CN106233140A - 用于增强测定灵敏度的数字lspr - Google Patents

用于增强测定灵敏度的数字lspr Download PDF

Info

Publication number
CN106233140A
CN106233140A CN201580022387.3A CN201580022387A CN106233140A CN 106233140 A CN106233140 A CN 106233140A CN 201580022387 A CN201580022387 A CN 201580022387A CN 106233140 A CN106233140 A CN 106233140A
Authority
CN
China
Prior art keywords
analyte
change
interest
systems
sensor surface
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580022387.3A
Other languages
English (en)
Inventor
达尼埃勒·格利翁
兰道夫·斯托勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LamdaGen Corp
Original Assignee
LamdaGen Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LamdaGen Corp filed Critical LamdaGen Corp
Publication of CN106233140A publication Critical patent/CN106233140A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明提供了与检测分析物的存在和/或测定分析物的浓度相关的系统、方法和装置。分析物可提供于LSPR活性表面上。该LSPR活性表面可包含灵敏度增强标记物。该分析物可在接近该LSPR活性表面处诱导局部变化。该LSPR活性表面可在反应发生之前、期间或之后采用成像装置成像以获得图像。可分析该图像内感兴趣的局部区域以检测局部变化。

Description

用于增强测定灵敏度的数字LSPR
交叉引用
本申请要求2014年2月26日提交的第61/966,576号美国临时申请和2015年1月28日提交的第62/108,979号美国临时申请的权益，这些美国临时申请通过引用并入本文。
背景技术
为检测和定量特定分子(例如分析物或标记物)和/或分析分子相互作用而设计的仪器的精确性、灵敏度、再现性和易用性在包括生物医学研究、临床诊断学、环境测试和工业过程监测在内的许多领域都受到重要关注。这些关注受多种因素驱动，包括与例如在生物医学研究中产生和/或分离感兴趣的分子相关的困难及成本，或健康照护领域中诊断测试结果对正确诊断和治疗疾病可能具有的重要影响。通常，分子可仅以极低浓度存在于感兴趣的样品中，并且可能需要极其灵敏的检测测定。虽然存在多种测定程序和检测技术，但它们通常不足以检测微量存在于样品中的分析物。因此，不断地需要改进测定装置和仪器、尤其是欲用于现场测试或照护点(point-of-care)诊断学测试应用所需的灵敏度、检测极限、定量和/或产生结果的时间。信号放大和/或检测技术的改进将在达到这些目标中起重要作用。
发明内容
本文公开的实施方案提供了用于检测和/或定量分析物的改进方法。在许多实施方案中，检测或定量可借助于光学系统和LSPR传感器实现。
因此，在一个方面，提供了一种用于检测样品中的分析物的方法。该方法包括：捕获传感器表面的一系列两个或更多个图像，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振(surface plasmon resonance)；在所述一系列两个或更多个图像中选择一个或多个相应的感兴趣区域；在所述一系列两个或更多个图像上测量选定的感兴趣区域内的颜色变化；以及基于所测量的颜色变化检测分析物。
在一些实施方案中，用于检测分析物的检测极限优于1ng/mL。在一些实施方案中，用于检测分析物的检测极限优于1pg/mL。在一些实施方案中，用于检测分析物的检测极限优于1fg/mL。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所测量的颜色变化测定分析物的浓度。在一些实施方案中，该颜色变化是相应的感兴趣区域中的像素RGB值的变化。在一些实施方案中，所测量的颜色变化是从传感器表面反射的光的颜色变化。在一些实施方案中，选定的感兴趣区域中的每一个是传感器表面上约为或小于5um2的区域。在一些实施方案中，选定的感兴趣区域中的每一个是3×3像素的网格。在一些实施方案中，所述一系列两个或更多个图像在局部分析物诱导的变化发生之前和之后捕获。在一些实施方案中，该分析物选自：肽、蛋白质、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子、病毒、细菌、细胞、脂质分子、碳水化合物分子、有机小分子、药物分子或离子。在一些实施方案中，传感器表面与第一结合组分、分析物和第二结合组分依次或同时接触，其中第二结合组分是灵敏度增强标记物。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是催化反应物转化成不溶性产物，从而在传感器表面上形成沉淀物的酶。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物催化这样的反应：该反应导致聚合物、生物聚合物、化学化合物或选自无机化合物、有机化合物、化学发光化合物和荧光化合物的酶促反应产物的沉积。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是能够诱导金属纳米颗粒与传感器表面之间的等离子体-等离子体耦合的金属纳米颗粒。在一些实施方案中，所述一个或多个相应的感兴趣区域是随机选择的。在一些实施方案中，选择多个相应的感兴趣区域。在一些实施方案中，所述多个相应的感兴趣区域是10个或更多个相应的感兴趣区域。在一些实施方案中，所述多个相应的感兴趣区域是100个或更多个相应的感兴趣区域。在一些实施方案中，捕获一系列两个或更多个图像所需的积分时间短于50ms。在一些实施方案中，分析物以100ng/mL或更低的量存在于样品中。在一些实施方案中，分析物以1ng/mL或更低的量存在于样品中。在一些实施方案中，分析物以1pg/mL或更低的量存在于样品中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括接收包含该方法的结果的报告，以及基于所报告的结果作出医疗保健决定，其中样品为患者样品。
在另一方面，提供了一种用于检测样品中的分析物的系统。该系统包含：传感器表面，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；光学成像装置，其中该光学成像装置能够捕获一系列两个或更多个图像；以及处理器，其中该处理器能够在所述一系列两个或更多个图像中选择一个或多个相应的感兴趣区域，测量选定的感兴趣区域内的颜色变化，以及基于所测量的颜色变化检测分析物。
在一些实施方案中，用于检测分析物的检测极限优于1ng/mL。在一些实施方案中，用于检测分析物的检测极限优于1pg/mL。在一些实施方案中，用于检测分析物的检测极限优于1fg/mL。在一些实施方案中，所述处理器能够基于所测量的颜色变化测定分析物的浓度。在一些实施方案中，该颜色变化是相应的感兴趣区域中的像素RGB值的变化。在一些实施方案中，所述传感器表面是不透明的且反射光。在一些实施方案中，所述相应的感兴趣区域中的每一个是传感器表面上约为或小于5um2的区域。在一些实施方案中，所述相应的感兴趣区域中的每一个是3×3像素的网格。在一些实施方案中，所述一系列两个或更多个图像在颜色变化之前和之后捕获。在一些实施方案中，分析物选自：肽、蛋白质、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子、病毒、细菌、细胞、脂质分子、碳水化合物分子、有机小分子、药物分子或离子。在一些实施方案中，所述系统进一步包含用于将样品和测定试剂递送至传感器表面的流体系统，其中该测定试剂包含第一结合组分和第二结合组分，并且其中第二结合组分包含灵敏度增强标记物。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是催化反应物转化成不溶性产物，从而在传感器表面上形成沉淀物的酶。在一些实施方案中，该酶催化这样的反应：该反应导致聚合物、生物聚合物、化学化合物或选自无机化合物、有机化合物、化学发光化合物和荧光化合物的酶促反应产物的沉积。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是能够诱导金属纳米颗粒与传感器表面之间的等离子体-等离子体耦合的金属纳米颗粒。在一些实施方案中，所述处理器能够在所述一系列两个或更多个图像中随机选择一个或多个相应的感兴趣区域。在一些实施方案中，所述处理器能够选择多个相应的感兴趣区域。在一些实施方案中，所述多个相应的感兴趣区域是10个或更多个相应的感兴趣区域。在一些实施方案中，所述多个相应的感兴趣区域是100个或更多个相应的感兴趣区域。在一些实施方案中，所述光学成像装置的积分时间短于50ms。在一些实施方案中，分析物以100ng/mL或更低的量存在于样品中。在一些实施方案中，分析物以1ng/mL或更低的量存在于样品中。在一些实施方案中，分析物以1pg/mL或更低的量存在于样品中。在一些实施方案中，样品包含患者样品，并且分析物的检测用于临床诊断应用。
在另一方面，提供了一种计算机可读介质，其包括使计算机执行方法的代码。该方法包括：在传感器表面的一系列两个或更多个图像的每一个中选择一个或多个相应的感兴趣区域，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；通过比较所述一系列两个或更多个图像中相应的感兴趣区域的颜色来测量颜色变化；以及基于所测量的颜色变化来确定分析物的存在。
在一些实施方案中，所述一个或多个相应的感兴趣区域是随机选择的。在一些实施方案中，选择多个感兴趣区域。在一些实施方案中，所述颜色变化是所述相应的感兴趣区域内的像素RGB值的变化。在一些实施方案中，该RGB值的变化根据公式测量，其中ΔR、ΔG和ΔB对应于图像中红色、绿色和蓝色像素值的变化。在一些实施方案中，所述方法进一步包括计算RGB或灰度值变化的分布的色矩。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用模式挖掘算法来描绘对分析物接触表现出不同反应的传感器表面的区域。
在另一方面，提供了一种用于测定样品中的分析物浓度的方法。该方法包括：检测接近传感器表面的局部分析物诱导的变化，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；以及基于该局部分析物诱导的变化来测定分析物的浓度，其中该方法的检测极限优于1fg/ml。在一些实施方案中，用数字成像系统检测分析物诱导的变化。
