WO2010005069A1 - 免疫誘導剤及び癌の検出方法 - Google Patents

免疫誘導剤及び癌の検出方法 Download PDF

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文義 岡野
まさき 清水
孝則 齋藤
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東レ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a novel immunity-inducing agent useful as an agent for treating and / or preventing cancer.
  • the present invention also relates to a novel method for detecting cancer.
  • Cancer is a disease that occupies the top cause of all deaths, and the current treatment is a combination of radiation therapy and chemotherapy, mainly surgery. Despite the recent development of new surgical methods and the discovery of new anti-cancer drugs, the therapeutic results of cancer have not improved much except for some cancers. Recent advances in molecular biology and cancer immunology have identified cancer antigens recognized by cytotoxic T cells that respond to cancer, genes encoding cancer antigens, etc. (Non-Patent Document 1).
  • dogs and cats are known to have many tumors such as breast cancer, leukemia, and lymphoma, and are ranked high in the disease statistics of dogs and cats.
  • canine and feline cancer there is currently no effective therapeutic or prophylactic agent for canine and feline cancer.
  • Most dogs and cat tumors are noticed by the owner after the tumor has progressed and the tumor has grown, and even if they come to the hospital and are removed by surgery or administered human drugs (such as anticancer drugs) Already too late to die soon after treatment. Under such circumstances, if cancer therapeutics and preventives effective for dogs and cats become available, it is expected that the use for canine cancer will be opened.
  • Tumor products refer to tumor-related antigens, enzymes, specific proteins, metabolites, oncogenes, oncogene products and tumor suppressor genes.
  • Non-patent Document 10 Carcinoembryonic antigen CEA, glycoproteins CA19-9, CA125
  • PSA, calcitonin which is a peptide hormone produced in the thyroid gland, and the like have been utilized for cancer detection as tumor markers in some cancers.
  • tumor markers there are no tumor markers useful for cancer detection.
  • highly sensitive measurement methods and special techniques are required to detect them. Needed. Under such circumstances, if a novel cancer detection means capable of detecting various cancers with high sensitivity by a simple operation is provided, diagnostic applications for various cancers are expected to be opened.
  • CD179b is part of an alternative light chain of immunoglobulin, and is known to be expressed on the membrane surface of B cell progenitor cells (pre-B cells and pro-B cells). It disappears as B cells differentiate and is not expressed on mature B cells.
  • CD179b is known to be expressed in leukemia (pre-B cell leukemia) cells in which pre-B cells have become cancerous (Non-patent Documents 10 and 11).
  • CD179b is also expressed in lymphoma (pre-B cell lymphoma) cells in which pre-B cells have become cancerous, and is known to be usable as a diagnostic marker for pre-B cell lymphoma (Non-patent Document 12). ).
  • An object of the present invention is to find a novel polypeptide useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer, and to provide use of the polypeptide as an immunity-inducing agent.
  • a further object of the present invention is to provide a cancer detection means useful for cancer diagnosis.
  • the inventors of the present application encode a protein that binds to an antibody present in serum derived from a cancer-bearing organism by the SEREX method using serum from the same dog as the canine breast cancer tissue-derived cDNA library.
  • a canine CD179b polypeptide having the amino acid sequence shown was generated.
  • a human CD179b polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is prepared based on the obtained human homologous gene, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 95 is similarly used based on the bovine homologous gene.
  • a bovine CD179b polypeptide having the sequence was generated. They have found that these CD179b polypeptides are specifically expressed in breast cancer, leukemia and lymphoma cells. Furthermore, it has been found that by administering these CD179b to a living body, immune cells against CD179b can be induced in vivo, and tumors in vivo that express CD179b can be regressed.
  • a recombinant vector that can express a polynucleotide encoding CD179b polypeptide or a fragment thereof induces an antitumor effect in vivo against a cancer that expresses CD179b.
  • the partial polypeptide in CD179b protein has the ability to be presented by antigen presenting cells to activate and proliferate cytotoxic T cells specific for the peptide (immunity-inducing activity), It has been found that the peptide is useful for the treatment and / or prevention of cancer, and that antigen-presenting cells in contact with the peptide and T cells in contact with the antigen-presenting cells are useful for the treatment and / or prevention of cancer. It was. Furthermore, the present inventors have found that a recombinant polypeptide prepared based on the amino acid sequence of the CD179b protein can detect cancer because it specifically reacts only with serum in cancer-bearing organisms. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention has the following features.
  • polypeptide selected from the following polypeptides (a) to (c) and having immunity-inducing activity, or a polynucleotide encoding the polypeptide in vivo: An immunity-inducing agent containing a possible recombinant vector as an active ingredient.
  • a polypeptide comprising 7 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence represented by an odd SEQ ID No. among SEQ ID Nos. 3 to 95 in the Sequence Listing
  • the polypeptide having immunity-inducing activity is a polypeptide comprising 7 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence represented by an odd sequence number in SEQ ID NO: 3 to 95 of the sequence listing, or the polypeptide
  • the polypeptide having immunity-inducing activity is SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116 or polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 117, or SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115 of the sequence listing.
  • the immunity-inducing agent according to (5) above which is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 116 or SEQ ID NO: 117 as a partial sequence and having 8 to 12 amino acid residues.
  • An isolated antigen-presenting cell comprising a complex of the above-described polypeptide having immunity-inducing activity and an HLA molecule.
  • polypeptides selected from the following polypeptides (a) to (c) and having immunity-inducing activity, or a polynucleotide encoding the polypeptide in vivo: A method of inducing immunity comprising administering a possible recombinant vector to an individual.
  • a polypeptide comprising 7 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence represented by an odd SEQ ID No. among SEQ ID Nos. 3 to 95 in the Sequence Listing
  • a method for detecting cancer which is a method performed on a sample separated from a living body, comprising measuring the expression of at least one polypeptide of (a) to (c) below.
  • the measurement of the expression of the polypeptide is carried out by immunoassay of the antibody induced in the living body against the polypeptide to be measured, which can be contained in the sample. Method.
  • a method performed on a sample isolated from a living body, which has a base sequence represented by an even sequence number among SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NOs: 4-94 in a sample derived from a cancer patient A method for detecting cancer, comprising examining the expression of a CD179b gene having a coding region and comparing the expression level of the gene in a sample derived from a healthy subject.
  • a cancer detection reagent comprising a polypeptide that undergoes an antigen-antibody reaction with an antibody induced in vivo against any of the following polypeptides (a) to (c): (a) a polypeptide comprising 7 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence represented by an odd SEQ ID No. among SEQ ID Nos. 3 to 95 in the Sequence Listing (b) A polypeptide having 90% or more sequence identity with the polypeptide (a) and comprising 7 or more amino acids (c) a polypeptide comprising the polypeptide of (a) or (b) as a partial sequence
  • the present invention provides a novel immunity-inducing agent useful for cancer treatment and / or prevention.
  • a novel immunity-inducing agent useful for cancer treatment and / or prevention.
  • immune cells can be induced in the cancer-bearing animal body, and cancer that has already occurred. Can be reduced or retracted.
  • the present invention also provides a novel cancer detection method.
  • By measuring the expression of the polypeptide in the sample by the method of the present invention it is possible to detect small-sized cancers that are invisible to the eye and cancers in the deep part of the body. It is.
  • the method of this invention is utilized for the follow-up of the patient after cancer treatment, the cancer which recurred can also be detected at an early stage.
  • it is possible to diagnose the degree of cancer progression such as tumor growth, infiltration into surrounding tissues, and cancer metastasis to lymph nodes and distant organs.
  • Reference number 1 the expression pattern of the gene encoding CD179b protein
  • Reference number 2 the expression pattern of the GAPDH gene.
  • reference number 1 on the vertical axis indicates the expression pattern of the gene identified above
  • reference number 2 indicates the expression pattern of the GAPDH gene as a comparative control.
  • reference numbers 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10 on the horizontal axis represent T2 pulses of the peptides of SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116, and 117, respectively.
  • Reference number 11 shows the results for the negative control peptide of SEQ ID NO: 118 (a peptide that is a sequence outside the scope of the present invention).
  • reference numbers 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, and 19 on the horizontal axis represent HLA stimulated using SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116, and 117, respectively.
  • -A0201-positive CD8-positive T cells show cytotoxic activity against Namalwa cells.
  • Reference number 20 indicates the cytotoxic activity of CD8 positive T cells induced with a negative control peptide (SEQ ID NO: 118).
  • SEQ ID NO: 118 a negative control peptide that is a sequence outside the scope of the present invention.
  • reference numbers 21, 22, 23, 24, and 25 on the horizontal axis represent HLA-A24 positive CD8 by stimulation from JTK-LCL cells pulsed with the peptides of SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 115, and 116, respectively.
  • 1 shows the ability of positive T cells to produce IFN- ⁇ .
  • Reference number 26 shows the results for the negative control peptide of SEQ ID NO: 118.
  • reference numbers 27, 28, 29, 30, and 31 on the horizontal axis represent JTKs of HLA-A24-positive CD8-positive T cells stimulated with the peptides of SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 115, and 116, respectively.
  • Reference number 32 shows the cytotoxic activity of CD8 positive T cells induced with a negative control peptide (SEQ ID NO: 118).
  • polypeptide contained as an active ingredient in the immunity-inducing agent of the present invention include one or more polypeptides selected from the following polypeptides (a), (b) and (c). (a) having an amino acid sequence represented by an odd sequence number (ie, sequence number 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,...
  • polypeptide refers to a molecule formed by peptide bonding of a plurality of amino acids. Not only a polypeptide molecule having a large number of amino acids but also a low molecular weight having a small number of amino acids. Molecules (oligopeptides) and full-length molecules are also included, and in the present invention, proteins consisting of the full lengths of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,.
  • a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 means 176 amino acids having the amino acid sequence of Leu Leu Arg Pro ⁇ (Omitted) shown in SEQ ID NO: 3 ⁇ Ala Glu Cys Ser By a residue size polypeptide is meant.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 may be abbreviated as “polypeptide of SEQ ID NO: 3”. The same applies to the expression “having a base sequence”.
  • immuno-inducing activity means the ability to induce immune cells that secrete cytokines such as interferon in vivo.
  • ELISPOT assay a known ELISPOT assay.
  • cells such as peripheral blood mononuclear cells are obtained from a living body administered with a polypeptide whose immunity-inducing activity is to be evaluated, and the cells are referred to as the polypeptide.
  • the number of immune cells in the cells can be measured by coculturing and measuring the production amount of cytokines such as IFN- ⁇ and interleukin (IL) and / or chemokines from the cells using a specific antibody.
  • cytokines such as IFN- ⁇ and interleukin (IL) and / or chemokines
  • a cancer-bearing recombinant polypeptide prepared based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95
  • the tumor can also be reduced or regressed due to its immunity-inducing activity. Therefore, the above immunity-inducing activity suppresses the growth of cancer cells expressing the polypeptide of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 or suppresses cancer tissue (tumor). It can also be evaluated as the ability to reduce or extinguish (hereinafter referred to as “antitumor activity”).
  • the antitumor activity of a polypeptide can be determined by examining whether the tumor is actually reduced or regressed by actually administering the polypeptide to a cancer-bearing animal, as specifically described in the examples below. Can be confirmed.
  • T cells stimulated with the polypeptide that is, T cells brought into contact with antigen-presenting cells presenting the polypeptide
  • the antitumor activity of the polypeptide can also be evaluated.
  • the T cell and the antigen-presenting cell can be contacted by co-culturing both in a liquid medium.
  • the cytotoxic activity can be measured by a known method called a 51 Cr release assay described in, for example, Int. J. Cancer, 58: p317,1994.
  • the polypeptide When the polypeptide is used for cancer treatment and / or prevention, it is not particularly limited, but it is preferable to evaluate immunity induction activity using antitumor activity as an index.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 of the sequence listing disclosed by the present invention are the same as those in dogs with the same canine mammary carcinoma-derived cDNA library.
  • SEREX method using serum a polypeptide that binds to an antibody specifically present in serum derived from a cancer-bearing dog, and the amino acid sequence of CD179b isolated as a human homologous factor (homolog) of the polypeptide Yes (see Example 1 below).
  • the polypeptide of the above (a) is 7 or more consecutive in the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ...
  • a polypeptide consisting of 8, 9, or 10 or more consecutive amino acids and having immunity-inducing activity As known in the art, a polypeptide having about 7 amino acid residues or more can exhibit antigenicity and immunogenicity. Therefore, any polypeptide having 7 or more consecutive amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 can have immunity-inducing activity. Therefore, it can be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention.
  • the polypeptide As a principle of immune induction by administering a cancer antigen polypeptide, the polypeptide is taken up by the antigen-presenting cell, and then undergoes degradation by peptidase in the cell to become a smaller fragment, which is presented on the surface of the cell, It is known that cytotoxic T cells and the like recognize this and selectively kill cells presenting the antigen.
  • the size of the polypeptide presented on the surface of the antigen-presenting cell is relatively small, and is about 7 to 30 amino acids. Therefore, from the viewpoint of presentation on antigen-presenting cells, the above-described polypeptide (a) includes the amino acid represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95.
  • One of the preferred embodiments is that it is about 7 to 30 contiguous in the sequence, more preferably it is composed of about 8 to 30 or 9 to 30 amino acids. These relatively small polypeptides may be presented directly on the cell surface on antigen-presenting cells without being taken up into antigen-presenting cells.
  • Polypeptides taken up by antigen-presenting cells are cleaved at random positions by peptidases in the cells to generate various polypeptide fragments, and these polypeptide fragments are presented on the surface of antigen-presenting cells. Therefore, if a polypeptide having a large size, such as the full length region of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95, is administered, Polypeptide fragments effective for immunity induction via antigen-presenting cells are inevitably generated.
  • a large-sized polypeptide can also be used for immunity induction via antigen-presenting cells, and the number of amino acids is 30 or more, more preferably 100 or more, more preferably 200 or more, more preferably SEQ ID NOs: 3, 5, It is good also as a polypeptide of the full length area
  • the polypeptide of the present invention can be used as a verification medium capable of searching for an epitope peptide consisting of 8 to 12, preferably 9 to 10, amino acids having a binding motif of each type of HLA, such as Bioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS ) HLA Peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html), and peptides that can be epitope peptides can be screened. Specifically, 7 or more consecutive in the region of aa1-34 or a52-75 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 A polypeptide consisting of the amino acids is preferable, and in the polypeptide of SEQ ID NO: 3, the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 108 to 117 are more preferable.
  • BIMAS Bioinformatics & Molecular Analysis Selection
  • the polypeptide of (b) is a polypeptide in which a small number of amino acid residues in the polypeptide of (a) are substituted, and / or deleted and / or added and / or inserted, and the original sequence 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more, and a polypeptide having immunity-inducing activity It is.
  • a protein antigen has almost the same antigenicity or immunogenicity as the original protein even when a small number of amino acid residues in the amino acid sequence of the protein are substituted, deleted, added or inserted. It is well known to those skilled in the art.
  • polypeptide (b) can also exert immunity-inducing activity, it can be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention.
  • the polypeptide of (b) above is one to several amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95. It is also preferred that is a substituted, deleted, added and / or inserted polypeptide.
  • sequence identity with respect to an amino acid sequence or a base sequence refers to both amino acid sequences (or bases) so that the amino acid residues (or bases) of two amino acid sequences (or base sequences) to be compared match as much as possible. (Or base sequence), and the number of matched amino acid residues (or the number of matched bases) divided by the total number of amino acid residues (or the total number of bases) is expressed as a percentage (%). In the above alignment, a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared as necessary. Such sequence alignment can be performed using a well-known program such as BLAST, FASTA, CLUSTAL W (Karlin and Altschul, Proc. Natl.
