の基準粒子の使用は、前記較正をさらに向上させる。参照または基準カーカーの例としては、ポリスチレン球体、ナノパターン化表面構造体、ＰＤＭＳアイランドがある。光信号変動は、例えば結像面（ｚ軸）に対して垂直な光路長の変動により引き起こされる。この問題を解決するためには、システム内に能動的ｚ軸フィードバック及び制御を有することが好ましい。

検体の多重化、すなわち、様々な検体を同時に測定することは、生物医学的な感度及び特異性を高めるのに有利である。このような多重化を提供するために、いくつかの実施形態では、表面に様々なレセプターを有する粒子が使用される。計数統計及び正確さの理由で、粒子の数は、全ての検体について少なくとも１００個以上であり、低結合事象レートの検体が必要な場合はより多くなるようにすべきである（例えば、それが低濃度を有するため、またはレセプターの親和性及び密度に起因して）。この光学システムの最小フレームレートは、最大の（非）結合事象レートを有する検体により決定される。また、いくつかの実施形態では、様々な粒子を混合できるように、様々な光学特性を有する粒子が使用される。粒子は、光学的に区別することができ、かつその表面に様々なレセプターを有する少なくとも２つの部分母集団を有することが好ましい。また、この場合も、計数統計及び正確さの理由で、粒子の数は、全ての検体について少なくとも１００個以上であり、低結合事象レートの検体が必要な場合はより多くすることが好ましい（例えば、それが低濃度を有するため、またはレセプターの親和性及び密度に起因して）。この光学システムの最小フレームレートは、最大事象レートを有する検体により決定される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、テザー粒子運動（ＴＰＭ：tethered particle motion）システムは、半径５００ｎｍのナノ粒子（例えば、マイクロスフェアまたはナノビーズ）を基板に結合させる５０ｎｍの長さの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）テザーから形成され得る。一般的なＴＰＭシステムでは、この粒子の平面内運動を経時的に追跡することにより、ビーズ（粒子）の運動の２次元投影が得られる。いくつかの後続時間間隔Δｔ内でこのようなビーズが繰り返し画像化された場合、全ての画像の組み合わせが動作パターンとなる。従来のＴＰＭ方法と比較した、本発明に係るＴＰＭ方法の区別される特徴は、本システムが、例えばビーズ及び基板の両方を相補的結合分子で被覆することにより、粒子が表面に結合できるように設計されているという事実である。したがって、テザーを介した基板への第１の結合を有するテザー粒子は、基板との第２の結合を形成することができる。このような第２の結合が形成されたとき、運動パターンは大幅に変化し、その大きさ及び／または対称性を変化させる。さらに、結合状態及び非結合状態は標的検体の存在の有無により影響を受けるので、粒子運動の性質の変化を測定することにより、検体の存在の有無を判定することができる。運動パターンの一時的な変化は、測定対象であるバイオマーカーまたは検体の存在を示すため、バイオマーカーまたは検体の濃度の評価基準となる。

図８Ａは、テザー粒子の非結合状態を示す概略図であり、図８Ｃは、テザー粒子の結合状態を示す概略図である。図８Ｂ及び図８Ｄの各プロットは、表面のｘ−ｙ面における粒子の位置に対応する。図８Ｂのプロットに示すように、サンプリング期間中の非結合状態のテザー粒子は、中心軸（円の中心）を中心にして対称的な分布を有する。図８Ｄのプロットに示すように、サンプリング期間中の結合状態のテザー粒子は、中心軸（円の中心）を中心にして非対称的な分布を有する。

本発明の実施形態は、一般的に、一端が表面（基板）に結合され、他端が自由ビーズ（粒子）に結合された任意の様々な種類のポリマー（テザー）を使用する。テザーは、例えば、二本鎖ＤＮＡ、単一鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または他のポリマーであり得る。しかしながら、粒子を表面に結合させることができる任意のポリマー、あるいは任意の高分子でさえも、理論的にはＴＰＭとして使用することができる。本発明に係るＴＰＭシステムは、約５０ｎｍの持続長を有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用することが好ましい。

より長いテザーは、粒子の結合状態と非結合状態との運動の差異が大きくなるという利点（したがって、結合状態と非結合状態とを区別し易くなる）と、粒子と表面との間の幅広い相互作用領域を測定できる（したがって、生体機能化表面領域をより効果的に使用できる）という利点を有する。より短いテザーは、粒子及び表面領域間の相互作用率（ヒット率、有効濃度）が高いという利点を有する。有用なテザー長さは、数ナノメートルから数マイクロメートル（例えば、５ｎｍ〜１０μｍ）の範囲である。

