KR101323192B1 - 면역 유도제 및 암의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

(a) 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, (b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는코딩하는레오티드를 포함하고 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 함유하는 면역 유도체는 암의 치료용 및/또는 예방용으로서 사용된다. 또한, 상기 폴리펩티드는 암 환자의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 반응하므로, 시료 중의 상기 항체를 측정하면 생체 내의 암을 검출할 수 있다.

Description

면역 유도제 및 암의 검출 방법{IMMUNITY-INDUCING AGENT AND METHOD FOR DETECTION OF CANCER}
본 발명은 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용한 신규 면역 유도제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 암의 검출 방법에 관한 것이다.
암은 전체 사망 원인의 제 1 위를 차지하는 질환이고, 현재 행해지고 있는 치료는 수술 요법을 주체로 방사선 요법과 화학 요법을 조합한 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 불구하고, 일부의 암을 제외하고 암의 치료 성적은 그다지 향상되고 있지 않은 것이 현재의 상태이다. 최근, 분자 생물학이나 암 면역학의 진보에 의해 암에 반응하는 세포 장해성 T세포에 의해 인식되는 암 항원류, 암 항원을 코딩하는 유전자류 등이 동정되어 있고, 항원 특이성 면역 요법에의 기대가 높아지고 있다(비특허문헌 1).
면역 요법에 있어서는 부작용을 경감하기 위해서 그 항원으로서 인식되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백은 정상 세포에는 거의 존재하지 않고, 암세포에 특이적으로 존재하고 있는 것을 필요로 한다. 1991년, 벨기에 Ludwig 연구소의 Boon 등은 자기 암 세포주와 암 반응성 T세포를 사용한 cDNA 발현 클로닝법에 의해 CD8 양성 T세포가 인식하는 인간 멜라노마 항원 MAGE1을 단리했다(비특허문헌 2). 그 후, 암 환자의 생체 내에서 자기의 암에 반응해서 산생되는 항체가 인식하는 종양 항원을 유전자의 발현 클로닝의 방법을 도입해서 동정하는 SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)법이 보고되어 있고(비특허문헌 3; 특허문헌 1), 이 방법에 의해 몇몇의 암 항원이 단리되어 있다(비특허문헌 4~비특허문헌 9). 또한, 그 일부를 타겟으로 해서 암 면역 요법의 임상 시험이 개시되어 있다.
한편, 인간과 마찬가지로 개나 고양이에서도 유선암, 백혈병, 임파종 등 다수의 종양이 공지되어 있고, 개나 고양이의 질병 통계에서도 상위에 랭크되어 있다. 그러나, 개나 고양이의 암에 대해 유효한 치료약 및 예방약은 현재 시점에서 존재하지 않는다. 대부분의 개나 고양이의 종양은 진행되어 종유가 커지고 나서 기르는 주인이 알아차리는 케이스가 대부분이어서, 내원하여 외과적 수술에 의해 절제하거나 인체약(항암제 등)을 투여해도 이미 늦어서 처치 후 곧 사망하는 경우가 많다. 이와 같은 현상 중에서 개나 고양이에 유효한 암의 치료약 및 예방약이 입수 가능해지면, 개의 암에 대한 용도가 열릴 것으로 기대된다.
또한, 암은 조기 발견할 수 있으면 치료 성적이 좋기 때문에, 암 환자의 체력적, 경제적 부담이 없고, 혈청이나 뇨 등을 이용하여 간편하게 검사할 수 있는 암의 검출 방법이 요구되고 있다. 혈액이나 뇨를 사용한 암 검출법으로서, 최근에는 종양 마커 등의 종양 생산물을 측정하는 방법이 보급되어 왔다. 종양 생산물이란, 종양에 관련된 항원, 효소, 특정 단백질, 대사 산물, 종양 유전자, 종양 유전자 생산물 및 종양 억제 유전자 등을 가리키고, 암 태아성 항원 CEA, 당단백질 CA19-9, CA125, 전립선 특이 항원 PSA, 갑상선에서 산생되는 펩티드 호르몬인 칼시토닌 등이 일부의 암에서 종양 마커로서 암 검출에 활용되고 있다(비특허문헌 10). 그러나, 많은 암종에 있어서는 암 검출에 유용한 종양 마커는 존재하지 않는다. 또한, 현재 공지되어 있는 종양 마커의 대부분은 체액 중에는 극히 미량(대략 pg/mL 정도)만이 존재하기 때문에 그들을 검출하기 위해서는 고감도의 측정법이나 특수한 기술을 필요로 한다. 이와 같은 현상 중에서 각종 암을 간편한 조작으로 고감도로 검출할 수 있는 신규 암 검출 수단이 제공되면 각종 암에 대한 진단 용도가 열릴 것으로 기대된다.
CD179b는 면역 글로블린의 대체 경쇄의 일부이고, B세포의 전구 세포(프리 B세포 및 프로 B세포)의 막 표면에 발현되어 있는 것이 공지되어 있다. B세포의 분화에 따라 소멸하여 성숙 B세포에서는 발현되지 않는다. 그러나, CD179b는 프리 B세포가 암화된 백혈병(프리 B세포성 백혈병) 세포에 있어서 발현되어 있는 것이 공지되어 있다(비특허문헌 10, 비특허문헌 11). 또한, CD179b는 프리 B세포가 암화된 임파종(프리 B세포성 임파종) 세포에 있어서도 발현되어 있고, 프리 B세포성 임파종의 진단 마커로서 이용할 수 있는 것이 공지되어 있다(비특허문헌 12). 그러나, 프리 B세포성 백혈병 세포 이외의 백혈병 세포, 프리 B세포성 임파종 이외의 임파종 및 유방암 세포 등에 있어서 특이적으로 발현되어 있다는 보고는 없다. 또한, CD179b에 대한 면역을 증강시키는 것이 암의 치료 및/또는 예방에 유용한 것을 시사하는 보고는 없다.
미국 특허 제 5698396호
아키요시 타케시, 「암과 화학 요법」, 1997년, 제 24 권, p551-519 Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813(1995) Int. J. Cancer, 72: 965-971(1997) Cancer Res., 58: 1034-1041(1998) Int. J. Cancer, 29: 652-658(1998) Int. J. Oncol., 14: 703-708(1999) Cancer Res., 56: 4766-4772(1996) Hum. Mol. Genet6: 33-39(1997) Adv. Immunol., 63: 1-41(1996) Blood, 92: 4317-4324(1998) Modern Pathology, 17: 423-429(2004)
본 발명의 목적은 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용한 신규 폴리펩티드를 발견하고, 상기 폴리펩티드의 면역 유도제에의 사용을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 암의 진단에 유용한 암의 검출 수단을 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 예의 연구의 결과, 개의 유방암 조직 유래 cDNA 라이브러리와 동일한 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 그 cDNA를 기초로 해서 서열표의 서열 번호 5~93 중 홀수의 서열 번호(즉, 서열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 91 또는 93)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 개 CD179b 폴리펩티드를 제작했다. 또한, 취득한 유전자의 인간 상동성 유전자를 기초로 해서 서열 번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 인간 CD179b 폴리펩티드를 제작하고, 마찬가지로 소 상동성 유전자를 기초로 해서 서열 번호 95로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 소 CD179b 폴리펩티드를 제작했다. 그리고, 이들 CD179b 폴리펩티드가 유방암, 백혈병 및 임파종 세포에 특이적으로 발현되어 있는 것을 발견했다. 또한, 이들 CD179b를 생체에 투여함으로써 생체 내에 CD179b에 대한 면역 세포를 유도할 수 있는 것 및 CD179b를 발현하는 생체 내의 종양을 퇴축시킬 수 있는 것을 발견했다. 또한, CD179b 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능하게 포함하는 재조합 벡터가 CD179b를 발현시키는 암에 대하여 생체 내에서 항종양 효과를 유도하는 것을 발견했다.
또한, CD179b 단백 중의 부분 폴리펩티드가 항원 제시 세포에 의해 제시되어서 상기 펩티드에 특이적인 세포 장해성 T세포를 활성화 및 증식시키는 능력(면역 유도 활성)을 갖는 것, 이 때문에 상기 펩티드가 암의 치료 및/또는 예방에 유용하고, 또한 상기 펩티드와 접촉한 항원 제시 세포나 상기 항원 제시 세포와 접촉한 T세포가 암의 치료 및/또는 예방에 유용한 것을 발견했다. 또한, 상기 CD179b 단백의 아미노산 서열을 기초로 제작된 재조합 폴리펩티드가 담암 생체 중의 혈청과만 특이적으로 반응하는 점에서 암을 검출할 수 있는 것을 발견했다. 이상과 같이 함으로써 본원 발명을 완성하는 것에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다.
(1) 이하의 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 함유하는 면역 유도제.
(a) 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드.
(2) (1)에 있어서, 상기 (b)의 폴리펩티드가 상기 (a)의 폴리펩티드와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 면역 유도제.
(3) (1)에 있어서, 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드인 면역 유도제.
(4) (3)에 있어서, 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 면역 유도제.
(5) (3)에 있어서, 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 aa1-34 또는 aa52-75의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드인 면역 유도제.
(6) (5)에 있어서, 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열표의 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116 또는 서열 번호 117로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 서열표의 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116 또는 서열 번호 117로 나타내어지는 아미노산 서열을 부분 서열로서 포함하고, 아미노산 잔기수가 8~12개인 폴리펩티드인 면역 유도제.
(7) (1)~(6) 중 어느 하나에 있어서, 1개 또는 복수개의 상기 폴리펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 면역 유도제.
(8) (7)에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항원 제시 세포의 처리제인 면역 유도제.
(9) (1)~(8) 중 어느 하나에 있어서, 동물의 암 치료용 및/또는 예방용인 면역 유도제.
(10) (9)에 있어서, 상기 암이 CD179b 유전자를 발현시키는 암인 면역 유도제.
(11) (10)에 있어서, 상기 암이 유방암, 백혈병 또는 임파종인 면역 유도제.
(12) (1)~(11) 중 어느 하나에 있어서, 면역 증강제를 더 포함하는 면역 유도제.
(13) 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 HLA 분자의 복합체를 포함하는 단리 항원 제시 세포.
(14) 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 HLA 분자의 복합체를 선택적으로 결합시키는 단리 T세포.
(15) 이하의 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 개체에 투여하는 것을 포함하는 면역 유도 방법.
(a) 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드.
(16) 생체로부터 분리된 시료에 대하여 행하는 방법으로서, 이하의 (a) 내지 (c) 중 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현을 측정하는 것을 포함하는 암의 검출 방법.
(a) 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드.
(17) (16)에 있어서, 상기 폴리펩티드 발현의 측정은 상기 시료에 포함될 수 있는 측정해야 할 상기 폴리펩티드에 대하여 상기 생체 내에서 유도된 항체를 면역 측정함으로써 행해지는 암의 검출 방법.
(18) 생체로부터 분리된 시료에 대하여 행하는 방법으로서, 암 환자 유래의 시료 중의 서열표의 서열 번호 1 또는 서열 번호 4~94 중 짝수의 서열 번호로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 코드 영역을 갖는 CD179b 유전자의 발현을 조사하고, 건상자 유래의 시료 중의 상기 유전자의 발현량과 비교하는 것을 포함하는 암의 검출 방법.
(19) 이하의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드에 대하여 생체 내에서 유도되는 항체와 항원 항체 반응하는 폴리펩티드를 포함하는 암 검출용 시약.
(a) 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드
<발명의 효과>
본 발명에 의해, 암의 치료 및/또는 예방 등에 유용한 신규 면역 유도제가 제공된다. 후술의 실시예에 있어서 구체적으로 나타내는 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 담암 동물에 투여하면 상기 담암 동물체 내에 있어서 면역 세포를 유도할 수 있고, 또한 이미 생성되어 있는 암을 축소 또는 퇴축시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 신규 암의 검출 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 의해 시료 중의 상기 폴리펩티드의 발현을 측정하면, 육안으로 보이지 않는 작은 사이즈의 암이나 체내 심부의 암도 검출할 수 있기 때문에 건강 진단 등에 있어서의 암의 조기 발견에도 유용하다. 또한, 암 치료 후의 환자의 경과 관찰에 본 발명의 방법을 이용하면 재발한 암을 조기에 검출할 수도 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면 종양의 증대나 주변 조직에의 침윤, 림프절 및 원격 장기에의 암의 전이라고 하는 암의 진행도의 진단도 가능하다.