  • the total number of amino acid residues is the number of residues (or the number of bases) obtained by counting one gap as one amino acid residue (or base).
  • the identity (%) is the total number of amino acid residues (or the longer sequence) (or The total number of bases) is calculated by dividing the number of matched amino acid residues (or the number of bases).
  • a preferred substitution is a conservative amino acid substitution.
  • the 20 types of amino acids that make up natural proteins are neutral amino acids with low polarity side chains (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), neutral amino acids with hydrophilic side chains (Asn, Gln) , Thr, Ser, Tyr Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), and aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp, His)
  • neutral amino acids with low polarity side chains Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro
  • neutral amino acids with hydrophilic side chains Asn, Gln
  • Thr, Ser, Tyr Cys acidic amino acids
  • Asp, Glu acidic amino acids
  • basic amino acids Arg, Lys, His
  • aromatic amino acids Phe, Tyr, Trp, His
  • the polypeptide (c) is a polypeptide that contains the polypeptide (a) or (b) as a partial sequence and has immunity-inducing activity. That is, the polypeptide (a) or (b) is a polypeptide in which another amino acid or polypeptide is added to one or both ends of the polypeptide and has immunity-inducing activity.
  • a polypeptide can also be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention.
  • the Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method t-butyloxycarbonyl method
  • polypeptide synthesized can also synthesize
  • a polynucleotide encoding the above polypeptide is prepared, the polynucleotide is incorporated into an expression vector and introduced into a host cell, and the polypeptide is produced in the host cell.
  • the desired polypeptide can be obtained.
  • the polynucleotide encoding the above polypeptide can be easily prepared by a known genetic engineering technique or a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer.
  • DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 4 is subjected to PCR using a canine chromosomal DNA or cDNA library as a template and a pair of primers designed to amplify the base sequence described in SEQ ID NO: 4.
  • Any DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be similarly prepared by using human chromosomal DNA or cDNA library as the template. PCR reaction conditions can be set as appropriate.
  • one cycle of the reaction process consisting of 94 ° C for 30 seconds (denaturation), 55 ° C for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C for 2 minutes (extension)
  • the conditions include, but are not limited to, conditions of reacting at 72 ° C. for 7 minutes after 30 cycles.
  • Methods, conditions, etc. of PCR are described, for example, in Ausubel et al., Hor Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons ing.
  • probes and primers are prepared based on the nucleotide sequence and amino acid sequence information shown in SEQ ID NOs: 1 to 95 in the sequence listing in the present specification, and cDNAs of humans, dogs, cows, etc. are prepared using them. By screening the library, the desired DNA can be isolated.
  • the cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing the protein of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95. Procedures such as probe or primer preparation, cDNA library construction, cDNA library screening, and gene cloning described above are known to those skilled in the art.
  • DNA encoding the polypeptide (a) can be obtained.
  • the codons encoding each amino acid are known, the base sequence of a polynucleotide encoding a specific amino acid sequence can be easily specified. Accordingly, since the base sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide (b) or the polypeptide (c) described above can be easily specified, such a polynucleotide can also be obtained using a commercially available nucleic acid synthesizer. It can be easily synthesized by conventional methods.
  • the host cell may be any cell that can express the polypeptide.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli
  • examples of eukaryotic cells include monkey kidney cells COS 1, Chinese hamster ovary.
  • Examples include, but are not limited to, mammalian cultured cells such as cell CHO, human fetal kidney cell line HEK293, mouse fetal skin cell line NIH3T3, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells.
  • an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a multicloning site, a terminator, a drug resistance gene, a nutritional complement gene, etc. that can be replicated in the prokaryotic cell is used as the expression vector.
  • Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescriptII, pET expression system, pGEX expression system and the like.
  • an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site and the like is used as an expression vector.
  • expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, and the like.
  • a DNA encoding the polypeptide is incorporated into such an expression vector, and after transforming a eukaryotic host cell with the vector, the resulting transformant is cultured, and the DNA encodes. Can be expressed in eukaryotic host cells.
  • pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. as an expression vector, a His tag (for example, (His) 6 to (His) 10 ), FLAG tag, myc tag
  • the polypeptide can be expressed as a fusion protein to which various tags such as HA tag and GFP are added.
  • the introduction of the expression vector into the host cell can be performed by a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, microinjection and the like.
  • known separation operations can be combined. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out and solvent fractional precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include, but are not limited to, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography.
  • Polypeptides obtained by the above methods include those in the form of fusion proteins with other arbitrary proteins as described above. Examples thereof include glutathione-S-transferase (GST) and a fusion protein with a His tag. Such a polypeptide in the form of a fusion protein is also included in the scope of the present invention as the polypeptide of (c). Furthermore, the polypeptide expressed in the transformed cell may be subjected to various modifications in the cell after being translated. Such post-translationally modified polypeptides are also included in the scope of the present invention as long as they have immunity-inducing activity. Examples of such translation modification include elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, sugar chain addition, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, phosphorylation, and the like.
  • the immunity-inducing agent of the present invention can be used for treating and / or preventing cancer.
  • tumor and cancer refer to malignant neoplasms and are used interchangeably.
  • the target cancer is a cancer expressing the CD179b gene, for example, a gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95.
  • Cancer that is expressed preferably breast cancer, leukemia and lymphoma.
  • These specific cancers include, for example, breast cancer (breast cancer, complex breast cancer, mammary mixed tumor, intraductal papillary adenocarcinoma, etc.), leukemia (chronic lymphocytic leukemia, etc.), lymphoma (gastrointestinal type) Lymphoma, gastrointestinal lymphoma, small to medium cell lymphoma, etc.), and the like.
  • polypeptide or a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide and capable of expressing the polypeptide in vivo can be used as a therapeutic method for immunity induction. It can also be used as a treatment method for the purpose of treating and / or preventing cancer of animals, and can also be used as a treatment method further comprising an immunopotentiator.
  • target animals are mammals, for example, mammals including primates, pet animals, domestic animals, sport animals, etc., and humans, dogs and cats are preferable.
  • the administration route to the living body of the immunity-inducing agent of the present invention may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferred.
  • parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferred.
  • the immunity-inducing agent When used for the purpose of treating cancer, it can be administered to a regional lymph node in the vicinity of the tumor to be treated, as described in Examples below, in order to enhance the anticancer effect.
  • the dose may be an amount effective for inducing immunity.
  • the dose may be an amount effective for the treatment and / or prevention of cancer. It can be changed according to the animal's weight, sex (male or female), symptoms and the like.
  • the amount effective for the treatment and / or prevention of cancer is appropriately selected according to the size and symptoms of the tumor, but is usually 0.0001 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably 0.001 ⁇ g It is 1000 ⁇ g and can be administered once or divided into several times. Preferably, it is divided into several times and administered every few days to several months.
  • the immunity-inducing agent of the present invention can reduce or regress an already formed tumor. Therefore, since anticancer activity can be exerted on a small number of cancer cells at the early stage of development, onset and recurrence of cancer can be prevented if used before onset of cancer or after treatment of cancer. That is, the immunity-inducing agent of the present invention is useful for both treatment and prevention of cancer.
  • the immunity-inducing agent of the present invention may consist only of a polypeptide, or may be appropriately mixed with additives such as pharmacologically acceptable carriers, diluents and excipients suitable for each administration form. It can also be formulated. Formulation methods and usable additives are well known in the field of pharmaceutical formulations, and any method and additive can be used. Specific examples of additives include diluents such as physiological buffers; excipients such as sugar, lactose, corn starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine; syrup, gelatin, gum arabic, sorbitol, polyvinyl chloride, tragacanth, etc.
  • additives include diluents such as physiological buffers; excipients such as sugar, lactose, corn starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine; syrup, gelatin, gum arabic, sorbitol, polyvinyl chloride, tragacanth, etc.
  • Binders such as: lubricants such as magnesium stearate, polyethylene glycol, talc and silica, but are not limited thereto.
  • examples of the dosage form include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral preparations such as inhalants, injections, suppositories, and liquids. These preparations can be made by generally known production methods.
  • the immunity-inducing agent of the present invention can be used in combination with an immunity enhancing agent capable of enhancing the immunological response in vivo.
  • the immunopotentiator may be contained in the immunity-inducing agent of the present invention, or may be administered to a patient in combination with the immunity-inducing agent of the present invention as a separate composition.
  • the patient is an animal, particularly a mammal, preferably a human, a dog or a cat.
  • the above immunopotentiator examples include an adjuvant.
  • Adjuvants provide a reservoir of antigen (extracellular or within macrophages), enhance immunological responses by activating macrophages and stimulating specific sets of lymphocytes, thus enhancing anticancer effects be able to. Therefore, in particular, when the immunity-inducing agent of the present invention is used for the treatment and / or prevention of cancer, it is preferable that the immunity-inducing agent further contains an adjuvant in addition to the above polypeptide as an active ingredient. Many types of adjuvants are well known in the art, and any adjuvant can be used.
  • adjuvants include MPL (SmithKline Beecham), Salmonella minnesota Re 595 lipopolysaccharide of the genus Salmonella and the like obtained after acid hydrolysis; QS21 (SmithKline Beecham), pure purified from Quillja saponaria extract QA-21 saponin; DQS21 described in PCT application WO96 / 33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 and QS-L1 (So et al., Molecules and Cells, 1997, Vol. 7, p.
  • Freund's incomplete adjuvant Freund's complete adjuvant; Vitamin E; Montanide; Alum; CpG oligonucleotides (eg, Kreig et al., Nature, 374, p.546-549); Poly IC and its Various water-in-oil solutions prepared from derivatives (such as poly ICLC) and biodegradable oils such as squalene and / or tocopherols Maruchon, etc.
  • Freund's incomplete adjuvant, montanide, poly IC and derivatives thereof, and CpG oligonucleotides are preferred.
  • the mixing ratio of the adjuvant to the polypeptide is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1, more preferably about 1: 1.
  • the adjuvant is not limited to the above examples, and other adjuvants known in the art may be used when administering the immunity-inducing agent of the present invention (for example, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, No. 2). Edition, 1986). Methods for preparing polypeptide and adjuvant mixtures or emulsions are well known to those skilled in vaccination.
  • factors that stimulate the immune response of the subject can also be used as the immune enhancer.
  • various cytokines having the property of stimulating lymphocytes and antigen-presenting cells can be used in combination with the immune inducer of the present invention as an immune enhancer.
  • Numerous cytokines capable of enhancing such immunological responses are known to those skilled in the art, such as interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines, Examples include, but are not limited to, GM-CSF, IL-18, interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , and Flt3 ligand.
  • IL-12 interleukin-12
  • Such factors can also be used as the above-mentioned immunity enhancing agent, and can be administered to patients in the immunity-inducing agent of the present invention or in combination with the immunity-inducing agent of the present invention as a separate composition.
  • the polypeptide used in the present invention and antigen-presenting cells can be brought into contact with each other in vitro to present the polypeptide to antigen-presenting cells. That is, the above-described polypeptides (a) to (c) can be used as a treatment agent for antigen-presenting cells.
  • antigen-presenting cells include dendritic cells, B cells and macrophages, and dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules can be preferably used.
  • the treatment agent refers to an agent that pulses antigen-presenting cells, and the pulsed antigen-presenting cells can be used as a vaccine because they can have the ability to stimulate peripheral blood lymphocytes.
  • HLA class I molecules have been identified and are well known. MHC molecules in humans are called HLA.
  • HLA class I molecules include HLA-A, HLA-B, and HLA-C. More specifically, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602, and the like.
  • Dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules can be prepared from peripheral blood by well-known methods. For example, dendritic cells are induced from bone marrow, umbilical cord blood, or patient peripheral blood using granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and IL-3 (or IL-4), and tumor-related peptides are introduced into the culture system. Can be added to induce tumor-specific dendritic cells.
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IL-3 or IL-4
  • Peripheral blood or bone marrow may be a fresh sample, a cryopreserved sample, or a cryopreserved sample.
  • whole blood may be cultured, or only the leukocyte component may be separated and cultured, but the latter is more efficient and preferable.
  • mononuclear cells may be separated among the leukocyte components.
  • the whole cells constituting the bone marrow may be cultured, or mononuclear cells may be separated and cultured from this.
  • Peripheral blood, its white blood cell components, and bone marrow cells include mononuclear cells, hematopoietic stem cells, immature dendritic cells, CD4 positive cells, and the like that are the origin of dendritic cells.
  • the cytokine used has a property that has been confirmed to be safe and physiologically active, it does not matter whether it is a natural type or a genetically engineered type, and its production method is preferably ensured. Are used in the minimum amount required.
  • the concentration of cytokine to be added is not particularly limited as long as it is a concentration at which dendritic cells are induced, and is usually preferably about 10 to 1000 ng / mL, more preferably about 20 to 500 ng / mL in terms of the total concentration of cytokines.
  • the culture can be performed using a well-known medium usually used for culturing leukocytes.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as leukocyte growth is possible, but is most preferably about 37 ° C. which is the human body temperature.
  • the gas environment during the culture is not particularly limited as long as leukocytes can grow, but it is preferable to aerate 5% CO 2 .
  • the culture period is not particularly limited as long as a necessary number of cells are induced, but it is usually performed for 3 days to 2 weeks.
  • a device used for cell separation and culture an appropriate device can be used as appropriate, but it is preferable that safety is confirmed for medical use and that the operation is stable and simple.
  • stacked containers, multistage containers, roller bottles, spinner bottles, bag-type incubators, hollow fiber columns, etc. can be used regardless of general containers such as petri dishes, flasks, and bottles. .
  • the method of bringing the polypeptide into contact with the antigen-presenting cell in vitro can be performed by a well-known method. For example, it can be performed by culturing antigen-presenting cells in a culture solution containing the polypeptide.
  • the peptide concentration in the medium is not particularly limited, but is usually about 1 ⁇ g / ml to 100 ⁇ g / ml, preferably about 5 ⁇ g / ml to 20 ⁇ g / ml.
  • the cell density at the time of culture is not particularly limited, but is usually about 10 3 cells / ml to 10 7 cells / ml, preferably about 5 ⁇ 10 4 cells / ml to 5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • Cultivation is preferably carried out in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere according to a conventional method.
  • the length of the peptide that can be presented on the surface by antigen-presenting cells is usually about 30 amino acid residues at the maximum. Therefore, although not particularly limited, when the antigen-presenting cell and the polypeptide are contacted in vitro, the polypeptide may be prepared to a length of about 30 amino acid residues or less.
  • an isolated antigen-presenting cell containing a complex of the polypeptide and MHC molecule can be prepared using the polypeptide.
  • Such antigen-presenting cells can present the polypeptide to T cells in vivo or in vitro, and induce and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide.
  • Antigen-presenting cells containing the above-described polypeptide and MHC molecule complex prepared as described above are contacted with T cells in vitro to induce cytotoxic T cells specific for the polypeptide. And can be grown. This can be done by co-culturing the antigen-presenting cells and T cells in a liquid medium. For example, it can be carried out by suspending antigen-presenting cells in a liquid medium, placing them in a container such as a well of a microplate, adding T cells thereto, and culturing.
  • the mixing ratio of antigen-presenting cells and T cells during co-culture is not particularly limited, but is usually about 1: 1 to 1: 100, preferably about 1: 5 to 1:20 in terms of the number of cells.
  • the density of antigen-presenting cells suspended in the liquid medium is not particularly limited, but is usually about 1 to 10 million cells / ml, preferably about 10,000 to 1 million cells / ml.
