CN113281309B - 一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法 - Google Patents

一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其包括步骤：首先将农药小分子的牛血清偶联蛋白捕获抗原共价偶联到镀金芯片表面，构建SPR芯片；然后选择合适固定浓度的单克隆抗体，混合不同浓度的农药残留提取物标样；农药残留的标样预先与其对应的单克隆抗体结合；反应剩余的单克隆抗体再次结合到SPR芯片表面，当农药的残留浓度越高，与SPR芯片表面的蛋白捕获抗原结合的单克隆抗体越少，响应信号越低，响应值与浓度存在反比关系，从而实现对农药残留的定量检测。本发明提供的的检测方法不需要对待测样本进行复杂的预处理，且本发明能够同时实现定量检测毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三种农药的残留浓度，其检测效率高。

Description

一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法
技术领域
本发明涉及农药残留检测领域，尤其涉及一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法。
背景技术
毒死蜱的化学名为O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸，分子式为C9H11Cl3NO3PS，呈白色结晶，具有轻微的硫醇味，是一种非内吸性广谱杀虫、杀螨剂，在土地中挥发性较高。多菌灵(Carbendazim)为苯并咪唑类杀菌剂，是一种良好的广谱、内吸性杀菌剂，对子囊菌、担子菌以及半知菌类中的大多数病原菌都有效，广泛应用于农作物、中草药、烟草等的病害防治工作中。阿特拉津的化学名称为2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪，分子式为C8H14ClN5，是一种三嗪类除草剂。
毒死蜱、多菌灵以及阿特拉津这三种药物均可用于农作物病害防治工作中，但是这些药物能被植物的种子、根和叶吸收，残效期较长，对人、畜均有一定毒性。例如，我国针对不同作物，制定了多菌灵的最大残留限量标准，其中，多菌灵在谷物中的最大残留限量在0.05-2mg/kg之间，在蔬菜中的最大残留限量在0.02-5mg/kg之间，在水果中的最大残留限量在0.5-5mg/kg之间，在坚果中的最大残留限量为0.1mg/kg。
目前，国内外对毒死蜱、多菌灵、阿特拉津等残留的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法。仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，旨在解决现有技术对毒死蜱、多菌灵、阿特拉津的检测存在检测效率较低、样品处理繁琐的问题。
本发明的技术方案如下：
一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，包括步骤：
提供SPR芯片，所述SPR芯片上设置有至少三个流道，每个流道内均偶联有蛋白捕获抗原；
将不同浓度的毒死蜱标准样品分别与固定浓度的毒死蜱单克隆抗体混合，得到不同浓度的毒死蜱混合样品；将不同浓度的多菌灵标准样品分别与固定浓度的多菌灵单克隆抗体混合，得到不同浓度的多菌灵混合样品；将不同浓度的阿特拉津标准样品分别与固定浓度的阿特拉津单克隆抗体混合，得到不同浓度的阿特拉津混合样品；
将所述不同浓度的毒死蜱混合样品、不同浓度的多菌灵混合样品以及不同浓度的阿特拉津混合样品分别通过所述SPR芯片，测得不同浓度的毒死蜱混合样品对应的RU值，不同浓度的多菌灵混合样品对应的RU值，以及不同浓度的阿特拉津混合样品对应的RU值；
根据不同浓度的毒死蜱混合样品对应的RU值，不同浓度的多菌灵混合样品对应的RU值，以及不同浓度的阿特拉津混合样品对应的RU值分别构建毒死蜱浓度-RU标准曲线、多菌灵浓度-RU标准曲线、阿特拉津浓度-RU标准曲线；
将待测样品分别与所述固定浓度的毒死蜱单克隆抗体、固定浓度的多菌灵单克隆抗体以及固定浓度的阿特拉津单克隆抗体混合，分别得到第一待测混合样品、第二待测混合样品以及第三待测混合样品；
将所述第一待测混合样品、第二待测混合样品以及第三待测混合样品分别通过所述SPR芯片上的三个流道，测得对应的第一RU值、第二RU值、以及第三RU值；