テザー粒子運動を実験的タイムスケールで観察するために、粒子のサイズは、数マイクロメートル未満であることが好ましい。金属粒子（例えば、金）、有機または無機物質の粒子、ポリスチレン粒子、及びフルオロスフェアなどの数種類の粒子を使用することができる。金属粒子をポリスチレン粒子と比較すると、金属粒子の利点は、光を強力に散乱することである。一方、ポリスチレン粒子は、光ピンセット実験においてよく使用され、磁気コアを含む場合に粒子の磁気制御が可能となる。

より大きな粒子は、光信号の強度がより高く、モーションブラーがより低い（したがって、位置精度がより高い）という利点を有する。より小さい粒子は、粒子及び表面間のより高い相互作用率のために、拡散率がより高く、運動がより素早いという利点を有し、そのため、検体を介した結合に起因する運動性の変化は、より高い時間分解能を有する。有用な粒子サイズは、数ナノメートルから数マイクロメートル（例えば、５ｎｍ〜１０μｍ）の範囲である。

好適な実施形態では、粒子の位置は、暗視野顕微鏡により追跡され、それにより、基板に対して平行なＸＹ平面の粒子中心座標、すなわちビーズの２次元投影運動のデータが得られる。いくつかの実施形態では、例えば回析信号を使用して、粒子のＺ座標も追跡される。

いくつかの実施形態では、多数の小さい酸化鉄磁性体（Ｆｅ_２Ｏ_３）粒子を有するポリマーマトリックスから成る磁気粒子が使用される。磁気粒子は、磁石で駆動させることができ、標準的な光学顕微鏡検査により検出することができる。

一実施形態では、このシステムの動態を特徴付けるのに用いられるパラメータは、粒子の位置を表す面内ベクトル

の自己相関である。

特性時間τ_１は、ビーズの位置を表す上記の面内ベクトルの自己相関関数に対応する時間として定義される。例えば、いくつかの実施形態では、τ_１の値は（０．０９±０．１）秒であり、より一般的には、τ_１は０．１−０．３ｓの範囲であり得る。

バイオセンサで使用される結合部分は、例えば、タンパク質、抗体、抗体断片、組み換えタンパク質、糖類、分子鋳型ポリマー、小分子、核酸、ＤＮＡ、アプタマー、多効果性バインダ、及びそれらの組み合わせであり得る。

結合部分は、粒子及び表面、好ましくは２つの物体が相互作用する領域、すなわち粒子及び表面が非ゼロのヒット率を有する領域に結合される。結合部分は、テザー結合点の近傍の位置、またはテザー結合点から離れた位置に配置される。非結合及び結合間の運動パターンの変化は、結合がなされる位置に依存する。例えば、２つの各テザー結合点でのパッチ間の結合では、中心を有する小さい運動パターンが生じ、粒子及び基板の相互作用領域の周縁部でのパッチ間での結合では、中心を外れた運動パターンが生じる。部分１０８がテザー（テザーの表面側端部、またはテザーの他の場所）と結合し、かつ部分１０６が粒子と結合した場合（図１参照）、部分１０６及び１０８が結合すると、有効なテザー長さが短くなることに関連して、これらの部分間の結合が存在しないときの粒子運動パターンよりも小さいサイズで、テザーが表面に結合した場所を中心とする運動パターンが生じる。部分１０６がテザー（テザーの表面側端部、またはテザーの他の場所）と結合し、部分１０８が表面と結合されている場合、部分１０６及び１０８が結合すると、表面上の部分１０８の位置に応じて、中心を有する運動パターン、または中心を外れた運動パターンが生じる。そのため、結合状態のときの運動パターンは、粒子及び基板上におけるバインダの位置、並びに、検体が結合される位置の影響を受ける。このため、粒子結合の発生を高感度で検出するために、可能性のある運動パターンを示した参照テーブルを持ち、測定された運動パターンを参照テーブルのデータと関連付けることは有利であり得る。