在另一方面，提供了一种用于检测样品中的分析物的方法。该方法包括：捕获传感器表面的一系列两个或更多个图像，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；以及检测局部分析物诱导的变化，其中该变化在所述一系列两个或更多个图像中可检测到。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于局部的分析物诱导的变化来测定分析物的浓度。在一些实施方案中，在所述一系列两个或更多个图像的每一个中的相应的感兴趣区域中检测局部分析物诱导的变化。在一些实施方案中，该感兴趣区域是随机选择的。在一些实施方案中，考虑多个感兴趣区域。在一些实施方案中，相应的感兴趣区域包含在所述一系列两个或更多个图像的每一个中具有相同的一组坐标的一个或多个像素。在一些实施方案中，感兴趣区域的大小对应于传感器表面上约为或小于5um2的区域。在一些实施方案中，用于测定分析物浓度的检测极限优于1fg/mL。在一些实施方案中，所述局部分析物诱导的变化是接近传感器表面的介电常数或传感器表面的光学性质的变化。在一些实施方案中，所述局部分析物诱导的变化是从传感器表面反射的光的光学性质的变化。在一些实施方案中，该光学性质的变化是光的吸收最大值的位移。在一些实施方案中，传感器表面的吸收最大值通过调节组成传感器的材料的介电常数来修改。在一些实施方案中，使用选自光源、透镜、反射镜、滤光器、分束器、棱镜、CCD或CMOS图像传感器的一或多种组件来捕获所述一系列两个或更多个图像。在一些实施方案中，所述一系列两个或更多个图像在所述局部分析物诱导的变化之前和之后捕获。在一些实施方案中，一系列三个或更多个图像在所述局部分析物诱导的变化之前、期间和之后捕获。在一些实施方案中，使传感器表面与第一结合组分、分析物和第二结合组分同时或依次接触，其中第二结合组分能够结合该分析物或分析物-第一结合组分复合物，并且其中第二结合组分包含灵敏度增强标记物。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是催化反应物转化成不溶性产物，从而在传感器表面上形成沉淀物的酶。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是能够诱导金属纳米颗粒与传感器表面之间的等离子体-等离子体耦合的金属纳米颗粒。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物催化这样的反应：该反应导致聚合物、生物聚合物、化学化合物或选自无机化合物、有机化合物、化学发光化合物、荧光化合物的酶促反应产物的沉积。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是磁性胶体或等离子体胶体。在一些实施方案中，检测局部分析物诱导的变化包括将所述一系列两个或更多个图像中的每一个分成多个感兴趣区域，选择一个或多个感兴趣区域，以及在所述一系列图像上测量在选定的感兴趣区域内的RGB和/或灰度强度值的变化。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于RGB和/或灰度强度值的变化来测定分析物的浓度。在一些实施方案中，所述一个或多个感兴趣区域由3×3像素的网格组成。在一些实施方案中，所述一个或多个感兴趣区域是随机选择的。在一些实施方案中，分析物选自：肽、蛋白质、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子、病毒、细菌、细胞、脂质分子、碳水化合物分子、有机小分子、药物分子或离子。在一些实施方案中，第一结合组分为抗体、抗体片段、适体、分子印迹聚合物、生物素、链霉亲和素、组氨酸标签、螯合金属离子如Ni-NTA，或寡核苷酸探针。在一些实施方案中，第二结合组分为抗体、抗体片段、适体、分子印迹聚合物、生物素、链霉亲和素、组氨酸标签(his-tag)、螯合金属离子如Ni-NTA，或寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)。在一些实施方案中，所述传感器表面包含吸附的颗粒，其包含贵金属、非贵金属、金属、金属氧化物、金属合金、金属掺杂半导体、非金属复合材料或聚合物。在一些实施方案中，所述传感器表面包含吸附的金或金覆盖的颗粒(gold-cappedparticles)。在一些实施方案中，所述传感器表面包含中空的或多孔的吸附的颗粒。在一些实施方案中，所述传感器表面包含具有核/壳结构的吸附的颗粒，其中核与壳材料是不同的。在一些实施方案中，所述颗粒具有约5nm至2.5um的直径。在一些实施方案中，所述颗粒通过机械、真空或化学方法进行图案化或沉积。在一些实施方案中，所述传感器表面包含通过向金属薄膜施加热以形成岛状物而产生的纳米结构或微米结构。在一些实施方案中，所述传感器表面包含使用光刻术(lithography)和蚀刻技术产生的纳米结构或微米结构。在一些实施方案中，所述传感器表面包含使用纳米印刷技术产生的纳米结构或微米结构。在一些实施方案中，所述传感器表面能够在一部分传感器表面上维持局域表面等离子体共振。在一些实施方案中，同时处理两个或更多个样品。在一些实施方案中，所述方法进一步包括测定至少第二分析物的浓度，其中样品包含两种或更多种不同类型的分析物。
在另一方面，提供了一种用于测定样品中的分析物浓度的成像系统。该系统包含：传感器表面，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；以及传感器，其中该传感器能够检测局部的分析物诱导的变化；以及处理器，其中该处理器可测定分析物的浓度，其中检测极限优于1fg/ml。
在一些实施方案中，所述传感器包含数字成像装置。
在另一方面，提供了一种用于检测样品中的分析物的系统。该系统包含：传感器表面，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；以及光学系统，其中该光学系统能够捕获一系列两个或更多个图像，并且在所述一系列两个或更多个图像中检测局部分析物诱导的变化。
在一些实施方案中，所述光学系统包含用于处理所述一系列两个或更多个图像并且基于局部分析物诱导的变化来测定分析物的浓度的处理器。在一些实施方案中，在所述一系列两个或更多个图像的每一个中的相应的感兴趣区域中检测局部分析物诱导的变化。在一些实施方案中，所述感兴趣区域是随机选择的。在一些实施方案中，考虑多个感兴趣区域。在一些实施方案中，相应的感兴趣区域包含在所述一系列两个或更多个图像的每一个中具有相同的一组坐标的一个或多个像素。在一些实施方案中，感兴趣区域的大小对应于传感器表面上约为或小于5um2的区域。在一些实施方案中，用于测定分析物浓度的检测极限优于1fg/mL。在一些实施方案中，所述局部分析物诱导的变化是接近传感器表面的介电常数或传感器表面的光学性质的变化。在一些实施方案中，所述局部分析物诱导的变化是从传感器表面反射的光的光学性质的变化。在一些实施方案中，该光学性质的变化是光的吸收最大值的位移(shift)。在一些实施方案中，通过调节组成传感器的材料的介电常数来修改传感器表面的吸收最大值。在一些实施方案中，所述光学系统包含光源、透镜、反射镜、滤光器、分束器、棱镜、CCD和/或CMOS图像传感器。在一些实施方案中，在局部分析物诱导的变化之前和之后捕获所述一系列两个或更多个图像。在一些实施方案中，在局部分析物诱导的变化之前、期间和之后捕获一系列三个或更多个图像。在一些实施方案中，所述系统进一步包含用于将样品和测定试剂递送至传感器表面的流体系统。在一些实施方案中，该测定试剂包含第一结合组分(primary binding component)和第二结合组分(secondarybinding component)，并且其中第二结合组分包含灵敏度增强标记物。在一些实施方案中，使传感器表面与第一结合组分、分析物和第二结合组分同时或依次接触。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是酶，该酶催化反应物转化成不溶性产物，从而在传感器表面上形成沉淀物。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是能够诱导金属纳米颗粒与传感器表面之间的等离子体-等离子体耦合的金属纳米颗粒。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物催化这样的反应：该反应导致聚合物、生物聚合物、化学化合物或选自无机化合物、有机化合物、化学发光化合物、荧光化合物的酶促反应产物的沉积。在一些实施方案中，该灵敏度增强标记物是磁性胶体或等离子体胶体。在一些实施方案中，所述光学系统包含处理器，该处理器能够将所述一系列两个或更多个图像中的每一个分成多个感兴趣区域，选择一个或多个感兴趣区域，并且在所述一系列图像上测量在选定的感兴趣区域内的RGB和/或灰度强度值的变化。在一些实施方案中，该处理器进一步能够基于所测量的RGB和/或灰度强度值的变化来测定分析物的浓度。在一些实施方案中，所述一个或多个感兴趣区域由3×3像素的网格组成。在一些实施方案中，所述一个或多个感兴趣区域是随机选择的。在一些实施方案中，RGB和/或灰度强度值的变化量值与样品中分析物的浓度相关。在一些实施方案中，该分析物选自：肽、蛋白质、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子、病毒、细菌、细胞、脂质分子、碳水化合物分子、有机小分子、药物分子或离子。在一些实施方案中，第一结合组分为抗体、抗体片段、适体、分子印迹聚合物、生物素、链霉亲和素、组氨酸标签、螯合金属离子如Ni-NTA，或寡核苷酸探针。在一些实施方案中，第二结合组分为抗体、抗体片段、适体、分子印迹聚合物、生物素、链霉亲和素、组氨酸标签、螯合金属离子如Ni-NTA，或寡核苷酸探针。在一些实施方案中，所述传感器表面包合吸附的颗粒，其包含贵金属、金属、金属氧化物、金属合金、金属惨杂半导体、非金属复合材料或聚合物。在一些实施方案中，所述传感器表面包含吸附的金或金覆盖的颗粒。在一些实施方案中，所述传感器表面包含中空的或多孔的吸附的颗粒。在一些实施方案中，所述传感器表面包含具有核/壳结构的吸附的颗粒，其中核和壳材料是不同的。在一些实施方案中，所述颗粒具有约5nm至2.5um的直径。在一些实施方案中，所述颗粒通过机械、真空或化学方法进行图案化。在一些实施方案中，所述传感器表面包含通过向金属薄膜施加热以形成岛状物而产生的纳米结构或微米结构。在一些实施方案中，所述传感器表面包含使用光刻术和蚀刻技术产生的纳米结构或微米结构。在一些实施方案中，所述传感器表面包含使用纳米印刷技术产生的纳米结构或微米结构。在一些实施方案中，所述传感器表面能够在一部分传感器表面上维持局域表面等离子体共振。在一些实施方案中，同时处理两个或更多个样品。在一些实施方案中，所述系统经进一步配置用于测定至少第二分析物的浓度，其中样品包含两种或更多种不同类型的分析物。
在另一方面，提供了一种计算机可读介质，其包括使计算机执行方法的代码。在一些实施方案中，该方法包括：在传感器表面的一系列两个或更多个图像的每一个中选择包含一个或多个图像像素的感兴趣区域，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；以及通过比较所述一系列两个或更多个图像中相应的感兴趣区域的RGB或灰度值来测量RGB或灰度值的变化。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在传感器表面的完整图像中生成分析区域(对该分析区域测量RGB或灰度值的指定变化)数目的直方图。在一些实施方案中，该方法进一步包括测定分析物浓度。在一些实施方案中，RGB值的变化根据公式计算，其中ΔR、ΔG和ΔB对应于图像中红色、绿色和蓝色组分的变化。在一些实施方案中，该方法进一步包括计算RGB或灰度值变化的分布的色矩。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用模式挖掘算法来描绘对分析物接触表现出不同反应的传感器表面区域。
