CN100487137C - 基于片上pcr的多通道表面等离子共振影像传感器的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于片上PCR的多通道表面等离子共振影像传感器的检测方法。该传感器同时具有PCR扩增SPR检测功能。本发明的有益效果有以下四个特点：(a)可以一次完成多个样品的检测；(b)可以一次完成同一样品的不同特征的检测；c)在多通道中设置参考通道，消除非特异性响应的影响；(d)由于具备PCR扩增功能，所以可以对低浓度的生物分子进行检测。

Description

基于片上PCR的多通道表面等离子共振影像传感器的检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于表面等离子体共振原理的生物传感器，特别是涉及利用生物PCR技术和等离子体共振原理相结合制作的传感器，可以并行检测多个生物学信号的。

背景技术

21世纪是生物学发展的时代，特别是生物科学与计算机科学经融合产生的生物信息学将得到蓬勃的发展。传感技术是信息科学的主要技术之一，是信息获取的手段。利用传感技术获取生物样品的信息是生物检测技术发展的重要内容。

其中，光学方法由于其具有非破坏性和高灵敏度的特点被视为是最成熟和最好的生物传感技术。自1902年，Wood在光学实验中首次发现了表面等离子体共振(Surface PlasmonResonance，SPR)现象以来，SPR仪器和SPR生物传感器的研究一直受到关注。表面等离子体振子共振(SPR)是存在于金属边缘的自由电子的等离子振荡。这些振荡受临近金属表面的材料的折射率影响。这种现象被用来检测表面折射率的细微变化，是形成各种传感器机制的基础。形成SPR现象的必要条件之一是金属和电介质间的界面存在。当入射光以某一特定的角度入射时，其反射率会显著减少，此入射角度即为SPR角。附着在金属表面的物质不同，其SPR角不同，而同一种物质，附着在金属表面的量不同，其SPR角也不相同。根据上述原理，SPR生物传感器可以将已知的生物分子固定在几十纳米厚的金属膜表面，当它与互补的目标生物分子结合时，由于表面结构的改变将导致SPR角改变，并且根据SPR角的改变值，可以得知结合的目标生物分子的种类及浓度。

SPR可以用影像的方法来显示，这最早由Yeatman在1987年提出。Bengt Ivarsson提出了另外的构想：应用多波长非同步的SPR影像仪。带有生物传感器的SPR最先于1983年使用，1987年应用于影像分析。随着SPR影像分析的出现，新型、无标记、实时、用来提高单位时间内检测量的多点生化分析设备层出不穷。目前有三种测量SPR影像的方法。第一种是通过测量在SPR倾斜角一侧以特定波长和共振角度的反射光强(即反射系数法)来实现；第二种固定入射角，检测复色光的共振波长(波长探询法)。第三种是偏振状态及相位的检测(相位探询法)。

在近些年来，SPR传感器因为可实时、无标记检测，以及高灵敏及小型化的优势广泛应用于疫苗研制、疾病诊断、药物靶标与药物开发、案件侦破、环境监测、食品安全检验、兴奋剂检测等多个领域。特别是在生物传感器中，使用SPR检测抗体及其对抗原的反应是生物医学诊断中主要关心的问题，其中与细菌或病毒有关的抗体的存在是重要的感染指示。SPR还可用于基因探测器，其中可以使用联结成目标分析物中规定序列的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

世界上已有一些基于SPR原理的生物传感器产品，以瑞典的Biacore AB的Biacore系列生物传感器为例，它的制备方法是将100nm厚的金膜固定在玻璃基质上，将此玻璃片嵌在一个塑料平板夹里，用一种折射率与棱镜匹配的聚合物将芯片耦合到玻璃棱镜上。在芯片表面固定一层葡聚糖分子层，使它较容易与其它生物大分子偶联.它以发光二极管为光源，用线性阵列发光二极管作为检测器，检测不同入射角处的反射光强度.但这只完成了单点SPR的检测，一次只能对一种物质进行检测，并且它没有影像检测的能力，这就严重限制了它在一次试验中筛别多种DNA序列的能力，在一定程度限制了它的应用。而且这种设备体积较大，价格昂贵，这就限制了其在国内的使用。因而开发出具有自主知识产权、结构紧凑，价格合理的SPR传感器是国内在此领域工程技术人员共同追求的目标。