粒子及び表面上の結合部分の光学密度は、分析の種類及び検体の濃度に依存する。例えば、非常に低い検体濃度でのサンドイッチ分析では、良好な動態及び感度を得るために、粒子及び基板上に高密度の結合部分を有することが有益である。高密度は、例えば、１０^３−１０^５部分／μｍ^２であり得る。競合分析では、粒子及び表面間の非常に強い多価結合を避けるために、各結合部分の少なくとも１つが低い表面密度を有するべきである。さもなければ、検体分子は、粒子を非結合状態にするために、結合部分を効果的に変位させることができない。結合部分の一方が少ない数で存在するシステムを持つための１つの方法は、部分１０６または部分１０８がテザーに結合された実施形態である。テザー上における部分の数は、化学調製方法により良好に調節することができ、例えば、競合分析では有利になるように、テザーあたり１つだけの結合部分だけを有するように調節することができる。

表面上の粒子間の間隔は、粒子が互いの運動を妨げないように、及び粒子を互いに独立して検出することができるように十分に大きくあるべきであり、また、最適な統計値のために多数の粒子をセンシング表面上に配置することができるように十分に小さくあるべきである。

本発明の実施形態によれば、バイオセンサの作製は、いくつかのステップに分けることができる。第１のステップでは、生のサンプルを洗浄する。第２のステップでは、表面及び粒子を機能化する。第３のステップでは、機能化粒子を、機能化表面に結合させる。第４のステップでは、表面を、さらなる使用のために、例えば、センサに流体を加えたときに分解する保護糖含有または他の親水性コーティングで被覆することより保護する。あるいは、センサ表面を、センサを流体サンプルに接触させたときに、生化学部分を保護し、かつ検体を通過させるヒドロゲルで被覆する。バイオセンサデバイスを作製するための、当分野で公知の他の様々な方法及び手法が存在する。

本発明に係るバイオセンシングシステムは、インビトロ用途またはインビボ用途に使用することができ、人体の試験のために非常に広く使用することができる。本システムは、例えば、カテーテル、パッチ、チューブ、ニードル、ファイバ、クリップ、ワイヤなどの医療デバイスの一部として使用され得る。本システムは、医療処置を支援するため、または人体内または上のモニタリング用デバイスの一部として使用され得る。本システムは、例えばカートリッジ、チューブ、滴定プレートなどの使い捨ての形態で使用され得る。

インビボ用途では、プローブは、第１のモジュール（例えば、対象の検体は通過させるが、他の成分の通過は阻むコーティング）、及び／または生体と接触したときに生体適合性及び良好な作用を確実にする材料を介して生体系と相互作用する。

本発明の実施形態は、多重化の様々な形態（例えば、検体多重化、空間多重化、分光多重化、プローブ機能多重化）を含む、様々な別の特徴を含み得る。本発明の実施形態は、統計のため、またはダイナミックレンジのためのプローブの並列化を含み得る（例えば、様々なプローブ機能化、配置及び／または光学特性の多重化）。本発明の実施形態は、複雑な生体系では特に重要である特異性及び／または感受性のために、様々なプローブコーティング、プローブ被覆、プローブをマトリックス内に埋め込み配置するための様々な方法及び材料、検体分離要素、セル分離要素を含み得る。

本発明の実施形態は、（例えば、光学、電気、音響）センサに対して励起を送信し、センサから信号を受信して信号処理を実施する分析器または読み出し機器を含み得る。分析器はまた、信号を他の機器、及び／または遠隔通信、処理及び／または記憶システムに信号を送信するのに使用され得る。

特定の一実施形態では、バイオセンサは、数百個または数千個の個々の粒子に基づいており、暗視野顕微鏡装置によりリアルタイムで同時にモニタすることができる単一粒子及び単一分子感度を有する。この技術は、検体のラベル付けを必要とせずに、単一分子相互作用の統計的分析を可能にする。数百個のナノ粒子を同時に測定する能力は、センサに大きなダイナミックレンジを提供する。このバイオセンサは、多数の単一粒子センサをリアルタイムでモニタリングすることにより、従来技術の限界を克服するバイオセンシングシステムの一部をなす。