  • the coculture is preferably performed in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere according to a conventional method.
  • the culture time is not particularly limited, but is usually 2 days to 3 weeks, preferably about 4 days to 2 weeks.
  • the coculture is preferably performed in the presence of one or more interleukins such as IL-2, IL-6, IL-7 and IL-12.
  • the concentration of IL-2 and IL-7 is usually about 5 U / ml to about 20 U / ml
  • the concentration of IL-6 is usually about 500 U / ml to about 2000 U / ml
  • the concentration of IL-12 is usually about Although it is about 5 ng / ml to 20 ng / ml, it is not limited to these.
  • “U” represents an active unit.
  • the above co-culture may be repeated once to several times by adding fresh antigen-presenting cells. For example, the operation of discarding the culture supernatant after co-culture, adding a fresh antigen-presenting cell suspension, and further co-culturing may be repeated once to several times. The conditions for each co-culture may be the same as described above.
  • cytotoxic T cells specific for the polypeptide are induced and proliferated. Therefore, an isolated T cell that selectively binds the complex of the polypeptide and the MHC molecule can be prepared using the polypeptide.
  • the gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 is present in breast cancer cells, leukemia cells and lymphoma cells. It is expressed specifically. Therefore, in these cancer types, it is considered that the polypeptide of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 is significantly present more than normal cells.
  • Sex T cells can damage cancer cells.
  • the antigen-presenting cells presenting the polypeptide can induce and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide in vivo, the antigen-presenting cells are administered in vivo. In some cases, cancer cells can be damaged. That is, the cytotoxic T cell and the antigen-presenting cell prepared using the polypeptide are also useful as a cancer treatment and / or prevention agent, like the immunity-inducing agent of the present invention.
  • the administration route of the therapeutic and / or prophylactic agent for cancer containing antigen-presenting cells or isolated T cells as an active ingredient is preferably parenteral administration such as intravenous administration or intraarterial administration.
  • the dosage is appropriately selected according to the symptoms and purpose of administration, and is usually 1 to 10 trillion, preferably 1 million to 1 billion, and this is once every few days to several months. Administration is preferred.
  • the preparation may be, for example, one in which cells are suspended in physiological buffer saline, and can be used in combination with other anticancer agents, cytokines, and the like.
  • one or two or more additives well known in the pharmaceutical field can be added.
  • the immunity-inducing agent of the present invention contains a polynucleotide encoding the polypeptide of (a), (b) and (c) above, and an effective component is a recombinant vector capable of expressing the polypeptide in vivo. May be included.
  • a recombinant vector capable of expressing an antigen polypeptide is also called a gene vaccine.
  • the vector used for producing the gene vaccine is not particularly limited as long as it can be expressed in the target animal cell (preferably in the mammalian cell), and may be a plasmid vector or a virus vector, and is known in the field of gene vaccines. Any of these vectors may be used.
  • a polynucleotide such as DNA or RNA encoding the polypeptide can be easily prepared by a conventional method.
  • the polynucleotide can be incorporated into a vector by a method well known to those skilled in the art.
  • the administration route of the gene vaccine is preferably a parenteral administration route such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration or intraarterial administration, and the dosage can be appropriately selected according to the type of antigen and the like.
  • the weight of the gene vaccine is about 0.1 ⁇ g to 100 mg, preferably about 1 ⁇ g to 10 mg per kg body weight.
  • a polynucleotide encoding the above polypeptide in RNA virus or DNA virus such as retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, Sindbis virus, etc. And a method for infecting a target animal with this.
  • retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.
  • Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.
  • an in vivo method of directly introducing the gene into the body, and collecting a certain cell from the target animal and excluding the gene outside the body There is an ex vivo method for introducing cells into the body (Nikkei Science, April 1994, p20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 1994, Vol. 36, No. 1, p.23-48, Experimental Medicine Special Issue) 1994, Vol. 12, No. 15, and references cited therein).
  • the in vivo method is more preferred.
  • the in vivo method When administered by the in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease, symptoms, etc. for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intramuscularly, or directly to the affected area where the tumor is present.
  • it When administered by the in vivo method, for example, it can be in the form of a preparation such as a liquid, but is generally an injection containing the DNA encoding the peptide of the present invention, which is an active ingredient.
  • customary carriers may be added.
  • the liposome or membrane-fused liposome containing the DNA can be in the form of a liposome preparation such as a suspending agent, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent.
  • base sequence shown in SEQ ID NO: 1 includes the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1 as well as a complementary sequence thereto. Therefore, when saying “polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1”, the single-stranded polynucleotide having the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1, its complementary base sequence Single-stranded polynucleotides having and double-stranded polynucleotides comprising these are included.
  • any base sequence is appropriately selected, but those skilled in the art can easily select it.
  • the expression of the polypeptide used in the present invention is measured using a sample separated from a living body.
  • a method for measuring the expression of a polypeptide using the above sample a method for immunoassay of an antibody against the polypeptide contained in the sample (first method), and an immunoassay for the polypeptide itself contained in the sample And a method for measuring mRNA encoding the polypeptide contained in the sample (third method).
  • polypeptide expression may be measured by any of these methods.
  • the term “measurement” includes any of detection, quantification, and semi-quantification.
  • CD179b is a polypeptide that binds to an antibody (cancer-specific antibody) specifically present in serum derived from a cancer-bearing dog by the SEREX method using serum from the same dog as the canine breast cancer-derived cDNA library.
  • an antibody against CD179b is specifically induced in cancer-bearing dogs. Therefore, a cancer expressing CD179b can also be detected by measuring an antibody against CD179b in a cancer-bearing living body (see Example 7).
  • canine cancer can also be detected by measuring CD179b as an antigen by the second method.
  • mRNA encoding the antigen polypeptide is significantly higher than normal tissues in cancer, particularly breast cancer and leukemia cells (see Example 1).
  • Canine cancer can also be detected by measurement.
  • CD179b is known to be expressed on the membrane surface of B cell progenitor cells (pre-B cells), and thus leukemia (pre-B cell leukemia) in which pre-B cells have become cancerous. It has been reported for the first time in the present invention that it has been reported to be expressed in cells but is expressed in leukemia cells and breast cancer cells other than pre-B cell leukemia cells. As a result, by examining the expression of CD179b, it became possible to detect leukemia, lymphoma and breast cancer other than pre-B cell leukemia cells.
  • the cancer-specific antibody that can be present in the sample can be easily measured by immunoassay using an antigen substance that reacts with the antibody by antigen-antibody reaction.
  • the immunoassay method itself is a well-known conventional method as described in detail below.
  • the above-mentioned polypeptides (a) to (c) can be used as an antigen substance for immunoassay.
  • antibodies are cross-reactive, and even molecules other than the antigenic substance that actually became the immunogen can be used as immunogens if a structure similar to the epitope of the immunogen exists on the molecule. It can bind to the antibody induced against it by an antigen-antibody reaction.
  • polypeptides having high amino acid sequence homology often have similar epitope structures, in which case they may exhibit the same antigenicity.
  • the human-derived polypeptide of SEQ ID NO: 3 reacts with the above antibody induced in the cancer-bearing dog by antigen-antibody reaction. Therefore, in the first method of the present invention, a homologous factor derived from any mammal can be used as an antigen for immunoassay.
  • an antigenic substance having a complex structure such as a protein having a large molecular weight
  • a plurality of sites having different structures exist on the molecule.
  • an antibody produced in vivo against an antigenic substance such as a protein is a polyclonal antibody that is a mixture of a plurality of types of antibodies.
  • the term “polyclonal antibody” refers to an antibody that is present in serum derived from a living body containing an antigen substance in the body and that is induced in the living body with respect to the antigen substance.
  • Immunoassays themselves are well known in this field, and classified by reaction mode include sandwich method, competition method, agglutination method, Western blot method and the like.
  • classification by label includes radioimmunoassay, fluorescent immunoassay, enzyme immunoassay, biotin immunoassay, and the like, and any method can be used to perform immunoassay of the antibody.
  • the sandwich ELISA and the agglutination method can be preferably applied as an immunoassay method for the above-described antibody in the method of the present invention because it is easy to operate and does not require a large-scale apparatus.
  • an enzyme When an enzyme is used as a label for an antibody, the enzyme is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of a substrate.
  • conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of a substrate.
  • an enzyme inhibitor, a coenzyme, etc. can also be used.
  • These enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound.
  • a known substance can be used according to the type of enzyme used.
  • the enzyme 33 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine can be used, and when alkaline phosphatase is used as the enzyme, paranitrolphenol or the like can be used.
  • the radioisotope those usually used in radioimmunoassay such as 125 I and 3 H can be used.
  • the fluorescent dye those used in usual fluorescent antibody methods such as fluoroless isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.
  • FITC fluoroless isothiocyanate
  • TRITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • the polypeptide used as an antigen is immobilized on a solid phase and serum or the like is used. Then, after washing, an appropriate secondary antibody is reacted. After washing, the secondary antibody bound to the solid phase is measured. Since the unbound secondary antibody can be easily removed by immobilizing the antigen polypeptide to the solid phase, it is preferable as an embodiment of the cancer detection method of the present invention.
  • the secondary antibody for example, if the sample is derived from a dog, an anti-dog IgG antibody can be used. By labeling the secondary antibody with the labeling substance exemplified above, the secondary antibody bound to the solid phase can be measured.
  • the amount of secondary antibody measured in this way corresponds to the amount of antibody in the serum sample.
  • an enzyme used as the labeling substance
  • the amount of antibody can be measured by adding a substrate that develops color by degradation by enzymatic action and optically measuring the amount of degradation of the substrate.
  • a radioisotope used as the labeling substance
  • the radiation dose emitted by the radioisotope can be measured with a scintillation counter or the like.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 that can be contained in a sample obtained from a living body is measured.
  • a cancer-specific antibody reacting with an antigen-antibody with the polypeptide shown in SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 or a homologous factor thereof.
  • the amount is significantly high, this indicates that the production amount of these polypeptides or their homologous factors as antigens of the cancer-specific antibody is significantly high in cancer patients. Therefore, by measuring the polypeptide shown in SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or 95 or a homologous factor thereof, as in the first method, Cancer in the body can be detected.
  • Measurement of a polypeptide in a sample can be easily performed by a well-known immunoassay method.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with a polypeptide comprising the sequence represented by an odd sequence number among SEQ ID NOs: 3 to 95 or a homologous factor thereof is prepared and used.
  • an immunoassay a polypeptide consisting of the sequence represented by an odd sequence number among SEQ ID NOs: 3 to 95 that may be present in a sample or a homologous factor thereof can be measured.
  • the immunoassay method itself is a well-known conventional method as described above.
  • an antibody fragment such as Fab fragments or F (ab ') 2 fragment contained in an antibody molecule is meant an antibody fragment capable of binding to the antigen.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody with high reproducibility is preferred for immunoassay and the like.
  • Methods for preparing polyclonal and monoclonal antibodies using a polypeptide as an immunogen are well known and can be easily performed by conventional methods. For example, an antibody against a polypeptide can be induced by immunizing an animal with an adjuvant using a polypeptide bound to a carrier protein such as keyhole limpet hemocyan (KLH) or casein as an immunogen. .
  • KLH keyhole limpet hemocyan
  • Hybridomas are prepared by fusing antibody-producing cells such as spleen cells and lymphocytes collected from immunized animals with myeloma cells, and SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,... 93 or A hybridoma that produces an antibody that binds to the polypeptide shown in 95 or its homologous factor can be selected and grown to obtain a monoclonal antibody using the protein as a corresponding antigen from the culture supernatant.
  • the above method is a well-known ordinary method.
  • mRNA encoding CD179b that can be contained in a sample obtained from a living body is measured.
  • mRNA encoding CD179b is significantly highly expressed in cancer, particularly breast cancer and leukemia cells. Therefore, in vivo cancer can also be detected by measuring the mRNA in the sample.
  • the detection method of the present invention based on the expression level of the polypeptide measured as described above, it is determined whether or not the target living body has cancer.
  • detection of cancer is possible only by measuring the expression of the polypeptide in the target living body, from the viewpoint of improving the detection accuracy, the expression level of the polypeptide (antibody amount, polypeptide amount) in one or more healthy subjects samples.
  • examine the polypeptide expression level for samples obtained from a large number of patients who are known to have cancer obtain the cancer patient reference value, and obtain the measured value of the target organism.
  • the reference value can be determined, for example, by digitizing the polypeptide expression level in each sample and calculating the average value.
  • the healthy subject reference value and the cancer patient reference value can be determined in advance by examining the polypeptide expression level for a large number of healthy subjects and cancer patients. Therefore, when comparing with a reference value by the method of the present invention, a predetermined reference value may be used.
  • detection by other cancer antigens or cancer markers may be used in combination. Thereby, the detection accuracy of cancer can further be improved.
  • cancer in vivo can be detected.
  • a tumor of a small size that cannot be seen by the eye or a tumor in the deep part of the body can be detected, which is useful for early detection of cancer.
  • the detection method of the present invention is applied to a patient who is being followed up after treatment for cancer, the cancer can be detected at an early stage when the cancer recurs.
  • the amount of accumulation of the polypeptide and its mRNA in the organism increases as the number of cancer cells that express the predetermined polypeptide to be measured in the present invention increases. Many antibodies against the polypeptide are produced.
  • the number of cancer cells decreases, the amount of the polypeptide and its mRNA accumulated in vivo decreases, and the antibody against the polypeptide in serum decreases. Therefore, when the expression level of the predetermined polypeptide is large, it can be determined that tumor growth or cancer metastasis has occurred, that is, the degree of progression of cancer has progressed.
  • the amount of the antibody is significantly higher in the malignant type than in the benign type. Therefore, when the expression level of the predetermined polypeptide is large, it can be determined that the malignancy of cancer is higher. That is, according to the method of the present invention, the malignancy of cancer can also be detected.
  • the therapeutic effect of cancer can be monitored using the increase or decrease in the expression level of the predetermined polypeptide as an index. Therefore, by observing the expression level of the above polypeptide during and after cancer treatment, clues to quickly know the therapeutic effects of anticancer agents, the presence or absence of residual tumor after tumor removal, and even follow-up observation of metastasis / recurrence Is obtained. If it is properly treated, the expression level of the polypeptide will be lower than that of the cancer-bearing state before treatment, so it should be judged that the effect of the treatment performed on the living body is good. Can do.
  • the expression level of the polypeptide is increased or maintained, or if it further increases after decreasing, it can be determined that the therapeutic effect is insufficient, and changes to other treatment methods or administration of anticancer agents It is a useful judgment material for selecting a treatment method such as changing the amount.
  • the cancer to be targeted by the cancer detection method of the present invention is a cancer that expresses CD179b (excluding pre-B cell type), breast cancer, composite breast cancer, mixed breast malignant tumor, Intraductal papillary adenocarcinoma, leukemia (preferably chronic lymphocytic leukemia, but excluding pre-B cells) lymphoma (preferably gastrointestinal lymphoma, digestive lymphoma, small to medium cell lymphoma, medium Cell type lymphoma or multicentric lymphoma except for pre-B cell type), but is not limited thereto.
  • the living body which is the object of the method of the present invention is a mammal, and preferably a human, a dog or a cat.
  • Specimens used in the method of the present invention include blood, serum, plasma, ascites, pleural effusion and other body fluids, tissues, and cells.
  • serum, plasma, ascites and pleural effusion can be preferably used in the first method and the second method, and a tissue sample and a cell sample are preferable in the third method for measuring mRNA. .
  • the above-described polypeptide used as an antigen for immunoassay in the first method can be provided as a cancer detection reagent.
  • the reagent may be composed only of the above polypeptide, and may contain various additives useful for stabilizing the polypeptide.
  • the reagent can also be provided in a state immobilized on a solid phase such as a plate or a membrane.
  • the polypeptide used in immunoassay of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ... 93 or 95 or a homologous factor thereof in the second method An antibody or antigen-binding fragment thereof that reacts with a homologous factor by an antigen-antibody reaction can also be provided as a cancer detection reagent.
  • the cancer detection reagent in this case may also consist only of the antibody or antigen-binding fragment, and may contain various additives useful for stabilizing the antibody or antigen-binding fragment. Good.
  • the antibody or antigen-binding fragment may be one obtained by binding a metal such as manganese or iron. When such a metal-binding antibody or antigen-binding fragment is administered into the body, a larger amount of the antibody or antigen-binding fragment accumulates at a site where more antigenic protein is present. The presence of cancer cells that produce the protein can be detected.
  • the above-mentioned cancer detection polynucleotide used for mRNA measurement by the third method can also be provided as a cancer detection reagent.
  • the cancer detection reagent may be composed of only the polynucleotide, and may contain various additives useful for stabilizing the polynucleotide.
  • the cancer detection polynucleotide contained in the reagent is preferably a primer or a probe.
  • Example 1 Acquisition of a novel cancer antigen protein by SEREX method (1) Preparation of cDNA library Total RNA by the acid-guanidium-phenol-chloroform method (Acid guanidium-Phenol-Chloroform method) from canine mammary cancer tissues excised by surgery The polyA RNA was purified using Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo) according to the protocol attached to the kit.
  • a canine mammary carcinoma-derived cDNA phage library was synthesized using the obtained mRNA (5 ⁇ g).
  • the cDNA phage library was prepared using cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, and ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (manufactured by STRATAGENE) according to the protocol attached to the kit.
  • the size of the prepared cDNA phage library was 2.99 ⁇ 10 5 pfu / ml.
  • the membrane was recovered, immersed in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5) containing 0.5% nonfat dry milk, and shaken at 4 ° C. overnight to suppress nonspecific reaction.
  • TBS 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5
  • This filter was reacted with serum of a patient dog diluted 500 times at room temperature for 2 to 3 hours.
  • the serum pretreatment method is as follows. That is, ⁇ ZAP Express phage into which no foreign gene was inserted was infected with host E. coli (XL1-BLue MRF ′) and then cultured overnight at 37 ° C. on NZY plate medium. Next, 0.2 M NaHCO 3 pH 8.3 buffer containing 0.5 M NaCl was added to the plate, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 15 hours, and then the supernatant was recovered as an E.
  • E. coli / phage extract was passed through an NHS-column (GE Healthecare Bio-Science) to immobilize the E. coli / phage derived protein.
  • Serum dog serum was passed through this protein-immobilized column and reacted, and antibodies adsorbed to E. coli and phage were removed from the serum.
  • the serum fraction passed through the column was diluted 500 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk, and this was used as an immunoscreening material.
  • the membrane on which the treated serum and the fusion protein were blotted was washed 4 times with TBS-T (0.05% Tween20 / TBS), and then diluted 5000 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk as a secondary antibody.
  • phagemid solution 200 ⁇ l of a phagemid host Escherichia coli (SOLR) solution having an absorbance OD 600 of 1.0 was mixed with 10 ⁇ l of the purified phage solution and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and 50 ⁇ l was treated with ampicillin (final concentration 50 ⁇ g / ml). ) Seeded on LB agar medium and cultured overnight at 37 ° C.
  • SOLR phagemid host Escherichia coli
  • a single colony of transformed SOLR is collected and cultured at 37 ° C in LB medium containing ampicillin (final concentration 50 ⁇ g / ml), and then the plasmid DNA having the target insert is purified using the QIAGEN plasmid Miniprep Kit (Qiagen). did.
  • the purified plasmid was analyzed for the full-length insert sequence by the primer walking method using the T3 primer set forth in SEQ ID NO: 96 and the T7 primer set forth in SEQ ID NO: 97.
  • the gene sequences described in the even numbers of SEQ ID NOs: 4 to 92 were obtained.
  • a homologous search program BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) is carried out using the base sequence and amino acid sequence of this gene (odd numbers of SEQ ID NOs: 5 to 93) and known genes
  • BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
  • the homology among the 45 genes was 94 to 99% of the nucleotide sequence and 96 to 99% of the amino acid sequence.
  • the homology of this gene with the gene encoding the human homologous factor was 62 to 82% of the base sequence and 69 to 80% of the amino acid sequence in the region translated into the protein.
  • the base sequence of the human homologous factor is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3.
  • the homology of this gene with the gene encoding the bovine homologous factor was 68 to 82% of the nucleotide sequence and 56 to 77% of the amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the base sequence of the bovine homologous factor is shown in SEQ ID NO: 94, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 95.
  • the homology between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the bovine homologous factor was 62% for the nucleotide sequence and 72% for the amino acid sequence in the region translated into the protein.
  • Gene pool cDNA (manufactured by Invitrogen), QUICK-Clone cDNA (manufactured by Clontech), and Large-Insert cDNA Library (manufactured by Clontech) were used as cDNAs for normal human tissues (brain, hippocampus, testis, colon, placenta). .
  • the PCR reaction was performed as follows using a primer specific for the obtained canine gene (described in SEQ ID NOs: 98 and 99) and a primer specific for the human homologous gene (described in SEQ ID NOs: 100 and 101).
  • the gene-specific primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 98 and 99 are those that amplify numbers 32 to 341 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, A region common to all of the canine CD179b genes shown was amplified.
  • the gene-specific primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 100 and 101 amplifies the region of the 216th to 738th bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • GAPDH specific primers (described in SEQ ID NOs: 102 and 103) were also used. As a result, as shown in FIG.
  • the obtained canine gene was not expressed at all in healthy dog tissues, whereas strong expression was seen in canine breast cancer tissues.
  • human homologous gene expression only bone marrow was confirmed in normal human tissues.
  • Human cancer cells detected expression in leukemia and breast cancer cell lines, and CD179b was specific to leukemia and breast cancer cell lines. It was confirmed that it was expressed.
  • reference number 1 on the vertical axis indicates the expression pattern of the gene identified above, and reference number 2 indicates the expression pattern of the GAPDH gene as a comparison control.
  • Example 2 Production of a novel canine and human cancer antigen protein (1) Production of recombinant protein Based on the gene of SEQ ID NO: 4 obtained in Example 1, a recombinant protein was produced by the following method. For PCR, 1 ⁇ l of a vector prepared from the phagemid solution obtained in Example 1 and subjected to sequence analysis was used, and two types of primers containing NdeI and KpnI restriction enzyme cleavage sequences (described in SEQ ID NOs: 104 and 105) were each 0.4 ⁇ M.
  • the purified DNA fragment was ligated to a cloning vector pCR-Blunt (manufactured by Invitrogen). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence.
  • the plasmid corresponding to the target sequence was treated with NdeI and KpnI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then inserted into the expression vector pET30b for Escherichia coli treated with NdeI and KpnI restriction enzymes (Novagen) . By using this vector, a His-tagged recombinant protein can be produced.
  • This plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression, and the target protein was expressed in E. coli by inducing expression with 1 mM IPTG.
  • a recombinant protein of human homologous gene was prepared by the following method.
  • PCR 1 ⁇ l of cDNA that was confirmed to be expressed by RT-PCR method from various tissue and cell cDNAs prepared in Example 1 and two primers containing EcoRI and SalI restriction enzyme cleavage sequences (described in SEQ ID NOs: 106 and 107).
  • Each 0.4 ⁇ M, 0.2mM dNTP, 1.25U PrimeSTAR HS polymerase (Takara Shuzo) add each reagent and attached buffer to make a total volume of 50 ⁇ l, and use Thermal Cycler (BIO RAD). The cycle of 98 ° C. to 10 seconds and 68 ° C.
  • the two types of primers were those that amplify the region encoding the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. After PCR, the amplified DNA was electrophoresed on a 2% agarose gel, and a DNA fragment of about 540 bp was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the purified DNA fragment was ligated to a cloning vector pCR-Blunt (manufactured by Invitrogen). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence.
  • the plasmid corresponding to the target sequence was treated with EcoRI and SalI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then inserted into the expression vector pET30a (manufactured by Novagen) for Escherichia coli treated with EcoRI and SalI restriction enzymes. .
  • This vector a His-tagged recombinant protein can be produced.
  • This plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression, and the target protein was expressed in E. coli by inducing expression with 1 mM IPTG.
  • the cells were suspended in phosphate buffered physiological saline and sonicated on ice.
  • the E. coli sonication solution was centrifuged at 7000 rpm for 20 minutes, and the resulting supernatant was used as a soluble fraction and the precipitate was used as an insoluble fraction.
  • the insoluble fraction was suspended in 4% Triton-X100 solution and centrifuged at 7000 rpm for 20 minutes. This procedure was repeated twice to perform a protease removal operation.
  • the residue was suspended in 6 mM guanidine hydrochloride-containing 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) and allowed to stand at 4 ° C. for 20 hours to denature the protein. After this denaturation operation, the soluble fraction obtained by centrifuging at 7000 rpm for 20 minutes was prepared in accordance with a nickel chelate column (carrier: Chelateing Sepharose TM Fast Flow (GE Health ⁇ Care)), column volume 5 mL, equilibration buffer Solution: 6M guanidine hydrochloride-containing 20 mM phosphate buffer (pH 8.0)).
  • 200 ⁇ l of the purified sample obtained by the above method was dispensed into 1 ml of a reaction buffer solution (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 pH 7.4), and then enterokinase (Novagen) ) After 2 ⁇ l was added, the mixture was allowed to stand at room temperature overnight and reacted, the His tag was cleaved, and purified using the Enterokinase Cleavage Capture Kit (Novagen) according to the attached protocol.
  • a reaction buffer solution (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 pH 7.4
  • enterokinase Novagen
  • Example 3 Administration test of a recombinant protein to a cancer-bearing dog (1) Antitumor evaluation Evaluation of the antitumor effect of the recombinant protein purified above on a cancer-bearing dog (breast cancer) having a tumor on the epidermis Went.
  • a cancer therapeutic agent was prepared by mixing 100 ⁇ g (0.5 ml) of the recombinant polypeptide purified as described above with an equal amount of incomplete Freund's adjuvant (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). This was administered a total of 3 times to the regional lymph nodes near the tumor 3 days and 7 days after the initial administration. As a result, a tumor having a size of about 55 mm 3 at the time of administration of the cancer therapeutic agent was changed to 30 mm 3 after 10 days from the initial administration of the cancer therapeutic agent, to 16 mm 3 after 20 days, and to 10 mm 3 after 30 days. Reduced to
  • each canine peripheral blood mononuclear cell suspended in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum was added to the plate at 5x10 5 cells / well, and the dog-derived polypeptide used for each administration or human-derived Interferon ⁇ was produced from immune cells that could be present in peripheral blood mononuclear cells by adding 10 ⁇ L / well of the polypeptide and culturing under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. After culturing, the medium was removed, and the wells were washed 6 times with a washing solution (0.1% Tween 20-200 mM Sodium Bicarbonate (pH 8.2)).
  • Rabbit anti-dog polyclonal antibody diluted 1000 times with the blocking solution was added to each well in an amount of 100 ⁇ L and incubated at 4 ° C. overnight. After washing the well three times with the washing solution, 100 ⁇ L of HRP-labeled anti-rabbit antibody diluted 1000 times with the blocking solution was added to each well and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After washing the well three times with the above washing solution, color was developed with Konica Immunostain (manufactured by Konica), and the well was washed with water to stop the reaction. After stopping the reaction, the membrane was dried, and the number of spots that appeared using KS Elispot (manufactured by Carl Zeitz) was counted.
  • Konica Immunostain manufactured by Konica
  • Example 4 Induction of CD179b-derived peptide epitope-reactive CD8-positive T cells (1) Prediction of peptide motif binding to HLA-A0201 and HLA-A24 Information on the amino acid sequence of human CD179b protein was obtained from GenBank.
  • Peripheral blood was isolated from HLA-A0201-positive healthy individuals, layered on a Lymphocyte separation medium (OrganonpTeknika, Durham, NC), and centrifuged at 1,500 rpm for 20 minutes at room temperature. did. Fractions containing PBMC were collected and washed three times (or more) in cold phosphate buffer to obtain peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The obtained PBMC was suspended in 20 ml of AIM-V medium (manufactured by Life Technololgies) and allowed to adhere in a culture flask (manufactured by Falcon) for 2 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . Non-adherent cells were used for T cell preparation, and adherent cells were used to prepare dendritic cells.
  • AIM-V medium manufactured by Life Technololgies
  • Adherent cells were cultured in the presence of IL-4 (1000 U / ml) and GM-CSF (1000 U / ml) in AIM-V medium. 6 days later, IL-4 (1000 U / ml), GM-CSF (1000 U / ml), IL-6 (1000 U / ml, Genzyme, Cambridge, MA), IL-1 ⁇ (10 ng / ml, Genzyme, Cambridge, MA)
  • the non-adherent cell population obtained after replacement for AIM-V medium supplemented with TNF- ⁇ (10 ng / ml, Genzyme, Cambridge, MA) and further cultured for 2 days was used as dendritic cells.
  • the prepared dendritic cells are suspended in AIM-V medium at a cell density of 1 ⁇ 10 6 cells / ml, and sequenced from SEQ ID NO: 108, which is expected to be able to bind to the HLA-A0201 molecule selected in (1) above.
  • the peptides shown in No. 110 and SEQ ID No. 113 to SEQ ID No. 117 were added at a concentration of 10 ⁇ g / ml, and cultured in a 96-well plate at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours.
  • X-ray irradiation (3000 rad) washed with AIM-V medium, 10% human AB serum (Nabi, Miami, FL), IL-6 (1000 U / ml) and IL-12 (10 ng / ml, Genzyme) , Cambridge, MA) and suspended in AIM-V medium and added at 1 ⁇ 10 5 cells per well of a 24-well plate. Further, the prepared T cell population was added at 1 ⁇ 10 6 cells per well, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Example 5 Determination of CD179b-derived cytotoxic T cell antigen epitope that stimulates HLA-A0201-positive CD8-positive T cells (1) IFN- ⁇ production ability Among the T cells induced above, T cells that showed proliferation For each, T2 cells expressing HLA-A0201 molecule pulsed with each peptide (Salter RD et al., Immunogenetics, 21: 235-246 (1985), ATCC, to investigate specificity for peptide epitopes. (Purchase) (Add each peptide in AIM-V medium at a concentration of 10 ⁇ g / ml and incubate for 4 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 ) 5 ⁇ 10 4 vs.
  • T cells 5 ⁇ 10 3 T cells were added and cultured in 96-well plates for 24 hours in AIM-V medium containing 10% human AB serum. The supernatant after the culture was taken, and the amount of IFN- ⁇ produced was measured by ELISA. As a result, compared to the culture supernatant of the hole using T2 cells not pulsed with the peptide, the hole of the T2 cell pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 108 to SEQ ID NO: 110 or SEQ ID NO: 113 to SEQ ID NO: 117 was used. IFN- ⁇ production was confirmed in the culture supernatant (FIG. 2). From these results, it was found that the above peptide is a T cell epitope peptide having the ability to specifically stimulate HLA-A0201-positive CD8-positive T cells to proliferate and induce IFN- ⁇ production.
  • reference numbers 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10 on the horizontal axis pulse the peptides of SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116, and 117, respectively.
  • 2 shows the IFN- ⁇ production ability of HLA-A0201-positive CD8-positive T cells by stimulation from the prepared T2 cells.
  • Reference number 11 shows the results for the negative control peptide of SEQ ID NO: 118.
  • the peptides of SEQ ID NO: 108 to SEQ ID NO: 110 and SEQ ID NO: 113 to SEQ ID NO: 117 used in the present invention are HLA-A0201 positive and HLA-A0201 on tumor cells expressing CD179b. It was examined whether CD8-positive T cells stimulated with this peptide can damage tumor cells expressing HLA-A0201 and expressing CD179b.
  • the plate was washed 3 times with RPMI medium (Kibco) containing 10% fetal bovine serum (Kibco), and 10 3 pieces were added per well of a 96-well V-bottom plate, followed by 10% fetal bovine serum.
  • RPMI medium Kibco
  • fetal bovine serum Kibco
  • each suspended 5 ⁇ 10 4 pieces of peptide epitopes reactive HLA-A0201-positive stimulated with each peptide of CD8-positive T cells were added in RPMI medium containing, 37 ° C., of 5% CO 2 condition
  • the cells were cultured for 4 hours.
  • the cytotoxic activity of CD8 positive T cells stimulated with each peptide was calculated by measuring the amount of chromium 51 in the culture supernatant released from the damaged tumor cells.
  • HLA-A0201-positive CD8-positive T cells stimulated with this peptide have cytotoxic activity against Namalwa cells (FIG. 3).
  • CD8 positive T cells induced with the negative control peptide did not show cytotoxic activity.
  • each peptide used in the present invention (SEQ ID NO: 108 to SEQ ID NO: 110 and SEQ ID NO: 113 to SEQ ID NO: 117) is presented on the HLA-A0201 molecule on tumor cells that are positive for HLA-A0201 and express CD179b.
  • this peptide has the ability to induce CD8-positive cytotoxic T cells that can damage such tumor cells.
  • cytotoxic activity as described above, mixed 10 and three B cell leukemia line Namalwa which were incorporated the CD8-positive T cells 10 5 and chromium 51 stimulated induced by each peptide used in the present invention Then, the amount of chromium 51 released into the medium after culturing was measured for 4 hours, and the cytotoxic activity of CD8-positive T cells, calculated by the following calculation formula *, against Namalwa cells was shown.
  • Cytotoxic activity (%) chromium 51 release from Namalwa cells when CD8 positive T cells were added ⁇ chromium 51 release from target cells added with 1N hydrochloric acid ⁇ 100.
  • reference numbers 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, and 19 on the horizontal axis are stimuli using SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116, and 117, respectively.
  • the cytotoxic activity with respect to Namalwa cell of the HLA-A0201-positive CD8 positive T cell was shown.
  • Reference number 20 indicates the cytotoxic activity of CD8 positive T cells induced with a negative control peptide (SEQ ID NO: 118).
  • Example 6 Determination of CD179b-derived cytotoxic T cell antigen epitope that stimulates HLA-A24-positive CD8-positive T cells (1) IFN- ⁇ production ability Example 3 (2) in the same manner as Example 5 (1) JTK expressing HLA-A24 molecule pulsed with peptides of SEQ ID NO: 110, 111, 112, 115, 116 to examine the specificity for peptide epitopes for peptide epitope reactive CD8 positive T cells induced in -LCL cells (purchased from RIKEN) (adding each peptide in AIM-V medium at a concentration of 10 ⁇ g / ml and culturing at 37 ° C.
  • reference numbers 21, 22, 23, 24, and 25 on the horizontal axis represent HLA-A24 by stimulation from JTK-LCL cells pulsed with the peptides of SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 115, and 116, respectively.
  • 1 shows the ability of positive CD8-positive T cells to produce IFN- ⁇ .
  • Reference number 26 shows the results for the negative control peptide of SEQ ID NO: 118.
  • the peptides of SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 115, and 116 used in the present invention are presented on the HLA-A24 molecule on the HLA-A24 positive and CD179b expressing cells. Whether CD8-positive T cells stimulated with this peptide can damage HLA-A24-positive cells expressing CD179b was examined by the same method as in Example 5 (2). 10 6 JTK-LCL cells positive for HLA-A24 and expressing CD179b were collected in a 50-ml centrifuge tube, added with 100 ⁇ Ci of chromium 51, and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
  • the plate was washed 3 times with RPMI medium containing 10% fetal calf serum, added 10 3 per well of 96-well V-bottom plate, and further suspended in RPMI medium containing 10% fetal calf serum.
  • HLA-A24-positive peptide epitope-reactive CD8-positive T cells stimulated with 10 4 peptides were added, respectively, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours. After culturing, the cytotoxic activity of CD8 positive T cells stimulated with each peptide was calculated by measuring the amount of chromium 51 in the culture supernatant released from the damaged cells.
  • each peptide (SEQ ID NO: 110, 111, 112, 115, 116) used in this example is presented on an HLA-A24 molecule on a cell expressing H179-A24 positive and expressing CD179b. Furthermore, it was revealed that this peptide has the ability to induce CD8 positive cytotoxic T cells that can damage such cells.
  • CD8 positive T cells induced with the negative control peptide (SEQ ID NO: 118) did not show cytotoxicity.
  • reference numbers 27, 28, 29, 30, and 31 on the horizontal axis represent HLA-A24-positive CD8-positive T cells stimulated with the peptides of SEQ ID NOs: 110, 111, 112, 115, and 116, respectively. Shows cytotoxic activity against JTK-LCL cells.
  • Reference number 32 shows the cytotoxic activity of CD8 positive T cells induced with a negative control peptide (SEQ ID NO: 118).
  • Example 7 Cancer Detection Using Recombinant Protein (1) Canine Cancer Detection The blood of 153 diseased dogs with confirmed malignant tumors and 264 healthy dogs was collected and the serum was separated. Serum that specifically reacts with the polypeptide by ELISA using the canine-derived cancer antigen protein prepared in Example 2 (in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5: No. 5 to 120) and an anti-dog IgG antibody IgG antibody titer was measured.
  • the prepared polypeptide was solid-phased by adding 100 ⁇ L / well of a recombinant protein solution diluted to 100 ⁇ g / mL with phosphate buffered saline to a 96-well immobilizer amino plate (manufactured by NUNK) at 4 ° C. I left it overnight.
  • Blocking was performed by adding 100 ⁇ L / well of a solution obtained by dissolving 4 g of Block Ace powder (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) in 100 ml of purified water and diluting 4 times with purified water (hereinafter referred to as blocking solution) for 1 hour at room temperature. Shake.
  • HRP-modified canine IgG antibody Goat anti Dog IgG- washed three times with phosphate buffered saline (hereinafter PBS-T) containing 0.05% Tween20 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and diluted 3000 times with blocking solution h + I / HRP + conjugated: BETHYL Laboratories) was added at 100 ⁇ L / well, and the mixture was allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • PBS-T phosphate buffered saline
  • Tween20 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • HRP substrate TMB (1-Step Turbo TMB (tetramethylbenzidine), PIERCE) was added and allowed to react at room temperature for 30 minutes. Thereafter, 0.5 M sulfuric acid solution (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) was added at 100 ⁇ l / well, the reaction was stopped, and absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader. As a control, the prepared recombinant protein was not immobilized, and the cancer-retained dog serum was not reacted in the same manner as described above for comparison.
  • cancer types used for the above-mentioned cancer detection 112 breast cancer samples, 31 lymphoma samples and 10 leukemia samples that were confirmed as malignant by pathological diagnosis were used.
  • Example 2 by using the human-derived cancer antigen protein (amino acid sequence of SEQ ID NO: 3) prepared in Example 2 and an anti-dog IgG antibody by ELISA, specific for the polypeptide in each of the above cancer-bearing dog serum samples
  • IgG antibody titer that reacts automatically was measured, 56 samples (50%) in breast cancer, 18 samples (58%) in lymphoma, and 5 samples (50%) in leukemia were found to be malignant.
  • 17 human serum derived from patients suffering from malignant breast cancer purchased from Promeddx
  • human-derived cancer antigen protein amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the IgG antibody titer in the sera that react spontaneously was measured.
  • the absorbance at 450 nm was as high as 0.28 on average for 17 breast cancer patients compared to the polypeptide. Therefore, it was found that cancer can be detected by this technique even in humans.
  • the present invention provides an immunity-inducing agent containing a polypeptide that exhibits antitumor activity against cancer (tumor) such as breast cancer, leukemia, and lymphoma, it is useful for the treatment of cancer.
  • cancer such as breast cancer, leukemia, and lymphoma
  • the present invention provides a novel means for detecting cancer, and thus is useful for cancer diagnosis.

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Abstract

　(a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド (b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、及び(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドのポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤は、癌の治療用及び／又は予防用として使用される。また、上記ポリペプチドは、癌患者の血清中に特異的に存在する抗体と反応するので、試料中の該抗体を測定すれば、生体内の癌を検出することができる。

Description

免疫誘導剤及び癌の検出方法
　本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。また、本発明は、新規な癌の検出方法に関する。
　癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１）。
　免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパクは、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。1991年、ベルギー国Ludwig研究所のBoonらは、自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたcDNA発現クローニング法によりCD8陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原MAGE1を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)法が報告され（非特許文献３；特許文献１）、この方法により、いくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４～９）。さらに、その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験が開始されている。
　一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺癌、白血病、リンパ腫など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬及び予防薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんどで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬（抗癌剤など）を投与しても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬及び予防薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。
　また、癌は早期発見できれば治療成績が良いため、癌患者の体力的、経済的負担なく、血清や尿などを用いて簡便に検査できる癌の検出方法が求められている。血液や尿を用いた癌検出法として、最近では腫瘍マーカーなどの腫瘍生産物を測定する方法が普及してきた。腫瘍生産物とは、腫瘍に関連する抗原、酵素、特定のタンパク質、代謝産物、腫瘍遺伝子、腫瘍遺伝子生産物および腫瘍抑制遺伝子などをさし、癌胎児性抗原CEA、糖タンパク質CA19-9、CA125、前立腺特異抗原PSA、甲状腺で産生されるペプチドホルモンであるカルシトニンなどが一部の癌で腫瘍マーカーとして癌検出に活用されている（非特許文献１０）。しかし多くの癌種においては、癌検出に有用な腫瘍マーカーは存在しない。また、現在知られている腫瘍マーカーの大部分は、体液中にはごく微量（pg/mLオーダー程度）しか存在しないため、それらを検出するためには、高感度な測定法や特殊な技術が必要とされる。このような現状の中で、各種癌を簡便な操作で高感度に検出できる新規な癌検出手段が提供されれば、各種癌に対する診断用途が開かれると期待される。
　CD179bは免疫グロブリンの代替軽鎖の一部であり、B細胞の前駆細胞（プレB細胞およびプロB細胞）の膜表面に発現していることが知られている。B細胞の分化に伴い消滅し、成熟B細胞では発現しない。しかしながら、CD179bは、プレB細胞が癌化した白血病（プレB細胞性白血病）細胞において発現していることが知られている（非特許文献１０、１１）。またCD179bは、プレB細胞が癌化したリンパ腫（プレB細胞性リンパ腫）細胞においても発現しており、プレB細胞性リンパ腫の診断マーカーとして利用されうることが知られている（非特許文献１２）。しかしながら、プレB細胞性白血病細胞以外の白血病細胞、プレB細胞性リンパ腫以外のリンパ腫および乳癌細胞等において特異的に発現しているという報告はない。また、CD179bに対する免疫を増強することが癌の治療及び／又は予防に有用であることを示唆する報告はない。
米国特許第5698396号
秋吉毅,「癌と化学療法」、1997年、第２４巻、ｐ551-519 Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995) Int.J.Cancer,72:965-971(1997) Cancer Res., 58:1034-1041(1998) Int.J.Cancer, 29:652-658(1998) Int.J.Oncol.,14:703-708(1999) Cancer Res., 56:4766-4772(1996) Hum. Mol. Genet６：33-39 (1997) Adv. Immunol., 63:1-41(1996) Blood, 92:4317-4324(1998) Modern Pathology,17:423-429(2004)
　本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの、免疫誘導剤への使用を提供することである。さらに本発明の目的は、癌の診断に有用な癌の検出手段を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの乳癌組織由来cDNAライブラリーと同一患犬の血清を用いたSEREX法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするcDNAを取得し、そのcDNAを基にして、配列表の配列番号５～９３のうち奇数の配列番号（すなわち配列番号５、７、９、１１、１３、１５、・・・９１又は９３）で示されるアミノ酸配列を有するイヌCD179bポリペプチドを作製した。また、取得した遺伝子のヒト相同性遺伝子を基にして、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するヒトCD179bポリペプチドを作製し、同様にウシ相同性遺伝子を基にして配列番号９５で示されるアミノ酸配列を有するウシCD179bポリペプチドを作製した。そしてこれらCD179bポリペプチドが乳癌、白血病およびリンパ腫細胞に特異的に発現していることを見出した。さらにまた、これらCD179bを生体に投与することによって、生体内にCD179bに対する免疫細胞を誘導することができること、およびCD179bを発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。さらにまた、CD179bポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能に含む組換えベクターが、CD179bを発現する癌に対し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。
　さらにまた、CD179bタンパク中の部分ポリペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化および増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ペプチドが癌の治療および／または予防に有用であり、また該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療および／または予防に有用であることを見出した。さらにまた、上記CD179bタンパクのアミノ酸配列を基に作製された組換えポリペプチドが、担癌生体中の血清とのみ特異的に反応することから癌を検出できることを見出した。以上のことにより、本願発明を完成させるに至った。
　したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
　(1)以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
(a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
　(2)上記(b)のポリペプチドが、上記(a)のポリペプチドと９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、上記(1)の免疫誘導剤。
　(3)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、上記(1)の免疫誘導剤。
　(4)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、上記(3)の免疫誘導剤。
　(5)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中のaa1-34又はaa52-75の領域内の連続する７個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、上記(3)の免疫誘導剤。
　(6)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６又は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列表の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６又は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を部分配列として含み、アミノ酸残基数が８～１２であるポリペプチドである、上記(5)の免疫誘導剤。
　(7)１又は複数の上記ポリペプチドを有効成分として含有する、上記(1)～(6)のいずれかの免疫誘導剤。
　(8)上記ポリペプチドが抗原提示細胞の処理剤である、上記(7)の免疫誘導剤。
　(9)動物の癌の治療用及び／又は予防用である、上記(1)～(8)のいずれかの免疫誘導剤。
　(10)上記癌が、CD179ｂ遺伝子を発現する癌である、上記(9)の免疫誘導剤。
　(11)上記癌が乳癌、白血病又はリンパ腫である、上記(10)の免疫誘導剤。
　(12)免疫増強剤をさらに含む、上記(1)～(11)のいずれかの免疫誘導剤。
　(13)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。
　(14)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。
　(15)以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを個体に投与することを含む、免疫誘導方法。
(a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
　(16)生体から分離された試料に対して行う方法であって、以下の(a)ないし(c)の少なくともいずれか１つのポリペプチドの発現を測定することを含む、癌の検出方法。
(a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
　(17)上記ポリペプチドの発現の測定は、前記試料に含まれ得る、測定すべき上記ポリペプチドに対し上記生体内で誘導された抗体を免疫測定することにより行われる上記(16)に記載の方法。
　(18)生体から分離された試料に対して行う方法であって、癌患者由来の試料中の配列表の配列番号１または配列番号４～９４のうち偶数の配列番号に示される塩基配列を有するコード領域を有するCD179b遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法。
　(19)以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドに対して生体内で誘導される抗体と抗原抗体反応するポリペプチドを含む癌検出用試薬。
(a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
　本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを担癌動物に投与すると、該担癌動物体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。
　また、本発明により、新規な癌の検出方法が提供される。本発明の方法により試料中の前記ポリペプチドの発現を測定すれば、眼に見えない小さいサイズの癌や体内深部の癌も検出することができるため、健康診断等における癌の早期発見にも有用である。また、癌治療後の患者の経過観察に本発明の方法を利用すれば、再発した癌を早期に検出することもできる。さらに、本発明の方法によれば、腫瘍の増大や周辺組織への浸潤、リンパ節及び遠隔臓器への癌の転移といった、癌の進行度の診断も可能である。
CD179bタンパクをコードする遺伝子の、正常組織および腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；CD179bタンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるGAPDH遺伝子の発現パターンを示す。 図２中、横軸の参照番号３、４、５、６、７、８、９、１０は、それぞれ配列番号１０８、１０９、１１０、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７のペプチドをパルスしたＴ２細胞からの刺激によるHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のIFN-γ産生能を示す。参照番号１１は、配列番号１１８の陰性コントロールのペプチド（本発明の範囲外の配列であるペプチド）についての結果を示す。 図３中、横軸の参照番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９は、それぞれ配列番号１０８、１０９、１１０、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７を用いて刺激したHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号２０は陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。 図４中、横軸の参照番号２１、２２、２３、２４、２５は、それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドをパルスしたＪＴＫ－ＬＣＬ細胞からの刺激によるHLA-A24陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のIFN-γ産生能を示す。参照番号２６は、配列番号１１８の陰性コントロールのペプチドについての結果を示す。 図５中、横軸の参照番号２７、２８、２９、３０、３１は、それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドを用いて刺激したHLA-A24陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＪＴＫ－ＬＣＬ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号３２は陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
　＜ポリペプチド＞
　本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下(a)、(b)及び(c)のポリペプチド類から選択される1もしくは複数のポリペプチドが挙げられる。
(a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上のアミノ酸からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有する、かつ７個以上のアミノ酸からなる、免疫誘導活性を有するポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含む、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
　本明細書において使用される「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長分子も包含され、本発明では、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５の全長からなるタンパク質も包含される。
　本明細書において使用される「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基が特定の順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号３に示されるLeu Leu Arg Pro ・・(中略)・・ Ala Glu Cys Serのアミノ酸配列を持つ、１７６アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号３のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。
　本明細書で使用される「免疫誘導活性」とは、生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。
　上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポット(ELISPOT)アッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、例えば後述の実施例に記載されるように、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドを投与した生体から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのIFN-γ、インターロイキン(IL)などのサイトカイン及び/又はケモカインの産生量を特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。
　あるいは、後述の実施例に記載されるように、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のアミノ酸配列を基に作製した組換えポリペプチドを担癌動物に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を縮小又は退縮させることもできる。よって、上記免疫誘導活性は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のポリペプチドを発現する癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば後述の実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌動物に投与して腫瘍が縮小又は退縮されるか否かを調べることよって確認することができる。
　あるいは、上記ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばInt.J.Cancer,58:p317,1994に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。
　上記ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。
　本発明が開示する配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５にそれぞれ示されるアミノ酸配列は、イヌ乳腺癌由来cDNAライブラリーと同一患犬の血清を用いたSEREX法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチド、および該ポリペプチドのヒト相同因子（ホモログ）として単離された、CD179bのアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。上記(a)のポリペプチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸からなる、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチドである。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
　癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７～３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記(a)のポリペプチドとしては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５で示されるアミノ酸配列中の連続する７～３０程度であることが好ましい態様のひとつであり、より好ましくは８～３０もしくは９～３０程度のアミノ酸からなるものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。
　また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５の全長領域のポリペプチドとしてもよい。
　さらに、本発明のポリペプチドは、HLAの各型の結合モチーフを有する８～１２個、好ましくは９～１０個のアミノ酸からなるエピトープペプチドを検索しうる照合媒体、例えばBioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS)のHLA Peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)によって照合し、エピトープペプチドとなりうるペプチドをスクリーニングすることができる。具体的には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５で示されるアミノ酸配列中のaa1-34又はaa52-75の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチドが好ましく、さらに配列番号３のポリペプチドにおいては、配列番号１０８～１１７で示されるポリペプチドがより好ましい。
　上記(b)のポリペプチドは、上記(a)のポリペプチドのうちの少数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、９９％以上、又は99.5％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性又は免疫原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記(b)のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記(b)のポリペプチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５で示されるアミノ酸配列のうち、１個ないし数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたポリペプチドであることも好ましい。
　本明細書中、アミノ酸配列又は塩基配列に関する「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率(%)で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる(Karlin及びAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268, 1993; Altschulら, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997)。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数（又は全塩基数）は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基（又は塩基）として数えた残基数（又は塩基数）となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数（又は全塩基数）が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で、一致したアミノ酸残基数（又は塩基数）を除して算出される。
　アミノ酸残基の置換において、好ましい置換は保存的アミノ酸置換である。天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp, His)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換、すなわち保存的置換、であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明の上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。
　上記(c)のポリペプチドは、上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含み、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、上記(a)又は(b)のポリペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる
　上記のポリペプチドは、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
　上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号４の塩基配列を有するDNAは、イヌ染色体DNA又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号４に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。配列番号１の塩基配列を有するDNAであれば、上記鋳型としてヒト染色体DNA又はcDNAライブラリーを使用することで同様に調製できる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。PCRの手法、条件等については、例えばAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons（特に第15章）に記載されている。また、本明細書中の配列表の配列番号１～９５に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒト、イヌやウシなどのcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のDNAを単離することができる。cDNAライブラリーは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, 第２版, Current Protocols in Molecular Biology (1989年)、Ausubelら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたDNAから、上記(a)のポリペプチドをコードするDNAを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した(b)のポリペプチドや(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。
　上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞COS 1、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293、マウス胎仔皮膚細胞株NIH3T3、等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするDNAをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、上記DNAがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)など）との融合タンパク質として発現させることもできる。
　宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（A）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするDNAをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、上記DNAがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてpIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等を用いた場合には、Hisタグ（例えば(His)6～(His)10）、FLAGタグ、mycタグ、HAタグ、GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
　発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション等の周知の方法を用いることができる。
　宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン－S－トランスフェラーゼ（GST）やHisタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記 (c)のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
　＜免疫誘導剤＞
　後述の実施例に具体的に記載される通り、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌動物に投与すると、既に生じている腫瘍を縮小又は退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療用及び／又は予防用として用いることができる。
　本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
　この場合、対象となる癌としては、CD179b遺伝子を発現している癌、例えば配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくは、乳癌、白血病及びリンパ腫である。これらの特定の癌には、例えば、乳癌（乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌等）、白血病（慢性型リンパ球性白血病等）、リンパ腫（消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小～中細胞型リンパ腫等）等が包含されるが、これらに限定されない。
　上記のポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を免疫誘導のための治療方法として用いることができる。また動物の癌の治療及び／又は予防を目的とした治療方法としても用いることができ、免疫増強剤をさらに含む治療方法としても用いることができる。
　また、対象となる動物は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、ヒト、イヌおよびネコが好ましい。
　本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、後述の実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよいし、また、動物の体重、性別（雄又は雌）、症状などに応じて変化させうる。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として0.0001μｇ～1000μｇ、好ましくは0.001μｇ～1000μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。
　後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を縮小又は退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。
　本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
　本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。
　ここで、患者は、動物、特に哺乳動物であり、好ましくはヒト、イヌ及びネコである。
　上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ－２１サポニン；ＰＣＴ出願WO96/33739（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８およびＱＳ－Ｌ１（Soら、Molecules and Cells、1997、第7巻、p.178-186）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、Kreigら、Nature、第374巻、p.546-549）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルション、などが挙げられる。なかでも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０～１０：１，好ましくは約１：５～５：１、さらに好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、Goding著, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、第2版、1986年）。ポリペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
　また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγおよびＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。
　＜抗原提示細胞＞
　下記実施例において具体的に記載されるように、本発明で用いられる上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した(a)ないし(c)のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージが例示され、ＭＨＣクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。また、処理剤とは、抗原提示細胞をパルスする薬剤を指し、パルスされた抗原提示細胞は、末梢血リンパ球を刺激する能力をもつことができるので、ワクチンとして使用しうる。
　種々のＭＨＣクラスI分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。
　ＭＨＣクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。
　この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞としては、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10～1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20～500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％CO2を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日～2週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
　上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、10３細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x10４細胞/mlから５x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
　上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。
　上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１～１：１００程度、好ましくは１：５～１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００～１０００万細胞/ml程度、好ましくは１００００～１００万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日～３週間、好ましくは４日～２週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。ここで、「U」は活性単位を表す。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。
　上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
　後述の実施例に記載される通り、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のポリペプチドをコードする遺伝子は、乳癌細胞、白血病細胞およびリンパ腫細胞に特異的に発現している。従って、これらの癌種においては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のポリペプチドが正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。癌細胞内に存在するポリペプチドの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示され、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、上記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防剤として有用である。
　上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記(a)ないし(c)のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
　抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個～10兆個、好ましくは100万個～10億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
　＜遺伝子ワクチン＞
　また、上記(a)ないし(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記の(a)、(b)及び(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。このような、抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。
　遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
　遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg～100mg程度、好ましくは1μg～10mg程度である。
　ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
　その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
　本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、および対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０－４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３－４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。
　in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができるし、あるいは、腫瘍の存在する患部に直接投与することもできる。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）－リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
　なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
　＜癌の検出＞
