BRPI0910513B1

BRPI0910513B1 - Uso de pelo menos um polipeptídeo, método para a detecção de câncer de mama e leucemia in vitro, e reagente para a detecção de câncer de mama e leucemia

Info

Publication number: BRPI0910513B1
Application number: BRPI0910513-1A
Authority: BR
Inventors: Okano Fumiyoshi; Masaki Shimizu; Saito Takanori
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 2008-07-10
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2020-06-16
Also published as: CA2730088C; MX2011000116A; CN102089001B; CA2730088A1; WO2010005069A1; RU2011104704A; EP2319533B1; DK2319533T3; ES2633468T3; US8901082B2; JP5703562B2; BRPI0910513B8; AU2009270182B2; CN102089001A; BRPI0910513A2; JPWO2010005069A1; EP2319533A1; EP2319533A4; PL2319533T3; US20110130343A1

Abstract

uso de pelo menos um polipeptídeo, método para a detecção de câncer de mama e leucemia in vitro, e reagente para a detecção de câncer de mama e leucemia a presente invenção descreve um agente indutor de imunidade que compreende como ingrediente(s) eficaz(es) pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir dos polipeptídeos a seguir, o(s) polipeptídeo(s) que possui(em) atividades/atividade indutora de imunidade, ou que possui(em) como ingrediente(s) eficaz(es) um vetor(es) recombinante(s) que compreende polinucleotídeo(s) que codificam o(s) polipeptídeo(s) e os que é/são capazes de expressar o(s) polipeptídeo(s) in vivo podem ser usados para terapia e/ou profilaxia de câncer: (a) um polipeptídeo que consiste, essencialmente, em pelo menos 7 aminoácidos consecutivos em qualquer uma das sequências de aminoácidos de números ímpares dentre as seq id n°s: 3 a 95; (b) um polipeptídeo que apresenta identidade de sequência de pelo menos 90% com o polipeptídeo (a) que consiste, essencialmente, em pelo menos 7 aminoácidos; e (c) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial do mesmo. ademais, já que os polipeptídeo(s) acima reagem com os anticorpos que existe especificamente no soro de um paciente com câncer, é possível detectar o câncer em um ser vivo através da medição dos anticorpos em uma amostra.

Description

“USO DE PELO MENOS UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE CÂNCER DE MAMA E LEUCEMIA IN VITRO, E REAGENTE PARA A DETECÇÃO DE CÂNCER DE MAMA E LEUCEMIA”

Campo Da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um novo agente de indução de imunidade útil como agente profilático e/ou terapêutico para o câncer. Além disso, a presente invenção se refere a um novo método para detecção de câncer.

Antecedentes Da Invenção

[002] O câncer é a causa de morte mais comum dentre todas as causas de morte e as terapias executadas são, portanto, no presente momento, principalmente tratamento cirúrgico em combinação à radioterapia e quimioterapia. Apesar do desenvolvimento de novos métodos cirúrgicos e da descoberta de novos agentes anticâncer atualmente, os resultados de tratamento de cânceres não foram muito aprimorados no presente, exceto para alguns cânceres. Atualmente, em virtude do desenvolvimento na biologia molecular e imunologia ao câncer, os antígenos de câncer reconhecidos pelas células T citotóxicas reativas com cânceres, bem como os genes que codificam os antígenos de câncer, foram identificados e elevaram-se as expectativas para imunoterapias de antígeno específico (Literatura de Não Patente 1).

[003] Na imunoterapia, a fim de reduzir os efeitos colaterais, é necessário que o peptídeo, polipeptídeo ou proteína reconhecida como o antígeno dificilmente existam em células normais e existam especificamente em células cancerosas. Em 1991, Boon et al. de Ludwig Institute na Bélgica isolou um antígeno de melanoma humano MAGE 1, que é reconhecido através de células T CD8-positivo, através de um método de clonagem de expressão de cDNA com o uso de uma linhagem celular autóloga de câncer e células T reativas ao câncer (Literatura de Não Patente 2). Por conseguinte, o método SEREX (identificações sorológicas de antígenos através de clonagem de expressão

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2/64 recombinante), sendo que os antígenos de tumor reconhecidos por anticorpos produzidos no ser vivo de um paciente com câncer em resposta ao câncer do próprio paciente são identificados através da aplicação de um método de clonagem de expressão de gene, foi reportado (Literatura de Não Patente 3; Literatura de Patente 1) e diversos antígenos de câncer foram isolados através deste método (Literaturas de Não Patente 4 a 9). Usando uma parte disto como alvo, foram iniciados os testes clínicos para imunoterapia contra o câncer.

[004] Por outro lado, como em seres humanos, inúmeros tumores como câncer de glândula mamária, leucemia e linfoma são conhecidos em cachorros e gatos e os mesmos também, são, estatisticamente, os maiores causadores de doenças em cachorros e gatos. No entanto, neste momento, não existem nenhum agente terapêutico e agente profilático que sejam eficazes para cânceres em cachorros e gatos. A maioria dos tumores em cachorros e gatos é percebida pelos donos apenas após o avanço do crescimento e, em muitos casos, já é muito tarde para visitar um hospital para receber excisão cirúrgica do tumor ou administração de um fármaco humano (um preparo anticâncer ou similar), d modo que aqueles cachorros e gatos muitas vezes morrem logo após o tratamento. Sob tais circunstâncias, se agentes terapêuticos e agentes profiláticos para câncer eficazes para cachorros e gatos se tornarem disponíveis, espera-se que seus usos para cânceres caninos sejam desenvolvidos.

[005] Já que uma detecção precoce de câncer leva a resultados de tratamento satisfatórios, é exigido um método para detectar câncer que pode ser facilmente executado através de urina, soro de teste ou similar sem sobrecarga econômica e física aos pacientes com câncer. Recentemente, métodos, nos quais os produtos de tumor como marcadores de tumor são medidos, são amplamente usados como métodos de diagnóstico com o uso de sangue ou urina. Os exemplos dos produtos de tumor incluem antígenos relacionados ao tumor, enzimas, proteínas específicas, metabólitos, genes de

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3/64 tumor, produtos de genes de tumor e genes supressores de tumor e, em alguns cânceres, um antígeno carcinoembriônico CEA, glicoproteínas CA19-9 e CA125, um antígeno específico para próstata PSA, calcitonina que é um hormônio de peptídeo produzido na tiróide e similares são utilizados como marcadores de tumor em diagnose de câncer (Literatura de Não Patente 10). No entanto, na maioria dos tipos de cânceres, não existe nenhum marcador de tumor útil para diagnose de câncer. Adicionalmente, já que a maioria dos marcadores de tumor conhecidos atualmente existe apenas em pequenas quantidades (por exemplo, na ordem de pg/mL) no fluido corpóreo, sua detecção requer um método de medição altamente perceptivo ou uma técnica especial. Sob tais circunstâncias, se for fornecido um novo método de detecção de câncer, através do qual podem ser detectados vários cânceres através de operações simples, seu uso para diagnose de vários cânceres deverá ser desenvolvido.

[006] CD179b é conhecido por ser uma parte da cadeia leve substituta de imunoglobulina e por ser expresso sobre as superfícies de membrana de células precursoras de células B (células pré-B e células pró-B). Isto desaparece após a diferenciação de células B e não é expresso em células B maduras. No entanto, CD179b é conhecido por ser expresso em células de leucemia (leucemia de célula pré-B) produzidas pela cancerização de células pré-B (Literaturas de Não Patente 10 e 11). Adicionalmente, CD179b é conhecido por também ser expresso em células de linfoma (linfoma de célula pré-B) produzidas pela cancerização de células pré-B e capaz de ser usado como um marcador de diagnóstico para linfoma de célula pré-B (Literatura de Não Patente 12). No entanto, sua expressão específica não foi relatada para células de leucemia diferente das células de leucemia de célula pré-B, linfomas diferentes de linfoma de célula pré-B, células de câncer de mama e similares. Adicionalmente, não ouve nenhum relato sugerindo que a acentuação da imunidade contra CD179b é útil para terapia e/ou profilaxia

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4/64 do câncer.

Literaturas Do Estado da Técnica

[007] Documentos de Patente:

Documento 1: US 5.698.396 B.

[008] Documentos não patentários:

Documento não patentário 1: Tsuyoshi Akiyoshi, “Cancer and Chemotherapy”, 1997, Volume 24, páginas 551 a 519;

Documento não patentário 2: Bruggen P. et al., Science, 254:1643 a 1647 (1991);

Documento não patentário 3: Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 92:11810 a 11813 (1995);

Documento não patentário 4: Int. J. Cancer, 72:965 a 971 (1997);

Documento não patentário 5: Cancer Res., 58:1034 a 1041 (1998);

Documento não patentário 6: Int. J. Cancer, 29:652 a 658 (1998);

Documento não patentário 7: Int. J. Oncol., 14:703 a 708 (1999);

Documento não patentário 8: Cancer Res., 56:4766 a 4772 (1996);

Documento não patentário 9: Hum. Mol. Genet 6:33 a 39 (1997);

Documento não patentário 10: Adv. Immunol., 63:1 a 41 (1996);

Documento não patentário 11: Blood, 92:4317 a 4324 (1998);

Documento não patentário 12: Modern Pathology, 17:423 a 429 (2004);

Descrição Resumida Da Invenção

[009] A presente invenção tem como objetivo descobrir um novo polipeptídeo útil como agente para terapia e/ou profilaxia e/ou similar de câncer, fornecendo, deste modo, o uso do polipeptídeo como agente de indução de imunidade. A presente invenção também tem como objetivo fornecer um método para detecção de câncer, que é útil para diagnosticar câncer.

[010] Os inventores da presente invenção estudaram de modo intensivo para obter, através do método SEREX utilizando soro de um paciente

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5/64 canino, a partir do qual foi preparado uma biblioteca de cDNA derivado de tecido de câncer de mama canino, sendo que o cDNA codifica uma proteína que se liga aos anticorpos existentes no soro derivado do ser vivo portador de tumor e, com base no cDNA, os polipeptídeos CD179b caninos que têm as sequências de aminoácidos de números ímpares das SEQ ID n°:5 a 95 (isto é, SEQ ID n°:5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 91 e 93) da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA foram preparados. Adicionalmente, com base em um gene homólogo humano dos genes obtidos, um polipeptídeo CD179b humano que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:3 foi preparado e, similarmente, com base em um gene homólogo bovino, um polipeptídeo CD179b bovino que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:95 foi preparado. Os inventores da presente invenção verificaram então que estes polipeptídeos CD179b são especificamente expressos em células de linfoma, leucemia e câncer de mama. Adicionalmente, verificaram que, através da administração de tais CD179b a um ser vivo, os imunócitos contra CD179b podem ser induzidos no ser vivo, e um tumor no ser vivo que expressa CD179b pode ser regredido. Adicionalmente, os inventores da presente invenção verificaram que um vetor recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CD179b ou um fragmento do mesmo, de tal modo que o mesmo possa ser expresso, induz um efeito antitumoral contra o câncer que expressa CD179b no ser vivo.

[011] Adicionalmente, os inventores da presente invenção verificaram que um polipeptídeo parcial em uma proteína CD179b possui capacidade para ser apresentado através de células apresentadoras de antígeno, permitindo, deste modo, a ativação e crescimento de células T citotóxicas específicas para o peptídeo (atividade de indução de imunidade) e, portanto, que o peptídeo é útil para terapia e/ou profilaxia de câncer e, adicionalmente, que as células apresentadoras de antígeno em contato com o peptídeo e as células T em contato com as células apresentadoras de antígeno

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6/64 são úteis para a terapia e/ou profilaxia de câncer. Adicionalmente, os inventores da presente invenção verificaram que, uma vez que um polipeptídeo recombinante preparado com base na sequência de aminoácido da proteína CD179b mencionada acima reage especificamente apenas com soro de um ser vivo portador de tumor, o câncer pode ser detectado através disto. Com base na descrição acima, os inventores da presente invenção alcançaram a realização do pedido em questão.

[012] Assim, a presente invenção apresenta as seguintes características:

(1) Um agente de indução de imunidade que compreende, como ingrediente eficaz, pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir dos polipeptídeos (a) a (c) abaixo, em que o(s) polipeptídeo(s) possui(em) atividade(s) de indução de imunidade ou, dito agente compreende, como ingrediente eficaz, vetor(es) recombinante(s) que compreende(m) polinucleotídeo(s) que codifica(m) o(s) polipeptídeo(s) e é(são) capaz(es) de expressar o(s) polipeptídeo(s) in vivo;

em que:

(a) é um polipeptídeo que consiste essencialmente em pelo menos 7 aminoácidos consecutivos em qualquer uma das sequências de aminoácido de números ímpares dentre as SEQ ID n°:3 a 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA;

(b) é um polipeptídeo que possui uma identidade de sequência de pelo menos 90% com o polipeptídeo (a) e que consiste essencialmente de pelo menos 7 aminoácidos; e (c) é um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial do mesmo.

(2) O agente de indução de imunidade de acordo com o item (1) acima, em que o polipeptídeo (b) apresenta uma identidade de sequência de

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7/64 pelo menos 95% com o polipeptídeo (a).

(3) O agente de indução de imunidade de acordo com o item (1) acima, sendo que cada polipeptídeo que possui atividade de indução de imunidade é um polipeptídeo que consiste essencialmente em pelo menos 7 aminoácidos consecutivos em qualquer uma das sequências de aminoácidos de números ímpares dentre as SEQ ID n°:3 a 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA, ou um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo como uma sequência parcial do mesmo.

(4) O agente de indução de imunidade de acordo com o item (3) acima, sendo que cada polipeptídeo que possui atividade de indução de imunidade é um polipeptídeo que possui qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos de números ímpares dentre as SEQ ID n°:3 a 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA.

(5) O agente de indução de imunidade de acordo com o item (3) acima, sendo que cada polipeptídeo que possui atividade de indução de imunidade é um polipeptídeo que consiste essencialmente de pelo menos 7 aminoácidos consecutivos na região de aa 1-34 ou aa 52-75 em qualquer uma das sequências de aminoácidos de números ímpares dentre as SEQ ID n°:3 a 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA, ou um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo como uma sequência parcial do mesmo.

(6) O agente de indução de imunidade de acordo com o item (5) acima, sendo que cada polipeptídeo que possui atividade de indução de imunidade é um polipeptídeo que consiste essencialmente das sequências de aminoácidos selecionadas a partir de SEQ ID N°:108, SEQ ID N°:109, SEQ ID N°:110, SEQ ID N°:111, SEQ ID N°:112, SEQ ID N°:113, SEQ ID N°:114, SEQ ID N°:115, SEQ ID N°:116 ou SEQ ID N°:117 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA, ou um polipeptídeo que compreende como uma sequência parcial do mesmo, as sequências de aminoácidos selecionadas a partir de SEQ ID N°:108, SEQ ID

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N°:109, SEQ ID N°:110, SEQ ID N°:111, SEQ ID N°:112, SEQ ID N°:113, SEQ ID N°:114, SEQ ID N°:115, SEQ ID N°:116 ou SEQ ID N°:117 na LISTAGEM DE SEQUÊNCIA, sendo que o polipeptídeo possui 8 a 12 resíduos de aminoácido.

(7) O agente de indução de imunidade de acordo com qualquer um dos itens (1) a (6) acima, que compreende um ou mais dos polipeptídeos como ingrediente eficaz.

(8) O agente de indução de imunidade de acordo com o item (7) acima, sendo que o(s) polipeptídeo(s) é(são) um agente(s) para tratar células apresentadoras de antígeno.

(9) O agente de indução de imunidade de acordo com qualquer um dos itens (1) a (8) acima, que é para terapia e/ou profilaxia de câncer(es) de animal.