データ収集

分析において粒子の運動に関する情報を得るために、粒子運動を追跡する。粒子は、好ましくは、ただし必須ではないが、暗視野光学顕微鏡により画像化する。

生のカメラ画像データは、視野内の全ての粒子の運動パターンに加工される。例えば、運動パターンの共分散行列の固有ベクトルの長さの平方根を計算することにより、短軸及び長軸に沿ったデータ点の標準偏差が求められる。運動パターンの対称性は、小さい振幅の大きい振幅に対する比として定義される。前記小さい運動振幅及び運動パターンの対称性は、運動パターンの規則化（ordering）、及び、時間を関数とした粒子挙動の追跡に用いられる。結合及び非結合事象の数を明らかにし、それにより検体濃度を推定するために、さらなるデータ処理が行われる。

一実施形態に係る粒子運動測定用の装置が図９Ａに示されている。粒子９００は、長さ４０ｎｍのｄｓＤＮＡテザー９０２によって基板に結合されている。前記分子テザーは、その一端が、粒子９００上に被覆されたストレプトアビジン９０１と結合するためにビオチンにより機能化されており、その他端が、表面に結合された抗テキサスレッド抗体９０４と結合するためにテキサスレッド（Texas Red）９０６により機能化されている。粒子運動は、白色光源９０８及びＣＣＤカメラ９１０を有する暗視野顕微鏡構造体により記録される。前記画像化装置は、ビームブロック９１２と、レンズ９１４、９１６、９１８とを含む。カメラ９１０により撮像された画像は、プロセッサ９１１により分析される。図９Ｂに示すように、一連の画像９２０が収集され、各フレームにおける粒子の位置を検出するために分析される。対応する運動パターンが、ドットプロット９２２として構成される。

前記短いテザー９０２は、粒子９００を基板９０５の近傍に維持し、それにより、粒子及び基板間の相互作用の高頻度のサンプリングを可能にする。粒子ドットプロット９２２の分析によって、様々な運動パターンが、数ナノメートルの位置精度で解析される。逸脱した運動パターンは、テザーの数及び向き、粒子の粗さ、及び、粒子と表面との間の結合におけるばらつきに関連する。

例示的な具体例として、１つの特別な実施例を説明する。機能化された基板９０５を提供するために、カバーガラス（ドイツ国、Menzel-Glaser社製）をアセトン、イソプロピルアルコール及びメタノール槽中での５分間の超音波処理により洗浄した。基板を、窒素の緩流を用いて各ステップ間で乾燥させ、使用されるまで乾燥機内に真空下で保管した。２３μＬの容積を有する流体セル（Grace Biolabs社製）を、接着層を使用して、機能化された基板に取り付けた。基板の機能化は、抗テキサスレッド抗体をカバーガラスに物理吸着させることにより行った。抗体を、ＰＢＳ中で所望の濃度（８−５０００ｎｇ／ｍＬ）に希釈し、流体セル中で６０分間培養した。その後、ＰＢＳ中で１ｗｔ％ＢＳＡを５分間培養することにより、基板を保護した。各培養ステップ後、流体セルを１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。

ＤＮＡによる粒子の機能化を提供するために、ストレプトアビジンで被覆された超常時性粒子（Life Technologies社製のMyOne Streptavidin C1）を１２０ｄｐのｄｓＤＮＡとともに、粒子あたり１０〜２０００のｄｓＤＮＡの割合で培養した。一方の端部にビオチン分子を有し、他方の端部にテキサスレッド色素分子を有する長さ１２０ｄｐの２本鎖ＤＮＡが、Ella Biotech社（ドイツ国、Martinsried）から市販されている。ＰＢＳ緩衝液中での６０分間の培養中の粒子の濃度は、８．３ｐＭであった。ＤＮＡ上のビオチン分子は、培養中にストレプトアビジン分子と結合する。この結合反応の効率は、浮遊物分析により、約７０％であることが分かった。この浮遊物分析は、ＤＮＡ挿入染料SYBRGreen（詳細については補足データを参照されたい）の蛍光信号を使用して、反応上清中の非結合ＤＮＡの濃度を定量化する。磁気分離後、粒子をＰＢＳで洗浄し、最終的にはＰＢＳ中の１ｗｔ％ＢＳＡで懸濁して１４０ｆＭの最終濃度にした。

ｄｓＤＮＡ機能化粒子を、希釈した粒子を流体セル中で５分間培養することにより、抗体で被覆された基板に結合させた。ＤＮＡテザーのテキサスレッド端部が基板上のテキサスレッド抗体に結合され、それにより、図１ａに示す粒子／テザー／基板システムが構成された。沈降作用により基板から非結合粒子を除去するために、サンプルを上下逆さまにして１０−３０分間静置した。