在另一方面，提供了一种用于测定样品中的分析物浓度的方法。该方法包括：检测接近传感器表面的分析物诱导的变化，其中该分析物诱导的变化是用成像系统检测到的RGB颜色变化；以及基于步骤(a)中检测到的变化来测定分析物的浓度，其中该方法的检测极限小于1fg/ml。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在随附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的具体实施方式及其附图，将会获得对本发明的特征和优势的更好的了解，在附图中：
图1说明根据实施方案与LSPR传感器结合使用的ELISA测定形式。
图2说明根据实施方案与LSPR传感器结合使用的等离子体-等离子体耦合夹心法测定。
图3显示根据实施方案，由抗原以两种不同浓度固定引起的从测定表面反射的白光的消光(extinction)。
图4说明根据实施方案的数字LSPR的原理。
图5显示根据实施方案的光学系统。
图6显示根据实施方案，反应(例如ELISA反应)之前引向传感器表面的光的吸收，其不同于反应之后引向传感器表面的光的吸收。
图7说明根据实施方案，在反应发生之后获取的LSPR活性表面的图像。
图8说明根据实施方案，借助于直方图，数字LSPR概念及其在检测极限方面相比于传统LSPR测定形式的优越性。
图9说明根据实施方案，使用数字LSPR在若干表面覆盖度下检测分析物。
图10说明根据实施方案，在若平表面覆盖度下，传统LSPR与数字LSPR之间的比较。
图11说明根据实施方案，对应于各种整体(bulk)折射率变化的红色通道值(channel value)变化。
图12说明根据实施方案，对应于各种整体折射率变化的红色通道值变化。
图13是根据实施方案，列出了传统LSPR(例如，光谱检测)与数字LSPR(成像)之间的比较的表格。
图14说明对应于图7的图像的直方图，其在8位标度上显示成像之前与之后红色值的相对差(r值为0至255)。
具体实施方式
本公开内容的方法、装置和系统提供对样品中少量存在的分析物的检测和定量。尽管本公开内容可能提及样品中少量存在的分析物的检测和定量，但应当理解，这是指本文中提及的方法、装置和系统的能力，而不应理解为限制。因此，本公开内容的方法、装置和系统可用于样品中少量、适量或大量存在的分析物的检测和/或定量。该分析物可以是任何感兴趣的分子。该分析物可以是肽、蛋白质、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子、病毒、细菌、细胞、脂质分子、碳水化合物分子、有机小分子、药物分子或离子。可使用各种传感器检测分析物的存在。先前已研究了利用局域表面等离子体共振(LSPR)现象来光学检测分析物分子与传感器表面的结合的传感器。
表面等离子体是存在于负介电常数材料与正介电常数材料之间的界面处的连贯的离域电子振荡。例如，表面等离子体可存在于金属-介质界面如暴露于水溶液的薄金属膜。当通过入射光诱导电子振荡时，可能发生表面等离子体共振，其中入射光子的频率与表面电子的自然频率相匹配，所述表面电子相对于分布于金属内的带正电荷的原子核所施加的恢复力而振荡。局域表面等离子体共振可在由适当频率的光激发时在小金属纳米颗粒的表面或纳米结构化的表面发生。
LSPR传感器依赖于表面等离子体吸收最大值的位置对紧邻界面的局部环境的极大灵敏度。特别地，LSPR传感器中的信号转导机制通常可与LSPR活性表面附近的折射率(或介电常数)变化相关。LSPR传感器中的信号转导机制可能与传感器表面的光学性质变化(例如光的吸收最大值的位移)或从LSPR活性表面反射的光的光学性质变化相关。LSPR活性表面可指LSPR传感器表面。如果LSPR传感器表面与折射率为n1的膜或溶液接触放置，之后沉积于折射率为n2的材料表面上，则等离子体吸收最大值的波长位移Δλ的值。可以通过以下关系式将等离子体位移与折射率变化Δn＝n2-n1联系在一起:
Δλ＝m*Δn[1-e(-2L/δ)] (1)
其中m为表示传感器灵敏度的常数，L是折射率为n2的沉积材料的厚度，δ为渐消等离子体电场的衰减长度。在一些情况下，除了监测吸收最大值的位移之外，传感器表面附近的折射率(或介电常数)变化也可以通过监测其他光学性质来检测，例如入射光的反射角变化、透射光或反射光的强度变化、从表面反射的光的偏振变化等。随后可使用如下文进一步描述的多种光源和传感器中的任一种来监测表面或通过表面透射或反射的光的光学性质。
LSPR传感器可与各种信号放大技术(例如ELISA测定)结合使用。图1说明了根据实施方案与LSPR传感器结合使用的ELISA测定形式(ELISA assay format)。该ELISA测定形式是依赖于信号放大来提高测定灵敏度的、用于检测分析物的常用测定技术。在本文所公开的方法和系统的一些实施方案中，纳米结构化LSPR传感器表面与免疫沉淀ELISA测定形式和数字检测方案相组合，以实现极低的检测极限(例如在fg/ml范围内)。在ELISA测定中，针对感兴趣的分析物102的第一抗体可用来捕获传感器表面104上的分析物，并且与灵敏度增强标记物106缀合的第二抗体可与固定的分析物结合。该灵敏度增强标记物例如可以是酶，所述酶催化可溶性反应物转化成在传感器表面接近固定化酶的位置上形成沉积物的不溶性产物。LSPR传感器可用于检测由于沉积物108形成而引起的传感器表面的变化(例如折射率、介电常数等)。在本文公开的方法和装置的一些实施方案中，用作灵敏度增强标记物的酶是碱性磷酸酶，其催化5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸盐(BCIP，5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate)和硝基蓝四唑鎓盐(NBT，nitro-blue tetrazolium)的混合物转化成不溶性产物的混合物。
当在LSPR表面处形成薄免疫沉淀物时，估计预期峰值波长位移的数值可能是有益的。对于小沉积物，方程式(1)可被线性化并简化成
Δ λ = m * Δ n 2 L δ - - - ( 2 )
使用m/Δn＝200、Δn＝0.15(对于n2约为1.48且n1＝1.33的BCIP/NBT沉积)、δ约为30nm且L＝5nm，获得约为10nm的Δλ。因此，可预测5nm沉积物产生约10nm的等离子体波长位移。实际上，可观察到高达50-80nm的波长位移。已发现，与使用常规ELISA实现的值相比，在LSPR传感器表面上实施免疫沉淀ELISA测定形式将用于若干种测定的检测极限改善了约1个数量级。
除了对如上所述的局部折射率变化灵敏之外，还可存在能够产生较大局域表面等离子体共振位移的其他转导机制。例如，等离子体-等离子体耦合也可产生较大的局域等离子体共振位移。图2说明了根据实施方案，与LSPR传感器结合使用的等离子体-等离子体耦合夹心法。在此实施方案中，等离子体部分201，例如能够维持表面等离子体的颗粒，如胶体金颗粒或银颗粒，与作为灵敏度增强标记物的第二抗体203缀合。当第二抗体固定于表面上时，在颗粒等离子体与传感器表面等离子体之间发生强耦合，并导致测量到较大的等离子体位移。
作为说明性实例，考虑了等离子体颗粒如40nm金胶体。当链霉亲和素结合至40nm金胶体的表面时，其在金胶体的等离子体位置产生大约2nm的位移。相反，如果链霉亲和素附接至40nm金胶体并且该生物分子-金胶体缀合物与第二等离子体颗粒接触，则胶体颗粒之间的等离子体-等离子体耦合产生极大的等离子体位移，可能超过70nm。该现象已在技术文献中报道，其使用溶液中的胶体颗粒对，并且对于其他配置，使用在溶液中的一个胶体颗粒和在表面上的等离子体配偶体。
上述两种信号放大机制(即，使用作为灵敏度增强标记物的缀合的酶来催化反应，引起局部折射率变化，并且使用缀合的金属纳米颗粒来产生等离子体-等离子体耦合)导致量值可达到数十纳米的等离子体位移。增强的局域表面等离子体共振位移与生物测定的增强的检测极限(LOD)相关。通常，在纳米结构化LSPR表面上进行的ELISA测定的LOD在(亚)pg/mL分析物的范围内。对于平均约60kDa的分析物，这些LOD对应于约1010个分析物分子/毫升溶液。
用作传感器的大多数LSPR仪器可以测量模拟信号。模拟信号可表示所记录的信号是由多个分析物分子在表面上结合所产生的平均信号。各个结合事件在时间和空间上作为随机过程发生，并且其本身可能无法通过己知的检测方案直接检测。随着时间的推移，随机性可在表面上产生明确定义的平均数目的固定分子。当固定分子的平均数目超过检测极限时，仪器可产生正读数。相反，当固定分子的平均数目不超过检测极限(例如，由于分析物的浓度低)时，尽管存在分析物，仪器也可产生负读数。
图3显示根据实施方案，由抗原以两种不同浓度的固定引起的从测定表面反射的白光的消光(extinction)。测量了(例如经由光谱检测)低抗原浓度302和高抗原浓度304的模拟信号。对于每个抗原浓度，在放大之前和之后测量来自测定表面的白光的消光。在高抗原浓度时，在放大306之前测量的来自测定表面的白光的消光明显不同于在放大308之后测量的来自测定表面的白光的消光。然而，对于低抗原浓度108，在放大310之前测量的来自测定表面的白光的消光与放大312之后测量的值无法区分。
由折射率变化或等离子体-等离子体耦合引起的等离子体位移可能不依赖于LSPR感测区域的大小(例如，如方程式(1)所示)。已成功证明了小至20nm的LSPR感测区域。使用如此小的感测区域的困难可能在于所收集的光子的数目较小。因此，测量峰值位移的模拟光谱分析可能需要比1分钟长得多的较长的积分时间(integration time)。对于在定量测定中所需的精确测量，通过信号平均化来减少光学检测中固有的噪音所需的信号测量数目可使总信号收集时间长于10-100分钟，因为信噪比随着信号采样重复的数目而按比例增大(例如)。
当有限数目的光子从传感器表面反射(例如，由于分析物的浓度低或传感器表面小)时，可使用数字检测方案(例如数字LSPR)。数字检测方案可使得能够检测单个结合事件，和/或检测局部区域(小感测区域)中的结合事件。单个分子与其配体的结合是二进制或数字过程(例如，结合或不结合)。因此，检测个别结合事件的能力可能达到先前未曾获得的测定灵敏度。
图4说明了根据实施方案的数字LSPR的原理。在一些实施方案中，分析物诱导的光学性质(例如等离子共振峰值波长的位移)的检测可利用到白光照明、能够形成LSPR传感器表面的放大图像的光学系统、用来捕获图像的彩色或灰度CCD或CMOS相机以及测量图像每个像素的RGB或灰度值的变化的算法。在数字LSPR中，不溶性产物或强等离子体-等离子体耦合可产生或诱导LSPR活性表面的折射率的局部变化，该LSPR活性表面本身显现为具有在放大之下可检测到的不同颜色位移(例如图4中的黑色斑点)的局部区域。如果分析物的浓度较高(例如，在pg/ml范围内)，则固定分析物分子的表面密度可使得整个传感器表面402覆盖有黑色斑点，并且分析物可通过传统光谱手段以及数字检测方案检测到。然而，如果被表面捕获的抗原的数目较小(例如，分析物浓度为几fg/ml或更低)，则局部化的颜色位移可能无法通过光谱手段解析，但可如404中所示以数字方式检测到。
对于本文中提及的数字检测方案，1-5nm的局部光谱位移可等同于可在彩色图像中捕获且通过像素的RGB或灰度值变化来定量的局部颜色变化。例如，约5nm的局部光谱位移可能与对应于固定分析物分子在传感器表面放大图像中的位置的一个或多个像素的(255中的)约1至3的RGB值变化相关。测量个别图像传感器像素的颜色或强度可比测量照射到其上的光的全光谱需要更少的光子。因此，与传统光谱检测相比，数字颜色和/或强度检测可提供快速采样率的优势。然而，数字和光谱检测方法两者含有相似的信息(例如光谱位移)。因此，对于光子计数有限的um2范围及以下的感测区域，数字检测可提供用于检测大于5nm的共振峰值位移的优良方法。