(10) O agente de indução de imunidade de acordo com o item (9) acima, sendo que o(s) câncer(es) é(são) câncer(es) que expressa(m) o gene CD179b.

(11) O agente de indução de imunidade de acordo com o item (10), sendo que o(s) câncer(es) é(são) câncer de mama, leucemia e/ou linfoma.

(12) O agente de indução de imunidade de acordo com qualquer um dos itens (1) a (11) acima, que compreende adicionalmente um potenciador de imunidade.

(13) Uma célula apresentadora de antígeno isolada que compreende um complexo formado pelo polipeptídeo que possui atividade de indução de imunidade e uma molécula HLA.

(14) Uma célula T isolada que se liga de forma seletiva a um complexo formado pelo polipeptídeo que possui atividade de indução de imunidade e uma molécula HLA.

(15) Um método para induzir imunidade, em que o método compreende administrar a um indivíduo pelo menos um polipeptídeo selecionado

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9/64 a partir dos polipeptídeos (a) a (c) abaixo, em que o(s) polipeptídeo(s) que possui(em) atividade de indução de imunidade ou um vetor(s) recombinante(s) que compreende(m) um polinucleotídeo(s) que codifica(m) o(s) polipeptídeo(s) é(são) capazes de expressar o(s) polipeptídeo(s) in vivo;

em que:

(a) é um polipeptídeo que consiste essencialmente de pelo menos 7 aminoácidos consecutivos em qualquer uma das sequências de aminoácidos de números ímpares dentre as SEQ ID n°:3 a 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA;

(b) é um polipeptídeo que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 90% com o polipeptídeo (a) e que consiste essencialmente de pelo menos 7 aminoácidos; e (c) é um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial do mesmo.

(16) Um método para a detecção de câncer, cujo método é aplicado a uma amostra separada de um ser vivo e compreende a medição de expressão de ao menos um dentre os polipeptídeos selecionado a partir de (a) a (c) abaixo;

em que:

(b) é um polipeptídeo que tem uma identidade de sequência de pelo menos 90% com o polipeptídeo (a) e que consiste essencialmente de pelo menos 7 aminoácidos;

(c) é um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial do mesmo.

(17) O método de acordo com o item (16) acima, sendo que a

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10/64 medição de expressão do(s) polipeptídeo(s) é realizada através da medição de anticorpo(s) que pode(m) estar contido(s) na amostra através de imunoensaio, em que o(s) anticorpo(s) foi(foram) induzido(s) no ser vivo contra o(s) polipeptídeo(s) a ser(em) medido(s).

(18) Um método para a detecção de câncer, que é aplicado a uma amostra separada de um ser vivo e compreende a investigação da expressão do gene CD179b que possui uma região de codificação que apresenta qualquer uma dentre as sequências base selecionadas a partir de SEQ ID N°:1 e de números pares dentre as SEQ ID n°:4 a 94 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA em uma amostra derivada de um paciente com câncer e a comparação da mesma com o nível de expressão do gene em uma amostra derivada de um indivíduo saudável.

(19) Um reagente para a detecção de câncer, em que o reagente compreende um polipeptídeo que é submetido à reação antígeno-anticorpo com um anticorpo induzido em um ser vivo contra um polipeptídeo selecionado a partir de (a) a (c) abaixo;

em que:

(b) é um polipeptídeo que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 90% com o polipeptídeo (a) e que consiste essencialmente em pelo menos 7 aminoácidos; e (c) é um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial do mesmo.

[013] É fornecido, através da presente invenção, um novo agente de indução de imunidade útil para terapia e/ou profilaxia e/ou similares de câncer.

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Conforme particularmente descrito nos Exemplos mencionados abaixo, ao administrar o polipeptídeo usado na presente invenção a um animal portador de tumor, os imunócitos podem ser induzidos no corpo do animal portador de tumor e um câncer que já tenha ocorrido pode ser reduzido ou regressado.

[014] Adicionalmente, através da presente invenção, é fornecido um novo método para detecção de câncer. Uma vez que a medição da expressão do polipeptídeo em uma amostra através do método da presente invenção habilita a detecção de pequenos cânceres invisíveis e cânceres que existem em partes profundas de um corpo, o método também é útil para detecção precoce de cânceres em exames médicos e similares. Se o método da presente invenção for usado no acompanhamento de pacientes após terapia contra câncer, a recorrência do câncer pode ser detectada em seu estágio precoce. Além disso, o método da presente invenção torna possível avaliar o estágio da progressão do câncer como crescimento do tumor, invasão do tumor nos tecidos circundantes e metástase do câncer aos linfonodos e órgãos distantes.

Breve Descrição das Figuras

[015] A Figura 1 é um diagrama que apresenta os padrões de expressão do gene que codifica a proteína CD179b em linhagens celulares de tumor ou tecidos normais. A referência numérica 1 representa o padrão de expressão do gene que codifica a proteína CD179b; e a referência numérica 2 representa o padrão de expressão do gene GAPDH. Na Figura 1, a referência numérica 1 na ordenada representa o padrão de expressão do gene identificado conforme descrito acima e a referência numérica 2 representa o padrão de expressão do gene GAPDH como o controle para comparação.

[016] Na Figura 2, as referências numéricas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 na abscissa indicam as capacidades de produção de IFN-γ de células T CD8positivo HLA-A0201-positivo devido ao estímulo de células T2 pulsadas com os peptídeos de SEQ ID n°:108, 109, 110, 113, 114, 115, 116 e 117,

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12/64 respectivamente. A referência numérica 11 indica o resultado para o peptídeo de SEQ ID N°:118 usado como o controle negativo (peptídeo que possui sequência fora do escopo da presente invenção).

[017] Na Figura 3, as referências numéricas 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19 na abscissa indicam as atividades citotóxicas de células T CD8-positivo HLA-A0201-positivo contra células Namalwa, cujas células foram estimuladas com o uso de SEQ ID n°:108, 109, 110, 113, 114, 115, 116 e 117, respectivamente. A referência numérica 20 indica a atividade citotóxica de células T CD8-positivo induzidas com o uso do peptídeo do controle negativo (SEQ ID N°:118).

[018] Na Figura 4, as referências numéricas 21, 22, 23, 24 e 25 na abscissa indicam as capacidades de produção de IFN-γ de células T CD8positivo HLA-A24-positivo devido ao estímulo de células JTK-LCL pulsadas com os peptídeos de SEQ ID n°:110, 111, 112, 115 e 116, respectivamente. A referência numérica 26 indica o resultado para o peptídeo de SEQ ID N°:118 usado como o controle negativo.

[019] Na Figura 5, as referências numéricas 27, 28, 29, 30 e 31 indicam as atividades citotóxicas de células T CD8-positivo HLA-A24-positivo estimuladas com os peptídeos de SEQ ID N°:110, 111, 112, 115 e 116, respectivamente, contra células JTK-LCL. A referência numérica 32 indica a atividade citotóxica de células T CD8-positivo induzidas com o uso do controle negativo (SEQ ID N°:118).

Descrição Detalhada da Invenção POLIPEPTÍDEO

[020] Os exemplos do polipeptídeo contido no agente de indução de imunidade da presente invenção como um ingrediente eficaz incluem um ou mais polipeptídeo(s) selecionados a partir dos polipeptídeos de (a), (b) e (c) abaixo:

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13/64 (a) um polipeptídeo que consiste essencialmente em pelo menos 7 aminoácidos consecutivos em um polipeptídeo que possui uma dentre as sequências de aminoácidos de números ímpares dentre as SEQ ID n°: 3 a 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA (isto é, SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 e 95) e possui atividade de indução de imunidade;

(b) um polipeptídeo que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 90% com o polipeptídeo (a), que consiste essencialmente em pelo menos 7 aminoácidos e que possui atividade de indução de imunidade; e (c) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial do mesmo e que possui atividade de indução de imunidade.

[021] Para uso no presente documento, o termo “polipeptídeo” significa uma molécula formada por uma pluralidade de aminoácidos juntamente ligados por ligações de peptídeo e inclui não apenas moléculas de polipeptídeo que têm um grande número de aminoácidos constituindo as mesmas, mas também moléculas de baixo peso molecular que um número pequeno de aminoácidos (oligopeptídeos) e moléculas de comprimento total. Na presente invenção, as proteínas constituídas pelos comprimentos totais de SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 e 95 também estão incluídas nisto.

[022] De acordo com a presente invenção, o termo “que possui uma sequência de aminoácidos” significa que os resíduos de aminoácido estão ordenados em uma ordem específica. Portanto, por exemplo, “um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 3” significa um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de Leu Leu Arg Pro ... (snip) . Ala Glu Cis Ser apresentada pela SEQ ID N°:3, cujo polipeptídeo possui tamanho de 176 resíduos de aminoácido. Adicionalmente, por exemplo, “polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 3” também pode ser abreviado como “polipeptídeo de SEQ ID N°: 3”. Isto também se aplica ao termo “que possui uma

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14/64 sequência base”.

[023] De acordo com a presente invenção, o termo “atividade de indução de imunidade” significa uma capacidade para induzir imunócitos que secretam citocinas como interferon em um ser vivo.

[024] A possibilidade de um polipeptídeo ter uma atividade de indução de imunidade pode ser confirmada através do uso, por exemplo, do ensaio ELISPOT conhecido. Mais particularmente, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos abaixo, as células como células mononucleares sanguíneas periféricas são obtidas de um ser vivo para a qual um polipeptídeo cuja atividade de indução de imunidade deve ser avaliada foi administrado, cujas células são, então, co-cultivadas com o polipeptídeo, seguido da medição da(s) quantidade(s) de uma citosina(s) e/ou uma quimiocina(s) como IFN-γ e/ou interleucina (IL) produzida pelas células com o uso de um anticorpo específico, medindo, deste modo, o número de imunócitos nas células, que habilita a avaliação da atividade de indução de imunidade.

[025] Alternativamente, conforme descritos nos Exemplos descritos posteriormente, quando um polipeptídeo recombinante preparada com base na sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 for administrado a um animal portador de tumor, o tumor pode ser reduzido ou regredido por sua atividade de indução de imunidade. Assim, a atividade de indução de imunidade citada acima pode ser avaliada também como uma capacidade para suprimir o crescimento de células cancerosas que expressam o polipeptídeo de SEQ ID N°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95, ou para causar redução ou desaparecimento de um tecido canceroso (tumor) (referido doravante como “atividade anti-tumor”). A atividade anti-tumor de um polipeptídeo pode ser confirmada por, por exemplo, observação se o tumor é reduzido ou regredido quando o polipeptídeo foi administrado a um ser vivo portador de tumor, conforme descrito mais particularmente nos Exemplos

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15/64 abaixo.

[026] Alternativamente, a atividade anti-tumor de um polipeptídeo pode ser avaliada também por observação se as células T estimuladas com o polipeptídeo (isto é, células T colocadas em contato com as células apresentadoras de antígeno que apresentam o polipeptídeo) apresentam uma atividade citotóxica contra as células de tumor in vitro. O contato entre as células T e as células apresentadoras de antígeno pode ser executado através de cocultivo de ambas em um meio líquido, conforme mencionado abaixo. A medição da atividade citotóxica pode ser executada por, por exemplo, um método conhecido denominado ensaio de liberação ⁵¹Cr descrito em Int. J. Cancer, 58: página 317, 1994.

[027] Nos casos em que o polipeptídeo é usado para terapia e/ou profilaxia de câncer, a avaliação da atividade de indução de imunidade é executada, de preferência, com o uso da atividade anti-tumor como um índice, embora o índice não seja restrito.

[028] As sequências de aminoácidos SEQ ID n°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ... 93 e 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA são as sequências de aminoácidos de um polipeptídeo que se liga a um anticorpo que existe, especificamente, no soro derivado de um cachorro portador de tumor no método SEREX que usa soro do paciente canino do qual uma biblioteca de cDNA derivado de câncer de glândula mamária canina foi preparada ou a sequência de aminoácidos de CD179b isolado como um fator homólogo humano (homólogo) do polipeptídeo (vide Exemplo 1 abaixo). O polipeptídeo (a) é um polipeptídeo que consiste essencialmente em pelo menos 7 aminoácidos consecutivos, de preferência, 8, 9 ou pelo menos 10 aminoácidos consecutivos em um polipeptídeo que possui qualquer uma das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID N°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 e 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA e possui uma atividade de indução de imunidade. Conforme

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16/64 conhecido na técnica, um polipeptídeo que possui pelo menos cerca de 7 resíduos de aminoácido pode exercer sua antigenicidade e imunogenicidade. Assim, um polipeptídeo que possui pelo menos 7 resíduos de aminoácido consecutivos nas sequências de aminoácidos SEQ ID N°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 pode possuir uma atividade de indução de imunidade, de modo que a mesma possa ser usada para a preparação do agente de indução de imunidade da presente invenção.

[029] Como um princípio de indução imunológica através da administração de um polipeptídeo antigênico de câncer, o seguinte processo é conhecido: o polipeptídeo é incorporado em uma célula apresentadora de antígeno e, então, degradado em fragmentos menores através de peptidase na célula, seguido pela apresentação dos fragmentos na superfície da célula. Os fragmentos são, então, reconhecidos através de uma célula T citotóxica ou similar, que extermina seletivamente as células apresentadoras de antígeno. O tamanho do polipeptídeo apresentado sobre a superfície da célula apresentadora de antígeno é relativamente pequeno e cerca de 7 a 30 aminoácidos. Portanto, do ponto de vista da apresentação do mesmo sobre a superfície da célula apresentadora de antígeno, um modo preferencial do polipeptídeo (a) é um polipeptídeo composto de cerca de 7 a 30 aminoácidos consecutivos nas sequências de aminoácidos SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 e, mais preferencialmente, um polipeptídeo composto por 8 a 30 ou 9 a 30 aminoácidos é suficiente como o polipeptídeo (a). Em alguns casos, estes polipeptídeos relativamente pequenos são apresentados diretamente sobre a superfície das células apresentadoras de antígeno sem a incorporação dos mesmos nas células apresentadoras de antígeno.

[030] Adicionalmente, já que um polipeptídeo incorporado em uma célula apresentadora de antígeno é clivado em sítios aleatórios através de peptidase na célula para gerar vários fragmentos de polipeptídeo, que são,

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17/64 então, apresentados sobre a superfície da célula apresentadora de antígeno, a administração de um grande polipeptídeo como toda a região de SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93ou 95 causa, inevitavelmente, a produção de fragmentos de polipeptídeo através da degradação disto na célula apresentadora de antígeno, cujos fragmentos são eficazes para indução imunológica através da célula apresentadora de antígeno. Portanto, também para indução imunológica através de células apresentadoras de antígeno, um grande polipeptídeo pode ser usado e o polipeptídeo pode ser composto de pelo menos 30, de preferência, pelo menos 100, mais preferivelmente pelo menos 200 aminoácidos, cujo polipeptídeo ainda pode ser, de preferência, composto de toda a região de SEQ ID N°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95.

[031] Adicionalmente, os polipeptídeos da presente invenção podem ser verificados com um meio de verificação através do qual peptídeos epítopos que possuem unidades de ligação de vários tipos de HLA e composto de 8 a 12, de preferência, 9 a 10 aminoácidos podem ser pesquisados, por exemplo, Predições de Ligação de Peptídeo HLA (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html) em Bioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS), para efetuar a varredura de peptídeos que podem ser peptídeos epítopos. Mais particularmente, um polipeptídeo composto por pelo menos 7 aminoácidos consecutivos na região de aa 1-34 ou aa 52-75 nas sequências de aminoácidos SEQ ID N°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 é preferencial e no polipeptídeo de SEQ ID N°:3, os polipeptídeos de SEQ ID n°:108 to 117 são mais preferenciais.