５００ｎｍの直径を有する滑らかなポリスチレン（ＰＳ）粒子（ドイツ国、Microparticle GmbH社製）を、ビオチンに対する抗体で機能化させた。この粒子を、MyOne粒子（上記参照）の場合と同じ手順を用いて、１２０ｄｐのｄｓＤＮＡで機能化させた。ＰＳ粒子は、その質量密度及び直径がMyOne粒子よりも小さいので、沈降速度が遅い。そのため、ＰＳ粒子には、１５分間の培養時間が用いられる。

サンプルを、図９Ａに示すように、Nikon Ti-E倒立顕微鏡（オランダ国、Nikon Instruments Europe BV社製）で調べた。粒子を、２００倍の総合倍率で観察し、暗視野コンデンサを使用して照明した。粒子は、低輝度背景上に明るい点として現れる。４１５×４１５μｍ^２の視野（ＦＯＶ）には、数個から数千個の粒子が含まれる。図９Ｂに示すように、粒子を、３０Ｈｚのサンプリングレートで６０秒間記録した。

プロセッサ９１１による後処理において、背景光は、ローパス・ウェーブレットベース周波数フィルタを使用して除去した。個々の粒子の位置は、散乱光スポットの強度の中心を計算することにより求めた。他の利用可能な処理技術としては、フーリエ、ウェーブレット、閾値フィルタリングが挙げられる。後続フレームでの粒子位置を相互に関連付けて、軌跡

を求めた。各粒子について、平均絶対位置

の差分を取って、相対軌跡

を求めた。

実験中に顕微鏡において若干のサンプルドリフトが生じる。このサンプルドリフトは、基準としての役割を果たす静止した粒子の集団を識別することにより補正される。静止した粒子は、全てのｉ≠ｊについて、相対軌跡の最大差

に閾値ｐを適用することにより識別される、同様の運動軌跡を有する粒子と定義される。閾値ｐは、ドリフト補正

により生じる推定誤差を最小化限に抑えるように選択される。Ｎ（ｐ）は、選択された閾値について静止と分類された粒子の数である。サンプルドリフトは、これらの静止粒子の平均運動から求められ、ローパス・ウェーブレットフィルタを用いて、高周波数ノイズ及びブラウン運動寄与を抑制する。生データから求められた軌跡は、その後、観察されたサンプルドリフトについて補正される。

位置精度は、１μｍの磁気粒子について、３ｎｍ未満であることが求められる。磁気粒子とＰＳ粒子の光散乱信号は同等なので、ＰＳ粒子の位置精度も極めて類似すると予想される。

図１０は、粒子の明白な時間依存性運動パターンのシーケンスを示す。この図は、円形運動パターンと多重ストライプ運動パターンとの間で変化する粒子についての累積位置散布図を示す。この図は、８つの連続的な時間間隔を示す。各フレームにおいて、新しく収集された点はグレーで示されており、すでに収集された点は黒で示されている。最初にフレーム１で観察された粒子は、粒子の非結合状態を示す円形パターンを示す。フレーム２におけるストライプパターンは、粒子が表面の第１の位置に結合した状態を示し、フレーム３における別方向を向いたストライプは、粒子が表面の第２の位置に結合した状態を示す。これらの結合状態及び非結合状態は、後続のフレーム４、５、６、７、８において蓄積される。この実験は、粒子及び表面の様々な結合状態の遷移を測定できることを実証する。前記状態は、可逆性及び再現性を有する。前記状態は、第１のテザーに加えて、第２の結合（binding）の存在を示す。

測定対象の粒子は、運動パターンの変化を示す粒子であり、経時的な運動の変化のタイプに対応する。これらの粒子の運動を分析することにより、粒子の結合状態または自由状態（非結合状態）の期間を求めることができる。時間依存性運動を分析する２つの方法、ステップサイズ関数及び面積関数を説明する。