根据所述第一RU值以及所述毒死蜱浓度-RU标准曲线获得待测样品中的毒死蜱浓度，根据所述第二RU值以及所述多菌灵浓度-RU标准曲线获得待测样品中的多菌灵浓度，根据所述第三RU值以及所述阿特拉津浓度-RU标准曲线获得待测样品中的阿特拉津浓度。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，所述SPR芯片的制备包括步骤：
将镀金芯片浸入16-巯基-1-十一烷酸溶液中，孵育预定时间后，使16-巯基-1-十一烷酸结合在镀金芯片上，得到修饰后镀金芯片；
将EDC与NHS的混合液流经所述修饰后镀金芯片表面，得到活化后镀金芯片；
将蛋白捕获抗原溶液流经所述活化后镀金芯片表面各自的流道区域，使所述蛋白捕获抗原偶联在所述活化后镀金芯片的流道上，制得所述SPR芯片。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，将镀金芯片浸入16-巯基-1-十一烷酸溶液中，孵育预定时间后，使16-巯基-1-十一烷酸结合在镀金芯片上，得到修饰后镀金芯片的步骤包括：
将16-巯基-1-十一烷酸分散在无水乙醇中，得到16-巯基-1-十一烷酸溶液；
将镀金芯片浸入在所述16-巯基-1-十一烷酸溶液中，放入恒温摇床中，调节温度为30-40℃，转速为80-120rpm，孵育7-9小时，使16-巯基-1-十一烷酸结合在镀金芯片上；
孵育结束后，用无水乙醇和纯化水对所述镀金芯片进行清洗，氮气吹干后，制得所述修饰后镀金芯片。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，将EDC与NHS的混合液流经所述修饰后镀金芯片表面，得到活化后镀金芯片的步骤包括：
将200mM的所述EDC与200mM的NHS按照1:1的体积混合，得到混合液；
将200μL的所述混合液以20μL·min-1的速度流经所述修饰后镀金芯片表面；
运行结束后再以100μL·min-1的速度通入纯水溶液进行冲洗至基线稳定，制得所述活化后镀金芯片。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，将蛋白捕获抗原溶液流经所述活化后镀金芯片表面各自的流道区域，使所述蛋白捕获抗原偶联在所述活化后镀金芯片的流道上，之后还包括步骤：
采用缓冲液流经所述活化后镀金芯片的流道；
运行结束后再以100μL·min-1的速度通入纯水冲洗至基线稳定。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，所述缓冲液为pH值为4.5的醋酸盐、pH为5.5的MES、pH为6.5的柠檬酸钠、pH值为7.5的PBS以及pH为8.5的硼酸盐中的一种。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，不同浓度的毒死蜱标准样品包括5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的毒死蜱标准样品；不同浓度的多菌灵标准样品包括5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的多菌灵标准样品；不同浓度的阿特拉津标准样品包括5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的阿特拉津标准样品。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，将所述不同浓度的毒死蜱混合样品通过所述SPR芯片，测得不同浓度的毒死蜱混合样品对应的RU值的步骤包括：
将5μg·mL-1的毒死蜱混合样品通过所述SPR芯片，通过SPR仪测得5μg·mL-1的毒死蜱混合样品对应的RU值；
采用再生液流经所述SPR芯片，对所述SPR芯片上的蛋白捕获抗原与毒死蜱单克隆抗体进行洗脱分离，得到再生SPR芯片；
将10μg·mL-1的毒死蜱混合样品通过所述再生SPR芯片，通过SPR仪测得10μg·mL-1的毒死蜱混合样品对应的RU值；
重复上述步骤，依次制得20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的毒死蜱混合样品对应的RU值。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，所述再生液为0.05mol·L-1的HCL。
