CN102089001B - 免疫诱导剂及癌的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有多肽或重组载体作为有效成分的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂用于癌的治疗及/或预防，所述多肽为选自以下(a)～(c)的多肽类、且具有免疫诱导活性的至少一个多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸，且能够在生物体内表达该多肽，(a)多肽，由序列表的序列号3～95中奇数序列号表示的氨基酸序列中连续7个以上的氨基酸组成；(b)多肽，与上述(a)的多肽具有90％以上的序列同源性、且由7个以上的氨基酸组成；及(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列。另外，由于上述多肽与特异性存在于癌症患者的血清中的抗体反应，所以如果测定试样中的该抗体，则可以检测生物体内的癌。

Description

免疫诱导剂及癌的检测方法
技术领域
本发明涉及一种作为癌的治疗及/或预防剂等有用的新型免疫诱导剂。另外，本发明涉及一种新型的癌的检测方法。 
背景技术
癌症是占据所有死亡原因第一位的疾病，目前进行的治疗以手术疗法为主，组合使用放射疗法和化学疗法。近年来，尽管开发了新的手术方法并发现了新的抗癌剂，但现状是除了部分癌症之外，癌的治疗效果仍未见提高。近年来，由于分子生物学和癌免疫学的进步，逐渐能够鉴定出被与癌反应的细胞毒性T细胞所识别的癌抗原类、及编码癌抗原的基因类等，对抗原特异性免疫疗法的期待日渐高涨(非专利文献1)。 
在免疫疗法中，为了减轻副作用，作为其抗原被识别的肽、多肽或蛋白必须在正常细胞中几乎不存在，而特异性地存在于癌细胞中。1991年，比利时Ludwig研究所的Boon等人通过使用自身癌细胞株与癌反应性T细胞的cDNA表达克隆法，分离出CD8阳性T细胞识别的人黑色素瘤抗原MAGE1(非专利文献2)。之后，报导了采用基因表达克隆的方法鉴别在癌症患者体内与自身的癌反应产生的抗体所识别的肿瘤抗原，即SEREX法(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)(非专利文献3；专利文献1)，通过该方法，分离出一些癌抗原(非专利文献4～9)。进而，正在开始进行以其一部分作为靶的癌症免疫疗法的临床试验。 
另一方面，已知犬和猫与人相同，有乳腺癌、白血病、淋巴瘤等多种肿瘤，并在犬和猫的疾病统计中排名较高。然而，目前针对 犬和猫尚无有效的治疗药物及预防药物。大部分犬和猫的肿瘤，几乎都是在肿瘤进行性扩大后，方为饲主察觉，入院之后，即使通过外科手术切除并给与人类药物(抗癌剂等)，多数情况下为时已晚，在处理后不久即死亡。在上述现状下，如有可能获得对犬和猫有效的癌症治疗药物及预防药物，则可以期望开拓其针对犬的癌症的用途。 
另外，如果能在早期发现癌症，则治疗效果较好，因此寻求一种对癌症患者没有体力、经济负担的可以使用血清或尿等简便地进行检查的癌症的检测方法。作为使用血液或尿的癌检测法，最近开始普及测定肿瘤标记物等肿瘤产物的方法。所谓肿瘤产物，是指与肿瘤相关的抗原、酶、特定的蛋白质、代谢产物、肿瘤基因、肿瘤基因产物及肿瘤抑制基因等，在一部分癌症中，癌胚抗原CEA、糖蛋白CA19-9、CA125、前列腺特异抗原PSA、由甲状腺产生的肽类激素即降钙素等作为肿瘤标记物有效运用于癌症检测中(非专利文献10)。但是，在大多癌症种类中，不存在对癌症检测有用的肿瘤标记物。另外，目前已知的大部分肿瘤标记物在体液中仅存在极微量(pg/mL级程度)，因此，为了检测上述肿瘤标记物，需要高灵敏度的测定法及特殊的技术。在上述现状中，如果能提供可以用简便的操作高灵敏度地检测出各种癌症的新型癌症检测方法，可以期待开发其针对各种癌症的诊断用途。 
已知CD179b是免疫球蛋白的替代轻链的一部分，且在B细胞的前体细胞(前B细胞及原B细胞)的膜表面表达。伴随B细胞的分化而消失，在成熟的B细胞中不表达。然而，已知CD179b在前B细胞癌化的白血病(前B细胞性白血病)细胞中表达(非专利文献10、11)。另外，已知CD179b在前B细胞癌变的淋巴瘤(前B细胞性淋巴瘤)细胞中也表达，且可以作为前B细胞性淋巴瘤的诊断标记物使用(非专利文献12)。然而，没有报道其在前B细胞性白血病细胞以外的白血病细胞、前B细胞性淋巴瘤以外的淋巴瘤及乳癌细胞等中特异性地表达。另外，没有报道暗示增强针对CD179b的 免疫对癌的治疗及/或预防有用。 
专利文献1：美国专利第5698396号 
非专利文献1：秋吉毅，“癌与化学疗法”，1997年，第24卷，p551-519 
非专利文献2：Bruggen P.et al.，Science，254：1643-1647(1991) 
非专利文献3：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11810-11813(1995) 
非专利文献4：Int.J.Cancer，72：965-971(1997) 
非专利文献5：Cancer Res.，58：1034-1041(1998) 
非专利文献6：Int.J.Cancer，29：652-658(1998) 
非专利文献7：Int.J.Oncol.，14：703-708(1999) 
非专利文献8：Cancer Res.，56：4766-4772(1996) 
非专利文献9：Hum.Mol.Genet 6：33-39(1997) 
非专利文献10：Adv.Immunol.，63：1-41(1996) 
非专利文献11：Blood，92：4317-4324(1998) 
非专利文献12：Modern Pathology，17：423-429(2004) 
发明内容
本发明的目的在于发现一种作为癌的治疗及/或预防剂等有用的新型多肽，并提供该多肽作为免疫诱导剂的应用。进而，本发明的目的在于提供一种对癌的诊断有用的癌的检测方法。 
本发明人等经过深入研究，结果通过使用来自犬乳癌组织的cDNA文库及同一罹癌犬血清的SEREX法，获得cDNA，所述cDNA编码与来自罹癌生物体的血清中存在的抗体相结合的蛋白质，并以此cDNA为基础，制作具有序列表的序列号5～93中奇数序列号(即，序列号5、7、9、11、13、15、...91或93)表示的氨基酸序列的犬CD179b多肽。另外，以获得基因的人同源性基因为基础，制作具有序列号3表示的氨基酸序列的人CD179b多肽，同样地以牛同源性基因为基础，制作具有序列号95表示的氨基酸序列的牛CD179b多肽。发现上述CD179b多肽在乳癌、白血病及淋巴瘤细胞中特异性 表达。进而，发现通过向生物体给与上述CD179b，可以在生物体内诱导针对CD179b的免疫细胞，及可以使表达CD179b的生物体内的肿瘤萎缩。进而，发现重组载体在生物体内诱导对于表达CD179b的癌的抗肿瘤效果，所述重组载体含有能够表达编码CD179b多肽或其片段的多核苷酸。 
进而，发现CD179b蛋白中的部分多肽被抗原呈递细胞呈递，具有活化及增殖对该肽特异性的细胞毒性T细胞的能力(免疫诱导活性)，因此，该肽对癌的治疗及/或预防有用，另外，与该肽接触的抗原呈递细胞、和与该抗原呈递细胞接触的T细胞对癌的治疗及/或预防有用。进而，发现以上述CD179b蛋白的氨基酸序列为基础制作的重组多肽，只特异性地与罹癌生物体中的血清反应，因此可以检测出癌。根据以上结果，完成了本发明。 
因此，本发明具有以下特征。 
(1)一种免疫诱导剂，所述免疫诱导剂含有多肽或重组载体作为有效成分，所述多肽为选自以下(a)～(c)的多肽类、且具有免疫诱导活性的至少一个多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸、且能够在生物体内表达该多肽。 
(a)多肽，由序列表的序列号3～95中奇数序列号表示的氨基酸序列中连续7个以上的氨基酸组成， 
(b)多肽，与上述(a)的多肽具有90％以上的序列同源性、且由7个以上的氨基酸组成， 
(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列。 
(2)如上述(1)的免疫诱导剂，其中，上述(b)的多肽为与上述(a)的多肽具有95％以上的序列同源性的多肽。 
(3)如上述(1)的免疫诱导剂，其中，上述具有免疫诱导活性的多肽为由序列表的序列号3～95中奇数序列号表示的氨基酸序列中连续7个以上的氨基酸组成的多肽、或包含该多肽作为部分序列的多肽。 
(4)如上述(3)的免疫诱导剂，其中，上述具有免疫诱导活 性的多肽为具有序列表的序列号3～95中奇数序列号表示的氨基酸序列的多肽。 
(5)如上述(3)的免疫诱导剂，其中，上述具有免疫诱导活性的多肽为由序列表的序列号3～95中奇数序列号表示的氨基酸序列中的aa1-34或aa52-75的区域内连续7个以上氨基酸序列组成的多肽、或包含该多肽作为部分序列的多肽。 
(6)如上述(5)的免疫诱导剂，其中，上述具有免疫诱导活性的多肽为由序列表的序列号108、序列号109、序列号110、序列号111、序列号112、序列号113、序列号114、序列号115、序列号116或序列号117组成的多肽，或包含序列表的序列号108、序列号109、序列号110、序列号111、序列号112、序列号113、序列号114、序列号115、序列号116或序列号117表示的氨基酸序列作为部分序列，且氨基酸残基数为8～12的多肽。 
(7)如上述(1)～(6)中任一项的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂含有1个或多个上述多肽作为有效成分。 
(8)如上述(7)的免疫诱导剂，其中，上述多肽为抗原呈递细胞的处理剂。 
(9)如上述(1)～(8)中任一项的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂用于动物的癌的治疗及/或预防。 
(10)如上述(9)的免疫诱导剂，其中，上述癌为表达CD179b基因的癌。 
(11)如上述(10)的免疫诱导剂，其中，上述癌为乳癌、白血病或淋巴瘤。 
(12)如上述(1)～(11)中任一项的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂还含有免疫增强剂。 
(13)一种分离抗原呈递细胞，所述分离抗原呈递细胞含有上述具有免疫诱导活性的多肽和HLA分子的复合物。 
(14)一种分离T细胞，所述分离T细胞与上述具有免疫诱导活性的多肽和HLA分子的复合物选择性结合。 
(15)一种免疫诱导方法，包括给与个体多肽或重组载体，所述多肽为选自下述(a)～(c)的多肽类、且具有免疫诱导活性的至少1个多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸、且能够在生物体内表达该多肽。 
(a)多肽，由序列表的序列号3～95中奇数序列号表示的氨基酸序列中连续7个以上氨基酸组成。 
(b)多肽，与上述(a)的多肽具有90％以上的序列同源性、且由7个以上的氨基酸组成。 
(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列。 
(16)一种癌的检测方法，为针对从生物体分离的试样进行的方法，包括测定以下(a)～(c)中至少任一多肽的表达。 
(a)多肽，由序列表的序列号3～95中奇数序列号表示的氨基酸序列中连续7个以上的氨基酸组成， 
(b)多肽，与上述(a)的多肽具有90％以上的序列同源性、且由7个以上氨基酸组成， 
(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列。 
(17)如上述(16)所述的方法，其中，上述多肽的表达的测定通过免疫测定下述抗体来进行，所述抗体可能被包含在上述试样中、是针对应测定的上述多肽在上述生物体内被诱导的抗体。 
(18)一种癌的检测方法，为针对从生物体分离的试样进行的方法，包括分析具有编码区的CD179b基因的表达，将其与来自健康人的试样中该基因的表达量进行比较，所述编码区具有来自癌患者的试样中序列表的序列号1或序列号4～94中偶数序列号表示的碱基序列。 
(19)一种癌检测用试剂，含有与针对以下(a)～(c)中任一多肽在生物体内被诱导的抗体发生抗原抗体反应的多肽。 
(a)多肽，由序列表的序列号3～95中奇数序列号表示的氨基酸序列中连续7个以上氨基酸组成， 
(b)多肽，与上述(a)的多肽具有90％以上的序列同源性、 且由7个以上氨基酸组成， 
(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列。 
通过本发明，提供了一种作为癌的治疗及/或预防等有用的新型免疫诱导剂。如下述实施例中具体说明所示，向罹癌犬给与本发明中使用的多肽时，可以在该罹癌动物体内诱导免疫细胞，进而能够使已经生成的癌缩小或萎缩。 
另外，根据本发明，提供了一种新型的癌的检测方法。根据本发明的方法测定试样中的上述多肽的表达时，也可以检测出肉眼看不见的较小尺寸的癌和体内深处的癌，因此对健康诊断等中的癌的早期发现也有用。另外，如在癌治疗后的患者的跟进观察中利用本发明的方法，则也可以在早期检测出复发的癌。进而，根据本发明的方法，也可以诊断癌的进展程度，包括肿瘤的增大、向周边组织的侵入、癌向淋巴结及远处器官的转移。 
附图说明
[图1]为表示编码CD 179b蛋白的基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱的图。标号1：编码CD179b蛋白的基因的表达谱；标号2：表示GAPDH基因的表达谱。需要说明的是，图1中，纵轴的标号1表示上述鉴定的基因表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达谱。 
[图2]图2中，横轴的标号3、4、5、6、7、8、9、10，分别表示由于来自T2细胞的刺激而引起的HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞产生IFN-γ的能力，所述T2细胞用序列号108、109、110、113、114、115、116、117的肽进行脉冲。标号11表示关于序列号118阴性对照的肽(作为本发明的范围外的序列的肽)的结果。 
[图3]图3中，横轴的标号12、13、14、15、16、17、18、19，分别表示HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞对Namalwa细胞的细胞毒性，所述T细胞使用序列号108、109、110、113、114、115、116、117刺激。标号20表示使用阴性对照的肽(序列号118) 诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒性。 
[图4]图4中，横轴的标号21、22、23、24、25，分别表示由于来自JTK-LCL细胞的刺激而引起HLA-A24阳性CD8阳性T细胞产生IFN-γ的能力，所述JTK-LCL细胞用序列号110、111、112、115、116的肽进行脉冲。标号26表示关于序列号118的阴性对照的肽的结果。 
[图5]图5中，横轴的标号27、28、29、30、31，分别表示HLA-A24阳性的CD8阳性T细胞对JTK-LCL细胞的细胞毒性，所述T细胞使用序列号110、111、112、115、116的肽刺激。标号32表示使用阴性对照的肽(序列号118)诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒性。 
具体实施方式
<多肽> 
作为本发明免疫诱导剂中作为有效成分所含的多肽，可以举出选自以下(a)、(b)及(c)的多肽类中的1个或多个多肽。 
(a)由具有序列表的序列号3～95中奇数序列号(即，序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95)表示的氨基酸序列的多肽中的连续7个以上氨基酸组成的、具有免疫诱导活性的多肽， 
(b)与上述(a)的多肽具有90％以上的序列同源性、且由7个以上氨基酸组成的、具有免疫诱导活性的多肽， 
(c)含有上述(a)或(b)的多肽作为部分序列、具有免疫诱导活性的多肽。 
本发明中使用的所谓“多肽”，是指多个氨基酸通过肽键形成的分子，不仅包括构成的氨基酸数量多的多肽分子，也包括氨基酸数量少的低分子量的分子(寡肽)和全长分子，在本发明中，还包括由序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的全长组成的蛋白质。 
在本说明书中使用的所谓“具有氨基酸序列”，是指氨基酸残基按照特定的顺序排列。因此，例如所谓“具有序列号3表示的氨基酸 序列的多肽”，是指具有序列号3表示的Leu Leu Arg Pro...(省略)...Ala Glu Cys Ser的氨基酸序列，大小为176个氨基酸残基的多肽。另外，例如有时将“具有序列号3表示的氨基酸序列的多肽”简称为“序列号3的多肽”。“具有碱基序列”之类的表达也相同。 
本说明书中使用的所谓“免疫诱导活性”，是指在生物内对分泌干扰素等细胞因子的免疫细胞加以诱导的能力。 
上述多肽是否具有免疫诱导活性可以通过例如公知的ELISPOT法等确认。具体而言，例如如下述实施例所述，从给与应评价免疫诱导活性的多肽的生物体中，获得末梢血单核细胞等细胞，将该细胞与该多肽共同培养，通过使用特异性抗体测定来自该细胞的IFN-γ、白细胞介素(IL)等细胞因子及/或趋化因子的生成量，可以测定该细胞中免疫细胞的数量，从而可以评价免疫诱导活性。 
或者，如下述实施例所示，向罹癌动物给与基于序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的氨基酸序列制成的重组多肽时，也可以通过其免疫诱导活性使肿瘤缩小或萎缩。因此，上述免疫诱导活性，也可以作为抑制表达序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的多肽的癌细胞的增殖或使癌组织(肿瘤)缩小或消失的能力(以下称作“抗肿瘤活性”)进行评价。多肽的抗肿瘤活性，例如如下述实施例中具体所述，实际上可以在向罹癌动物给与该多肽后，通过分析是否使肿瘤缩小或萎缩来进行确认。 
或者，通过分析由上述多肽所刺激的T细胞(即，与呈递该多肽的抗原呈递细胞相接触的T细胞)是否在生物体外显示出对肿瘤细胞的细胞毒性，也可评价多肽的抗肿瘤活性。T细胞与抗原呈递细胞的接触，如下所述，可以通过在液体培养基中将两者共同培养来进行。细胞毒性的测定，可以通过例如Int.J.Cancer，58：p317，1994中记载的被称作51Cr释放法的公知方法来进行。 
将上述多肽用于癌的治疗及/或预防用途时，没有特别限定，但优选以抗肿瘤活性作为指标对免疫诱导活性进行评价。 
本发明公开的序列表中序列号3、5、7、9、11、13、15、...93 或95分别表示的氨基酸序列，是通过使用来自犬乳腺癌的cDNA文库与同一患病犬的血清的SEREX法，以与特异性存在于来自罹癌犬血清中的抗体相结合的多肽、及该多肽的人同源因子(同源物)的形式被分离出的、CD179b的氨基酸序列(参照下述实施例1)。上述(a)的多肽是由具有序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的氨基酸序列的多肽中连续7个以上、优选连续8、9或10个以上的氨基酸组成，且具有免疫诱导活性多肽。需要说明的是，如该领域中公知的，如果是约7个氨基酸残基以上的多肽，则可以发挥抗原性及免疫原性。因此，只要为序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的氨基酸序列中连续7个氨基酸残基以上的多肽，即能够具有免疫诱导活性，因此可以用于本发明的免疫诱导剂的制备。 
作为通过给与癌抗原多肽进行免疫诱导的原理，已知为：多肽被抗原呈递细胞吞噬，其后在该细胞内被肽酶分解为更小的片段，呈递于该细胞的表面上，细胞毒性T细胞等将其识别，选择性地杀灭呈递该抗原的细胞。呈递到抗原呈递细胞表面上的多肽的尺寸较小，氨基酸数为7～30个左右。因此，从使其呈递到抗原呈递细胞表面上的观点来看，作为上述(a)的多肽，优选方案之一为序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的氨基酸序列中连续的7～30个左右，较优选由8～30个或9～30个左右的氨基酸组成的多肽。这些较小尺寸的多肽有时也直接呈递于抗原呈递细胞表面，不被抗原呈递细胞所吞噬。 
另外，被抗原呈递细胞所吞噬的多肽在随机位置被该细胞内的肽酶切断，产生各种多肽片段，上述多肽片段呈递于抗原呈递细胞表面上，因此，若给与如序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的全长序列所示的大尺寸的多肽，则通过抗原呈递细胞内的分解，必然会产生对抗原呈递细胞介导的免疫诱导有效的多肽片段。因此，即使对于抗原呈递细胞介导的免疫诱导，也可以使用尺寸大的多肽，氨基酸数为30以上，更优选为100以上，进一步优选为200以上，也可以进一步优选序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的 全长序列的多肽。 
进而，本发明的多肽，通过可以检索表位肽的检查方法，例如Biolnfomatics & Moleccular Analysis Selection(BIMAS)的HLA Peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)进行检查，可以筛选能成为表位肽的肽，所述表位肽具有HLA的各种类型的结合基序、由8～12个、优选9～10个氨基酸组成。具体而言，优选由序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的氨基酸序列中的aa1-34或aa52-75区域内的连续7个以上的氨基酸组成的多肽，进而在序列号3的多肽中，较优选序列号108～117表示的多肽。 
上述(b)的多肽，是上述(a)的多肽中少数氨基酸残基被取代及/或缺失及/或添加及/或插入得到的多肽，是具有与原序列的序列同源性为80％以上、优选为90％以上、较优选为95％以上、更优选为98％以上、99％以上、或99.5％以上、且具有免疫诱导活性的多肽。一般情况下，即使在蛋白质抗原中将该蛋白质的氨基酸序列中的少数氨基酸残基进行取代、缺失、添加或插入的情况下，有时也具有与原蛋白质几乎相同的抗原性或免疫原性，这一点是本领域技术人员所公知的。因此，上述(b)的多肽也可发挥免疫诱导活性，故可用于制备本发明的免疫诱导剂。另外，上述(b)的多肽，也优选为将序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的氨基酸序列中的1个～数个氨基酸残基进行取代、缺失、添加及/或插入得到的多肽。 
本说明书中，所谓与氨基酸序列或碱基序列相关的“序列同源性”，是将需要比较的2个氨基酸序列(或碱基序列)的氨基酸残基(或碱基)尽可能相一致地整齐排列，以一致的氨基酸残基数(或一致的碱基数)两氨基酸序列(或碱基序列)除以全部氨基酸残基数(或全碱基数)后所得的以百分比(％)表示的数值。在进行上述整齐排列时，根据需要，在加以比较的两个序列的一者或两者中插入适当的间隔。上述序列的整齐排列，可以使用例如BLAST、 FASTA、CLUSTAL W等公知的程序进行(Karlin及Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：2264-2268，1993；Altschul等.，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402，1997)。当有间隔插入时，上述全部氨基酸残基数(或总碱基数)，为以1个间隔作为1个氨基酸残基(或碱基)计算得到的残基数(或碱基数)。用这样的方法计算出的全部氨基酸残基数(或总碱基数)在加以比较的2个序列间不同时，同源性(％)是将一致的氨基酸残基数(或碱基数)除以较长序列的全部氨基酸残基数(或总碱基数)算出的。 
在氨基酸残基的取代中，优选的取代为保守的氨基酸取代。已知构成天然蛋白质的20种氨基酸可以根据具有类似的性质分为以下几组：具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly、Ile、Val、Leu、Ala、Met、Pro)，具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr、Cys)，酸性氨基酸(Asp、Glu)，碱基性氨基酸(Arg、Lys、His)，芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp，His)，在它们间发生取代，即保守的取代，多数情况下不会导致性质的变化。因此，取代本发明的上述(a)的多肽中的氨基酸残基时，通过在上述各组间进行取代，能够维持免疫诱导活性的可能性提高。 
上述(c)的多肽是含有上述(a)或(b)的多肽作为部分序列，且具有免疫诱导活性的多肽。即，为在上述(a)或(b)的多肽的一端或两端添加其他氨基酸或多肽、且具有免疫诱导活性的多肽。上述多肽也可以用于本发明的免疫诱导剂的制备。 
上述多肽可以按照例如Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法合成。另外，也可以利用各种市售的肽合成仪器通过常规方法合成。另外，还可以使用公知的基因工程学方法，制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸参入到表达载体上，导入宿主细胞，在该宿主细胞中使多肽生成，由此获得目标多肽。 
编码上述多肽的多核苷酸可以通过公知的基因工程学方法或使用市售的核酸合成仪的常规方法简单地制备。例如，具有序列号4的碱基序列的DNA可以如下制备：使用犬染色体DNA或cDNA文 库为模板，将一对引物设计成能够扩增序列号4所示的碱基序列，使用上述引物进行PCR法，由此制备。若为具有序列号1的碱基序列的DNA，则可以通过使用人染色体DNA或cDNA文库作为上述模板同样地制备。PCR的反应条件可以适当地设定，例如可以举出如下的条件等：将由94℃下30秒(变性)、55℃下30秒～1分钟(退火退火)、72℃下2分钟(延伸)构成的反应过程作为1个循环，例如进行30个循环后，在72℃下使其反应7分钟，但反应条件并不限定于此。关于PCR的方法、条件等例如记载在Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons(特别是第15章)中。另外，基于本说明书的序列表中序列号1～95表示的碱基序列及氨基酸序列的信息，制备适当的探针或引物，并用其筛选人、犬或牛等的cDNA文库，由此能够分离出所期望的DNA。cDNA文库，优选由表达序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的蛋白质的细胞、器官或组织制成。上述探针或引物的制备、cDNA文库的构筑、cDNA文库的筛选、以及靶基因的克隆等操作是本领域技术人员所公知的，例如可以按照Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)，Ausubel等(上述)等记载的方法进行。由上述方法获得的DNA可以获得编码上述(a)的多肽的DNA。另外，由于已知编码各氨基酸的密码子，所以可以容易地特定编码特定的氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列。因此，也能够容易地特定编码上述(b)的多肽和(c)的多肽的多核苷酸的碱基序列，故上述多核苷酸也可以使用市售的核酸合成仪按照常规方法容易地合成。 
作为上述宿主细胞，只要是能够表达上述多肽的细胞即可，作为原核细胞的例子可以举出大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以猴肾脏细胞COS1、中国仓鼠卵巢细胞CHO、人胚肾细胞HEK293、小鼠胚胎皮肤细胞株NIH3T3等哺乳动物培养细胞，芽殖酵母，裂殖酵母，蚕细胞、非洲爪蟾卵细胞等，但并不限定于这些。 
使用原核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体使用具有可以在原核细胞中复制起点、启动子、核糖体结合部位、多克隆部位、终止子、抗药基因、营养补充基因等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以举出pUC系列、pBluescriptII、pET表达系统、pGEX表达系统等。将编码上述多肽的DNA参入到上述表达载体中，使用该载体转化原核宿主细胞后，培养所得的转化体时，可以在原核宿主细胞中表达上述DNA编码的多肽。在此情况下，也可使该多肽以与其他蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等)的融合蛋白质的形式进行表达。 
使用真核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体使用具有启动子、剪接区域、poly-A附加部位等的真核细胞用表达载体。作为上述表达载体，可以举出pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等。与上述同样地，将编码上述多肽的DNA参入到上述表达载体中，用该载体转化真核宿主细胞后，培养所得的转化体时，可以使上述DNA编码的多肽在真核宿主细胞中表达。当使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等作为表达载体时，能够以附加有His标签(例如(His)6～(His)10)、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白质的形式，表达上述多肽。 
将表达载体导入宿主细胞，可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射法等众所周知的方法。 
为了从宿主细胞中分离纯化目标多肽，可以组合使用公知的分离操作。例如可以举出使用尿素等改性剂或表面活性剂进行的处理、超声波处理、酶消化、盐析或溶剂分步沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电聚焦电泳、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和色谱法、反相色谱法等，但并不限定于此。 
使用以上方法所得的多肽中，如上所述也可以以与其他任意蛋白质的融含蛋白质的形式存在。例如可以举出与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或His标签的融合蛋白质等。上述以融合蛋白质的形式存 在的多肽也作为(c)的多肽包含在本发明的范围内。进而，由转化细胞表达的多肽在翻译之后，有时在细胞内进行各种修饰。上述翻译后经修饰的多肽只要具有免疫诱导活性，则也包含在本发明的范围内。作为上述的翻译修饰，可以举出N末端移除蛋氨酸、N末端乙酰化、附加糖链、由细胞内蛋白酶导致的限制分解、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、磷酸化等。 
<免疫诱导剂> 
如下述实施例具体所述，对罹癌动物给与上述具有免疫诱导活性的多肽时，可以使已经产生的肿瘤缩小或萎缩。因此，本发明的免疫诱导剂可以用作癌的治疗及/或预防。 
本说明书中使用的所谓“肿瘤”及“癌”的术语，是指恶性新生物，可以互换使用。 
此时，作为对象的癌，为表达CD179b基因的癌，例如为表达编码序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示多肽的基因的癌，优选乳癌、白血病及淋巴瘤。上述特定的癌中，例如包括乳癌(乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌等)、白血病(慢性淋巴细胞性白血病等)、淋巴瘤(消化管淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤等)等，但并不限定于此。 
上述多肽、或含有编码该多肽的多核苷酸、且在生物体内可以表达该多肽的重组载体，可以用作免疫诱导的治疗方法。另外，也可以用作以动物的癌的治疗及/或预防为目的的治疗方法，也可以用作还含有免疫增强剂的治疗方法。 
另外，作为对象动物，为哺乳动物，例如包括灵长类、宠物、家畜类、竞技用动物等哺乳动物，优选人、犬及猫。 
本发明的免疫诱导剂向生物体的给药途径，可以口服给与也可以非口服给与，但优选肌肉内投与、皮下给与、静脉内给与、动脉内给与等非口服给与。以治疗癌为目的使用该免疫诱导剂时，为了提高抗癌作用，如下述实施例所述，可以向为治疗对象的肿瘤附近 的所属淋巴结给与。给与量只要是对免疫诱导有效的量即可，例如当用于癌的治疗及/或预防时，为对癌的治疗及/或预防有效的量即可，另外，可根据动物的体重、性别(雄或雌)、症状等变化。对癌的治疗及/或预防有效的量，应根据肿瘤的大小或症状等适当选择，但通常情况下，对于对象动物而言，每1日的有效量为0.0001μg～1000μg，优选为0.001μg～1000μg，可分1次或多次给与。优选分数次、数日～数月给与。 
如下述实施例具体所示，本发明的免疫诱导剂，可以使已经形成的肿瘤缩小或萎缩。因此，对发生早期的少数的癌细胞也能发挥抗癌作用，从而用于癌症发病前或癌症治疗后时，可以防止癌的发病和复发，即，本发明的免疫诱导剂对癌的治疗和预防两方面都有用。 
本发明的免疫诱导剂，既可仅由多肽组成，也可与适用于各给药方式的、药理学上允许的填充剂、稀释剂、赋形剂等添加剂适当混合制成制剂。制剂方法及可使用的添加剂，在医药制剂的领域众所周知，可以使用其中任何方法或添加剂。作为添加剂的具体例，可以举出生理缓冲液之类的稀释剂；如砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、甘氨酸等赋形剂；糖浆、明胶、阿拉伯胶、山梨醇、聚氯乙烯、黄芪胶等粘合剂；硬脂酸镁、聚乙二醇、滑石粉、二氧化硅等润滑剂等，但并不限定于此。作为制剂形态，可以举出片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等口服剂、吸入剂、注射剂、栓剂、液剂等非口服剂等。上述制剂可通过一般所知的制法制得。 
本发明的免疫诱导剂，可与能够在生物体内增强免疫应答的免疫增强剂组合使用。免疫增强剂既可包含在本发明的免疫诱导剂中，也可作为其他组合物与本发明的免疫诱导剂一并给与患者。 
此处，患者为动物、特别是哺乳动物，优选人、犬及猫。 
作为上述免疫增强剂，例如可以举出佐剂。佐剂为提供抗原的储存场所(细胞外或巨噬细胞内)，活化巨噬细胞、并且刺激特定组的淋巴细胞，由此可以提高免疫应答，从而可以提高抗癌作用。 因此，特别是当将本发明的免疫诱导剂用于癌的治疗及/或预防时，免疫诱导剂除了包含上述多肽作为有效成分外，优选还包含佐剂。在本技术领域多种佐剂众所周知，可以使用任一种佐剂。作为佐剂的具体例，可以举出MPL(SmithKline Beecham)、沙门氏菌属Salmonella Minnesota Re 595脂多糖类纯化及酸水解后得到的同源物质；QS21(SmithKline Beecham)、从Quillja saponaria提取物中纯化所得的QA-21皂苷；PCR申请WO96/33739(SmithKline Beecham)中记载的DQS21；QS-7、QS-17、QS-18及QS-L1(So等，Molecules and Cells，1997年，第7卷，p178-186)；弗氏不完全佐剂；弗氏完全佐剂；维生素E；Montanide；明矾；CpG寡核苷酸(例如，Kreig等，Nature，第374卷，p546-549)；多聚IC(Poly IC)及其衍生物(如多聚ICLC等)以及鲨烯及/或生育酚之类由可生物降解油制成的各种油包水乳剂等。其中，优选弗氏不完全佐剂、Montanide、多聚IC及其衍生物以及CpG寡核苷酸。上述佐剂和多肽的混合比典型约为1∶10～10∶1，优选约为1∶5～5∶1，更优选约为1∶1。不过，佐剂并不限定于上述例子，本领域公知的上述以外的佐剂在给与本发明的免疫诱导剂时也可以使用(例如，Goding著，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第2版，1986年)。多肽与佐剂的混合物或乳剂的制备方法，对于预防接种领域的技术人员来说是众所周知的。 
另外，作为上述免疫增强剂，除上述佐剂之外，还可以使用刺激对象免疫应答的因子。例如，可以将具有刺激淋巴细胞和抗原呈递细胞的特性的各种细胞因子作为免疫增强剂，与本发明的免疫诱导剂组合使用。上述可增强免疫应答的细胞因子多数为本领域技术人员所公知，作为其例，可以举出显示增强疫苗防御作用的白细胞介素-12(IL-12)、GM-CSF、1L-18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素γ及Flt3配体，但并不限定于此。这些因子也可用作上述免疫增强剂，可以包含在本发明的免疫诱导剂中或作为其他组合物与本发明的免疫诱导剂并用给与患者。 
<抗原呈递细胞> 
如下述实施例中具体所述，通过使本发明中使用的上述多肽与抗原呈递细胞在在体外接触，可使抗原呈递细胞呈递该多肽。即，上述(a)～(G)的多肽可以用作抗原呈递细胞的处理剂。此处，作为抗原呈递细胞，可以举出用树状细胞、B细胞及巨噬细胞，可以优选使用带有MHC类I分子的树状细胞或B细胞。另外，所谓处理剂，是指脉冲抗原呈递细胞的药剂，被脉冲的抗原呈递细胞可以具有刺激末梢血淋巴细胞的能力，因此可作为疫苗使用。 
多种MHC类I分子已被鉴定，并周知。人类的MHC分子称为HLA。作为HLA类I分子，可以举出HLA-A、HLA-B、HLA-C，更具体而言，可以举出HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A0204、HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602等。 
带有MHC类I分子的树状细胞或B细胞，可以使用众所周知的方法由末梢血制得。例如，从骨髓、脐带血或患者末梢血中，使用粒细胞巨噬细胞集落激活因子(GM-CSF)与IL-3(或IL-4)诱导树状细胞，并在该培养系中加入肿瘤相关肽，由此可以诱导肿瘤特异性的树状细胞。 
通过给与有效量的该树状细胞，可以诱导出癌症治疗所期望的应答。作为使用的细胞，可以使用健康者提供的骨髓活脐带血、患者本人的骨髓或末梢血等，但使用患者本来的自身细胞时安全性较高，也可以期待避免严重的副作用。末梢血或骨髓可以为新鲜试样、低温保存试样及冷冻保存试样，均可。末梢血可以培养全血，也可以只分离出白细胞成分加以培养，但从效率方面考虑，优选后者。进而，即使在白细胞成分中也可以分离单核细胞。另外，以骨髓或脐带血作为来源时，可以培养构成骨髓的所有细胞，也可以从中分离出单核细胞加以培养。在末植血或其白细胞成分、骨髓细胞中，包含为树状细胞起源的单核细胞、造血干细胞或未成熟树状细胞或CD4阳性细胞等。使用的细胞因子，只要是确认具有安全性和生理 活性特性的物质时，则无论天然型或基因重组型等其生产方法皆可，但优选以必要最低量使用确保能够用于医疗的质量的标准品。添加的细胞因子的浓度，只要是可诱导树状细胞的浓度即可，没有特别的限定，通常细胞因子的总浓度优选为10～1000ng/ml左右，更优选为20～500ng/ml左右。可以使用通常用于白细胞的培养中的众所周知的培养基进行培养。培养温度只要可使白细胞增殖即可，没有特殊限定，但最优选人体温度的37℃左右。另外，培养中的气体环境只要可使白细胞增殖即可，没有特殊限定，但优选通气5％CO2。进而，培养时间只要是可诱导出必要数量细胞的时间即可，没有特殊的限定，但通常为3天～2周。用于细胞的分离和培养的仪器，可以使用适当的仪器，但优选确认医疗用安全性、且操作稳定简单。特别是，对于细胞培养装置，并不限定于培养皿、烧瓶、烧杯等一般的容器，也可以使用层合型容器或多段式容器、滚瓶(Roller Bottle)、转瓶(Spinner Bottle)、袋式培养器、中空纤维柱等。 
在体外使上述多肽与抗原呈递细胞接触的方法本身，可使用众所周知的方法进行。例如，可以通过在含有上述多肽的培养液中培养抗原呈递细胞进行。培养基中的肽浓度没有特别限定，但通常为1μg/ml～100μg/ml左右，优选为5μg/ml～20μg/ml左右。培养时的细胞密度没有特别限定，但通常为103个细胞/ml～107个细胞/ml左右，优选为5×104个细胞/ml～5×106个细胞左右。优选根据常规方法，在5％CO2氛围气中进行培养。需要说明的是，在抗原呈递细胞表面上可呈递的肽的长度，通常最大为30个氨基酸残基左右。因此没有特别限定，但在体外使抗原呈递细胞与多肽接触时，也可以将该多肽制成长度大约30个氨基酸残基以下。 
通过在上述多肽共存下培养抗原呈递细胞，该肽被抗原呈递细胞的MHC分子捕获，使其呈递在抗原呈递细胞的表面。因此，使用上述多肽，可以制备含有该多肽与MHC分子的复合物的分离抗原呈递细胞。上述抗原呈递细胞在生物体内或体外，针对T细胞呈递该多肽，从而诱导该多肽特异性的细胞毒性T细胞，并使其增殖。 
通过使如上所述制备的含有上述多肽与MHC分子的复合物的抗原呈递细胞在体外与T细胞接触，可以诱导对该多肽特异性的细胞毒性T细胞并使其增殖。其可以通过将上述抗原呈递细胞和T细胞在液体培养基中共存培养来进行。例如，可将抗原呈递细胞悬浮在液体培养基中，移入微孔板的孔等的容器中，并向其中添加T细胞进行培养，由此进行。共存培养时的抗原呈递细胞与T细胞的混合比例，没有特别限定，但通常细胞数的比例为1∶1～1∶100左右，优选为1∶5～1∶20左右。另外，在液体培养基中悬浮的抗原呈递细胞的密度没有特别限定，但通常为100～1000万细胞/ml左右、优选为10000～100万细胞/ml左右。共存培养优选按照常规方法，在37℃、5％CO2气氛中进行。培养时间没有特别限定，但通常为2天～3周，优选为4天～2周左右。另外，共存培养优选在例如IL-2、IL-6、IL-7及IL-12之类的白细胞介素的1种或多种存在下进行。这种情况下，IL-2及IL-7的浓度通常为5U/ml～20U/ml左右，IL-6的浓度通常为500U/ml～2000U/ml左右，IL-12的浓度通常为5ng/ml～20ng/ml左右，但均不限于上述范围。此处，“U”表示活性单位。上述共存培养，可以追加新鲜的抗原呈递细胞一次至多次重复进行。例如，舍弃共存培养后的培养上清液，添加新鲜的抗原呈递细胞的悬浮液，进一步进行共存培养，上述操作可以重复1次至数次。各共存培养的条件可以与上述相同。 
通过上述的共存培养，可以诱导对该多肽特异性的细胞毒性T细胞，使其增殖。因此，使用上述多肽，可以制备选择性结合该多肽与MHC分子的复合物的分离T细胞。 
如下述实施例所示，编码序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的多肽的基因，在乳癌细胞、白血病细胞及淋巴瘤细胞中特异性表达。因此，一般认为序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95的多肽与正常细胞相比显著多地存在于上述癌细胞中。癌细胞内存在的多肽的一部分呈递于癌细胞表面上的MHC分子上，将如上所述制备的细胞毒性T细胞给与生物体内时，这些细胞毒性T细胞 可以以上述被呈递的多肽为目标毒杀癌细胞。另外，由于呈递上述多肽的抗原呈递细胞在生物体内也可诱导和增殖对该多肽特异性的细胞毒性T细胞，所以即使通过向生物体内给与该抗原呈递细胞，也可毒杀癌细胞。即，使用上述多肽制得的上述细胞毒性T细胞与上述抗原呈递细胞也与本发明的免疫诱导剂同样地作为癌的治疗及/或预防剂有用。 
在将上述分离抗原呈递细胞或分离T细胞给与生物体时，为了避免生物体内免疫应答将这些细胞作为异物加以攻击，优选如上所述使用上述(a)～(c)的多肽制备从接受治疗的患者采集的抗原呈递细胞或T细胞。 
含有抗原呈递细胞或分离T细胞作为有效成分的癌的治疗及/或预防剂，其给与途径优选为静脉内给与及动脉内给与上述的非口服给与。另外，给与量应根据症状及给与目的等适当地选择，但通常为1个～10兆个，优选为100万个～10亿个，优选数日至数月给与1次上述细胞。制剂例如可以为将细胞悬浮于生理缓冲盐水中的制剂等，也可以与其他抗癌剂及细胞因子等并用。另外，也可以添加制剂领域中众所周知的1种或2种以上的添加剂。 
<基因疫苗> 
另外，通过在对象动物体内表达编码上述(a)～(c)的多肽的多核苷酸，可以在该生物体内产生抗体并诱导细胞毒性T细胞，获得与给与该多肽同等的效果。即，本发明的免疫诱导剂，可以含有编码上述(a)、(b)及(c)的多肽的多核苷酸，含有可以在生物体内表达该多肽的重组载体作为有效成分。上述可以表达抗原多肽的重组载体，也可被称为基因疫苗。 
用于制备基因疫苗的载体，只要是能够在对象动物细胞内(优选哺乳动物细胞内)表达的载体即可，没有特别限定，质粒载体或病毒载体皆可，也可以使用在基因疫苗领域公知的任何载体。需要说明的是，编码上述多肽的DNA或RNA等多核苷酸，如上所述可以使用常规方法容易地制备。另外，可用本领域技术人员众所周知 的方法将该多核苷酸参入到载体中。 
基因疫苗的给与途径，优选肌肉内给与、皮下给与、静脉内给与、动脉内给与等非口服给与途径，其给与量可以根据抗原种类等适当地选择，但通常每1kg体重以基因疫苗的重量计为0.1μg～100mg左右，优选为1μg～10mg左右。 
作为利用病毒载体的方法，例如可以举出将编码上述多肽的多核苷酸参入到逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、疫苗病毒病毒、痘病毒(pox virus)、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)等RNA病毒或DNA病毒中，并用其感染对象动物的方法。其中，特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疫苗病毒等的方法。 
作为其他方法，可以举出将表达质粒直接给与肌肉内的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、Lipofectin法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，特别优选DNA疫苗法、脂质体法。 
为使本发明使用的编码上述多肽的基因可实际上作为药物作用，有将基因直接导入体内的体内方法、以及从对象动物采集某种细胞，在体外将基因导入该细胞中，然后将该细胞放回体内的ex vivo方法(日经科学，1994年4月，p.20-45；月刊药事，1994年，第36卷，第1号，p.23-48；实验医学增刊，1994年，第12卷，第15号；及其引用文献等)。较优选体内方法。 
通过体内方法给与药物时，可以按照与治疗目标的疾病、症状等相应的适当的给与途径给与。例如，可以通过静脉、动脉、皮下、肌肉内等途径给与，或也可以直接给与到肿瘤存在的患病部位。通过体内方法给与时，例如可以采取液体制剂等制剂形式，但一般而言，制成含有本发明中编码上述多肽的DNA的注射剂等，可以根据需要，添加常用的填充剂。另外，在含有该DNA的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)时，可以制成悬浊剂、冻结剂、离心分离浓缩冻结剂等的脂质体制剂形式。 
需要说明的是，在本发明中，当提及“序列号1表示的碱基序列”时，除序列号1实际表示的碱基序列外，还包含其互补序列。因此，当提及“具有序列号1表示的碱基序列的多核苷酸”时，包含具有序列号1实际所示的碱基序列的单链多核苷酸、具有其互补碱基序列的单链多核苷酸、及由上述两者组成的双链多核苷酸。在制备本发明中使用的编码多肽的多核苷酸时，适当选择任一碱基序列，对于本领域技术人员来说可以容易地选择。
<癌的检测> 
作为本发明的癌的检测方法，使用从生物体分离的试样，测定本发明中使用的多肽的表达。作为使用上述试样测定多肽表达的方法，可以举出对针对试样中所含该多肽的抗体进行免疫测定方法(第1方法)、对试验中所含该多肽本身进行免疫测定的方法(第2方法)、及测定编码试样中所含该多肽的mRNA的方法(第3方法)。在本发明的方法中，可以用上述任一种方法测定多肽的表达。需要说明的是，在本发明中，所谓“测定”的用语，也包括检测、定量及半定量的任一种。 
此处，CD179b可以通过使用来自犬乳癌的cDNA文库和同一患病犬的血清的SEREX法，作为与特异性存在于来自罹癌犬的血清中的抗体(癌特异性抗体)相结合的多肽被鉴定(参见实施例1)。即，在罹癌犬生物体内特异性诱导针对CD179b的抗体。因此，通过测定针对罹癌生物体内的CD179b的抗体，也可以检测表达CD179b的癌症(参见实施例7)。另外，通过采用上述第2方法测定作为抗原的CD179b，也可以检测犬的癌症。另外，如下述实施例所述，由于编码该抗原多肽的mRNA与正常组织相比较显著地表达于癌、特别是乳癌及白血病细胞中(参见实施例1)，所以通过测定mRNA，也可以检测犬的癌症。需要说明的是，如上所述，已知CD179b在B细胞的前体细胞(前B细胞)的膜表面表达，因此，报道了在前B细胞癌变的白血病(前B细胞性白血病)细胞中表达，但是，在本发明中首次发现在除前B细胞性白血病细胞之外的白血病细胞及乳癌细胞中表达的事实。由此，通过分析CD179b的表达，可以检测 除前B细胞性白血病细胞之外的白血病、淋巴瘤及乳癌。 
在上述第1方法中，可存在于试样中的上述癌特异性抗体的测定，可以通过使用与该抗体发生抗原抗体反应的抗原物质的免疫测定法简便地进行。如下述详述，免疫测定法本身为众所周知的常规方法。作为免疫测定的抗原物质，可以使用上述(a)～(c)的多肽。另外，抗体存在交叉反应性，实际上即使为除作为免疫原的抗原物质之外的分子，分子上存在与免疫原的表位类似的结构时，其分子通过与针对免疫原被诱导的抗体进行抗原抗体反应可以结合。例如，在氨基酸序列的同源性高的多肽之间，大多数情况下表位的结构也类似，在此种情况下，两者可以显示相同的抗原性。如下述实施例中具体所述，序列号3的来自人的多肽与罹癌犬体内被诱导的上述抗体发生抗原抗体反应。因此，在本发明的第1方法中，作为免疫测定的抗原，也可以使用来自任一哺乳动物的同源因子。 
通常，在如蛋白质等具有复杂结构的分子量大的抗原物质的情况下，在分子上存在结构不同的多个部位。因此，在生物体内，针对上述抗原物质，可以产生分别识别、结合多个部位的多种抗体。即，在生物体内针对蛋白质等抗原物质所产生的抗体，为作为多种抗体混合物的多克隆抗体。需要说明的是，本发明中所谓“多克隆抗体”的情况，是指存在于来自体内含有抗原物质的生物体的血清中的抗体，针对该抗原物质在该生物体内被诱导的抗体。 
试样中抗体的测定可以通过使用上述多肽作为抗原的免疫测定简便地进行。免疫测定本身在本技术领域中众所周知，按反应方式分类时，包括夹层法、竞争法、凝集法、蛋白质印迹法等。另外，按标记分类时，包括放射免疫测定、荧光免疫测定、酶免疫测定、生物素免疫测定等，可以使用任一种方法进行上述抗体的免疫测定。没有特别限定，但由于夹层ELISA或凝集法的操作简便且不需要繁琐的装置等，可以优选作为本发明的方法中的上述抗体的免疫测定方法使用。使用酶作为抗体的标记时，作为酶，只要是满足转化数大、即使与抗体结合也稳定、且使基质特异性地染色等的条件的酶即可，没有特别的限制，也可以使用通常的酶免疫测定法中使用的酶，例如过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酯酶、葡糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。另外，也可以使用酶抑制物质或辅酶等。上述酶与抗体的结合，可以通过使用马来酰亚胺化合物等交联剂的公知的方法进行。作为基质，可以根据所使用的酶的种类，使用公知的物质。例如，使用过氧化物酶作为酶时，可以使用3，3’、5，5’-四甲基联苯胺，另外使用碱性磷酸酯酶作为酶时，可以使用对硝基酚等。作为放射性同位素，可以使用125I或3H等常用的放射免疫测定法中使用的物质。作为荧光色素，可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)等常用的荧光抗体法中使用的物质。 
需要说明的是，上述免疫测定法本身众所周知，在本说明书中没有说明的必要，但简单记载时，例如，在夹层法中，将作为抗原使用的上述多肽固定在固相上，使其与血清等试样反应，清洗后，与适当的二级抗体反应，清洗后，测定与固相结合的二级抗体。通过将抗原多肽固定在固相上，可以容易地除去未结合的二级抗体，因此，优选作为本发明中癌的检测方法的方案。作为二级抗体，例如如果试样来自犬，则可以使用抗犬IgG抗体。通过用上述列举的标记物质标记二级抗体，可以测定与固相结合的二级抗体。这样测定的二级抗体量相当于血清试样中的上述抗体量。使用酶作为标记物质时，加入因酶作用而分解、显色的基质，用光学方法测定基质的分解量，由此可以测定抗体量。使用放射性同位素作为标记物质时，使用闪烁计数器等可以测定放射性同位素发出的放射线量。 
本发明的第2方法中，测定序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的多肽，所述多肽可以包含在从生物体获得的试样中。如上所述，在癌患者中，与序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的多肽或其同源因子发生抗原抗体反应的癌特异性抗体的量显著增加，这表明在癌患者体内，作为该癌特异性抗体的抗原的上述多肽或其同源因子的生成量显著增多。因此，即使通过测定序 列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的多肽或其同源因子，也可以与上述第1方法同样地检测出生物体内的癌。 
试样中的多肽的测定，可以通过众所周知的免疫测定法简便地进行。具体而言，例如制作与由序列号3～95中奇数序列号表示的序列组成的多肽或其同源因子发生抗原抗体反应的抗体或其抗原结合性片段，使用抗体或其抗原结合性片段进行免疫测定，由此可以测定可存在于试样中的由序列号3～95中奇数序列号表示的序列组成的多肽或其同源因子。免疫测定方法本身如上所述为众所周知的常规方法。 
此处，所谓“抗原结合性片段”，是指包含在抗体分子中的Fab片段或F(ab’)2片段之类具有与抗原的结合能力的抗体片段。抗体可以为多克隆抗体也可以为单克隆抗体，但为了免疫测定等，优选重现性高的单克隆抗体。以多肽为免疫原的多克隆抗体及单克隆抗体的制备方法众所周知，可以按照常规方法简便地进行。例如，使多肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)或酪蛋白等载体蛋白质结合，用其作为免疫原与佐剂一同对动物免疫，由此可以诱导针对该多肽的抗体。使从经免疫的动物采集的脾细胞或淋巴细胞之类的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，制作杂交瘤，选择生成与序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的多肽或其同源因子相结合的抗体的杂交瘤，使其增殖，可以从培养上清得到以上述蛋白质为对应抗原的单克隆抗体。需要说明的是，上述方法为众所周知的常规方法。 
在本发明第3方法中，测定了可包含在从生物体获得的试样中、且编码CD179b的mRNA。如下述实施例中具体所示，编码CD179b的mRNA在癌、特别是乳癌及白血病细胞中显著地高表达。因此，即使通过测定试样中的该mRNA，也可以检测生物体内的癌。本发明的检测方法中，基于如上所述测定得到的多肽的表达量，判断对象生物体是否患癌等。癌的检测也可以只测定对象生物体中多肽的表达，但从提高检测精度的观点考虑，优选考察1个至多个健康人试样中多肽的表达量(抗体量、多肽量或mRNA量)，取得健康人 基准值，比较对象生物体的测定值与该健康人基准值。欲进一步提高检测精度时，也可以针对从已知罹患癌症的多个患者得到的试样，考察多肽的表达量，取得癌患者基准值，比较对象生物体的测定值与健康人基准值及癌患者基准值两方面。上述基准值例如可以如下确定：可以将各试样中多肽表达量数值化，算出其平均值。需要说明的是，可以事先考察多个健康人及癌患者的多肽表达量来确定健康人基准值与癌患者基准值。因此，用本发明的方法进行与基准值的比较时，也可以使用预先确定的基准值。 
在本发明的检测方法中，也可以组合使用利用其他癌抗原和癌标记物的检测。由此，可以进一步提高癌的检测精度。 
根据本发明的检测方法，可以检测生物体内的癌。根据本发明的方法，也可以检测出肉眼看不见的较小尺寸的肿瘤和体内深处的肿瘤，因此对癌的早期发现有用。另外，如在对癌的治疗后跟进观察中的患者应用本发明的检测方法，则存在癌的复发时可以在早期检测该癌。另外，在罹癌生物体内，如果表达本发明中作为测定对象的上述规定的多肽的癌细胞的数量增加，则该生物体内的该多肽及其mRNA的蓄积量增大，血清中生成更多针对上述多肽的抗体。另一方面，如果癌细胞的数量减少，则生物体内该多肽及其mRNA的蓄积量减少，血清中针对上述多肽的抗体减少。因此，上述规定多肽的表达量多时，可以判断发生了肿瘤的增大或癌的转移，即癌的进展程度在发展。 
另外，如下述实施例所示，在同一种类的肿瘤中，在恶性型中的上述抗体量明显多于良性型的上述抗体量。因此，上述规定多肽的表达量多时，可以判断癌的恶性程度较高。即，根据本发明的方法，也可以检测癌的恶性程度。 
进而，以上述规定多肽的表达量的增减为指标，也可以监测癌的治疗效果。因此，对于癌的治疗中或治疗后的个体，通过观察上述多肽的表达量，可迅速获得下述线索：抗癌剂的治疗效果、肿瘤摘除后是否有残存肿瘤、进而跟进观察中的转移·复发。可以进行 适当治疗时，多肽的表达量比治疗前的罹癌状态低，因此可以判断针对上述生物体已进行的(正在进行的)治疗的效果良好。多肽表达量上升或维持时、或一旦下降后可进一步观察到上升时，可以判断治疗效果不充分，改变为其他治疗方法或改变抗癌剂给与量等为对治疗方法选择的有用的判断材料。 
作为本发明的癌的检测方法的对象癌，是表达CD179b的癌(但是不包括前B细胞性的癌)，可以举出乳腺癌、复合型乳腺癌、乳癌恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、白血病(优选慢性淋巴细胞性白血病，但不包括前B细胞性的癌)淋巴瘤(优选消化管淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、中细胞型淋巴瘤或多中心型淋巴瘤，但不包括前B细胞性的癌)等，但不并限定于此。另外，作为本发明方法的对象的生物体为哺乳动物，优选人或犬、猫。 
作为用于本发明的方法的试样，可以举出血液、血清、血浆、腹水、胸水等体液，组织、细胞。特别是在上述第1方法及第2方法中，可以优选使用血清、血浆、腹水及胸水，另外，在测定mRNA的上述第3方法中，优选组织试样及细胞试样。 
在第1方法中作为免疫测定的抗原使用的上述多肽，可以作为癌检测试剂提供。该试剂可以只由上述多肽组成，另外，也可以含有对该多肽的稳定等有用的各种添加剂等。另外，该试剂也可以以固定在板或膜等固相上的状态进行提供。 
在第2方法中对序列号3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的多肽或其同源因子进行免疫测定时使用的、与该多肽或其同源因子发生抗原抗体反应的抗体或其抗原结合性片段，也可以作为癌检测试剂提供。上述情况下，癌检测试剂可以只由上述抗体或抗原结合性片段组成，另外，也可以含有对该抗体或抗原结合性片段的稳定等有用的各种添加剂等。另外，该抗体或抗原结合性片段可以与锰或铁等金属结合。向体内给与上述金属结合抗体或抗原结合性片段时，在抗原蛋白质较多存在的部位，该抗体或抗原结合性片段较多蓄积，因此利用MRI等测定金属时，可以检测产生抗原蛋白 质的癌细胞的存在。 
进而，在第3方法中，mRNA的测定中使用的上述癌检测用多核苷酸，也可以作为癌检测试剂提供。在上述情况下，癌检测用试剂可以只由该多核苷酸组成，另外，也可以含有对该多核苷酸的稳定等有用的各种添加剂等。该试剂中所包含的该癌检测用多核苷酸优选引物或探针。 
实施例 
以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围并不限定于以下的具体例。 
实施例1：通过SEREX法制取新型癌抗原蛋白 
(1)构建cDNA文库 
使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)从通过手术摘除的犬乳腺癌组织中提取总RNA，用Oligotex-dT30mRNA purification Kit(宝酒造公司制)，按照该试剂盒所附操作说明书纯化多聚A RNA。 
使用由此所得的mRNA(5μg)合成来自犬乳腺癌的cDNA噬菌体文库。在构建cDNA噬菌体文库时，使用cDNA Synthesis Kit、ZAP-cDNA Synthesis Kit、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE公司制)按照试剂盒所附的操作说明书构建文库。构建的cDNA噬菌体文库的大小为2.99×105pfu/ml。 
(2)利用血清筛选cDNA文库 
用上述构建的来自犬乳腺癌的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中，感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)，使其为2340克隆，在42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，在37℃下，用浸透了IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Hybond C Extra：GE Healthecare Bio-Science公司制)覆盖培养板4小时，由此诱导·表达蛋白质，并使蛋白质转印到膜上。之后，回收膜，将其浸泡在含0.5％脱脂奶粉的TBS (10mM Tris-HCl，150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一晚，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释了500倍的患病犬血清反应2～3小时。 
作为上述患病犬血清，分别使用从摘除了上述乳腺癌的同一患病犬及其他乳腺癌患病犬收集的共3个血清样本。上述血清在-80℃下保存，在即将使用前进行前处理。血清前处理的方法采用如下方法。即，用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)后，在37℃下，在NZY平板培养基中培养一晚。接着，向培养板中添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3 pH8.3的缓冲液，在4℃下静置15小时后，回收上清作为大肠杆菌/噬菌体提取液。接着，将回收的大肠杆菌/噬菌体提取液通过NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制)，固定化来自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质。在此蛋白质固定化柱中使患病犬血清通过·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。用含有0.5％脱脂奶粉的TBS将只是仅仅通过柱子的血清馏分稀释500倍，将其作为免疫筛选的材料。 
将经上述处理血清与上述融合蛋白质印迹的膜用TBS-T(0.05％ Tween20/TBS)清洗4次后，将用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)作为二级抗体，在室温下使其反应1小时，使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制)通过酶显色反应检测，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，使其溶解在500μl SM缓冲液(100mM NaCl，10mM MgClSO4，50mMTris-HCl，0.01％明胶pH7.5)中。采用与上述同样的方法将显色反应呈阳性的菌落反复筛选两次、三次，直至菌落单一化，筛选出与血清中IgG反应的92820个噬菌体克隆，分离出45个阳性克隆。 
(3)分离抗原基因的同源性检索 
为了将用上述方法分离所得的45个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作从噬菌体载体转化为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL1-Blue M RF’)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述 溶液200μl与250μl经纯化的噬菌体溶液以及1μl ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制)混合后，在37℃下反应15分钟，然后，添加3ml LB培养基，在37℃下进行培养2.5～3小时，立即在70℃水浴中保持温度20分钟后，在4℃下以1000×g离心15分钟，回收上清作为噬菌粒溶液。接着，将噬粒宿主大肠杆菌(SOLR)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与10μl经纯化的噬菌体溶液混合后，在37℃下反应15分钟，取50μl接种于含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一晚。采集经转化的SOLR单菌落，在37℃下，用含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB培养基培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN公司制)，纯化含有目标插入片段的质粒DNA。 
纯化的质粒，可以使用序列号96所记载的T3引物与序列号97所记载的T7引物，通过引物步移法(primer-walking)来解析插入片段的全长序列。通过该序列解析获得序列号4～92的偶数号所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列(序列号5～93的奇数号)，进行同源性检索程序BLAST  搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因的同源性检索，结果表明所得的45个基因均为编码CD179b的基因。45个基因间的同源性为碱基序列94～99％、氨基酸序列96～99％。该基因与编码人同源因子的基因的同源性，在被翻译为蛋白质的区域，为碱基序列62～82％、氨基酸序列69～80％。人同源因子的碱基序列如序列号1所示，氨基酸序列如序列号2及3所示。另外，该基因与编码牛同源因子的基因的同源性，在被翻译为蛋白质的区域为碱基序列68～82％、氨基酸序列56-77％。牛同源因子的碱基序列如序列号94所示，氨基酸序列如序列号95所示。需要说明的是，编码人同源因子的基因与编码牛同源因子的基因的同源性，在被翻译为蛋白质的区域，为碱基序列62％、氨基酸序列72％。 
(4)在各组织中的表达解析 
对于通过上述方法所得的基因，利用RT-PCR(Reverse  Transcription-PCR)分析其在犬及人的正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应以下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制)按照所附说明书从50～100mg各组织及5～10×106个各细胞株的细胞中提取总RNA。通过Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen公司制)，按照所附说明书用上述总RNA合成cDNA。人正常组织(脑、海马、睾丸、结肠、胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制)、QUICK-Clone cDNA(CLONETECH公司制)及Large-Insert cDNA Library(CLONETECH公司制)。PCR反应使用对获得的犬基因具有特异性的引物(序列号98及99所示)及对其人同源基因具有特异性的引物(序列号100及101所示)如下进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中使通过逆转录反应制得的试样为0.25μl，上述引物各为2μlM，各dNTP为0.2mM，ExTaq聚合酶为0.65U(宝酒造公司制)，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以94℃～30秒、60℃～30秒、72℃～30秒为1循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，对具有上述序列号98及99所示的碱基序列的基因具有特异性的引物，是扩增下述区域的引物，所述区域是序列号4的碱基序列中的32号～341号，及序列号4～92的偶数号所示的全部犬CD179b基因中共同的区域。另外，对具有序列号100及101所示的碱基序列的基因具有特异性的引物，是扩增序列号1的碱基序列中的216号～738号碱基的区域的引物。为了比较对照，同时也使用GAPDH特异性的引物(序列号102及103所示)。其结果如图1所示，发现获得的犬基因在健康的犬组织中几乎完全表达，另一方面，在犬乳癌组织中有强表达。人同源因子的表达中，可以确认到在人正常组织中表达的只有骨髓，在人癌细胞中检测到于白血病细胞株及乳癌细胞株中表达，确认到CD179b在白血病细胞株与乳癌细胞株中特异性表达。 
需要说明的是，图1中，纵轴的标号1表示上述鉴定的基因的表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达谱。 
实施例2：犬及人新型癌抗原蛋白的制备 
(1)重组蛋白质的制备 
基于实施例1取得的序列号4的基因，用以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使由实施例1中所得的噬粒溶液制备的用于序列解析的载体为1μl、使含有NdeI及KpnI限制性酶剪切序列的2种引物(如序列号104及105所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U。使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃～10秒、68℃～40秒为1循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，上述2种引物是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号5的氨基酸序列5号～120号氨基酸的区域。PCR之后，用2％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化出约350bp的DNA片段。 
将经纯化的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制)连接。将其转化至大肠杆菌后回收质粒，通过测序列确认经扩增的基因片段与目标序列一致。用NdeI及KpnI限制性酶处理与目标序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将目标基因序列插入到经NdeI、KpnI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30b(Novagen公司制)中。通过使用该载体可生成His标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mMIPTG的表达诱导，能够使目标蛋白质在大肠杆菌内表达。 
另外，基于序列号1的基因，用以下方法制备人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使实施例1中制备的各种组织·细胞cDNA中已经确认通过RT-PCR法表达的cDNA为1μl、使含有EcoRI及SalI限制性酶剪切序列的2种引物(序列号106及107所记载)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造公司制)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，以98℃～10秒、68℃～40秒为1循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，上述两种引物是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号3的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用 2％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制)纯化约540bp的DNA片段。 
将经纯化的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitroge公司制)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认经扩增的基因片段与目标序列相一致。用EcoRI及SalI限制性酶处理与目标序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化后，将目标基因序列插入到经EcoRI、SalI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制)中。通过使用该载体可生成His标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化为表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG进行表达诱导，使目标蛋白质在大肠杆菌内表达。 
(2)重组蛋白质的纯化 
将由上述方法得到的、表达序列号1及序列号4的各个重组大肠杆菌在含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中在37℃下进行培养直至600nm处吸光度为0.7左右，然后，添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷至终浓度为1mM，在30℃下培养20小时。之后以4800rpm离心10分钟集菌。将此菌体球状物悬浮在磷酸缓冲生理盐水中，进而以4800rpm离心10分钟，清洗菌体。 
将上述菌体悬浮在磷酸缓冲生理盐水中，在冰上进行超声粉碎声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以7000rpm离心分离20分钟，所得的上清为可溶馏分，沉淀物为不溶馏分。 
用4％Triton-X100溶液悬浮不溶馏分，以7000rpm离心分离20分钟。重复该操作2次，进行除蛋白酶的操作。 
将该残渣悬浮于含有6M胍盐酸盐的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，在4℃下静置20小时，使蛋白质变性。该变性操作后，以7000rpm离心20分钟，将所得的可溶馏分加入到按照常规方法制备的镍螯合柱(载体：Chelateing Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司)、柱容量5mL、平衡缓冲液：含有6M胍盐酸盐的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0))中。将未吸附馏分用柱容量10倍量的含 有6M胍盐酸的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)与20mM含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液(pH8.0)清洗后，立即用分为4个阶段的50mM-500mM咪唑阶段性浓度梯度进行洗脱，形成纯化馏分，以后将该纯化馏分作为给与试验用的材料。 
向1ml反应用缓冲液(20mM Tris-HCl、50mM NaCl、2mM CaCl2pH7.4)中分注200μl由上述方法所得的纯化标准品后，添加2μl肠激酶(Novagen公司制)，之后在室温下静置·反应一晚，切断His标签，使用Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen公司制)按照所附说明书进行纯化。接着，使用超滤NANOSEP 10K OMEGA(PALL公司制)将1.2ml用上述方法所得的纯化标准品进行生理用磷酸缓冲液(日水制药公司制)置换后，用0.22μm HT Tuffryn Acrodisc(PALL公司制)进行无菌过滤，用于以下的实验。 
实施例3：对罹癌犬给与重组蛋白质的试验 
(1)抗肿瘤评价 
评价上述纯化的重组蛋白对表皮患有肿瘤的罹癌患病犬(乳癌)的抗肿瘤效果。 
在100μg(0.5ml)如上述纯化的重组多肽中混合等量的弗氏不完全佐剂(和光纯药公司制)，制备癌症治疗剂。向膀胱附近的所述淋巴结给与该癌症治疗剂共3次，给与时间分别为初次给与、3日后以及7日后。结果，在给与癌治疗剂时大小约为55mm3的肿瘤，在初次给与癌治疗剂10日后缩小至30mm3，20日后缩小至16mm3、30日后缩小至10mm3。 
另外，在100μg(0.5ml)上述来自犬的多肽中混合0.5ml弗氏不完全佐剂，将所得混合物与上述同样地给与其他乳腺癌的患病犬共3次。另外同时，每次皮下给与100μg犬白细胞介素12。结果，在给与癌症治疗剂时，大小约为155mm3的肿瘤，在初次给与癌治疗剂24日后完全萎缩。 
(2)免疫诱导能力的评价 
在给与癌治疗剂前以及初次给与10日后及30日后的各时间点， 采集上述(1)的给与试验中已取得抗肿瘤效果的患病犬的血液，按照常规方法分离末梢血单核细胞，根据使用其的IFNγ酶联免疫斑点法(EliSpot Assay)，对给与的各重组蛋白进行免疫诱导能力的评价。 
将70％乙醇以100μL/孔分别添加到Millipore公司制的96孔板(MultiScreen-IP，MAIPS4510)上，静置5分钟，吸取并弃去后，用灭菌水清洗，以300μL/孔添加200mM碳酸氢钠(pH8.2)，静置5分钟后，吸取并弃去，清洗培养板。然后，将添加在200mM碳酸氢钠中的抗犬干扰素γ单克隆抗体(R&D公司制造，clone142529、MAB781)以0.5μg/孔分别添加在培养板中，在37℃下温育一晚，使一级抗体固相化。吸取并弃去一级抗体后，将封闭溶液(1％BSA-5％蔗糖-200mM碳酸氢钠(pH8.2))以300μL/孔分别添加到培养板中，在4℃下温育一晚，封闭培养板。吸取并弃去封闭溶液后，以300μL/孔分别添加含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen公司制)，静置5分钟，吸取并弃去培养基。之后，将悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中的各个犬末梢血单核细胞分别以5×105细胞/孔添加到培养板中，向其中以10μL/孔分别添加在每次给药中使用的来自犬的多肽或来自人的多肽，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时，由此使可存在于末梢血单核细胞中的免疫细胞产生干扰素γ。培养后，弃去培养基，用清洗液(0.1％Tween20-200mM碳酸氢钠(pH8.2))清洗孔6次。将用上述封闭溶液稀释1000倍的兔抗犬多克隆抗体以100μL/孔分别添加到各个孔中，在4℃下温育一晚。用上述清洗液清洗孔3次后，将用上述封闭溶液稀释1000倍的HRP标记抗兔抗体以100μL/孔分别添加到各个孔中，在37℃下反应2小时。用上述清洗液清洗孔3次后，用Konica免疫染色剂(Konica公司制)使其显色，用水清洗孔使反应停止，反应停止后，将膜干燥，用KS Elispot(Carl Zeiss公司制)计算出现的斑点数。结果，在给与多肽前的末梢血单核细胞中没有检测到斑点，另一方面，给与多肽后的患病犬中，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检测出18个、87个斑点。 
由以上结果可以确认，在给药的患病犬中，确认可以诱导免疫细胞，所述免疫细胞与给与的重组蛋白特异性反应、产生干扰素γ，一般认为通过上述免疫细胞为中心的免疫反应，能够发挥上述(1)所述的抗肿瘤效果。 
实施例4：来自CD179b的肽表位反应性CD8阳性T细胞的诱导 
(1)HLA-A0201与HLA-A24结合的肽基序的预测 
从GenBank获得了人CD179b蛋白质的氨基酸序列的信息。为了预测HLA-A0201与HLA-A24的结合基序，利用使用公知的BIMAS软件(在http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/中可以利用)的计算机预测程序，解析人CD 179b蛋白质的氨基酸序列，选择了下述肽：预计能够与HLA-A0201分子结合的从序列号108至至序列号110以及从序列号113至序列号117所示的8种肽、预计能够与HLA-A24分子结合的从序列号110至序列号112、序列号115、以及序列号116所示的5种肽。 
(2)肽表位反应性CD8阳性T细胞的诱导 
从HLA-A0201阳性的健康人分离末梢血，重叠在Lymphocyte separation medium(OrganonpTeknika，Durham，NC)上，以500rpm在室温下离心分离20分钟。回收含有PBMC的馏分，在冷磷酸盐缓冲液中清洗3次(或更多次)，得到末梢血单核细胞(PBMC)。将所得PBMC悬浮在20ml AIM-V培养基(Life Technololgies公司制)中，在37℃、5％CO2的条件下使其附着在培养烧瓶(Falcon公司制)中2小时。非附着细胞用于制备T细胞，附着细胞用于制备树状细胞。 
在AIM-V培养基中、IL-4(1000U/ml)及GM-CSF(1000U/ml)的存在下培养附着细胞。6天后，将培养基替换为添加有IL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)、IL-6(1000U/ml，Genzyme，Cambridge，MA)、IL-1β(10ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)及TNF-α(10ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基，进一步培养2天后，将所得的非附着细胞集团用作树状细 胞。 
在AIM-V培养基中以1×106细胞/ml的细胞密度悬浮制备得到的树状细胞，将上述(1)中选择的、预计能够与HLA-A0201分子结合的从序列号108至序列号110、从序列号113至序列号117所示的肽以10μg/ml的浓度添加到上述悬浮液中，使用96孔板，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，用X射线照射(3000rad)，用AIM-V培养基清洗，在含有10％人AB血清(Nabi，Miami，FL)、IL-6(1000U/ml)及IL-12(10ng/ml、Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基中悬浮，以1×105细胞/孔分别添加到24孔板的每1个孔中。进而将制备得到的T细胞集团以1×106细胞/孔分别添加到各孔中，在37℃、5％CO2的条件下培养。7天后，弃去各个培养上清，与上述同样地，用得到的各肽处理后，将X射线照射的树状细胞悬浮在含有10％人AB血清(Nabi，Miami，FL)、IL-7(10U/ml，Genzyme，Cambridge，MA)及IL-2(10U/ml、Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基中(细胞密度：1×105细胞/ml)，以1×105细胞/孔分别添加到24孔板的每1个孔中，进一步培养。每隔7天重复同样的操作4～6次后，回收刺激的T细胞，利用流式细胞术确认CD8阳性T细胞的诱导。 
对于预计能够与HLA-A24分子结合的序列号110、111、112、115、116所示的肽，使用HLA-A24阳性的来自健康人末梢血的经诱导的树状细胞和T细胞集团，按照与上述同样的方法，尝试肽表位反应性CD8阳性T细胞的诱导。 
需要说明的是，作为阴性对照，使用作为本发明范围之外的序列的肽(序列号118)。 
实施例5：刺激HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞的来自CD179b的细胞毒性T细胞抗原表位的确定 
(1)产生IFN-γ的能力 
为了分析各个T细胞对肽表位的特异性，所述T细胞在上述诱导的T细胞内可观察到增殖，向5×104个使用各肽进行脉冲的、表 达HLA-A0201分子的T2细胞(Salter RD et al.，Immunogenetics，21：235-246(1985)，购自ATCC)(以10μg/ml的浓度向AIM-V培养基中添加各肽，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时)中添加5×103个T细胞，在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中、于96孔培养板中培养24小时。取培养后的上清，根据ELISA法测定IFN-γ的产生量。结果，与使用没有脉冲肽的T2细胞的孔的培养上清相比，确认了在使用脉冲了从序列号108至序列号110或从序列号113至序列号117的肽的T2细胞的孔的培养上清中产生IFN-γ(图2)。由该结果表明，上述肽特异性地增殖刺激HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞，为具有诱导IFN-γ产生的能力的T细胞表位肽。 
需要说明的是，图2中，横轴的标号3、4、5、6、7、8、9、10，分别表示由于来自T2细胞的刺激而产生的HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞产生1FN-γ的能力，所述T2细胞用序列号108、109、110、113、114、115、116、117的肽进行脉冲。标号11表示关于序列号118的阴性对照的肽的结果。(2)细胞毒性评价 
接着，分析本发明中使用的从序列号108至序列号110以及从序列号113至序列号117的肽是否呈递在HLA-A0201阳性、且表达CD179b的肿瘤细胞上的HLA-A0201分子上，或被此肽刺激的CD8阳性T细胞是否能够损伤HLA-A0201阳性、且表达CD179b的肿瘤细胞。将106个确认了CD 179b表达的B细胞白血病细胞株、Namalwa细胞(购自ATCC)收集到50ml容量的离心管中，加入100μCi铬51，在37℃下温育2小时。之后用含有10％胎牛血清(Gibco公司制)的RPMI培养基(Gibco公司制)清洗3次，添加到96孔V底板上，使每孔为103个，进一步向每个孔中分别加入5×104个CD8阳性T细胞，所述CD8阳性T细胞悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中、且具有被各肽刺激的HLA-A0201阳性的肽表位反应性，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到损伤的肿瘤细胞中释放的培养上清中的铬51的量，由此算出被 各肽刺激的CD8阳性T细胞的细胞毒性。其结果表明，被此肽刺激的HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞具有对Namalwa细胞的细胞毒性(图3)。用阴性对照的肽(片列号118)诱导的CD8阳性T细胞不显示细胞毒性。因此，本发明中使用的各肽(从序列号108至序列号110以及从序列号113至序列号117)为呈递到HLA-A0201阳性、且表达CD179b的肿瘤细胞上的HLA-A0201分子上的肽，进一步表明，该肽具有诱导能够损伤上述肿瘤细胞的CD8阳性细胞毒性T细胞的能力。 
需要说明的是，如上所述，细胞毒性为下述结构：混合105个由本发明中使用的各肽刺激诱导的CD8阳性T细胞与103个参入了铬51的B细胞白血病株Namalwa，培养4小时，培养后测定释放到培养基中的铬51的量，以下表示根据计算式*算出的CD8阳性T细胞针对Namalwa细胞的细胞毒性的结果。 
*式：细胞毒性(％)＝由加入了CD8阳性T细胞时的Namalwa细胞释放的铬51游离量÷由加入了1N盐酸的靶细胞释放的铬51游离量×100。 
需要说明的是，图3中，横轴的标号12、13、14、15、16、17、18、19，分别表示HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞对Namalwa细胞的细胞毒性，所述T细胞使用序列号108、109、110、113、114、115、116、117刺激。标号20表示使用阴性对照的肽(序列号118)诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒性。 
实施例6：刺激HLA-A24阳性CD8阳性T细胞的来自GD179b的细胞毒性T细胞抗原表位的确定 
(1)生成IFN-γ的能力 
与实施例5(1)同样地，为了分析实施例3(2)中诱导的肽表位反应性CD8阳性T细胞对肽表位的特异性，向5×104个使用序列号110、111、112、115、116的肽脉冲的、表达HLA-A24分子的JTK-LCL细胞(购自理化学研究所)(以10μg/ml的浓度向AIM-V培养基中添加各肽，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时)中 添加5×103个上述T细胞，在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中、于96孔板中培养24小时。取出培养后的上清，根据ELISA法测定IFN-γ的产生量。结果，与使用没有脉冲肽的JTK-LCL细胞的孔的培养上清相比，确认了在使用脉冲了序列号110、111、112、115、116的肽的JTK-LCL细胞的孔的培养上清中产生IFN-γ(图4)。由该结果表明，上述肽为特异性地增殖刺激HLA-A24阳性CD8阳性T细胞，为具有诱导IFN-γ产生的能力的T细胞表位肽。 
需要说明的是，图4中，横轴的标号21、22、23、24、25，分别表示由于来自JTK-LCL细胞的刺激而产生的HLA-A24阳性CD8阳性T细胞产生IFN-γ的能力，所述JTK-LCL细胞用序列号110、111、112、115、116的肽进行脉冲。标号26表示关于序列号118的阴性对照的肽的结果。(2)细胞毒性评价 
接着，采用与实施例(5)同样的方法，分析本发明中使用的序列号110、111、112、115、116的肽是否呈递在HLA-A24阳性、且表达CD 179b的细胞上的HLA-A24分子上，或被该肽刺激的CD8阳性T细胞是否能够损伤HLA-A24阳性、且表达CD179b的细胞。将106个HLA-A24阳性、且表达CD179b的JTK-LCL细胞收集到50ml容量的离心管中，加入100μCi的铬51，在37℃下温育2小时。之后用含有10％胎牛血清的RPMI培养基清洗3次，添加到96孔V底板上，使每1个孔为103个，进一步向各个孔中分别添加5×104个CD8阳性T细胞，所述CD8阳性T细胞悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中、且具有被各肽刺激的HLA-A24阳性的肽表位反应性，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到损伤的细胞中释放的培养上清中的铬51的量，由此算出被各肽刺激的CD8阳性T细胞的细胞毒性。其结果表明，被该肽刺激的HLA-A24阳性的CD8阳性T细胞具有对JTK-LCL细胞的细胞毒性(图5)。因此，本实施例中使用的各肽(序列号110、111、112、115、116)为呈递到HLA-A24阳性、且表达CD179b的细胞上的HLA-A24分子上的肽，进而表明，该肽具有诱导能够损伤上述细胞的CD8阳性细胞毒性T细胞的能力。用阴性对照的肽(序列号118)诱导的CD8阳性T细胞不显示细胞毒性。
需要说明的是，图5中，横轴的标号27、28、29、30、31，分别表示HLA-A24阳性的CD8阳性T细胞对JTK-LCL细胞的细胞毒性，所述T细胞使用序列号110、111、112、115、116的肽刺激。标号32表示用阴性对照的肽(序列号118)诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒性。 
实施例7：使用重组蛋白质的癌检测 
(1)犬的癌检测 
采集153确认到恶性肿瘤的患病犬和264只健康犬的血液，分离血清。使用实施例2中制备的来自犬的癌抗原蛋白(序列号5的氨基酸序列中：5号～120号)和抗犬1gG抗体，用ELISA法测定与该多肽特异性反应的血清中的IgG抗体效价。 
制备的多肽的固定化如下进行：将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释到100μg/mL的重组蛋白质溶液以100μL/孔添加到96孔固定化氨基培养板(Immobilizer Amino plate)(Nunc公司制)中，在4℃下静置一晚。封闭如下进行，即，以100μL/孔加入下述溶液，所述溶液是将4g Block Ace粉末(DS Pharma Biomedical株式会社制)溶解在100ml精制水中，将所得的溶液用精制水稀释4倍得到的溶液(以下，封闭溶液)，在室温下振荡1小时。以100μL/孔添加使用稀释时中使用的封闭溶液的稀释1000倍的血清，在室温下振荡3小时使其反应。用含有0.05％Tween20(和光纯药工业公司制)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下PBS-T)清洗3次，以100μL/孔加入用封闭溶液稀释了3000倍的HRP修饰犬1gG抗体(Goat anti Dog IgG(-H+L)HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)，在室温下振荡1小时使其反应。用PBS-T清洗3次，以100μl/孔添加HRP基质TMB(1-Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)，PIERCE公司)，在室温下进行30分钟酶基质反应。之后，以100μl/孔加入0.5M硫酸溶液(Sigma-Aldrich Japan公司制)停止反应后，用酶标仪 (Microplate reader)测定450nm处的吸光度。作为对照，将没有固定化制备的重组蛋白质的、使罹癌犬血清不反应的情况与上述同样地进行并比较。 
作为使用上述癌检测的癌症种类，使用通过病理诊断确诊为恶性的112个乳癌试样、31个淋巴瘤试样及10个白血病试样。 
上述来自罹癌犬生物体的血清显示出显著高的针对重组蛋白质的抗体效价。表明利用本检测法判断为恶性是健康犬平均值的2倍以上时，可以判断乳癌中61个试样(54％)、淋巴瘤中21个试样(71％)、白血病中7个试样(70％)分别为恶性。另外，使用通过病理诊断确诊为良性的30只乳腺肿瘤患病犬的血清，同样地进行检查，结果检测出健康犬平均值2倍以上值的试样数为0。 
同样地，使用实施例2中制备的来自人的癌抗原蛋白(序列号3的氨基酸序列)与抗犬IgG抗体，用ELISA法测定与上述各罹癌犬血清试样中的该多肽特异性反应的IgG抗体效价，结果表明，可以判断乳癌中56个试样(50％)、淋巴瘤中18个试样(58％)、白血病中5个试样(50％)分别为恶性。 
另外，使用从末期癌症患病犬收集的胸水、腹水，进行与上述同样的检测，结果可以检测出与通过使用血清的该检测法的结果同样的值，能够诊断为癌。 
(2)人的癌检测 
使用上述使用的来自人的癌抗原蛋白(序列号3的氨基酸序列)与抗人IgG抗体，与上述同样地测定与该多肽特异性反应的健康人血清中的IgG抗体效价。用封闭溶液将HRP修饰抗人IgG抗体(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L)Conj ugate：Zymed Laboratories公司制)稀释10000倍，用作2次抗体。作为阳性对照，使用蛋清白蛋白抗原，所述蛋清白蛋白抗原用磷酸盐缓冲生理盐水配制为50μg/mL且被固定化。结果，在450m处的吸光度，对于蛋清白蛋白抗原，7个健康人显示了较高的平均值，为0.45。另一方面，对于上述多肽，完全检测不到，为0。 
进而，与上述同样地，对于17个来自患有恶性乳癌的患者的血清的试样(购自Promeddx公司)，与上述同样地测定与来自人的癌抗原蛋白(序列号3的氨基酸序列)特异性反应的血清中的IgG抗体效价。结果，在450nm处的吸光度，对于上述多肽，17个乳癌患者显示了较高的平均值，为0.28。因此，表明在人中也可以通过该方法检测癌症。 
产业上的可利用性 
本发明提供了含有发挥针对乳癌、白血病、淋巴瘤等癌(肿瘤)的抗肿瘤活性的多肽的免疫诱导剂，因此对癌的治疗有用。另外，本发明提供了新型的癌的检测方法，因此对癌的诊断有用。 

Claims (4)

1.多肽或重组载体在制备用于治疗和/或预防动物的乳癌、白血病或淋巴瘤的免疫诱导剂中的应用，所述多肽为选自以下(a)～(b)的多肽类、且具有免疫诱导活性的至少一个多肽，所述重组载体含有编码所述多肽的多核苷酸、且能够在生物体内表达所述多肽，
(a)由序列表的序列号3或5表示的氨基酸序列组成的多肽，
(b)由序列表的序列号108、序列号109、序列号110、序列号111、序列号112、序列号113、序列号114、序列号115、序列号116或序列号117表示的氨基酸序列组成的多肽。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述多肽为抗原呈递细胞的处理剂。
3.如权利要求1或2所述的应用，还含有免疫增强剂。
4.一种乳癌、白血病或淋巴瘤的检测用试剂，含有与针对以下(a)～(b)中任一多肽在生物体内被诱导的抗体发生抗原抗体反应的多肽，
(a)由序列表的序列号3或5表示的氨基酸序列组成的多肽，
(b)由序列表的序列号108、序列号109、序列号110、序列号111、序列号112、序列号113、序列号114、序列号115、序列号116或序列号117表示的氨基酸序列组成的多肽。
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