经文献检索，发现在专利号为US 5,313,264描述了一种由微导管和阀门构成一个具有样液操作处理模块网络的SPR传感器，该网络被用来在构成探测层SPR导体表面移动适量的包含有探测物质的液体，然后再移动到位于探测层上面目标液体。该SPR传感器也是单色光源和光学系统组成。光学系统产生由光源提供光线而形成楔型汇聚光束并且引导光束照射到传感器表面。楔型光束沿着一个空间固定的，相对窄条的传感器表面在发生共振角的范围内照射到探测层。共振角的范围由楔型光束的汇聚角度决定。反射光线在一个二维光电探测器上成像。光电探测器上提供的信号是探测层表面折射率变化的度量，而附着于探测层的物质与通过样液处理模块流经探测层表面的待测溶液相互作用结果产生了这种变化。

许多常规的用于形成探针层SPR方法和仪器都要求样液从探测层流过并光学扫描传感器表面，这些方法相对复杂，不够经济并且耗费时间。该传感器设计较为复杂，体积较大，不利于仪器的小型化。这就需要一种具有可选择性SPR传感器，能够具有多层次的分析探针，同时在几个通道探测层泵送样液。

US 2003048452专利描述了一种基于传感器表面光学分析采样区域的二维影像SPR仪器。该仪器包含有一个的传感器表面层，该层由能够响应SPR传导材料构成，如一些带有自由电荷的金属：金，银，铝等。一束由两种或者两种以上波长的电磁波从传感器的二维表面区域前端或者后端照射，与此同时，这两种或两种以上波长的在传感器表面的反射强度被检测到，检测装置提供了二维或者多维的表面影像，表面每一点有效折射率以二维影像的方式显示，二维影像构成一幅彩色图像。但是该SPR传感器装置采用固定入射光角度，以波长为变量的工作模式。这些装置的灵敏度受分光计分辨率，温度变化以及入射光波长的限制，要同时使用复色光才能够在比较大的动态范围内获得较高的灵敏度和精度。

核酸阵列技术在生命科学研究中的成功使用比传统方法用来定量检测复杂生物系统大大节省了时间，但是，由于定量检测生物分子技术的成本高昂，并且带有一定的放射性和需要进行荧光标定和探测，因而使得这种技术受到了限制。US20030049639描述的是基于核酸微阵列大规模鉴别生物分子的共振SPR影像探测的方法。校对过的复色光在SPR角度范围内照射到经过化学修饰金膜表面的核酸分子膜上，反射的光线经过宽度为10nm的带通虑波器(830nm)被CCD收集。通过CCD采集的信号能够探测到金膜表面不同的核酸分子反射率。由于金膜表面不同的探针结合的靶分子不同因而可以迅速的检测出DNA/RNA等生物分子。

CN1421699描述了一种基于表面等离子体共振(SPR)原理、可以并行检测多个生物学信号的生物传感器。该生物传感器依次由基质，金属膜，化学修饰层，交联剂层和生物单分子层构成，其特征在于在生物单分子层的不同位置结合了多种生物分子，可并行定量检测生物样品中特定目标分子的浓度。这种设计的缺点在于测量精度不够。由于影响SPR传感器测量精度的因素很多，其中样液的成份、浓度、温度以及样液中非待测分子与敏感膜的作用是影响检测精度的主要因素。除了待测分子与敏感膜上的探针分子相互作用可以改变敏感膜的介电常数，从而改变共振角或共振波长(特异性响应)外，样液中其它成份及其浓度的变化、温度变化会引起样液介电常数的变化，而且样液中非待测分子与敏感膜的相互作用会直接改变敏感膜介电常数；这些变化最终都将引起共振角或共振波长的变化(非特异性响应)。

如上所述，这些方法有三个主要缺陷：响应时间低和角度分辨率有限，SPR传感器测量精确度不够高。另外，目前SPR传感系统所能检测到的生物分子材料表面最小覆盖量为1×10^-12g/mm²，这对于检测低浓度、小分子量的样品是不够的，因此可以通过PCR扩增的方法提高样品浓度，从而提高SPR检测的分辩能力。