所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其中，所述再生液的洗脱时间为15min。
有益效果：本发明选择了间接竞争法测定样本溶液中的农药(毒死蜱、多菌灵、阿特拉津)残留含量，首先将农药小分子的牛血清偶联蛋白捕获抗原共价偶联到镀金芯片表面，构建SPR芯片；然后选择合适固定浓度的单克隆抗体，混合不同浓度的农药残留提取物标样；农药残留的标样预先与其对应的单克隆抗体结合；反应剩余的单克隆抗体再次结合到SPR芯片表面，当农药的残留浓度越高，与SPR芯片表面的蛋白捕获抗原结合的单克隆抗体越少，响应信号越低，响应值与浓度存在反比关系，从而实现对农药残留的定量检测。本发明提供的的检测方法不需要对待测样本进行复杂的预处理，且本发明能够同时实现定量检测毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三种农药的残留浓度，其检测效率高。
附图说明
图1为本发明一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法较佳实施例的流程图。
图2为本发明SPR芯片的形貌表征图。
具体实施方式
本发明提供一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，图1为本发明提供的一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法较佳实施例的流程图，如图所示，其包括步骤：
S10、提供SPR芯片，所述SPR芯片上设置有至少三个流道，每个流道内均偶联有蛋白捕获抗原；
S20、将不同浓度的毒死蜱标准样品分别与固定浓度的毒死蜱单克隆抗体混合，得到不同浓度的毒死蜱混合样品；将不同浓度的多菌灵标准样品分别与固定浓度的多菌灵单克隆抗体混合，得到不同浓度的多菌灵混合样品；将不同浓度的阿特拉津标准样品分别与固定浓度的阿特拉津单克隆抗体混合，得到不同浓度的阿特拉津混合样品；
S30、将所述不同浓度的毒死蜱混合样品、不同浓度的多菌灵混合样品以及不同浓度的阿特拉津混合样品分别通过所述SPR芯片，测得不同浓度的毒死蜱混合样品对应的RU值，不同浓度的多菌灵混合样品对应的RU值，以及不同浓度的阿特拉津混合样品对应的RU值；
S40、根据不同浓度的毒死蜱混合样品对应的RU值，不同浓度的多菌灵混合样品对应的RU值，以及不同浓度的阿特拉津混合样品对应的RU值分别构建毒死蜱浓度-RU标准曲线、多菌灵浓度-RU标准曲线、阿特拉津浓度-RU标准曲线；
S50、将待测样品分别与所述固定浓度的毒死蜱单克隆抗体、固定浓度的多菌灵单克隆抗体以及固定浓度的阿特拉津单克隆抗体混合，分别得到第一待测混合样品、第二待测混合样品以及第三待测混合样品；
S60、将所述第一待测混合样品、第二待测混合样品以及第三待测混合样品分别通过所述SPR芯片上的三个流道，测得对应的第一RU值、第二RU值、以及第三RU值；
S70、根据所述第一RU值以及所述毒死蜱浓度-RU标准曲线获得待测样品中的毒死蜱浓度，根据所述第二RU值以及所述多菌灵浓度-RU标准曲线获得待测样品中的多菌灵浓度，根据所述第三RU值以及所述阿特拉津浓度-RU标准曲线获得待测样品中的阿特拉津浓度。
具体来讲，SPR(Surface plasmon resonance)，被称为表面等离子体共振，又称表面等离激元共振，本质上是一种物理光学现象。基于SPR芯片的检测原理为：当光源发出的P偏振光(电磁波)以一定的角度入射到棱镜中，在棱镜与金属的界面处将发生反射和折射，当入射角大于临界角时，光线将发生全内反射，在全内反射的情况下，电场在金属与棱镜的界面处并不立即消失，而是向金属介质中传输振幅呈指数衰减的消逝波，同时引发金属中的自由电子产生表面等离子波，当金属表面等离子波与消逝波发生共振时，检测到的反射光强度会大幅度地减弱，能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被金属表面等离子波吸收，使得反射光的能量急剧减少。当入射光波长固定时，反射光强度是入射角的函数，其中反射光强度最低时所对应的入射角为共振角(Resonance Angle)。表面等离子共振(SPR)对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感，当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，SPR谱(共振角的变化VS时间)能够反映与金属膜表面接触的体系的变化。作为举例，假设有一偶联了抗原的SPR芯片，当样本流过SPR芯片，抗体与抗原结合，导致样本通道(Sample Channel 2)的共振角发生改变，而对照通道(ReferenceChannel 1，是没有偶联抗原的对照表面)共振角不发生改变，此时利用这两个通道共振角之差(Channel2-Channel 1)绘制出的共振单位RU(Resonance Units)随时间变化的曲线是一个向上的曲线。
本发明提供的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法是基于SPR芯片实现的，首先通过所述SPR芯片分别测量已知浓度的毒死蜱标准样品、多菌灵标准样品，以及阿特拉津标准样品对应的RU值，以此构建毒死蜱浓度-RU标准曲线、多菌灵浓度-RU标准曲线、阿特拉津浓度-RU标准曲线；然后将待测样品分别与所述固定浓度的毒死蜱单克隆抗体、固定浓度的多菌灵单克隆抗体以及固定浓度的阿特拉津单克隆抗体混合，分别得到第一待测混合样品、第二待测混合样品以及第三待测混合样品；将所述第一待测混合样品、第二待测混合样品以及第三待测混合样品分别通过所述SPR芯片上的三个流道，测得对应的第一RU值、第二RU值、以及第三RU值；最后根据所述第一RU值以及所述毒死蜱浓度-RU标准曲线获得待测样品中的毒死蜱浓度，根据所述第二RU值以及所述多菌灵浓度-RU标准曲线获得待测样品中的多菌灵浓度，根据所述第三RU值以及所述阿特拉津浓度-RU标准曲线获得待测样品中的阿特拉津浓度。
本发明选择了间接竞争法测定样本溶液中的农药(毒死蜱、多菌灵、阿特拉津)残留含量，首先将农药小分子的牛血清偶联蛋白捕获抗原共价偶联到镀金芯片表面，构建SPR芯片；然后选择合适固定浓度的单克隆抗体，混合不同浓度的农药残留提取物标样；农药残留的标样预先与其对应的单克隆抗体结合；反应剩余的单克隆抗体再次结合到SPR芯片表面，当农药的残留浓度越高，与SPR芯片表面的蛋白捕获抗原结合的单克隆抗体越少，响应信号越低，响应值与浓度存在反比关系，从而实现对农药残留的定量检测。本发明提供的的检测方法不需要对待测样本进行复杂的预处理，且本发明能够同时实现定量检测毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三种农药的残留浓度，其检测效率高。
在一些实施方式中，所述SPR芯片的制备包括步骤：
将镀金芯片浸入16-巯基-1-十一烷酸溶液中，孵育预定时间后，使16-巯基-1-十一烷酸结合在镀金芯片上，得到修饰后镀金芯片；将EDC与NHS的混合液流经所述修饰后镀金芯片表面，得到活化后镀金芯片；将蛋白捕获抗原溶液流经所述活化后镀金芯片表面各自的流道区域，使所述蛋白捕获抗原偶联在所述活化后镀金芯片的流道上，制得所述SPR芯片。
具体来讲，将全新制备的镀金芯片从包装盒中取出；放入表面皿中，纯化水淋洗3次；然后缓慢加入98％H2SO4:30％H2O2(体积比7:3)混合溶液，80℃条件下孵育5分钟，以除去芯片表面存在的杂质；取出镀金芯片后，再用纯化水清洗干净，氮气吹干备用；将16-巯基-1-十一烷酸分散在无水乙醇中，得到16-巯基-1-十一烷酸溶液；将镀金芯片浸入在所述16-巯基-1-十一烷酸溶液中，放入恒温摇床中，调节温度为30-40℃，转速为80-120rpm，孵育7-9小时，使16-巯基-1-十一烷酸结合在镀金芯片上；孵育结束后，用无水乙醇和纯化水对所述镀金芯片进行清洗，氮气吹干后，制得所述修饰后镀金芯片。利用原子力显微镜对镀金芯片表面微观形貌进行扫描，结果如图2所示，自组装后的镀金芯片表面完整，无脱落等情况。
进一步地，打开表面等离子共振检测仪，表面自组装修饰的镀金芯片自动装载到芯片检测区域，待仪器自检通过以后即可进行下一步实验。取上述配制的200mM EDC和200mM NHS溶液进行等体积1:1混合，仪器设定取样体积200μL，注液速度20μL·min-1的速度流过镀金芯片表面；运行结束后再以100μL·min-1的速度通入纯水溶液进行冲洗至基线稳定。然后将合成抗原用缓冲液稀释至工作浓度，设定流注液速度为10μL·min-1，取样体积200μL，使合成抗原流过上述已经过EDC/NHS活化的芯片表面各自的通道区域(参比通道使用BSA进行偶连)；运行结束后再以100μL·min-1的速度通入纯水进行冲洗至基线稳定；然后各取体积200μL的缓冲液分别以20μL·min-1流过已经偶联蛋白捕获抗原的芯片；运行结束后再以100μL·min-1的速度通入纯水冲洗至基线稳定。
在一些实施方式中，所述缓冲液为pH值为4.5的醋酸盐、pH为5.5的MES、pH为6.5的柠檬酸钠、pH值为7.5的PBS以及pH为8.5的硼酸盐中的一种，但不限于此。
具体来讲，由于不同pH值缓冲液也会对蛋白的空间结构产生影响，导致暴露到蛋白表面的氨基基团数量不一样，同样也会对偶联的效果产生影响。因此，本实施例根据芯片的表面性质和抗原的特性选择醋酸盐缓冲液(pH4.5)、MES缓冲液(pH5.5)、柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)、PBS缓冲液(pH7.5)、硼酸盐缓冲液(pH8.5)5种缓冲液，在相同蛋白浓度条件(40μg·mL-1)下，通过比较合成抗原在芯片上的固定效果醋酸盐缓冲液(pH4.5)确定为最佳缓冲液，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003069242430000071
在一些实施方式中，对单克隆抗体的反应浓度进行选择。用PBS缓冲液对抗体按照5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1、共5个梯度浓度进行稀释，选取阴性样本提取液，然后按照体积比1：1进行稀释；设定取样体积200μL，注液速度为10μL·min-1，使混合溶液流过上述芯片至反应结束；然后再以100μL·min-1的速度通入纯水进行冲洗至基线稳定。选择阴性样本反应RU值＞150RU值以上的抗体浓度值，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003069242430000072
Figure BDA0003069242430000081
从表2可以看出，DSP浓度选择20ug/mL，ART浓度选择40ug/mL，多菌灵在5ug/mL的条件下，其芯片表面的结合已经饱和。
在一些实施方式中，对通入SPR芯片流道的待测样品流速进行选择。根据上述选定的抗体反应浓度的结果；取200μL的混合溶液，调节流速为5μL·min-1，10μL·min-1，20μL·min-1，50μL·min-1，100μL·min-1使混合溶液流过上述芯片至反应结束；运行结束后再以100μL·min-1的速度通入纯水进行冲洗至基线稳定。通过分析通入混合溶液反应后的差值选择合适的待测样品流速，结果如表3所示，考虑到3合一芯片的同时检测，选择流速10μL·min-1。
表3
Figure BDA0003069242430000082
在一些实施方式中，SPR芯片的主要优点之一是在一定条件下可以将SPR芯片再生重复使用。对于制备了定向蛋白敏感层的传感器芯片再利用，是使用洗脱溶液从传感器表面去除配体后，保持定向蛋白SPA以及定向固定的抗体的活性，再次识别配体的时候，生物活性以及物理化学性质应保持不变。因此，实验研究了洗脱液破坏配体与被分析物结合的能力，并且要求在这一过程中，传感器表面应完全分离抗原抗体复合物，而不会造成芯片表面定向蛋白活性的破坏。
实验分别测定了5种再生液：0.01mol·L-1甘氨酸-盐酸(pH 3.0)缓冲液、0.1mol·L-1NaOH、0.05mol·L-1NaOH、0.01mol·L-1HCl、0.05mol·L-1HCl。每种再生液用20μL·min-1的流速再生传感器芯片5分钟，考察其洗脱结合抗体的能力，结果如表4所示。
表4洗脱能力测试结果
Figure BDA0003069242430000083
Figure BDA0003069242430000091
不同再生液的效果，DSP(0.05mol·L-1HCl)，DJL(0.05mol·L-1NaOH)，ART(0.1mol·L-1NaOH)最佳；考虑3合1检测需求，在NaOH的再生条件下，芯片表面有损伤，因此选择0.05mol·L-1HCL作为再生溶液。
更进一步地，以0.05mol·L-1HCL作为再生溶液，并对洗脱时间进行条件摸索，结果如表5所示，确定洗脱时间为15min。
表5洗脱时间确定表
Figure BDA0003069242430000092
在一些实施方式中，以盲样的检测结果的相对误差作为准确性评价指标；以重复测定盲样的检测结果的变异系数作为精密度评价指标。其中，相对误差的计算公式为：
Figure BDA0003069242430000093
其中Xi为实际测量值，μ为真实值，
Figure BDA0003069242430000094
为均值，δ标示相对误差。变异系数计算公式为：
Figure BDA0003069242430000095
其中，Sd为测定数据的标准偏差，
Figure BDA0003069242430000096
为测定数据的平均值。
在一些具体的实施方式中，待测样品的检测过程为：将SPR芯片放入SPR仪，初始化仪器，待仪器自检通过后，开始实验。取一定量的单克隆抗体(DSP对应的单克隆抗体：20ug/mL；多菌灵对应的单克隆抗体：5.0ug/mL；阿特拉津对应的单克隆抗体：40ug/mL)和不同浓度的抗原(标准样品)各100μL 1:1混合后送入到芯片表面；调节流速10μL·min-1，进行反应；反应完成后使用Running Buffer反复冲洗至基线平衡。检测完样品的溶液，调节流速20μL·min-1，通入300μL的再生溶液进行芯片再生，最后，通入Running Buffer清洗芯片至芯片平衡，然后进行下一轮的实验。
在一些实施方式中，不同浓度的毒死蜱标准样品包括0μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg的毒死蜱标准样品，将0μg/kg的毒死蜱混合样品通过所述SPR芯片，通过SPR仪测得0μg/kg的毒死蜱混合样品对应的RU值；采用再生液流经所述SPR芯片，对所述SPR芯片上的蛋白捕获抗原与毒死蜱单克隆抗体进行洗脱分离，得到再生SPR芯片；
将1μg/kg的毒死蜱混合样品通过所述再生SPR芯片，通过SPR仪测得1μg/kg的毒死蜱混合样品对应的RU值；重复上述步骤，依次制得5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg1的毒死蜱混合样品对应的RU值，结果如表6所示。
表6不同浓度的毒死蜱对应的RU值
Figure BDA0003069242430000101
根据表6结果构建毒死蜱浓度-RU标准曲线，然后将待测样品与固定浓度的毒死蜱单克隆抗体混合，得到第一待测混合样品；将所述第一待测混合样品通过所述SPR芯片上的流道，测得对应的第一RU值；根据所述第一RU值以及所述毒死蜱浓度-RU标准曲线获得待测样品中的毒死蜱浓度，结果如表7所示。
表7待测样品的毒死蜱浓度测试结果
Figure BDA0003069242430000102
在一些实施方式中，不同浓度的多菌灵标准样品包括0μg/kg、0.25μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg的多菌灵标准样品，将0μg/kg的多菌灵混合样品通过所述SPR芯片，通过SPR仪测得0μg/kg的多菌灵混合样品对应的RU值；采用再生液流经所述SPR芯片，对所述SPR芯片上的蛋白捕获抗原与多菌灵单克隆抗体进行洗脱分离，得到再生SPR芯片；将0.25μg/kg的多菌灵混合样品通过所述再生SPR芯片，通过SPR仪测得0.25μg/kg的多菌灵混合样品对应的RU值；重复上述步骤，依次制得1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg的多菌灵混合样品对应的RU值，结果如表8所示。
表8不同浓度的多菌灵对应的RU值
Figure BDA0003069242430000111
根据表8结果构建多菌灵浓度-RU标准曲线，然后将待测样品与固定浓度的多菌灵单克隆抗体混合，得到第二待测混合样品；将所述第二待测混合样品通过所述SPR芯片上的流道，测得对应的第二RU值；根据所述第二RU值以及所述多菌灵浓度-RU标准曲线获得待测样品中的多菌灵浓度，结果如表9所示。
表9待测样品的多菌灵浓度测试结果
Figure BDA0003069242430000112
在一些实施方式中，不同浓度的阿特拉津标准样品包括0μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg的多菌灵标准样品，将0μg/kg的阿特拉津混合样品通过所述SPR芯片，通过SPR仪测得0μg/kg的阿特拉津混合样品对应的RU值；采用再生液流经所述SPR芯片，对所述SPR芯片上的蛋白捕获抗原与阿特拉津单克隆抗体进行洗脱分离，得到再生SPR芯片；将1μg/kg的阿特拉津混合样品通过所述再生SPR芯片，通过SPR仪测得1μg·mL-1的阿特拉津混合样品对应的RU值；重复上述步骤，依次制得2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg的阿特拉津混合样品对应的RU值，结果如表10所示。
表10不同浓度的阿特拉津对应的RU值
Figure BDA0003069242430000121
根据表10结果构建阿特拉津浓度-RU标准曲线，然后将待测样品与固定浓度的阿特拉津单克隆抗体混合，得到第三待测混合样品；将所述第三待测混合样品通过所述SPR芯片上的流道，测得对应的第三RU值；根据所述第三RU值以及所述阿特拉津浓度-RU标准曲线获得待测样品中的阿特拉津浓度，结果如表11所示。
表11待测样品的阿特拉津浓度测试结果
Figure BDA0003069242430000122
Figure BDA0003069242430000131
在一些实施方式中，采用本发明方法对DSP浓度的测量精密度进行验证，分别对10ug/kg的DSP，60ug/kg的DSP以及120ug/kg的DSP进行验证，结果如表12所示：
表12 DSP浓度的测量精密度结果
Figure BDA0003069242430000132
在一些实施方式中，采用本发明方法对多菌灵浓度的测量精密度进行验证，分别对5ug/kg的多菌灵，40ug/kg的多菌灵以及80ug/kg的多菌灵进行验证，结果如表13所示：
表13多菌灵浓度的测量精密度结果
Figure BDA0003069242430000133
在一些实施方式中，采用本发明方法对阿特拉津浓度的测量精密度进行验证，分别对1ug/kg的阿特拉津，5ug/kg的阿特拉津以及20ug/kg的阿特拉津进行验证，结果如表14所示：
表14阿特拉津浓度的测量精密度结果
Figure BDA0003069242430000141
应当理解的是，以上描述和解释了本发明的主要特征、基本原理和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受所述实例的限制，在不脱离本发明设计思想和范围前提下，本发明还会有各种变化以及改进，例如技术人员可对上述参数进行修改来适应不同工作波段，或修改相关参数以使其结构、性能与本实例有所不同，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由权利要求及其等同界定。

Claims (9)

1.一种毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，包括步骤：
提供SPR芯片，所述SPR芯片上设置有至少三个流道，每个流道内均偶联有蛋白捕获抗原；
将不同浓度的毒死蜱标准样品分别与固定浓度的毒死蜱单克隆抗体混合，得到不同浓度的毒死蜱混合样品；将不同浓度的多菌灵标准样品分别与固定浓度的多菌灵单克隆抗体混合，得到不同浓度的多菌灵混合样品；将不同浓度的阿特拉津标准样品分别与固定浓度的阿特拉津单克隆抗体混合，得到不同浓度的阿特拉津混合样品；
将所述不同浓度的毒死蜱混合样品、不同浓度的多菌灵混合样品以及不同浓度的阿特拉津混合样品分别通过所述SPR芯片，测得不同浓度的毒死蜱混合样品对应的RU值，不同浓度的多菌灵混合样品对应的RU值，以及不同浓度的阿特拉津混合样品对应的RU值；
根据不同浓度的毒死蜱混合样品对应的RU值，不同浓度的多菌灵混合样品对应的RU值，以及不同浓度的阿特拉津混合样品对应的RU值分别构建毒死蜱浓度-RU标准曲线、多菌灵浓度-RU标准曲线、阿特拉津浓度-RU标准曲线；
将待测样品分别与所述固定浓度的毒死蜱单克隆抗体、固定浓度的多菌灵单克隆抗体以及固定浓度的阿特拉津单克隆抗体混合，分别得到第一待测混合样品、第二待测混合样品以及第三待测混合样品；
将所述第一待测混合样品、第二待测混合样品以及第三待测混合样品分别通过所述SPR芯片上的三个流道，测得对应的第一RU值、第二RU值、以及第三RU值；
根据所述第一RU值以及所述毒死蜱浓度-RU标准曲线获得待测样品中的毒死蜱浓度，根据所述第二RU值以及所述多菌灵浓度-RU标准曲线获得待测样品中的多菌灵浓度，根据所述第三RU值以及所述阿特拉津浓度-RU标准曲线获得待测样品中的阿特拉津浓度；
其中，所述SPR芯片的制备包括步骤：
将镀金芯片放入表面皿中，纯水淋洗3次；然后缓慢加入98％H2SO4:30％H2O2混合液，80℃条件下孵育5分钟，所述98％H2SO4:30％H2O2混合液的体积比为7:3；