도 1은 CD179b 단백을 코딩하는 유전자의 정상 조직 및 종양 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조 번호 1; CD179b 단백을 코딩하는 유전자의 발현 패턴, 참조 번호 2; GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다. 또한, 도 1 중 세로축의 참조 번호 1은 상기에서 동정된 유전자의 발현 패턴을, 참조 번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2 중 가로축의 참조 번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10은 각각 서열 번호 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116, 117의 펩티드를 펄스한 T2세포로부터의 자극에 의한 HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포의 IFN-γ 산생능을 나타낸다. 참조 번호 11은 서열 번호 118의 음성 컨트롤의 펩티드(본 발명의 범위 이외의 서열인 펩티드)에 관한 결과를 나타낸다.
도 3 중 가로축의 참조 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19는 각각 서열 번호 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116, 117을 이용하여 자극한 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포의 Namalwa 세포에 대한 세포 장해 활성을 나타낸다. 참조 번호 20은 음성 컨트롤의 펩티드(서열 번호 118)를 이용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포 장해 활성을 나타낸다.
도 4 중 가로축의 참조 번호 21, 22, 23, 24, 25는 각각 서열 번호 110, 111, 112, 115, 116의 펩티드를 펄스한 JTK-LCL 세포로부터의 자극에 의한 HLA-A24 양성 CD8 양성 T세포의 IFN-γ 산생능을 나타낸다. 참조 번호 26은 서열 번호 118의 음성 컨트롤의 펩티드에 관한 결과를 나타낸다.
도 5 중 가로축의 참조 번호 27, 28, 29, 30, 31은 각각 서열 번호 110, 111, 112, 115, 116의 펩티드를 이용하여 자극한 HLA-A24 양성의 CD8 양성 T세포의 JTK-LCL 세포에 대한 세포 장해 활성을 나타낸다. 참조 번호 32는 음성 컨트롤의 펩티드(서열 번호 118)를 이용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포 장해 활성을 나타낸다.
<폴리펩티드>
본 발명의 면역 유도제에 유효 성분으로서 포함되는 폴리펩티드로서는 이하 (a), (b) 및 (c)의 폴리펩티드류에서 선택되는 1개 또는 복수개의 폴리펩티드가 열거된다.
(a) 서열표의 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호(즉, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지고, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드
(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드.
본 명세서에 있어서 사용되는 「폴리펩티드」란 복수의 아미노산이 펩티드 결합함으로써 형성되는 분자를 말하고, 구성하는 아미노산수가 많은 폴리펩티드 분자뿐만 아니라 아미노산수가 적은 저분자량의 분자(올리고펩티드)나 전장 분자도 포함되며, 본 발명에서는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 전장으로 이루어지는 단백질도 포함된다.
본 명세서에 있어서 사용되는 「아미노산 서열을 갖는」이란 아미노산 잔기가 특정한 순서로 배열되어 있다고 하는 의미이다. 따라서, 예를 들면 「서열 번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」란 서열 번호 3으로 나타내어지는 Leu Leu Arg Pro … (중략) … Ala Glu Cys Ser의 아미노산 서열을 갖고, 176 아미노산 잔기의 사이즈의 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 예를 들면 「서열 번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」를 「서열 번호 3의 폴리펩티드」라고 약기하는 경우가 있다. 「염기 서열을 갖는」이라고 하는 표현에 관해서도 동일하다.
본 명세서에서 사용되는 「면역 유도 활성」이란 생체 내에서 인터페론 등의 사이토카인을 분비하는 면역 세포를 유도하는 능력을 의미한다.
상기 폴리펩티드가 면역 유도 활성을 갖는지의 여부는 예를 들면 공지의 엘리스포트(ELISPOT) 분석 등을 이용하여 확인할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 후술의 실시예에 기재되는 바와 같이 면역 유도 활성을 평가해야 할 폴리펩티드를 투여한 생체로부터 말초혈 단핵구 등의 세포를 얻고, 상기 세포를 상기 폴리펩티드와 공존 배양하여 상기 세포로부터의 IFN-γ, 인터로이킨(IL) 등의 사이토카인 및/또는 케모카인의 산생량을 특이 항체를 이용하여 측정함으로써 상기 세포 중의 면역 세포수를 측정할 수 있으므로, 이에 따라 면역 유도 활성을 평가할 수 있다.
또는, 후술의 실시예에 기재되는 바와 같이 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 아미노산 서열을 기초로 제작한 재조합 폴리펩티드를 담암 동물에 투여하면 그 면역 유도 활성에 의해 종양을 축소 또는 퇴축시킬 수도 있다. 따라서, 상기 면역 유도 활성은 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 폴리펩티드를 발현하는 암세포의 증식을 억제하거나 또는 암 조직(종양)을 축소 또는 소멸시키는 능력(이하, 「항종양 활성」이라고 함)으로서 평가할 수도 있다. 폴리펩티드의 항종양 활성은 예를 들면 후술의 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이 실제로 상기 폴리펩티드를 담암 동물에 투여해서 종양이 축소 또는 퇴축되는지의 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다.
또는, 상기 폴리펩티드로 자극된 T세포(즉, 상기 폴리펩티드를 제시하는 항원 제시 세포와 접촉시킨 T세포)가 생체 이외에 종양 세포에 대하여 세포 장해 활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 폴리펩티드의 항종양 활성을 평가할 수도 있다. T세포와 항원 제시 세포의 접촉은 후술하는 바와 같이 양자를 액체 배지 중에서 공존 배양함으로써 행할 수 있다. 세포 장해 활성의 측정은 예를 들면 Int. J. Cancer, 58: p317, 1994에 기재된 51Cr 릴리즈 분석이라고 칭하는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
상기 폴리펩티드를 암의 치료 및/또는 예방 용도로 사용할 경우에는 특별하게 한정되지 않지만, 항종양 활성을 지표로서 면역 유도 활성을 평가하는 것이 바람직하다.
본 발명이 개시하는 서열표의 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 각각 나타내어지는 아미노산 서열은 개 유선암 유래 cDNA 라이브러리와 동일 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암견 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 인간 상동 인자(호모로그)로서 단리된 CD179b의 아미노산 서열이다(후술의 실시예 1 참조). 상기 (a)의 폴리펩티드는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중의 연속하는 7개 이상, 바람직하게는 연속하는 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산으로 이루어지고, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 또한, 이 분야에서 공지된 바와 같이 약 7 아미노산 잔기 이상의 폴리펩티드이면 항원성 및 면역원성을 발휘할 수 있다. 따라서, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 아미노산 서열 중의 연속하는 7 아미노산 잔기 이상의 폴리펩티드이면 면역 유도 활성을 가질 수 있으므로, 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다.
암 항원 폴리펩티드를 투여하는 것에 의한 면역 유도의 원리로서, 폴리펩티드가 항원 제시 세포에 도입되고, 그 후 상기 세포 내에서 펩티다아제에 의해 분해되어 보다 작은 단편이 되고, 상기 세포의 표면 상에 제시되어 그것을 세포 장해성 T세포 등이 인식하고, 그 항원을 제시하고 있는 세포를 선택적으로 죽여가는 것이 공지되어 있다. 항원 제시 세포의 표면 상에 제시되는 폴리펩티드의 사이즈는 비교적 작고, 아미노산수로 7~30 정도이다. 따라서, 항원 제시 세포 상에 제시된다고 하는 관점에서는 상기 (a)의 폴리펩티드로서는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7~30 정도인 것이 바람직한 형태 중 하나이고, 보다 바람직하게는 8~30 또는 9~30 정도의 아미노산으로 이루어지는 것이면 충분하다. 이들 비교적 작은 사이즈의 폴리펩티드는 항원 제시 세포 내에 도입되지 않고 직접 항원 제시 세포 상의 세포 표면에 제시되는 경우도 있다.
또한, 항원 제시 세포에 도입된 폴리펩티드는 상기 세포 내의 펩티다아제에 의해 임의적인 위치에서 절단되어 각종 폴리펩티드 단편이 생기고, 이들의 폴리펩티드 단편이 항원 제시 세포 표면 상에 제시되므로, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 전장 영역과 같이 큰 사이즈의 폴리펩티드를 투여하면 항원 제시 세포 내에서의 분해에 의해 항원 제시 세포를 개재하는 면역 유도에 유효한 폴리펩티드 단편이 필연적으로 생긴다. 따라서, 항원 제시 세포를 개재하는 면역 유도에 있어서도 사이즈가 큰 폴리펩티드를 사용할 수 있고, 아미노산수를 30 이상, 보다 바람직하게는 100 이상, 더욱 바람직하게는 200 이상, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 전장 영역의 폴리펩티드로 해도 좋다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 HLA의 각 형태의 결합 모티브를 갖는 8~12개, 바람직하게는 9~10개의 아미노산으로 이루어지는 에피토프 펩티드를 검색할 수 있는 대조 매체, 예를 들면 Bioinformatics & Molecular Analysis Selection(BIMAS)의 HLA Peptide Binding Predictions(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)에 의해 대조하고, 에피토프 펩티드가 될 수 있는 펩티드를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 aa1-34 또는 aa52-75의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드가 바람직하고, 또한 서열 번호 3의 폴리펩티드에 있어서는 서열 번호 108~117로 나타내어지는 폴리펩티드가 보다 바람직하다.
상기 (b)의 폴리펩티드는 상기 (a)의 폴리펩티드 중 소수의 아미노산 잔기가 치환 및/또는 결실 및/또는 부가 및/또는 삽입된 폴리펩티드로서, 원래의 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95 %이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 단백질 항원에 있어서 상기 단백질의 아미노산 서열 중 소수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 경우이어도 원래의 단백질과 거의 동일한 항원성 또는 면역원성을 갖는 경우가 있는 것은 당업자에 있어서 널리 공지되어 있다. 따라서, 상기 (b)의 폴리펩티드도 면역 유도 활성을 발휘할 수 있으므로, 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다. 또한, 상기 (b)의 폴리펩티드는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 아미노산 서열 중 1개 또는 몇 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 폴리펩티드인 것도 바람직하다.
본 명세서 중 아미노산 서열 또는 염기 서열에 관한 「서열 동일성」이란 비교해야 할 2개의 아미노산 서열(또는 염기 서열)의 아미노산 잔기(또는 염기)가 가능한 한 많이 일치하도록 양쪽 아미노산 서열(또는 염기 서열)을 정렬시켜, 일치한 아미노산 잔기수(또는 일치한 염기수)를 전체 아미노산 잔기수(또는 전체 염기수)로 나눈 것을 백분율(%)로 나타낸 것이다. 상기 정렬시에는 필요에 따라 비교하는 2개의 서열 중 한쪽 또는 양쪽에 적당하게 갭을 삽입한다. 이러한 서열의 정렬화는 예를 들면 BLAST, FASTA, CLUSTAL W 등의 주지의 프로그램을 이용하여 행할 수 있다(Karlin 및 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 2264-2268, 1993; Altschul 등, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997). 갭이 삽입되는 경우, 상기 전체 아미노산 잔기수(또는 전체 염기수)는 1개의 갭을 1개의 아미노산 잔기(또는 염기)로서 센 잔기수(또는 염기수)가 된다. 이렇게 하여 센 전체 아미노산 잔기수(또는 전체 염기수)가 비교하는 2개의 서열 사이에서 다른 경우에는 동일성(%)은 긴 쪽의 서열의 전체 아미노산 잔기수(또는 전체 염기수)로 일치한 아미노산 잔기수(또는 염기수)를 나누어서 산출된다.
아미노산 잔기의 치환에 있어서, 바람직한 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 천연의 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산은 저극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), 친수성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(Arg, Lys, His), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp, His)과 같이 유사의 성질을 갖는 것으로 그룹을 나눌 수 있고, 이들 사이에서의 치환, 즉 보존적 치환이면 폴리펩티드의 성질이 변화되지 않는 것이 많이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 상기 (a)의 폴리펩티드 중의 아미노산 잔기를 치환할 경우에는 이들의 각 그룹 사이에서 치환함으로써 면역 유도 활성을 유지할 수 있을 가능성이 높아진다.
상기 (c)의 폴리펩티드는 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 즉, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 일단 또는 양단에 다른 아미노산 또는 폴리펩티드가 부가된 것으로서, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드도 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다.
상기의 폴리펩티드는 예를 들면 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라서 합성할 수 있다. 또한, 각종의 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 방법을 이용하여 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 조립하여 숙주 세포에 도입하고, 상기 숙주 세포 중에서 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 4의 염기 서열을 갖는 DNA는 개 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열 번호 4에 기재된 염기 서열을 증폭할 수 있도록 설계한 한쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. 서열 번호 1의 염기 서열을 갖는 DNA이면 상기 주형으로서 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 사용함으로써 동일하게 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당하게 설정할 수 있고, 예를 들면 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초~1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 행정을 1사이클로서, 예를 들면 30사이클 행한 후 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 열거할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. PCR의 방법, 조건 등에 대해서는 예를 들면 Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology, 제 3 판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons(특히, 제 15 장)에 기재되어 있다. 또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열 번호 1~95로 나타내어지는 염기 서열 및 아미노산 서열의 정보에 의거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 이용하여 인간, 개나 소 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이고, 예를 들면 Sambrook 등, Molecular Cloning, 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology(1989년), Ausubel 등(상기) 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이렇게 해서 얻어진 DNA로부터 상기 (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다. 또한, 각 아미노산을 코딩하는 코돈은 공지이기 때문에 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 용이하게 특정할 수 있다. 따라서, 상기한 (b)의 폴리펩티드나 (c)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열도 용이하게 특정할 수 있으므로, 그러한 폴리뉴클레오티드도 시판의 핵산 합성기를 이용하여 상법에 의해 용이하게 합성할 수 있다.
