CN113820492A - 一种用于检测阿特拉津的检测制剂，其试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测阿特拉津的检测制剂，其试剂盒及检测方法。检测制剂包括胶体金试纸条和反应孔，所述胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，NC膜上设置有T线和C线；反应孔中冻干保存有阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；T线处包被有阿特拉津完全抗原，用于竞争结合阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金。本发明的检测制剂在15min内实现对阿特拉津的检测，具有线性范围宽、检测限低、灵敏度高的技术优势。

Description

一种用于检测阿特拉津的检测制剂，其试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测阿特拉津的检测制剂，其试剂盒及检测方法。
背景技术
阿特拉津(Atrazine，ATZ)又名莠去津，分子式为C8H14ClN5。是一种典型的三嗪类除草剂，阿特拉津是选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，主要用于玉米、高粱、甘蔗、果树、林地等旱田，可防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，对某些多年生杂草也有一定的抑制作用。尽管它是低毒除草剂，但其在土壤中具有中等持留性，半存留期最长可达57周。阿特拉津因其化学性质稳定、残留时间长而引起的污染越来越受到人们的关注。在地表水、地下水、土壤以及作物等均检测出阿特拉津阳性，在中国辽东半岛附近的沿海水域，ATZ被发现是主要杀虫剂之一。因为它有潜在的有害影响，包括扰乱激素水平，导致心脏、肺部和肾脏充血等，美国环境保护署(EPA)曾就阿特拉津的使用做出警告，同时在世卫组织公布个致癌物清单中，阿特拉津被列为3类致癌物。
检测阿特拉津的方法主要基于色谱法(高效液相色谱、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法)和免疫学方法。基于色谱学的方法具有灵敏度高等优点，但是所需仪器昂贵、需要专业人员，不能够满足现场的快速检测需要。免疫检测具有操作简便、分析时间段以及易于实地检测的特点被广泛应用。其中侧流免疫层析试纸免疫法在快速实地检测中具有操作简单、反应迅速、易于读取、成本低廉等优势。然而传统的采用肉眼分辨胶体金免疫层析分析方法多为半定量的检测，且不同操作人员和干扰因素容易对测试的结果带来较大的影响。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测阿特拉津的检测制剂。
本发明的第二发明目的在于提供一种用于检测阿特拉津试纸条。
本发明的第三发明目的在于提供一种用于检测阿特拉津的检测方法。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种用于检测阿特拉津的检测制剂，所述检测制剂包括胶体金试纸条和反应孔，所述胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，所述NC膜上设置有T线和C线；
所述反应孔中冻干保存有阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；包被量为5～10μg/mL的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金30～80μL，优选为7μg/mL的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金50μL；
所述T线处包被有阿特拉津完全抗原，用于竞争结合所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；所述T线由T线抗原划线液制备而成，T线抗原划线液中0.5～2.0mg/mL的阿特拉津完全抗原；优选为1.5mg/mL；
所述C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；所述C线由C线抗体划线液制备而成，C线抗体划线液中含有0.1～0.3mg/mL的羊抗小鼠抗体，优选为0.3mg/mL。
可选的，T线抗原划线液中含有质量百分比浓度为0.5～3％的PEG20000，优选为1％。
可选的，T线抗原划线液采用10～100mM的PB缓冲液配制而成，优选25～50mM的PB缓冲液；
更优选的，PB缓冲液的pH为6.2。
可选的，所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金的制备方法：
S1、制备胶体金溶液；
S2、取OD值为1的胶体金溶液1mL，调整pH至8.5，加入7μg阿特拉津单克隆抗体，混匀，封闭，离心，加入抗体稳定液1mL，复溶沉淀，离心，最后加入100μL的抗体稳定液重悬；得到所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；
所述抗体稳定液的组成为：含有质量百分比浓度为0.05％PEG6000、质量百分比浓度为10％蔗糖的0.02M PB缓冲液，pH为6.2。
可选的，在S1中，采用采用1mL 1％柠檬酸钠与1mL 1％氯金酸制备胶体金溶液；
优选为：在沸水浴的容器中加入1％柠檬酸钠1mL，在搅拌状态下迅速加入1mL 1％氯金酸，待溶液变成酒红色后，撤去热源，继续搅拌；温度降至50℃左右停止搅拌，取胶体金用容量瓶定容至100mL。
可选的，所述划线液的流量均为1μL/cm，优选的，划好的NC膜放入烘箱36～37℃条件下烘干4～8h。
本发明还涉及一种用于检测阿特拉津的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的检测制剂，所述试剂盒中还含有样本处理液、阿特拉津标准溶液和样品稀释液；
所述样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；
阿特拉津标准溶液中阿特拉津的浓度范围为0～200ng；
所述样品稀释液为PBS溶液，pH为6.2。
本发明还涉及一种阿特拉津的检测方法，采用上述的试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：
S1、对待测样本加入所述样本处理液，得混合物；优选的，每1g待测样本加入1mL所述样本处理液；
S2、将所述混合物离心，取100μL上清，用所述样品稀释液稀释，得到待测液；
S3、在反应孔加入待测液100μL，35～38℃条件下孵育5～8min，将孵育得到的液体滴加于所述胶体金试纸条的样品垫上，通过手持式读卡器测定显色值。
可选的，在步骤S3中，37℃条件下孵育6min后通过手持式读卡器测定显色值。
可选的，所述待测样本选自粮食作物制备的粉状物，所述粮食作物优选为玉米。
本发明至少具有以下有益的效果：
本发明的检测制剂在15min内实现对阿特拉津的检测，具有线性范围宽、检测限低、灵敏度高的技术优势。阿特拉津在粮食作物中的检出限为20ng/mL，读取器检出限为4.92ng/mL，线性范围为5.014～95.86ng/mL(IC20～IC80)；在玉米粉中进行加标回收实验，LFI的定量结果与ELISA和HPLC的结果一致，LFI的平均加标回收率为93.5％～141.1％，ELISA的加标回收率为91.9％～123.0％，HPLC的加标回收率为93.0％～111.5％。
附图说明
图1为T线抗原划线液的抗体浓度优化实验结果；
图2为T线抗原划线液的抗原浓度的优化实验结果；
图3为T线抗原划线液的PEG20000浓度的优化实验结果；
图4为T线抗原划线液的离子强度的优化实验结果；
图5为T线抗原划线液的pH的优化实验结果；
图6为检测过程中孵育时间的优化实验结果；
图7为采用试纸条检测ATZ的检测结果；
图8为采用试纸条检测ATZ的标准曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例涉及一种用于检测阿特拉津的检测制剂，通过配合手持式读卡器可以定性测定样品中的阿特拉津，本发明实施例通过对检测制剂的条件进行深入的研究，从而大大降低了阿特拉津的最低检出限，从而获得一种线性范围宽、检测限低、灵敏度高的阿特拉津定量检测方法。胶体金检测制剂包括胶体金试纸条和反应孔，胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，NC膜上设置有T线和C线。
其中，反应孔中冻干保存有阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；包被量为5～10μg/mL的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金30～80μL，优选为7μg/mL的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金50μL。通过筛选实验发现，7μL抗体标记的胶体金，其不添加ATZ与添加50ppb的ATZ之间的差值最大，说明在此浓度的抗体标记具有较好的竞争以及显色效果，因此最优选该浓度用于阿特拉津单克隆抗体-胶体金标记物。
T线处包被有阿特拉津完全抗原，用于竞争结合阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；T线由T线抗原划线液制备而成，T线抗原划线液中0.5～2.0mg/mL的阿特拉津完全抗原；优选为1.5mg/mL。根据筛选试验发现，抗原划线浓度在0.5～2.0mg/mL的显色结果差异不大，在2min内即可有明显的显色效果。综合成本考虑，可采用1.5mg/mL的抗原浓度。如果阿特拉津完全抗原的浓度低于这个范围可能会因为结合的胶体金数量较少而使最大显色值降低，使得检测范围变窄；如果阿特拉津完全抗原的浓度高于这个浓度，可能会因为结合的胶体金数量过多而使得检测限升高。
C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；C线由C线抗体划线液制备而成，C线抗体划线液中含有0.1～0.3mg/mL的羊抗小鼠抗体，优选为0.3mg/mL。经实验发现，该浓度与包被量与T线配合，可提高试剂盒的灵敏度。如果羊抗小鼠抗体的浓度低于这个范围可能会因为无法完全结合的胶体金，而使显色值降低，影响对阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金性能的判定；如果羊抗小鼠抗体的浓度高于这个浓度，可能会导致材料浪费，增大制备成本。
在本发明实施例中，T线抗原划线液中含有质量百分比浓度为0.5～3％的PEG20000，优选为0.5～1％。经筛选实验发现，在PEG20000浓度为1％的时候，阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金中未添加ATZ与添加20ppb层析的试纸条中，其差值最大，因此最优选1％的PEG20000浓度用于抗原划线液
在本发明实施例中，T线抗原划线液采用10～100mM的PB缓冲液配制而成，优选25～50mM的PB缓冲液。经筛选实验发现，在离子强度为50mM的时候，阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金中未添加ATZ与添加20ppb层析的试纸条中，其差值最大，因此最优选50mM的PB缓冲液用于抗原划线液。
更优选的，PB缓冲液的pH为6.2。经筛选实验发现，在pH为6.2的时候，实验组与空白对照组的差值最大，因此后续实验采用pH为6.2的缓冲液用于抗原划线液。
在本发明实施例中，阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金的制备方法：
S1、制备胶体金溶液；采用1mL 1％柠檬酸钠与1mL 1％氯金酸制备胶体金溶液；经实验证实，该条件制备得到的胶体金溶液的稳定性良好。
S2、取OD值为1的胶体金溶液1mL，调整pH至8.5，加入7μg阿特拉津单克隆抗体，混匀，封闭，离心，加入抗体稳定液1mL，复溶沉淀，离心，最后加入100μL的抗体稳定液重悬；得到阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；采用该浓度阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金的稳定性最佳。
抗体稳定液的组成为：含有质量百分比浓度为0.05％PEG6000、质量百分比浓度为10％蔗糖的0.02M的PB缓冲液，pH为6.2。
进一步优选的，胶体金的制备方法为：在沸水浴的容器中加入1％柠檬酸钠1mL，在搅拌状态下迅速加入1mL 1％氯金酸，待溶液变成酒红色后，撤去热源，继续搅拌；温度降至50℃左右停止搅拌，取胶体金用容量瓶定容至100mL。
在本发明实施例中，划线液的流量均为1μL/cm，优选的，划好的NC膜放入烘箱36～37℃条件下烘干4～8h。
本发明实施例还涉及一种用于检测阿特拉津的试剂盒，试剂盒中含有上述的检测制剂，试剂盒中还含有样本处理液、阿特拉津标准溶液和样品稀释液；其中，样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；阿特拉津标准溶液中阿特拉津的浓度范围为0～200ng；样品稀释液为PBS溶液，pH为6.2。
本发明实施例还涉及一种阿特拉津的检测方法，采用上述试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：
S1、对5g待测样本加入5mL所述样本处理液，得混合物；优选的，每1g待测样本加入1mL样本处理液；
S2、将混合物离心，取100μL上清，用样品稀释液稀释，得到待测液；
S3、在反应孔加入待测液100μL，35～38℃条件下孵育5～8min，将孵育得到的液体滴加于所述胶体金试纸条的样品垫上，通过手持式读卡器测定显色值。
优选的，在步骤S3中，37℃条件下孵育6min后通过手持式读卡器测定显色值。
其中，在加标回收实验中，在步骤S1中加入阿特拉津标准溶液。具体的，每5g待测样品加入阿特拉津标准物质0、0.1μg、1μg、10μg。
优选的，待测样本选自粮食作物制备的粉状物，粮食作物优选为玉米。
实施例1：
步骤一 胶体金纳米颗粒的制备
将搅拌桨、玻璃器皿均放在酸缸中浸泡过夜，清洗干净；组装搅拌桨至搅拌器上，打开电热套预热5min；待烧瓶中水沸腾后，加入1mL 1％柠檬酸钠，打开搅拌器使其混匀；调整转速至500rpm，迅速加入1mL 1％氯金酸。待溶液变成酒红色后，撤去热源，继续搅拌；温度降至50℃左右停止搅拌，取胶体金用容量瓶定容至100mL，测定紫外吸收峰。
步骤二 阿特拉津单克隆抗体-胶体金标记物的制备及优化
取1mL OD520＝1的胶体金，加入0.1M碳酸钠20μL调整pH至8.5左右，加入7μL 1mg/mL的阿特拉津单抗，混匀30min，加入10％BSA 120μL，封闭15min，10000rpm离心15min，弃上清，加入抗体稳定液1mL，复溶沉淀，继续8000rpm离心15min，重复2次，最后100μL抗体稳定液重悬。
抗体稳定液的组成为：含有质量百分比浓度为0.05％PEG6000、10％蔗糖的0.02MPB缓冲液，pH为6.2。
实施例2试纸条的制备
配制T线抗原划线液：含有1.5mg/mL的阿特拉津完全抗原(阿特拉津-卵清蛋白偶联物)、质量百分比浓度为0.5％的PEG20000的100mM的PB缓冲液，pH值为6.2；
配制C线抗体划线液：含有0.3mg/mL羊抗小鼠抗体，用PBS溶液稀释。
将T线抗原划线液、C线抗体划线液分别划线包被到NC膜上，划线流量均为1μL/cm，T线与C线的距离5mm。将划好的NC膜放入烘箱37℃烘干4h，取出。
将实施例1制备的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金冻干保存在反应孔上，粘贴样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫。
具体粘贴方法：首先粘贴NC膜，再将结合垫粘贴在NC膜下端，与NC膜重叠2mm，随即粘贴样品垫在结合垫下端，同样与NC膜重叠2mm；取吸水垫粘贴到NC膜上方，与NC膜重叠2mm，将上述的材料压紧后裁成5mm宽的试纸条，装入检测卡槽内备用。
试纸条的使用方法为：
S1、对待测样本加入阿特拉津标准品，然后加入样本处理液，得混合物；样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；
S2、将混合物离心，取100μL上清，用样品稀释液稀释，得到待测液；样品稀释液为含有质量百分比含量为0.05％PEG6000、质量百分比含量为5％蔗糖的浓度为20mM的PB溶液，pH为6.2；
S3、在反应孔加入待测液100μL，35～38℃条件下孵育5～8min，将孵育得到的液体滴加于胶体金试纸条的样品垫上，通过手持式读卡器测定显色值。
实验例1阿特拉津单克隆抗体-胶体金标记物的制备及优化
取1mL胶体金，加入0.1M碳酸钠20μL调整pH至8.5左右，加入3、5、7、10μL浓度为1mg/mL的阿特拉津单抗，混匀30min，加入10％BSA 120μL，封闭15min，10000rpm离心15min，弃上清，加入抗体稳定液1mL，复溶沉淀，继续8000rpm离心15min，重复2次，最后100μL抗体稳定液重悬，得到阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金。
将制备的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金与50ppb的ATZ混合孵育，之后滴加到试纸条的样品垫中，同时设置空白组(仅含有阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金)作为对照。使阿特拉津单克隆抗体标记的胶体与T线上喷涂的阿特拉津完全抗原结合，采用手持式读卡器测定T线上的显色值，实验结果如图1所示。
由图1可知，在随着抗体浓度的增加，T线上固定的胶体金含量逐渐增高，红色增强，同时在添加竞争小分子50ppb的ATZ的试纸条中，固定在T线的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金浓度相对较低，说明出现了较为明显的竞争反应。由结果可以看出用7μL抗体标记的胶体金，其不添加ATZ与添加50ppb的ATZ之间的差值最大，说明在此浓度的抗体标记具有较好的竞争以及显色效果，因此后续采用此浓度用于阿特拉津单克隆抗体-胶体金标记物。
实验例2阿特拉津试纸抗原划线浓度优化
将阿特拉津-卵清蛋白偶联物包被到T线上构成检测线，将羊抗小鼠抗体包被在C线上构成质控线。按照实施例2的方法制备检测制剂A1～A4，区别在于：改变T线抗原划线液中阿特拉津完全抗原的浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL。
将20ppb的ATZ分别加入到检测制剂A1～A4的反应孔中混合孵育，同时设置空白对照。将孵育得到的液体滴加于样品垫上，采用手持式读卡器测定T线上的显色值，得到实验结果如图2所示。
如图2可知，抗原划线浓度在0.5～2.0mg/mL的显色结果差异不大，在2min内即可有明显的显色效果。综合成本考虑，可采用1.5mg/mL的抗原浓度进行后续实验。
实验例3 ATZ试纸抗原划线液中PEG20000浓度优化
为了提高抗原在NC膜上的偶联效率，可通过调整划线液中的PEG20000浓度来调节抗原的静电吸附性能。按照实施例2的方法制备检测制剂B1～B4，区别在于：改变T线抗原划线液调整抗原划线液中PEG20000的质量百分比浓度分别为0％、0.5％、1.0％、3％，通过检测T线上的中金标抗体的显色程度，确定最佳PEG20000浓度。
将与20ppb的ATZ分别加入到检测制剂B1～B4的反应孔中混合孵育，同时设置空白对照。将孵育得到的液体滴加于样品垫上，采用手持式读卡器测定T线上的显色值，实验结果如图3所示。
由图3可知，在PEG20000浓度为1％的时候，阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金中未添加ATZ与添加20ppb层析的试纸条中，其差值最大，因此后续实验采用1％的PEG20000浓度用于抗原划线液。
实验例4 ATZ试纸抗原划线液中离子强度优化
为了提高抗原在NC膜上的偶联效率，通过调整划线液中的离子强度来调节抗原的静电吸附性能。按照实施例2的方法制备检测制剂C1～C6，区别在于：分别采用10、25、50、75、100mM的PB缓冲液溶解完全抗原，通过检测T线上的中金标抗体的显色程度，确定最佳离子强度。
将与20ppb的ATZ分别加入到检测制剂C1～C6的反应孔中混合孵育，同时设置空白对照。将孵育得到的液体滴加于样品垫上，采用手持式读卡器测定T线上的显色值，实验结果如图4所示。
由图4可知，在离子强度为50mM的时候，阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金中未添加ATZ与添加20ppb层析的试纸条中，其差值最大，因此后续实验采用50mM的PB缓冲液用于抗原划线液。
实验例5 ATZ试纸抗原划线液中pH值优化
划线液pH值对于抗原的吸附能力的改变对于T线显色效果会产生一定的影响，为了提高显色效果，调整划线液的pH值。按照实施例2的方法制备检测制剂D1～D6，区别在于：划线液的pH分别为5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0。
将20ppb的ATZ分别加入到检测制剂D1～D6的反应孔中混合孵育，同时设置空白对照。将孵育得到的液体滴加于样品垫上，采用手持式读卡器测定T线上的显色值，实验结果如图5所示。
由图5可知，在pH为6.2的时候，实验组与空白对照组的差值最大，因此后续实验采用pH为6.2的缓冲液用于抗原划线液。
实验例6阿特拉津试纸条孵育时间的优化
为了获取最佳的显色效果，对金标抗体与提取液的孵育时间进行优化，按照实施例2的方法进行检测，区别在于在37℃条件下分别孵育1-10min，分别测定T线和C线的显色值。具体为，采用实施例2的试剂盒与含有20ppb的阿特拉津提取液混匀，37℃分别孵育1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min后添加到试纸条上，采用手持式读卡器测定T线以及C线上的显色值，实验结果如图6所示。
由图6可知，孵育时间在6min的时候，其T线与C线之间的差值最大，说明此时的显色结果最好，因此在后续的实验中选择孵育6min后，将样品及胶体金混合物添加到试纸条的样品垫上。
实验例7采用阿特拉津试纸条检测阿特拉津的标准曲线的建立
按照实施例2的检测制剂和检测条件进行检测，采用样品提取液梯度稀释阿特拉津为1～10ng/mL以及0～1020ng/mL与实施例2试剂盒孵育后6min后，添加到样品垫中，分别采用手持式度读卡器和肉眼观察的方法进行阿特拉津浓度的测定，并得到了标定曲线。
如图7和图8所示，肉眼检出限为20ng/mL，读取器检出限为4.92ng/mL，线性范围为5.014～95.86ng/mL(IC20～IC80)。采用手持式读取器检测限相对于肉眼检测提高了近4倍。
实验例8加标回收实验
分别称取5g玉米粉，分别添加阿特拉津0、0.1、1、10μg，之后加入5mL加入80％的甲醇/水溶液涡旋震荡3min，3500rpm离心10min。吸取上清分别用PBS稀释6倍和8倍分别用于层析试纸条检测和ELISA检测。
ELISA测定按照ELISA试剂盒(上海安谱实验科技股份有限公司)的操作说明进行，通过酶标仪测定OD450值绘制标准曲线，按照标准曲线计算加标的阿特拉津浓度。
按照国家环境保护标准HJ 587-2010《水质阿特拉津的测定高效液相法》对提取的阿特拉津的加标回收情况进行测定；测定结果见表1。
如表1所示，LFI的定量结果与ELISA和HPLC的结果一致，LFI的平均加标回收率为93.5％～141.1％，ELISA的加标回收率为91.9％～123.0％，HPLC的加标回收率为93.0％～111.5％。
表1采用LFI ELISA和HPLC法对玉米样品进行ATZ分析
Figure BDA0003287238410000141
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种用于检测阿特拉津的检测制剂，所述检测制剂包括胶体金试纸条和反应孔，所述胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，所述NC膜上设置有T线和C线；其特征在于：
所述反应孔中冻干保存有阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；包被量为5～10μg/mL的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金30～80μL，优选为7μg/mL的阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金50μL；
所述T线处包被有阿特拉津完全抗原，用于竞争结合所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；所述T线由T线抗原划线液制备而成，T线抗原划线液中0.5～2.0mg/mL的阿特拉津完全抗原；优选为1.5mg/mL；
所述C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；所述C线由C线抗体划线液制备而成，C线抗体划线液中含有0.1～0.3mg/mL的羊抗小鼠抗体，优选为0.3mg/mL。
2.根据权利要求1所述的检测制剂，其特征在于：T线抗原划线液中含有质量百分比浓度为0.5～3％的PEG20000，优选为1％。
3.根据权利要求1所述的检测制剂，其特征在于：T线抗原划线液采用10～100mM的PB缓冲液配制而成，优选25～50mM的PB缓冲液；
更优选的，PB缓冲液的pH为6.2。
4.根据权利要求1所述的检测制剂，其特征在于：所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金的制备方法：
S1、制备胶体金溶液；
S2、取OD值为1的胶体金溶液1mL，调整pH至8.5，加入7μg阿特拉津单克隆抗体，混匀，封闭，离心，加入抗体稳定液1mL，复溶沉淀，离心，最后加入100μL的抗体稳定液重悬；得到所述阿特拉津单克隆抗体标记的胶体金；
所述抗体稳定液的组成为：含有质量百分比浓度为0.05％PEG6000、质量百分比浓度为10％蔗糖的0.02M PB缓冲液，pH为6.2。
5.根据权利要求1所述的检测制剂，其特征在于：在S1中，采用采用1mL 1％柠檬酸钠与1mL 1％氯金酸制备胶体金溶液；
优选为：在沸水浴的容器中加入1％柠檬酸钠1mL，在搅拌状态下迅速加入1mL 1％氯金酸，待溶液变成酒红色后，撤去热源，继续搅拌；温度降至50℃左右停止搅拌，取胶体金用容量瓶定容至100mL。
6.根据权利要求5所述的检测制剂，其特征在于：所述划线液的流量均为1μL/cm，
优选的，划好的NC膜放入烘箱36～37℃条件下烘干4～8h。
7.一种用于检测阿特拉津的试剂盒，所述试剂盒中含有如权利要求1～6任一项所述的检测制剂，其特征在于，所述试剂盒中还含有样本处理液、阿特拉津标准溶液和样品稀释液；
所述样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；
阿特拉津标准溶液中阿特拉津的浓度范围为0～200ng；
所述样品稀释液为PBS溶液，pH为6.2。
8.一种阿特拉津的检测方法，其特征在于，采用权利要求7所述的试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：
S1、对待测样本加入所述样本处理液，得混合物；优选的，每1g待测样本加入1mL所述样本处理液；
S2、将所述混合物离心，取100μL上清，用所述样品稀释液稀释，得到待测液；
S3、在反应孔加入待测液100μL，35～38℃条件下孵育5～8min，将孵育得到的液体滴加于所述胶体金试纸条的样品垫上，通过手持式读卡器测定显色值。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，37℃条件下孵育6min后通过手持式读卡器测定显色值。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，
所述待测样本选自粮食作物制备的粉状物，所述粮食作物优选为玉米。
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