[032] O polipeptídeo (b) é o mesmo polipeptídeo que o polipeptídeo (a) exceto que um número menor de resíduos de aminoácido é substituído, removido, adicionado e/ou inserido, que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 80%, de preferência, pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente, pelo menos

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98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% em relação à sequência original e possui atividade de indução de imunidade. É conhecido na técnica que, em geral, estes são casos nos quais um antígeno de proteína retém substancialmente a mesma antigenicidade ou imunogenicidade que a original mesmo se a sequência de aminoácidos da proteína for modificada de tal modo que um número menor de aminoácidos seja substituído, removido, adicionado e/ou inserido. Portanto, já que o polipeptídeo (b) também pode exercer uma atividade de indução de imunidade, o mesmo pode ser usado para o preparo do agente de indução de imunidade da presente invenção. Adicionalmente, o polipeptídeo (b) também é, de preferência, o mesmo polipeptídeo que possui as sequências de aminoácidos dentre as SEQ ID N°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 exceto aquele ou diversos resíduos de aminoácido são substituídos, removidos, adicionados e/ou inseridos.

[033] De acordo com a presente invenção, o termo “identidade de sequência” em relação às sequências de aminoácidos ou sequências base significa o valor calculado através do alinhamento de duas sequências de aminoácidos (ou sequências base) a serem comparadas de tal modo que o número de resíduos de aminoácido (ou bases) correspondentes seja o máximo entre as sequências de aminoácidos (ou sequências base), e divisão do número de resíduos de aminoácido correspondentes (ou o número de bases correspondentes) pelo número total de resíduos de aminoácido (ou o número total de bases), cujo valor é representado como um percentual (%). Quando o alinhamento é executado, um intervalo (s) é/são inseridos em uma ou em ambas as sequências a serem comparadas conforme necessário. Tal alinhamento de sequências pode ser executado com o uso de um programa conhecido como BLAST, FASTA ou CLUSTAL W (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 87:2264 a 2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389 a 3402, 1997). Quando um intervalo é inserido, o número descrito acima dos resíduos totais de aminoácido (ou as bases totais) é o número de resíduos (ou

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19/64 bases) calculado através da contagem de um intervalo como um resíduo de aminoácido (ou base). Quando os números assim contados dos resíduos totais de aminoácido (ou bases) são diferentes entre as duas sequências a serem comparadas, a identidade (%) é calculada através da divisão do número de resíduos de aminoácido (ou bases) correspondentes pelo número dos resíduos totais de aminoácido (ou as bases totais) na maior sequência.

[034] Dentre as substituições de resíduos de aminoácido, são preferenciais as substituições de aminoácido conservadoras. Os 20 tipos de aminoácidos que constituem as proteínas de ocorrência natural podem ser classificados em grupos, em que cada um apresenta propriedades similares, por exemplo, em aminoácidos neutros com cadeias laterais que têm baixa polaridade (Gli, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), aminoácidos neutros que têm cadeias laterais hidrofílicas (Asn, Gln, Thr, Ser, Tir, Cis), aminoácidos ácidos (Asp, Glu), aminoácidos básicos (Arg, Lis, His) e aminoácidos aromáticos (Phe, Tir, Trp, His). É conhecido que, na maioria dos casos, as substituições de aminoácidos no mesmo grupo, isto é, substituições conservadoras, não alteram as propriedades do polipeptídeo. Portanto, nos casos em que um resíduo de aminoácido no polipeptídeo (a) da presente invenção é substituído, a probabilidade de que a atividade de indução de imunidade pode se mantida pode ser alta através da condução de substituição(ões) no mesmo grupo.

[035] O polipeptídeo (c) compreende o polipeptídeo (a) ou (b) como uma sequência parcial do mesmo e possui atividade de indução de imunidade. Isto é, o polipeptídeo (c) possui outro(s) aminoácido(s) ou polipeptídeo(s) adicionados a uma extremidade ou ambas as extremidades do polipeptídeo (a) ou (b) e possui atividade de indução de imunidade. Tal polipeptídeo também pode ser usado para o preparo do agente de indução de imunidade da presente invenção.

[036] Os polipeptídeos descritos acima podem ser sintetizados

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20/64 através de, por exemplo, um método de síntese química como o método Fmoc (método fluorenilmetiloxicarbonila) ou o método tBoc (método tbutiloxicarbonila). Adicionalmente, os mesmos podem ser sintetizados através de métodos convencionais com o uso de vários tipos de sintetizadores de peptídeo comercialmente disponíveis. Adicionalmente, o polipeptídeo de interesse pode ser obtido com o uso de técnicas de engenharia genética conhecidas, através do preparo de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo descrito acima e incorpora o polinucleotídeo em um vetor de expressão, que é, então, transfectado em uma célula hospedeira, seguido da permissão para que os polipeptídeo sejam produzidos na célula hospedeira.

[037] O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo acima pode ser facilmente preparado por uma técnica de engenharia genética conhecida ou um método convencional com o uso de um sintetizador de ácido nucléico comercialmente disponível. Por exemplo, o DNA que apresenta a sequência de base da SEQ ID N°:4 pode ser preparado através da execução de PCR com o uso de um DNA cromossomal canino ou biblioteca de cDNA como modelo, e um par de primers projetados de modo que a sequência de base da SEQ ID N°:4 possa ser ampliada com o mesmo. No caso do DNA que apresenta a sequência de base da SEQ ID N°:1, esse pode ser preparado similarmente através do uso de um DNA cromossomal humano ou biblioteca de cDNA conforme o modelo. As condições de reação para a PCR podem ser ajustadas apropriadamente e os exemplos das mesmas incluem, mas não se limitam a, repetir o processo de reação de 94°C por 30 segundos (desnaturação), 55°C por 30 segundos a 1 minuto (anelamento) e 72°C por 2 minutos (extensão) durante, por exemplo, 30 ciclos, seguido pela reação a 72°C durante 7 minutos. Os métodos, condições e similares de PCR são descritos em, por exemplo, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3^a ed., A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (em particular, Capítulo 15).

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Adicionalmente, o DNA desejado pode ser isolado pela preparação de uma sonda ou primer(s) apropriados com base nas informações das sequências de base e sequências de aminoácidos de SEQ ID N°:1 a 95 da LISTAGEM DE SEQUÊNCIA no presente relatório descritivo e, pela triagem de uma biblioteca de cDNA humano, canino, bovino ou similares usando sonda(s) ou primer(s). A biblioteca de cDNA é, de preferência, preparada a partir de uma célula, órgão ou tecido que expresse a proteína de SEQ ID N°:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95. As operações descritas acima como a preparação da sonda(s) ou primer(s), construção de uma biblioteca de cDNA, triagem da biblioteca de cDNA e clonagem do gene de interesse são conhecidas pelos técnicos no assunto e podem ser executadas de acordo com os métodos descritos em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Segunda Edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989); e Ausubel et al. (descrito acima). A partir do DNA então obtido, o DNA que codifica o polipeptídeo (a) pode ser obtido. Adicionalmente, visto que os códons que codificam cada aminoácido são conhecidos, uma sequência de base de um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos específica pode ser facilmente especificada. Portanto, as sequências de base de polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo (b) e o polipeptídeo (c) também podem ser facilmente especificadas, de modo que esses polinucleotídeos possam também ser facilmente sintetizados com o uso de um sintetizador de ácido nucléico comercialmente disponível de acordo com um método convencional.

[038] As células hospedeiras não são restritas desde que possam expressar o polipeptídeo descrito acima, e os exemplos das mesmas incluem, mas não se limitam a, células procarióticas como E. coli; e células eucarióticas como células cultivadas de mamíferos, incluindo células dos rins de macaco COS 1, células do ovário de hamster chinês CHO, uma linhagem celular embrionária de rim humano HEK293 e uma linhagem celular embrionária de pele

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22/64 de camundongo NIH3T3; levedura em germinação; levedura de fissão; células do bicho da seda e células do ovo de Xenopus laevis.

[039] Nos casos em que as células procarióticas são usadas como as células hospedeiras, um vetor de expressão que possui origem que permite sua replicação em uma célula procariótica, promotor, sítio de ligação de ribossomo, sítio de multiclonagem, terminador, gene resistente a droga, gene complementar nutriente e/ou similares é usado. Os exemplos do vetor de expressão para E. coli incluem o sistema pUC, pBluescriptII, sistema de expressão pET e sistema de expressão pGEX. Ao incorporar um DNA que codifica o polipeptídeo acima em um vetor de expressão e ao transformar células hospedeiras procarióticas com o vetor, seguido pelo cultivo dos transformantes resultantes, o polipeptídeo codificado pelo DNA pode ser expresso nas células hospedeiras procarióticas. Nesse processo, o polipeptídeo também pode ser expresso como uma proteína de fusão com outra proteína (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) ou glutationa S-transferase (GST)).

[040] Nos casos em que as células eucarióticas são usadas como células hospedeiras, um vetor de expressão para as células eucarióticas que possui um promotor, sítio de splicing, sítio de adição de poli (A) e/ou similares é usado como o vetor de expressão. Os exemplos desse vetor de expressão incluem pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vetor EBV, pRS, pcDNA3, pMSG e pYES2. Da mesma maneira conforme descrito acima, através da incorporação de um DNA que codifica o polipeptídeo acima em tal vetor de expressão e da transformação de células hospedeiras eucarióticas com o vetor, seguido pelo cultivo dos transformantes resultantes, o polipeptídeo codificado pelo DNA pode ser expresso nas células hospedeiras eucarióticas. Nos casos em que pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 ou similares são usados como o vetor de expressão, o polipeptídeo acima pode ser expresso como uma proteína de fusão para a qual uma marcação como

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23/64 marcação His (por exemplo, (His)6 a (His)io), marcação FLAG, marcação myc, marcação HA ou GFP foi adicionada.

[041] Para a introdução do vetor de expressão nas células hospedeiras, os métodos conhecidos como eletroporação, o método de fosfato de cálcio, o método de lipossoma, o método de DEAE-dextran e microinjeção podem ser usados.

[042] O isolamento e purificação do polipeptídeo de interesse das células hospedeiras podem ser executados por uma combinação de operações de separação conhecidas. Os exemplos das operações de separação conhecidas incluem, mas não se limitam a, tratamento com um desnaturante como uréia ou um tensoativo; tratamento de ultrasonicação; digestão de enzima; precipitação fracional por solvente ou por sais; diálise; centrifugação; ultrafiltragem; filtragem em gel; SDS-PAGE; focalização isoelétrica; cromatografia de troca iônica; cromatografia hidrofóbica; cromatografia por afinidade e cromatografia de fase reversa.

[043] Os polipeptídeos obtidos pelo método acima, conforme mencionado acima, aqueles sob a forma de uma proteína de fusão com outra proteína arbitrária. Os exemplos da mesma incluem proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST) e com uma marcação His. Esse polipeptídeo sob a forma de uma proteína de fusão também incluído no escopo da presente invenção como o polipeptídeo (c). Adicionalmente, em alguns casos, um polipeptídeo expresso em uma célula transformada é modificado em vários modos na célula após a translação do mesmo. Esse polipeptídeo modificado após a translação do mesmo também é incluído no escopo da presente invenção desde que esse tenha uma atividade de indução de imunidade. Os exemplos dessa modificação pós-translacional incluem a eliminação de metionina N terminal, acetilação N-terminal, glicosilação, degradação limitada por uma protease intracelular, miristoilação, isoprenilação e fosforilação.

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Agente De Indução De Imunidade

[044] Conforme descrito de forma concreta nos exemplos a seguir, o polipeptídeo descrito acima que possui atividade de indução de imunidade pode causar a regressão de um tumor recentemente ocorrido quando administrado para um animal portador de tumor. Portanto, o agente de indução de imunidade da presente invenção pode ser usado como um agente profilático e/ou terapêutico para câncer.

[045] Os termos “câncer” e “tumor” usados no presente relatório descritivo significam um neoplasma maligno e são usados de forma intercambiável.

[046] Nesse caso, os cânceres a serem tratados são aqueles que expressam o gene CD179b, como cânceres que expressam o gene que codifica o polipeptídeo de SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95, de preferência, câncer de mama, leucemia e linfoma. Os exemplos desses cânceres em particular incluem, mas não são limitados a, cânceres de mama (câncer da glândula mamária, cânceres da glândula mamária combinados, tumor misto maligno de glândula mamária, adenocarcinoma papilar intraductal e similares), leucemias (leucemia linfocítica crônica e similares), linfomas (linfoma gastrointestinal, linfoma do órgão digestivo, linfoma de célula pequena/média e similares).

[047] O polipeptídeo descrito acima ou um vetor recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo e capaz de expressar o polipeptídeo in vivo pode ser usado como um método terapêutico para a indução de imunidade. Adicionalmente, esse pode ser usado como um método terapêutico para os propósitos de terapia e/ou profilaxia de câncer animal e também pode ser usado como um método terapêutico que compreende adicionalmente um potenciador de imunidade.

[048] O indivíduo animal é um mamífero como um primata, animal

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25/64 de estimação, animal doméstico ou animal para a prática de esportes, de preferência, um ser humano, cão ou gato.

[049] A rota de administração do agente de indução de imunidade da presente invenção para um ser vivo pode ser administração oral ou administração parenteral e, é de preferência, administração parenteral como administração intramuscular, administração subcutânea, administração intravenosa ou administração intraarterial. Nos casos em que o agente de indução de imunidade é usado para a terapia de câncer, esse pode ser administrado para um linfonodo regional nas proximidades do tumor a ser tratado, conforme descrito nos exemplos abaixo, com a finalidade de aprimorar sua atividade anticâncer. A dose pode ser qualquer dose desde que a dose seja eficaz para a indução de imunidade, e, por exemplo, nos casos em que o agente for usado para a terapia e/ou profilaxia de câncer, a dose poderá ser aquela eficaz para a terapia e/ou profilaxia do câncer. Adicionalmente, a dose pode variar dependendo do peso do corpo, sexo (masculino ou feminino), sintomas e similares. A dose eficaz para terapia e/ou profilaxia de câncer é apropriadamente selecionada dependendo do tamanho do tumor, do sintoma e similares, e usualmente, 0.0001 μg a 1000 μg, de preferência, 0,001 μg a 1000 μg por indivíduo animal por dia, que pode ser administrado uma única vez ou diversas vezes. O agente é, de preferência, administrado inúmeras vezes, por diversos dias a diversos meses.

[050] Conforme apresentado de maneira concreta nos exemplos abaixo, o agente de indução de imunidade da presente invenção pode causar a redução ou regressão de um tumor ocorrido recentemente. Portanto, visto que o agente pode manifestar sua atividade anticâncer também contra um pequeno número de células cancerígenas no estágio inicial, o desenvolvimento ou recorrência de câncer pode ser evitado pelo uso do antes do desenvolvimento do câncer ou após a terapia para o câncer. Isto é, o agente de indução de

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26/64 imunidade da presente invenção é eficaz tanto para a terapia quanto para a profilaxia de câncer.

[051] O agente de indução de imunidade da presente invenção pode conter apenas um polipeptídeo ou pode ser formulado pela mistura conforme apropriado com um aditivo como um veículo, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável adequado para cada modo de administração. Os métodos de formulação e aditivos que podem ser usados são bem conhecidos no campo de formulação de farmacêuticos, e qualquer dentre os métodos e aditivos pode ser usado. Os exemplos específicos dos aditivos incluem, mas não se limitam a, diluentes como soluções de tampão fisiológicas; veículos como sacarose, lactose, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol e glicina; ligantes como xarope, gelatina, goma arábica, sorbitol, cloreto de polivinila e tragacanta; e lubrificantes como estearato de magnésio, polietileno glicol, talco e sílica. Os exemplos da formulação incluem preparações orais como tabletes, cápsulas, grânulos, pós e xaropes; e preparações parenterais como inalantes, soluções de injeção, supositórios e soluções. Essas formulações podem ser preparadas pelos métodos de produção comumente conhecidos.

[052] O agente de indução de imunidade da presente invenção pode ser usado em combinação com um potenciador de imunidade capaz de aprimorar a reação imunológica em um ser vivo. O potenciador de imunidade pode estar contido no agente de indução de imunidade da presente invenção ou administrado como uma composição separada para um paciente em combinação com o agente de indução de imunidade da presente invenção.

[053] Aqui, o paciente é um animal, especificamente um mamífero, de preferência, ser humano, cão ou gato.

[054] Os exemplos do potenciador de imunidade incluem adjuvantes. Os adjuvantes podem aprimorar a reação imunológica através do fornecimento de um reservatório de antígeno (extracelularmente ou dentro de

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27/64 macrófagos), da ativação macrófagos e estimulação de grupos específicos de linfócitos, por meios disso, aprimorando a reação imunológica e, por conseguinte, a ação anticâncer. Portanto, especialmente nos casos em que o agente de indução de imunidade da presente invenção for usado para terapia e/ou profilaxia de câncer, o agente de indução de imunidade, de preferência, compreenderá um adjuvante, em adição ao polipeptídeo descrito acima como um ingrediente eficaz. Muitos tipos de adjuvantes são bem conhecidos na técnica, e qualquer desses adjuvantes pode ser usado. Os exemplos específicos dos adjuvantes incluem MPL (SmithKline Beecham) e homólogos de lipossacarídeo de Salmonella minnesota Re 595 obtido após a purificação e hidrólise ácida do lipopolissacarídeo; QS21 (SmithKline Beecham), saponina QA-21 pura purificada de um extrato de Quillja saponaria; DQS21 descrito em WO96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 e QS-L1 (So et al., “Molecules and cells”, 1997, Vol. 7, p. 178 a 186); adjuvante incompleto de Freund; adjuvante completo de Freund; vitamina E; Montanide; alume; oligonucleotídeos de CpG (por exemplo, Kreig et al., Nature, Vol. 374, p. 546 a 549); poli-I:C e derivados do mesmo (por exemplo, poli ICLC); e várias emulsões de água em óleo preparadas de óleos biodegradáveis como esqualeno e/ou tocoferol. Dentre esses, adjuvante incompleto de Freund; Montanide; poli-I:C e derivados do mesmo; e oligonucleotídeos CpG são preferíveis. A razão de mistura entre o adjuvante descrito acima e o polipeptídeo é tipicamente cerca de 1:10 a 10:1, de preferência, cerca de 1:5 a 5:1, com mais preferência cerca de 1:1. Entretanto, o adjuvante não é limitado aos exemplos descritos acima, e os adjuvantes conhecidos na técnica diferentes daqueles descritos acima (por exemplo, Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2^a edição”, 1986) podem ser usados quando o agente de indução de imunidade da presente invenção for administrado. Os métodos de preparação para misturas ou emulsões de um polipeptídeo e um adjuvante são bem conhecidos pelos

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28/64 técnicos no assunto.

[055] Ainda, em adição aos adjuvantes descritos acima, os fatores que estimulam a reação imunológica do indivíduo podem ser usados conforme o potenciador de imunidade descrito acima. Por exemplo, várias citocinas que têm uma propriedade para estimular linfócitos e/ou células apresentadoras de antígeno podem ser usadas como o potenciador de imunidade em combinação com o agente de indução de imunidade da presente invenção. Inúmeras de tais citocinas capazes de aprimorar a reação imunológica são conhecidas dos técnicos no assunto e exemplos das mesmas incluem, mas não se limitam a, interleucina-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, interferon-α, interferon-β, interferon-ω, interferon-γ, e ligante Flt3, que são apresentadas por aprimorarem a ação profilática das vacinas. Esses fatores também podem ser usados conforme o potenciador de imunidade descrito acima e podem estar contidos no agente de indução de imunidade da presente invenção ou podem ser preparados como uma composição separada a ser usada em combinação com o agente de indução de imunidade da presente invenção, a ser administrada a um paciente.

Células Apresentadoras de Antígeno

Vacina Gênica

[056] Também pela expressão do polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos (a) a (c) no corpo do indivíduo animal, a produção de anticorpo e de células T citotóxicas pode ser induzida no ser vivo, e o efeito comparável àquele obtido no caso de administração de um polipeptídeo pode ser obtido. Isto é, o agente de indução de imunidade da presente invenção pode ser um que compreenda como um ingrediente efetivo um vetor recombinante que possui um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo (a) a (c), sendo que o vetor recombinante é capaz de expressar o polipeptídeo em um ser vivo. Esse vetor recombinante capaz de expressar um polipeptídeo antigênico também é

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29/64 chamado de vacina gênica.

[057] O vetor usado para a produção de uma vacina gênica não é restrito desde que seja um vetor capaz de expressar um polipeptídeo em uma célula do indivíduo animal (de preferência, em uma célula de mamífero) e um vetor plasmidial ou um vetor viral e qualquer vetor conhecido no campo das vacinas gênicas pode ser usado. O polinucleotídeo como DNA ou RNA que codifica o polipeptídeo descrito acima pode ser facilmente preparado, conforme mencionado acima, por um método convencional. A incorporação do polinucleotídeo no vetor pode ser executada com o uso de um método bem conhecido dos técnicos no assunto.

[058] A rota de administração da vacina gênica é, de preferência, uma rota parenteral como intramuscular, subcutânea, intravenosa ou administração intraarterial, e a dose pode ser aproximadamente selecionada dependendo do tipo do antígeno e similares, e é usualmente cerca de 0,1 μg a 100 mg, de preferência, cerca de 1 μg a 10 mg em termos do peso da vacina gênica por 1 kg do peso corporal.

[059] Os métodos que usam um vetor viral incluem aqueles em que um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo descrito acima é incorporado em um vírus de RNA ou vírus de DNA, como um retrovírus, adenovírus, vírus adeno associado, vírus da herpes, vírus vaccinia, pox vírus, poliovírus ou vírus Sindbis e, então, o indivíduo animal é infectado com o vírus resultante. Dentre esses métodos, aqueles que usam um retrovírus, adenovírus, vírus adeno associado, vírus vaccinia ou similares, são especialmente preferíveis.

[060] Os exemplos de outros métodos incluem um método em que um plasmídeo de expressão é diretamente administrado intramuscularmente (método de vacina de DNA), método lipossoma, método lipofectina, método de microinjeção, método de fosfato de cálcio e método de eletroporação e o método de vacina de DNA e método lipossoma são especialmente preferíveis.

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[061] Os métodos para realmente produzir o gene que codifica o polipeptídeo descrito acima usado na presente invenção atuam como um produto farmacêutico que inclui o método in vivo em que o gene é diretamente transfectado no corpo, e o método ex vivo em que tipos de células são coletados do indivíduo animal e no gene é transfectado nas células ex vivo, seguido pelo retorno das células ao corpo (Nikkei Science, 1994, April, p. 20 a 45; The Pharmaceutical Monthly, 1994, Vol. 36, No. 1, p. 23 a 48; Experimental Medicine, Edição Extra, 1994, Vol.12, No. 15; e referências citadas nesses papéis e similares). O método in vivo é mais preferível.

[062] Em casos em que o gene é administrado pelo método in vivo, o gene pode ser administrado através de uma rota de administração apropriada dependendo da doença a ser tratada, sintoma e assim por diante. O mesmo pode ser administrado através de, por exemplo, administração intravenosa, intraarterial, subcutânea e intramuscular ou similares, ou podem ser diretamente administrados na área afetada na qual existe um tumor. Nos casos em que o gene é administrado através do método in vivo, o gene pode ser formulado em um preparo como uma solução e, em geral, o mesmo é formulado em uma solução de injeção ou similar que contém DNA que codifica o peptídeo mencionado acima da presente invenção como um ingrediente eficaz. Um carreador comumente usado pode ser adicionado ao isto se necessário. No caso de um lipossomo ou um lipossomo de fusão de membrana (lipossomo (HVJ) do vírus Sendai ou similar) que contém o DNA, o lipossomo pode ser formulado em um preparo de lipossomo como uma suspensão, preparo congelado ou preparação congelada concentrada de forma centrífuga.

[063] Na presente invenção, “a sequência de base SEQ ID N°:1” inclui não apenas a sequência de base expressamente escrita na SEQ ID N°:1, mas também a sequência complementar a mesma. Assim, “um polinucleotídeo que possui a sequência de base da SEQ ID N°:1” inclui um polinucleotídeo de

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31/64 fita simples que possui a sequência de base expressamente escrita na SEQ ID N°:1, um polinucleotídeo de fita simples que possui a sequência de base complementar a mesma e um polinucleotídeo de fita dupla composto destes polinucleotídeos de fita simples. Quando o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo usado na presente invenção é preparado, qualquer uma destas sequências de base deveriam ser selecionadas apropriadamente e os técnicos no assunto executariam facilmente a seleção.

Detecção De Câncer

[064] Em um método da presente invenção para detecção de câncer, a expressão do polipeptídeo usado na presente invenção é medida com o uso de uma amostra separada de um ser vivo. O método para medir a expressão de um polipeptídeo com o uso da amostra inclui um método no qual um anticorpo contra o polipeptídeo, cujo anticorpo está contido na amostra, é medido através de imunoensaio (Método 1); um método no qual o polipeptídeo pode estar contido na amostra é medido através de imunoensaio (Método 2); e um método no qual mRNA contido na amostra que codifica o polipeptídeo é medido (Método 3). No método da presente invenção, a expressão do polipeptídeo pode ser medida através de qualquer um dentre estes três métodos. Na presente invenção, o termo “medição” inclui detecção, quantificação e semiquantificação.

[065] No presente documento, CD179b foi identificado como um polipeptídeo que se liga a um anticorpo (anticorpo de câncer específico) que existe especialmente no soro derivado de um cachorro portador de tumor, através do método SEREX com o uso de soro de um paciente canino do qual uma biblioteca de DNA derivado de câncer de mama canino foi preparada (vide Exemplo 1). Isto é, no ser vivo de um cachorro portador de tumor, um anticorpo contra CD179b é especificamente induzido. Assim, também ao medir um anticorpo contra CD179b em um ser vivo portador de tumor, um câncer que

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32/64 expressa CD179b pode ser detectado (vide Exemplo 7). Adicionalmente, um câncer canino pode ser detectado também através da medição de CD179b como um antígeno através do Método 2 acima. Adicionalmente, já que, conforme descrito nos Exemplos abaixo, o mRNA que codifica o polipeptídeo de antígeno é mais expresso de forma mais elevada significantemente em câncer, especialmente em células de leucemia e câncer de mama, que em tecidos normais (vide Exemplo 1), um câncer canino pode ser detectado também através da medição do mRNA. Conforme mencionado acima, CD179b é conhecido por ser expresso sobre as superfícies de membrana de células precursoras de células B (células pré-B) e, portanto, é relatado que CD179b é expresso em células de leucemia (leucemia de célula pré-B) derivadas por cancerização de células pré-B, mas o fato de que as células de leucemia diferentes das células de leucemia de célula pré-B e células de câncer de mama apresentam expressão de CD179b foi primeiramente encontrado na presente invenção. Consequentemente, a detecção de leucemia diferente das células de leucemia de célula pré-B, linfoma e câncer de mama se torna possível através da investigação da expressão de CD179b.

[066] No Método 1 acima, a medição do anticorpo de câncer específico que pode existir na amostra pode ser facilmente executada através de imunoensaio com o uso de uma substância antigênica que reage imunologicamente com o anticorpo. O imunoensaio, em si, é um método convencional conhecido conforme explicado detalhadamente abaixo. Enquanto a substância antigênica que pode ser usada no imunoensaio, o polipeptídeo (a) a (c) pode ser usado. Como os anticorpos possuem reatividade cruzada, uma molécula pode ser ligada a um anticorpo que é induzido contra outro imunógeno, desde que a molécula apresente qualquer estrutura que seja similar ao epítopo do imunógeno. Por exemplo, os polipeptídeos que têm alta homologia de sequência de aminoácidos em relação um ao outro frequentemente têm epítopos

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33/64 com estruturas similares e, em tais casos, ambos os polipeptídeos podem ter a mesma antigenicidade. Conforme concretamente descrito nos Exemplos abaixo, o polipeptídeo derivado de humano de SEQ ID N°:3 reage imunologicamente com o anticorpo induzido no corpo de um cachorro portador de tumor. Portanto, no Método 1 da presente invenção, qualquer fator homólogo de mamífero pode ser usado como um antígeno no imunoensaio.

[067] As substâncias antigênicas que têm um peso molecular elevado e uma estrutura complexa, como proteínas, têm normalmente uma pluralidade de sítios com estruturas diferentes em sua superfície. Portanto, tal substância antigênica induz uma pluralidade de tipos de anticorpos que reconhecem respectivamente cada um dos sítios em um ser vivo. Isto é, um anticorpo induzido em um ser vivo contra uma substância antigênica como uma proteína é um anticorpo policlonal, que é uma mistura de uma pluralidade de tipos de anticorpos. Deve-se notar que, na presente invenção, o termo “anticorpo policlonal” significa um anticorpo que existe em um soro derivado a partir de um ser vivo que possui uma substância antigênica no mesmo e é induzido no ser vivo contra a substância antigênica.

[068] A medição do anticorpo em uma amostra pode, facilmente, ser executada pelo imunoensaio com o uso do polipeptídeo descrito acima como um antígeno. Os imunoensaios per se são bem conhecidos na técnica, e incluem, quando classificados com base no modo de reação, o método sanduíche, método de competição, método de aglutinação, execução de Western blot e similares. Quando classificados com base na marcação, os imunoensaios incluem imunoensaio por rádio, imunoensaio por fluorescência, imunoensaio por enzima, imunoensaio por biotina e similares, e o imunoensaio do anticorpo descrito acima pode ser executado por qualquer um destes imunoensaios. Embora não seja restrito, o método ELISA do tipo sanduíche e o método de aglutinação podem ser, de preferência, usados como um

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34/64 imunoensaio do anticorpo acima na presente invenção, como estes métodos são simples e não exigem um aparelho de grande escala. Nos casos onde uma enzima é usada como marcação de um anticorpo, a enzima usada não é particularmente restrita, contanto que a mesma satisfaça tais condições de que o número de produção seja grande, que a enzima seja estável mesmo quando está ligada a um anticorpo, de que a mesma colora especificamente seu substrato e similares. Por exemplo, as enzimas usadas em um imunoensaio de enzima comum como peroxidase, β-galactosidase, fosfatase alcalina, glicose oxidase, acetilcolinesterase, glicose-6-fosfato dehidrogenase, e malato dehidrogenase podem ser usados. Os inibidores de enzima, coenzimas e similares também podem ser usados. A ligação destas enzimas com um anticorpo pode ser executada por um método conhecido com o uso de um agente de reticulação como um composto maleimida. Como um substrato, as substâncias conhecidas podem ser usadas, dependendo do tipo de enzima usada. Por exemplo, em casos onde a peroxidase é usada como enzima, 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina pode ser usado e em casos onde a fosfatase alcalina é usada como a enzima, para-nitrofenol ou similares podem ser usados. Como radioisotopo, aqueles usados em um imunoensaio por rádio comum como ¹²⁵I ou ³H podem ser usados. Como corante fluorescente, um usado em uma técnica de anticorpo fluorescente comum, como fluoresceína isotiocianato (FITC), tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC) ou similares podem ser usados.

[069] Estes imunoensaios per se são bem conhecidos na técnica e, portanto, não é necessário explicar estes imunoensaios no presente relatório descritivo. Brevemente, nos imunoensaios do tipo sanduíche, por exemplo, o polipeptídeo mencionado acima usado como um antígeno é imobilizado em uma fase sólida e, então, reagido com uma amostra como um soro. Após a lavagem da fase sólida, o material resultante é reagido com um anticorpo secundário adequado. Após a lavagem da fase sólida, o anticorpo secundário ligado à fase

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35/64 sólida é medido. No método para a detecção de câncer de acordo com a presente invenção, é preferencial imobilizar um polipeptídeo antígeno em uma fase sólida, em razão de a imobilização em uma fase sólida tornar possível a remoção fácil do anticorpo secundário não ligado. Como o anticorpo secundário, por exemplo, anti-anticorpo igG de cachorro pode ser usado em casos onde a amostra é obtida a partir de cachorros. O anticorpo secundário ligado à fase sólida pode ser medido através da marcação do anticorpo secundário com uma substância de marcação exemplificada acima. A quantidade assim medida do anticorpo secundário corresponde à quantidade do anticorpo mencionado acima em uma amostra de soro. Em casos onde uma enzima é usada como a substância de marcação, a quantidade do anticorpo pode ser medida através da adição de um substrato que é decomposto pela atividade enzimática para desenvolver uma cor e, então, medir oticamente a quantidade do substrato decomposto. Em casos onde um radioisotopo é usado como a substância de marcação, a quantidade de radiação do radioisotopo pode ser medida com um contador de cintilação ou similares.

[070] No método 2 da presente invenção, o polipeptídeo de SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 é medido, sendo que o polipeptídeo pode ser contido na amostra obtida a partir de um ser vivo. Conforme explicado acima, a abundância do anticorpo de câncer-específico que reage imunologicamente com o polipeptídeo de SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 ou um fator homólogo do mesmo é significativamente alto em pacientes com câncer, o que indica que a produção do polipeptídeo ou fator homólogo do mesmo, que é o antígeno do anticorpo de câncer-específico, é significativamente alta em pacientes com câncer. Portanto, similarmente ao método 1 acima, os cânceres em um ser vivo podem ser detectados através da medição do polipeptídeo de SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 ou um fator homólogo do mesmo.

[071] A medição do polipeptídeo em uma amostra pode ser

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36/64 facilmente executada por um imunoensaio bem conhecido. Especificamente, por exemplo, o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de números ímpares dentre as SEQ ID N°s: 3 a 95 ou um fator homólogo dos mesmos que pode existir em uma amostra podem ser medidos através da preparação de um anticorpo ou fragmento ligante de antígeno do mesmo, que reage imunologicamente com o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de números ímpares dentre as SEQ ID N°s: 3 a 95 ou um fator homólogo do mesmo e, então, executa um imunoensaio com o uso do anticorpo preparado ou fragmento do mesmo. O imunoensaio per se é um método convencional bem conhecido conforme descrito acima.

[072] O termo “fragmento ligante de antígeno” significa aqui um fragmento de anticorpo como o fragmento Fab ou o fragmento F(ab’)2 contido em uma molécula de anticorpo, que possui uma capacidade de ligação a um antígeno. Embora o anticorpo possa ser tanto um anticorpo policlonal quanto anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal é preferencial em imunoensaios e similares, em razão de uma alta capacidade de reprodução ser realizada pelos mesmos. Os métodos para a preparação de um anticorpo policlonal ou monoclonal com o uso de um polipeptídeo como um imunógeno são bem conhecidos e a preparação pode ser executada facilmente por um método convencional. Por exemplo, os anticorpos contra o polipeptídeo podem ser induzidos através da imunização de um animal com um imunógeno, o polipeptídeo conjugado em uma proteína carreadora como hemocianina do molusco keyhole (KLH) ou caseína, junto com um adjuvante. Então, as células produtoras de anticorpo como células de baço ou linfócitos são coletadas a partir do animal imunizado e fundidas com células mieloma para o preparo de hibridomas. Dentre os hibridomas, um que produz um anticorpo que se liga ao polipeptídeo de SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 ou um fator homólogo do mesmo é selecionado e proliferado e, então, o anticorpo

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37/64 monoclonal cujo antígeno correspondente é a proteína mencionada acima pode ser coletado a partir do sobrenadante do cultivo. O método descrito acima é um método convencional bem conhecido.

[073] No método 3 da presente invenção, o mRNA que codifica CD179b, que pode ser contido em uma amostra obtida a partir de um ser vivo, é medido. Conforme descrito de forma concreta nos Exemplos abaixo, o nível de expressão de mRNA que codifica CD179b é significativamente alto em câncer, especificamente, câncer de mama e células de leucemia. Portanto, os cânceres em um ser vivo podem ser detectados através da medição do mRNA em uma amostra.

[074] No método de detecção da presente invenção, se o sujeito sofre de câncer ou não ou similares é determinado com base no nível de expressão do polipeptídeo medido, conforme descrito acima. Embora a detecção de câncer possa ser realizada simplesmente através da medição de expressão do polipeptídeo no ser vivo do sujeito, é preferencial a obtenção de valor de referência normal através da determinação do nível de expressão do polipeptídeo (a quantidade do anticorpo, polipeptídeo ou mRNA) em uma ou mais amostras provenientes dos indivíduos saudáveis a fim de comparar o valor medido no ser vivo do sujeito com o valor de referência normal, tendo em vista o aumento na precisão da detecção. A fim de aumentar adicionalmente a precisão de detecção, o valor de referência do câncer pode ser obtido através da determinação do nível de expressão do polipeptídeo nas amostras obtidas a partir de diversos pacientes que sofrem de câncer, a fim de comparar o valor medido do ser vivo do sujeito com os valores de referencia normal e de câncer. Os valores de referência mencionados acima podem ser determinados pela expressão do nível de expressão do polipeptídeo em cada amostra nos valores e cálculo do valor médio dos mesmos. Os valores de referência normal e de câncer podem ser determinados anteriormente através da medição do nível de

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38/64 expressão do polipeptídeo em diversos sujeitos saudáveis e com câncer. Dessa forma, quando o valor medido é comparado com os valores de referência no método da presente invenção, os valores de referência podem ser aqueles predeterminados.

[075] O método de detecção da presente invenção pode ser executado em combinação com a detecção que usa outros antígenos de câncer e/ou marcadores de câncer, de forma que a precisão de detecção de cânceres possa ser mais aperfeiçoada.

[076] Através do método de detecção da presente invenção, os cânceres em um ser vivo podem ser detectados. O método da presente invenção pode detectar até mesmo um tumor pequeno invisível ou um tumor que existe em uma parte profunda de um corpo e, dessa forma, o método é útil para a detecção precoce de câncer. Ademais, através da aplicação do método de detecção da presente invenção em pacientes no período de acompanhamento após a terapia para câncer, o câncer recorrente, se houver, pode ser detectado em seu estado precoce.

[077] Quanto mais células cancerígenas que expressam o polipeptídeo prescrito para ser medido na presente invenção proliferarem em um ser vivo portador de tumor, mais polipeptídeos e mRNAs que os codificam se acumulam no corpo, o que ocasiona a quantidade aumentada de anticorpos contra os polipeptídeos mencionados acima no soro. Por outro lado, quanto mais células cancerígenas diminuem, mais os polipeptídeos e mRNAs acumulados que codificam as mesmas diminuem no ser vivo, o que faz com que a quantidade dos anticorpos diminua contra os polipeptídeos mencionados acima no soro. Assim, se o nível de expressão do polipeptídeo prescrito é alto, pode ser determinado que o crescimento do tumor e/ou metástase do câncer ocorreu, isto é, o estágio de progressão do câncer é avançado.

[078] Ademais, conforme apresentado no Exemplo abaixo, quando

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39/64 comparado entre os mesmos tipos de tumores, um do tipo maligno produz uma quantidade significativamente mais alta dos anticorpos do que um benigno. Portanto, se o nível de expressão dos polipeptídeos prescritos for alto, pode ser determinado que o grau de malignidade do câncer é alto. Isto é, o grau de malignidade de câncer também pode ser detectado pelo método da presente invenção.

[079] Adicionalmente, o efeito da terapia de câncer pode ser monitorado com base no aumento ou diminuição do nível de expressão dos polipeptídeos prescritos. Portanto, através da observação do nível de expressão dos polipeptídeos mencionados acima em um indivíduo durante ou após a terapia contra câncer, uma pista para avaliar o quão eficaz o agente anticancerígeno administrado foi eficaz, ou se uma porção do tumor foi deixada no paciente após a extirpação do tumor ser alcançada, assim como uma pista para encontrar metástase e/ou recorrência o mais cedo possível ser obtida durante o acompanhamento. O tratamento adequado para os resultados de câncer com diminuição no nível de expressão dos polipeptídeos comparados ao estado portador de tumor antes da terapia. Em tais casos, pode-se julgar que o efeito da terapia que foi (está sendo) executado no ser vivo é/foi bom. Em casos onde o nível de expressão dos polipeptídeos aumenta ou é mantido, ou diminui uma vez e depois aumenta, pode-se julgar que o efeito da terapia não é bom o bastante. Isto pode ser uma base útil para a seleção de um método terapêutico, como decisão de mudar o método terapêutico ou de mudar a dosagem de um agente anti-cancerígeno.

[080] Os cânceres que serão detectados pelo método da presente invenção são aqueles que expressam o CD179b (excluindo tumores com célula pré-B), e exemplos dos mesmos incluem, mas não se limitam a, câncer na glândula mamária, câncer combinado na glândula mamária, tumor misto maligno na glândula mamária, adenocarcinoma papilar intraductal, leucemias (de

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40/64 preferência, leucemia linfocítica crônica excluindo aquelas do tipo célula pré-B) e linfomas (de preferência, linfoma gastrointestinal, linfoma de órgão digestivo, linfoma de célula pequeno/médio, linfoma de célula médio e linfoma multicêntrico, excluindo aqueles do tipo célula pré-B). os corpos vivos nos quais o método da presente invenção se aplica são de mamíferos, de preferência humanos, cachorros e gatos.

[081] A amostra a ser submetida ao método da presente invenção inclui fluidos corporais como sangue, soro, plasma, ascite e efusão pleural; tecidos e células. Em particular, soro, plasma, ascite e efusão pleural podem ser usados de preferência no Método 1 e Método 2 acima. Uma amostra de tecido e amostra de célula são preferenciais no caso do Método 3 acima no qual o mRNA é medido.

[082] O polipeptídeo usado como um antígeno para o imunoensaio no Método 1 pode ser fornecido como um reagente para a detecção de câncer. O reagente pode consistir apenas no polipeptídeo mencionado acima, ou pode conter diversos aditivos úteis para a estabilização do polipeptídeo e similares. O reagente pode ser, ainda, fornecido de forma imobilizado em uma fase sólida, como uma placa ou membrana.

[083] O anticorpo ou um fragmento ligante de antígeno do mesmo que reage imunologicamente com o polipeptídeo de SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ..., 93 ou 95 ou um fator homólogo do mesmo, que é usado para medir o polipeptídeo ou o fator homólogo do mesmo através de imunoensaio no Método 2, pode ser fornecido ainda como um reagente para a detecção de câncer. O reagente pode consistir, ainda, apenas do anticorpo ou fragmento ligante de antígeno do mesmo mencionado acima, ou pode conter diversos aditivos úteis para a estabilização do anticorpo ou fragmento ligante de antígeno do mesmo e similares. O anticorpo ou fragmento ligante de antígeno do mesmo pode estar ainda na forma para ser conjugado com um metal como manganês ou ferro. Já

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41/64 que tal anticorpo conjugado por metal ou fragmento ligante de antígeno do mesmo se acumula em um sítio no qual uma grande quantidade de proteína de antígeno existe quando administrado em um corpo, a existência de células cancerígenas que produzem a proteína do antígeno pode ser detectada através da medição do metal por MRI ou similares.

[084] Adicionalmente, o polinucleotídeo descrito acima para a detecção de câncer usado para a medição de mRNA no Método 3 pode ser fornecido ainda como um reagente para a detecção de câncer. O reagente para a detecção de câncer pode consistir ainda apenas no polinucleotídeo, ou pode conter diversos aditivos úteis para a estabilização do polinucleotídeo e similares. O polinucleotídeo para detecção de câncer contido no reagente é, de preferência, um primer ou uma sonda.

Exemplos

[085] A presente invenção será descrita agora de forma mais concreta a título de Exemplos, mas o escopo da presente invenção não é limitado aos exemplos particulares abaixo.

Exemplo 1: Aquisição da Nova Proteína de antígeno de câncer através do Método SEREX (1) Preparação da biblioteca de cDNA

[086] A partir de um tecido de câncer na glândula mamária canino removido por cirurgia, o RNA total foi extraído pelo método de Ácido guanidínioFenol-Clorofórmio e o poli(A)⁺ RNA foi purificado com o uso do kit de purificação de mRNA Oligotex-dT30 (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.), de acordo com o protocolo descrito nas instruções anexadas.

[087] Com o uso do mRNA (5 μg) obtido, uma biblioteca de fago de cDNA derivado de câncer na glândula mamária canino foi sintetizado. A preparação da biblioteca de fago de cDNA foi executada com o uso do Kit de síntese de cDNA, Kit se síntese de cDNA ZAP e Kit de clonagem ZAP-cDNA

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Gigapack III Gold (produzido por STRATAGENE) de acordo com os protocolos anexados aos kits. O tamanho da biblioteca de fago de cDNA preparada foi de 2.99 x 105 pfu/ml.

(2) Triagem da biblioteca de cDNA com Soro

[088] Com o uso da biblioteca de fago de cDNA derivado de câncer na glândula mamária canino preparada conforme descrito acima, a imunotriagem foi executada. Mais particularmente, o hospedeiro de E. coli (XL1-Blue MRF') foi infectado com biblioteca de forma que os 2340 clones foram incluídos em uma placa de agarose Φ90χ15 mm NZY, seguido de cultivo a 42°C por 3 a 4 horas a fim de permitir a formação de placas. A placa foi coberta com uma membrana de nitrocelulose (Hybond C Extra; produzido por GE Healthcare Bio-Science) impregnada com IPTG (isopropil-e-D-tiogalactosídeo) a 37°C por 4 horas, a fim de permitir a indução e expressão de proteínas, transferindo, assim, as proteínas para a membrana. A partir disto, a membrana foi coberta e encharcada com TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5) suplementada com 0,5% de leite desnatado seco, para ser posteriormente agitado a 4°C do dia para a noite para suprimir as reações não específicas. Permitiu-se que o filtro reagisse com soro do paciente canino diluído 500 vezes em temperatura ambiente por 2 a 3 horas.

[089] Conforme o soro de paciente canino descrito acima, um total de 3 amostras de soro foram usadas, sendo que as mesmas foram coletadas de cada um dos cachorros a partir do qual o câncer na glândula mamária acima foi removido e outro paciente canino com câncer na glândula mamária. Estes soros foram armazenados a -80°C e pré-tratados imediatamente após o uso. O prétratamento dos soros foi executado pelo método a seguir. Isto é, o hospedeiro E. coli (XL1-BLue MRF') foi infectado com fago expresso λ ZAP no qual nenhum gene exógeno foi inserido, e o mesmo foi cultivado em uma placa NZY a 37°C do dia para a noite. Subsequentemente, 0,2 de tampão M NaHCO3 (pH 8,3) que contém 0,5 de M NaCl foi adicionado à placa, e a placa foi deixada descansando

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43/64 a 4°C por 15 horas, seguido da recuperação do sobrenadante como um E. coli/extrato de fago. A partir disto, o E. coli/extrato de fago recuperado foi passado através de uma coluna NHS (produzido por GE Healthcare Bio-Science) a fim de imobilizar as proteínas derivadas a partir do E. coli/fago. O soro proveniente do paciente canino foi passado através desta coluna imobilizada por proteína e permitiu-se que o mesmo reagisse com as proteínas, removendo assim os anticorpos que absorvem os E. coli e o fago a partir do soro. A fração do soro passada através da coluna sem ser absorvida foi diluída 500 vezes com TBS suplementado com 0,5% de leite desnatado seco e a diluição resultante foi usada como um material para a imunotriagem.