数字检测方案可使用LSPR传感器。LSPR传感器可包含LSPR活性表面。LSPR活性表面可以是能够维持局域表面等离子体共振的任何表面。表面等离子体在LSPR传感器中的定位来源于金属纳米颗粒或纳米结构化金属表面的使用。如下文将更全面描述的，存在本领域技术人员已知的用于制造能够维持局域表面等离子体共振的合适传感器表面的多种方法，参见例如Takei等人，美国专利号6,331,276，其通过引用以其全文并入本文。制造纳米结构化LSPR传感器所需的组件可包括基板、金属层或膜、纳米颗粒或纳米结构，和/或其他介电材料或绝缘材料。
LSPR活性表面可包含传感器基板。纳米结构化的LSPR传感器基板可使用多种材料来制造，包括但不限于玻璃、熔融二氧化硅、硅、陶瓷、金属或聚合物材料。在一些实施方案中，希望基板材料是光学透明的，以使得传感器表面可以从背侧照明。在其他实施方案中，传感器表面从前侧照明，并且基板材料的透明度或不透明度并不重要。在一些实施方案中，可能需要测量透射穿过传感器表面的光的性质。在一些实施方案中，可能需要测量从传感器表面反射的光的性质。例如，在对分析物的等离子体反应方面，测量从传感器表面反射的光的性质可优于测量透射穿过传感器表面的光。通常，用于制造纳米结构化LSPR传感器的基板将具有至少一个平坦表面。然而，在一些实施方案中，基板可具有弯曲表面(例如，凸出表面或凹陷表面，或一些其他几何形状的表面)。
纳米结构化LSPR传感器可包含一个或多个金属层或金属薄膜。在一些实施方案中，可存在约1、2、5、10、15、20个或更多的金属层。在一些实施方案中，用于层或膜的优选金属将是贵金属，如金、银、铂、钯等。在一些实施方案中，可使用非贵金属，例如铜。使用贵金属的一个优势可以是它们由于传导带电子的高迁移率而能够支持表面等离子体活动的能力。对于一些贵金属，另外一个优势是它们抵抗化学腐蚀或氧化的能力。金属层或金属薄膜可包含本文中提及的优选金属的任何混合物和/或任何组合。例如，金属层可包含一层金、一层铜和一层银与铂的混合物。金属层或膜可通过本领域技术人员已知的任何技术制造，包括但不限于热、电镀、溅涂、化学汽相沉积、真空沉积等。薄膜可具有5nm至500nm的厚度。
在一些实施方案中，纳米结构化的LSPR传感器将包括一层或多层介电(绝缘)材料。种类繁多的任何材料可用来产生介电材料，包括但不限于玻璃、陶瓷、硅或聚合物材料，如聚酰亚胺、杂芳环聚合物、聚(芳基醚)、含氟聚合物或缺乏极性基团的烃聚合物。聚合物层或薄膜可通过本领域技术人员已知的多种技术制造，包括但不限于溶液浇注和旋涂、化学汽相沉积、等离子体增强化学汽相沉积等。在一些实施方案中，纳米结构化LSPR传感器的表面等离子体共振性质(例如共振波长、吸收最大值等)可通过调节用来在两个金属层之间形成绝缘层的材料的厚度或介电常数来调整。
在一些实施方案中，纳米结构化或微米结构化的表面可通过将颗粒(例如纳米颗粒或细颗粒)吸附或附着至基板表面来制备。该颗粒可以是任何种类以及任何形状，包括但不限于球形、非球形、立方体、长方体、锥体、圆柱形、圆锥形、椭圆形、星形、短纳米线的形式、中空、多孔等。纳米颗粒可以是直径在5至500纳米范围内的颗粒。细颗粒可以是直径在500至2,500纳米范围内的颗粒。可使用许多不同颗粒类型中的任一种，包括但不限于金属、贵金属、金属氧化物、金属合金、金属掺杂半导体、非金属复合材料、聚合物、金或银胶体、介电纳米颗粒和微米颗粒、半导体纳米颗粒以及诸如核-壳纳米颗粒的杂合结构，其中许多可商购获得或者可通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种来制备。杂合结构可由不同的材料组成。例如，核-壳纳米颗粒可由固体外壳和液体内核组成。
在一些实施方案中，纳米结构化的LSPR表面如下制备：将纳米颗粒(例如非金属纳米颗粒)吸附或附着至基板表面，并且用薄金属膜涂覆或部分涂覆附着的颗粒以产生覆盖的颗粒表面，例如金覆盖的颗粒表面。纳米颗粒可涂覆有一层或多层薄金属膜。例如，纳米颗粒可涂覆有约1、2、5、10、20层或20更多层薄金属膜。在一些实施方案中，用于薄金属膜中的优选金属将是诸如金、银、铂、钯、铜等贵金属。薄金属膜可包含本文中提及的优选金属的任何混合物和/或任何组合。例如，薄金属膜可以由一层金、一层铜和一层银与铂的混合物组成。涂层可具有5nm至200nm的厚度。在一些实施方案中，纳米结构化的表面可覆盖整个基板表面。在其他实施方案中，纳米结构化的表面可仅覆盖基板表面的一部分，并且可以以预定义的图案分布在基板表面上。
在一些实施方案中，并非利用吸附或附着至表面上的纳米颗粒来产生纳米结构化LSPR表面，而是可使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种制造(例如，通过机械、真空或化学方法图案化)纳米结构化的表面。诸如圆柱形管柱或支柱、矩形管柱或支柱、圆柱形或矩形纳米孔等纳米结构可使用诸如光刻术、蚀刻和/或印刷等技术在多种基板材料中制造。例如，可使用光刻术和湿法化学蚀刻、反应性离子蚀刻或深反应性离子蚀刻、聚焦离子束铣削、对金属薄膜施加热以形成岛状物、浸笔纳米光刻术(dip-pennanolithography)、纳米印刷等制造纳米结构。
前述纳米结构的尺寸可在数纳米至数百纳米的范围内。在一些实施方案中，纳米结构化的表面可覆盖整个基板表面。在其他实施方案中，纳米结构化的表面可仅覆盖基板表面的一部分，并且可以以预定义的图案分布在基板表面上。传感器表面可能够在所有或部分传感器表面上维持局域表面等离子体共振。纳米结构化的表面可具有高或低密度。为了测量透射穿过传感器表面的光的性质，可能需要具有低密度的纳米结构化的表面。为了测量从传感器表面反射的光的性质，可能需要具有高密度的纳米结构化的表面。具有高密度纳米结构的表面可有效地吸收且散射光。在一些实施方案中，可能需要测量透射穿过传感器表面的光的性质。在一些实施方案中，可能需要测量从传感器表面反射的光的性质。例如，在对分析物的等离子体反应方面，测量从传感器表面反射的光的性质可优于测量透射穿过传感器表面的光。
LSPR活性表面可以以多种方式和/或步骤产生。作为一个说明性实例，产生本文中提及的一种类型的LSPR5活性表面的方法可包括1)在5-500nm厚范围内的AU薄膜的沉积，2)纳米大小的二氧化硅或聚合物颗粒(约10nm至2500nm大小)以随机、紧密堆积形式的化学沉积，和3)用一层或多层Au(约5nm至200nm厚)覆盖二氧化硅或聚合物颗粒。
如上所述，多种测定形式可使用纳米结构化LSPR传感器作为检测器来实施，包括但不限于夹心法免疫测定、酶联免疫吸附(ELISA)测定、电化学测定等。这些测定形式中有许多需要使用亲和试剂(或结合组分)，例如抗体，以赋予传感器表面对感兴趣的分析物的结合特异性。
用于检测和定量多种样品中的分析物的测定可使用纳米结构化LSPR传感器或合并纳米结构化LSPR传感器的装置来实施。样品的实例包括空气、气体、水、土壤或工业过程流样品，以及生物样品，如组织、细胞或任何体液，如血液、汗液、泪液、尿液或唾液。
用于检测和定量多种分析物(标记物、生物标志物)的测定可使用纳米结构化LSPR传感器来实施，所述分析物包括但不限于肽、蛋白质、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子、病毒、细菌、细胞、脂质分子、碳水化合物分子、有机小分子、药物分子或离子。
多种亲和试剂、亲和标签或第一结合组分中的任一种可用于以高特异性及高亲和性识别并结合目标分析物，包括但不限于抗体、抗体片段、适体、分子印迹聚合物、生物素、链霉亲和素、组氨酸标签、螯合金属离子如Ni-NTA，或寡核苷酸探针。在一些实施方案中，一种或多种第一结合组分在进行测定之前可预先固定在传感器表面上。在一些实施方案中，一种或多种第一结合组分可与样品混合，随后使传感器表面与样品接触(例如，作为测定程序的一部分)。
在一些实施方案中，多种亲和试剂、亲和标签或第二结合组分也可用来对纳米结构化LSPR传感器的性能赋予高特异性和增强的灵敏度。在一些实施方案中，第二结合组分可与灵敏度增强标记物缀合，以进一步提高该测定的灵敏度。适用于本文公开的方法和装置的第二结合组分的实例包括但不限于抗体、抗体片段、适体、分子印迹聚合物珠粒、生物素、链霉亲和素、组氨酸标签、螯合金属离子如Ni-NTA、寡核苷酸探针。灵敏度增强标记物的实例包括(i)催化不可检测的反应物转化成可检测的反应物(例如在纳米结构化LSPR传感器表面上形成沉积物的不溶性沉淀物)的酶，以及(ii)能够诱导与传感器表面的等离子体-等离子体耦合的金属纳米颗粒或微米颗粒。灵敏度增强标记物可催化这样的反应：该反应导致聚合物、生物聚合物、化学化合物或选自包括但不限于无机化合物、有机化合物、化学发光化合物、荧光化合物、磁性胶体和等离子体胶体的组的酶促反应产物的沉积。可适合用作灵敏度增强标记物的酶的实例包括但不限于碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。可适用于酶促转化成可在传感器表面上形成沉积物的不溶性沉淀物的反应物的实例包括但不限于5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸盐(BCIP)和硝基蓝四唑鎓盐(NBT)，或其混合物，其通过碱性磷酸酶转化成不溶性沉淀物。
本文描述的方法和系统可利用能够使表面与光学系统耦合的LSPR。光学系统可指数字成像系统。图5显示了根据实施方案的光学系统。光学系统可包含光源502、物镜504、反射镜、滤光器、分束器、棱镜、检测器(例如，CCD、CMOS传感器)506和/或相对于检测器固定的可经扫描或维持的平台。光源可为LED、激光、卤素源或其他光源。光源可在信号的放大(例如，等离子体-等离子体耦合或ELISA反应)发生之前和之后将光引向传感器表面。光源可从基板侧面或从传感器表面侧面引导光。图6显示了根据实施方案，在反应(例如，ELISA反应)之前引向传感器表面的光的吸收601不同于在反应之后引向传感器表面的光的吸收603。由于沉淀物在LSPR活性表面上的沉积，因此吸收峰从反应之前的约550nm上移至反应之后的约600nm。
可以将光源放置为使得光通常以90度入射至LSPR表面。类似地，可放置检测器使得它检测以90度从表面反射的光。可放置光源使得光通常以倾斜角入射至LSPR表面。光可被配置为狭窄且准直的。类似地，可放置检测器使得它检测以倾斜角从表面反射的光。光源可通过光通道或光纤导引。光通道或光纤可随后定位，以使得光离开光通道或光纤并且以所需角度入射至LSPR表面。
检测器可在等离子体-等离子体耦合或ELISA反应之前和之后检测光吸收峰的位移。检测器可检测光的任何光学性质，诸如吸收峰、反射光角度以及光的偏光性质。检测器可包含图像传感器。图像传感器可以是CCD传感器、CMOS传感器或NMOS传感器。图像传感器可捕获传感器表面的一系列图像。所述一系列图像可以是灰度图像。所述一系列图像可以是RGB图像。所述一系列图像可包含对应于在完成分析物的测定之前、期间和之后捕获的图像的图像帧(frames)。本文所描述的一系列图像可具有充分的细节，以使得可在一系列时移图像中检测到因分析物导致的变化。所述一系列图像可包含大约或超过1000个图像、500个图像、400个图像、300个图像、200个图像、100个图像、50个图像、10个图像、5个图像、4个图像、3个图像或2个图像。图像传感器可以以预定义的捕获速率捕获一系列图像帧。捕获速率的倒数可以是1毫秒/帧、2毫秒/帧、5毫秒/帧、10毫秒/帧、20毫秒/帧或50毫秒/帧。图像传感器可在像素尺寸和像素计数方面不同。图像分辨率可取决于像素尺寸和像素计数。图像传感器可具有大约或大于0.5兆像素、l兆像素、4兆像素、10兆像素、20兆像素、50兆像素、80兆像素、100兆像蒙、200兆像素、500兆像素或1000兆像素的像素计数。对应于图像传感器的像素尺寸可以是大约或小于5微米、3.5微米、2微米、1微米、0.5微米或0.1微米。