　本発明の癌を検出する方法として、生体から分離された試料を用いて、本発明で用いられるポリペプチドの発現を測定する。上記試料を用いてポリペプチドの発現を測定する方法としては、試料中に含まれる該ポリペプチドに対する抗体を免疫測定する方法（第１の方法）、試料中に含まれる該ポリペプチド自体を免疫測定する方法（第２の方法）、及び試料中に含まれる該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを測定する方法（第３の方法）が挙げられる。本発明の方法では、これらのいずれの方法でポリペプチドの発現を測定してもよい。なお、本発明において、「測定」という語には、検出、定量及び半定量のいずれもが包含される。
　ここで、CD179bはイヌ乳癌由来cDNAライブラリーと同一患犬の血清を用いたSEREX法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体（癌特異的抗体）と結合するポリペプチドとして同定されたものである（実施例１参照）。すなわち、担癌犬生体ではCD179bに対する抗体が特異的に誘導されている。従って、担癌生体内のCD179bに対する抗体を測定することで、CD179bを発現する癌を検出することもできる（実施例７参照）。また、上記第２の方法により抗原たるCD179bを測定することでも、イヌの癌を検出できる。また、下記実施例に記載される通り、該抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは癌、特に乳癌および白血病細胞において正常組織よりも有意に高発現しているため（実施例１参照）、該ｍＲＮＡを測定することによっても、イヌの癌を検出することができる。なお、前述のように、CD179bは、B細胞の前駆細胞（プレB細胞）の膜表面に発現していることが知られており、従ってプレB細胞が癌化した白血病（プレB細胞性白血病）細胞において発現していることが報告されているが、プレB細胞性白血病細胞以外の白血病細胞および乳癌細胞において発現しているという事実が本発明で初めて見出された。これにより、CD179bの発現を調べることで、プレB細胞性白血病細胞以外の白血病やリンパ腫および乳癌の検出が可能になった。
　上記第１の方法において、試料中に存在し得る上記癌特異的抗体の測定は、該抗体と抗原抗体反応する抗原物質を用いた免疫測定により容易に行うことができる。免疫測定法自体は下記に詳述するとおり周知の常法である。免疫測定の抗原物質として、上記(a)ないし(c)のポリペプチドを用いることができる。また、抗体には交叉反応性があり、実際に免疫原となった抗原物質以外の分子であっても、分子上に免疫原のエピトープと類似した構造が存在すれば、その分子は免疫原に対して誘導された抗体と抗原抗体反応により結合し得る。例えば、アミノ酸配列の相同性が高いポリペプチド同士では、エピトープの構造も類似している場合が多く、その場合には両者は同一の抗原性を示し得る。下記実施例に具体的に記載される通り、配列番号３のヒト由来ポリペプチドは、担癌イヌ体内で誘導された上記抗体と抗原抗体反応する。従って、本発明の第１の方法では、免疫測定の抗原として、いずれの哺乳動物由来の相同因子を用いることもできる。
　通常、タンパク質等のような、複雑な構造をとる分子量の大きい抗原物質の場合、分子上に構造の異なる複数の部位が存在している。従って、生体内では、そのような抗原物質に対し、複数の部位をそれぞれ認識して結合する複数種類の抗体が生産される。すなわち、生体内でタンパク質等の抗原物質に対して生産される抗体は、複数種類の抗体の混合物であるポリクローナル抗体である。なお、本発明において「ポリクローナル抗体」といった場合には、抗原物質を体内に含む生体由来の血清中に存在する抗体であって、該抗原物質に対して該生体内で誘導された抗体を指す。
　試料中の抗体の測定は、上記したポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により容易に行うことができる。免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等がある。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、いずれの方法を用いても上記抗体の免疫測定を行うことができる。特に限定されないが、サンドイッチELISAや凝集法は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないため、本発明の方法における上記抗体の免疫測定方法として好ましく適用することができる。抗体の標識として酵素を用いる場合、酵素としては、ターンオーバー数が大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たす物であれば特段の制限はなく、通常の酵素免疫測定法に用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β―ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース－６－リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3´,5,5´―テトラメチルベンジシンを、また酵素としてはアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトルフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては125Iや3H等の通常ラジオイムノアッセイで用いられている物を使用することができる。蛍光色素としては、フルオロレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられる物を使用することができる。
　なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、抗原として用いる上記ポリペプチドを固相に不動化し、血清等の試料と反応させ、洗浄後、適当な二次抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した二次抗体を測定する。抗原ポリペプチドを固相に不動化することにより、未結合の二次抗体を容易に除去することができるため、本発明の癌の検出方法の態様として好ましい。二次抗体としては、例えば試料がイヌ由来であれば、抗イヌIgG抗体を用いることができる。二次抗体を上記に例示した標識物質で標識しておくことにより、固相に結合した二次抗体を測定することができる。こうして測定した二次抗体量が血清試料中の上記抗体量に相当する。標識物質として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって抗体量を測定できる。標識物質として放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定することができる。
　本発明の第２の方法では、生体から得た試料中に含まれ得る、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチドが測定される。上述した通り、癌患者においては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチド若しくはその相同因子と抗原抗体反応する癌特異的抗体の量が有意に多いが、このことは、癌患者体内において、該癌特異的抗体の抗原たるこれらのポリペプチド又はその相同因子の産生量が有意に多いことを示している。従って、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチド若しくはその相同因子を測定することによっても、上記第１の方法と同様に、生体内の癌を検出することができる。
　試料中のポリペプチドの測定は、周知の免疫測定法により容易に行なうことができる。具体的には、例えば、配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示される配列から成るポリペプチド又はその相同因子と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を作製し、これを用いて免疫測定を行うことにより、試料中に存在し得る配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示される配列から成るポリペプチド又はその相同因子を測定することができる。免疫測定方法自体は、上述した通り周知の常法である。
　ここで、「抗原結合性断片」とは、抗体分子中に含まれるFab断片やF(ab´)2断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナルでもよいが、免疫測定等のためには、再現性が高いモノクローナル抗体が好ましい。ポリペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行うことが出来る。例えば、ポリペプチドをキーホールリンペットヘモシアン（KLH）やカゼイン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより、該ポリペプチドに対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチド又はその相同因子と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて、培養上清から上記タンパク質を対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることが出来る。なお、上記の方法は周知の常法である。
　本発明の第３の方法では、生体から得た試料中に含まれ得る、CD179bをコードするｍＲＮＡが測定される。下記実施例に具体的に示される通り、CD179bをコードするｍＲＮＡは、癌、特に乳癌および白血病細胞において有意に高発現している。従って、試料中の該ｍＲＮＡを測定することによっても、生体内の癌を検出することができる。
　本発明の検出方法では、上記のとおりに測定したポリペプチドの発現量に基づいて、対象生体が癌であるか否か等を判断する。癌の検出は、対象生体におけるポリペプチドの発現を測定するのみでも可能であるが、検出精度を高める観点からは、１ないし複数の健常者試料におけるポリペプチドの発現量（抗体量、ポリペプチド量又はｍＲＮＡ量）を調べて健常者基準値を取得し、対象生体の測定値を該健常者基準値と比較することが好ましい。さらに検出精度を高めたい場合には、癌を罹患していることがわかっている多数の患者から得た試料についてポリペプチド発現量を調べて癌患者基準値を取得し、対象生体の測定値を健常者基準値及び癌患者基準値の双方と比較してもよい。上記基準値は、例えば、各試料におけるポリペプチド発現量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。なお、健常者基準値と癌患者基準値は、予め多数の健常者及び癌患者についてポリペプチド発現量を調べて定めておくことができる。そのため、本発明の方法で基準値との比較を行なう場合には、予め定めた基準値を用いてもよい。
　本発明の検出方法では、他の癌抗原や癌マーカーによる検出を組み合わせて用いてもよい。これにより、癌の検出精度をさらに高めることができる。
　本発明の検出方法によれば、生体内の癌を検出することができる。本発明の方法によれば眼に見えない小さいサイズの腫瘍や体内深部の腫瘍をも検出できるので、癌の早期発見に有用である。また、癌の治療後経過観察中の患者について本発明の検出方法を適用すれば、癌の再発があった場合にその癌を早期に検出することができる。
　また、担癌生体において、本発明で測定対象となる上記所定のポリペプチドを発現する癌細胞の数が増加すればそれだけ、該生体内における該ポリペプチド及びそのｍＲＮＡの蓄積量が増大し、血清中に上記ポリペプチドに対する抗体が多く産生される。一方、癌細胞の数が減少すればそれだけ、生体内の該ポリペプチド及びそのｍＲＮＡの蓄積量が減少し、血清中の上記ポリペプチドに対する抗体が減少する。従って、上記所定のポリペプチドの発現量が多い場合には、腫瘍の増大や癌の転移が生じている、すなわち癌の進行度が進んでいると判断することができる。
　また、下記実施例に示される通り、同一種類の腫瘍において、悪性型では良性型よりも有意に上記抗体量が多い。そのため、上記所定のポリペプチドの発現量が多い場合には、癌の悪性度がより高いと判断することができる。すなわち、本発明の方法によれば、癌の悪性度を検出することもできる。
　さらに、上記所定のポリペプチドの発現量の増減を指標として、癌の治療効果をモニタリングすることもできる。従って、癌の治療中や治療後の個体について、上記ポリペプチドの発現量を観察することで、抗癌剤の治療効果や、腫瘍摘出後の残存腫瘍有無、さらに経過観察でも転移・再発をいち早く知る手がかりが得られる。適切に治療できている場合には、ポリペプチドの発現量は治療前の担癌状態よりも低下するので、その生体に対し行なった（行なっている）治療の効果が良好であると判断することができる。ポリペプチド発現量が上昇又は維持されている場合、あるいは一旦低下した後さらに上昇が見られた場合には、治療効果が不十分と判断することができ、他の治療方法への変更や抗癌剤投与量の変更等、治療方法選択の有用な判断材料となる。
　本発明の癌の検出方法の対象となる癌としては、CD179bを発現している癌（ただし、プレB細胞性のものを除く）であり、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、白血病（好ましくは慢性型リンパ球性白血病、ただしプレB細胞性のものを除く）リンパ腫（好ましくは消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小～中細胞型リンパ腫、中細胞型リンパ腫または多中心型リンパ腫、ただしプレB細胞性のものを除く）などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明の方法の対象となる生体は哺乳動物であり、ヒトやイヌ、ネコが好ましい。
　本発明の方法に供する試料としては、血液、血清、血漿、腹水、胸水などの体液、組織、細胞が挙げられる。特に、上記第１の方法及び第２の方法においては、血清、血漿、腹水及び胸水を好ましく用いることができ、また、ｍＲＮＡを測定する上記第３の方法においては、組織試料及び細胞試料が好ましい。
　第１の方法で免疫測定の抗原として用いられる上記したポリペプチドは、癌検出試薬として提供することができる。該試薬は、上記ポリペプチドのみから成っていてもよく、また、該ポリペプチドの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該試薬は、プレートやメンブレン等の固相に固定化した状態で提供することもできる。
　第２の方法で配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチド又はその相同因子を免疫測定する際に用いられる、該ポリペプチド又はその相同因子と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片も、癌検出試薬として提供することができる。この場合の癌検出試薬も、上記抗体又は抗原結合性断片のみから成るものであってもよく、また、該抗体又は抗原結合性断片の安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該抗体又は抗原結合性断片は、マンガンや鉄等の金属を結合させたものであってもよい。そのような金属結合抗体又は抗原結合性断片を体内に投与すると、抗原タンパク質がより多く存在する部位に該抗体又は抗原結合性断片がより多く集積するので、MRI等によって金属を測定すれば、抗原タンパク質を産生する癌細胞の存在を検出することができる。
　さらにまた、第３の方法でｍＲＮＡの測定に用いられる上記した癌検出用ポリヌクレオチドも、癌検出試薬として提供することができる。この場合に癌検出用試薬も、該ポリヌクレオチドのみから成るものであってもよく、また、該ポリヌクレオチドの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。該試薬中に含まれる該癌検出用ポリヌクレオチドは、好ましくはプライマー又はプローブである。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の具体例に制限されないものとする。
　実施例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
　（１）ｃＤＮＡライブラリの作製
　手術により摘出したイヌの乳腺癌組織から酸－グアニジウム－フェノール－クロロフォルム法（Acid guanidium-Phenol-Chloroform法）により全ＲＮＡを抽出し、Oligotex-dT30 mRNA purification Kit（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ  ＲＮＡを精製した。
　この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ乳腺癌由来ｃＤＮＡファージライブラリを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリの作製にはcDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit（STRATAGENE社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリのサイズは２．９９×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。
　（２）血清によるｃＤＮＡライブラリのスクリーニング
　上記作製したイヌ乳腺癌由来ｃＤＮＡファージライブラリを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２３４０クローンとなるように宿主大腸菌（XL1-Blue MRF´）に感染させ、４２℃、３～４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－D－チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（10mM Tris-HCl,150mM NaCl pH7.5）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２～３時間反応させた。
　上記患犬血清としては、上記乳腺癌を摘出された同一の患犬および他の乳腺癌患犬より採取した血清計３検体をそれぞれ用いた。これらの血清は－８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ZAP Express ファージを宿主大腸菌（XL1-BLue MRF´）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで0.5M NaClを含む0.2M NaHCO3 pH8.3のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をNHS-カラム (GE Healthecare Bio-Science社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌およびファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。
　かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ－Ｔ（0.05% Tween20/TBS）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories社製）を、室温1時間反応させ、NBT/BCIP反応液（Roche社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５mmのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris-HCl、0.01% ゼラチン pH7.5）５００μlに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する９２８２０個のファージクローンをスクリーニングして、４５個の陽性クローンを単離した。
　（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
　上記方法により単離した４５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（XL1-Blue MRF´）を吸光度OD600が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液２５０μlさらにExAssist helper phage (STRATAGENE社製)１μlを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５～３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（SOLR）を吸光度OD600が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１０μlを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたSOLRのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、QIAGEN plasmid Miniprep Kit(キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
　精製したプラスミドは、配列番号９６に記載のＴ３プライマーと配列番号９７に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号４～９２の偶数番号に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列（配列番号５～９３の奇数番号）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた４５個全ての遺伝子がCD179bをコードする遺伝子であることが判明した。４５個の遺伝子間の相同性は、塩基配列９４～９９％、アミノ酸配列９６～９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との相同性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列６２～８２％、アミノ酸配列６９～８０％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２及び３に示す。また、この遺伝子のウシ相同因子をコードする遺伝子との相同性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列６８～８２％、アミノ酸配列５６－７７％であった。ウシ相同因子の塩基配列を配列番号９４に、アミノ酸配列を配列番号９５に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウシ相同因子をコードする遺伝子との相同性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列６２％、アミノ酸配列７２％であった。
　（４）各組織での発現解析
　上記方法により得られた遺伝子に対しイヌおよびヒトの正常組織および各種細胞株における発現をRT-PCR(Reverse Transcription-PCR)法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０～１００ｍｇおよび各細胞株５～１０×１０６個の細胞からTRIZOL試薬（invitrogen社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてSuperscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR（invitrogen社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃDNAは、ジーンプールｃDNA（invitrogen社製）、QUICK-Clone cDNA（クロンテック社製）およびLarge-Insert cDNA Library（クロンテック社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得したイヌ遺伝子に特異的なプライマー（配列番号９８および９９に記載）及びそのヒト相同遺伝子に特異的なプライマー（配列番号１００および１０１に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル0.25μl、上記プライマーを各2μM、0.2mM各dNTP、0.65UのExTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Thermal Cycler(BIO RAD社製）を用いて、９４℃～３０秒、６０℃～３０秒、７２℃～３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記した配列番号９８及び９９に示す塩基配列を有する遺伝子特異的プライマーは、配列番号４の塩基配列中の３２番～３４１番を増幅するものであり、配列番号４～９２の偶数番号に示されるイヌCD179ｂ遺伝子全てに共通の領域を増幅するものであった。また、配列番号１００及び１０１に示す塩基配列を有する遺伝子特異的プライマーは配列番号１の塩基配列中の２１６番～７３８番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、GAPDH特異的なプライマー（配列番号１０２および１０３に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、取得したイヌ遺伝子は、健常なイヌ組織では全く発現が見られず、一方イヌ乳癌組織で強い発現が見られた。ヒト相同遺伝子の発現では、ヒト正常組織で発現が確認できたのは骨髄のみで、ヒト癌細胞では白血病細胞株および乳癌細胞株で発現が検出され、CD179bが白血病細胞株と乳癌細胞株に特異的に発現していることが確認された。
　なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるGAPDH遺伝子の発現パターンを示す。
　実施例２：イヌおよびヒト新規癌抗原タンパクの作製
　（１）組換えタンパク質の作製
　実施例１で取得した配列番号４の遺伝子を基に、以下の方法にて組換えタンパク質を作製した。PCRは、実施例１で得られたファージミド溶液より調製し配列解析に供したベクターを１μl、NdeIおよびKpnI制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１０４および１０５に記載）を各0.4μM、0.2mM dNTP、1.25UのPrimeSTAR HSポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cycler (BIO RAD社製)を用いて、９８℃～１０秒、６８℃～４０秒のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記2種類のプライマーは、配列番号５のアミノ酸配列５番～１２０番アミノ酸をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを２％アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
　精製したDNA断片をクローニングベクターpCR-Blunt（invitrogen社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをNdeIおよびKpnI制限酵素で処理し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製後、目的遺伝子配列を、NdeI、KpnI制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターpET30b（Novagen社製）に挿入した。このベクターの使用によりHisタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。
　また、配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてヒト相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。PCRは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃDNAよりRT-PCR法による発現が確認できたｃDNAを１μl、EcoRIおよびSalＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１０６および１０７に記載）を各０．４μＭ, 0.2mM dNTP，１．２５ＵのPrimeSTAR HSポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cycler (BIO RAD社製)を用いて、９８℃～１０秒、６８℃～４０秒のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記2種類のプライマーは、配列番号３のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを２％アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて約５４０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
　精製したDNA断片をクローニングベクターpCR-Blunt（invitrogen社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをEcoRＩおよびSalＩ制限酵素で処理し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製後、目的遺伝子配列を、EcoRＩ、SalＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターpET30a（Novagen社製）に挿入した。このベクターの使用によりHisタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ　ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。
　(２)組換えタンパク質の精製
　上記で得られた、配列番号１および配列番号４を発現するそれぞれの組換え大腸菌を30μg/mL カナマイシン含有LB培地にて600nmでの吸光度が0.7付近になるまで37℃で培養後、イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド終濃度が1 mMとなるよう添加し、30℃で20時間培養した。その後4800rpmで10分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに4800rpmで10分間遠心し菌体の洗浄を行った。
　この菌体をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を7000rpmで20分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。
　不溶性画分を4％Triton-X100溶液にて懸濁し7000rpmで20分間遠心した。本操作を2回繰り返し、脱プロテアーゼ操作を行った。
　この残渣を6Mグアニジン塩酸塩含有20ｍMリン酸緩衝液(pH8.0)に懸濁し、4℃で20時間静置しタンパク質を変性させた。この変性操作後、7000rpmで20分間遠心して得られた可溶性画分を、定法に従って調製したニッケルキレートカラム（担体：Chelateing Sepharose(商標) Fast Flow（GE Health Care社）、カラム容量5mL、平衡化緩衝液：6Mグアニジン塩酸塩含有20mMリン酸緩衝液(pH8.0)）に添加した。未吸着画分をカラム容量の10倍量の6Mグアニジン塩酸塩含有20mMリン酸緩衝液(pH8.0)と10ｍMイミダゾール含有20mMリン酸緩衝液(pH8.0)にて洗浄操作を行った後、直ちに、4段階に分けた50mM-500mMイミダゾール段階的濃度勾配にて溶出を行い精製画分とし、以降この精製画分を投与試験用の材料とした。
　上記方法によって得られた精製標品のうち、200μｌを１ｍｌの反応用緩衝液（20mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 2mM CaCl2 pH7.4）に分注を行った後、エンテロキナーゼ（Novagen社製）2μｌ添加した後、室温にて一晩静置・反応を行い、Hisタグを切断し、Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen社製)を用いて添付プロトコールに従って精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品1.2mlを、限外ろ過NANOSEP 10K OMEGA（PALL社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、HTタフリンアクロディスク0.22μm（PALL社製）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。
　実施例３：組換えタンパク質の担癌患犬に対する投与試験
　（１）抗腫瘍評価
　表皮に腫瘤を持つ担癌患犬（乳癌）に対して、上記で精製した組換えタンパクの抗腫瘍効果の評価を行った。
　上記の通り精製した組換えポリペプチド100μg（0.5ml）に等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬社製）を混合して癌治療剤を調製した。これを初回投与、３日後および７日後に腫瘍近傍の所属リンパ節に計３回投与を行った。その結果、癌治療剤投与時点で、大きさが約５５ｍｍ３であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から１０日後には３０ｍｍ３に、２０日後には１６ｍｍ３に、３０日後には１０ｍｍ３まで縮小した。
　また、別の乳腺癌の患犬に対して、上記イヌ由来ポリペプチド100μg（0.5ml）に、0.5mlの不完全フロイントアジュバントを混合したものを上記と同様にして計３回投与した。また同時にイヌインターロイキン１２を100μgずつ皮下投与した。その結果、癌治療剤投与時点で、大きさが約１５５ｍｍ３であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から２４日後には完全に退縮した。
　（２）免疫誘導能評価
　上記（１）での投与試験で抗腫瘍効果が得られた患犬の血液を、癌治療剤投与前並びに初回投与から１０日後及び３０日後の各時点で採取し、常法に従って末梢血単核球を分離し、それを用いたIFNγのエリスポットアッセイ法により、投与した各組換えタンパクについて免疫誘導能の評価を行った。
　ミリポア社製の96穴プレート（MultiScreen-IP, MAIPS4510）に70%エタノールを100μＬ/穴ずつ添加し、５分間静置し吸引除去後、滅菌水で洗浄し、200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2)を300μＬ/穴添加し５分間静置後、吸引除去しプレートを洗浄した。次に200mM Sodium Bicarbonateに添加した抗イヌインターフェロンγモノクローナル抗体（R&D社製、clone142529, MAB781）を0.5μg/穴ずつ添加し、３７℃で一晩インキュベートし、一次抗体を固相化した。一次抗体を吸引除去後、ブロッキング溶液（1%BSA-5%スクロース-200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2)）を300μＬ/穴ずつ添加し４℃にて一晩インキュベートしてプレートをブロッキングした。ブロッキング溶液を吸引除去後、10%牛胎児血清を含むRPMI培地（Invitrogen社製）を300μＬ/穴ずつ添加して５分間静置し培地を吸引除去した。その後、10%牛胎児血清を含むRPMI培地に懸濁した各々のイヌ末梢血単核球を5x105細胞/穴ずつプレートに添加し、これにそれぞれの投与に用いたイヌ由来ポリペプチドもしくはヒト由来ポリペプチドを10μＬ/穴ずつ添加し、３７℃、5%CO2の条件下で２４時間培養することにより、末梢血単核球中に存在し得る免疫細胞からインターフェロンγを産生させた。培養後、培地を除去し、洗浄液（0.1%Tween20-200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2)）を用いてウエルを６回洗浄した。上記ブロッキング溶液にて1000倍に希釈したラビット抗イヌポリクローナル抗体をそれぞれのウエルに100μＬずつ添加し４℃にて一晩インキュベートした。上記洗浄液で３回ウエルを洗浄した後、上記ブロッキング溶液にて1000倍に希釈したHRP標識抗ラビット抗体をそれぞれのウエルに100μＬずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。上記洗浄液で３回ウエルを洗浄した後、コニカイムノステイン（コニカ社製）にて発色させ、ウエルを水洗して反応を停止させた。反応停止後、メンブレンを乾燥させ、KSエリスポット（カールツァイツ社製）を用いて出現したスポット数をカウントした。その結果、ポリペプチド投与前の末梢血単核球ではスポットが検出されなかった。一方、ポリペプチドを投与後の患犬においては、投与１０日後および３０日後の末梢血単核球でそれぞれ１８個、８７個のスポットが検出された。
　以上の結果から、投与患犬におい、投与した組換えタンパクに特異的に反応してインターフェロンγを産生する免疫細胞が誘導されていることが確認でき、これらの免疫細胞を中心とした免疫反応により、上記（１）に示す抗腫瘍効果が発揮されたものと考えられる。
　実施例４：CD179b由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
　（１）HLA-A0201とHLA-A24に結合するペプチドモチーフの予測
　ヒトCD179bタンパク質のアミノ酸配列の情報をGenBankから得た。HLA-A0201とHLA-A24結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトCD179bタンパク質のアミノ酸配列を解析し、HLA-A0201分子に結合可能と予想される配列番号１０８から配列番号１１０と配列番号１１３から配列番号１１７に示すペプチド８種類と、HLA-A24分子に結合可能と予想される配列番号１１０から配列番号１１２及び配列番号１１５と配列番号１１６に示すペプチド５種類を選択した。
　（２）ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
　HLA-A0201陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して1,500rpmで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ－Ｖ培地（Life Technololgies社製）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon社製）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。
　付着細胞をＡＩＭ－Ｖ培地中でＩＬ－４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ－４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－６（１０００Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）、ＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したＡＩＭ－Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。
　調製した樹状細胞をＡＩＭ－Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、上記（１）にて選択したHLA-A0201分子に結合可能と予想される配列番号１０８から配列番号１１０、配列番号１１３から配列番号１１７に示すペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ－Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ－６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ－Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ－７（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ－Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４～６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。
　HLA-A24分子に結合可能と予想される配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６に示すペプチドについても、HLA-A24陽性の健常人の末梢血から誘導した樹状細胞とＴ細胞集団を用いて上記と同様の方法にて、ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を試みた。
　なお、陰性コントロールとして、本発明の範囲外の配列であるペプチド（配列番号１１８）を使用した。
　実施例５：HLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するCD179b由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
　（１）IFN-γ産生能
　上記で誘導したＴ細胞の内、増殖が見られたＴ細胞それぞれについて、ペプチドエピトープに対する特異性を調べるために、各ペプチドを用いてパルスした、HLA-A0201分子を発現するＴ２細胞（Salter RD et al.,Immunogenetics, 21:235-246(1985)、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ－Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、５×１０３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ－Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、IFN-γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号１０８から配列番号１１０又は配列番号１１３から配列番号１１７のペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において、IFN-γ産生が確認された（図２）。この結果から、上記ペプチドは特異的にHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、IFN-γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。
　なお、図２中、横軸の参照番号３、４、５、６、７、８、９、１０は、それぞれ配列番号１０８、１０９、１１０、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７のペプチドをパルスしたＴ２細胞からの刺激によるHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のIFN-γ産生能を示す。参照番号１１は、配列番号１１８の陰性コントロールのペプチドについての結果を示す。
　（２）細胞障害性評価
　次に、本発明で用いられる配列番号１０８から配列番号１１０および配列番号１１３から配列番号１１７のペプチドが、HLA-A0201陽性でCD179bを発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がHLA-A0201陽性でCD179bを発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。CD179bの発現が確認されているＢ細胞白血病細胞株、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣより購入）を１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ウシ胎児血清（キブコ社製）を含むＲＰＭＩ培地（キブコ社製）で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加し、さらにこれに後１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で懸濁された５×１０４個の各ペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のペプチドエピトープ反応性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、各ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞障害活性を有することが判明した（図３）。陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、細胞障害活性を示さなかった。従って、本発明で用いられる各ペプチド（配列番号１０８から配列番号１１０ならびに配列番号１１３から配列番号１１７）は、HLA-A0201陽性でCD179bを発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。
　なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられる各ペプチドで刺激誘導されたＣＤ８陽性Ｔ細胞１０５個とクロミウム５１を取り込ませた１０３個のＢ細胞白血病株Ｎａｍａｌｗａとを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出したＣＤ８陽性Ｔ細胞のＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞障害活性を示した結果である。
　＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＤ８陽性Ｔ細胞を加えた際のＮａｍａｌｗａ細胞からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。
　なお、図３中、横軸の参照番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９は、それぞれ配列番号１０８、１０９、１１０、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７を用いて刺激したHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号２０は陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
　実施例６：HLA-A24陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するCD179b由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
　（１）IFN-γ産生能
　実施例５（１）と同様に、実施例３（２）で誘導したペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞について、ペプチドエピトープに対する特異性を調べるために、配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドを用いてパルスした、HLA-A24分子を発現するＪＴＫ－ＬＣＬ細胞（理化学研究所より購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ－Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、５×１０３個の上記Ｔ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ－Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、IFN-γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＪＴＫ－ＬＣＬ細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドをパルスしたＪＴＫ－ＬＣＬ細胞を用いた穴の培養上清において、IFN-γ産生が確認された（図４）。この結果から、上記ペプチドは特異的にHLA-A24陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、IFN-γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。
　なお、図４中、横軸の参照番号２１、２２、２３、２４、２５は、それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドをパルスしたＪＴＫ－ＬＣＬ細胞からの刺激によるHLA-A24陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のIFN-γ産生能を示す。参照番号２６は、配列番号１１８の陰性コントロールのペプチドについての結果を示す。
　（２）細胞障害性評価
　次に、本発明で用いられる配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドが、HLA-A24陽性でCD179bを発現する細胞上のHLA-A24分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がHLA-A24陽性でCD179bを発現する細胞を障害することができるかを実施例５（２）と同様の方法で検討した。HLA-A24陽性でCD179bを発現するＪＴＫ－ＬＣＬ細胞を１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個づつ添加し、さらにこれに１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で懸濁された５×１０４個の各ペプチドで刺激されたHLA-A24陽性のペプチドエピトープ反応性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、各ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたHLA-A24陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＪＴＫ－ＬＣＬ細胞に対する細胞障害活性を有することが判明した（図５）。従って、本実施例で用いられた各ペプチド（配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６）は、HLA-A24陽性でCD179bを発現する細胞上のHLA-A24分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、細胞障害性を示さなかった。
　なお、図５中、横軸の参照番号２７、２８、２９、３０、３１は、それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドを用いて刺激したHLA-A24陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＪＴＫ－ＬＣＬ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号３２は陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
　実施例７：組換えタンパク質を用いた癌検出
　（１）イヌの癌検出
　悪性腫瘍の確認された患犬153頭と健常犬264頭の血液を採取し、血清を分離した。実施例２で作製したイヌ由来癌抗原タンパク（配列番号５のアミノ酸配列中：５番～１２０番）と抗イヌIgG抗体を用いてELISA法にて該ポリペプチドに特異的に反応する血清中のIgG抗体価を測定した。
　作製したポリペプチドの固相化は、リン酸緩衝化生理食塩水にて100μg/mLに希釈した組換えタンパク質溶液を96穴イモビライザーアミノプレート（ヌンク社製）に100μL/well添加し、4℃で一晩静置して行った。ブロッキングは、ブロックエース粉末（ＤＳファ－マバイオメディカル株式会社製）４ｇを精製水１００ｍｌに溶解した溶液を精製水で４倍希釈したもの（以下ブロッキング溶液）を100μL/well加え、室温で1時間振とうした。希釈にブロッキング溶液を用いた1000倍希釈血清を100μL/well添加し、室温で3時間振とうして反応させた。0.05%Tween20（和光純薬工業社製）含有リン酸緩衝化生理食塩水（以下PBS-T）で3回洗浄し、ブロッキング溶液にて3000倍希釈したHRP修飾イヌIgG抗体(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated:BETHYL Laboratories社製)を100μL/well加え、室温で1時間振とうして反応させた。PBS-Tで３回洗浄し、HRP基質 TMB（1-Step　Turbo　TMB（テトラメチルベンジジン）、PIERCE社）を100μl/well添加し、室温で30分間酵素基質反応させた。その後、0.5M硫酸溶液（シグマアルドリッチジャパン社製）を100μl/well加えて反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度測定を行った。コントロールとしては、作製した組換えタンパク質を固相化しないもの、担癌犬血清を反応させないものを上記と同様に行い比較することとした。
　上記癌検出に用いた癌種として、病理診断で悪性と確定診断がされている、乳癌112検体、リンパ腫31検体および白血病10検体を用いた。
　これら担癌犬生体由来の血清は、有意に高い組換えタンパク質に対する抗体価を示した。本検出法による悪性判断を健常犬平均値の２倍以上とした場合、乳癌で61検体(54%)で、リンパ腫で21検体(71%)で、白血病で7検体(70%)でそれぞれ悪性と判断できることが判った。また、病理診断で良性と確定診断がされている、乳腺腫瘍患犬30頭の血清を用いて同様に検査したところ、健常犬平均値の２倍以上の値が検出された検体数は0であった。
　同様にして、実施例２で作製したヒト由来癌抗原タンパク（配列番号３のアミノ酸配列）と抗イヌIgG抗体を用いてELISA法にて、上記各担癌犬血清サンプル中の該ポリペプチドに特異的に反応するIgG抗体価を測定したところ、乳癌で56検体(50%)で、リンパ腫で18検体(58%)で、白血病で5検体(50%)でそれぞれ悪性と判断できることが判った。
　また、末期癌患犬より採取した胸水、腹水を用いて、上記と同様の検出を行った結果、血清を用いた本検出法による結果と同様の値を検出することができ、癌と診断することができた。
　（２）ヒトの癌検出
　上記で用いたヒト由来癌抗原タンパク（配列番号３のアミノ酸配列）と抗ヒトIgG抗体を用いて、上記と同様にして、該ポリペプチドに特異的に反応する健常人血清中のIgG抗体価を測定した。2次抗体は、HRP修飾抗ヒトIgG抗体(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: Zymed Laboratories社製)をブロッキング溶液にて10000倍希釈して用いた。ポジティブコントロールとしてリン酸緩衝化生理食塩水にて50μg/mlに調製した卵白アルブミン抗原を固相化したものを用いた。その結果、450nmでの吸光度は、卵白アルブミン抗原に対して健常人７人の平均で0.45と高い値を示した。一方、上記ポリペプチドに対しては0と全く検出されなかった。
　さらに、上記と同様にして、悪性乳癌を患っている患者由来の血清17検体（Promeddx社から購入）に対して、上記と同様にしてヒト由来癌抗原タンパク（配列番号３のアミノ酸配列）に特異的に反応する血清中のIgG抗体価を測定した。その結果、450nmでの吸光度は、上記ポリペプチドに対して乳癌患者１７人の平均で0.28と高い値を示した。従って、ヒトにおいても、本手法によって癌を検出できることが判った。
　本発明は、乳癌、白血病、リンパ腫などの癌（腫瘍）に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤を提供するため、癌の治療に有用である。また、本発明は新規な癌の検出手段を提供するため、癌の診断に有用である。

Claims (19)

  1. 　以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
    (a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
    (b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
    (c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
  2. 　前記(b)のポリペプチドが、前記(a)のポリペプチドと９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１記載の免疫誘導剤。
  3. 　前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、請求項１記載の免疫誘導剤。
  4. 　前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３記載の免疫誘導剤。
  5. 　前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中のaa1-34又はaa52-75の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである請求項３記載の免疫誘導剤。
  6. 　前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６又は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列表の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６又は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を部分配列として含み、アミノ酸残基数が８～１２であるポリペプチドである、請求項５記載の免疫誘導剤。
  7. 　１又は複数の前記ポリペプチドを有効成分として含有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  8. 　前記ポリペプチドが抗原提示細胞の処理剤である、請求項７記載の免疫誘導剤。
  9. 　動物の癌の治療用及び／又は予防用である、請求項１～８のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  10. 　前記癌が、CD179ｂ遺伝子を発現する癌である、請求項９に記載の免疫誘導剤。
  11. 　前記癌が乳癌、白血病又はリンパ腫である、請求項１０記載の免疫誘導剤。
  12. 　免疫増強剤をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  13. 　前記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。
  14. 　前記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。
  15. 　以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを個体に投与することを含む、免疫誘導方法。
    (a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
    (b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
    (c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
  16. 　生体から分離された試料に対して行う方法であって、以下の(a)ないし(c)の少なくともいずれか１つのポリペプチドの発現を測定することを含む、癌の検出方法。
    (a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドに対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する、生体内で生産されるポリペプチド
    (b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドに対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する、生体内で生産されるポリペプチド
    (c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドに対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する、生体内で生産されるポリペプチド
  17. 　前記ポリペプチドの発現の測定は、前記試料に含まれ得る、測定すべき前記ポリペプチドに対し前記生体内で誘導された抗体を免疫測定することにより行われる請求項１６に記載の方法。
  18. 　生体から分離された試料に対して行う方法であって、癌患者由来の試料中の配列表の配列番号１または配列番号４～９４のうち偶数の配列番号に示される塩基配列を有するコード領域を有するCD179b遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法。
  19. 　以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドに対して生体内で誘導される抗体と抗原抗体反応するポリペプチドを含む癌検出用試薬。
    (a)配列表の配列番号３～９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
    (b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
    (c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
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