由此可见，将PCR技术与SPR技术结合起来可以大大提高SPR技术的检测范围和效果。同时要提高特异性响应的检测精度，就必须从实际测得的响应中剔除非特异性响应。

发明内容

本发明采用的方法是：单色光入射，反应池采用MEMS工艺，集成制造了PCR反应池和SPR反应池，使DNA分子的扩增和检测得以在一个芯片上完成；利用单色面阵CCD采集SPR影像，通过SPR影像分析，可以同时检测各通道的共振角，实现了SPR响应曲线的实时、动态检测，提高了检测精度及速度，使用方便，符合SPR传感器发展趋势。该传感系统的光路设计使得入射光可以在可能发生共振的角度范围内以不同角度同时照射各个通道，通过SPR影像可以同时检测不同角度入射光线的反射光强。

由本发明的原理可知由于无需对反应物进行标记和纯化，SPR技术特别适用于生物分子之间相互作用的研究。SPR传感器的优点是能够无干扰地实时监测物质分子，特别是生物分子的相互作用。使用PCR的优点在于灵敏度高(PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平，在细菌学中最小检出率为3个细菌)；简便、快速；对标本的纯度要求低(不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模，可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测)。

本发明的技术方案：这种基于片上PCR的多通道表面等离子共振影像传感器，包括共振SPR样品池和PCR反应池，其特点是：它将共振SPR样品池和PCR反应池)结合在一起，构成传感器反应池；传感器主体上部是由硅片构成的长方体形传感器反应池，下部是柱面棱镜，两者之间是玻璃基片，玻璃基片上是敏感膜，敏感膜上是硅片的传感器反应池，在硅片反应池中设置共振SPR样品池和PCR反应池，从硅片传感器反应池上部设置样液的样品进口和样品出口；

在传感器主体两侧是入射光路、出射光路和与出射光路末端连接的计算机平台(19)；

入射光路中由发光二极管发出的光经过球面透镜，在针孔处会聚，再经过一个平凸透镜转换为平行光，平行光先后通过滤光片和偏振片，调整偏振片的位置产生P偏振光，最后利用一个柱面透镜对平行光进行角向会聚，使其在柱面棱镜的敏感膜处会聚成一条直线，射向柱面棱镜底面；

出射光路由一个会聚透镜和面阵CCD组成，入射光在柱面棱镜底面发生全反射后经会聚透镜成为平行光，由面阵CCD完成光信号的采集，再送入计算机进行处理。

这种基于片上PCR的多通道表面等离子共振影像传感器的检测方法，它包括10个步骤。

本发明率先提出了将PCR技术与SPR技术结合起来的检测方式，解决了SPR技术对于低浓度的DNA分子难以测量的问题，同时也简化了PCR扩增后相对烦杂的检测过程，提高了检测效率。

本发明克服了非特异性响应对于SPR传感器测量精度的影响，提供一种多通道影像传感器，以便能够很好地克服非特异性响应，得到特异性响应，从而实现对待测生物分子及其相互作用的检测，从总体上提高了传感器的性能。

本发明采用角向会聚入射光，使得入射光可以在可能发生共振的角度范围内以不同角度同时照射各个通道，避免了机械调节可能带来的误差。

本发明使用了SPR影像检测手段，可以同时检测各通道的共振角，实现了SPR响应曲线的实时、动态检测，提高了检测精度及速度。

本发明还有另外一个方面是能够将SPR仪器和基于SPR的传感器小型化，提高了仪器的热稳定性和机械稳定性，结构紧凑。

本发明的相关原理也适用于复色光入射，检测共振波长的方法。

本发明的有益效果有以下四个特点：(a)可以一次完成多个样品的检测，在真正意义上，实时、动态检测生物分子的相互作用所引起的特异性响应，这在药物筛选中是十分必要的；(b)可以一次完成同一样品的不同特征的检测，这一点可以有效降低疾病检测中存在假阳性的几率；(c)在多通道中设置参考通道，可以消除非特异性响应的影响。(d)可以对低浓度的DNA分子进行测量，简化了PCR扩增后相对烦杂的检测过程。