物镜可提供传感器表面的放大。物镜可具有长工作距离(例如，2-5mm)以在传感器表面上拉近(zoom in)。长工作距离可以提供足够的空隙以适应样品操作(例如，使用流体技术)。可以针对近场成像优化物镜。放大可提供大约或大于5×、10×、20×、50×、100×或200×传感器表面的放大倍数。物镜的放大能够使图像帧的每个像素对应于比像素尺寸小得多的表面积。例如，像素尺寸为5微米、在10×物镜下捕获图像的图像传感器将产生像素对应于0.25um2的传感器表面的图像。此放大可使得LSPR表面上对应于酶活性或等离子体-等离子体耦合的局部区域能够明显可区别并且计数。
通过光学系统获取的一系列图像可使用算法进行分析。该算法可存储在计算机可读介质中。该计算机可读介质可以是能够以可被装置(例如，光盘、软盘、usb快闪驱动器、硬盘驱动器等)读取或处理的格式存储数据的任何介质。本文中提及的算法可包含描绘对分析物接触表现出反应的传感器表面区域的模式挖掘算法。该模式挖掘算法可操作RGB或灰度值的变化以测定图像上的特定模式(例如，测定图像像素在某一定义的范围内经历红色像素值变化的LSPR传感器表面区域)。
所述算法可选择图像帧中的随机像素坐标以供分析。该像素可包含感兴趣区域。RGB图像中的每个像素可通过指示相应红色、绿色和蓝色值来描述。图7说明了根据实施方案，在反应发生之后获取的LSPR活性表面的图像。坐标(x:24，y:193)处的随机像素显示232、132和79的RGB值。在反应发生之前获取的LSPR活性表面图像的坐标(x:24，y:193)处的随机像素可显示不同的RGB值。在反应发生之前和之后获取的图像的坐标(x:24，y:193)处的随机像素可包含相应的感兴趣区域。灰度图像中的每个像素可通过强度信息来描述。RGB图像可含有比灰度图像更多的信息。所述算法可通过在电磁谱的单波带中测量各像素处的光强度而将RGB图像转化成灰度图像。高于某一波长的强度变化可使用滤光器测量。例如，强度变化可使用长通、短通或带通滤光器测量。可分析随机像素坐标(例如，感兴趣区域)以用于测定一系列两个或更多个时移图像上的强度(例如，对于灰度图像而言)或RGB值(或强度/RGB值的变化)。或者，可分析围绕随机像素坐标的局部区域以用于测定一系列两个或更多个时移图像上的强度或RGB值(或强度/RGB值的变化)。围绕像素的局部区域可包含以随机像素坐标为中心或与随机像素坐标重叠的像素网格。例如，该局部区域可以是3×3、4×4、5×5、6××6、7×7、8×8、9×9、10×10、15×15、25×25、50×50、100×100或更大的以随机像素坐标为中心或与随机像素坐标重叠的像素网格。该局部区域可包含感兴趣区域。可分析对应于随机选择的像素的相同坐标或围绕随机选择的像素的坐标的相同局部区域在被光学系统捕获的一系列图像内的变化。可分析一系列图像在相应的感兴趣区域中的变化。感兴趣区域可对应于大约或小于100um2、50um2、25um2、10um2、5um2、4um2、3um2、2um2、1um2、0.5um2或0.25um2的LSPR传感器表面区域。
或者，可将一系列图像中的每个图像分成多个感兴趣区域。感兴趣区域可以是像素或如本文中提及的像素网格。所述算法可选择一个或多个相应的感兴趣区域，并且在一系列图像上测量在选定的感兴趣区域内的RGB和/或灰度强度值的变化。
一系列图像可基于本文中提及的分析进行比较。该比较可确定一系列图像内的相应的感兴趣区域之间是否存在统计学显著性差异。比较可涉及在反应(例如，ELISA反应)之前和之后比较感兴趣区域的RGB或强度值。比较可涉及在反应之前、期间和之后比较感兴趣区域的RGB或强度值。比较可涉及测定一系列图像上的变化。例如，可根据公式 测定RGB值的变化，其中Δx为x组分的值的变化，x＝R、G、B。或者，可测定RGB值的单一组分的变化(例如，D＝ΔR，其中ΔR为红色通道的值的变化)。强度变化可根据公式D＝ΔI测定，其中ΔI为一系列图像上随机选择的像素的强度值的变化。该变化可通过比较在等离子体-等离子体耦合或ELISA反应(例如，分析物的结合)之前和之后在LSPR活性表面上获取的图像来分析。该变化可通过比较在等离子体-等离子体耦合或ELISA反应(例如，分析物的结合)之前、期间和之后在LSPR活性表面上获取的图像来分析。如果观察到多组图像的变化，则对于给定像素或围绕该像素的局部区域而言，微小变化(例如，平均小于一个光子计数)可能是统计学显著的。前述过程可针对多个感兴趣区域进行，以使得充分数目的相应的感兴趣区域得到分析。因此，可同时或依次考虑多个或复数个感兴趣区域(例如，在单个图像内)。例如，可考虑大约或多于5、10、20、50、100、200、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、7500或10000个感兴趣区域。
图14说明了对于多个相应的感兴趣区域在两个图像(例如，在反应之前和之后)之间所测量的红色强度值的变化的直方图。该直方图在8位标度(8bit scale)上显示两个图像之间的红色值的相对差，其中红色强度值的范围为0至255。给定像素(或围绕该像素的局部区域)的1-3的RGB值变化或灰度值变化可对应于约5nm的局部光谱位移。所述算法可进一步测定RGB或灰度强度值变化的分布的色矩。第一色矩可提供平均值，而第二色矩可提供分布的宽度。通常，高阶色矩可表示分布有高阶对称性且可含有有价值的信息。LSPR活性表面与本文中提及的成像系统的组合可使得算法能够在光子计数可能有限的情况下以较高灵敏度和效率检测并分析分析物和样品。
所述算法可进一步基于在一系列图像上测定的RGB和/或强度值或RGB和/或强度值变化产生直方图。该直方图可提供关于样品中是否存在分析物的信息。图8说明了根据实施方案，借助于直方图，比较数字LSPR概念及其在检测极限方面相对于传统LSPR测定形式的优越性。对于所示出的情况1、情况2和情况3，固定在传感器表面上的标记物(分析物)分子的数目低于常规光谱分析的检测水平。这在A列中示出，其中模拟信号(例如，表面的颜色)不允许区分三种情况。B列显示了LSPR活性传感器表面的子部分的图像。不同颜色的微弱斑点在情况2和情况3中可明显地辨别，但在情况1中却不能。如果分析整个图像的若干随机选择的像素(或围绕所述像素的局部区域)的多个斑点并将其标绘于直方图(例如，x轴对应于斑点数而y轴对应于RGB值的变化)中，则3种情况之间存在明显区别。
所述算法可确定检测极限(LOD)。例如，对于分析物的各种已知量或浓度而言，可以比较反应之前的读数直方图(例如，对照直方图)与反应之后的读数直方图。如果存在统计学显著性差异，则该算法可确定存在分析物。该算法无法确定统计学显著性差异的分析物的已知量或浓度可以是检测极限。对于利用本文中描述的LSPR活性表面的数字检测方案，可检测到低至或低于10-6的表面覆盖度(其中表面覆盖度通过所占据的结合位点与潜在可用结合位点总数的比例来定义，参见实施例2)。这在某些假设(例如，如使用Langmuir结合等温线模型且假设结合亲和性为1nM所计算的)下转化成检测到(亚)fg/mL的分析物浓度。测定参数的进一步优化，例如传感器表面上第一结合组分的密度、样品温育时间等的优化，以及检测参数例如用来照明传感器表面的光的强度和/或波长的优化，低噪声检测器的选择等，可使可达到的检测极限比亚fg/ml低得多。在一些实施方案中，检测极限可优于1mg/ml、100ug/ml、10ug/ml、1ug/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、1pg/ml、100fg/ml、10fg/ml、1fg/ml或0.1fg/ml。因此，本文公开的系统和方法可检测以大约或小于100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100ug/ml、10ug/ml、1ug/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、1pg/ml、100fg/ml、10fg/ml、1fg/ml或0.1fg/ml的量存在于样品中的分析物。
用于照护点诊断学(例如，临床诊断学)的装置可能需要大约或优于200ng/mL、100ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL或1pg/mL的灵敏度。例如，照护点诊断学可能需要检测以小于1pg/mL的量存在于样品中的分析物的能力。本文中公开的系统和方法可实现用于高灵敏度及照护点诊断学的小型化装置。例如，传感器表面上的高密度纳米结构(例如，用于测量光反射)和灵敏度增强标记物(例如，酶、金属纳米颗粒等)以及如本文中提及的数字检测方案的组合可实现临床诊断应用所需的灵敏度。捕获将要在本文公开的系统和方法中分析的图像所需的积分时间可为大约或短于1ms、5ms、10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、100ms或200ms。
所述算法可测定样品中的分析物浓度。可测量若干已知浓度的分析物及其产生的相应信号，并用于生成校准曲线。可如本文所述检测分析物，并且可将随后测量的信号与校准曲线进行比较以测定样品中的分析物浓度。
本公开内容的方法、装置和系统可利用与一个或多个LSPR传感器完全或部分集成的流体系统。该流体系统可被配置为将含有分析物的样品和/或测定试剂递送至传感器表面。该流体系统可包含泵、阀、流体通道、膜、流动池、反应孔或反应室，和/或具有进行该测定所需的试剂的储器。在一些实施方案中，所有或一部分流体系统组件可与LSPR传感器集成以产生LSPR传感器芯片或装置。在一些实施方案中，所有或一部分流体系统组件可存在于与LSPR传感器芯片或装置接合的外壳或仪器中。
在一些实施方案中，所述流体系统可包括一个或多个流体致动机构。适用于所公开的方法、装置和系统的流体致动机构的实例包括向一个或多个反应孔或试剂储器施加正压或负压、电动力、电润湿力等。可直接施加正压或负压，例如通过使用与储器耦合的机械致动器或活塞来致动试剂从储器通过流体通道向传感器表面上的流动。在一些实施方案中，该机械致动器或活塞可向用来密封储器的柔性膜施加力。在一些实施方案中，可间接施加正压或负压，例如通过使用与一个或多个储器连接的加压气体管线或真空管线。在一些实施方案中，可利用泵驱动流体流动。这些泵可以是位于与LSPR传感器芯片接合的壳体或仪器中的泵，或在一些实施方案中，它们可以是与传感器芯片集成的微制造泵。
在一些实施方案中，所述流体系统可包括用于在储器与通道之间切换流体流动的一个或多个阀。这些阀可以是位于与LSPR传感器芯片接合的壳体或仪器中的阀，或在一些实施方案中，它们可以是与传感器芯片集成的微制造阀。
本文公开的LSPR传感器芯片可具有包含在其中进行测定的LSPR传感器的一个或多个反应孔。流体致动机构与在流体系统中使用的控制组件例如泵和阀的组合允许以进行特定测定所需的顺序将来自不同储器的流体引入反应孔中。该流体系统可按任何顺序，连续(例如依次)或同时引入来自不同储器的流体。例如，对于利用第二抗体缀合物的测定，在将样品引入反应孔中之后，可引入来自稀释剂储器的稀释剂以便冲洗反应孔。然后，可将第二抗体缀合物从第二抗体缀合物储器引入反应孔中。随后，可再次引入稀释剂以便冲洗反应孔。随后，可将试剂如酶促转化成不溶性沉淀物的酶底物从试剂储器引入反应孔中。因此，利用第二抗体缀合物的LSPR传感器芯片可包含样品储器(或者样品可直接沉积于反应孔中而无需样品储器；另外，样品储器可包括将要与样品混合的稀释剂)、稀释剂储器、缀合第二抗体储器、试剂储器和废料储器。缀合的第二抗体可包括与多种标记物或标签中的任一种缀合的抗体或抗体片段，所述标记物或标签包括但不限于酶、磁珠、金属珠、胶体或纳米颗粒、玻璃珠、质量标签等。在一些实施方案中，可进行单步测定，其中将样品与第一抗体和/或缀合的第二抗体在单一反应混合物中混合，并与经修饰或未修饰的传感器表面直接接触。