然后将镀金芯片浸入16-巯基-1-十一烷酸溶液中，孵育预定时间后，使16-巯基-1-十一烷酸结合在镀金芯片上，得到修饰后镀金芯片；
将EDC与NHS的混合液流经所述修饰后镀金芯片表面，得到活化后镀金芯片；
将蛋白捕获抗原溶液流经所述活化后镀金芯片表面各自的流道区域，使所述蛋白捕获抗原偶联在所述活化后镀金芯片的流道上，制得所述SPR芯片。
2.根据权利要求1所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，将镀金芯片浸入16-巯基-1-十一烷酸溶液中，孵育预定时间后，使16-巯基-1-十一烷酸结合在镀金芯片上，得到修饰后镀金芯片的步骤包括：
将16-巯基-1-十一烷酸分散在无水乙醇中，得到16-巯基-1-十一烷酸溶液；
将镀金芯片浸入在所述16-巯基-1-十一烷酸溶液中，放入恒温摇床中，调节温度为30-40℃，转速为80-120rpm，孵育7-9小时，使16-巯基-1-十一烷酸结合在镀金芯片上；
孵育结束后，用无水乙醇和纯化水对所述镀金芯片进行清洗，氮气吹干后，制得所述修饰后镀金芯片。
3.根据权利要求1所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，将EDC与NHS的混合液流经所述修饰后镀金芯片表面，得到活化后镀金芯片的步骤包括：
将200mM的所述EDC与200mM的NHS按照1:1的体积混合，得到混合液；
将200μL的所述混合液以20μL·min-1的速度流经所述修饰后镀金芯片表面；
运行结束后再以100μL·min-1的速度通入纯水溶液进行冲洗至基线稳定，制得所述活化后镀金芯片。
4.根据权利要求1所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，将蛋白捕获抗原溶液流经所述活化后镀金芯片表面各自的流道区域，使所述蛋白捕获抗原偶联在所述活化后镀金芯片的流道上，之后还包括步骤：
采用缓冲液流经所述活化后镀金芯片的流道；
运行结束后再以100μL·min-1的速度通入纯水冲洗至基线稳定。
5.根据权利要求4所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，所述缓冲液为pH值为4.5的醋酸盐、pH为5.5的MES、pH为6.5的柠檬酸钠、pH值为7.5的PBS以及pH为8.5的硼酸盐中的一种。
6.根据权利要求1所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，不同浓度的毒死蜱标准样品包括5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的毒死蜱标准样品；不同浓度的多菌灵标准样品包括5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的多菌灵标准样品；不同浓度的阿特拉津标准样品包括5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的阿特拉津标准样品。
7.根据权利要求6所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，将所述不同浓度的毒死蜱混合样品通过所述SPR芯片，测得不同浓度的毒死蜱混合样品对应的RU值的步骤包括：
将5μg·mL-1的毒死蜱混合样品通过所述SPR芯片，通过SPR仪测得5μg·mL-1的毒死蜱混合样品对应的RU值；
采用再生液流经所述SPR芯片，对所述SPR芯片上的蛋白捕获抗原与毒死蜱单克隆抗体进行洗脱分离，得到再生SPR芯片；
将10μg·mL-1的毒死蜱混合样品通过所述再生SPR芯片，通过SPR仪测得10μg·mL-1的毒死蜱混合样品对应的RU值；
重复上述步骤，依次制得20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的毒死蜱混合样品对应的RU值。
8.根据权利要求7所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，所述再生液为0.05mol·L-1的HCL。
9.根据权利要求7所述的毒死蜱、多菌灵、阿特拉津三合一检测方法，其特征在于，所述再生液的洗脱时间为15min。
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