附图说明

图1：传感器系统结构图

图2：反应池俯视图

图3：反应池剖面图

图4：传感芯片结构图

图5：A、B、C通道的总响应曲线图

图6：C通道的特异性响应曲线图

其中：1、样品进口；2、样品出口；3、硅片反应池；4、共振SPR样品池；5、敏感膜；6、发光二极管；7、球面透镜；8、针孔；9、平凸透镜；10、滤光片；11、偏振片；12、柱面透镜；13、柱面棱镜；14、面阵CCD；15、入射光路；16、出射光路；17、会聚透镜；18、玻璃基片；19、计算机；20、传感器主体；21、PCR反应池；22、棱镜放置槽；23、A通道；24、B通道；25、C通道；26、清洗通道进口；27、清洗通道出口

具体实施方式

为了更好的理解本发明，现在结合附图和实例来说明基于片上PCR多通道影像SPR传感器的基本结构和工作原理以及如何能够克服非特异性响应，得到特异性响应，从而实现对待测生物分子及其相互作用的检测。

这种基于片上PCR的多通道表面等离子共振影像传感器，包括共振SPR样品池和PCR反应池，其特点是：它将共振SPR样品池4和PCR反应池21结合在一起，构成传感器硅片反应池3；传感器主体20上部是由硅片构成的长方体形传感器硅片反应池3，下部是柱面棱镜13，两者之间是玻璃基片18，玻璃基片上是敏感膜5，敏感膜上是硅片的传感器硅片反应池3，在硅片反应池中设置共振SPR样品池和PCR反应池，从硅片传感器反应池上部设置样液的样品进口1和样品出口2；

在传感器主体两侧是入射光路15、出射光路16、和与出射光路末端连接的计算机平台19；

入射光路中由发光二极管6发出的光经过球面透镜7，在针孔8处会聚，再经过一个平凸透镜9转换为平行光，平行光先后通过滤光片10和偏振片11，调整偏振片的位置产生P偏振光，最后利用一个柱面透镜12对平行光进行角向会聚，使其在柱面棱镜13的敏感膜5处会聚成一条直线，射向柱面棱镜底面；

出射光路16由一个会聚透镜17和面阵CCD14组成，入射光在柱面棱镜底面发生全反射后经会聚透镜成为平行光，由面阵CCD完成光信号的采集，再送入计算机进行处理。

入射光路的光线入射角必须在40°—90°之间。

在针孔(8)处会聚的孔径Φ＝0.1—0.3mm。

滤光片用来改善入射光的单色性，滤光片的峰值波长为632.8nm。

这种基于片上PCR的多通道表面等离子共振影像传感器的检测方法，它包括下述步骤：

1)先向A、B、C三个通道同时通入摩尔比为1:9的生物素化硫醇衍生物和OH根硫醇稀释液的混合物磷酸盐PBS缓冲液，反应16—30小时，在各通道表面生成紧密覆盖的自组装单分子膜SAM，再用PBS缓冲液清洗；

2)然后在各通道顺序通入磷酸盐PBS缓冲液、浓度足够高的链酶抗生物素Streptavidin，反应5—20分钟、磷酸盐PBS缓冲液，同时实时检测A、B通道的共振角；

3)计算反应前后共振角的差值，计算出表面灵敏度；

4)用磷酸盐PBS缓冲液清洗三个通道，再将含有大鼠肝脏f蛋白基因探针的磷酸盐PBS缓冲液通入C通道，完成探针分子的固定；

5)通入缓冲液PBS清洗C通道，再用纯净水对三个通道进行清洗，然后同时向三个通道中依次通入纯净水和乙二醇，计算各个通道在通入纯净水和乙二醇时的共振角的差值，计算出体灵敏度和K_C；

6)使用蠕动泵将反应物注入PCR扩增反应池，反应体积为20μl，PCR扩增样品为大鼠肝脏f蛋白基因，浓度为1.3μg/μl，反应缓冲液中含有上游、下游引物各20pmol、Taq酶1.25u及dNTP各0.2mmol；

7)将反应物的温度依次稳定在95℃、55℃、72℃，并进行30个温度循环，达到DNA扩增的目的；

8)在向共振SPR样品池通入待测样液进行检测前，应先通入共振PBS对SPR样品池各通道进行清洗；

9)使用蠕动泵将PCR反应池中的扩增产物注入共振SPR样品池，并控制杂交温度，实时检测各通道共振角，结果如图5所示；、

10)求得任意时刻t各通道的响应，以PBS的共振角为基准，分别求出A、B、C三个通道的共振角变化量Δθ_A(t)、Δθ_B(t)、Δθ_C(t)，根据求出的参数就可以求出C通道的特异性动态响应曲线。

滤光片用来改善入射光的单色性，滤光片的峰值波长为632.8nm。

利用微机电系统MEMS工艺制备硅片反应池，包括下述过程：

1.清洗：选择所需的单晶硅片(确定晶向、电阻率等)，用清洗液和大量冷、热去离子水将表面清洗干净。

2.氧化：在单晶硅表面生长一层SiO₂薄膜，保护和钝化硅片表面，作为选择性腐蚀的掩蔽层，氧化膜的好坏对后续工艺有很大影响。

3.涂胶：在SiO₂膜上涂一层光刻胶。

4.光刻：光刻是图形复印和化学腐蚀相结合的精密表面加工技术，将设计好的系统结构通过掩膜版，利用紫外光复制在光刻胶层。

5.显影：将光刻后的硅片放入显影液中，使曝光后的光刻胶溶解，从而显现出系统结构图形。

6.SiO₂腐蚀：使用氢氟酸(HF)腐蚀液，将无胶膜覆盖的SiO₂腐蚀掉，得到系统结构图形。腐蚀液的配比是氢氟酸(48％)：氟化铵(pH值约为4～5)：去离子水＝3毫升：6克：10毫升。氢氟酸腐蚀SiO₂的机理是其与SiO₂发生络合反应，生成可溶于水的络合物，反应式为：

SiO₂+4HF＝SiF₄+2H₂O

SiF₄+2HF＝H₂[SiF₆]

总反应式为：

SiO₂+6HF＝H₂[SiF₆]+2H₂O

7.去胶：将腐蚀后硅片表面残留的光刻胶去除干净。

8.硅各向异性腐蚀：根据硅的各向异性特性，利用碱性腐蚀液，将没有SiO₂膜保护的单晶硅腐蚀掉，形成V型槽或U型槽。

9.去除SiO₂保护膜：用氢氟酸腐蚀液去除残余的SiO₂保护层，得到刻蚀好系统结构的衬底硅片。

10.键合：根据需要，将多个制作好微结构的硅片利用键合工艺结合在一起，组成封闭的三维系统，完成所需的功能。

图4是传感芯片的结构：23、A通道，24、B通道，25、C通道。在玻璃基片上共有A、B、C三个通道。各通道首先同时生成一层厚度为50nm的均匀金膜，然后在B通道的金膜上制备厚度约为15nm的高折射率电介质层(Ta₂O₅或TiO₂等)。测试前，在C通道的金膜上生成一层含有探针分子的敏感膜。传感芯片的基片与柱面棱镜的材料相同，二者通过光学耦合液结合为一个完整的半柱面棱镜。传感芯片上各种膜的制备采用溅射、光刻工艺。入射光路产生的角向会聚单色P偏振光束正好在传感芯片金膜表面会聚为一条与三个通道正交的直线。单色面阵CCD与计算机共同完成SPR影像的实时采集。SPR影像中不同象素行对应不同的入射角，其象素值为对应入射角光线的反射光强。进样系统由PCR—SPR反应池和温控系统(由半导体制冷片和温控电路组成)及微量蠕动泵构成。

体响应即是指待测样液成份、浓度、温度等体内变化所引起的共振角的变化。A、B、C三个通道的响应可分别表示为：

Δθ_A(t)＝b_A(t)+s_A(t)＝B_AΔn(t)+S_AΔN_n(t)  (1)

Δθ_B(t)＝b_B(t)+s_B(t)＝B_BΔn(t)+S_BΔN_n(t)  (2)

Δθ_C(t)＝b_C(t)+s_C(t)  (3)

＝B_CΔn(t)+S_C(K_CΔN_n(t)+ΔN_SC(t))

Δθ_A(t)、Δθ_B(t)、Δθ_C(t)分别表示A、B、C通道的响应(即共振角度的改变)，b_A(t)、b_B(t)、b_C(t)表示A、B、C通道中体内折射率变化引起的响应，s_A(t)、s_B(t)、s_C(t)表示A、B、C通道中的表面折射率变化而引起的响应。B_A、S_A、B_B、S_B、B_C、S_C分别表示A、B、C通道的体灵敏度和表面灵敏度。Δn(t)、ΔN_n(t)、ΔN_SC(t)表示体内折射率的变化、非特异性作用所引起的表面折射率变化和特异性作用所引起的表面折射率变化，t表示时间。

对通道C而言，特异性作用引起的响应为：

Δθ_SC＝S_CΔN_SC(t)  (4)

＝Δθ_C(t)-B_CΔn(t)-S_CK_CΔN_n(t)

为确定K_C的值，可向传感器表面通入不含目标分子的样液，此时C通道的响应中不包含特异性吸收引起的响应，即(4)式的值为0，可得：

$K_C=\frac{{\mathrm{\θ}}_C\left(t\right)-B_C\mathrm{\Δn}\left(t\right)}{S_C\mathrm{\Δ}{N}_n\left(t\right)}=\frac{{\mathrm{\θ}}_C\left(t\right)-\frac{B_C}{B_A}{b}_A}{\frac{S_C}{S_A}{s}_A}$

再通过(1)、(2)式求得Δn(t)、ΔN_n(t)并与K_C一起代入(4)式就可以得到C通道的非特异性响应。

入射光路可以提供一定角度范围的入射光，与面阵CCD相配合，可以一次完成一定角度范围的反射光强的检测。在柱面透镜前还加装有滤光片和偏振片。滤光片用于改善入射光的单色性，偏振片用于产生P偏振光。

光路的具体参数及说明如下：

①LED：东芝公司的TLRH190P型LED，参数如前所述。

②球面透镜：直径Φ＝10mm，焦距f＝10mm；LED距离球面透镜约为焦距的10倍(100mm左右，近似于平行入射)。

③平凸透镜：直径Φ＝20mm，焦距f＝35mm。

④柱面透镜：焦距f＝40mm，大小为15mm×15mm。

⑤·滤光片：干涉滤光片，峰值波长为632.8nm，其透过率为60％。

⑥偏振片：直径Φ＝25.4mm，透过率>60％，偏振化方向在图平面内；偏振片和柱面透镜的方向应保持统一。

⑦光路的所有元件均可方便拆装，易于更换；各元件的间距均按照上述参数设计，且可微调。

⑧所有光学元件封装于煮黑的金属筒内，可削弱杂散光影响，提高检测精度。

⑨整个光路的设计既要充分利用光源的能量，又要获得宽度很小的会聚线。

因柱面透镜的通光孔径为12mm×12mm，焦距f＝40mm，可以估算入射角范围大约为α＝2×arctg[12/(2×40)]≈17度。CCD距金属膜约120mm，所以反射光在CCD表面形成的光斑宽度约为36mm，CCD有效长度约为37.4mm。实验中通过观察采集到的曲线可以看出，CCD可一次性采集到所有反射光的信号。检测精度由CCD决定，我们所采用的CCD的象素间距为7μm，反射光程约为120mm，经计算理论角度分辨率达0.0033度，比0.1度提高了约2个数量级。

实施例1

采用以下实验步骤可以确定A、B、C通道的表面灵敏度，同时完成敏感膜的制备。在确定各通道灵敏度时，采用如图2所示的样品池(3、硅片基底，22、棱镜放置槽，23、A通道样品池，24、B通道样品池，25、C通道样品池)，先向A、B、C三个通道同时通入摩尔比为1:9的生物素化硫醇衍生物和OH根硫醇稀释液的混合物(PBS缓冲液环境)，反应足够长时间(16小时以上)，在各通道表面生成紧密覆盖的自组装单分子膜(SAM)，再用PBS缓冲液清洗。然后在各通道顺序通入表面等离子体PBS缓冲液、浓度足够高的链酶抗生物素(Streptavidin)(反应约5—20分钟)、磷酸盐PBS缓冲液，同时实时检测A、B通道的共振角，并计算反应前后共振角的差值。由上述的(1)—(3)式计算得出表面灵敏度。

通过下面的实验完成C通道探针分子的固定，并可以测定体灵敏度的比值。用PBS缓冲液清洗三个通道，再将含有大鼠肝脏f蛋白基因探针的磷酸盐PBS缓冲液通入C通道，完成探针分子的固定。通入磷酸盐PBS缓冲液清洗C通道，再用纯净水对三个通道进行清洗，然后同时向三个通道中依次通入纯净水和乙二醇，计算各个通道在通入纯净水和乙二醇时的共振角的差值。并由上述的(1)—(3)、(5)式计算得出体灵敏度和K_C。此时传感芯片制作完成，如图4所示。

以下实验可以实现用SPR检测方法对PCR扩增产物直接进行检测，简化了PCR扩增后相对烦杂的检测过程。

PCR扩增样品为大鼠肝脏f蛋白基因，浓度为1.3μg/μl。反应缓冲液中含有上游、下游引物各20pmol、Taq酶1.25u及dNTP各0.2mmol，使用蠕动泵将反应物注入PCR扩增反应池，反应体积约为20μl。

PCR扩增的一个热循环周期包括以下三个步骤：

①.加热样品，当温度达到95℃左右时，DNA分子由双链结构分解成两条单链。

②.降温冷却至55℃左右，使分解后的单链按碱基互补原则与引物结合。

③.再次加热升温至72℃，使寡核苷酸按碱基配对原则沿引物生长，完成DNA的一次复制。

实验采用半导体制冷片温控系统对反应池进行温度控制，将反应物的温度依次稳定在95℃、55℃、72℃，并进行30个温度循环，达到DNA扩增的目的，为后继SPR检测做准备。

在向SPR样品池通入待测样液进行检测前，应先通入PBS对SPR样品池各通道进行清洗，之后再通入包含有待测样品的扩增产物，并控制杂交温度，实时检测各通道共振角，结果如图5所示。从图中可以求得任意时刻t各通道的响应(以PBS的共振角为基准)：Δθ_A(t)、Δθ_B(t)、Δθ_C(t)，结合标定结果，利用(1)—(5)式及已求出的参数就可以求出C通道的特异性动态响应曲线，如图6所示。

Claims (1)

1.一种基于片上PCR的多通道表面等离子共振影像传感器的检测方法，其特征在于它包括下述步骤：

1)先向A、B、C三个通道同时通入摩尔比为1:9的生物素化硫醇衍生物和OH根硫醇稀释液的混合物磷酸盐PBS缓冲液，反应16—30小时，在各通道表面生成紧密覆盖的自组装单分子膜SAM，再用PBS缓冲液清洗；

2)然后在各通道顺序通入磷酸盐PBS缓冲液、浓度足够高的链酶抗生物素Streptavidin，反应5—20分钟、磷酸盐PBS缓冲液，同时实时检测A、B通道的共振角；

3)计算反应前后共振角的差值，计算出表面灵敏度；

4)用磷酸盐PBS缓冲液清洗三个通道，再将含有大鼠肝脏f蛋白基因探针的磷酸盐PBS缓冲液通入C通道，完成探针分子的固定；

5)通入缓冲液PBS清洗C通道，再用纯净水对三个通道进行清洗，然后同时向三个通道中依次通入纯净水和乙二醇，计算各个通道在通入纯净水和乙二醇时的共振角的差值，计算出体灵敏度和K_C；

6)使用蠕动泵将反应物注入PCR扩增反应池，反应体积约为20μl，PCR扩增样品为大鼠肝脏f蛋白基因，浓度为1.3μg/μl，反应缓冲液中含有上游、下游引物各20pmol、Taq酶1.25u及dNTP各0.2mmol；

7)将反应物的温度依次稳定在95℃、55℃、72℃，并进行30个温度循环，达到DNA扩增的目的；

8)在向共振SPR样品池通入待测样液进行检测前，应先通入共振PBS对SPR样品池各通道进行清洗；

9)使用蠕动泵将PCR反应池中的扩增产物注入共振SPR样品池，并控制杂交温度，实时检测各通道共振角；

10)求得任意时刻t各通道的响应，以PBS的共振角为基准，分别求出A、B、C三个通道的共振角变化量Δθ_A(t)、Δθ_B(t)、Δθ_C(t)，根据求出的参数就可以求出C通道的特异性动态响应曲线。

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