在一些实施方案中，所述LSPR传感器芯片可具有多个反应孔，其中每个反应孔均包含传感器。在一些实施方案中，LSPR传感器芯片可具有包含传感器阵列的单个反应孔。LSPR传感器可以是多组的(multi-paneled)或多路的(multiplexed)，以使得可在每个反应孔中运行不同类型的测定。因此，不同的反应孔可含有固定于反应孔中的不同抗体、用于运行DNA测定的DNA、RNA、细菌等。在一些实施方案中，LSPR传感器可具有固定于单个传感器表面上的多种第一抗体或其他第一结合组分。LSPR传感器芯片可同时检测和/或定量一种以上的分析物。
在一些实施方案中，所述LSPR传感器芯片可包括一个或多个样品或试剂储器。LSPR传感器芯片可同时检测和/或定量一个以上样品中的一种以上的分析物。储器中的试剂可通过流体通道引至传感器表面上。储器可含有样品、试剂、稀释剂、缀合的抗体、颗粒或珠粒和/或由运行测定产生的废产物。例如，LSPR传感器芯片可包含用于储存稀释剂的一个或多个储器、用于储存抗体缀合物的一个或多个储器、用于储存缓冲液或其他测定试剂的一个或多个储器和/或用于储存珠粒的一个或多个储器。珠粒储器可含有磁珠、贵金属珠粒、核壳珠粒、等离子体胶体和/或玻璃珠。此外，LSPR传感器芯片也可包含一个或多个废料储器。在一些实施方案中，所述储器可以是约0.1mm深且直径为约10mm，或具有使得容积在1nL与3mL之间的尺寸。
在一些实施方案中，可存在置于反应孔或样品储器顶部的充当过滤器的膜。在一些实施方案中，待测定的样品可通过将样品直接沉积于过滤器顶部的反应孔上而沉积至LSPR传感器表面上。该过滤器可被设计为根据尺寸滤掉不需要的颗粒。例如，该过滤器可包含仅允许较小尺寸的颗粒滤过至反应孔的适当尺寸的孔穴。不需要的颗粒可包括细胞、盐晶体、不溶性沉淀物或可干扰该测定或阻塞流体通道的其他颗粒。样品可含有可通过膜分离的一种或多种感兴趣的分子。因此，不同类型的分子可滤过至不同的反应孔，并且具有不同孔隙率的膜可使得能够同时分析样品中的一种以上的分析物。在一些实施方案中，通过将样品沉积于储器而非反应孔上或沉积于反应孔和储器上来引入样品。LSPR传感器可包含尤其适于接收样品的一个或多个储器。根据是否需要过滤，样品储器可以包括或可以不包括置于储器顶部的膜。
通常，反应孔、样品和试剂储器以及流体通道可使用多种材料中的任一种制造，该材料包括但不限于玻璃、熔融二氧化硅、硅、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃共聚物(COC)或环烯烃聚合物(COP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其他弹性体材料。合适的制造技术包括(根据材料的选择)但不限于CNC机械加工、光刻术和蚀刻、激光消融、注射成型、热压印、冲切等。
可设计流体通道的尺寸及形状，以及施加于一个或多个反应孔或储器的压力，以使得向反应孔中的流动是层流。在一些实施方案中，流体通道的长度可以在约1mm至约100mm的范围内，并且最大横截面尺寸可以在约10um至约5mm的范围内。
实施例
实施例l
响应于整体折射率变化的红色通道变化
使用ThorLabs CMOS相机(DCC 1645C-HQ)对LSPR传感器进行成像，其中将10×放大倍数的物镜置于距表面约7mm(并且距流动池盖的顶部约3-4mm)处。在流动池中，相继地泵送不同的溶液(水、5％EG、10％EG和20％EG)。对于每种溶液，获取并分析一系列图像。对于每一系列图像，随机选择像素，并且分析以随机选择的像素为中心的3×3像素的红色通道值变化。从彩色CMOS传感器收集的传感器表面原始数据显示了当整体折射率从水到5％乙二醇(EG)、10％EG和20％EG相继变化时，整个图像的3×3像素子部分的红色通道是如何变化的(在图11中示出)。图A显示了一个随机选择的像素的原始信号，而图B显示了贯穿平均过滤器以移除短时随机波动的同一信号。尖峰对应于添加新乙烯溶液时的扰动。尖峰之后的平稳段对应于该溶液的平衡值。
如图12中所示，图像上的随机选择的像素对溶液的变化有响应。为了看出这一点，基于多个像素的分析数据而生成了直方图。红色通道值的变化标绘于x轴上，而对于红色通道值的相应变化，在整个图像上的发生数标绘于y轴上。如在图12右侧可见，红色通道值的变化是明显可辨别的。如从5％EG的直方图明显可见，可检测到255中平均小于1个计数的变化。实际上，亚单位像素变化可通过该方法检测到，因为该方法依赖于图像的多个像素的统计学分析。
同时，如下进行光谱检测：将50/50分束器插入检测路径中。将一部分传送至CMOS相机，而另一部分传送至2048像素光谱仪(来自Avantes的AvaSpec)。记录并分析约460nm至720nm的整个光谱。如图13所示，比较通过数字检测(成像)与光谱检测(传统方法)获得的值。
实施例2
基于各种表面覆盖度下的分析物检测的检测极限测定
图9说明了根据实施方案，使用数字LSPR在若干表面覆盖度下对分析物的检测。在概念验证实验中，通过共吸附其比例不同但总抗体浓度(生物素化IgG加天然IgG)固定为1mg/mL的生物素化IgG和天然IgG来制备表面。尤其以10-6、3×10-6、8×10-6、10-5、10-4和10-3的比例制备。总浓度大到足以使表面饱和。假设生物素化IgG的表面覆盖度对应于生物素化IgG与总抗体的比例。因此，10-6的表面覆盖度意味着在生物素化IgG和天然IgG的共吸附期间，每106个天然IgG存在1个生物素化IgG。这些模型表面模拟了实际测定中的抗原覆盖度。使用链霉亲和素-碱性磷酸酶扩增方案，随后通过BCIP/NBT显色来检测LSPR表面上的生物素化抗体。在PBS中收集在添加BCIP/NBT之前和之后的同一区域的图像。分析了随机选择的感兴趣区域的RGB值，并将彩色图像的红色组分值的变化绘制成直方图。对于每种浓度而言，以黑色标绘的直方图对应于反应之前的读数，而以灰色标绘的直方图对应于酶促反应之后测得的值。针对多个表面覆盖度，将以黑色标绘的直方图与以灰色标绘的直方图进行比较。图9表明可检测到低至10-6的表面覆盖度(其中表面覆盖度通过所占据的结合位点与潜在可用结合位点总数的比例来定义)，因为直方图分布显示出其一阶距(平均)和二阶距(宽度)值有统计学显著性差异。
光谱检测(模拟检测)与数字检测一同进行。对在10-3至10-7的若干表面覆盖度(即，饱和表面上的生物素化IgG相对于天然IgG的数目)下检测模型表面上的生物素化IgG的测定进行比较。如图10所示，模拟检测在10-4与4×10-5的表面覆盖度之间达到LOD。实际上，覆盖度为4×10-5的表面在反应之前和之后的光谱几乎无法区别，而在2×10-6的覆盖度下大部分被覆盖。相比而言，10-5和10-6的表面覆盖度的数字读数明显显示出反应之前与之后的读数差异。
实施例3(预示性)
核酸目标分子的检测
在一些实施方案中，公开的数字LSPR方法和系统可用于检测生物或环境样品中的目标核酸序列。本领域技术人员可设想将捕获探针固定在与一种或多种目标核酸序列的一部分互补的LSPR传感器表面上。探针在表面上的固定可通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种实现，例如通过使用在贵金属表面上图案化的、自组装的硫醇化寡核苷酸(或合适的接头分子，根据需要)单层。随后，可使该表面与感兴趣的样品在促进互补序列杂交的条件下接触，使得目标核酸分子(如果存在)被捕获并固定在传感器表面上。随后，可冲洗传感器表面，并使其与包含检测探针的溶液接触，该检测探针与一个或多个固定化靶标远端的一部分互补。在促进检测探针与固定化靶标(如果存在)杂交的条件下使检测探针与LSPR传感器表面一起温育，之后可冲洗传感器表面以移除任何未杂交的检测探针分子。
在一些实施方案中，可以用灵敏度增强标记物，诸如上文讨论的催化反应物转化成不溶性产物的酶来标记检测探针，由此产生可使用本文公开的数字成像技术检测的局部折射率变化。在一些实施方案中，可以用如上文讨论的金属纳米颗粒标记检测探针，该纳米颗粒诱导可使用本文公开的数字成像技术检测的局域等离子体-等离子体耦合。在一些实施方案中，例如当两种或更多种目标核酸分子待检测时，可将捕获探针以特定的空间图案固定于传感器表面上，以使得这两种或更多种目标分子的检测可彼此相区别。在一些实施方案中，可以用使LSPR传感器表面的光学性质产生可区别变化的两种或更多种不同的灵敏度增强标记物来标记检测探针，以使得这两种或更多种目标分子的检测可彼此相区别。
一般而言，捕获和检测探针将包括长度在约20至约40个核苷酸之间的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，捕获和/或检测探针的长度可以比该长度更短或更长，例如，探针可为10个核苷酸长，或50个核苷酸长。一般而言，设计捕获和检测探针的设计目标之一将是优化杂交的探针-目标序列的稳定性和特异性。在一些实施方案中，捕获和/或检测探针的长度可根据目标核苷酸序列的长度来调节，以便使检测探针的灵敏度增强标记物尽可能地紧密接近LSPR传感器表面。在一些实施方案中，可通过例如设计检测探针以使得其与固定化目标序列的部分(该部分紧密接近于与捕获探针杂交的那些)杂交来设计捕获和检测探针，使得无论目标核酸序列的长度如何，杂交的检测探针的灵敏度增强标记物都与LSPR传感器表面保持紧密接近。
用于此方法的潜在应用的实例包括但不限于检测特定基因序列或其片段、检测特定mRNA或微小RNA序列等。
实施例4(预示性)
核酸测序
在一些实施方案中，所公开的数字LSPR方法和系统可用于核酸分子的测序，例如使用合成测序方法。可使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种将待测序的模板分子固定于传感器表面上，例如通过与固定于传感器表面上的通用衔接子寡核苷酸杂交或连接。在一些实施方案中，该衔接子寡核苷酸可包含正向和反向引物序列，并且可使用固相扩增技术(例如桥式扩增)产生空间上分离的模板分子簇。随后，通用测序引物与模板分子杂交以启动测序反应。随后，使聚合酶和标记的dNTP(例如，其中用诱导与LSPR传感器表面的等离子体-等离子体耦合的金属纳米颗粒标记dNTP)以逐步方式(即，每个循环使用一个标记的dNTP)与传感器表面接触，并使用上文描述的数字成像技术监测传感器表面的光学性质，以确定给定的聚合酶反应步骤中是否已添加了碱基。在一些实施方案中，可在因连续添加标记的核苷酸而产生的累积“背景”信号的存在下监测信号变化。在一些实施方案中，可利用可切割附接化学方法用金属纳米颗粒标记dNTP，以使得纳米颗粒标记物可在各个聚合酶反应之间从生长的寡核苷酸链上移除，从而使“背景信号”的积累最小化，并改善对单碱基添加的灵敏度。在一些实施方案中，可通过同时监测在许多固定化模板分子(或模板分子簇)位置处发生的反应，同时使用本文公开的数字成像技术来实现高通量。在一些实施方案中，可达到的潜在读取长度可能受有效等离子体-等离子体耦合的距离依赖性的影响。
虽然本文中已显示并描述了本发明的优选实施方案，但本领域技术人员将会明白，这些实施方案只是作为举例而提供的。本领域技术人员在不背离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。意欲以所附权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (55)