ステップサイズは、テザー粒子の拡散運動の定量化に用いることができる。具体的には、拡散運動は、テザー粒子が所定の時間間隔で移動する絶対距離、すなわちステップサイズを算出することにより求められる。ステップサイズは、ステップサイズ（ｔ）＝｜ｒ（ｔ＋Δｔ）−ｒ（ｔ）｜、として算出することができる（ｒはベクトルである）。時間を関数とするステップサイズは、ブラウン運動の固有の態様である大きな変化を示す。この結果、ステップサイズは幅広い分布となる。ステップサイズの変化量は、所定の時間ウィンドウ中のステップサイズを平均化し、このウィンドウを時間軸に沿ってシフトすることにより抑制することができる。ステップサイズの減少は、結合事象を示す。ステップサイズデータの変動量を減少させるために、ステップサイズは、ウィンドウにわたって平均化される。変動を定量化するために、各ウィンドウにおけるステップサイズの標準偏差を計算する。ウィンドウサイズが増加すると、予想通り、変動量は減少する。しかしながら、ウィンドウサイズの増加はまた、時間分解能の減少をもたらす。したがって、統計的変動量と時間分解能との間には、二律背反が存在する。好ましい平均化時間ウィンドウは、例えば粒子のサイズに依存する。例えば、１マイクロメートルの直径を有する粒子の場合、平均化ウィンドウサイズは０．１−１０ｓであることが好ましい。

自由状態及び結合状態の粒子のステップサイズ間のコントラストを増大させるために、ステップサイズが計算される時間間隔を変更する。結合状態では、運動は、ステップサイズが計算される時間間隔により制限されないが、分子結合に起因する運動の自由度の限定により制限される。ステップサイズのコントラストは、時間間隔Δｔを関数として、自由状態における平均ステップサイズを、結合状態における平均ステップサイズで割った値と定義される。コントラストは、Δｔの関数として増加するが、時間分解能は、Δｔとともに減少する。コントラストは、自由状態の粒子がテザーにより制限されると、最大値に収束する。

粒子が結合状態にあるとき、粒子の運動は、自由状態にあるときの粒子の運動と比べると大幅に限定される。粒子のステップサイズ及び粒子が測定する面積の両方が、結合状態では減少する。粒子が測定する面積を時間の関数として表すために、図１１Ｂに示すように、シフトウィンドウについての凸包を計算する。これは、面積関数と呼ばれる。面積関数は、ウィンドウサイズの範囲について計算される。ウィンドウサイズが、１秒の何分の１から数秒まで増加すると、面積はより多くのデータ点にわたって計算され、自由状態における面積関数は増加する。しかしながら、システムが結合状態にあるとき、面積の増加は著しく低い。これは、結合状態では、粒子が利用可能な位相空間を測定するのに必要とされる時間が短いためである。そのため、位相空間を測定する必要があるシステムよりも長時間にわたって面積を計算しても、より大きな面積にはならない。自由状態では、システムは、ウィンドウサイズを増加させたときに粒子がより大きな面積を測定する状態に依然としてある。自由状態と結合状態との間のコントラストは、ウィンドウサイズの関数として増加する。繰り返すが、ウィンドウサイズの増加の副作用は、時間分解能の低下である。ステップサイズについては、結合状態及び非結合状態を区別するために、アルゴリズムにおいて同一のウィンドウサイズが使用され得る。図１１Ｂは、面積関数のより大きな変化が、ウィンドウ内に存在するデータ点から遠く離れたデータ点の追加または除去に関連することを示す。テザー粒子が分子結合を形成したときのステップサイズ及び面積関数の減少は、常に同じではない。この減少は、テザーに対する分子結合の位置に依存する。

粒子運動の分析の目的は、観察されたテザー粒子運動における結合事象を識別することである。

生データの分析の実施後、全ての粒子の軌跡が分かる。これらの軌跡のうち、単一のテザー粒子に対応する軌跡が測定対象となる。第１のステップは、測定対象外の運動パターンを除外することである。運動パターンの小振幅及び対称性の両方に閾値を設定することにより、測定対象外の運動パターンの大部分を除外することができる。使用される閾値は、好ましくは下記の通りである。短テザーシステムについては、対称性＞０．７５、５０＜小振幅＜１７５ｎｍ。長テザーシステムについては、対称性＞０．８５、１２５＜小振幅＜２２５ｎｍ。なお、これらの閾値は単なる例示であり、関連するシステムについて最適化することができる。選択基準を満たすリング・アンド・ベル形状の運動パターンを除外することができるが、これは、必ずしも必要ではない。

選択された各軌跡について、状態ベクトルにより表される、時間を関数とするテザー粒子システムの状態が計算される。状態ベクトルは、１がシステムの結合状態に対応し、０が自由状態に対応する、１と０とのリストと定義される。このアルゴリズムは、まず、ステップサイズ関数と面積関数の両方から判断して、状態ベクトルの大雑把な推定を計算する。各関数について、運動が分析され、時間に対するステップ（または面積）関数のグラフである図１１Ａに示すように上限閾値及び下限閾値の２つの閾値を設定することにより、システムの状態が判断される。下限閾値を下回る関数の遷移は、自由状態から結合状態への状態の変化（結合事象）を検出するのに用いられる。上限閾値を上回る関数の遷移は、結合状態から自由状態への状態の変化（非結合事象）を検出するのに用いられる。状態検出は統計的変動に対して感受性が低いので（非常に大きい増加または減少のみが検出されるので）、この２つの互いに異なる閾値が使用される。両方の関数が、システムが結合状態にあると見なすフレームにおいてのみ、状態ベクトルは、１に設定される。両関数についての上限閾値及び下限閾値は、下限閾値が結合状態のレベルよりも高くなり、上限閾値が自由状態のレベルよりも約１シグマ低くなるように選択される。これらの閾値は、２つのモデルシステムについて異なる。システムの寸法が互いに異なるからである。第３（最後）のステップでは、各結合期間の正確な開始フレームと終了フレームを求める。

本システムはまた、例えば磁力、光学力、または音響力に基づき、粒子に対して力を加える手段を具備する。力を加えることにより、結合粒子と非結合粒子との区別を助けるか、または、結合状態及び非結合状態間の動態及び／または平衡に影響を与えることができ、これにより、感度、特異性、速度を向上させることができる。

本発明の様々な別個の実施形態において説明した特徴は、必ずしも排他的ではなく、互いに組み合わせて用いてもよい。このような特徴及び実施形態はまた、参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第６２／０９２７５１号（２０１４年１２月１６日出願）、同第６２／０９２７６３号（２０１４年１２月１６日出願）、同第６２／１３２０９６号（２０１５年３月１２日出願）に開示された材料を含む。

Claims (7)

1. テザー粒子運動を用いて検体をセンシングするための方法であって、
   検体を含んでいるマトリックスを、表面と、第１の端部が前記表面に結合され、かつ第２の端部が機能化粒子に結合されたテザー分子とを有するセンサデバイスに接触させるステップであって、前記機能化粒子が、該粒子が前記表面に結合された第１の状態と、該粒子が前記表面に結合されていない第２の状態とを有し、該粒子が、前記検体の存在の有無に応じて前記第１の状態と前記第２の状態との間で切り替わり、これにより、前記検体の存在の有無に応じて機能化粒子の運動特性が変化するステップと、
   前記表面に対する前記機能化粒子の空間座標パラメータを測定するステップと、
   前記測定された空間座標パラメータの変化に基づき前記検体の存在／濃度を判定するステップとを有する方法。
2. 前記空間座標パラメータを測定する前記ステップが、
   前記機能化粒子及び／または表面を照明するステップと、
   前記機能化粒子及び／または表面からの光放射を検出するステップと、
   前記光放射から、前記表面に対する前記機能化粒子の位置、方向、及び／または速度を判定するステップとを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記空間座標パラメータを測定する前記ステップが、
   前記機能化粒子及び／または表面の自由電荷キャリアを励起するステップと、
   前記機能化粒子及び／または表面からの光放射を検出するステップとを含み、
   前記励起及び／または検出が、前記機能化粒子及び／または表面のプラズモン共鳴の近傍の波長で実施され、
   前記検体の存在／濃度を判定する前記ステップが、前記検出された光放射の変化を測定するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記検出された空間座標パラメータの変化に基づき前記検体の存在／濃度を判定する前記ステップが、
   粒子局在化の分布、局在化パターンの面積の変化、または粒子局在化間のステップサイズの変化に基づき前記検体の存在／濃度を判定するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記空間座標パラメータを測定する前記ステップが、
   ５ｎｍよりも大きい線幅を有する光源または高輝度発光ダイオードによって前記機能化粒子及び／または表面を照明するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記検体の存在／濃度を判定する前記ステップが、
   背景ノイズを抑制し、特異性を向上させるために、ヒストグラム及び／またはヒストグラム処理を実施するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記機能化粒子の前記空間座標パラメータを測定するステップが、
   前記粒子の位置、前記粒子の方向、前記粒子の角速度、または前記粒子の線速度を測定するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。