상기 숙주 세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 세포이면 어떠한 것이어도 좋고, 원핵 세포의 예로서는 대장균 등, 진핵 세포의 예로서는 원숭이 신장 세포 COS 1, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO, 인간 태아 신장 세포주 HEK293, 마우스 태아 피부 세포주 NIH3T3 등의 포유 동물 배양 세포, 출아 효모, 분열 효모, 누에 세포, 아프리카 손톱 개구리(Xenopus laevis) 난세포 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
숙주 세포로서 원핵 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터로서는 원핵 세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 멀티클로닝 사이트, 터미네이터, 약제 내성 유전자, 영양 상보 유전자 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 조립하여 상기 벡터로 원핵 숙주 세포를 형질 전환한 후 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질(예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타티온-S-트랜퍼라아제(GST) 등)과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.
숙주 세포로서 진핵 세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리 (A) 부가 부위 등을 갖는 진핵 세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 조립하여 상기 벡터로 진핵 숙주 세포를 형질 전환한 후 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는 His 태그(예를 들면, (His)6~(His)10), FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
발현 벡터의 숙주 세포에의 도입은 전기 천공법, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 마이크로인젝션 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.
숙주 세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합시켜서 행할 수 있다. 예를 들면, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심 분리, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기 영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
이상의 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드에는 상술한 바와 같이 다른 임의의 단백질과의 융합 단백질의 형태로 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST)나 His 태그와의 융합 단백질 등을 예시할 수 있다. 이러한 융합 단백질 형태의 폴리펩티드도 상기 (c)의 폴리펩티드로서 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 형질 전환 세포에서 발현되어진 폴리펩티드는 번역된 후 세포 내에서 각종 수식을 받을 경우가 있다. 이러한 번역 후 수식된 폴리펩티드도 면역 유도 활성을 갖는 한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 번역 수식으로서는 N말단 메티오닌의 탈리, N말단 아세틸화, 당쇄 부가, 세포 내 프로테아제에 의한 한정 분해, 미리스토일화, 이소프레닐화, 인산화 등을 예시할 수 있다.
<면역 유도제>
후술의 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 상기한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드를 담암 동물에 투여하면 이미 생성되어 있는 종양을 축소 또는 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역 유도제는 암의 치료용 및/또는 예방용으로서 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 「종양」 및 「암」이라고 하는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.
이 경우, 대상이 되는 암으로서는 CD179b 유전자를 발현하고 있는 암, 예를 들면 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현하고 있는 암이며, 바람직하게는 유방암, 백혈병 및 임파종이다. 이들의 특정한 암에는 예를 들면 유방암(유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상 선암 등), 백혈병(만성형 임파구성 백혈병 등), 임파종(소화관형 임파종, 소화기형 임파종, 소~중 세포형 임파종 등) 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
상기의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 면역 유도를 위한 치료 방법으로서 사용할 수 있다. 또한, 동물의 암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 하는 치료 방법으로서도 사용할 수 있고, 면역 증강제를 더 포함하는 치료 방법으로서도 사용할 수 있다.
또한, 대상이 되는 동물은 포유 동물이고, 예를 들면 영장류, 애완 동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유 동물이며, 인간, 개 및 고양이가 바람직하다.
본 발명의 면역 유도제의 생체에의 투여 경로는 경구 투여이어도 비경구 투여이어도 좋지만, 근육내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 비경구 투여가 바람직하다. 암의 치료 목적으로 상기 면역 유도제를 사용할 경우에는 항암 작용을 향상시키기 위해서 후술의 실시예에 기재하는 바와 같이 치료 대상이 되는 종양의 근방의 소속 림프절에 투여할 수도 있다. 투여량은 면역 유도하는데 유효한 양이면 좋고, 예를 들면 암의 치료 및/또는 예방에 사용하는 것이면 암의 치료 및/또는 예방에 유효한 양이면 좋으며, 또한 동물의 체중, 성별(수컷 또는 암컷), 증상 등에 따라 변화시킬 수 있다. 암의 치료 및/또는 예방에 유효한 양은 종양의 크기나 증상 등에 따라 적당하게 선택되지만, 통상 대상 동물에 대하여 1일당의 유효량으로서 0.0001㎍~1000㎍, 바람직하게는 0.001㎍~1000㎍이며, 1회 또는 수회로 나눠서 투여할 수 있다. 바람직하게는 수회로 나눠서 수일 또는 수개월마다 투여한다.
후술의 실시예에 구체적으로 나타내는 바와 같이, 본 발명의 면역 유도제는 이미 형성되어 있는 종양을 축소 또는 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 발생 초기의 소수의 암세포에도 항암 작용을 발휘할 수 있으므로, 암의 발증 전이나 암의 치료 후에 사용하면 암의 발증이나 재발을 방지할 수 있다. 즉, 본 발명의 면역 유도제는 암의 치료와 예방의 쌍방에 유용하다.
본 발명의 면역 유도제는 폴리펩티드만으로 이루어져 있어도 좋고, 각 투여 형태에 적합한 약리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 등의 첨가제를 적당하게 혼합시켜서 제제할 수도 있다. 제제 방법 및 사용 가능한 첨가제는 의약 제제의 분야에 있어서 주지이고, 어느 쪽의 방법 및 첨가제도 사용할 수 있다. 첨가제의 구체예로서는 생리 완충액과 같은 희석제; 설탕, 유당, 옥수수 전분, 인산칼슘, 소르비톨, 글리신 등과 같은 부형제; 시럽, 젤라틴, 아라비아 고무, 소르비톨, 폴리비닐클로리드, 트라간트 등과 같은 결합제; 스테아린산마그네슘, 폴리에틸렌글리콜, 탈크, 실리카 등의 활택제 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 제제 형태로서는 정제, 캅셀제, 과립제, 산제, 시럽제 등의 경구제, 흡입제, 주사제, 좌제, 액제 등의 비경구제 등을 열거할 수 있다. 이들의 제제는 일반적으로 알려져 있는 제법에 의해 제작할 수 있다.
본 발명의 면역 유도제는 생체 내에서의 면역학적 응답을 강화할 수 있는 면역 증강제와 조합시켜서 사용할 수 있다. 면역 증강제는 본 발명의 면역 유도제에 포함되어 있어도 좋고, 별개의 조성물로서 본 발명의 면역 유도제와 병용해서 환자에게 투여해도 좋다.
여기에서, 환자는 동물, 특히 포유 동물이고, 바람직하게는 인간, 개 및 고양이이다.
상기 면역 증강제로서는 예를 들면 애쥬번트를 열거할 수 있다. 애쥬번트는 항원의 저장소(세포 외 또는 마크로파지 내)를 제공하고, 마크로파지를 활성화하고, 또한 특정 세트의 임파구를 자극함으로써 면역학적 응답을 강화할 수 있으므로 항암 작용을 높일 수 있다. 따라서, 특히 본 발명의 면역 유도제를 암의 치료 및/또는 예방에 사용할 경우, 면역 유도제는 유효 성분인 상기 폴리펩티드에 추가해서 애쥬번트를 더 포함하는 것이 바람직하다. 다수의 종류의 애쥬번트가 당업계에서 주지이고, 어느 쪽의 애쥬번트이어도 사용할 수 있다. 애쥬번트의 구체예로서는 MPL(SmithKline Beecham), 살모넬라속의 Salmonella minnesota Re 595 리포다당류의 정제 및 산 가수 분해 후에 얻어지는 동류물; QS21(SmithKline Beecham), Quillja saponaria 추출물로부터 정제되는 순 QA-21 사포닌; PCT 출원 WO 96/33739(SmithKline Beecham)에 기재된 DQS21; QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-L1(So 등, Molecules and Cells, 1997, 제 7 권, p. 178-186); 프로인트의 불완전 애쥬번트; 프로인트의 완전 애쥬번트; 비타민 E; 몬타니드; 명반; CpG 올리고뉴클레오티드(예를 들면, Kreig 등, Nature, 제 374 권, p. 546-549); 폴리 IC 및 그 유도체(폴리 ICLC 등) 및 스쿠알란 및/또는 토코페롤과 같은 생분해성 기름으로부터 조제되는 각종의 유중수 에멀젼 등이 열거된다. 그 중에서도, 프로인트의 불완전 애쥬번트, 몬타니드, 폴리 IC 및 그 유도체 및 CpG 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 상기 애쥬번트와 폴리펩티드의 혼합비는 전형적으로는 약 1:10~10:1, 바람직하게는 약 1:5~5:1, 보다 바람직하게는 약 1:1이다. 단, 애쥬번트는 상기 예시에 한정되지 않고, 당업계에 공지된 상기 이외의 애쥬번트도 본 발명의 면역 유도제를 투여할 때에 사용할 수 있다(예를 들면, Goding 저, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 제 2 판, 1986년). 폴리펩티드 및 애쥬번트의 혼합물 또는 에멀젼의 조제 방법은 예방 접종의 당업자에게는 주지이다.
또한, 상기 면역 증강제로서는 상기 애쥬번트 이외에도 대상의 면역 응답을 자극하는 인자를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 임파구나 항원 제시 세포를 자극하는 특성을 갖는 각종 사이토카인을 면역 증강제로서 본 발명의 면역 유도제와 조합하여 사용할 수 있다. 그러한 면역학적 응답을 증강 가능한 다수의 사이토카인이 당업자에게 공지이고, 그 예로서는 백신의 방어 작용을 강화하는 것이 나타내어진 인터로이킨-12(IL-12), GM-CSF, IL-18, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 ω, 인터페론 γ 및 Flt3 리간드가 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 인자도 상기 면역 증강제로서 사용할 수 있고, 본 발명의 면역 유도제에 포함시키거나 또는 별개의 조성물로서 본 발명의 면역 유도제와 병용해서 환자에게 투여할 수 있다.
<항원 제시 세포>
하기 실시예에 있어서 구체적으로 기재되는 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 상기 폴리펩티드와 항원 제시 세포를 인 비트로 접촉시킴으로써 상기 폴리펩티드를 항원 제시 세포에 제시할 수 있다. 즉, 상기한 (a) 또는 (c)의 폴리펩티드는 항원 제시 세포의 처리제로서 이용할 수 있다. 여기에서, 항원 제시 세포로서는 수상 세포, B세포 및 마크로파지가 예시되고, MHC 클래스 I 분자를 보유하는 수상 세포 또는 B세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 처리제란 항원 제시 세포를 펄스하는 약제를 지칭하고, 펄스된 항원 제시 세포는 말초혈 임파구를 자극하는 능력을 갖는다는 것일 수 있으므로 백신으로서 사용할 수 있다.
각종 MHC 클래스 I 분자가 동정되어 있어 주지이다. 인간에 있어서의 MHC 분자는 HLA라고 칭한다. HLA 클래스 I 분자로서는 HLA-A, HLA-B, HLA-C를 열거할 수 있고, 보다 구체적으로는 HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 등을 열거할 수 있다.
MHC 클래스 I 분자를 보유하는 수상 세포 또는 B세포는 주지의 방법에 의해 말초혈로부터 조제할 수 있다. 예를 들면, 골수, 제대혈 또는 환자 말초혈로부터 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 IL-3(또는 IL-4)을 이용하여 수상 세포를 유도하고, 그 배양계에 종양 관련 펩티드를 첨가함으로써 종양 특이적인 수상 세포를 유도할 수 있다.
이 수상 세포를 유효량 투여함으로써 암의 치료에 바람직한 응답을 유도할 수 있다. 사용되는 세포로서는 건강인으로부터 제공된 골수나 제대혈, 환자 본인의 골수나 말초혈 등을 사용할 수 있지만, 환자 본래의 자가 세포를 사용하는 경우에는 안전성이 높고, 중독한 부작용을 회피하는 것도 기대할 수 있다. 말초혈 또는 골수는 신선 시료, 저온 보존 시료 및 동결 보존 시료 중 어느 것이어도 좋다. 말초혈은 전혈을 배양해도 좋고, 백혈구 성분만을 분리해서 배양해도 좋지만, 후자쪽이 효율적이어서 바람직하다. 또한, 백혈구 성분 중에서도 단핵구를 분리해도 좋다. 또한, 골수나 제대혈을 기원으로 하는 경우에는 골수를 구성하는 세포 전체를 배양해도 좋고, 이로부터 단핵구를 분리해서 배양해도 좋다. 말초혈이나 그 백혈구 성분, 골수 세포에는 수상 세포의 기원이 되는 단핵구, 조혈간 세포 또는 미성숙 수상 세포나 CD4 양성 세포 등이 포함되어 있다. 사용되는 사이토카인은 안전성과 생리 활성이 확인된 특성의 것이면 천연형 또는 유전자 재조합형 등, 그 생산 방법에 대해서는 상관없지만, 바람직하게는 의료용으로 사용되는 품질이 확보된 표품이 필요 최저량으로 사용된다. 첨가하는 사이토카인의 농도는 수상 세포가 유도되는 농도이면 특별하게 한정되지 않고, 통상 사이토카인의 합계 농도로 10~1000ng/mL 정도가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20~500ng/mL 정도이다. 배양은 백혈구의 배양에 통상 사용되고 있는 주지의 배지를 이용하여 행할 수 있다. 배양 온도는 백혈구의 증식이 가능하면 특별하게 한정되지 않지만, 인간의 체온인 37℃ 정도가 가장 바람직하다. 또한, 배양 중의 기체 환경은 백혈구의 증식이 가능하면 특별하게 한정되지 않지만, 5% CO2를 통기하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 기간은 필요수의 세포가 유도되는 기간이면 특별하게 한정되지 않지만, 통상 3일~2주간의 사이에서 행해진다. 세포의 분리나 배양에 제공되는 기기는 적당한 것을 사용할 수 있지만, 의료용으로 안전성이 확인되고, 또한 조작이 안정되고 간편한 것이 바람직하다. 특히, 세포 배양 장치에 대해서는 샤알레, 플라스크, 병 등의 일반적 용기에 관계없이 적층형 용기나 다단식 용기, 롤러 병, 스피너식 병, 백타입(bag type) 배양기, 중공사 컬럼 등도 사용할 수 있다.
상기 폴리펩티드와 항원 제시 세포를 인 비트로 접촉시키는 방법 자체는 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 항원 제시 세포를 상기 폴리펩티드를 포함하는 배양액 중에서 배양함으로써 행할 수 있다. 배지 중의 펩티드 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 1㎍/ml 내지 100㎍/ml 정도, 바람직하게는 5㎍/ml 내지 20㎍/ml 정도이다. 배양시의 세포 밀도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 103세포/ml~107세포/ml 정도, 바람직하게는 5×104세포/ml~5×106세포/ml 정도이다. 배양은 상법에 따라 37℃, 5% CO2 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 또한, 항원 제시 세포가 표면 상에 제시할 수 있는 펩티드의 길이는 통상 최대로 30 아미노산 잔기 정도이다. 따라서, 특별하게 한정되지 않지만, 항원 제시 세포와 폴리펩티드를 인 비트로 접촉시킬 경우, 상기 폴리펩티드를 약 30 아미노산 잔기 이하의 길이로 조제해도 좋다.
상기한 폴리펩티드의 공존 하에 있어서 항원 제시 세포를 배양함으로써 펩티드가 항원 제시 세포의 MHC 분자에 도입되어 항원 제시 세포의 표면에 제시된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 이용하여 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 단리 항원 제시 세포를 조제할 수 있다. 이러한 항원 제시 세포는 생체내 또는 인 비트로에 있어서 T세포에 대하여 상기 폴리펩티드를 제시하고, 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포 장해성 T세포를 유도하여 증식시킬 수 있다.
상기한 바와 같이 해서 조제되는 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 항원 제시 세포를 T세포와 인 비트로 접촉시킴으로써 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포 장해성 T세포를 유도하여 증식시킬 수 있다. 이것은 상기 항원 제시 세포와 T세포를 액체 배지 중에서 공존 배양함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 항원 제시 세포를 액체 배지에 현탁시키고, 마이크로플레이트의 웰 등의 용기에 넣고, 이것에 T세포를 첨가해서 배양함으로써 행할 수 있다. 공존 배양시의 항원 제시 세포와 T세포의 혼합 비율은 특별하게 한정되지 않지만, 통상 세포수의 비율로 1:1~1:100 정도, 바람직하게는 1:5~1:20 정도이다. 또한, 액체 배지 중에 현탁되는 항원 제시 세포의 밀도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 100~1000만 세포/ml 정도, 바람직하게는 10000~100만 세포/ml 정도이다. 공존 배양은 상법에 따라 37℃, 5% CO2 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 특별하게 한정되지 않지만, 통상 2일~3주간, 바람직하게는 4일~2주간 정도이다. 또한, 공존 배양은 IL-2, IL-6, IL-7 및 IL-12와 같은 인터로이킨의 1종 또는 복수의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 이 경우, IL-2 및 IL-7의 농도는 통상 5U/ml~20U/ml 정도, IL-6의 농도는 통상 500U/ml~2000U/ml 정도, IL-12의 농도는 통상 5ng/ml~20ng/ml 정도이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 여기에서, 「U」는 활성 단위를 나타낸다. 상기의 공존 배양은 신선한 항원 제시 세포를 추가해서 1회 또는 수회 반복해도 좋다. 예를 들면, 공존 배양 후의 배양 상청을 버리고, 신선한 항원 제시 세포의 현탁액을 첨가해서 공존 배양을 더 행한다고 하는 조작을 1회 또는 수회 반복해도 좋다. 각 공존 배양의 조건은 상기와 동일해도 좋다.
상기의 공존 배양에 의해, 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포 장해성 T세포가 유도되어 증식된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 이용하여 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 선택적으로 결합시키는 단리 T세포를 조제할 수 있다.
후술의 실시예에 기재되는 바와 같이, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 유방암 세포, 백혈병 세포 및 임파종 세포에 특이적으로 발현되고 있다. 따라서, 이들의 암종에 있어서는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95의 폴리펩티드가 정상 세포보다도 매우 많이 존재하고 있다고 생각된다. 암세포 내에 존재하는 폴리펩티드의 일부가 암세포 표면 상의 MHC 분자에 제시되고, 상기한 바와 같이 해서 조제한 세포 장해성 T세포가 생체 내에 투여되면 이것을 마크로 해서 세포 장해성 T세포가 암세포를 장해할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 제시하는 항원 제시 세포는 생체 내에 있어서도 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포 장해성 T세포를 유도하고 증식시킬 수 있으므로, 상기 항원 제시 세포를 생체 내에 투여함으로써도 암세포를 장해할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩티드를 이용하여 조제된 상기 세포 장해성 T세포나 상기 항원 제시 세포도 또한 본 발명의 면역 유도제와 마찬가지로 암의 치료 및/또는 예방제로서 유용하다.
상기한 단리 항원 제시 세포나 단리 T세포를 생체에 투여할 경우에는 이들의 세포를 이물로서 공격하는 생체 내에서의 면역 응답을 회피하기 위해서 치료를 받는 환자로부터 채취한 항원 제시 세포 또는 T세포를 상기한 바와 같이 상기 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드를 이용하여 조제한 것이 바람직하다.
항원 제시 세포 또는 단리 T세포를 유효 성분으로서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방제의 투여 경로는 정맥내 투여나 동맥내 투여와 같은 비경구 투여가 바람직하다. 또한, 투여량은 증상이나 투여 목적 등에 따라 적당하게 선택되지만, 통상 1개~10조개, 바람직하게는 100만개~10억개이며, 이것을 수일 내지 수개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 제제는 예를 들면 세포를 생리 완충 식염수에 현탁한 것 등이어도 좋고, 다른 항암제나 사이토카인 등과 병용할 수도 있다. 또한, 제제 분야에 있어서 주지의 1 또는 2 이상의 첨가제를 첨가할 수도 있다.
<유전자 백신>
또한, 상기 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상 동물의 체내에서 발현시킴으로써도 상기 생체 내에서 항체 생산이나 세포 장해성 T세포를 유도할 수 있고, 폴리펩티드를 투여하는 것과 동등한 효과가 얻어진다. 즉, 본 발명의 면역 유도제는 상기의 (a), (b) 및 (c)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 포함하는 것이어도 좋다. 이와 같은 항원 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터는 유전자 백신이라고도 칭한다.
유전자 백신을 제조하기 위해서 사용하는 벡터는 대상 동물 세포 내(바람직하게는 포유 동물 세포 내)에서 발현 가능한 벡터이면 특별하게 한정되지 않고, 플라스미드 벡터이어도 바이러스 벡터이어도 좋으며, 유전자 백신의 분야에서 공지의 어떠한 벡터를 사용해도 좋다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA나 RNA 등의 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같이 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 또한, 벡터에의 상기 폴리뉴클레오티드의 조립은 당업자에게 주지인 방법을 이용하여 행할 수 있다.
유전자 백신의 투여 경로는 바람직하게는 근육내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 비경구 투여 경로이고, 투여량은 항원의 종류 등에 따라 적당하게 선택할 수 있지만, 통상 체중 1kg당 유전자 백신의 중량으로 0.1㎍~100mg 정도, 바람직하게는 1㎍~10mg 정도이다.
바이러스 벡터에 의한 방법으로서는 예를 들면 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 폴리오 바이러스, 신드비스 바이러스 등의 RNA 바이러스 또는 DNA 바이러스에 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조립하고, 이것을 대상 동물에 감염시키는 방법이 열거된다. 이 중에서, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스, 백시니아 바이러스 등을 사용한 방법이 특히 바람직하다.
그 이외의 방법으로서는 발현 플라스미드를 직접 근육 내에 투여하는 방법(DNA 백신법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 전기 천공법 등이 열거되고, 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해서는 유전자를 직접 체내에 도입하는 인 비보 방법 및 대상 동물로부터 어느 종류의 세포를 채취하여 체외에서 유전자를 상기 세포에 도입하여 그 세포를 체내에 돌려주는 엑스 비보 방법이 있다(Nikkei Science, 1994년 4월, p. 20-45, 월간 약사, 1994년, 제 36 권, 제 1 호, p. 23-48, 실험 의학 증간, 1994년, 제 12 권, 제 15 호 및 이들의 인용 문헌 등). 인 비보 방법이 보다 바람직하다.
인 비보 방법에 의해 투여하는 경우에는 치료 목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥, 동맥, 피하, 근육내 등에 투여할 수 있고, 또는 종양이 존재하는 환부에 직접 투여할 수도 있다. 인 비보 방법에 의해 투여하는 경우에는 예를 들면 액제 등의 제제 형태를 취할 수 있지만, 일반적으로는 유효 성분인 본 발명의 상기 펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 주사제 등으로 하고, 필요에 따라 관용의 담체를 첨가해도 좋다. 또한, 상기 DNA를 함유하는 리포솜 또는 막 융합 리포솜(센다이 바이러스(HVJ)-리포솜 등)에 있어서는 현탁제, 동결제, 원심 분리 농축 동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 「서열 번호 1로 나타내어지는 염기 서열」이라고 언급하는 경우에는 서열 번호 1로 실제로 나타내어진 염기 서열 이외에 이것과 상보적인 서열도 포함된다. 따라서, 「서열 번호 1로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드」라고 언급하는 경우에는 서열 번호 1로 실제로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 그 상보적인 염기 서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드 및 이들로 이루어지는 이중쇄 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제할 경우에는 적당하게 어느 하나의 염기 서열을 선택하면 되지만, 당업자이면 용이하게 그 선택을 할 수 있다.
<암의 검출>
본 발명의 암을 검출하는 방법으로서, 생체로부터 분리된 시료를 이용하여 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드의 발현을 측정한다. 상기 시료를 이용하여 폴리펩티드의 발현을 측정하는 방법으로서는 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 면역 측정하는 방법(제 1 방법), 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드 자체를 면역 측정하는 방법(제 2 방법) 및 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 측정하는 방법(제 3 방법)이 열거된다. 본 발명의 방법에서는 이들 중 어느 쪽의 방법으로 폴리펩티드의 발현을 측정해도 좋다. 또한, 본 발명에 있어서 「측정」이라고 하는 단어에는 검출, 정량 및 반정량 모두가 포함된다.
여기에서, CD179b는 개 유방암 유래 cDNA 라이브러리와 동일 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암견 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체(암 특이적 항체)와 결합하는 폴리펩티드로서 동정된 것이다(실시예 1 참조). 즉, 담암견 생체에서는 CD179b에 대한 항체가 특이적으로 유도되어 있다. 따라서, 담암 생체 내의 CD179b에 대한 항체를 측정함으로써 CD179b를 발현하는 암을 검출할 수도 있다(실시예 7 참조). 또한, 상기 제 2 방법에 의해 항원인 CD179b를 측정함으로써도 개의 암을 검출할 수 있다. 또한, 하기 실시예에 기재되는 바와 같이 상기 항원 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA는 암, 특히 유방암 및 백혈병 세포에 있어서 정상 조직보다 현저하게 고발현되고 있기 때문에(실시예 1 참조), 상기 mRNA를 측정함으로써도 개의 암을 검출할 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이 CD179b는 B세포의 전구 세포(프리 B세포)의 막 표면에 발현되어 있는 것이 공지되어 있고, 따라서 프리 B세포가 암화된 백혈병(프리 B세포성 백혈병) 세포에 있어서 발현되고 있는 것이 보고되어 있지만, 프리 B세포성 백혈병 세포 이외의 백혈병 세포 및 유방암 세포에 있어서 발현되고 있다고 하는 사실이 본 발명에서 처음으로 발견되었다. 이에 의해, CD179b의 발현을 조사함으로써 프리 B세포성 백혈병 세포 이외의 백혈병이나 임파종 및 유방암의 검출이 가능하게 되었다.
상기 제 1 방법에 있어서, 시료 중에 존재할 수 있는 상기 암 특이적 항체의 측정은 상기 항체와 항원 항체 반응하는 항원 물질을 사용한 면역 측정에 의해 용이하게 행할 수 있다. 면역 측정법 자체는 하기에 상세하게 설명하는 바와 같은 주지의 상법이다. 면역 측정의 항원 물질로서, 상기 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 항체에는 교차 반응성이 있고, 실제로 면역원이 된 항원 물질 이외의 분자이어도 분자 상에 면역원의 에피토프와 유사한 구조가 존재하면 그 분자는 면역원에 대하여 유도된 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열의 상동성이 높은 폴리펩티드끼리는 에피토프의 구조도 유사한 경우가 많고, 그 경우에는 양자는 동일한 항원성을 나타낼 수 있다. 하기 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 서열 번호 3의 인간 유래 폴리펩티드는 담암견 체내에서 유도된 상기 항체와 항원 항체 반응한다. 따라서, 본 발명의 제 1 방법에서는 면역 측정의 항원으로서 어느 포유 동물 유래의 상동 인자를 사용할 수도 있다.
통상, 단백질 등과 같은 복잡한 구조를 갖는 분자량이 큰 항원 물질의 경우, 분자 상에 구조가 다른 복수의 부위가 존재하고 있다. 따라서, 생체 내에서는 그러한 항원 물질에 대하여 복수의 부위를 각각 인식해서 결합하는 복수 종류의 항체가 생산된다. 즉, 생체 내에서 단백질 등의 항원 물질에 대하여 생산되는 항체는 복수 종류의 항체의 혼합물인 폴리클로날 항체이다. 또한, 본 발명에 있어서 「폴리클로날 항체」라고 하는 경우에는 항원 물질을 체내에 포함하는 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체이고, 상기 항원 물질에 대하여 상기 생체 내에서 유도된 항체를 지칭한다.
시료 중의 항체의 측정은 상기한 폴리펩티드를 항원으로서 사용한 면역 측정에 의해 용이하게 행할 수 있다. 면역 측정 자체는 이 분야에 있어서 주지이고, 반응 양식으로 분류하면 샌드위치법, 경합법, 응집법, 웨스턴블로트법 등이 있다. 또한, 표식으로 분류하면 방사 면역 측정, 형광 면역 측정, 효소 면역 측정, 비오틴 면역 측정 등이 있고, 어떠한 방법을 이용하여도 상기 항체의 면역 측정을 행할 수 있다. 특별하게 한정되지 않지만, 샌드위치 ELISA나 응집법은 조작이 간편해서 대규모 장치 등을 필요로 하지 않기 때문에 본 발명의 방법에 있어서의 상기 항체의 면역 측정 방법으로서 바람직하게 적용할 수 있다. 항체의 표식으로서 효소를 사용하는 경우, 효소로서는 턴오버수가 큰 것, 항체와 결합시켜도 안정된 것, 기질을 특이적으로 착색시키는 등의 조건을 만족시키는 것이면 특별한 제한은 없고, 통상의 효소 면역 측정법에 사용되는 효소, 예를 들면 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리 포스파타아제, 글루코오스 옥시다아제, 아세틸콜린 에스테라아제, 글루코오스-6-인산화 탈수소 효소, 말산 탈수소 효소 등을 사용할 수도 있다. 또한, 효소 저해 물질이나 조효소 등을 사용할 수도 있다. 이들 효소와 항체의 결합은 말레이미드 화합물 등의 가교제를 사용하는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 기질로서는 사용하는 효소의 종류에 따라 공지의 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소로서 퍼옥시다아제를 사용할 경우에는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을, 또한 효소로서 알칼리 포스파타아제를 사용할 경우에는 파라니트로페놀 등을 사용할 수 있다. 방사성 동위체로서는 125I나 3H 등의 통상 방사 면역 측정법에서 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 형광 색소로서는 플루오레센스 이소티오시아네이트(FITC)나 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(TRITC) 등의 통상의 형광 항체법에 사용되는 것을 사용할 수 있다.
또한, 이들의 면역 측정법 자체는 주지이고, 본 명세서에서 설명할 필요는 없지만, 간단하게 기재하면 예를 들면 샌드위치법에서는 항원으로서 사용하는 상기 폴리펩티드를 고상으로 부동화하고, 혈청 등의 시료와 반응시키고, 세정 후 적당한 2차 항체를 반응시키고, 세정 후 고상으로 결합된 2차 항체를 측정한다. 항원 폴리펩티드를 고상으로 부동화함으로써 미결합의 2차 항체를 용이하게 제거할 수 있기 때문에 본 발명의 암의 검출 방법의 형태로서 바람직하다. 2차 항체로서는 예를 들면 시료가 개 유래이면 항 개 IgG 항체를 사용할 수 있다. 2차 항체를 상기에 예시한 표식 물질로 표식하여 둠으로써 고상으로 결합된 2차 항체를 측정할 수 있다. 이렇게 해서 측정한 2차 항체량이 혈청 시료 중의 상기 항체량에 해당한다. 표식 물질로서 효소를 사용하는 경우에는 효소 작용에 의해 분해되어 발색하는 기질을 첨가하고, 기질의 분해량을 광학적으로 측정함으로써 항체량을 측정할 수 있다. 표식 물질로서 방사성 동위체를 사용하는 경우에는 방사성 동위체가 발하는 방사선량을 신틸레이션 카운터 등에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 제 2 방법에서는 생체로부터 얻은 시료 중에 포함될 수 있는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 폴리펩티드가 측정된다. 상술한 바와 같이, 암환자에 있어서는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원 항체 반응하는 암 특이적 항체의 양이 현저하게 많지만, 이것은 암환자 체내에 있어서 상기 암 특이적 항체의 항원인 이들 폴리펩티드 또는 그 상동 인자의 생산량이 현저하게 많은 것을 나타내고 있다. 따라서, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 측정함으로써도 상기 제 1 방법과 마찬가지로 생체 내의 암을 검출할 수 있다.
시료 중의 폴리펩티드의 측정은 주지의 면역 측정법에 의해 용이하게 행할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원 항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 제작하고, 이것을 이용하여 면역 측정을 행함으로써 시료 중에 존재할 수 있는 서열 번호 3~95 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 측정할 수 있다. 면역 측정 방법 자체는 상술한 바와 같은 주지의 상법이다.
여기에서, 「항원 결합성 단편」이란 항체 분자 중에 포함되는 Fab 단편이나 F(ab')2 단편과 같은 항원과의 결합능을 갖는 항체 단편을 의미한다. 항체는 폴리클로날 항체이어도 모노클로날이어도 좋지만, 면역 측정 등을 위해서는 재현성이 높은 모노클로날 항체가 바람직하다. 폴리펩티드를 면역원으로 하는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체의 조제 방법은 주지이고, 상법에 의해 용이하게 행할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드를 키홀 림펫 헤모시안(KLH)이나 카세인 등의 캐리어 단백질에 결합시킨 것을 면역원으로 해서 애쥬번트와 함께 동물에 면역함으로써 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 유기할 수 있다. 면역된 동물로부터 채취한 비장 세포나 임파구와 같은 항체 산생 세포를 미엘로마 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제작하고, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하여 이것을 증식시켜서 배양 상청으로부터 상기 단백질을 대응 항원으로 하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 상기의 방법은 주지의 상법이다.
본 발명의 제 3 방법에서는 생체로부터 얻은 시료 중에 포함될 수 있는 CD179b를 코딩하는 mRNA가 측정된다. 하기 실시예에 구체적으로 나타내어진 바와 같이 CD179b를 코딩하는 mRNA는 암, 특히 유방암 및 백혈병 세포에 있어서 현저하게 고발현되고 있다. 따라서, 시료 중의 상기 mRNA를 측정함으로써도 생체 내의 암을 검출할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서는 상기한 바와 같이 측정한 폴리펩티드의 발현량에 의거하여 대상 생체가 암인지의 여부 등을 판단한다. 암의 검출은 대상 생체에 있어서의 폴리펩티드의 발현을 측정하는 것만으로도 가능하지만, 검출 정밀도를 높이는 관점에서는 1 내지 복수의 건상자 시료에 있어서의 폴리펩티드의 발현량(항체량, 폴리펩티드량 또는 mRNA량)을 조사해서 건상자 기준값을 취득하고, 대상 생체의 측정값을 상기 건상자 기준값과 비교하는 것이 바람직하다. 또한, 검출 정밀도를 높이고자 하는 경우에는 암을 이환하고 있는 것을 알고 있는 다수의 환자로부터 얻은 시료에 대해서 폴리펩티드 발현량을 조사해서 암환자 기준값을 취득하고, 대상 생체의 측정값을 건상자 기준값 및 암환자 기준값의 쌍방과 비교해도 좋다. 상기 기준값은 예를 들면 각 시료에 있어서의 폴리펩티드 발현량을 수치화하고, 그 평균값을 산출함으로써 정할 수 있다. 또한, 건상자 기준값과 암환자 기준값은 미리 다수의 건상자 및 암환자에 대해서 폴리펩티드 발현량을 조사해서 정해 둘 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 방법에서 기준값과의 비교를 행할 경우에는 미리 정해진 기준값을 사용해도 좋다.
본 발명의 검출 방법에서는 다른 암 항원이나 암 마커에 의한 검출을 조합시켜서 사용해도 좋다. 이에 따라 암의 검출 정밀도를 높일 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 생체 내의 암을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에 의하면 육안으로 보이지 않는 작은 사이즈의 종양이나 체내 심부의 종양도 검출할 수 있으므로 암의 조기 발견에 유용하다. 또한, 암의 치료 후 경과 관찰 중의 환자에 대해서 본 발명의 검출 방법을 적용하면 암의 재발이 있었을 경우에 그 암을 조기에 검출할 수 있다.
또한, 담암 생체에 있어서 본 발명에서 측정 대상이 되는 상기 소정의 폴리펩티드를 발현하는 암세포의 수가 증가할수록 상기 생체 내에 있어서의 상기 폴리펩티드 및 그 mRNA의 축적량이 증대하고, 혈청 중에 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 많이 산생된다. 한편, 암세포의 수가 감소할수록 생체 내의 상기 폴리펩티드 및 그 mRNA의 축적량이 감소하고, 혈청 중의 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 감소한다. 따라서, 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량이 많을 경우에는 종양의 증대나 암의 전이가 발생, 즉 암의 진행도가 진행되고 있다고 판단할 수 있다.
또한, 하기 실시예에 나타내어지는 바와 같이 동일 종류의 종양에 있어서 악성형에서는 양성형보다 현저하게 상기 항체량이 많다. 그 때문에, 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량이 많을 경우에는 암의 악성도가 보다 높다고 판단할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면 암의 악성도를 검출할 수도 있다.
또한, 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량의 증감을 지표로서 암의 치료 효과를 모니터링할 수도 있다. 따라서, 암의 치료 중이나 치료 후의 개체에 대해서 상기 폴리펩티드의 발현량을 관찰함으로써 항암제의 치료 효과나 종양 적출 후의 잔존 종양 유무, 또한 경과 관찰에서도 전이ㆍ재발을 조기에 아는 단서가 얻어진다. 적절하게 치료할 수 있는 경우에는 폴리펩티드의 발현량은 치료 전의 담암 상태보다도 저하되므로, 그 생체에 대하여 행한(행하고 있는) 치료의 효과가 양호하다고 판단할 수 있다. 폴리펩티드 발현량이 상승 또는 유지되어 있을 경우 또는 일단 저하된 후 더욱 상승될 경우에는 치료 효과가 불충분하다고 판단할 수 있고, 다른 치료 방법으로의 변경이나 항암제 투여량의 변경 등 치료 방법 선택의 유용한 판단 재료가 된다.
본 발명의 암의 검출 방법의 대상이 되는 암으로서는 CD179b를 발현하고 있는 암(단, 프리 B세포성의 것을 제외)이고, 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상 선암, 백혈병(바람직하게는 만성형 임파구성 백혈병, 단 프리 B세포성의 것을 제외), 임파종(바람직하게는 소화관형 임파종, 소화기형 임파종, 소~중 세포형 임파종, 중세포형 임파종 또는 다중심형 임파종, 단 프리 B세포성의 것을 제외) 등을 열거할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 방법의 대상이 되는 생체는 포유 동물이고, 인간이나 개, 고양이가 바람직하다.
본 발명의 방법에 제공하는 시료로서는 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 흉수 등의 체액, 조직, 세포가 열거된다. 특히, 상기 제 1 방법 및 제 2 방법에 있어서는 혈청, 혈장, 복수 및 흉수를 바람직하게 사용할 수 있고, 또한 mRNA를 측정하는 상기 제 3 방법에 있어서는 조직 시료 및 세포 시료가 바람직하다.
제 1 방법에서 면역 측정의 항원으로서 사용되는 상기 폴리펩티드는 암 검출 시약으로서 제공할 수 있다. 상기 시약은 상기 폴리펩티드만으로 이루어져 있어도 좋고, 또한 상기 폴리펩티드의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 상기 시약은 플레이트나 멤브레인 등의 고상으로 고정화된 상태로 제공할 수도 있다.
제 2 방법에서 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, … 93 또는 95로 나타내어지는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 면역 측정할 때에 사용되는 상기 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원 항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편도 암 검출 시약으로서 제공할 수 있다. 이 경우의 암 검출 시약도 상기 항체 또는 항원 결합성 단편만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 또한 상기 항체 또는 항원 결합성 단편의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 상기 항체 또는 항원 결합성 단편은 망간이나 철 등의 금속을 결합시킨 것이어도 좋다. 그러한 금속 결합 항체 또는 항원 결합성 단편을 체내에 투여하면 항원 단백질이 보다 많이 존재하는 부위에 상기 항체 또는 항원 결합성 단편이 보다 많이 집적되므로, MRI 등에 의해 금속을 측정하면 항원 단백질을 생산하는 암세포의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 제 3 방법에서 mRNA의 측정에 사용되는 상기한 암 검출용 폴리뉴클레오티드도 암 검출 시약으로서 제공할 수 있다. 이 경우에 암 검출용 시약도 상기 폴리뉴클레오티드만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 또한 상기 폴리뉴클레오티드의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 포함하고 있어도 좋다. 상기 시약 중에 포함되는 상기 암 검출용 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 프라이머 또는 프로브이다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 근거하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이하의 구체예에 제한되지 않는 것으로 한다.
실시예 1: SEREX법에 의한 신규 암 항원 단백의 취득
(1) cDNA 라이브러리의 제작
수술에 의해 적출한 개의 유선암 조직으로부터 산-구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)를 이용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리A RNA를 정제했다.
이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 개 유선암 유래 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(STRATAGENE 제품)를 사용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 2.99×105pfu/ml이었다.
(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝
상기 제작한 개 유선암 유래 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여 이뮤노스크리닝을 행했다. 구체적으로는 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트에 2340클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시키고, 42℃, 3~4시간 배양하여 용균반(플라크)을 제작하고, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science 제품)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 피복함으로써 단백질을 유도ㆍ발현시켜 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후, 멤브레인을 회수하여 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH 7.5)에 침지하여 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이 반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2~3시간 반응시켰다.
상기 환견 혈청으로서는 상기 유선암을 적출한 동일한 환견 및 다른 유선암 환견에서 채취한 혈청 합계 3검체를 각각 사용했다. 이들의 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 사전 처리를 행했다. 혈청의 사전 처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하지 않은 λ ZAP Express 파지 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후 NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서, 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO3 pH 8.3의 버퍼를 플레이트에 첨가하여 4℃에서 15시간 정치 후 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 이어서, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthecare Bio-Science 제품)에 통액해서 대장균ㆍ파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액ㆍ반응시켜 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 소통한 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS에서 500배 희석하여, 이것을 이뮤노스크리닝 재료로 했다.
이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 블로트한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항 개 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories, Inc. 제품)을 실온 1시간 반응시켜 NBT/BCIP 반응액(Roche 제품)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트 상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH 7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화될 때까지 상기와 동일한 방법으로 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG과 반응하는 92820개의 파지 클론을 스크리닝해서 45개의 양성 클론을 단리했다.
(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색
상기 방법에 의해 단리한 45개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서, 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제된 파지 용액 250㎕, 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE 제품) 1㎕를 혼합한 후, 37℃에서 15분간 반응 후 LB 배지를 3ml 첨가하여 37℃에서 2.5~3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕에서 20분간 보온한 후, 4℃, 1000×g, 15분간 원심을 행하여 상청을 파지미드 용액으로서 회수했다. 이어서, 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제된 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜, 50㎕를 암피실린(최종 농도 50㎍/ml) 함유 LB 한천 배지에 뿌려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼된 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하여 암피실린(최종 농도 50㎍/ml) 함유 LB 배지 37℃에서 배양 후 QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN 제품)를 사용해서 목적의 인서트를 갖는 플라스미드 DNA를 정제했다.
정제된 플라스미드는 서열 번호 96에 기재된 T3 프라이머와 서열 번호 97에 기재된 T7 프라이머를 이용하여 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전장 서열의 해석을 행했다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열 번호 4~92의 짝수 번호에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열(서열 번호 5~93의 홀수 번호)을 이용하여 상동성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행하여 기지 유전자와의 상동성 검색을 행한 결과, 얻어진 45개 전체의 유전자가 CD179b를 코딩하는 유전자인 것이 판명되었다. 45개의 유전자간의 상동성은 염기 서열 94~99%, 아미노산 서열 96~99%이었다. 이 유전자의 인간 상동 인자를 코딩하는 유전자와의 상동성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 62~82%, 아미노산 서열 69~80%이었다. 인간 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 1에, 아미노산 서열을 서열 번호 2 및 3에 나타낸다. 또한, 이 유전자의 소 상동 인자를 코딩하는 유전자와의 상동성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 68~82%, 아미노산 서열 56-77%이었다. 소 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 94에, 아미노산 서열을 서열 번호 95에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 코딩하는 유전자와 소 상동 인자를 코딩하는 유전자의 상동성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 62%, 아미노산 서열 72%이었다.
(4) 각 조직에서의 발현 해석
상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개 및 인간의 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50~100mg 및 각 세포주 5~10×106개의 세포로부터 TRIZOL 시약(INVITROGEN 제품)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(INVITROGEN 제품)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상 조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 유전자 풀 cDNA(INVITROGEN 제품), QUICK-Clone cDNA(CLONETECH 제품) 및 Large-Insert cDNA Library(CLONETECH 제품)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 개 유전자에 특이적인 프라이머(서열 번호 98 및 99에 기재) 및 그 인간 상동 유전자에 특이적인 프라이머(서열 번호 100 및 101에 기재)를 이용하여 이하와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제된 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리머라아제(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 25㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD 제품)를 이용하여 94℃~30초, 60℃~30초, 72℃~30초의 사이클을 30회 반복하여 행했다. 또한, 상기한 서열 번호 98 및 99로 나타내는 염기 서열을 갖는 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 4의 염기 서열 중의 32~341번을 증폭하는 것이고, 서열 번호 4~92의 짝수 번호로 나타내어지는 개 CD179b 유전자 전체에 공통의 영역을 증폭하는 것이었다. 또한, 서열 번호 100 및 101에 나타내는 염기 서열을 갖는 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 1의 염기 서열 중의 216번~738번 염기의 영역을 증폭하는 것이었다. 비교 대조를 위해서, GAPDH 특이적인 프라이머(서열 번호 102 및 103에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 취득한 개 유전자는 건상한 개 조직에서는 전혀 발현되지 않고, 한편 개 유방암 조직에서 강하게 발현되었다. 인간 상동 유전자의 발현에서는 인간 정상 조직에서 발현을 확인할 수 있었던 것은 골수뿐이고, 인간 암세포에서는 백혈병 세포주 및 유방암 세포주에서 발현이 검출되며, CD179b가 백혈병 세포주와 유방암 세포주에 특이적으로 발현되고 있는 것이 확인되었다.
또한, 도 1 중 세로축의 참조 번호 1은 상기에서 동정된 유전자의 발현 패턴을, 참조 번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
실시예 2: 개 및 인간 신규 암 항원 단백의 제작
(1) 재조합 단백질의 제작
실시예 1에서 취득한 서열 번호 4의 유전자를 기초로 이하의 방법으로 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 1에서 얻어진 파지미드 용액으로부터 조제하여 서열 해석에 제공한 벡터를 1㎕, NdeI 및 KpnI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 104 및 105에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리머라아제(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD 제품)를 이용하여 98℃~10초, 68℃~40초의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열 번호 5의 아미노산 서열 5번~120번 아미노산을 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후 증폭된 DNA를 2% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN 제품)를 이용하여 약 350bp의 DNA 단편을 정제했다.
정제된 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(INVITROGEN 제품)에 라이게이션했다. 이것을 대장균에 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치하는 플라스미드를 NdeI 및 KpnI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후 목적 유전자 서열을 NdeI, KpnI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30b(Novagen 제품)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 산생할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균 내에서 발현시켰다.
또한, 서열 번호 1의 유전자를 기초로 이하의 방법으로 인간 상동 유전자의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 1에서 제작한 각종 조직ㆍ세포 cDNA로부터 RT-PCT법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, EcoRI 및 SalI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 106 및 107에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리머라아제(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD 제품)를 이용하여 98℃~10초, 68℃~40초의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열 번호 3의 아미노산 서열 전장을 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후 증폭된 DNA를 2% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN 제품)를 이용하여 약 540bp의 DNA 단편을 정제했다.
정제된 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(INVITROGEN 제품)에 라이게이션했다. 이것을 대장균에 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치하는 플라스미드를 EcoRI 및 SalI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후 목적 유전자 서열을 EcoRI, SalI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30b(Novagen 제품)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 산생할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균 내에서 발현시켰다.
(2) 재조합 단백질의 정제
상기에서 얻어진 서열 번호 1 및 서열 번호 4를 발현하는 각각의 재조합 대장균을 30㎍/ml 카나마이신 함유 LB 배지에서 600nm에서의 흡광도가 0.7 부근이 될 때까지 37℃에서 배양 후 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 30℃에서 20시간 배양했다. 그 후, 4800rpm으로 10분간 원심하여 집균했다. 이 균체 펠렛을 인산 완충화 생리 식염수에 현탁시키고, 또한 4800rpm으로 10분간 원심하여 균체의 세정을 행했다.
이 균체를 인산 완충화 생리 식염수에 현탁하고, 빙 상에서 초음파 파쇄를 행했다. 대장균 초음파 파쇄액을 7000rpm으로 20분간 원심 분리하여 얻어진 상청을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분으로 했다.
불용성 획분을 4% Triton-X100 용액에 현탁시켜 7000rpm으로 20분간 원심했다. 본 조작을 2회 반복, 탈프로테아제 조작을 행했다.
이 잔사를 6M 구아니딘 염산염 함유 20mM 인산 완충액(pH 8.0)에 현탁시키고, 4℃에서 20시간 정치하여 단백질을 변성시켰다. 이 변성 조작 후, 7000rpm으로 20분간 원심해서 얻어진 가용성 획분을 정법에 따라서 조제한 니켈 킬레이트 컬럼(담체: Chelateing Sepharose(상표) Fast Flow(GE Health Care사), 컬럼 용량 5mL, 평형화 완충액: 6M 구아니딘 염산염 함유 20mM 인산 완충액(pH 8.0))에 첨가했다. 미흡착 획분을 컬럼 용량의 10배량의 6M 구아니딘 염산염 함유 20mM 인산 완충액(pH 8.0)과 10mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 세정 조작을 행한 후, 즉시 4단계로 나눈 50mM-500mM 이미다졸 단계적 농도 구배로 용출을 행하여 정제 획분으로 하고, 이후 이 정제 획분을 투여 시험용의 재료로 했다.
상기 방법에 의해 얻어진 정제 표품 중 200㎕를 1ml의 반응용 완충액(20mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 2mM CaCl2 pH 7.4)에 분주(分注)를 행한 후, 엔테로키나아제(Novagen 제품)를 2㎕ 첨가한 후 실온에서 하룻밤 정치ㆍ반응을 행하여 His 태그를 절단하고, Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen 제품)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라서 정제를 행했다. 이어서, 상기 방법에 의해 얻어진 정제 표품 1.2ml를 한외 여과 NANOSEP 10K OMEGA(PALL 제품)를 이용하여 생리용 인산 완충액(Nissui Pharmaceutical 제품) 치환한 후, HT Tuffryn Acrodisc 0.22㎛(PALL 제품)로 무균 여과를 행하고, 이것을 이하의 실험에 사용했다.
실시예 3: 재조합 단백질의 담암견에 대한 투여 시험
(1) 항종양 평가
표피에 종유를 갖는 담암 환견(유방암)에 대하여 상기에서 정제한 재조합 단백의 항종양 효과의 평가를 행했다.
상기한 바와 같이 정제한 재조합 폴리펩티드 100㎍(0.5ml)에 등량의 불완전 프로인트 애쥬번트(Wako Pure Chemicals 제품)를 혼합해서 암 치료제를 조제했다. 이것을 첫회 투여, 3일 후 및 7일 후에 종양 근방의 소속 림프절에 합계 3회 투여를 행했다. 그 결과, 암 치료제 투여 시점에서 크기가 약 55㎣이었던 종유가 암 치료제 첫회 투여로부터 10일 후에는 30㎣, 20일 후에는 16㎣, 30일 후에는 10㎣까지 축소되었다.
또한, 별도의 유선암의 환견에 대하여 상기 개 유래 폴리펩티드 100㎍(0.5ml)에 0.5ml의 불완전 프로인트 애쥬번트를 혼합한 것을 상기와 동일한 방법으로 합계 3회 투여했다. 또한, 동시에 개 인터로이킨 12를 100㎍씩 피하 투여했다. 그 결과, 암 치료제 투여 시점에서 크기가 약 155㎣이었던 종유가 암 치료제 첫회 투여로부터 24일 후에는 완전하게 퇴축되었다.
(2) 면역 유도능 평가
상기 (1)에서의 투여 시험에서 항종양 효과가 얻어진 환견의 혈액을 암 치료제 투여 전 및 첫회 투여로부터 10일 후 및 30일 후의 각 시점에서 채취하여, 상법에 따라서 말초혈 단핵구를 분리하고, 그것을 사용한 IFNγ의 ELISPOT 분석법에 의해 투여한 각 재조합 단백에 대해서 면역 유도능의 평가를 행했다.
Millipore 제품의 96웰 플레이트(MultiScreen-IP, MAIPS4510)에 70% 에탄올을 100㎕/웰씩 첨가하고, 5분간 정치하여 흡인 제거 후 멸균수로 세정하고, 200mM 중탄산나트륨(pH 8.2)를 300㎕/웰 첨가하여 5분간 정치 후 흡인 제거하여 플레이트를 세정했다. 이어서, 200mM 중탄산나트륨에 첨가한 항 개 인터페론 γ 모노클로날 항체(R&D 제품, clone142529, MAB781)를 0.5㎍/웰씩 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트해서 1차 항체를 고상화했다. 1차 항체를 흡인 제거 후, 블로킹 용액(1% BSA-5% 슈크로오스-200mM 중탄산나트륨(pH 8.2))을 300㎕/웰씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트해서 플레이트를 블로킹했다. 블로킹 용액을 흡인 제거 후, 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지(INVITROGEN 제품)를 300㎕/웰씩 첨가해서 5분간 정치하고, 배지를 흡인 제거했다. 그 후, 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지에 현탁된 각각의 개 말초혈 단핵구를 5×105세포/웰씩 플레이트에 첨가하고, 이것에 각각의 투여에 사용한 개 유래 폴리펩티드 또는 인간 유래 폴리펩티드를 10㎕/웰씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 24시간 배양함으로써 말초혈 단핵구 중에 존재할 수 있는 면역 세포로부터 인터페론 γ를 산생시켰다. 배양 후 배지를 제거하고, 세정액(0.1% Tween20-200mM 중탄산나트륨(pH 8.2))을 이용하여 웰을 6회 세정했다. 상기 블로킹 용액으로 1000배 희석한 토끼 항 개 폴리클로날 항체를 각각의 웰에 100㎕씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트했다. 상기 세정액으로 3회 웰을 세정한 후, 상기 블로킹 용액으로 1000배 희석한 HRP 표식 항 토끼 항체를 각각의 웰에 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 상기 세정액으로 3회 웰을 세정한 후, Konica Immunostain(Konica 제품)으로 발색시키고, 웰을 수세해서 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후 멤브레인을 건조시키고, KS ELISPOT(Carls Zeiss, Inc. 제품)를 이용하여 출현된 스폿수를 카운트했다. 그 결과, 폴리펩티드 투여 전의 말초혈 단핵구에서는 스폿이 검출되지 않았다. 한편, 폴리펩티드 투여 후의 환견에 있어서는 투여 10일 후 및 30일 후의 말초혈 단핵구에서 각각 18개, 87개의 스폿이 검출되었다.
이상의 결과로부터, 투여 환견에 있어서 투여한 재조합 단백에 특이적으로 반응하여 인터페론 γ를 산생하는 면역 세포가 유도되어 있는 것을 확인할 수 있고, 이들의 면역 세포를 중심으로 한 면역 반응에 의해 상기 (1)에 나타낸 항종양 효과가 발휘된 것으로 생각된다.
실시예 4: CD179b 유래 펩티드 에피토프 반응성 CD8 양성 T세포의 유도
(1) HLA-A0201과 HLA-A24에 결합하는 펩티드 모티브의 예측
인간 CD179b 단백질의 아미노산 서열의 정보를 GenBank로부터 얻었다. HLA-A0201과 HLA-A24 결합 모티브 예측을 위해, 공지의 BIMAS 소프트(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/에서 이용 가능)를 사용한 컴퓨터 예측 프로그램을 이용하여 인간 CD179b 단백질의 아미노산 서열을 해석하고, HLA-A0201 분자에 결합 가능하다고 예상되는 서열 번호 108~서열 번호 110과 서열 번호 113~서열 번호 117로 나타내는 펩티드 8종류와 HLA-A24 분자에 결합 가능하다고 예상되는 서열 번호 110~서열 번호 112 및 서열 번호 115와 서열 번호 116으로 나타내는 펩티드 5종류를 선택했다.
(2) 펩티드 에피토프 반응성 CD8 양성 T세포의 유도
HLA-A0201 양성의 건상인으로부터 말초혈을 분리하여 Lymphocyte separation medium(OrganonpTeknika, Durham, NC)에 중층해서 1,500rpm으로 실온에서 20분간 원심 분리했다. PBMC를 함유하는 획분을 회수하고, 냉 인산염 완충액 중에서 3회(또는 그 이상) 세정하여 말초혈 단핵구(PBMC)를 얻었다. 얻어진 PBMC을 AIM-V 배지(Life Technololgies, Inc. 제품) 20ml에 현탁시키고, 배양 플라스크(Falcon 제품) 중에 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 2시간 부착시켰다. 비부착 세포는 T세포 조제에 사용하고, 부착 세포는 수상 세포를 조제하는데 사용했다.
부착 세포를 AIM-V 배지 중에서 IL-4(1000U/ml) 및 GM-CSF(1000U/ml)의 존재 하에서 배양했다. 6일 후에 IL-4(1000U/ml), GM-CSF(1000U/ml), IL-6(1000U/ml, Genzyme, Cambridge, MA), IL-1β(10ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA) 및 TNF-α(10ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)를 첨가한 AIM-V 배지로 교환해서 2일간 더 배양한 후 얻어진 비부착 세포 집단을 수상 세포로서 사용했다.
조제한 수상 세포를 AIM-V 배지 중에 1×106세포/ml의 세포 밀도로 현탁시키고, 상기 (1)에서 선택한 HLA-A0201 분자에 결합 가능하다고 예상되는 서열 번호 108~서열 번호 110, 서열 번호 113~서열 번호 117로 나타내는 펩티드를 10㎍/ml의 농도로 첨가하고, 96웰 플레이트를 이용하여 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후 X선 조사(3000rad)하고, AIM-V 배지로 세정하고, 10% 인간 AB 혈청(Nabi, Miami, FL), IL-6(1000U/ml) 및 IL-12(10ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)를 함유하는 AIM-V 배지에 현탁시키고, 24웰 플레이트 1웰당 각각 1×105세포씩 첨가했다. 또한, 조제한 T세포 집단을 1웰당 각각 1×106세포 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 배양했다. 7일 후, 각각의 배양 상청을 버리고, 상기와 동일하게 해서 얻은 각 펩티드로 처리 후 X선 조사한 수상 세포를 10% 인간 AB 혈청(Nabi, Miami, FL), IL-7(10U/ml, Genzyme, Cambridge, MA) 및 IL-2(10U/ml, Genzyme, Cambridge, MA)를 함유하는 AIM-V 배지에 현탁시켜(세포 밀도: 1×105세포/ml), 24웰 플레이트 1웰당에 각각 1×105세포씩 첨가하고, 더 배양했다. 동일한 조작을 7일 간격으로 4~6회 반복한 후 자극된 T세포를 회수하여 플로우 사이토메트리에 의해 CD8 양성 T세포의 유도를 확인했다.
HLA-A24 분자에 결합 가능하다고 예상되는 서열 번호 110, 111, 112, 115, 116으로 나타내는 펩티드에 관해서도 HLA-A24 양성의 건상인의 말초혈로부터 유도된 수상 세포와 T세포 집단을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 펩티드 에피토프 반응성 CD8 양성 T세포의 유도를 시험해 보았다.
또한, 음성 컨트롤로서 본 발명의 범위 이외의 서열인 펩티드(서열 번호 118)를 사용했다.
실시예 5: HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포를 자극하는 CD179b 유래 세포 장해성 T세포 항원 에피토프의 결정
(1) IFN-γ 산생능
상기에서 유도된 T세포의 내에서 증식이 나타난 T세포 각각에 대해서 펩티드 에피토프에 대한 특이성을 조사하기 위해서, 각 펩티드를 이용하여 펄스한 HLA-A0201 분자를 발현하는 T2 세포(Salter RD et al., Immunogenetics, 21: 235-246(1985), ATCC에서 구입)(10㎍/ml의 농도로 AIM-V 배지 중 각 펩티드를 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양) 5×104개에 대하여 5×103개의 T세포를 첨가하고, 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 AIM-V 배지 중에서 96웰 플레이트에서 24시간 배양했다. 배양 후의 상청을 취해서 IFN-γ의 산생량을 ELISA법에 의해 측정했다. 그 결과, 펩티드를 펄스하지 않는 T2세포를 사용한 웰의 배양 상청에 비해서 서열 번호 108~서열 번호 110 또는 서열 번호 113~서열 번호 117의 펩티드를 펄스한 T2세포를 사용한 웰의 배양 상청에 있어서 IFN-γ 산생이 확인되었다(도 2). 이 결과로부터, 상기 펩티드는 특이적으로 HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포를 증식 자극시켜 IFN-γ 산생을 유도하는 능력을 갖는 T세포 에피토프 펩티드인 것이 판명되었다.
또한, 도 2 중 가로축의 참조 번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10은 각각 서열 번호 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116, 117의 펩티드를 펄스한 T2세포로부터의 자극에 의한 HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포의 IFN-γ 산생능을 나타낸다. 참조 번호 11은 서열 번호 118의 음성 컨트롤의 펩티드에 관한 결과를 나타낸다.
(2) 세포 장해성 평가
이어서, 본 발명에서 사용되는 서열 번호 108~서열 번호 110 및 서열 번호 113~서열 번호 117의 펩티드가 HLA-A0201 양성에서 CD179b를 발현하는 종양 세포 상의 HLA-A0201 분자 상에 제시되는 것인지, 또한 본 펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포가 HLA-A0201 양성에서 CD179b를 발현하는 종양 세포를 장해할 수 있을지를 검토했다. CD179b의 발현이 확인된 B세포 백혈병 세포주, Namalwa 세포(ATCC에서 구입)를 106개 50ml용의 원심 튜브에 모으고, 100μCi 의 크로뮴 51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후, 10% 소 태아 혈청(Gibco 제품)을 포함하는 RPMI 배지(Gibco 제품)로 3회 세정하고, 96웰 V저면 플레이트 1웰당 103개씩 첨가하고, 또한 그 후에 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지에 현탁된 5×104개의 각 펩티드로 자극된 HLA-A0201 양성의 펩티드 에피토프 반응성의 CD8 양성 T세포를 각각 첨가해서, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크로뮴 51의 양을 측정함으로써 각 펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포의 세포 장해 활성을 산출했다. 그 결과, 본 펩티드로 자극된 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포가 Namalwa 세포에 대한 세포 장해 활성을 갖는 것이 판명되었다(도 3). 음성 컨트롤의 펩티드(서열 번호 118)를 이용하여 유도한 CD8 양성 T세포는 세포 장해 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 각 펩티드(서열 번호 108~서열 번호 110 및 서열 번호 113~서열 번호 117)는 HLA-A0201 양성에서 CD179b를 발현하는 종양 세포 상의 HLA-A0201 분자 상에 제시되는 것이고, 또한 본 펩티드는 이러한 종양 세포를 장해할 수 있는 CD8 양성 세포 장해성 T세포를 유도하는 능력이 있는 것이 밝혀졌다.
또한, 세포 장해 활성은 상기한 바와 같이 본 발명에서 사용되는 각 펩티드로 자극 유도된 CD8 양성 T세포 105개와 크로뮴 51을 도입한 103개의 B세포 백혈병주 Namalwa를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크로뮴 51의 양을 측정해서 이하 계산식 *에 의해 산출된 CD8 양성 T세포의 Namalwa 세포에 대한 세포 장해 활성을 나타낸 결과이다.
*식: 세포 장해 활성(%)=CD8 양성 T세포를 첨가했을 때의 Namalwa 세포로부터의 크로뮴 51 유리량÷1N 염산을 첨가한 표적 세포로부터의 크로뮴 51 유리량×100.
또한, 도 3 중 가로축의 참조 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19는 각각 서열 번호 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116, 117을 이용하여 자극한 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포의 Namalwa 세포에 대한 세포 장해 활성을 나타낸다. 참조 번호 20은 음성 컨트롤의 펩티드(서열 번호 118)를 이용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포 장해 활성을 나타낸다.
실시예 6: HLA-A24 양성 CD8 양성 T세포를 자극하는 CD179b 유래 세포 장해성 T세포 항원 에피토프의 결정
(1) IFN-γ 산생능
실시예 5(1)와 마찬가지로, 실시예 3(2)에서 유도된 펩티드 에피토프 반응성 CD8 양성 T세포에 대해서 펩티드 에피토프에 대한 특이성을 조사하기 위해서 서열 번호 110, 111, 112, 115, 116의 펩티드를 이용하여 펄스한 HLA-A24 분자를 발현하는 JTK-LCL 세포(RIKEN에서 구입)(10㎍/ml의 농도로 AIM-V 배지 중 각 펩티드를 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양) 5×104개에 대하여 5×103개의 상기 T세포를 첨가하고, 10% 인간 AB혈청을 포함하는 AIM-V 배지 중에서 96웰 플레이트에서 24시간 배양했다. 배양 후의 상청을 취해서, IFN-γ의 산생량을 ELISA법에 의해 측정했다. 그 결과, 펩티드를 펄스하지 않는 JTK-LCL 세포를 사용한 웰의 배양 상청에 비해서 서열 번호 110, 111, 112, 115, 116의 펩티드를 펄스한 JTK-LCL 세포를 사용한 웰의 상청에 있어서 IFN-γ 산생이 확인되었다(도 4). 이 결과로부터, 상기 펩티드는 특이적으로 HLA-A24 양성 CD8 양성 T세포를 증식 자극시켜, IFN-γ 산생을 유도하는 능력을 갖는 T세포 에피토프 펩티드인 것이 판명되었다.
또한, 도 4 중 가로축의 참조 번호 21, 22, 23, 24, 25는 각각 서열 번호 110, 111, 112, 115, 116의 펩티드를 펄스한 JTK-LCL 세포로부터의 자극에 의한 HLA-A24 양성 CD8 양성 T세포의 IFN-γ 산생능을 나타낸다. 참조 번호 26은 서열 번호 118의 음성 컨트롤의 펩티드에 관한 결과를 나타낸다.
(2) 세포 장해성 평가
이어서, 본 발명에서 사용되는 서열 번호 110, 111, 112, 115, 116의 펩티드가 HLA-A24 양성에서 CD179b를 발현하는 세포 상의 HLA-A24 분자 상에 제시되는 것인지, 또한 본 펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포가 HLA-A24 양성에서 CD179b를 발현하는 세포를 장해할 수 있을지를 실시예 5(2)와 동일한 방법으로 검토했다. HLA-A24 양성에서 CD179b를 발현하는 JTK-LCL 세포를 106개 50ml용의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크로뮴 51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후, 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지(Gibco 제품)로 3회 세정하고, 96웰 V저면 플레이트 1웰당 103개씩 첨가하고, 또한 그 후에 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지에 현탁된 5×104개의 각 펩티드로 자극된 HLA-A24 양성의 펩티드 에피토프 반응성의 CD8 양성 T세포를 각각 첨가해서, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크로뮴 51의 양을 측정함으로써 각 펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포의 세포 장해 활성을 산출했다. 그 결과, 본 펩티드로 자극된 HLA-A24 양성의 CD8 양성 T세포가 JTK-LCL 세포에 대한 세포 장해 활성을 갖는 것이 판명되었다(도 5). 따라서, 본 실시예에서 사용된 각 펩티드(서열 번호 110, 111, 112, 115, 116)는 HLA-A24 양성에서 CD179b를 발현하는 세포상의 HLA-A24 분자 상에 제시되는 것이고, 또한 본 펩티드는 이러한 세포를 장해할 수 있는 CD8 양성 세포 장해성 T세포를 유도하는 능력이 있는 것이 밝혀졌다. 음성 컨트롤의 펩티드(서열 번호 118)를 이용하여 유도한 CD8 양성 T세포는 세포 장해성을 나타내지 않았다.
또한, 도 5 중 가로축의 참조 번호 27, 28, 29, 30, 31은 각각 서열 번호 110, 111, 112, 115, 116의 펩티드를 이용하여 자극한 HLA-A24 양성의 CD8 양성 T세포의 JTK-LCL 세포에 대한 세포 장해 활성을 나타낸다. 참조 번호 32는 음성 컨트롤의 펩티드(서열 번호 118)를 이용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포 장해 활성을 나타낸다.
실시예 7: 재조합 단백질을 사용한 암 검출
(1) 개의 암 검출
악성 종양이 확인된 환견 153마리와 건상견 264마리의 혈액을 채취하여 혈청을 분리했다. 실시예 2에서 제작한 개 유래 암 항원 단백(서열 번호 5의 아미노산 서열 중: 5번~120번)과 항 개 IgG 항체를 이용하여 ELISA법으로 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
제작한 폴리펩티드의 고상화는 인산 완충화 생리 식염수로 100㎍/ml로 희석한 재조합 단백질 용액을 96웰 Immobilizer Amino plate(Nunc 제품)에 100㎕/웰 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치를 행했다. 블로킹은 Block Ace powder(DS Pharma Biomedical Co., Ltd. 제품) 4g을 정제수 100ml에 용해한 용액을 정제수로 4배 희석한 것(이하, 블로킹 용액)을 100㎕/웰 첨가하여, 실온에서 1시간 진탕시켰다. 희석에 블로킹 용액을 사용한 1000배 희석 혈청을 100㎕/웰 첨가하고, 실온에서 3시간 진탕시켜서 반응시켰다. 0.05% Tween20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품) 함유 인산 완충화 생리 식염수(이하, PBS-T)로 3회 세정하고, 블로킹 용액으로 3000배 희석한 HRP 수식 개 IgG 항체(Goat anti Dog IgG(-H+L) HRP conjugated: BETHYL Laboratories 제품)를 100㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 진탕시켜서 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE)를 100㎕/웰 첨가하여, 실온에서 30분간 효소 기질 반응시켰다. 그 후, 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan 제품)을 100㎕/웰 첨가해서 반응 정지 후 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 컨트롤로서는 제작된 재조합 단백질을 고상화하지 않은 것, 담암견 혈청을 반응시키지 않은 것을 상기와 동일하게 행동 비교하는 것으로 했다.
상기 암 검출에 사용한 암종으로서, 병리 진단에서 악성으로 확정 진단이 되어 있는 유방암 112 검체, 임파종 31 검체 및 백혈병 10 검체를 사용했다.
이들 담암견 생체 유래의 혈청은 매우 높은 재조합 단백질에 대한 항체값을 나타냈다. 본 검출법에 의한 악성 판단을 건상견 평균값의 2배 이상으로 했을 경우, 유방암에서 61검체(54%), 임파종에서 21검체(71%), 백혈병에서 7검체(70%)가 각각 악성이라고 판단할 수 있는 것을 알았다. 또한, 병리 진단에서 양성으로 확정 진단이 되어 있는 유선 종양 환견 30마리의 혈청을 이용하여 동일하게 검사한 바, 건상견 평균값의 2배 이상의 값이 검출된 검체수는 0이었다.
마찬가지로, 실시예 2에서 제작한 인간 유래 암 항원 단백(서열 번호 3의 아미노산 서열)과 항 개 IgG 항체를 이용하여 ELISA법으로 상기 각 담암견 혈청 샘플 중의 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 IgG 항체값을 측정한 바, 유방암에서 56검체(50%), 임파종에서 18검체(58%), 백혈병에서 5검체(50%)가 각각 악성이라고 판단할 수 있는 것을 알았다.
또한, 말기암 환견에서 채취한 흉수, 복수를 이용하여 상기와 동일한 검출을 행한 결과, 혈청을 사용한 본 검출법에 의한 결과와 동일한 값을 검출할 수 있어 암으로 진단할 수 있었다.
(2) 인간의 암 검출
상기에서 사용한 인간 유래 암 항원 단백(서열 번호 3의 아미노산 서열)과 항 인간 IgG 항체를 이용하여 상기와 동일하게 해서 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 건상인 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 인간 IgG 항체(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: Zymed Laboratories 제품)를 블로킹 용액으로 10000배 희석해서 사용했다. 포지티브 컨트롤로서 인산 완충화 생리 식염수로 50㎍/ml로 조제한 난백 알부민 항원을 고상화한 것을 사용했다. 그 결과, 450nm에서의 흡광도는 난백 알부민 항원에 대하여 건상인 7인의 평균으로 0.45로 높은 값을 나타냈다. 한편, 상기 폴리펩티드에 대해서는 0으로 전혀 검출되지 않았다.
또한, 상기와 동일한 방법으로 악성 유방암을 이환하고 있는 환자 유래의 혈청 17검체(Promeddx에서 구입)에 대하여 상기와 동일하게 해서 인간 유래 암 항원 단백(서열 번호 3의 아미노산 서열)에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 그 결과, 450nm에서의 흡광도는 상기 폴리펩티드에 대하여 유방암 환자 17인의 평균으로 0.28로 높은 값을 나타냈다. 따라서, 인간에 있어서도 본 방법에 의해 암을 검출할 수 있는 것을 알았다.
<산업상의 이용 가능성>
본 발명은 유방암, 백혈병, 임파종 등의 암(종양)에 대하여 항종양 활성을 발휘하는 폴리펩티드를 포함하는 면역 유도제를 제공하기 때문에 암의 치료에 유용하다. 또한, 본 발명은 신규 암의 검출 수단을 제공하기 때문에 암의 진단에 유용하다.
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Claims (19)

  1. 하기 (a)의 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 1개 이상의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
    (a) 서열표의 서열 번호 3~93 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열표의 서열 번호 3~93 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열표의 서열 번호 3~93 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 aa1-34 또는 aa52-75의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열표의 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116 또는 서열 번호 117로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 서열표의 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116 또는 서열 번호 117로 나타내어지는 아미노산 서열을 부분 서열로서 포함하고, 아미노산 잔기수가 8~12개인 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  7. 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1개 또는 복수개의 상기 폴리펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 항원 제시 세포의 처리제인 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  9. 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동물의 암 치료용 또는 예방용인 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 암은 CD179b 유전자를 발현시키는 암인 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 백혈병 또는 임파종인 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  12. 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    애쥬번트 및 사이토카인에서 선택되는 면역 증강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 유도의 사용을 위한 제품.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 하기 (a)의 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 1개 이상의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 개체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물에 대한 면역 유도 방법.
    (a) 서열표의 서열 번호 3~93 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
  16. 생체로부터 분리된 체액, 조직 또는 세포에 대하여 행하는 방법으로서, 하기 (a)의 폴리펩티드의 발현을 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물에 대한 암의 검출 방법.
    (a) 서열표의 서열 번호 3~93 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖고, 생체 내에서 생산되는 폴리펩티드
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 발현의 측정은 상기 체액, 조직 또는 세포에 포함될 수 있는 측정해야 할 상기 폴리펩티드에 대하여 상기 생체 내에서 유도된 항체를 면역 측정함으로써 행해지는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물에 대한 암의 검출 방법.
  18. 생체로부터 분리된 체액, 조직 또는 세포에 대하여 행하는 방법으로서, 암 환자 유래의 체액, 조직 또는 세포 중의 서열표의 서열 번호 1 또는 서열 번호 4~92 중 짝수의 서열 번호로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 코드 영역을 갖는 CD179b 유전자의 발현을 조사하고, 건상자 유래의 체액, 조직 또는 세포 중의 상기 유전자의 발현량과 비교하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물에 대한 암의 검출 방법.
  19. 하기 (a)의 폴리펩티드에 대하여 생체 내에서 유도되는 항체와 항원 항체 반응하는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 검출용 시약.
    (a) 서열표의 서열 번호 3~93 중 홀수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
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