1.一种用于检测样品中的分析物的方法，其包括：
捕获传感器表面的一系列两个或更多个图像，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；
在所述一系列两个或更多个图像中选择一个或多个相应的感兴趣区域；
在所述一系列两个或更多个图像上测量所选定的感兴趣区域内的颜色变化；以及
基于所测量的颜色变化来检测分析物。
2.如权利要求1所述的方法，其中用于检测所述分析物的检测极限优于1ng/mL。
3.如权利要求1所述的方法，其中用于检测所述分析物的检测极限优于1pg/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其中用于检测所述分析物的检测极限优于1fg/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括基于所述测量的颜色变化来测定所述分析物的浓度。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述颜色变化是所述相应的感兴趣区域中的像素RGB值的变化。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述测量的颜色变化是从所述传感器表面反射的光的颜色变化。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述选定的感兴趣区域中的每一个是所述传感器表面上约为或小于5um2的区域。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述选定的感兴趣区域中的每一个是3×3像素的网格。
10.如权利要求1所述的方法，其中在局部分析物诱导的变化发生之前和之后，捕获所述一系列两个或更多个图像。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物选自：肽、蛋白质、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子、病毒、细菌、细胞、脂质分子、碳水化合物分子、有机小分子、药物分子或离子。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述传感器表面与第一结合组分、分析物和第二结合组分依次或同时接触，其中该第二结合组分是灵敏度增强标记物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述灵敏度增强标记物是酶，所述酶催化反应物转化成不溶性产物，从而在所述传感器表面上形成沉淀物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述灵敏度增强标记物催化这样的反应：该反应导致聚合物、生物聚合物、化学化合物或选自无机化合物、有机化合物、化学发光化合物和荧光化合物的酶促反应产物的沉积。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述灵敏度增强标记物是金属纳米颗粒，所述金属纳米颗粒能够诱导所述金属纳米颗粒与所述传感器表面之间的等离子体-等离子体耦合。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个相应的感兴趣区域是随机选择的。
17.如权利要求16所述的方法，其中选择多个相应的感兴趣区域。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述多个相应的感兴趣区域是10个或更多个相应的感兴趣区域。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述多个相应的感兴趣区域是100个或更多个相应的感兴趣区域。
20.如权利要求1所述的方法，其中捕获所述一系列两个或更多个图像所需的积分时间短于50ms。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物以100ng/mL或更低的量存在于所述样品中。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物以1ng/mL或更低的量存在于所述样品中。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物以1pg/mL或更低的量存在于所述样品中。
24.如权利要求1、13、15或21所述的方法，进一步包括接收包含该方法的结果的报告，以及基于所报告的结果作出医疗保健决定，其中所述样品为患者样品。
25.一种用于检测样品中的分析物的系统，该系统包含：
传感器表面，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；
光学成像装置，其中该光学成像装置能够捕获一系列两个或更多个图像；以及
处理器，其中该处理器能够在所述一系列两个或更多个图像中选择一个或多个相应的感兴趣区域，测量选定的感兴趣区域内的颜色变化，并且基于所测量的颜色变化来检测分析物。
26.如权利要求25所述的系统，其中用于检测所述分析物的检测极限优于1ng/mL。
27.如权利要求25所述的系统，其中用于检测所述分析物的检测极限优于1pg/mL。
28.如权利要求25所述的系统，其中用于检测所述分析物的检测极限优于1fg/mL。
29.如权利要求25所述的系统，其中所述处理器能够基于所述测量的颜色变化来测定所述分析物的浓度。
30.如权利要求25所述的系统，其中所述颜色变化是所述相应的感兴趣区域中的像素RGB值的变化。
31.如权利要求25所述的系统，其中所述传感器表面是不透明的且反射光。
32.如权利要求25所述的系统，其中所述相应的感兴趣区域中的每一个是所述传感器表面上约为或小于5um2的区域。
33.如权利要求25所述的系统，其中所述相应的感兴趣区域中的每一个是3×3像素的网格。
34.如权利要求25所述的系统，其中在所述颜色变化之前和之后，捕获所述一系列两个或更多个图像。
35.如权利要求25所述的系统，其中所述分析物选自：肽、蛋白质、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子、病毒、细菌、细胞、脂质分子、碳水化合物分子、有机小分子、药物分子或离子。
36.如权利要求25所述的系统，其进一步包含用于将样品和测定试剂递送至所述传感器表面的流体系统，其中所述测定试剂包含第一结合组分和第二结合组分，并且其中该第二结合组分包含灵敏度增强标记物。
37.如权利要求36所述的系统，其中所述灵敏度增强标记物是其中所述灵敏度增强标记物是酶，所述酶催化反应物转化成不溶性产物，从而在所述传感器表面上形成沉淀物。
38.如权利要求37所述的系统，其中所述酶催化这样的反应：该反应导致聚合物、生物聚合物、化学化合物或选自无机化合物、有机化合物、化学发光化合物和荧光化合物的酶促反应产物的沉积。
39.如权利要求36所述的系统，其中所述灵敏度增强标记物是金属纳米颗粒，所述金属纳米颗粒能够诱导所述金属纳米颗粒与所述传感器表面之间的等离子体-等离子体耦合。
40.如权利要求25所述的系统，其中所述处理器能够在所述一系列两个或更多个图像中随机选择一个或多个相应的感兴趣区域。
41.如权利要求40所述的系统，其中所述处理器能够选择多个相应的感兴趣区域。
42.如权利要求41所述的系统，其中所述多个相应的感兴趣区域是10个或更多个相应的感兴趣区域。
43.如权利要求41所述的系统，其中所述多个相应的感兴趣区域是100个或更多个相应的感兴趣区域。
44.如权利要求25所述的系统，其中所述光学成像装置的积分时间短于50ms。
45.如权利要求25所述的系统，其中所述分析物以100ng/mL或更低的量存在于所述样品中。
46.如权利要求25所述的系统，其中所述分析物以1ng/mL或更低的量存在于所述样品中。
47.如权利要求25所述的系统，其中所述分析物以1pg/mL或更低的量存在于所述样品中。
48.如权利要求25、37、39或45所述的系统，其中所述样品包含患者样品并且所述分析物的检测用于临床诊断应用。
49.一种计算机可读介质，其包括使计算机执行包括以下步骤的方法的代码：
在传感器表面的一系列两个或更多个图像的每一个中选择一个或多个相应的感兴趣区域，其中该传感器表面能够维持局域表面等离子体共振；
通过比较所述一系列两个或更多个图像中相应的感兴趣区域的颜色来测量颜色变化；以及
基于所测量的颜色变化来确定分析物的存在。
50.如权利要求49所述的计算机可读介质，其中所述一个或多个相应的感兴趣区域是随机选择的。
51.如权利要求50所述的计算机可读介质，其中选择多个感兴趣区域。
52.如权利要求49所述的计算机可读介质，其中所述颜色变化是所述相应的感兴趣区域内的像素RGB值的变化。
53.如权利要求52所述的计算机可读介质，其中根据公式测量所述RGB值的变化，其中ΔR、ΔG和ΔB对应于图像中红色、绿色和蓝色像素值的变化。
54.如权利要求49所述的计算机可读介质，其进一步包括计算RGB或灰度值变化的分布的色矩。
55.如权利要求49所述的计算机可读介质，其进一步包括使用模式挖掘算法来描绘对所述分析物的接触表现出不同反应的所述传感器表面的区域。
CN201580022387.3A 2014-02-26 2015-02-26 用于增强测定灵敏度的数字lspr Pending CN106233140A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461966576P 2014-02-26 2014-02-26
US61/966,576 2014-02-26
US201562108979P 2015-01-28 2015-01-28
US62/108,979 2015-01-28
PCT/US2015/017839 WO2015130980A1 (en) 2014-02-26 2015-02-26 Digital lspr for enhanced assay sensitivity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106233140A true CN106233140A (zh) 2016-12-14