[090] A membrana na qual o soro tratado dessa forma e as proteínas de fusão descritas acima foram manchadas foi lavada com TBS-T (0,05% de Tween 20/TBS) 4 vezes e permitiu-se que o anti-IgG de cachorro e cabra (Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugado; produzido por BETHYL Laboratories, Inc.) que foi diluído 5000 vezes com TBS suplementado com 0,5% de leite desnatado seco, como um anticorpo secundário, reagisse em temperatura ambiente por 1 hora. A detecção foi executada por uma reação de coloração enzimática com o uso da solução de reação NBT/BCIP (produzido por Roche), e as colônias cujas posições eram idênticas às dos sítios positivos de reação de coloração foram coletadas a partir da placa de agarose Φ90χ15mm NZY, e dissolvidas em 500 μΙ de tampão SM (100 mM NaCl, 10 mM MgClSO4, 50 mM Tris-HCl, 0,01 % de gelatina, pH 7,5). A segunda e terceira triagens foram executadas através da repetição do mesmo método, conforme descrito acima, até que as colônias positivas na reação de coloração se tornassem colônias únicas, isolando assim 45 clones positivos após a triagem de 92820 clones de fago reativos com IgG no soro.

(3) Pesquisa de Homologia para Genes de Antígeno Isolados

[091] Para submeter os 45 clones positivos isolados pelo método

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44/64 acima para análise de sequência, uma operação para converter o vetor de fago em um vetor plasmidial foi executada. Mais particularmente, 200 μΙ de uma solução preparada de forma que o hospedeiro E. coli (XL1-Blue MRF’) estava contido em uma absorção de OD600 de 1.0, 250 μl da solução purificada de fago e 1 μl do fago auxiliador ExAssist (produzido por STRATAGENE) forma misturados e a permitiu-se que a mistura resultante reagisse a 37°C por 15 minutos, seguido da adição de 3 ml de caldo de LB ao mesmo e cultivo do material resultante a 37°C por 2,5 a 3 horas. O processo foi imediatamente seguido por 20 minutos de incubação em banho-maria a 70°C e centrifugação a IQQQxg por 15 minutos, após o qual o sobrenadante foi coletado como uma solução fagomídea. Subsequentemente, 200 μl de uma solução preparada de forma que o hospedeiro fagomídeo E. coli (SOLR) estava contido em uma absorção OD6qq de 1.0 e 10 μl da solução purificada fagomídea foram misturadas e permitiu-se que a mistura resultante reagisse a 37°C por 15 minutos, seguido de plaqueamento de uma alíquota de 50 μl do material resultante em meio ágar LB suplementado com ampicilina (50 μg/ml de concentração final) e cultivo a 37°C do dia para a noite. As colônias únicas do SOLR transformado foram escolhidas e cultivadas em meio LB suplementado com ampicillina (50 μg/ml de concentração final) a 37°C, seguido de purificação de DNAs de plasmídeo que possui inserções de interesse com o uso de QIAGEN plasmídeo Miniprep Kit (produzido por QIAGEN).

[Q92] Cada plasmídeo purificado foi submetido à análise da sequência de comprimento total do inserto pelo método walking primer com o uso do primer T3 apresentado na SEQ ID N°: 96 e o primer T7 apresentado na SEQ ID NO°: 97. Através desta análise de sequência, as sequências de gene de números pares dentre as SEQ ID N°s: 4 a 92 foram obtidos. Com o uso das sequências de base e da sequência de aminoácidos (números ímpares das SEQ ID N°s: 5 a 93) destes genes, a pesquisa de homologia contra os genes

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45/64 conhecidos foram executadas com o uso de um programa de pesquisa de homologia BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), e, como resultado, revelou-se que todos os 45 genes obtidos foram os que codificaram CD179b. As homologias dentre os 45 genes foram 94 a 99% em termos das sequências de base e 96 a 99% em termos das sequências de aminoácidos. As homologias entre estes genes e o gene que codifica um fator homólogo humano foram de 62 a 82% em termos de sequências de base e 69 a 80% em termos de sequências de aminoácidos, na região traduzida em uma proteína. A sequência de base do fator homólogo humano é apresentada na SEQ ID N°: 1, e as sequências de aminoácidos do fator homólogo humano são apresentadas na SEQ ID N°s: 2 e 3. Ademais, as homologias entre estes genes e o gene que codifica um fator homólogo bovino foram de 68 a 82% em termos de sequências de base e 56 a 77% em termos de sequência de aminoácidos, na região traduzida em uma proteína. A sequência de base do fator homólogo bovino é apresentada na SEQ ID N°: 94, e a sequência de aminoácidos do fator homólogo bovino é apresentada na SEQ ID N°: 95. A homologia entre o gene que codifica o fator homólogo humano e o gene que codifica o fator homólogo bovino foi de 62% em termos de sequências de base e 72% em termos de sequência de aminoácidos, na região traduzida em uma proteína.

(4) Análise da Expressão em Diversos Tecidos

[093] As expressões dos genes obtidos através do método acima em tecidos normais caninos e humanos e diversas linhagens de célula foram investigadas pelo método RT-PCR (Transcrição Reversa-PCR). A reação de transcrição reversa foi executada conforme a seguir. Isto é, de 50 a 100 mg de cada tecido ou 5-10*10⁶ células de cada linhagem de célula, o RNA total foi extraído com o uso de reagente TRIZOL (produzido por INVITROGEN), de acordo com o protocolo descrito nas instruções anexadas. Com o uso deste RNA total, o cDNA foi sintetizado pelo Superscript First-Strand Synthesis System para

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RT-PCR (produzido por INVITROGEN), de acordo com o protocolo descritos nas instruções anexadas. Conforme o cDNAs dos tecidos normais humanos (cérebro, hipocampo, testículo, cólon e placenta), Gene Pool cDNA (produzido por INVITROGEN), QUICK-Clone cDNA (produzido por CLONETECH) e LargeInsert cDNA Library (produzido por CLONETECH) foram usados. A reação de PCR foi executada conforme a seguir, com o uso de primers específicos para os genes caninos obtidos (apresentados nas SEQ ID N°s: 98 e 99) e seus genes homólogos humanos (apresentados nas SEQ ID N°s: 100 e 101). Isto é, os reagentes e um tampão anexado foram misturados de forma que as concentrações/quantidades de 0,25 μΙ de uma amostra preparada pela reação de transcrição reversa, 2 μM cada dos primers acima, 0,2 mM cada de dNTPs, e 0,65 U de ExTaq polimerase (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.) foram realizados em um volume total de 25 μl e a reação foi executada com 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos com o uso de um Thermal Cycler (produzido por BIO RAD). Os primers descritos acima específicos para genes que possuem as sequências de base SEQ ID N°s: 98 e 99 foram para a ampliação das posições 32 a 341 na sequência de base SEQ ID N°: 4, e para ampliação da região comum a todos aos genes CD179b de caninos apresentado nas sequências de números pares dentre as SEQ ID N°s: 4 a 92. Ademais, os primers específicos a genes que possuem as sequências de base da SEQ ID N°s: 100 e 101 foram para a ampliação das posições 216 a 738 na sequência de base SEQ ID N°: 1. Como um controle para a comparação, os primers específicos para GAPDH (apresentado na SEQ ID N°s: 102 e 103) foram usados ao mesmo tempo. Como resultado, conforme apresentado na Figura 1, os genes caninos obtidos não mostraram a expressão em tecidos caninos normais, mas mostrara forte expressão em tecidos de câncer de mama caninos. Em termos de expressão dos genes homólogos humanos, a medula óssea foi o único tecido normal humano em que a sua expressão foi

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47/64 confirmada, mas, em células cancerígenas humanas, sua expressão foi detectada em linhagens de célula de leucemia e linhagens de célula de câncer de mama, de forma que a expressão específica de CD179b nas linhagens de célula de leucemia e nas linhagens de célula de câncer de mama foi confirmada.

[094] Na Figura 1, o numeral de referência 1 nos ordenados representa o padrão de expressão do gene identificado, conforme descrito acima, e o numeral de referência 2 representa o padrão de expressão do gene GAPDH, conforme o controle para comparação.

Exemplo 2: Preparação de Nova Proteína de antígeno de câncer canina e HUMANA (1) Preparação da Proteína Recombinante

[095] Com base no gene de SEQ ID N°: 4 obtido no Exemplo 1, uma proteína recombinante foi preparada pelo método seguinte. Isto é, os reagentes e um tampão anexado foram misturados de forma que as concentrações/quantidades de 1 μΙ do vetor preparado a partir da solução fagomídea obtida no Exemplo 1 e submetida à análise de sequência, 0,4 μΜ de cada um dos dois tipos de primers que possuem sítios de restrição Nde I e Kpn I (descritos na SEQ ID N°s: 104 e 105), 0,2 mM dNTP, e 1,25 U PrimeSTAR HS polimerase (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.) foram realizados em um volume total de 50 pl, e o PCR foi executado com 30 ciclos de 98°C por 10 segundos e 68°C por 40 segundos com o uso do Thermal Cycler (produzido por BIO RAD). Os dois tipos de primers descritos acima foram os da ampliação da região que codifica o 5° ao 120° aminoácidos na sequência de aminoácidos SEQ ID N°:5. Após o PCR, o DNA ampliado foi submetido à eletroforese com o uso de 2% de gel agarose e um fragmente de DNA de cerca de 350 bp foi purificado com o uso de QIAquick Gel Extraction Kit (produzido por QIAGEN).

[096] O fragmento de DNA purificado foi ligado em um vetor de clonagem pCR-Blunt (produzido por Invitrogen). O E. coli foi transformado com

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48/64 o produto de ligação resultante e os plasmídeos foram recuperados a partir disto, seguido de confirmação, através de sequenciamento, que a sequência do fragmento de gene ampliado combina com a sequência de interesse. O plasmídeo que possui a sequência que combina com a sequência de interesse foi tratado com enzimas de restrição Nde I e Kpn I e purificado com o uso de QIAquick Gel Extraction Kit, seguido da inserção da sequência de gene de interesse em um vetor de expressão para E. coli, pET30b (produzido por Novagen) que foi tratado com enzimas de restrição NdeI e KpnI. O uso deste vetor possibilita a produção de uma proteína recombinante de fusão His-tag. E. coli para a expressão, BL21 (DE3), foi transformada com este plasmídeo e a expressão da proteína de interesse foi induzida em E. coli com 1 mM IPTG.

[097] Por outro lado, com base no gene da SEQ ID N°:1, uma proteína recombinante dos genes homólogos humanos foi preparada pelo método a seguir. Os reagentes e um tampão anexado foram misturados de forma que as concentrações/quantidades de 1 μΙ do cDNA preparado no Exemplo 1 cuja expressão poderia ser confirmada pelo método RT-PCR em cDNAs de diversos tecidos/células, 0,4 μM de cada um dos dois tipos de primers que possuem sítios de restrição Eco RI e Sal I (descritos nas SEQ ID N°s:106 e 107), 0,2 mM dNTP, e 1,25 U PrimeSTAR HS polimerase (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.) foram realizadas em um volume total de 50 pl, e o PCR foi executado com 30 ciclos de 98°C por 10 segundos e 68°C por 40 segundos com o uso de um Thermal Cycler (produzido por BIO RAD). Os dois tipos de primers descritos acima foram os da ampliação do comprimento total da sequência de aminoácidos SEQ ID N°:3. Após o PCR, o DNA ampliado foi submetido à eletroforese com o uso de 2% de gel agarose e um fragmento de DNA de cerca de 540 bp foi purificado com o uso de QIAquick Gel Extraction Kit (produzido por QIAGEN).

[098] O fragmento de DNA purificado foi ligado a um vetor de clonagem pCR-Blunt (produzido por Invitrogen). O E. coli foi transformado com

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49/64 o produto de ligação resultante e os plasmídeos foram recuperados a partir disto, seguido da confirmação, através de sequenciamento, de que a sequência do fragmento de gene ampliado combina com a sequência de interesse. O plasmídeo que possui a sequência que combinou com a sequência de interesse foi tratado com enzimas de restrição Eco RI e Sal I e purificado com o uso de QIAquick Gel Extraction Kit, seguido da inserção da sequência de gene de interesse em um vetor de expressão para E. coli, pET30a (produzido por Novagen) que foi tratado com enzimas de restrição Eco RI e Sal I. O uso deste vetor possibilita a produção de uma Proteína recombinante de fusão His-tag. O E. coli para expressão, BL21 (DE3), foi transformado com este plasmídeo e a expressão da proteína de interesse foi induzida em E. coli com 1 mM IPTG.

(2) Purificação de Proteína Recombinante

[099] As células de E. coli recombinantes obtidas acima que expressam a SEQ ID N°:1 e SEQ ID N°:4, respectivamente, foram cultivadas em meio LB suplementado com 30 μg/mL de canamicina a 37°C até que a absorção de 600 nm alcançou cerca de 0,7 e, então, o isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosida foi adicionado ao mesmo de forma que sua concentração final deve ser de 1 mM, seguido de cultivo dos mesmos a 30°C por 20 horas. Subsequentemente, as células foram coletadas através de centrifugação a 4.800 rpm por 10 minutos. O pélete das células foram suspensos em material salino tamponado-fosfato e submetido adicionalmente a centrifugação a 4.800 rpm por 10 minutos para a lavagem das células.

[0100] As células foram suspensas em material salino tamponadofosfato e submetidas à sonicação em gelo. A solução sonicada de E. coli foi centrifugada a 7.000 rpm por 20 minutos para se obter o sobrenadante como a fração solúvel e o precipitado como a fração insolúvel.

[0101 ] A fração insolúvel foi suspense em 4% de solução de TritonX100 e centrifugada a 7.000 rpm por 20 minutos. Esta operação foi repetida duas

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50/64 vezes e uma operação para a remoção de proteases foi executada.

[0102] O resíduo foi suspenso em 20 mM de tampão fosfato (pH 8,0) que contém 6M de hidrocloreto de guanidina e a suspensão resultante foi deixada para descansar a 4°C por 20 horas a fim de desnaturar as proteínas. A partir disto, a suspensão foi centrifugada a 7.000 rpm por 20 minutos, e a fração solúvel obtida foi disposta em uma coluna quelante de níquel preparada através de um método convencional (carreador: Chelating Sepharose Fast Flow (GE Health Care); volume de coluna: 5 mL; tampão de equilíbrio: 20 mM tampão de fosfato (pH 8,0) que contém 6M de hidrocloreto de guanidina). A fração que não foi absorvida na coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de 20 mM tampão de fosfato (pH 8,0) que contém 6M de hidrocloreto de guanidina e 20 mM de tampão de fosfato (pH 8,0) que contém 10 mM de imidazol, e a eluição foi imediatamente executada com um gradiente de densidade de quatro etapas de 50 mM-500 mM imidazol, para se obter a fração purificada, que foi usada a partir disto como um material para a administração de testes.

[0103] Em 1 ml de um tampão de reação (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2; pH 7.4), 200 μΙ da preparação purificada obtida pelo método descrito acima foi dividido e 2 μl de enteroquinase (produzido por Novagen) foi, então, adicionado ao mesmo, a seguir a mesma foi deixada para descansar em temperatura ambiente do dia para a noite para clivar a His tag. O produto resultante foi purificado com o uso de Enterokinase Cleavage Capture Kit (produzido por Novagen), de acordo com o protocolo anexado ao kit. Subsequentemente, o tampão contido em 1,2 ml da preparação purificada obtida pelo descrito acima foi substituída com tampão de fosfato fisiológico (produzido por Nissui Pharmaceutical) através da ultrafiltração com o uso de NANOSEP 10K OMEGA (produzido por PALL) e a solução resultante foi filtrada de forma asséptica com o uso de HT Tuffryn Acrodisc 0,22 μm (produzido por PALL) e usado nos experimentos a seguir.

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Exemplo 3: Teste de Administração da Proteína recombinante no Cachorro PORTADOR DE CÂNCER (1) Ensaio Anti-Tumor

[0104] O efeito anti-tumor da proteína recombinante que foi purificada conforme descrito acima foi avaliado em um cachorro portador de tumor (câncer de mama) que possui um tumor epidérmico.

[0105] Uma quantidade igual do Adjuvante incompleto de Freund (produzido por Wako Pure Chemicals) foi misturada a 100 μg (0,5 ml) do polipeptídeo recombinante purificado, conforme descrito acima, a fim de preparar um agente terapêutico para o câncer. O mesmo foi administrado em um linfonodo regional próximo a um tumor no total 3 vezes, através da execução das administrações subsequentes por 3 dias e 7 dias após a primeira administração. Como resultado, o tumor com um tamanho de cerca de 55 mm³ no momento da administração do agente terapêutico para câncer teve o tamanho reduzido para 30 mm³ 10 dias após a primeira administração; para 16 mm³ 20 dias após a primeira administração; e para 10 mm³ 30 dias após a primeira administração.

[0106] Adicionalmente, em outro paciente canino que sofre de câncer na glândula mamária, uma mistura de 100 μg (0.5 ml) do polipeptídeo descrito acima derivado a partir do cachorro e 0,5 ml do adjuvante incompleto de Freund foram administrados da mesma maneira, conforme descrito acima, um total de 3 vezes. Adicionalmente, junto com as administrações respectivas, 100 μg de interleucina canina 12 foram administradas de forma subcutânea. Como resultado, o tumor com um tamanho de cerca de 155 mm³ no momento da administração do agente terapêutico para câncer regrediu completamente 24 dias após a primeira administração.

(2) Ensaio de Imuno-Indução

[0107] O sangue do paciente canino no qual o efeito anti-tumor foi obtido no teste de administração no objeto descrito acima (1) foi coletado antes

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52/64 da administração do agente terapêutico para câncer, e 10 dias e 30 dias após a primeira administração. As células mononucleares sanguíneas periféricas foram isoladas de acordo com um método convencional e através do ensaio ELISPOT para IFNy com o uso dos mesmos, a imuno-indução de cada proteína recombinante administrada foi avaliada.

[0108] Em uma placa com 96 poços produzida por Millipore (MultiScreen-IP, MAIPS 4510), foram dispostos 100 μL/poço de 70% de etanol e a placa foi deixada descansando por 5 minutos, seguido pela remoção do etanol através de aspiração. A placa foi lavada com água esterilizada e 300 μL/poço de 200 mM de Bicarbonato de sódio (pH 8,2) foram colocados na mesma. Após deixar descansar por 5 minutos, o Bicarbonato de sódio foi removido por aspiração e, então, a placa foi lavada. Subsequentemente, 0,5 μl/poço de anticorpo monoclonal γ de interferon ant icanino (produzido por R&D, clone 142529, MAB781) misturado a 200 mM de Bicarbonato de sódio foi disposto em poços e a placa foi incubada a 37°C do dia para noite a fim de imobilizar o anticorpo primário. Após a remoção do anticorpo primário por aspiração, 300 μL/poço de uma solução bloqueadora (Bicarbonato de sódio com 1% de BSA-5% de sacarose-200 mM (pH 8,2)) foram adicionados aos poços e a placa foi incubada a 4°C do dia para a noite a fim de bloquear a placa. Após a remoção da solução bloqueadora por a spiração, 300 μL/poço de 10% de meio RPMI que contém soro de feto de bezerro (produzido por Invitrogen) foram dispostos em poços e a placa foi deixada descansando por 5 minutos, seguido de remoção do meio por aspiração. Subsequentemente, 5 χ 10⁵ células/poço das células mononucleares sanguíneas periféricas caninas suspensas em 10% de meio RPMI que contém soro de feto de bezerro foram dispostos na placa e 10 μL/poço do polipeptídeo derivado canino ou polipeptídeo derivado humano usado em cada administração foi adicionado ao mesmo, seguido do cultivo

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53/64 de células sob as condições de 37°C e 5% CO2 por 24 horas, a fim de permitir imunócitos que podem existir nas células mononucleares sanguíneas periféricas a fim de produzir interferon γ. Após o cultivo, o meio foi removido e os poços foram lavados 6 vezes com uma solução de lavagem (0,1% de Bicarbonato de sódio Tween 20-200mM (pH 8,2)). Em cada poço, 100 μL de anti-anticorpo policlonal de cachorro e coelho diluído 1000 vezes com a solução bloqueadora descrita acima foram colocados e a placa foi incubada a 4°C do dia para a noite. Após a lavagem dos poços 3 vezes com a solução de lavagem descrita acima, 100 μL de anti-anticorpo de coelho marcado por HRP diluído 1000 vezes com a solução bloqueadora descrita acima foram dispostos em cada poço e permitiu-se que a reação prosseguisse a 37°C por 2 horas. Após a lavagem dos poços 3 vezes com a solução de lavagem descrita acima, o material resultante foi colorido com Konica Immunostain (produzido por Konica) e os poços foram lavados com água para paralisar a reação. A partir disto, a membrana foi seca e o número de manchas aparentes foi contabilizado com o uso de KS ELISPOT (produzido por Carl Zeiss, Inc.). Como resultado, nas células mononucleares sanguíneas periféricas coletadas para amostra antes da administração do polipeptídeo, nenhuma mancha foi detectada. Por outro lado, após a administração de polipeptídeo no paciente canino, 18 e 87 manchas foram detectadas nas células mononucleares sanguíneas periféricas coletadas para amostra 10 dias e 30 dias, respectivamente, após a administração.

[0109] A partir dos resultados acima, confirmou-se que os imunócitos que reagem especificamente com a proteína recombinante administrada e produzem interferon γ foram induzidos no paciente canino no qual a proteína recombinante foi administrada e acreditou-se que o efeito anti-tumor descrito acima (1) foi manifestado pelas imunorreações nas quais estes imunócitos foram envolvidos principalmente.

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Exemplo 4: Indução de Células T positivas para CD8 Reativas com Epítopos de Peptídeo derivado de CD179b (1) Previsão de Motivos de Peptídeo que se Liga a HLA-A0201 e HLA-A24

[0110] As informações sobre a sequência de aminoácidos da proteína CD179b humana foram obtidas a partir do GenBank. Para a previsão dos motives de ligação de HLA-A0201 e HLA-A24, a sequência de aminoácidos da proteína CD179b humana foi analisada com o emprego de um programa de previsão baseado em computador que usa um software BIMAS conhecido (disponível em http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). Como resultado, 8 tipos de peptídeos de SEQ ID N°s: 108 a 110 e SEQ ID N°s: 113 a 117, dos quais se espera serem capazes de se ligar à molécula HLA-A0201; e 5 tipos de peptídeos de SEQ ID N°s: 110 a 112, SEQ ID N°: 115 e SEQ ID N°: 116, das quais se espera serem capazes de se ligar a molécula HLA-A24; foram selecionadas.

(2) Indução de Células T positivas para CD8 reativas a peptídeo epítopo

[0111] A partir de um indivíduo saudável com HLA-A0201 positivo, o sangue periférico foi isolado e o sangue periférico foi sobreposto por meio de separação de linfócito (OrganonpTeknika, Durham, NC), seguido de centrifugação do mesmo a 1.500 rpm em temperatura ambiente por 20 minutos. Uma fração que contém A PBMC foi recuperada e lavada 3 vezes (ou mais) com tampão frio de fosfato para se obter células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs). As PBMCs obtidas foram suspensas em 20 ml de meio de AIM-V (produzido por Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), e permitiu-se que as mesmas aderissem a um frasco de cultivo (produzido por Falcon) a 37°C sob 5% de CO2 por 2 horas. As células que não aderiram foram usadas para a preparação de células T e as células aderidas foram usadas na preparação de

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55/64 células dendríticas.

[0112] As células aderidas foram cultivadas em meio de AIM-V na presença de IL-4 (1000 U/ml) e GM-CSF (1000 U/ml). Após seis dias, o meio foi substituído por meio de AIM-V suplementado com IL-4 (1000 U/ml), GM-CSF (1000 U/ml), IL-6 (1000 U/ml, Genzima, Cambridge, MA), IL-Ιβ (10 ng/ml, Genzima, Cambridge, MA) e TNF-α (10 ng/ml, Genzima, Cambridge, MA), e o cultivo foi continuado por 2 dias. A população de células obtidas, que não aderiram, foi usada como as células dendríticas.

[0113] As células dendríticas preparadas foram suspensas em meio de AIM-V em uma densidade de célula de 1 χ10⁶ células/ml, e o peptídeo de SEQ ID N°s: 108 a 110 ou SEQ ID N°s: 113 a 117, que são sequências selecionadas acima (1) e das quais se espera ser capazes de se ligarem à molécula HLA-A201, foi adicionado à suspensão resultante em uma concentração de 10 μg/ml, seguido pelo cultivo com o uso de placa com 96 poços sob as condições de 37°C, 5% de CO2 por 4 horas. A partir disto, as células foram radiadas com raios-X (3000 rad), lavadas com meio de AIM-V, suspensas em meio de AIM-V que contém 10% de soro AB humano (Nabi, Miami, FL), IL-6 (1000 U/ml) e IL-12 (10 ng/ml, Genzima, Cambridge, MA), e as mesmas foram dispostas em poços de uma placa com 24 poços em uma população de 1*10⁵células/poço. A população de célula T preparada foi adicionada aos poços em uma população de 1 x 10⁶ células/poço e as células foram cultivadas em 37°C sob 5% de CO2. Após sete dias, cada sobrenadante de cultivo foi descartado e as células foram tratadas com cada um dos peptídeos obtidos da mesma maneira, conforme descrito acima. Após a radiação com raios-X, as células dendríticas foram suspensas em meio de AIM-V que contém 10% de soro AB humano (Nabi, Miami, FL), IL-7 (10 U/ml, Genzima, Cambridge, MA) e IL-2 (10 U/ml, Genzima, Cambridge, MA) (densidade de célula: 1*10⁵células/ml) e as células foram dispostas em poços de uma placa com 24 poços em uma

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56/64 população de célula de 1 x 10⁵ células/poço e as mesmas foram adicionalmente cultivadas. As mesmas operações foram repetidas 4 a 6 vezes em intervalos de 7 dias e as células T estimuladas foram, então, recuperadas, que após a indução das células T positivas para CD8 foram confirmadas por citometria de fluxo.

[0114] Ainda para os peptídeos de SEQ ID N°s: 110, 111, 112, 115 e 116, dos quais se esperava que fossem capazes de se ligarem à molécula HLA-A24, a indução das células T positivas para CD8 reativas a peptídeo epítopo foi tentada com o uso de células dendríticas e uma população de célula T induzida a partir do sangue periférico de um indivíduo saudável com HLA-A24positivo.

[0115] Como um controle negativo, um peptídeo fora do escopo da presente invenção (SEQ ID NO: 118) foi usado.

Exemplo 5: Determinação de Epítopos antígenos de célula T derivados de CD179b que Estimulam Células T positivas para CD8 positivas para HLAA0201 (1) Capacidade de produção de (1) IFN-γ[0116] A fim de examinar a especificidade de cada uma das células T, cujo crescimento foi confirmado dentre as células T induzidas conforme descrito acima, em epítopos de peptídeo, 5*103 adicionaram-se células T a 5*10⁴ células T2 (Salter RD et al., Immunogenetics, 21:235-246 (1985), compradas de ATCC) que foram pulsadas com cada peptídeo e expressam a molécula HLA-A0201 (cultivada em meio de AIM-V suplementado com cada peptídeo em uma concentração de 10 μg/ml, a 37°C sob 5% de CO2 por 4 horas) e as células foram cultivadas em meio de AIM-V que contém 10% de soro AB humano em uma placa com 96 poços por 24 horas. O sobrenadante foi recuperado após o cultivo e a quantidade de produção de IFN-γ foi medida por ELISA. Como resultado, a produção de IFN-γ foi confirmada nos sobrenadantes de cultivo nos poços de células T2 pulsadas com o peptídeo de SEQ ID N°s: 108

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57/64 a 110 e SEQ ID N°s: 113 a 117, quando comparados aos sobrenadantes de cultivo nos poços de células T2 que não foram pulsados com um peptídeo (Figura 2). A partir destes resultados, revelou-se que os peptídeos descritos acima são peptídeos de epítopo de célula T que apresenta capacidade de estimular especificamente, e permitir a proliferação de células T positivas para CD8 e positivas para HLA-A0201, induzindo assim a produção de IFN-γ.

[0117] Na Figura 2, os numerais de referência 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 na abscissa indicam as capacidades de produção de IFN-γ das células T positivas para CD8 e positivas para HLA-A0201 devido ao estímulo proveniente das células T2 pulsadas com os peptídeos de SEQ ID N°s: 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116 e 117, respectivamente. O numeral de referência 11 indica o resultado para o peptídeo de SEQ ID N°: 118 usado como o controle negativo.

(2) Ensaio de citotoxidade

[0118] Subsequentemente, se os peptídeos de SEQ ID N°s: 108 a 110 e SEQ ID N°s: 113 a 117 usados na presente invenção são apresentados na molécula HLA-A0201s ou não em células de tumor, que são positivas para HLA-A0201 e expressam CD179b, e se as células T positivas para CD8 estimuladas por estes peptídeos podem danificar as células de tumor que são positivas para HLA-A0201 e expressam CD179b ou não foram examinados. Em um 50-ml tubo centrífugo, 10⁶ células de linhagem de célula de leucemia de célula B, células Namalwa (compradas de ATCC), cuja expressão de CD179b foi confirmada, foram coletadas e 100 μ^ de cromo 51 foi adicionado à mesma, seguido da incubação a 37°C por 2 horas. A partir disto, as células foram lavadas 3 vezes com meio RPMI (produzido por Gibco) que contém 10% de soro fetal de bezerro (produzido por Gibco) e dispostas em poços de uma placa com fundo em V de 96 poços em uma quantidade de 10³ células/poço. Ademais, em cada poço, 5χ10⁴ células T suspensas em meio RPMI que contém 10% de soro fetal bovino, cujas células foram estimuladas por cada peptídeo, e material positivo a

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CD8 reativo a epítopo peptídeo positivo para HLA-A0201, foram adicionados, seguido de cultivo a 37°C sob 5% de CO2 por 4 horas. A partir disto, através da medição da quantidade de cromo 51 no sobrenadante de cultivo, que foi liberado a partir das células de tumor danificadas, a atividade de citotoxidade das células T positivas para CD8 estimuladas por cada peptídeo foi calculada. Como resultado, revelou-se que as células T positivas para CD8 e positivas para HLAA0201 estimuladas pelo peptídeo têm uma atividade de citotoxidade contra as células Namalwa (Figura 3). As células T positivas para CD8 induzidas com o uso do peptídeo de controle negativo (SEQ ID N°: 118) não demonstraram uma atividade de citotoxidade. Dessa forma, provou-se que cada um dos peptídeos usados na presente invenção (SEQ ID N°s: 108 a 110 e SEQ ID N°s: 113 a 117) é apresentado na molécula HLA-A0201s em células de tumor que são positivas para HLA-A0201 e expressam CD179b, e que o peptídeo apresenta capacidade de induzir as células T citotóxicas positivas para CD8 que podem danificar tais células de tumor.

[0119] A atividade de citotoxidade foi determinada por, conforme descrito acima, mistura das 10⁵ células T positivas para CD8 estimuladas e induzidas com cada um dos peptídeos usados na presente invenção e 10³células da linhagem de célula Namalwa de leucemia de célula B que foram feitas para incorporar cromo 51; cultivar a mistura resultante por 4 horas; medir a quantidade de cromo 51 liberada no meio de cultivo após o cultivo e calcular a atividade de citotoxidade das células T positivas para CD8 em oposição às células Namalwa de acordo com a equação a seguir*:

*Equação: Atividade de citotoxidade (%) = a quantidade de cromo 51 liberado das células Namalwa na adição de células T positivas para CD8 / a quantidade de cromo 51 liberadas a partir de células alvo na adição de ácido clorídrico1 N x 100.

[0120] Na Figura 3, os numerais de referência 12, 13, 14, 15, 16,

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17, 18 e 19 na abscissa indicam as atividades citotóxicas das células T positivas para CD8 e positivas para HLA-A0201 contra as células Namalwa, cujas células T foram estimuladas com o uso de SEQ ID N°s: 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116 e 117, respectivamente. O numeral de referência 20 indica a atividade de citotoxidade de células T positivas para CD8 induzidas com o uso de peptídeo de controle negativo (SEQ ID NO: 118).

Exemplo 6: Determinação de Epítopos antígenos de célula T derivados de CD179B QUE ESTIMULAM CÉLULAS T POSITIVAS PARA CD8 E POSITIVAS PARA HLAA24 (1) Capacidade de Produção de IFN-γ

[0121] A fim de examinar a especificidade das células T positivas para CD8 reativas a peptídeo epítopo induzidas no Exemplo 3(2) a epítopos de peptídeo da mesma maneira do Exemplo 5(1), 5*10³ células das células T descritas acima foram adicionadas a 5*10⁴ células JTK-LCL que expressam a molécula HLA-A24s (comprada de RIKEN), cujas células JTK-LCL foram pulsadas com o uso de peptídeo de SEQ ID N°s: 110, 111, 112, 115 ou 116 (cultivadas em meio de AIM-V suplementadas com cada peptídeo em uma concentração de 10 μg/ml, a 37°C sob 5% de CO2 por 4 horas), e as células foram cultivadas em meio de AIM-V que contêm 10% de soro AB humano em uma placa com 96 poços por 24 horas. O sobrenadante, após o cultivo, foi recuperado e a quantidade de produção de IFN-γ foi medida por ELISA. Como resultado, a produção de IFN-γ foi confirmada nos sobrenadantes de cultivo nos poços de células JTK-LCL pulsadas com os peptídeos de SEQ ID N°s: 110, 111, 112, 115 e 116, quando comparados aos sobrenadantes de cultivo nos poços de células JTK-LCL que não foram pulsadas com um peptídeo (Figura 4). A partir destes resultados, revelou-se que os peptídeos descritos acima são peptídeos de epítopo de célula T que possuem capacidade de estimular de forma específica, e permitir a proliferação de células T positivas para CD8 e positivas

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60/64 para HLA-A24, induzindo assim a produção de IFN-γ.

[0122] Na Figura 4, os numerais de referência 21, 22, 23, 24 e 25 na abscissa indicam as Capacidades de produção de IFN-γ das células T positivas para CD8 e positivas para HLA-A24 devido ao estímulo das células JTK-LCL pulsadas com os peptídeos de SEQ ID N°s: 110, 111, 112, 115 e 116, respectivamente. O numeral de referência 26 indica o resultado do peptídeo de SEQ ID N°: 118 usado como controle negativo.

(2) Ensaio de citotoxidade

[0123] Subsequentemente, se os peptídeos de SEQ ID N°s: 110, 111, 112, 115 e 116 usados na presente invenção são apresentados ou não na molécula HLA-A24 em células que são positivas para HLA-A24 e que expressam CD179b, e se as células T positivas para CD8 estimuladas por estes peptídeos podem ou não danificar as células de tumor que são positivas para HLA-A24 e expressam CD179b foram examinadas da mesma maneira que ocorreu no Exemplo 5(2). Em um tubo centrífugo de 50-ml, 10⁶ células JTK-LCL, que são positivas para HLA-A24 e expressam CD179b, foram coletadas, e 100 μ^ de cromo 51 foram adicionados a mesma, seguido pela incubação a 37°C por 2 horas. A partir disto, as células foram lavadas 3 vezes com meio RPMI que contém 10% de soro fetal de bezerro, e as mesmas foram dispostas em poços de uma placa com fundo em V de 96 poços em uma quantidade de 10³células/poço. Ademais, em cada poço, 5*10⁴ células T suspensas em meio RPMI que contém 10% de soro fetal de bezerro, cujas células foram estimuladas com cada peptídeo, e positivas para HLA-A24, reativas a peptídeo e epítopo e positivas para CD8, foram adicionadas, seguido por cultivo a 37°C sob 5% de CO2 por 4 horas. A partir disto, através da medição da quantidade de cromo 51 no sobrenadante de cultivo, que foi liberado a partir das células danificadas, a atividade de citotoxidade das células T positivas para CD8 estimuladas por cada peptídeo foi calculada. Como resultado, revelou-se que as células T positivas

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61/64 para CD8 e positivas para HLA-A24 estimuladas pelo peptídeo têm uma atividade de citotoxidade contra as células JTK-LCL (Figura 5). Assim, provouse que cada um dos peptídeos usados na presente invenção (SEQ ID N°s: 110, 111, 112, 115 e 116) é apresentado na molécula HLA-A24s nas células que são positivas para HLA-A24 e expressam CD179b, e que o peptídeo possui a capacidade de induzir as células T citotóxicas positivas para CD8 que podem danificar tais células. As células T positivas para CD8 induzidas com o uso do peptídeo de controle negativo (SEQ ID N°: 118) não demonstrou uma atividade de citotoxidade.

[0124] Na Figura 5, os numerais de referência 27, 28, 29, 30 e 31 indicam as atividades citotóxicas das células T positivas para CD8 e positivas para HLA-A24 estimuladas com os peptídeos de SEQ ID N°: 110, 111, 112, 115 e 116, respectivamente, contra as células JTK-LCL. O numeral de referência 32 indica a atividade de citotoxidade das células T positivas para CD8 induzidas com o uso do peptídeo de controle negativo (SEQ ID NO: 118).

Exemplo 7: Detecção de Câncer com o uso de Proteína Recombinante (1) Detecção de Câncer Canino

[0125] O sangue foi coletado dos 153 pacientes caninos cujo tumor maligno foi confirmado e 264 cachorros saudáveis, e o soro foi separado do mesmo. Com o uso da proteína de antígeno de câncer derivada de cachorro preparada no Exemplo 2 (o 5° a 120° aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 5) e anti-anticorpo igG de cachorro, o título do anticorpo IgG no soro que reage especificamente com o polipeptídeo foi medido por ELISA.

Ii. Descrição

[0126] A imobilização do polipeptídeo preparado em uma fase sólida foi executada colocando 100 μL/poço da solução de proteína recombinante diluída em 100μg/mL com material salino tamponado-fosfato em uma placa amino imobilizadora com 96 poços (produzido por Nunc), em seguida

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62/64 a placa é deixada para descanso a 4°C do dia para a noite. O bloqueio é executado através da adição de 100 μL/poço de uma solução, que foi preparada por dissolução de 4 g de pó Block Ace (produzido por DS Pharma Biomedical Co, Ltd.) em 100 ml de água purificada, dentro dos poços e da agitação da placa em temperatura ambiente por 1 hora. O soro diluído 1000 vezes com a solução bloqueadora foi adicionado aos poços em uma quantidade de 100 μL/poço, e a placa foi agitada em temperatura ambiente por 3 horas, a fim d permitir que a reação prosseguisse. Os poços foram lavados 3 vezes com o material salino tamponado-fosfato que contém 0,05% de Tween 20 (produzido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (referido na presente invenção como PBS-T) e 100 μL/poço de Anticorpo IgG canino modificado por HRP (Anti HRP conjugado (H+L) de IgG canino e de cabra: produzido por BETHYL Laboratories) diluído 3000 vezes com a solução bloqueadora foi adicionado ao mesmo, seguido de agitação da placa em temperatura ambiente por 1 hora a fim de permitir que a reação prosseguisse. Após lavar os poços 3 vezes com PBS-T, 100 μl/poço de um TMB substrato de HRP (1-Etapa Turbo TMB (tetrametilbenzidina), PIERCE) foi adicionado, e permitiu-se que a reação enzima-substrato prosseguisse em temperatura ambiente por 30 minutos. A partir disto, 100 μl/poço de 0,5 M de solução de ácido sulfúrico (produzido por Sigma-Aldrich Japão) foram adicionados aos poços a fim de parar a reação e a absorção a 450 nm foi medida com o uso de um leitor de microplaca. Como controle, um caso onde a mesma operação foi executada da mesma maneira, conforme descrito acima, exceto que a proteína recombinante preparada não foi imobilizada, ou exceto que o soro do cachorro portador de tumor não foi reagido, e sim designado para comparação

[0127] Como as espécies de câncer a serem usadas para a detecção acima de câncer, 112 as amostras de câncer de mama, 31 amostras de linfoma e 10 amostras de leucemia que foram diagnosticadas

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63/64 definiti8vamente como malignas por diagnóstico patológico foram usadas.

[0128] Estes soros derivados de corpos vivos dos cachorros portadores de tumor apresentaram títeres de anticorpo significativamente altos contra a proteína recombinante. Revelou-se, através do diagnóstico de uma amostra que apresenta duas vezes o valor médio das amostras caninas saudáveis como malignas, 61 amostras (54%) de câncer de mama, 21 amostras (71%) de linfoma e 7 amostras (70%) de leucemia poderiam ser diagnosticadas como malignas de forma bem-sucedida. Quando o teste foi executado de forma similar com o uso de soros provenientes de 30 pacientes caninos que possuem tumor na glândula mamária, que foi definitivamente diagnosticado como benigno, a quantidade de amostras que apresenta duas vezes o valor médio as amostras caninas saudáveis foi 0.

[0129] Da mesma maneira, com o uso da proteína de antígeno de câncer derivado de humanos preparada no Exemplo 2 (a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 3) e do anti-anticorpo igG de cachorro, o título do anticorpo IgG que reage especificamente com o polipeptídeo em cada uma das amostras de soro de cachorros portadores de tumor descritas acima foi medido por ELISA. Como resultado, revelou-se que 56 amostras (50%) de câncer de mama, 18 amostras (58%) de linfoma e 5 amostras (50%) de leucemia poderiam ser julgadas como malignas.

[0130] Quando a execução foi executada da mesma maneira, conforme descrito acima, com o uso de efusão pleural e ascite coletado a partir dos pacientes caninos com câncer terminal, os valores similares aos resultados obtidos pelo método de detecção com o uso de soro poderiam ser detectados e o diagnóstico do câncer seria possível.

(2) Detecção de Câncer em Humanos

[0131] Da mesma maneira, o uso da proteína de antígeno de câncer derivado de humanos (a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 3) usada na

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64/64 detecção e anti-anticorpo IgG humano acima, o título de anticorpo IgG em um indivíduo saudável que reage especificamente com o polipeptídeo foi medido. O anticorpo secundário a ser usado foi um anti-anticorpo IgG humano modificado por HRP (produzido por HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: produzido por Zymed Laboratories) diluído 10000 vezes com a solução bloqueadora. Como controle positivo, a albumina branca de ovo que foi preparada em 50 μg/ml com material salino tamponado-fosfato e imobilizada na fase sólida foi usada. Como resultado, no caso da albumina branca de ovo, sete indivíduos saudáveis apresentaram uma absorção de 0,45 a 450 nm em média, o que foi um número alto. Por outro lado, no caso do polipeptídeo descrito acima, a absorção foi 0, o que significa que a reação não foi detectada de qualquer forma.

[0132] Ademais, da mesma maneira conforme descrito acima, o uso de 17 amostras de soros derivados de pacientes que sofrem de câncer de mama maligno (comprado junto à Promeddx), o título do anticorpo IgG em cada soro que reage especificamente com a proteína de antígeno de câncer derivado de humanos (sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 3) foi medido de forma similar. Como resultado, no caso do polipeptídeo descrito acima, os 17 pacientes com câncer de mama apresentaram uma absorção de 0,28 a 450 nm em média, o que foi considerado um número alto. Assim, revelou-se que o câncer pode ser detectado pelo método presente também em humanos.

Aplicabilidade Industrial

[0133] A presente invenção é útil para a terapia de câncer já que a mesma produz um agente indutor de imunidade que contém um polipeptídeo que manifesta uma atividade anti-tumor contra câncer(es) (tumor(es)), como câncer de mama, leucemia e/ou linfoma. Ademais, a presente invenção é útil para o diagnóstico de câncer já que a mesma produz um novo método de detecção para câncer.

Claims

Reivindicações

1. USO DE PELO MENOS UM POLIPEPTÍDEO, selecionado a partir dos polipeptídeos (a) a (c), caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para terapia e/ou profilaxia de câncer de mama e/ou leucemia, em que dito polipeptídeo possui uma atividade indutora de imunidade;

em que:

(a) é um polipeptídeo que consiste em uma das sequências de aminoácidos de números ímpares dentre as SEQ ID N°s: 3 a 95;

(b) é um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116 ou SEQ ID NO:117; e (c) é um polipeptídeo que consiste, como uma sequência parcial do mesmo, em uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116 ou SEQ ID NO:117, dito polipeptídeo tendo de 8 a 12 resíduos de aminoácidos.
2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender mais de um dos ditos polipeptídeos como ingredientes eficazes.
3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

2, caracterizado por compreender adicionalmente um adjuvante.
4. MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE CÂNCER DE MAMA E

LEUCEMIA IN VITRO, caracterizado por compreender as etapas de:

(1) medição da expressão do polipeptídeo (a) abaixo:

(a) é um polipeptídeo produzido no ser vivo que possui uma reatividade para se ligar, por reação antígeno-anticorpo, a um anticorpo dirigido contra um polipeptídeo que consiste essencialmente de pelo menos 7 aminoácidos consecutivos em uma das sequências de aminoácidos de números

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2/2 ímpares dentre as SEQ ID N°s: 3 a 95; ou (b) a investigação da expressão do gene CD179b, que possui uma região de codificação que apresenta qualquer uma dentre as sequências base selecionadas a partir de SEQ ID N°:1 e de números pares dentre as SEQ ID n°:4 a 94 em uma amostra derivada de um paciente com câncer, e a comparação da mesma com o nível de expressão do gene em uma amostra derivada de um indivíduo saudável.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela medição da expressão do dito polipeptídeo ser realizada através da medição de anticorpo(s) que pode(m) estar contido(s) na amostra através de imunoensaio, em que o(s) anticorpo(s) foi/foram induzido(s) no ser vivo contra o dito polipeptídeo a ser mensurado.
6. REAGENTE PARA A DETECÇÃO DE CÂNCER DE MAMA

E LEUCEMIA, caracterizado por compreender, em um veículo farmaceuticamente aceitável, um polipeptídeo que é submetido à reação antígeno-anticorpo com um anticorpo induzido em um ser vivo contra um polipeptídeo como abaixo:

(a) é um polipeptídeo que consiste em uma das sequências de aminoácidos de números ímpares dentre SEQ ID N°s: 3 a 95.