CN116438439A - 利用粒子运动的生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于利用粒子运动在一定时间段内感测分析物的生物传感器装置，所述生物传感器装置具有表面和粒子，其中粒子和/或表面被功能化，并且其中生物传感器装置具有其中粒子与表面缔合的第一状态和其中粒子未与表面缔合的第二状态，并且其中在第一和第二状态之间的转换取决于分析物的存在、不存在和/或浓度，由此粒子的运动特性根据分析物的存在、不存在和/或浓度而变化，并且其中对粒子和表面的性质进行选择，使得在第二状态下粒子在表面附近，使得生物传感器能够测量粒子相对于表面的空间坐标参数的变化，其中粒子未与表面缀合。

Description

利用粒子运动的生物传感器
技术领域
本发明涉及一种用于利用粒子运动在一定时间段内感测分析物的生物传感器装置。本发明还涉及用于利用粒子运动来感测分析物的方法、本发明的生物传感器装置在用于感测分析物的方法中的用途或作为在另一个装置上、在另一个装置中或作为另一个装置的一部分的传感器的用途。本发明还涉及用于体内生物感测、离体生物感测或体外生物感测的本发明的生物传感器装置。
背景技术
用于化学或生化标记的生物传感器装置典型地被开发用于体外诊断，其中采集样品(例如血液、唾液、尿液、粘液、汗液或脑脊液)并且将其转移到在活生物体外部的人工装置(例如一次性塑料)。在这样的生物感测测定中，可以应用宽范围的样品预处理步骤(例如分离或稀释步骤)，并且可以在测定中引入多种试剂(例如用于目标放大、信号放大或洗涤步骤)。体外生物感测测定的实例是：免疫测定、核酸测试、用于电解质和代谢物的测试、电化学测定、酶活性测定、基于细胞的测定等。对于完整综述，参考Tietz临床化学和分子诊断学教科书(Tietz textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics)(Connell，2012年，第5版)。
在体内生化感测中，传感器系统的至少一部分保持连接到活生物体或或插入活生物体，例如人体，例如在皮肤上、在皮肤中、在皮肤下，或者在身体的另一个部分上、在身体的另一个部分中或在身体的另一个部分下。由于生物传感器与活生物体之间的接触，体内生化感测对生物相容性提出了高要求(例如应使炎症过程最小化)，并且传感器系统应在活生物体的复杂环境内可靠地操作。对于监测应用，系统应能够随着时间的推移执行多于一次的测量，并且系统应是稳健的且易于处理。
体内生化感测的一个已知应用是连续葡萄糖监测(CGM)。商业的连续葡萄糖监测装置基于酶促电化学感测(参见例如：Heo、Yun Jung和Shoji Takeuchi；Towards smarttattoos:implantable biosensors for continuous glucose monitoring(迈向智能纹身：用于连续葡萄糖监测的植入式生物传感器)；Advanced healthcare materials 2(1),2013:pp.43-56)。酶促感测不如基于亲和力的感测通用。用于体内葡萄糖监测的商业系统可从例如Dexcom和Medtronic获得。
在感测和监测领域中有许多应用。生物系统，诸如细胞、多细胞系统、器官、生物体或者基于生物分子或含有生物分子或细胞的其他系统和材料，表现出处于由生物有机分子(诸如例如小分子、代谢物、激素、蛋白质或核酸)的时间依赖性变化驱动的最基本水平的动态(dynamics)。对于多种应用，能够监测严格反映动态的特定分子将非常有价值，以便可以及时采取行动并且可以管理变化。用于测量和监测生物分子的感测技术将允许研究生物系统的动态变化并且基于测量的响应控制这样的系统，例如在保健、生物工程和工业加工领域中。传感器可用于连续测量pH、电解质和代谢物，但是还不可用于测量处于低浓度的生物分子。
用于测量生物分子和生物分子相互作用的一种已知技术是拴系粒子运动(TPM)。TPM技术基于对拴系至表面的粒子的运动的测量。Laurens等人(Dissecting protein-induced DNA looping dynamics in real time(实时剖析蛋白质诱导的DNA循环动态)；Nucleic acids research 37(16),2009:pp.5454-5464)描述了这样的系统的一个实例，其中TPM实验对与DNA系链(tether)结合的蛋白质进行报道，以便揭示蛋白质如何改变DNA构象。在这样的研究中，采取措施以避免粒子与表面的不经由系链结合，因为以另一种方式而不是经由系链与表面结合的粒子不会提供关于系链的信息。
已经基于通过系链附着的粒子的运动根据分析物的存在而变化的原理开发了具有附着至表面的功能化系链的生物传感器。运动变化是由于分析物的存在导致系链本身的结构发生变化。还存在用于通过测量拴系至表面的功能化粒子根据分析物的存在的运动学特性来检测分析物的技术。在这些技术中，避免粒子与表面结合很重要，因为空间位阻会干扰受分析物影响的灵敏度。
例如，在WO 2016/096901 A1号公开的国际专利申请中已经描述了甚至更多的具有功能化粒子和/或功能化表面的基于TPM技术的生物传感器。
发明内容
考虑到本领域中描述的生物传感器，本发明人开发了一种新型生物传感器装置，其适用于利用粒子运动在一定时间段内连续、重复或间歇地感测分析物。本发明为此提供了一种具有表面和粒子的生物传感器装置，其中粒子和/或表面被功能化(functionalized)，并且其中：
-生物传感器装置具有其中粒子与表面缔合的第一状态和其中粒子未与表面缔合的第二状态；并且
-第一和第二状态之间的转换取决于分析物的存在、不存在和/或浓度，
由此粒子的运动特性根据分析物的存在、不存在和/或浓度是可变化的，从而允许通过测量粒子相对于表面的空间坐标参数的变化来感测分析物。已发现，如果将粒子和表面的性质选择为使得在第二状态下粒子在表面附近，使得生物传感器能够测量粒子相对于表面的空间坐标参数的变化。短语“在表面附近”可以是指在第二状态下的粒子和表面之间的距离，其中生物传感器仍然能够测量粒子相对于表面的空间坐标参数的变化。应注意，粒子与表面之间的这样的距离不限于任何距离，应注意，与其中粒子与表面之间的距离较小的生物传感器相比，粒子与表面之间的较大距离导致效率较低的生物传感器。优选地，在第二状态下的粒子与表面之间的距离为至少5nm，更优选地在5nm至100μm的范围内，更优选地在5nm至10μm的范围内。发现不再需要将粒子缀合至表面。换言之，本发明提供了一种非拴系的生物传感器装置，其适合用于连续感测分析物的方法。
已发现，尽管粒子并未连接到表面，例如使用系链接头，但是本发明的生物传感器装置能够在粒子和表面之间没有固定系链的情况下进行连续的分子生物感测。即粒子保持邻近表面，例如由于场力，例如由于引力场。本发明的生物传感器装置的粒子表现出布朗运动，并且当粒子在缔合状态和非缔合状态(也被称为“解离状态”)之间转换时，运动发生变化。粒子的运动行为和缔合/解离状态寿命取决于溶液中的目标物(即分析物)的浓度。
如本文中使用的，术语“缀合”是指第一分子与第二分子的共价附着。此外，术语“缀合”是指生物传感器装置的一个部件与生物传感器装置的另一个部件连接，例如经由例如接头或系链使生物传感器装置的粒子与生物传感器装置的表面交联。如本文中使用的，短语“粒子未与表面缀合”是指在非缔合状态下未连接至表面的可自由移动的粒子。
如本文中使用的，术语“生物感测”是指使用生物传感器来识别、测试、表征、监测和以其他方式测量分析物。
如本文中使用的，术语“分析物”是指被识别、测试、表征、监测或以其他方式测量的物质；分析物可以包含单一目标物种的分子(例如，葡萄糖)，或多个目标物种的分子(例如，葡萄糖和合成的脱氧核糖核酸(DNA))。分析物的实例包括乳胶珠、脂质囊泡、整个染色体、纳米粒子、细胞外囊泡、脂质体、病毒、细胞、细胞碎片、超分子体、蛋白质聚集体和生物分子(包括蛋白质和核酸)、气态分子(例如乙烯)、金属或半导体胶体和团簇、在亚纳米至10nm尺寸范围内的小分子、代谢物和其他这样的化学分子。
如本文中使用的，术语“粒子”可以是指在流体或粘弹性基质中具有可检测的运动的物体。流体或粘弹性基质通常被简称为流体。粒子可以由例如有机材料(例如聚合物、超分子系统、胶束、纳米体(nanosome))、无机材料(例如氧化物、二氧化硅、金属)或它们的组合组成。其可以具有不同的内部和外部形状和结构(例如球形、棒状、中空、星形、气泡、混合系统、基质内粒子、聚集体、规则或不规则)。其可以具有在1nm至15μm、更优选地5nm至5μm、更优选地10nm至3μm范围内的短轴。
如本文中使用的，术语“表面”可以是指这样的对象，可以相对于其测量粒子的坐标参数，例如位置、距离、平移、位移、角度、取向、旋转、平移速度或角速度。表面可以由例如有机材料或无机材料或它们的组合组成。其可以具有不同的形状(例如扁平的、弯曲的、波纹状的)以及不同的内部和外部结构(例如实心的、多孔的、可渗透的、分层的、柔性的、粘弹性的)。
关于适合用于本发明的表面，应注意，表面可以是支撑结构，诸如平坦表面、具有凹或凸结构的表面、化学和/或物理图案化的表面、粒子、聚合物、多孔结构或多孔基质。要强调的是，表面也可以是三维结构。
如本文中使用的，短语“粒子和表面的性质”是指粒子、表面和流体的参数，其导致在第二状态下粒子具有例如在5nm至10μm范围内的粒子与表面之间的距离。例如，与提供本发明的生物传感器相关的粒子参数可以包括粒子的尺寸和粒子的密度。例如，表面参数可以是表面材料或者材料类型或者具有声学或磁学或传输或机械性质等的设计的选择。此外，短语“粒子和表面的性质”包括粒子、表面和流体之间的协作，即将粒子束缚至表面的方法，例如通过重量、通过声场、通过流动、通过机械束缚等，以及相应的性质诸如密度、温度、施加的场、机械设计等。
如本文中使用的，术语“生物传感器”可以是指在生化测试、生物测试、化学测试、电化学测试等中使用的任何合适的传感器。
如本文中使用的，短语“与表面缔合”是指为非共价的结合或附着，并且意指例如本发明的粒子粘附至、键合至或静电附着至生物传感器装置的表面。
本发明的生物传感器装置可以含有各种数量的粒子。然而，优选地，本发明的生物传感器装置可以包含至少10个粒子，更优选至少100个粒子。已发现通过提供包含多于10个粒子、更优选多于100个粒子的生物传感器装置，可以执行稳健且可靠的生物感测方法。进一步发现，生物传感器装置可以包含在415×415μm2区域中的几个粒子至数千个粒子的密度。优选地，生物传感器装置可以包含在415×415μm2区域中的100至100,000个粒子、更优选地500至20,000个粒子、甚至更优选地在415×415μm2区域中的1,000至10,000个粒子的粒子密度。其中粒子被追踪的总面积优选地为100至108μm2，更优选103至107μm2，更优选104至106μm2。
为了感测分析物，生物传感器装置可以包括具有衍射极限的光学系统，其中生物传感器装置包括与最近邻粒子相隔至少光学系统的衍射极限的粒子。
本发明的生物传感器装置可以实施结合测定、竞争测定、置换测定、夹心测定、酶促测定、利用目标和/或信号放大的测定、多步测定或利用分子级联的测定。
如本文中使用的，术语“功能化”是指其中惰性粒子和/或惰性表面已经转变成具有特定活性的粒子和/或表面的状态。特别地，粒子和/或表面可以用结合位点或结合部分(诸如抗体、适体、纳米抗体、分子印迹聚合物、有机分子等)功能化。
生物传感器装置的粒子可以被第一部分功能化，其中第一部分与粒子结合。代替具有功能化粒子，生物传感器装置可以包含被第二部分功能化的功能化表面，其中第二部分与表面结合。在使用第一或第二部分的情况下，其中粒子被功能化或表面被功能化，使用的部分对分析物具有结合亲和力。通过提供这样的系统，分析物的存在的空间位阻导致粒子移动到第二状态(即粒子-表面非缔合状态)，而分析物的不存在以及因此任何空间位阻的不存在导致粒子移动到粒子-表面缔合状态(即本发明的第一状态)。
如本文中使用的，术语“结合”是指可以为共价(例如通过化学偶联)或非共价(例如通过离子相互作用、疏水相互作用、氢键等)的结合或附着。共价键可以是例如酯、醚、磷酸酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比术语诸如“偶联”、“融合”、“缔合”、“连接”和“附着”更广泛并且包括这些术语。
备选地，粒子和表面二者都可以被功能化，即提供这样的本发明的生物传感器装置，其中粒子被第一部分功能化，其中第一部分与粒子结合，并且其中表面被第二部分功能化，其中第二部分与表面结合。在本发明的生物传感器装置的这样的配置中，两个部分优选地根据分析物的存在、不存在或浓度而彼此具有结合亲和力。一方面，这样的生物传感器装置可以提供一种分析物生物感测方法，其中在分析物的存在下，功能化粒子处于其第一状态，即与功能化表面缔合。另一方面，这样的生物传感器装置可以提供一种分析物生物感测方法，其中在分析物的不存在下，功能化粒子处于其第一状态，即与功能化表面缔合。
关于与粒子或表面结合的部分的密度，认为任何密度都可以适于提供适合在生物感测分析物的方法中使用的生物传感器装置。这样的表面密度可以优选地为100至108个部分/μm2。优选地，生物传感器装置可以具有在101至107个部分/μm2范围内的部分的密度，优选地其中与粒子或表面结合的部分具有在101至107个部分/μm2、102至106个部分/μm2或103至105个部分/μm2范围内的密度。
第一部分或第二部分可以选自由以下各项组成的组：蛋白质、抗体、其片段、重组蛋白质、肽、碳水化合物、糖、分子印迹聚合物、小分子、核酸、DNA分子、PNA分子、适体、纳米抗体、多价结合剂或它们的组合。优选地，第一部分或第二部分选自由以下各项组成的组：用于葡萄糖、电解质、代谢物、小分子、生物活性物质、毒素、脂质、碳水化合物、肽、激素、药物、药物代谢物、蛋白质、寡核苷酸、DNA、RNA、纳米粒子、细胞外囊泡、外泌体、纳米体(nanosome)、脂质体、病毒粒子、细胞、细胞碎片、超分子体(supramolecular object)或蛋白质聚集体的结合分子。
在本发明的另一个方面，本发明涉及根据本发明的生物传感器装置在执行多路复用、优选地分析物多路复用、空间多路复用(例如点多路复用或室多路复用)、光谱多路复用、探针功能多路复用的方法中的用途。甚至进一步地，本发明涉及根据本发明的生物传感器装置作为传感器的用途，所述传感器在用于感测或监测的系统上、在所述系统中或作为所述系统的一部分，所述系统可以包括例如内窥镜、管、针、纤维、导管、贴片、一次性探头、可穿戴装置、可隐藏装置(insidable device)、流通池或一次性卡盒。
在本发明的另一个方面，本发明涉及根据本发明的生物传感器装置，其用于体内生物感测、离体生物感测或体外生物感测，诸如用于体外诊断测试、即时测试(point-of-care testing)、环境测试、食品测试、过程监测、过程控制、法医学、生物学、生物医学和药物研究，或者用于监测利用活细胞、组织或器官的测定。
在本发明的又一个方面，本发明涉及一种用于利用粒子运动来感测分析物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)使含有分析物的基质与本发明的生物传感器装置接触；和
b)检测粒子的根据分析物的存在而变化的运动特性，
其中，运动特性包括粒子相对于表面的空间坐标参数。
考虑到本发明的方法，应注意，本发明的生物传感器装置的粒子典型地被布置成以平均有效解离时间从第一状态(即粒子-表面缔合状态)转换至第二状态(即粒子-表面非缔合状态)。此外，本发明的生物传感器装置的粒子典型地被布置成以平均有效缔合时间从第二状态转换至第一状态。
此外，已发现通过控制含有分析物的基质的流动，粒子可以在整个生物传感器中移位的净距离被最小化。因此，本发明的方法还可以包括这样的步骤，其中在步骤b)中，含有分析物的基质的流动方向是连续或间歇地变化的。这样的流动的变化可以经历随机流动方向变化或经历反向流动方向变化。
如本文中使用的，术语“平均有效解离时间”和“平均有效缔合时间”是指粒子分别从表面解离和与表面缔合所需的平均时间。换句话说，分别达到完全粒子-表面非缔合状态(即第二状态)和粒子-表面缔合状态(即第一状态)(即任何类型的缔合状态，例如利用单分子键(单价)或利用多个分子键(多价))所需的平均时间。
鉴于粒子达到与表面的结合或未结合状态的平均有效解离和缔合时间，在本发明的方法的一个优选实施方案中，检测粒子的运动特性的步骤b)在比平均有效解离时间和/或平均有效缔合时间更长的时间段内执行。通过提供其中粒子的运动特性的检测在比平均有效解离时间和/或平均有效缔合时间更长的时间段内执行的方法，提供了一种稳健且可靠的方法，其中可以充分测量关于分析物的感测的事件，以实现良好的分析物感测事件统计或提取状态寿命和状态寿命分布。
本发明描述了一种具有单分子分辨率的生物传感器。具有单分子分辨率的传感器提供具有数字特性的信号，也被称为水平、状态、转变、转换或事件。这样的数字信号遵循泊松统计(Poisson statistics)的基本定律。这意味着，例如，由推测学引起的变异系数可以与1/平方根(N)成比例，其中N是检测到的事件的平均数量。因此，改善检测到的事件的统计减少变异并且提高精度。
在现有技术的传感器中，低浓度典型地通过使用具有高亲和力和/或具有低解离速率常数(低k_off)的结合部分来测量。低解离速率常数意味着缓慢的解开(unbinding)特性(分析物的长结合状态寿命)，如果其决定了粒子的结合事件的统计，则这将是不利的。为了获得良好的统计(高的检测到的粒子事件的数量N)，粒子状态寿命不应太长，否则在给定的测量时间跨度内记录的事件不足。
在本发明的一个方面，可以通过具有具有相对低的解离速率常数的一个结合(以便能够测量低浓度)以及具有相对高的解离速率常数的另一个结合(对于高N，即良好的粒子事件统计)来改善统计。当解离速率常数相差约3倍时，那么分析物从最强结合剂(具有最低解离速率常数)的解离时间平均是从最弱结合剂(具有最高解离速率常数)的解离时间的三倍长。由于这个时间比，在当分析物与最强结合剂缔合时的时间期间(例如在夹心测定中)，可能观察到若干粒子结合和解开事件，或者在当分析物与最强结合剂缔合时的时间期间(例如在竞争测定中)，若干粒子结合和解开事件可能被抑制。假设例如3个解开事件和3个结合事件，则有效地N＝6；这将使变异系数潜在降低1/平方根(6)，其明显低于1。因此，由于解离速率常数之间的比率，变异显著更低并且测量更加精确。
实施例
定义粒度
半径为R的未结合球形粒子的扩散性由Stokes-Einstein关系给出：
Figure BDA0004086292440000091
其中η是溶液的粘度。鉴于Stokes-Einstein关系，注意到小粒子具有比大粒子更高的扩散性。高扩散性对于粒子与表面之间的碰撞率或相遇率是有利的。
然而，还注意到，精确追踪小粒子比大粒子更难，因为小粒子扩散得更快。此外，小粒子的光学信号低于大粒子的光学信号，因为大粒子给出更多的信号，例如大粒子散射或产生更多的光子。
本发明的生物传感器中粒子与表面之间的距离可以取决于粒子的尺寸。
假设粒子被力F朝向表面吸引。所述力可以是时间和空间依赖性的；然而，此处假设力是恒定的(为简单起见)。此处假设热能导致每个粒子分布在不同的粒子位置。由于热能，粒子在近表面区域中具有概率分布，具有特征衰变长度(其可以类似于气压高度来查看)：
Figure BDA0004086292440000101
其中kb是玻尔兹曼常数(Boltzmann constant)，并且T是温度。力F可以具有多种来源(例如重力、声学、磁学、光学、电学、流体机械)，并且可以取决于粒子的尺寸。
在重力的情况下，粒子的特征衰变长度由浮力给出。假设球形粒子(为简单起见)具有半径R以及粒子与溶液之间的有效质量密度差Δρ。那么：
Figure BDA0004086292440000102
其中g是重力加速度。为查看缩放行为，假设Δρ的值为0.8·103kg/m3并且T＝293K(为简单起见)，然后针对不同的粒子半径值计算hb，得到以下值列表：
-R＝0.1μm得到hb＝122μm；
-R＝0.5μm得到hb＝0.98μm；并且
-R＝1.4μm得到hb＝45nm。
等式3表明小粒子的高度分布比大粒子的高度分布大得多。大的高度分布使粒子与表面之间的平均距离大，这对于粒子与表面之间的碰撞率或相遇率是不利的，因此阻碍粒子与表面之间的有效缔合率。
应注意，质量密度差Δρ可以是正的(即粒子比溶液更重；粒子“下沉”到生物感测表面)或负的(即粒子比溶液更轻；粒子“漂浮”到生物感测表面)。
备选地或另外地，粒子可以通过机械方式保持紧邻表面，例如通过第二表面，所述第二表面限制其中粒子可以驻留的高度空间，或者其限制粒子与第一表面之间的可接近距离范围。它可以用作使粒子保持在第一表面附近并且阻止粒子远离第一表面移动过远的手段。
在另一个方面，第二表面可以是多孔的，使得分析物和/或流体可以渗透到第二表面中，或者渗透通过第二表面进入具有粒子的区域中和/或从所述区域中渗透出来。
在另一个方面，第一表面可以是多孔的，使得分析物和/或流体可以渗透到第一表面中，或者渗透通过第一表面进入具有粒子的区域中和/或从所述区域中渗透出来。
大粒子可以在粒子和表面之间提供小的高度分布和小的有效距离(参见上文)。然而，小的高度分布和小的有效距离也可能阻碍生物分子相互作用的可逆性，从而导致低的解离率。大粒子可以产生空间位阻，从而减慢缔合和解离过程(即本发明的生物传感器装置系统从其第一状态至其第二状态的转换)并且反之亦然。此外，即使在粒子和表面上施加封闭和防污涂层，大粒子也可以在粒子和表面之间产生非特异性相互作用，包括不可逆的粘附。
使用直径为1μm的粒子的生物传感器装置
制备包含直径为1μm或2.8μm的粒子的生物传感器装置。通过使用链霉亲和素包覆的1μm粒子(Dynabeads MyOne C1)来制备两种类型的生物传感器装置，其中10μM粒子结合剂生物素-寡核苷酸(SEQ ID NO:1)经由链霉亲和素与粒子偶联。使用100μM 1kDa PEG-生物素和1％ BSA来封闭粒子的剩余部分。
表面(生物传感器装置A)通过以下方式制备：使用包含100μg/mL中性亲和素(neutravidin)(物理吸附)、经由中性亲和素偶联到表面的500nM表面生物素-寡核苷酸(SEQ ID NO:4)并且使用经由生物素-寡核苷酸偶联到表面的检测寡核苷酸分子(SEQ IDNO:3)。使用100μM 1kDa PEG-生物素和1％ BSA来封闭表面的剩余部分。
备选地，另一个表面(生物传感器装置B)通过在玻璃基板上使用PLL-g-PEG和点击偶联的生物素-寡核苷酸来制备。
带有测量室的流通池卡盒是使用双面粘合层以及带有流体入口和出口的顶板构建的。通过更换流通池中的流体，即通过连续插入具有不同分析物浓度的溶液来收集数据。使用移液管手动地插入流体。实验中的流速典型地为约1-300微升/分钟。
作为目标物，使用具有SEQ ID NO:2的分析物。
表1.所使用的合成DNA序列
Figure BDA0004086292440000111
Figure BDA0004086292440000121
结果DNA夹心和竞争测定
生物传感器装置A的数据表明，扩散系数直方图和测量的状态寿命取决于提供到流通池中的分析物浓度。可以提取状态寿命，因为在缔合状态和解离状态之间观察到可逆转换。状态寿命显示出短期状态和长期状态，这可能归因于不同类型(例如不同化合价)的相互作用。
生物传感器装置B的实例显示出作为提供到流通池中的分析物浓度的函数的测量的扩散系数直方图；在10pM浓度下的运动轨迹(自由、单键和多键状态是可见的)；以及在50pM浓度下的运动轨迹(单键和多键状态是可见的)。
本发明的生物传感器所提供的见解
实验的数据表明：
-在清楚地检测生物传感器装置的粒子的缔合和解离状态的情况下，可以在足够长的时间段内以足够的精度进行粒子追踪；
-缔合和非缔合状态寿命分布的统计分析显示出对目标物浓度的依赖性具有高灵敏度(皮摩尔范围)；和
-缔合和非缔合状态寿命的分布表现出多个特征寿命(参见：多指数拟合)和相应的群体分数，与不同状态(例如未结合状态、具有单价键的状态、具有多价键的状态)之间的转换有关，全都表现出目标浓度依赖性。
由于不同状态(未结合、单价键、多价键等)的观察结果，可以测量不同的转换率和状态寿命，这取决于粒子和表面上的目标物的捕获量，并且因此取决于目标物在溶液中的浓度。例如，当以单价键状态或在单分子键的情况下观察到粒子时，可以形成另外的键。这给出了与第一键和另外的键的形成相对应的寿命和转换率，其取决于浓度，但是幅度不同。这产生可以被提取并且用于改善生物感测性能的多个参数。
生物传感器的重要的生物感测性能方面是例如灵敏度、特异性、速度、可逆性、精度、准确度、动态范围、稳健性、稳定性、多路复用。
此外，测量的与不同状态(例如单键和多键状态)相关的寿命给出了有关分子的亲和力的信息，例如缔合速率、解离速率和平衡结合常数，其可以用于表征分子的性质。
此外，在填充流通池并且开始测量之后，在测量中观察到，可以在粒子的最小扰动的情况下在流通池中更换流体。因此，在没有固定系链的情况下粒子迁移率测定可以用于连续生物标记监测。由于可逆的相互作用，可以遵循分析物浓度的增加和减少。
此外，改变流通池中的流动方向可以有助于补偿位移并且使粒子发生位移的净距离最小化，这使得粒子的损失最小化并且能够实现长测量序列和长时间跨度内的测量。
关于在未结合状态下粒子与表面之间的距离，优选的距离在5nm至10μm的范围内。下限(5nm)由以下事实确定：使用分子和可逆生物分子相互作用，其典型地在几纳米的长度尺度上操作；粒子与表面之间需要足够的空间以能够获得未结合状态。上限(10μm)由以下事实确定：需要粒子与表面之间的足够高的碰撞率以获得有效缔合速率，使得可以观察到从未结合状态到结合状态的足够转换。
在没有固定系链的情况下的测定的优点(相对于在具有固定系链的情况下)：
-不需要拴系，因此化学和传感器制造涉及更少的试剂和更少的加工步骤；
-由于不存在固定系链，传感器不依赖于系链稳定性或不受系链降解的影响；
-由于不存在固定系链，存在更少的分子组分，因此存在更少的物理化学限制以及更大的物理化学和(生物)化学操作窗口，例如潜在地可以使用更宽泛种类的缓冲剂，潜在地可以应用更宽泛的温度范围等；
-没有固定系链的传感器更容易制备，因此测定开发、反应和制备条件的筛选以及技术开发可以更快地进行。随后，所获得的技术知识也可以应用于开发带有固定系链的传感器；
-需要更少的粒子来制备传感器，因为拴系过程典型地具有低效率；
-粒子具有旋转扩散的自由度，使得相互作用可以在粒子的所有面上发生(在具有固定系链的情况下，相互作用区域限于系链附着点周围的区域)；这可以改善动力学和灵敏度；此外，由于每个粒子的相互作用面积较大(对粒子上的物理和化学异质性的敏感性较低)，这可以减少变异性并且提高精度；
-粒子具有平移扩散的自由度，因此可以在大表面积上检测到缔合(在具有固定系链的情况下，相互作用区域限于系链附着点周围的区域)；这可以改善动力学和灵敏度；并且可以减少变异性。
-粒子与表面之间的距离可以在大范围内调整；使得还可以测量大的分析物，例如纳米粒子、细胞外囊泡、外泌体、纳米体、脂质体、病毒粒子、细胞、细胞碎片、超分子体、蛋白质聚集体(固定的短系链可以在空间上阻碍在粒子与表面之间的大分析物的捕获)；
-由于粒子的大位移，可以容易地检测到非缔合状态；
-传感器可以用干燥状态的粒子(例如在可溶解基质中)制备，使得传感器可以通过添加流体来激活并且直接使用(这在固定系链的情况下是更复杂的)；以及
-可以通过提供具有粒子的溶液来将新粒子添加到感测室中；这可以改善例如卡盒测量寿命(见下文)。
本发明的其他方面
本发明的生物传感器是这样的系统，其可以含有多个组件，例如用于对来自感兴趣的系统(例如生物系统、环境系统(例如河流、池塘、海洋、湖泊、源头)、通道、管道、水池、井、排气管、过程、反应器、发酵罐、液流、生物体、储器、患者、动物、类器官)的分析物进行取样、用于预处理样品(例如稀释、过滤、加热、酶促加工、分离)、用于将样品引导至感测粒子、用于照射粒子、用于收集来自粒子的辐射、用于对粒子进行成像、用于确定粒子在不同时间点的空间坐标参数、用于确定粒子的位移或平移或旋转或运动参数、用于确定粒子时间轨迹中的状态以及结合和解开事件、用于处理直方图和参数分布、用于将经处理的参数(例如幅度、状态、扩散率、扩散常数、寿命、速率、分布中的群体、分数占据、转换活动、事件频率、时间延迟)转换为分析参数(例如浓度、精度、准确度、时间谱)、用于将分析参数转换为控制动作(例如警告信号或闭环控制参数)、用于控制系统(例如带有软件的计算机)中的不同组件或用于与外部组件(例如更大的控制系统、数据库、互联网系统、信息系统或云系统)通信的组件。
本发明的生物传感器可以含有读取器系统(具有例如光学组件、用于数据和信号处理的组件、用于接口和数据通信的组件)、流体系统(具有例如使流体或粒子运动的方法、泵、施加低压或超压的方法、实现稀释的方法、实现混合的方法、通风孔、管、阀、过滤器、开关、流量传感器、压力传感器、气体传感器、气体处理方法、脱气单元、流量调节器、压力调节器)或卡盒或另一个容器装置(具有例如开口、连接器、入口、出口、井、通道、测量表面、测量室、对准标记、识别标记、ID标签)。系统可以具有用于试剂(例如缓冲剂、粒子、预处理试剂)或用于收集流体(例如废物储器)的容器。传感器系统可以含有湿试剂或干试剂(例如烘干的或冻干的)。
在另一个方面，可以使用多种流体传输或粒子传输或分子传输或分析物传输结构，例如面内传输、面外传输、错流传输、对流、平流、扩散。在传感器装置的另一个方面，传感器粒子可以位于第一表面附近，其中在相对于表面的不同方向上(例如在沿着表面的方向和/或垂直于表面的方向上)进行流体传输或分子传输或分析物传输；这包括穿过表面的传输。在另一个方面，粒子可以位于第一表面和第二表面之间；流体、分子或分析物的传输可以在不同的方向(例如沿着或穿过不同的表面)发生。表面可以被生物功能化以实现粒子与表面之间的结合。
卡盒和其他组件可以通过图案化技术(例如，光刻、接触印刷、微接触印刷、非接触印刷、自组装)、增材制造(例如，3D打印)、接合(例如，胶合、焊接、粘合剂、胶带)、组装、层压、自动放置、成型、包覆成型(over-molding)、滴铸、固化(例如，光学、热)来生产。其他可能的制造技术是例如生物图案化、生物沉积、生物缀合、物理吸附、干燥、冷冻干燥、辐照、灭菌、包装、密封。
通过化学、生物化学或物理方式调节样品或样品流可以改善传感器的分析性能，例如通过稳定pH、温度、溶液的质量密度(其例如与等式3中的Δρ相关)、溶液的组成(例如，不存在干扰性分子或细胞聚集体)等。
粒子检测和追踪可以涉及辐射、波、电磁原理、声学、散射、荧光、吸光度、干涉、等离子体感测、光谱感测、成像等。检测可以允许对单个粒子的可靠追踪。
在另一个方面，在使用光学检测方法的情况下，卡盒和光学组件可以含有光学透明材料，例如玻璃或聚合物。
在另一个方面，追踪坐标参数的方法的高度偏差(例如，在一些光学追踪方法的情况下的焦点深度)优选地与粒子的高度波动相兼容(参见例如等式2)，使得可以开发可靠的追踪算法，并且因此相对于其他误差来源，由于高度波动而丢失粒子轨迹的概率是可接受的。
例如，如果可以追踪粒子的时间量长于确定粒子是否处于一种状态还是处于另一种状态所需的时间，则可以精确和/或准确地确定粒子的状态。例如，如果可以追踪粒子的时间量长于确定有效空间坐标参数或运动参数所需的时间，则可以精确和/或准确地确定有效空间坐标参数或运动参数。例如，如果追踪到足够高比例的与表面相互作用的粒子，则可以精确和/或准确地确定结合分数、未结合分数和/或结合与未结合比率。例如，如果可以追踪粒子的时间量长于粒子的特征状态寿命，则可以精确和/或准确地确定特征状态寿命。
本发明的生物传感器可以制备成立即使用、或快速使用、或即插即用，例如通过掺入储存在流体中的粒子、或储存在可溶解基质内的粒子(基质在润湿时分散并且被激活用于测量室中的感测功能)。
本发明的生物传感器可以与多种结合剂例如分子、分子构建体和材料一起使用；例如与寡核苷酸、蛋白质、肽、聚合物、适体、小分子、糖、分子印迹聚合物等一起使用。
系统中的缔合和解离状态寿命可以通过选择例如结合剂、结合剂密度、封闭方法、缓冲条件等进行调节。
如果单个粒子的平均追踪时间长于粒子的平均缔合态寿命和/或平均解离状态寿命，则可以对每个粒子测量多个(未)结合事件。这对于统计以及派生参数的精度是有利的。
本发明的生物传感器可以包括用于从传感器解离或去除粒子的组件和方法，例如通过对粒子或流体施加流体机械阻力(例如流动脉冲)、界面张力(例如气体/液体界面、气泡)、场力(例如磁场、声力、光场)、热激发或者其他定向力或随机力。本发明的生物传感器还可以包括用于供应或添加粒子的组件或方法，例如通过使含有分散粒子的流体流到测量室中，或通过对粒子或流体的另一种力。去除和/或添加可以有助于优化传感器，或有助于重置、重新生成、重新启动或刷新传感器。
当粒子不再适用于感测(例如已变得不活跃、无响应、静止或饱和的)时，去除粒子可以是有帮助的。添加或更换粒子可以有助于供应具有良好感测特性或具有不同感测特性的粒子，例如用于顺序地测量不同的分析物，或用于在不同时间点顺序地感测相同的分析物(如果弛豫时间长，则特别相关)，或用于利用具有不同响应特性(例如，不同的灵敏度或特异性)的粒子来感测相同的分析物。
本发明的生物传感器可以具有混合的感测粒子，例如具有固定系链的粒子和不具有固定系链的粒子，或具有不同光学特性和/或感测特性的粒子(例如用于多路复用)。
本发明的生物传感器可以用于测量分子和/或粒子-表面组合的亲和参数以及亲和参数的分布。
本发明的生物传感器可以用于连续监测、间歇测试以及终点测量，例如用于在需要时使用或在实验室环境中使用。
本发明的生物传感器可以用于例如工业过程监测、生命科学应用、医疗应用、发酵、生物反应器、患者护理、临床试验、制药应用、环境监测、野外环境测试、家庭环境监测、地球外测试、空气质量监测、蒸气测试、呼吸流体测试、水质监测、化学监测、闭环控制、实时监测、预警系统等。
附图说明
图1示出了本发明的生物传感器装置的示意图，其中粒子1和表面2二者被第一部分3和第二部分4功能化。感兴趣的分析物5也在图1中可视化。如图1所示的生物传感器装置处于其第二解离状态：功能化粒子1并未与功能化表面2缔合。
图2示出了本发明的生物传感器装置的示意图，其中通过使用夹心测定来测量感兴趣的分析物5的感测，其中感兴趣的分析物5夹在(参见：图2A)粒子1的第一部分3和表面2的第二部分4之间，使粒子1与表面2处于缔合(即本发明的第一种状态)。图2B示出了生物传感器装置的示意图，其中分析物5未被生物传感器感测到。
图3示出了本发明的生物传感器装置的示意图，其中通过使用竞争测定来测量感兴趣的分析物5的感测，其中粒子1的第一部分3与表面2的第二部分4结合(图3A)或感兴趣的分析物5与表面2的部分4结合(图3B)。
图4示出了适合用作本发明的生物传感器装置的流通池卡盒的一个实例。流通池卡盒包括入口10、流动通道11和出口12。
图5示出了在125pM的ssDNA目标浓度下，在基于寡核苷酸的夹心测定中测量直径为1μm的粒子的结果。图5左侧的图示出了从xy轨迹数据重建的2D运动模式。图5中间的图示出了随时间变化的扩散系数，显示出自由布朗运动以及由粒子与底物之间的目标物诱导的夹心形成引起的受限布朗运动的两种情形。阈值设定为D＝0.1μm2/s以区分未结合状态(其中粒子未与表面缔合)和结合状态(其中粒子与表面缔合)。图5右侧的图示出了计算的扩散系数值的直方图，显示出未结合状态下的类高斯分布(Gaussian-like distribution)，以及低于结合状态的阈值的峰值。对于具有125pM目标物的这种配置(500nM的底物侧结合剂的温育浓度和10μM的粒子侧结合剂的温育浓度)，全部粒子的约15％显示出单分子结合。在250pM目标物浓度下，这增加到约30％。还应注意，测量是在添加目标物(待通过生物传感器感测的分析物)后2分钟开始的。
图6示出了具有1μm直径粒子的基于寡核苷酸的夹心测定的多个扩散系数直方图。在缓冲剂(PBS)中观察到类高斯曲线，其中平均值D为约0.25μm2/s。在添加ssDNA目标分子后，粒子可以以夹心形式与底物结合，并且因此扩散系数降低。这通过在D<0.15μm2/s处出现峰而在直方图中反映。峰的突出度随着目标物浓度的增大而增加。
图7示出了与图6所呈现的相同实验数据的结合状态寿命存活曲线。这些图示出了在不同目标物浓度下的寿命(x-轴，线性标度)及其存活分数(y-轴，对数(log)标度)。确定所有结合状态寿命的累积分布函数(CDF)，并且将存活分数定义为1-CDF(图中的点)。基于状态寿命存活曲线(图中的实线)的双指数拟合来提取特征结合状态寿命。第一个指数代表短的结合状态寿命，其归因于单分子结合模式(τsm)。这种特征寿命在添加目标物后保持相对恒定，因为寿命仅取决于亲和结合剂性质。第二个指数代表寿命更长的结合状态，其归因于多价结合(τmv)。在这个实验中观察到的多价结合的分数以及特征寿命随着目标物浓度的增大而增加。
图8示出了与图6所呈现的相同实验数据的未结合状态寿命存活曲线。这些图示出了在不同目标物浓度下的寿命(x-轴，线性标度)及其存活分数(y-轴，对数标度)。与结合状态寿命一样，基于状态寿命存活曲线(图中的实线)的双指数拟合来提取特征未结合状态寿命。第一个指数(τ1)代表短的未结合状态寿命(<10s)，其归因于非特异性相互作用以及测量和分析伪假象(artefacts)；这些与目标物浓度无关。第二个指数(τ2)归因于与分子结合相关的未结合状态寿命，其与目标物浓度成反比。随着目标物浓度的增大，粒子更频繁地与底物结合，并且结合事件之间的时间缩短。这反映在特征未结合状态寿命的减少上。
图9示出了利用PLL-PEG功能化的ssDNA夹心测定实验的示意图。粒子用具有与ssDNA目标物互补的11bp的粒子侧结合剂功能化。使用第二代点击化学，DBCO-标记的底物侧结合剂经由整合的叠氮基团与物理吸附的PLL-g-PEG聚合物偶联。底物侧结合剂与ssDNA目标物之间的可逆9bp杂合导致粒子的瞬时结合。在目标物的存在下，粒子由于目标物诱导的夹心键而可以与表面结合，并且可以从未结合状态(左)转换至单结合或双结合状态(右)。
图10示出了将浓度为1pM、10pM和100pM的单链DNA目标物顺序地添加到传感器以执行DNA夹心测定的结果。在10分钟的持续时间内以60Hz的帧速率追踪粒子的位置。为每个浓度绘制一组粒子的扩散系数直方图，显示了依赖于目标物浓度的未结合状态和结合状态群体。
图11示出了单个粒子轨迹的实例和扩散系数的相应演变。添加浓度为10pM的单链DNA目标物以执行在图9中解释的DNA夹心测定。在10分钟的持续时间内追踪粒子的位置，并且可以重建粒子轨迹(插图)。每一个粒子的扩散系数作为时间的函数计算，并且对于视野中的所有粒子检测结合/解开事件。
图12示出了单个粒子轨迹的实例和扩散系数的相应演变。将浓度为50pM的单链DNA目标物添加到图9所示的系统中，接着进行五分钟的测量。在这些实例中，粒子主要在单结合状态和双结合状态之间转换。示出了具有两种结合状态的时间轨迹，对应于插图中由不同灰度颜色标记的时间跨度。粒子在单结合状态下显示出薄饼状运动模式，并且在双结合状态下显示出条状或点状运动模式。
图13示出了基于测量与底物具有可逆分子结合的生物功能化粒子的自由长程扩散运动的监测生物传感器的基本原理。图13A示出了用粒子侧结合剂功能化的微粒。粒子扩散到用底物侧结合剂功能化的底物附近。结合剂对目标分子具有特异性亲和力。目标物诱导的夹心复合物可逆地形成并且导致粒子在未结合状态和结合状态之间转换。粒子在未结合状态下表现出自由布朗运动，并且在结合状态下表现出受限布朗运动。图13A的右图示出了在大约500μm×500μm的视野中的约500个粒子的显微镜图像。插图示出了追踪300秒的粒子子集(n＝约25个)的重建平面内轨迹。图13B示出了利用寡核苷酸结合剂和目标物的夹心系统的实验数据。图13B的左列示出了溶液中目标分子的不存在(上)和存在(下)下的单个粒子的轨迹。下图中的黑点表示由目标物诱导的夹心键引起的结合状态。图13B的右列示出了基于从粒子轨迹导出的面内位移作为时间的函数计算的扩散参数D。在分析物的不存在(上)下，粒子典型地表现出自由布朗运动。在分析物的不存在(下)下，粒子显示出从未结合状态(灰色)到结合状态(黑色)的转变。属性状态转变由二进制阶跃函数表示(上方的线)。图13C示出了测量的约500个粒子的D的分布，显示了取决于目标物浓度的未结合状态(灰色)和结合状态(黑色)群体。
图14示出了直径为1μm和2.8μm的粒子的迁移率时间轨迹和状态寿命。图14A示出了扩散系数。图14D示出了在5分钟时间段内测量的值，显示了未结合状态(灰色)和结合状态(黑色)。图14B示出了从图A中的单粒子轨迹导出的D的分布，例示了在1μm和2.8μm粒子之间的差异。图14C示出了数百个粒子的D分布。图14D示出了对于具有相似生物功能化和目标物浓度的1μm和2.8μm粒子，绘制为存活曲线的未结合状态寿命的分布。在相当的条件下，更大的粒子比更小的粒子表现出更短的未结合状态寿命。插图示出了在lin-lin标度上的相同数据。图14E示出了如图D中的存活图，此处为结合状态寿命。曲线段归因于短寿命的单价键和长寿命的多价键。
图15示出了使用2.8μm粒子的基于DNA的夹心测定。图15A示出了特征未结合状态寿命的存活曲线，显示了对目标物浓度的依赖性。随着DNA夹心目标物浓度的增大，存活曲线变得更陡峭(黑色箭头)，反映出在结合事件之间的更短时间。图15B示出了依赖于在30-500pM范围内的目标物浓度的特征未结合状态寿命(圆形)，并且虚线标度为约[T]-1.6±0.1。特征结合状态寿命(三角形)与目标物浓度无关，其中平均值为13±2秒(虚线)。未报告空白和15pM目标样品的寿命，因为由于低背景，拟合的寿命比测量时间长得多。误差条是寿命拟合的标准偏差，并且典型地小于符号大小。插图示出了用ssDNA结合剂功能化的中性亲和素底物，其组合了用不同的ssDNA结合剂功能化的2.8μm粒子。还描绘了ssDNA目标链。图15C示出了用Hill方程拟合的以活性表示的剂量-反应曲线，并且EC50为65±4pM。插图示出了结合分数的响应，其中EC50为240±40pM。虚线表示Hill方程拟合的95％置信区间。图15D示出了对各个目标物浓度的连续监测和传感器的可逆性(用指数衰减函数拟合，实线)。图15D的下图示出了以梯阶方式随时间应用的夹心目标物浓度，随后用缓冲液洗涤。图15D的上图示出了随时间测量的转换活动随着目标物浓度的增大而增加，并且可逆性在90分钟内得到证实。在用缓冲液的洗涤步骤之后，传感器功能得以保持。
图16示出了对于PBS中和过滤的未稀释血浆中的ssDNA竞争测定，利用1μm粒子的传感器对目标物浓度的响应。经由生物素-链霉亲和素相互作用和DNA杂交，1μm粒子用粒子侧结合剂功能化。使用第二代点击化学，DBCO标记的底物侧结合剂经由整合的叠氮基团与PLL-g-PEG聚合物偶联。在底物侧结合剂(其也用作ssDNA类似物)与粒子结合剂之间的可逆9bp杂交导致粒子的瞬时结合。在11-nt目标物的存在下，粒子侧结合剂上的结合区域被封闭，从而导致结合分数降低和转换事件减少。图16A示出了传感器响应曲线，即作为目标物浓度的函数的结合分数和转换活动，其用Hill方程拟合。黑色和灰色曲线代表在递减浓度系列的情况下的两个连续测量的剂量-响应曲线，其证实了传感器的可逆性及其对于监测应用的适用性。图16B示出了依赖于在10至2000nM范围内的目标物浓度的特征未结合状态寿命。图16C示出了对于50kDa旋转过滤的牛血浆中的ssDNA目标物所测量的转换活动。图16D示出了在过滤的牛血浆中测量的特征未结合和结合状态寿命。
图17示出了使用抗体夹心免疫测定法展示用于检测脓毒症生物标记降钙素原(PCT)的可逆传感器。示出了两个传感器装置的数据。玻璃基底通过物理吸附用100nM捕获抗体(c-Ab)进行功能化，并且随后用PBS(封闭缓冲液)中的1％ BSA封闭。链霉亲和素包覆的2.8μm Dynabeads用100nM生物素化检测抗体(d-Ab)功能化，用100μM生物素化PEG(1kDa)封闭并且用封闭缓冲液封闭。将d-Ab功能化微粒在具有0.1％ BSA的PBS(测定缓冲液)中稀释至66μg/mL，并且注入到c-Ab功能化传感器表面。将分析物PCT加入测定缓冲液中，并且将30μL溶液注入到传感器流通室中。每次注入都在流动反转(即在入口或出口交替供应)下进行，以使在传感器有效视野中的粒子的损失最小化。洗涤用测定缓冲液注入进行，与PCT测量相同，至少洗涤3次以达到基线结合粒子分数(空心符号)。在明场照明下以60Hz追踪粒子运动达10分钟。数据清楚地显示出传感器的监测功能，即传感器对PCT浓度的响应和传感器的可逆性。
其他信息
在本发明的装置或方法的其他实施方案中，生物传感器可以不与感兴趣的系统直接接触，或者可以与感兴趣的系统直接接触。备选地，生物传感器可以嵌入或集成或植入到感兴趣的系统中。生物传感器可以放置在距感兴趣的系统一定距离的地方。然而，生物传感器可以位于感兴趣的系统附近、系统上、无线集成等。样品可以放在容器中，然后输送到生物感测系统(有时被称为在线或离线操作)，样品可以被采集并且自动输送到生物感测系统(有时被称为在线操作)，或者生物感测系统可以与感兴趣的系统完全集成(有时被称为在线操作或旁路操作)。
在本发明的其他实施方案中，所述装置或方法可以连接到或集成到工业系统或过程、发酵罐、生物反应器、体上装置、导管、体内装置、可穿戴装置或可隐藏装置中。
在具有监测功能的生物感测系统中，可以获取时间相关的样品，可以记录测量数据，并且可以建立分析物浓度随时间变化的时间分布曲线。此外，生物传感器可以被配置为接收一系列样品(来自相同或不同来源)，其中该系列样品在生物传感器上连续测量并且产生与已经供应给生物传感器的不同样品相关的时间相关数据。
在本发明的其他实施方案中，所述装置或方法可以与用于样品预处理或分析物预处理(例如试剂添加、稀释、过滤、提取、富集、纯化、分离、扩增、缓冲液条件的改变、稳定化、(解)聚集或者化学基团或生化结构域或残基或部分的去除、修饰或添加)的方法或装置模块组合。
在本发明的其他实施方案中，所述装置或方法可以与用于优化或控制操作(例如温度、湿度、压力、光照条件、振动条件、声音条件、无菌、卫生、进入保护、清洁、零件更换、易于维护、校准等)的方法或装置模块组合。
序列表
<110> 埃因霍芬理工大学
<120> 利用粒子运动的生物传感器
<130> PA230346C
<150> NL2026320
<151> 2020-08-21
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 粒子结合剂
<400> 1
agcatggcac t 11
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 分析物
<400> 2
tcgtaccgtg agtaataatg cg 22
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测
<400> 3
cattattaca agctaagctc ttgcactgac g 31
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表面结合剂
<400> 4
cgattccaga acgtgactgc ttttt 25

Claims (18)

1.一种用于利用粒子运动在一定时间段内感测分析物的生物传感器装置，所述生物传感器装置具有表面和粒子，其中所述粒子和/或所述表面被功能化，并且其中：
-所述生物传感器装置具有其中所述粒子与所述表面缔合的第一状态和其中所述粒子未与所述表面缔合的第二状态；并且
-在所述第一状态和所述第二状态之间的转换取决于所述分析物的存在、不存在和/或浓度，
由此所述粒子的运动特性根据所述分析物的存在、不存在和/或浓度而是可变化的，从而允许通过测量所述粒子相对于所述表面的空间坐标参数来感测所述分析物，
其中对所述粒子和表面的性质进行选择，使得在所述第二状态下，所述粒子在所述表面附近，使得所述生物传感器能够测量所述粒子相对于所述表面的空间坐标参数的变化，优选地其中在所述第二状态下在所述粒子和所述表面之间的距离在5nm至10μm的范围内，并且
其中所述粒子未与所述表面缀合。
2.根据权利要求1所述的生物传感器装置，其中，其中所述粒子与所述表面缔合的所述第一状态包括第一缔合状态和第二缔合状态，其中：
-所述第一缔合状态包括在粒子和表面之间的单分子键；并且
-所述第二缔合状态包括在粒子和表面之间的两个或多于两个的单分子键。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感器装置，其中所述生物传感器装置包括至少10个粒子，更优选至少100个粒子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器装置，其中所述生物传感器装置包括在415×415μm2区域中的几个粒子至数千个粒子的密度。
5.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器装置，其中所述生物传感器装置包括具有衍射极限的光学系统，所述生物传感器装置包括与最近邻粒子相隔至少所述光学系统的所述衍射极限的粒子。
6.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器装置，其中所述生物传感器装置实施结合测定、竞争测定、置换测定、夹心测定、酶促测定、利用目标和/或信号放大的测定、多步测定或利用分子级联的测定。
7.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器装置，其中：
-所述粒子被第一部分功能化，其中所述第一部分与所述粒子结合；或
-所述表面被第二部分功能化，其中所述第二部分与所述表面结合，
其中所述部分与所述分析物具有结合亲和力。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的生物传感器装置，其中：
-所述粒子被第一部分功能化，其中所述第一部分与所述粒子结合；并且
-所述表面被第二部分功能化，其中所述第二部分与所述表面结合，
其中根据所述分析物的存在、不存在或浓度，所述部分彼此具有结合亲和力。
9.根据权利要求7或8所述的生物传感器装置，其中：
-所述分析物和所述第一部分相对于所述分析物和所述第二部分的解离速率常数相差至少3倍，优选地相差至少5倍；或
-所述第一部分和所述第二部分相对于所述分析物和所述第一部分和/或相对于所述分析物和所述第二部分的解离速率常数相差至少3倍，优选地相差至少5倍。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的生物传感器装置，其中所述生物传感器装置具有在100至108个部分/μm2范围内的部分的密度，优选地其中与所述粒子或与所述表面结合的所述部分具有在101至107个部分/μm2、102至106个部分/μm2或103至105个部分/μm2范围内的密度。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的生物传感器装置，其中所述第一部分或所述第二部分是蛋白质、抗体、其片段、重组蛋白质、肽、碳水化合物、糖、分子印迹聚合物、小分子、核酸、DNA分子、PNA分子、适体、纳米抗体、多价结合剂或它们的组合，优选地其中所述第一部分或所述第二部分是用于葡萄糖、电解质、代谢物、小分子、脂质、碳水化合物、肽、激素、药物、药物代谢物、蛋白质、寡核苷酸、DNA、RNA、纳米粒子、细胞外囊泡、外泌体、纳米体、脂质体、病毒粒子、细胞、细胞碎片、超分子体或蛋白质聚集体的结合分子。
12.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器装置在执行多路复用、优选地分析物多路复用、空间多路复用、光谱多路复用、探针功能多路复用的方法中的用途。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的生物传感器装置作为传感器的用途，所述传感器在用于感测或检测的系统上或在所述系统中或作为所述系统的一部分，所述系统包括内窥镜、管、针、纤维、导管、贴片、一次性探针、流通池或一次性卡盒。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的生物传感器装置，其用于体内生物感测、离体生物感测或体外生物感测，诸如用于体外诊断测试、即时测试、环境测试、食品测试、过程监测、过程控制、法医学、生物学、生物医学和药物研究，或者用于监测利用活细胞、组织或器官的测定。
15.一种利用粒子运动来感测分析物的方法，所述方法包括：
a)使含有所述分析物的基质与根据权利要求1-11中任一项所述的生物传感器装置接触；和
b)检测所述粒子的运动特性，所述运动特性根据所述分析物的存在、不存在和/或浓度而变化，
其中所述运动特性包括所述粒子相对于所述表面的空间坐标参数。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述粒子：
-被布置成以平均有效解离时间从所述第一状态转换至所述第二状态；并且
-被布置成以平均有效缔合时间从所述第二状态转换至所述第一状态，并且
其中检测所述粒子的运动特性的步骤b)在比所述平均有效解离时间和/或所述平均有效缔合时间更长的时间段内执行。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中在步骤b)中，含有所述分析物的基质的流动方向是连续或间歇地变化的。
18.根据权利要求17所述的方法，其中流动的变化经历随机流动方向变化或反向流动方向变化。
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