Family

ID=54006661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580022387.3A Pending CN106233140A (zh) 2014-02-26 2015-02-26 用于增强测定灵敏度的数字lspr

Country Status (7)

Country Link
US (3) US20150247846A1 (zh)
EP (1) EP3111214B1 (zh)
KR (1) KR20160138059A (zh)
CN (1) CN106233140A (zh)
CA (1) CA2976633A1 (zh)
TW (1) TW201538959A (zh)
WO (1) WO2015130980A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107995949A (zh) * 2017-11-07 2018-05-04 深圳达闼科技控股有限公司 发射功率控制方法、装置、存储介质及电子设备
CN111213051A (zh) * 2017-09-08 2020-05-29 哈佛学院院长及董事 用于确定分析物的纳米传感器方法和装置
CN113167718A (zh) * 2018-10-22 2021-07-23 生物电子公司 多路复用的测定系统和方法
CN115166903A (zh) * 2022-07-06 2022-10-11 中国科学院上海光学精密机械研究所 多光束小角度入射束靶耦合瞄准定位装置和方法
CN116051557A (zh) * 2023-03-31 2023-05-02 至美时代生物智能科技(北京)有限公司 基于图像匹配的微流控芯片反应孔图像识别方法及系统

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101975178B1 (ko) 2011-11-21 2019-05-07 아박시스, 인크. 측방 유동 및 관련된 면역검정에서의 신호 증폭
US20140256593A1 (en) * 2011-11-22 2014-09-11 University Of Maryland, Baltimore Plasmonic substrates for metal-enhanced fluorescence based sensing, imaging and assays
US20150247846A1 (en) 2014-02-26 2015-09-03 Lamdagen Corporation Digital lspr for enhanced assay sensitivity
TWI691716B (zh) 2014-08-13 2020-04-21 美商艾巴希斯公司 電漿特異性結合搭配物檢定中之信號放大
AU2016301375B2 (en) 2015-08-04 2022-03-03 Zoetis Services Llc Signal amplification in solution-based plasmonic specific-binding partner assays
US11977072B2 (en) 2017-01-30 2024-05-07 Zoetis Services Llc Solution-based plasmonic specific-binding partner assays using metallic nanostructures
KR102394294B1 (ko) * 2017-07-05 2022-05-04 주식회사 나노바이오라이프 미세 분할 영역을 가진 진단키트 및 진단키트를 이용한 진단방법
WO2020005768A1 (en) * 2018-06-25 2020-01-02 The Regents Of The University Of California Plasmonic swarm biosensing system and methods of use
JP7392341B2 (ja) 2019-09-17 2023-12-06 富士フイルムビジネスイノベーション株式会社 情報処理装置、及び情報処理プログラム
KR102245892B1 (ko) * 2019-10-11 2021-04-29 한국과학기술원 프렉션 바운드 측정에 기반한 피검출체의 농도 확인 방법
CA3210240A1 (en) * 2021-03-08 2022-09-15 Udayan Kanade System and method for finding the peak wavelength of the spectrum sensed by an lspr spectrometer
KR102530499B1 (ko) * 2021-08-26 2023-05-10 한밭대학교 산학협력단 플라즈몬 금속 나노입자를 이용한 세포핵 내 단백질 검출방법
US11828747B2 (en) * 2021-11-27 2023-11-28 M.I.S. Electronics Inc. Multimodal nanobiosensor for detecting cancer biomarkers in blood serum
WO2023215408A1 (en) * 2022-05-04 2023-11-09 Biosensing Instrument Inc. System and method for analyzing molecular interactions on living cells using biosensor techniques

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1460859A (zh) * 2003-06-27 2003-12-10 清华大学 蛋白质微阵列表面等离子体共振成像检测系统及检测方法
CN1664560A (zh) * 2004-12-30 2005-09-07 南开大学 基于片上pcr的多通道表面等离子共振影像传感器
CN1731180A (zh) * 2005-09-02 2006-02-08 清华大学 蛋白质芯片的传感方法及其检测系统
CN2758753Y (zh) * 2004-12-30 2006-02-15 南开大学 多通道表面等离子共振影像传感器
CN101617229A (zh) * 2007-01-03 2009-12-30 莱姆达仁公司 Lspr的酶测定

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6180415B1 (en) * 1997-02-20 2001-01-30 The Regents Of The University Of California Plasmon resonant particles, methods and apparatus
JP3380744B2 (ja) 1998-05-19 2003-02-24 株式会社日立製作所 センサおよびこれを利用した測定装置
US6455319B1 (en) * 1999-05-10 2002-09-24 California Institute Of Technology Use of spatiotemporal response behavior in sensor arrays to detect analytes in fluids
US7236623B2 (en) * 2000-04-24 2007-06-26 International Remote Imaging Systems, Inc. Analyte recognition for urinalysis diagnostic system
US20030129618A1 (en) * 2001-08-10 2003-07-10 Regents Of The University Of California Sensitive and rapid detection of pathogenic organisms and toxins using fluorescent polymeric lipids
US20050101841A9 (en) * 2001-12-04 2005-05-12 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Healthcare networks with biosensors
US7642064B2 (en) * 2003-06-24 2010-01-05 Ventana Medical Systems, Inc. Enzyme-catalyzed metal deposition for the enhanced detection of analytes of interest
US8133741B2 (en) * 2005-10-26 2012-03-13 General Electric Company Methods and systems for delivery of fluidic samples to sensor arrays
WO2007081692A2 (en) * 2006-01-04 2007-07-19 Chemimage Corporation Method and apparatus for dense spectrum unmixing and image reconstruction of a sample
WO2008082713A2 (en) * 2006-08-24 2008-07-10 California Institute Of Technology Integrated semiconductor bioarray
US20080166036A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-10 Carl Zeiss Microimaging Ais, Inc. System and method for analyzing tissue slides for observable pathologies
KR100962290B1 (ko) 2008-02-13 2010-06-11 성균관대학교산학협력단 금 나노입자의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서를 이용한 생체물질 검출 방법
WO2010091293A1 (en) * 2009-02-06 2010-08-12 The Regents Of The University Of California Plasmonic system for detecting binding of biological molecules
US20120220486A1 (en) * 2009-11-01 2012-08-30 Caerus Molecular Diagnostics Incorporated Methods and apparatus for binding assays
CA2800526C (en) 2010-04-22 2018-03-13 Ryan Cameron Denomme Method and apparatus for an interferometric localized surface plasmon resonance (ilspr) sensor
US8879065B1 (en) * 2011-05-10 2014-11-04 The Board Of Trustees Of The University Of Alabama For And On Behalf Of The University Of Alabama In Huntsville Systems and methods for localized surface plasmon resonance sensing
US9285314B2 (en) * 2011-10-12 2016-03-15 Brown University Systems and methods enabling high-throughput, real time detection of analytes
US9568416B2 (en) * 2011-12-22 2017-02-14 General Electric Company Multimode systems and methods for detecting a sample
US9915654B2 (en) 2012-09-28 2018-03-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Light microscopy chips and data analysis methodology for quantitative localized surface plasmon resonance (LSPR) biosensing and imaging
WO2014052759A1 (en) 2012-09-28 2014-04-03 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Calibrating single plasmonic nanostructures for quantitative biosensing
US9464985B2 (en) * 2013-01-16 2016-10-11 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Plasmon resonance imaging apparatus having nano-lycurgus-cup arrays and methods of use
WO2014159847A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Nanoplasmonic imaging technique for the spatio-temporal mapping of single cell secretions in real time
US20150247846A1 (en) 2014-02-26 2015-09-03 Lamdagen Corporation Digital lspr for enhanced assay sensitivity

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1460859A (zh) * 2003-06-27 2003-12-10 清华大学 蛋白质微阵列表面等离子体共振成像检测系统及检测方法
CN1664560A (zh) * 2004-12-30 2005-09-07 南开大学 基于片上pcr的多通道表面等离子共振影像传感器
CN2758753Y (zh) * 2004-12-30 2006-02-15 南开大学 多通道表面等离子共振影像传感器
CN1731180A (zh) * 2005-09-02 2006-02-08 清华大学 蛋白质芯片的传感方法及其检测系统
CN101617229A (zh) * 2007-01-03 2009-12-30 莱姆达仁公司 Lspr的酶测定

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUE LIU ET AL: "Individually color-coded plasmonic nanoparticles for RGB analysis", 《CHEM. COMMUN.》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111213051A (zh) * 2017-09-08 2020-05-29 哈佛学院院长及董事 用于确定分析物的纳米传感器方法和装置
CN107995949A (zh) * 2017-11-07 2018-05-04 深圳达闼科技控股有限公司 发射功率控制方法、装置、存储介质及电子设备
CN113167718A (zh) * 2018-10-22 2021-07-23 生物电子公司 多路复用的测定系统和方法
CN115166903A (zh) * 2022-07-06 2022-10-11 中国科学院上海光学精密机械研究所 多光束小角度入射束靶耦合瞄准定位装置和方法
CN115166903B (zh) * 2022-07-06 2023-08-15 中国科学院上海光学精密机械研究所 多光束小角度入射束靶耦合瞄准定位装置和方法
CN116051557A (zh) * 2023-03-31 2023-05-02 至美时代生物智能科技(北京)有限公司 基于图像匹配的微流控芯片反应孔图像识别方法及系统

Also Published As

Publication number Publication date
EP3111214A1 (en) 2017-01-04
US20150247846A1 (en) 2015-09-03
EP3111214A4 (en) 2017-07-26
EP3111214B1 (en) 2020-09-30
US20210181105A1 (en) 2021-06-17
US20190017105A1 (en) 2019-01-17
KR20160138059A (ko) 2016-12-02
CA2976633A1 (en) 2015-09-03
US10928319B2 (en) 2021-02-23
WO2015130980A1 (en) 2015-09-03
TW201538959A (zh) 2015-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106233140A (zh) 用于增强测定灵敏度的数字lspr
Tokel et al. Advances in plasmonic technologies for point of care applications
Liu et al. Recent advances in cytokine detection by immunosensing
JP5175584B2 (ja) 局所表面プラズモン共鳴イメージング装置
Wang et al. Duplex microfluidic SERS detection of pathogen antigens with nanoyeast single-chain variable fragments
Najeeb et al. A novel classification of prostate specific antigen (PSA) biosensors based on transducing elements
EP3397950A1 (en) Sequencing device
Han et al. Retroreflective Janus microparticle as a nonspectroscopic optical immunosensing probe
CN101571536A (zh) 单个纳米颗粒及其阵列基生物分子检测器的制备工艺
Nath et al. Detection of bacterial and viral pathogens using photonic point-of-care devices
Huo et al. Recent advances in surface plasmon resonance imaging and biological applications
US11280784B2 (en) Patterned plasmonic nanoparticle arrays for multiplexed, microfluidic biosensing assays
Desmet et al. Multiplexed remote SPR detection of biological interactions through optical fiber bundles
JP2001504219A (ja) 植物の病気を診断するためのバイオセンサーの使用
Xu et al. Recent advances of representative optical biosensors for rapid and sensitive diagnostics of SARS-CoV-2
Masterson et al. Selective detection and ultrasensitive quantification of SARS-CoV-2 IgG antibodies in clinical plasma samples using epitope-modified nanoplasmonic biosensing platforms
Linman et al. Etched glass microarrays with differential resonance for enhanced contrast and sensitivity of surface plasmon resonance imaging analysis
US20130130939A1 (en) Portable photonic sensor system as an early detection tool for ovarian cancer
JP4156567B2 (ja) Ｓｐｒセンサーおよび屈折率測定方法
Purr et al. Biosensing based on optimized asymmetric optofluidic nanochannel gratings
JP2009092405A (ja) 標的物質検出用素子、それを用いた標的物質検出装置、キット及び検出方法
US9851350B2 (en) Nanohole sensor chip with reference sections
Sadana Binding and dissociation kinetics for different biosensor applications using fractals
Lee et al. Selective fluorescence and fluorescence-free detection of single biomolecules on nanobiochips
Majdinasab et al. Recent progresses in optical biosensors for interleukin 6 detection

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161214

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication