JP2004501624A - Pd−l2分子:新規pd−1リガンドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、PD−L2核酸分子と命名された単離核酸分子を提供し、該分子は、PD−1リガンドである新規B7関連分子をコードする。また本発明は、アンチセンス核酸分子、PD−L2核酸分子を含有する組換え発現ベクター、該発現ベクターが導入されている宿主細胞、ならびにPD−L2遺伝子が導入または破壊されている非ヒトトランスジェニック動物も提供する。さらに本発明は、単離PD−L2ポリペプチド、融合蛋白、抗原性ペプチドならびに抗−PD−L2抗体を提供する。さらに本発明は、PD−L2とPD−1との間の相互作用を促進または阻害する方法を提供する。本発明の組成物を用いる診断および治療方法も提供される。
Description
【0001】
関連出願
本願は、2000年6月28日出願の米国仮出願第60/214563号、2001年2月23日出願の米国仮出願第60/270822号、2001年2月23日出願の米国仮出願第60/271114号に対して優先権を主張するものである。これらの各出願の全内容をこの参照により本明細書に一体化させる。
【0002】
政府の資金援助
本明細書に記載された研究は、National Institute of Healthにより与えられたAI39671、CA84500、AI41584、AI38310およびAI40614の下で援助された。
【0003】
発明の背景
T細胞が外来ポリペプチドに応答するためには、抗原提示細胞(APCs)により休止Tリンパ球に2つのシグナルが提供されなくてはならない(Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302−319; Mueller, D.L. et al. (1990) J. Immunol. 144:3701−3709)。最初のシグナルは免疫応答に特異性を付与するものであり、主要組織適合抗原系において提示された外来抗原の認識後にT細胞受容体を介して伝達される。次のシグナルは同時刺激と呼ばれるものであり、T細胞が増殖し、機能的となることを誘導する(Lenschow et al. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233)。同時刺激は抗原特異的でもなく、MHCにより制限されず、APCsにより発現される1またはそれ以上の異なる表面分子により提供されると考えられている(Jenkins, M.K. et al. (1988) J. Immunol. 140:3324−3330; Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721−730; Gimmi, C.D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575−6579; Young, J.W. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:229−237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:759−762; Reiser, H. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:271−275; van−Seventer, G.A. et al. (1990) J. Immunol. 144:4579−4586; LaSalle, J.M. et al. (1991) J. Immunol. 147:774−80; Dustin, M.I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:503; Armitage, R.J. et al. (1992) Nature 357:80−82; Liu, Y. et al. (1992) J. Exp. Med. 175:437−445)。
【0004】
APCs上に発現されるCD80(B7−1)およびCD86(B7−2)蛋白は重要な同時刺激分子である(Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143:2714; Azuma et al. (1993) Nature 366:76; Freeman et al. (1993) Science 262:909)。B7−2は一次免疫応答において主な役割を果たしていると思われ、B7−1は免疫応答の後期にアップレギュレーションされるものであり、一次T細胞応答の延長あるいは二次T細胞応答の同時刺激に重要である可能性がある(Bluestone (1995) Immunity 2:555)。
【0005】
B7−1およびB7−2が結合する1のリガンドであるCD28は休止T細胞上に構成的に発現され、活性化後の発現において増加する。T細胞受容体を介するシグナリング後、CD28と同時シグナルの伝達との連結により、T細胞の増殖およびIL−2分泌が誘導される(Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721−730; Gimmi, C.D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575−6579; June, C.H. et al. (1990) Immunol. Today 11:211−6; Harding, F.A. et al. (1992) Nature 356:607−609)。CTLA4(CD152)と呼ばれる第2のリガンドはCD28と相同的であるが、休止T細胞上には発現されず、T細胞活性化後に出現する(Brunet, J.F. et al. (1987) Nature 328:267−270)。CTLA4はT細胞応答の負の調節に重要であると思われている(Waterhouse et al. (1995) Science 270:985)。CTLA4のブロックは阻害シグナルを除去することがわかっているが、CTLA4の凝集は、T細胞応答をダウンレギュレーションする阻害シグナルを提供することがわかっている(Allison and Krummel (1995) Science 270:932)。B7分子はCD28よりもCTLA4に対して高いアフィニティーを有し(Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561−569)、B7−1およびB7−2はCTLA4分子の異なる領域に結合し、CTLA4への結合に関して異なるキネティクスを有することがわかっている(Linsley et al. (1994) Immunity 1:793)。CD28およびCTLA4に関連している新たな分子ICOSが、そのリガンドを有するものとして同定されており(Hutloff et al. (1999) Nature 397:263; WO 98/38216)、ICOSはB7ファミリーの新たなメンバーである(Aicher A. et al. (2000) J. Immunol. 164:4689−96; Mages H.W. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:1040−7; Brodie D. et al. (2000) Curr. Biol. 10:333−6; Ling V. et al. (2000) J. Immunol. 164:1653−7; Yoshinaga S.K. et al. (1999) Nature 402:827−32)。T細胞が、さらなる同時刺激シグナルを受け取ることなくT細胞受容体を介して刺激されるだけならば、それらは無応答性で、アネルギー性となり、あるいは死滅して免疫応答のダウンレギュレーションを引き起こすようになる。
【0006】
免疫細胞は活性化シグナルを伝達する受容体を有している。例えば、T細胞はT細胞受容体およびCD3複合体を有し、B細胞はB細胞受容体を有し、ミエロイド細胞はFc受容体を有している。さらに、免疫細胞は、同時刺激シグナルを提供するシグナルを伝達する受容体あるいは受容体により媒介されるシグナリングを阻害するシグナルを伝達する受容体を有している。例えば、CD28は同時刺激シグナルをT細胞に伝達する。T細胞受容体の連結後、CD28の連結は、例えば、IL−2rα、IL−2rβおよびIL−2rγ受容体のアップレギュレーション、IL−2メッセンジャーRNA転写増加、ならびにサイトカイン(IL−2、IFN−γ、GM−CSFおよびTNF−αを包含)遺伝子発現増加により特徴づけられる同時刺激シグナルを生じさせる。同時刺激シグナルの伝達により、細胞が細胞周期を経るようになり、かくして、T細胞増殖が増大する(Greenfield et al. (1998) Crit. Rev. Immunol. 18:389)。同時刺激シグナルを細胞に伝達するT細胞上の受容体の同時刺激リガンドによる結合(例えば、サイトカイン分泌および/またはT細胞増殖を誘導する同時刺激受容体の連結)は同時刺激を引き起こす。かくして、同時刺激リガンドと同時刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体との間の相互作用の阻害は、免疫応答のダウンレギュレーションおよび/または免疫細胞アネルギーと呼ばれる特異的無応答を引き起こす。例えば、抗−CD28 Fabフラグメント、B7ファミリー分子に対する抗体を用いて、あるいはB7ファミリーのメンバーの分子が競争的阻害剤として結合しうる可溶性形態の受容体(例えばCTLA4)を用いてこの相互作用の阻害が行なわれうる。
【0007】
同時刺激分子に結合する阻害性受容体も免疫細胞上において同定されている。例えば、CTLA4の活性化はT細胞に負のシグナルを伝達する。CTLA4を用いることはIL−2産生を阻害し、細胞周期停止を誘導しうる(Krummel and Allison (1996) J. Exp. Med. 183:2533)。さらに、CTLA4欠損マウスはリンパ球増殖性の疾病を発症する(Tivol et al. (1995) Immunity 3:541; Waterhouse et al. (1995) Science 270:985)。抗体でのCTLA4のブロックは阻害性シグナルを除去する可能性があり、抗体とのCTLA4の凝集は阻害性シグナルを伝達する。それゆえ、同時刺激分子が結合する受容体に応じて(すなわち、CD28のごとき同時刺激受容体またはCTLA4のごとき阻害性受容体)、B7−4を包含するB7分子はT細胞同時刺激または阻害を促進しうる。
【0008】
PD−1は免疫グロブリン分子のファミリーのメンバーである(Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704)。PD−1は以前、プログラムされた細胞死のモジュレーターを同定するための設計されたアプローチに基づく引き算クローニングを用いて同定された(Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887−95; Woronicz et al. (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 200:137)。PD−1は、リンパ球生存調節、例えば、クローン選択に間において役割を果たしている(Honjo (1992) Science 258:591; Agata et al. (1996) Int. Immunology 8:765; Nishimura et al. (1996) Int. Immunology 8:773)。PD−1は免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、膜貫通ドメインを含む細胞外領域、ならびに免疫受容体チロシンキナーゼに基づく阻害モチーフ(ITIM)を含む細胞内領域を有している(Ishida et al. (1992) supra; Shinohara et al. (1994) supra; US Patent 5,698,520)。この特徴は、免疫阻害性受容体と呼ばれる分子のより大きなファミリーも定義し、該ファミリーはgp49B、PIR−Bおよびキラー阻害性受容体(KIRs)をも包含する(Vivier and Daeron (1997) Immunology Today 18:286)。これらの受容体のチロシルリン酸化ITIMモチーフが、阻害性シグナルを誘導するSH2ドメイン含有ホスファターゼと相互作用すると仮定されることが多い。これらの免疫阻害性受容体の一部のものはMHC分子、例えばKIRsに結合し、CTLA4はB7−1およびB7−2に結合する。MHCとB7遺伝子との間に系統発生的関連性があると提案されている(Henry et al. (1999) Immunology Today 20:285−288)。
【0009】
PD1はB細胞応答のレギュレーターとしても関与している(Nishimura (1998) Int. Immunology 10:1563)。T細胞上でのみ見出されるCTLA4とは異なり、PD−1はB細胞(抗−IgMに応答)上ならびに胸腺細胞およびミエロイド細胞の一部のものの上にも見出される(Agata et al. (1996) supra; Nishimura et al. (1996) Int. Immunology 8:773)。
【0010】
B7:CD28/CTLA4同時刺激経路の重要性がインビトロおよびいくつかのインビボモデル系において示されている。この同時刺激経路のブロックは、メズミおよびヒトの系において抗原特異的耐性を発生させる(Harding, F.A. et al. (1992) Nature 356:607−609; Lenschow, D.J. et al. (1992) Science 257:789−792; Turka, L.A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102−11105; Gimmi, C.D. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6586−6590; Boussiotis, V. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1753−1763)。逆に、B7陰性ネズミ腫瘍細胞によるB7の発現は、T細胞により媒介される特異的免疫を生じさせ、それは腫瘍拒絶および腫瘍攻撃に対する長期防御を伴う(Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093−1102; Townsend, S.E. and Allison, J.P. (1993) Science 259:368−370; Baskar, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci 90:5687−5690.)。それゆえ、同時刺激経路を操作することにより、ヒトの免疫応答を刺激または抑制する大きな可能性が得られる。
【0011】
発明の概要
本発明は、少なくとも一部には、本明細書においてPD−L2核酸およびポリヌクレオチド分子と称される新規核酸分子およびかかる核酸分子によりコードされるポリペプチドの発見に基づくものであり、それらはB7ファミリーのメンバーでありPD−1のリガンドである。PD−L2とPD−1との相互作用は負のシグナルを免疫細胞に伝達し、免疫応答をダウンレギュレーションする。好ましいPD−L2分子はプロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、Bリンパ球、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞)および他の抗原提示細胞(例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞およびオリゴデンドロサイト)表面上に発現され、リンパ球活性化をダウンレギュレーションし、そして/あるいはPD−L2分子を認識する抗体により結合されるものである。本発明のPD−L2核酸およびポリペプチド分子は、例えば免疫応答のモジュレーションにおいて有用である。したがって、1の態様において、本発明はPD−L2ポリペプチドをコードする単離核酸分子ならびにPD−L2をコードする核酸の検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適当な核酸フラグメントを提供する。
【0012】
1の具体例において、本発明のPD−L2核酸分子は配列番号:1または3に示すヌクレオチド配列またはその相補配列に対して(例えば、ヌクレオチド配列全長に対して)少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一である。
【0013】
好ましい具体例において、単離核酸分子は配列番号:1または3に示すヌクレオチド配列、あるいはその相補配列を包含する。もう1つの具体例において、核酸分子は配列番号:3に示す核酸配列および配列番号:1のヌクレオチド1〜273を包含する。さらなる具体例において、核酸分子は配列番号:3に示す核酸配列および配列番号:1のヌクレオチド1096〜1223を包含する。もう1つの好ましい具体例において、核酸分子は配列番号:1または3に示すヌクレオチド配列からなる。
【0014】
もう1つの具体例において、PD−L2核酸分子は、配列番号:2のアミノ酸配列に対して十分に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。好ましい具体例において、PD−L2核酸分子は、配列番号:2のアミノ酸配列の全長に対して少なくとも約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。
【0015】
もう1つの好ましい具体例において、単離核酸分子はヒトPD−L2のアミノ酸配列をコードする。さらにもう1つの好ましい具体例において、核酸分子は配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。さらにもう1つの好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも約50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。さらなる好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも約50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、PD−L2活性(本明細書に記載)を有するポリペプチドをコードする。
【0016】
本発明のもう1つの具体例は核酸分子、好ましくはPD−L2核酸分子に関するものであり、それらは非PD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子と比較してPD−L2核酸分子を検出する。例えば、1の具体例において、かかる核酸分子は少なくとも880、900、950、1000、1050、1100、1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。もう1つの具体例において、かかる核酸分子は少なくとも20、30、40、50、100、150、200、250、300ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1のヌクレオチド1〜358を含む核酸分子またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。さらなる具体例において、かかる核酸分子は少なくとも20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、配列番号:1のヌクレオチド1〜358を含む配列の少なくとも15個のヌクレオチドまたはその相補配列を含み、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。
【0017】
好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも約880ヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド分子(すなわち、配列番号:の少なくとも880個の連続したヌクレオチド)またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。他の好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも約15ヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド分子のヌクレオチド1〜358(すなわち、配列番号:1のヌクレオチド1〜358の少なくとも15個の連続したヌクレオチド)またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。さらなる好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも15ヌクレオチドの長さであり、配列番号:1のヌクレオチド1〜358またはその相補配列を含む配列の少なくとも15個(すなわち、連続した15個)のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を含む核酸分子とハイブリダイゼーションする。
【0018】
さらに他の好ましい具体例において、核酸分子は配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種をコードし、該核酸分子は配列番号:1または3を含む核酸分子の相補配列あるいはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする。
【0019】
本発明のもう1つの具体例は、PD−L2核酸分子に対するアンチセンスである、例えば、配列番号:1または3に示すPD−L2核酸分子のコーディング鎖に対してアンチセンスである単離核酸分子を提供する。
【0020】
本発明のもう1つの態様は、PD−L2核酸分子を含むベクターを提供する。ある具体例において、ベクターは組換え発現ベクターである。もう1つの具体例において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。さらにもう1つの具体例において、本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。また本発明は、適当な培地中で宿主細胞、例えば組換え発現ベクターを含む本発明の非ヒト哺乳動物細胞のごとき哺乳動物宿主細胞を培養して、ポリペプチドを得ることによる、ポリペプチド、好ましくはPD−L2ポリペプチドの製造方法を提供する。
【0021】
本発明のもう1つの態様は、単離または組換えPD−L2ポリペプチド(例えば、蛋白、ポリペプチド、ペプチドまたはそれらのフラグメントもしくは部分)に関する。1の具体例において、単離PD−L2ポリペプチドは少なくとも1またはそれ以上の下記ドメインを含む:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0022】
好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドは少なくとも1またはそれ以上の下記ドメインを含み、配列番号:2のアミノ酸配列に対して少なくとも約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。もう1つの好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドは少なくとも1またはそれ以上の下記ドメインを含み、PD−L2活性(本明細書に記載)を有する:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0023】
さらにもう1つの好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドは少なくとも1またはそれ以上の下記ドメインを含み、配列番号:1または3のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0024】
もう1つの具体例において、本発明は、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントまたは部分に関し、フラグメントは配列番号:2のアミノ酸配列の少なくとも15個のアミノ酸(すなわち、連続したアミノ酸)を含む。もう1つの具体例において、PD−L2ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれよりなる。
【0025】
もう1つの具体例において、本発明は、配列番号:1または3のヌクレオチド配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる核酸分子によりコードされるPD−L2ポリペプチドに関する。さらに本発明は、配列番号:1または3のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列からなる核酸分子によりコードされるPD−L2ポリペプチドに関する。
【0026】
本発明のポリペプチドまたはその部分、例えば、その生物学的に活性のある分部を、非PD−L2ポリペプチド(例えば、異種アミノ酸配列)に作動可能に連結して、融合ポリペプチドを得ることができる。さらに本発明は、本発明のポリペプチド、好ましくはPD−L2ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体のごとき抗体に関する。さらに、PD−L2ポリペプチド(またはその生物学的に活性のあるフラグメント)またはPD−L2分子のモジュレーターを、医薬上許容される担体を含んでいてもよい医薬組成物中に含有させることができる。
【0027】
もう1つの態様において、本発明は、生物学的試料をPD−L2核酸分子を検出しうる作用剤と接触させて、生物学的試料中のPD−L2核酸分子、蛋白またはポリペプチドを検出することによる、生物学的試料中のPD−L2核酸分子、蛋白またはポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。
【0028】
もう1つの態様において、本発明は、生物学的試料をPD−L2活性のインジケーターを検出しうる作用剤と接触させて、生物学的試料中のPD−L2活性の存在を検出することによる、生物学的試料中のPD−L2活性の存在を検出する方法を提供する。
【0029】
もう1つの態様において、本発明は、PD−L2を発現しうる細胞をPD−L2活性をモジュレーションする作用剤と接触させて、細胞中のPD−L2活性をモジュレーションすることを特徴とする、PD−L2活性をモジュレーションする方法を提供する。1の具体例において、作用剤はPD−L2活性を阻害する。もう1つの具体例において、作用剤はPD−L2活性を刺激する。さらなる具体例において、作用剤はPD−L2ポリペプチドとその本来の結合パートナー、例えばPD−1との間の相互作用を妨害または促進する。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。1の具体例において、作用剤はPD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体である。さらなる具体例において、作用剤は、PD−L2に特異的に結合する抗体と、PD−L1ポリペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである。もう1つの具体例において、作用剤はPD−L2ポリペプチドに結合するペプチド、ペプチド模倣物、または他の小型分子である。さらにもう1つの具体例において、作用剤は、PD−L2とPD−1との間の相互作用をモジュレーションしうるもう1つのPD−1リガンドである。さらにもう1つの具体例において、作用剤は、PD−L2遺伝子の転写、PD−L2 mRNAの翻訳、あるいはPD−L2ポリペプチドの翻訳後修飾をモジュレーションすることによりPD−L2の発現をモジュレーションする。もう1つの具体例において、作用剤はPD−L2 mRNAまたはPD−L2遺伝子のコーディング鎖に対するアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【0030】
1の具体例において、PD−L2モジュレーターである作用剤を対象に投与することにより、異常な、不十分な、あるいは望ましくないPD−L2ポリペプチドまたは核酸の発現または活性により特徴づけられる疾病または症状を有する対象を治療するために本発明が用いられる。1の具体例において、PD−L2モジュレーターはPD−L2ポリペプチドである。もう1つの具体例において、PD−L2モジュレーターはPD−L2核酸分子である。さらなる具体例において、PD−L2モジュレーターはPD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体である。もう1つの具体例において、PD−L2モジュレーターはPD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体と、PD−L1ポリペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである。さらにもう1つの具体例において、PD−L2モジュレーターはペプチド、ペプチド模倣物、または他の小型分子である。好ましい具体例において、異常な、不十分な、あるいは望ましくないPD−L2ポリペプチドまたは核酸の発現または活性により特徴づけられる疾病または症状は、PD−L2活性のモジュレーションにより恩恵を受けるであろう免疫応答疾患または症状である。もう1つの具体例において、本発明は、免疫応答をモジュレーションするさらなる作用剤を用いて対象を治療することをさらに提供する。
【0031】
さらにもう1つの具体例において、本発明は、抗原と、PD−L2活性を低下あるいは阻害する作用剤とを含むワクチンを提供する。好ましい具体例において、ワクチンはPD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する。より好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。
【0032】
また本発明は、(i)PD−L2ポリペプチドをコードする遺伝子の異常な修飾または変異;(ii)該遺伝子の誤調節;および(iii)PD−L2ポリペプチドの異常な翻訳後修飾により特徴づけられる遺伝学的変化の存在または不存在を同定するための診断アッセイを提供し、ここに該遺伝子の野生型形態はPD−L2活性を有するポリペプチドをコードするものである。
【0033】
本発明のもう1つの態様は、PD−L2活性を有するPD−L2ポリペプチドを含むインジケーター組成物を用意し、インジケーター組成物を試験化合物と接触させ、ついで、インジケーター組成物中のPD−L2活性に対する試験化合物の影響を調べて、PD−L2ポリペプチドの活性をモジュレーションする化合物を同定することによる、PD−L2ポリペプチドに結合し、あるいはその活性をモジュレーションする化合物を同定する方法を提供する。
【0034】
もう1つの態様において、本発明は、PD−1とPD−L2との間の相互作用をモジュレーションすることによる、免疫応答をモジュレーションする方法を提供する。
【0035】
1の態様において、本発明は、PD−L2を発現する抗原提示細胞を、PD−L2の1形態およびPD−1の1形態からなる群より群より選択される作用剤、あるいはPD−L2とその本来の結合パートナーとの相互作用をモジュレーションする作用際と接触させて、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用をモジュレーションすることを特徴とする、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用をモジュレーションする方法に関する。好ましい具体例において、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナー(例えばPD−1)との相互作用をモジュレーションする作用剤は、PD−L2に特異的に結合する抗体である。もう1つの好ましい具体例において、作用剤はPD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体と、PD−L1ポリペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである。
【0036】
1の具体例において、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用がアップレギュレーションされる。もう1つの具体例において、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用がダウンレギュレーションされる。
【0037】
1の具体例において、該方法は、免疫細胞または抗原提示細胞を、免疫応答をモジュレーションするさらなる作用剤と接触させることを特徴とする。
1の具体例において、接触工程がインビトロで行なわれる。もう1つの具体例において、接触工程がインビボで行なわれる。
1の具体例において、免疫細胞はT細胞、B細胞およびミエロイド細胞からなる群より選択される。
1の具体例において、PD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0038】
もう1つの態様において、本発明は、細胞におけるPD−L2の活性または発現を増大させて免疫細胞活性化を阻害することを特徴とする、非アポトーシス機構による免疫細胞における活性化の阻害方法に関する。
【0039】
さらにもう1つの態様において、本発明は、抗原およびPD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する作用剤を含むワクチンに関する。
さらにもう1つの態様において、本発明は、抗原およびPD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を促進する作用剤を含むワクチンに関する。
1の具体例においてPD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0040】
もう1つの態様において、本発明は、免疫応答のアップレギュレーションにより恩恵を受けるであろう症状を有する対象の治療方法に関し、該方法は、PD−L2と対象細胞上のその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する作用剤を投与して、免疫応答のアップレギュレーションにより恩恵を受けるであろう症状を治療することを特徴とする。
【0041】
1の具体例において、作用剤は、PD−L2に結合し、PD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害するブロッキング抗体または小型分子を含む。もう1つの具体例において、作用剤は、PD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体と、PD−L1ポリペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである。
【0042】
もう1つの具体例において、該方法は、免疫応答をアップレギュレーションする第2の作用剤を対象に投与することをさらに特徴とする。
1の具体例において、症状は腫瘍、病原体感染または免疫抑制性疾患からなる群より選択される。
もう1つの具体例において、PD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0043】
1の態様において、本発明は、本発明は、免疫応答のダウンレギュレーションにより恩恵を受けるであろう症状を有する対象の治療方法に関し、該方法は、PD−L2と対象細胞上のその本来の結合パートナーとの間の相互作用を刺激する作用剤を投与して、免疫応答のダウンレギュレーションにより恩恵を受けるであろう症状を治療することを特徴とする。
【0044】
1の具体例において、作用剤は、PD−L2に結合し、PD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を刺激するブロッキング抗体または小型分子を含む。
【0045】
もう1つの具体例において、該方法は、免疫応答をダウンレギュレーションする第2の作用剤を対象に投与することをさらに特徴とする。
1の具体例において、症状は移植、アレルギー、および自己免疫疾患からなる群より選択される。
もう1つの具体例において、PD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0046】
もう1つの態様において、本発明は、PD−L2標的分子を発現する細胞を試験化合物と接触させ、ついで、PD−L2標的分子の活性をモジュレーションする試験化合物の能力を調べることを特徴とする、PD−L2の活性をモジュレーションする化合物のスクリーニングのための細胞に基づくアッセイに関する。
【0047】
さらにもう1つの態様において、本発明は、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分を試験化合物と接触させ、ついで、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分への試験化合物の結合能を調べることを特徴とする、PD−L2の標的分子への結合をモジュレーションする化合物のスクリーニングのための無細胞アッセイに関する。
【0048】
もう1つの具体例において、本発明は、PD−L2標的分子を発現するT細胞を第1の抗原濃度において試験化合物と接触させ、第1の濃度においてT細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする試験化合物の能力を調べ、PD−L2標的分子を発現するT細胞を第2の抗原濃度において試験化合物と接触させ、ついで、第2の濃度においてT細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする試験化合物の能力を調べ、そのことにより第1および第2の抗原濃度においてT細胞活性化をモジュレーションする化合物を同定することを特徴とする、第1および第2の抗原濃度においてT細胞活性化をモジュレーションする化合物を同定する方法に関する。
1の具体例において、PD−L2標的分子はPD−1である。
【0049】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【0050】
発明の詳細な説明
すでに特徴付けられているBリンパ球活性化抗原、例えば、B7−1およびBN7−2のほかに、抗原提示細胞(例えば、B細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、およびオリゴデンドロサイト)の表面上に、B細胞、T細胞、および他の免疫細胞の活性化をモジュレーションする他の抗原が存在する。本発明は、少なくとも一部には、本明細書でPD−L2ポリペプチドと称される新規分子の発見にも基づくものであり、該分子はPD−1受容体に結合し、これらの免疫細胞の活性化をダウンレギュレーションし、そして/あるいは免疫応答をダウンレギュレーションする。これらの新規分子は免疫応答のモジュレーションにおいて役割を果たす。
【0051】
PD−L2がPD−1に結合するという今回の知見は、PD−L2を阻害性リガンドのファミリー中に置くものであり、配列の分析はPD−L2をB7ファミリー中に置くものである。同時刺激受容体の使用は免疫細胞中に同時刺激シグナルを生じさせるが、阻害性受容体、例えば、CTLA−4またはPD−1の使用(架橋による、あるいは凝集による)は、免疫細胞において阻害性シグナルの伝達を誘導し、免疫細胞応答のダウンレギュレーションおよび/または細胞アネルギーを生じさせる。免疫細胞における阻害性シグナルの伝達は免疫細胞応答のダウンレギュレーションを導く(そして免疫応答全体をダウンレギュレーションする)が、免疫細胞における阻害性シグナルの妨害(例えば、PD−1に対する非活性化抗体(non−activating antibody)を用いることによる)は、免疫細胞応答のアップモジュレーションを誘導する(そして免疫応答のアップモジュレーションを引き起こす)。
【0052】
PD−L2は、すでに記載されているPD−1に対するリガンドであるPD−L1に対して相同性を有する(同時係属米国出願第09/644,934号; 国際公開WO 01/14557; Dong, H. et al. (1999) Nat. Med. 5:1365−1369; and Freeman, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034参照、参照により各内容を本明細書に一体化させる)。
【0053】
本発明は、PD−L2の活性および/または発現をモジュレーションするのに有用な作用剤;PD−L2とその本来の結合パートナー(例えば、PD−1)との間の相互作用をモジュレーションするための作用剤、ならびにPD−L2とその本来の結合パートナー(例えば、PD−1)との間の相互作用のモジュレーションにより免疫応答をモジュレーションするための作用剤を利用するものである。これらの方法に使用される典型的な調節作用剤を以下においてさらに説明する。
【0054】
定義
本明細書の用語「免疫細胞」は、造血系起源の細胞であって、免疫応答において役割を果たす細胞を包含する。免疫細胞はB細胞およびT細胞のごときリンパ球;ナチュラルキラー細胞;ならびに単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球のごときミエロイド細胞を包含する。
【0055】
本明細書の用語「T細胞」はCD4+T細胞およびCD8+T細胞を包含する。また用語T細胞はTヘルパー1タイプのT細胞およびTヘルパー2タイプのT細胞の両方を包含する。用語「抗原提示細胞」は、プロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、Bリンパ球、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞)ならびに他の抗原提示細胞(例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞およびオリゴデンドロサイト)を包含する。
【0056】
本明細書の用語「免疫応答」は、T細胞同時刺激のモジュレーションにより影響を受ける、T細胞により媒介される免疫応答および/またはB細胞により媒介される免疫応答を包含する。典型的な免疫応答はB細胞応答(例えば、抗体産生)、T細胞応答(例えば、サイトカイン産生、および細胞性の細胞毒性)およびサイトカイン応答細胞、例えばマクロファージの活性化を包含する。本明細書の免疫応答に関する用語「ダウンレギュレーション」は、1またはそれ以上の免疫応答の減少を包含し、免疫応答に関する用語「アップレギュレーション」は、1またはそれ以上の免疫応答の増加を包含する。1のタイプの免疫応答のアップモジュレーションは別のタイプの免疫応答における対応ダウンモジュレーションを誘導しうることが理解されよう。例えば、ある種のサイトカイン(例えば、IL−10)の産生のアップモジュレーションは細胞性免疫応答のダウンモジュレーションを誘導しうる。
【0057】
本明細書の用語「同時刺激受容体」は、同時刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体、例えば、CD28またはICOSを包含する。本明細書の用語「阻害性受容体」は、免疫細胞に負のシグナルを伝達する受容体を包含する(例えば、CLTA−4またはPD−1)。
【0058】
本明細書の用語「同時刺激」は、活性化された免疫細胞に関しては、増殖またはエフェクター機能を誘導する、第2の、活性化しない(non−activating)、受容体により媒介されるシグナル(「同時刺激シグナル」)を提供する同時刺激分子の能力を包含する。例えば、同時刺激シグナルはサイトカイン分泌を引き起こし、例えば、T細胞受容体により媒介されるシグナルを受け取ったT細胞におけるサイトカインにおけるサイトカイン分泌を引き起こす。細胞受容体により媒介、例えば、活性化受容体を介して伝達されるシグナルを受け取った免疫細胞を、本明細書において、「活性化された免疫細胞」という。
【0059】
同時刺激受容体(CD28またはICOSのごとき)が免疫細胞上に存在しない場合でさえも、阻害性受容体により伝達される阻害性シグナルが生じることがあり、それは同時刺激分子の結合に関する阻害性受容体と同時刺激受容体との間の競争の単なる関数ではない(Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205)。免疫細胞への阻害性シグナルの伝達は免疫細胞における無応答、アネルギーまたはプログラムされた細胞死を生じさせる。好ましくは、阻害性シグナルの伝達は、アポトーシスに関連しない機構を通して機能するものである。用語「アポトーシス」は、当該分野で知られた方法を用いて特徴づけされうるプログラムされた細胞死を包含する。例えば、細胞収縮、膜の水泡、および細胞断片化の際の顕著なクロマチン濃縮により、アポトーシスによる細胞死を特徴づけることができる。アポトーシスを受けている細胞は特徴的なヌクレオソーム間DNA開裂のパターンも示す。
【0060】
受容体に結合するPD−L2分子の形態に応じて、例えば、受容体に結合するためのPD−L2分子の活性化形態との競争により、シグナルが伝達(例えば、受容体の架橋を生じさせる多価形態のPD−L2分子により、あるいは抗原提示細胞上のFc受容体に結合する可溶性のPD−L2により)あるいは阻害(例えば、当該分野で知られた方法を用いて抗原提示細胞上のFc受容体に結合しないように変化させられた可溶性の1価形態のPD−L2分子または可溶性形態のPD−L2により)されうる。しかしながら、可溶性分子が刺激性でありうる例が存在する。本明細書に記載のように常套的なスクリーニングアッセイを用いて種々のモジュレーション作用剤の効果を容易に示すことができる。
【0061】
本明細書の用語「活性化受容体(activating receptor)」は、抗原、複合体化抗原(例えば、MHC分子の意味において)、または抗体に結合する免疫細胞受容体を包含する。かかる活性化受容体はT細胞受容体(TCRs)、B細胞受容体(BCRs)、サイトカイン受容体、LPS受容体、補体受容体、ならびにFc受容体を包含する。
【0062】
例えば、T細胞受容体はT細胞上に存在し、CD3分子と結合する。T細胞受容体はMHC分子の意味において抗原により(ならびにポリクローナルT細胞活性化試薬により)刺激される。TCRを介するT細胞活性化は多くの変化を生じさせ,例えば、蛋白リン酸化、膜脂質変化、イオンフラックス、環状ヌクレオチド変化、RNA転写変化、蛋白合成変化、ならびに細胞体積変化を生じさせる。
【0063】
本明細書の用語「B細胞受容体(BCR)」は、B細胞上に見られる膜Ig(mIg)と他の膜貫通ポリペプチド(例えば、IgαおよびIgβ)との間の複合体を包含する。mIgのシグナル伝達機能は、オリゴマーまたはマルチマー抗原による受容体分子の架橋により引き金を引かれる。B細胞は抗−免疫グロブリン抗体によっても活性化される。BCR活性化により、チロシンリン酸化をはじめとする多くの変化がB細胞において生じる。
【0064】
用語「Fc受容体」(FcRs)は免疫グロブリン分子(Igs)のFc部分に対する細胞表面受容体を包含する。Fc受容体は免疫応答に関与する多くの細胞上に見られる。これまで同定されたヒトFcRsにはIgGを認識するもの(FcγRと命名された)、IgEを認識するもの(FcεR1)、IgAを認識するもの(FcαR)、およびポリマー化IgM/Aを認識するもの(FcμαR)がある。FcRsは下記の細胞タイプにおいて見られる:FcεRI(肥満細胞)、FcεRII(多くの白血球)、FcαR(好中球)、およびFcμαR(顆粒内皮、肝細胞)(Hogg, N. (1988) Immunol. Today 9:185−86)。広く研究されたFcγRsは細胞性免疫防御の中枢であり、炎症メディエイタおよび自己免疫疾患の発症に関与している加水分解酵素の放出を刺激する(Unkeless, J.C. (1988) Annu. Rev. Immunol. 6:251−87)。FcγRsは、エフェクター細胞とIgを分泌するリンパ球との間の重要なリンクを提供する。なぜならマクロファージ/単球、多型核白血球、およびナチュラルキラー(NK)細胞のFcγRsはIgGにより媒介される特異的認識のエレメントを付与するからである。ヒト白血球はIgGに対する少なくとも3つの異なる受容体を有する:それらはhFcγRI(単球/マクロファージ上に見られる)、hFcγRII(単球、好中球、好酸球、血小板、おそらくB細胞、およびK562細胞系)、およびhFcγRIII(NK細胞、好中球、好酸球、およびマクロファージ)である。
【0065】
T細胞に関して、T細胞への同時刺激シグナルの伝達には、シクロスポリンAにより阻害されないシグナリング経路が用いられる。さらに、同時刺激シグナルはT細胞におけるサイトカイン分泌を誘導することができ、そして/あるいは抗原に対する無応答の誘導、アネルギーの誘導、あるいはT細胞における細胞死の誘導を防止することができる。
【0066】
本明細書の用語「阻害性シグナル」は、免疫細胞上の阻害性受容体(例えば、CTLA4またはPD−1)分子を介して伝達されるシグナルをいう。かかるシグナルは、活性化受容体を介する(例えば、TCR、CD3、BCR、またはFc分子)シグナルに拮抗し、例えば、下記のものの阻害を引き起こす:第2のメッセンジャー発生、増殖、または免疫細胞におけるエフェクター機能、例えば減少したファゴサイトーシス、抗体産生、あるいは細胞性の細胞毒性、あるいはサイトカイン(例えばIL−2)および/またはアレルギー性応答のメディエイタのごときメディエイタを免疫細胞が産生しないこと、あるいはアネルギーの発生。
【0067】
本明細書の用語「無応答」は、刺激、例えば、活性化受容体またはサイトカインを介する刺激に対する免疫細胞の無反応を包含する。無応答は、例えば、免疫抑制剤または高用量の抗原への曝露により生じうる。本明細書の用語「アネルギー」または「寛容」は、活性化受容体により媒介される刺激への無反応を包含する。一般的には、かかる無反応は抗原特異的であり、寛容化剤への曝露が終わってからも持続する。例えば、T細胞におけるアネルギー(無応答に対抗するものとしての)はサイトカイン、例えばIL−2産生欠乏により特徴づけられる。T細胞アネルギーは、T細胞が抗原に曝露され、第2のシグナル(同時刺激シグナル)の不存在下で最初のシグナル(T細胞受容体またはCD3により媒介されるシグナル)を受け取った場合に生じる。これらの条件下において、同じ抗原への細胞の再曝露(同時刺激分子の存在下で再曝露が行なわれたとしても)は、サイトカイン無産生を引き起こし、かくして、増殖が起こらなくなる。しかしながら、アネルギー性T細胞は無関係な抗原に対して応答をマウントでき、サイトカイン(例えばIL−2)とともに培養された場合に増殖できる。例えば、ELISAにより測定する場合にはTリンパ球によるIL−2産生欠如により、あるいはインジケーター細胞系を用いる増殖アッセイにより、T細胞アネルギーを観察できる。別法として、リポーター遺伝子構築物を用いることもできる。例えば、アネルギー性T細胞は、5’IL−2遺伝子エンハンサーの制御下の異種プロモーターによりあるいはエンハンサー中に見出されうるAP1配列のマルチマーにより誘導されるIL−2遺伝子転写を開始させることができない(Kang et al. (1992) Science 257:1134)。
【0068】
同時刺激シグナルのモジュレーションは免疫細胞のエフェクター機能のモジュレーションを引き起こす。かくして、用語「PD−L2活性」は、PD−L2ポリペプチドがその本来の結合パートナー、例えばPD−1に結合する能力、免疫細胞同時刺激または阻害性シグナルをモジュレーションする能力、ならびに免疫応答をモジュレーションする能力を包含する。
【0069】
PD−1に関して、用語「活性」は、例えば抗原提示細胞上の本来のリガンドを用いることにより、活性化された免疫細胞における阻害性シグナルをモジュレーションするPD−1の能力を包含する。PD−1は、CTLA4と類似の様式で、阻害性シグナルを免疫細胞に伝達する。免疫細胞における阻害性シグナルのモジュレーションは、免疫細胞の増殖および/または免疫細胞によるサイトカイン分泌のモジュレーションを引き起こす。PD−1は、その本来のリガンドを求めて同時刺激受容体と競争することにより、同時刺激シグナルをモジュレーションすることもできる。かくして、用語「PD−1活性」は、PD−1ポリペプチドがその本来のリガンドに結合する能力、免疫細胞同時刺激または阻害性シグナルをモジュレーションする能力、ならびに免疫応答をモジュレーションする能力を包含する。
【0070】
本明細書の用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子(例えば、天然蛋白をコードするもの)をいう。
【0071】
本明細書の用語「アンチセンス」は、蛋白をコードする「センス」核酸に対して相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に対して相補的な配列、mRNA配列に対して相補的な配列、あるいは遺伝子のコーディング鎖に対して相補的な配列を含む。したがって、アンチセンス核酸分子はセンス核酸分子に水素結合しうる。
【0072】
本明細書の用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基中に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいい、用語「非コーディング領域」はアミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域(例えば、5’および3’非翻訳領域)をいう。
【0073】
本明細書の用語「ベクター」は、別の核酸分子が結合しており、それを輸送可能な核酸分子をいう。1のタイプのベクターは「プラスミド」であり、それは環状二本鎖DNAループをいい、その中にさらなるDNAセグメントが連結されうる。もう1つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、その中のウイルスゲノム中にさらなるDNAセグメントが連結されうる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的複製が可能である(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)は、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そのことにより、宿主ゲノムとともに複製される。そのうえ、ある種のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指令しうる。かかるベクターを本明細書において「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」という。一般的には、組換えDNA法において有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが多い。プラスミドはベクターの形態として最も普通に用いられるので、本明細書において「プラスミド」および「ベクター」を混用する。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−随伴ウイルス)のような他の形態の発現ベクターも包含する。
【0074】
本明細書の用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターのごとき本発明の核酸分子が導入された細胞をいう。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を本明細書において混用する。かかる用語は特定の対象細胞のみならずかかる細胞の子孫または潜在的子孫をもいうことが理解されるべきである。突然変異または環境の影響によりある種の修飾が継代の間に生じうるので、実際には、かかる子孫は親細胞と同一でないかもしれないが、やはり本明細書に用いられる用語の範囲内である。
【0075】
本明細書の用語「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、その動物の1またはそれ以上の細胞が「導入遺伝子」を含んでいるものである。用語「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれており、成熟動物のゲノム中に残り、例えば、トランスジェニック動物の1またはそれ以上の細胞タイプまたは組織においてコードする遺伝子産物の発現を指令する外来DNAをいう。
【0076】
本明細書の用語「相同組換え動物」は、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスをいい、動物中において、動物の発生に先立って動物の細胞、例えば動物の胚性細胞中に導入された外来DNA分子と内在遺伝子との間の相同組換えによって内在遺伝子が変化しているものをいう。
【0077】
本明細書の用語「単離蛋白」は、細胞から単離された場合、あるいは組換えDNA法により製造された場合に他の蛋白、細胞性物質および培地を実質的に含まず、あるいは化学合成された場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない蛋白をいう。
【0078】
「単離」または「精製」された蛋白またはその生物学的に活性のある部分は、PD−L2蛋白が得られた細胞または組織ソースに由来する細胞性物質または他の混入蛋白を実質的に含まず、あるいは化学合成された場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、PD−L2蛋白が単離または組換え法により得られた細胞の細胞性成分からPD−L2蛋白が分離されているPD−L2調合物を包含する。1の具体例において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、約30%(乾燥重量)未満の非PD−L2蛋白(本明細書において「混入蛋白」ともいう)を有する、より好ましくは約20%未満の非PD−L2蛋白を有する、さらにより好ましくは約10%未満の非PD−L2蛋白を有する、最も好ましくは約5%未満の非PD−L2蛋白を有するPD−L2の調合物を包含する。PD−L2蛋白またはその生物学的に活性のある部分を組換え法により製造する場合、それが培地を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培地が蛋白調合物の体積の約20%未満、より好ましくは約10%未満、最も好ましくは約5%未満を占める。
【0079】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、蛋白合成に使用される化学前駆体または他の化学物質から蛋白が分離されているPD−L2調合物を包含する。1の具体例において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、約30%(乾燥重量)未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有し、より好ましくは約20%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有し、さらにより好ましくは約10%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有し、最も好ましくは約5%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有するPD−L2蛋白の調合物を包含する。
【0080】
本明細書の用語「抗体」は、抗体の「抗原結合部分」(あるいは単に「抗体部分」)ならびに抗体分子全体を包含する。本明細書の用語「抗原結合部分」は、抗原(例えば、PD−L2)に特異的に結合する能力を保持している抗体の1またはそれ以上のフラグメントをいう。完全長抗体のフラグメントによって抗体の抗原結合機能が果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの例は、(i)VL、VHCLおよびCH1ドメインからなる1価フラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された2つのFabフラグメントを含む2価フラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al. (1989) Nature 341:544−546);および(vi)単離された相補性決定領域(CDR)を包含する。さらにそのうえ、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは別個の遺伝子によりコードされるが、組換え法を用いて、それらを単一蛋白鎖にすることのできる合成リンカーによりVLとVH領域のペアーを1価分子にすることにより、それらを結合することができる(1本鎖Fv(scFv)として知られる。例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423−426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883; and Osbourn et al. 1998 Nat. Biotechnol. 16:778参照)。かかる1本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される。特定のscFvのVHおよびVL配列をヒト免疫グロブリン不変領域cDNAまたはゲノム配列に連結して、完全なIgG分子または他のイソタイプをコードする発現ベクターを得ることができる。蛋白化学または組換えDNA法のいずれかを用いて、VHおよびVLをFab、Fv、または免疫グロブリンの他のフラグメントの生成に使用することもできる。ダイアボディー(diabody)のごとき他の形態の1本鎖抗体も包含される。ダイアボディーは2価の二特異性抗体であり、その中で、VHおよびVLドメインが1本のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短かすぎるリンカーを用いて、それらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて2つの抗原結合部位が創生されている(例えば、Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444−6448; Poljak, R.J. et al. (1994) Structure 2:1121−1123参照)。
【0081】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、1またはそれ以上の他の蛋白またはペプチドとの抗体または抗体部分の共有結合または非共有結合により形成されるより大きな免疫接着分子の一部であってもよい。かかる免疫接着分子の例は、テトラマーscFvを生成するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov, S.M. et al. (1995) Hum. Antibodies Hybridomas 6:93−101)ならびに2価のビオチン化scFv分子を生成するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov, S.M. et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047−1058)を包含する。抗体全体のパパインまたはペプシン消化のごとき慣用的方法を用いてFabおよびF(ab’)2フラグメントのごとき抗体部分を抗体全体から調製することができる。そのうえ、本明細書記載の標準的な組換えDNA法を用いて抗体、抗体部分および免疫接着分子を得ることができる。
【0082】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナル;異種、同種、または同系;あるいはそれらの修飾形態、例えば、ヒト化、キメラ等であってもよい。好ましくは、本発明の抗体はPD−L2分子に特異的あるいは実質的に特異的に結合する。本明細書の用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特定のエピトープと免疫反応しうるだた1つの種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいい、用語「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」は特定抗原と相互作用しうる複数種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特異抗原に対する単一の結合アフィニティーを示す。
【0083】
本明細書の用語「ヒト化抗体」は、ヒト細胞により作られるであろう抗体に近似するように変化させられた可変領域および不変領域を有する非ヒト細胞により作られる抗体を包含する。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を変化させてヒト生殖系免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を含むようにしてもよい。本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムあるいは部位特異的突然変異による、あるいはインビボでの体細胞突然変異による)を、例えばCDRs中に含んでいてもよい。本明細書の用語「ヒト化抗体」は、マウスのごとき別の哺乳動物種の生殖系に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体も包含する。
【0084】
本明細書の用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう(例えば、特異的にPD−L2に結合する単離抗体は、PD−L2以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。そのうえ、単離抗体は他の細胞性物質および/または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【0085】
PD−L2核酸およびポリペプチド分子
用語「ファミリー」は、本発明のポリペプチドおよび核酸分子についていう場合、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、本明細書で定義するように十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する2種またはそれ以上のポリペプチドまたは核酸分子を意味する。かかるファミリーのメンバーは天然または非天然のものであってよく、同じまたは異なる種に由来するものであってもよい。例えば、ファミリーはヒト起源の第1のポリペプチドならびにヒト起源の他の異なるポリペプチドを含んでいてもよく、あるいは非ヒト起源のホモログ、例えば、サルのポリペプチドを含んでいてもよい。ファミリーのメンバーは共通の機能的特徴を有していてもよい。
【0086】
例えば、本発明のPD−L2ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも1つの「シグナルペプチドドメイン」を含む。本明細書の用語「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、分泌および膜結合ポリペプチドのN末端に存在し、多くの疎水性アミノ酸残基を含んでいる約15個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドを包含する。例えば、シグナル配列は少なくとも約10〜30個のアミノ酸残基,好ましくは約15〜25個のアミノ酸残基、より好ましくは約18〜20個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは約19個のアミノ酸残基を含み、少なくとも約35〜65%、好ましくは約38〜50%、より好ましくは約40〜45%の疎水性アミノ酸残基(例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはフェニルアラニン)を有する。かかる「シグナル配列」は、当該分野において「シグナルペプチド」とも呼ばれ、かかる配列を含むポリペプチドを脂質二重層に指向させるのに役立ち、分泌および膜結合ポリペプチド中にあって開裂される。シグナル配列は配列番号:2(図3)のアミノ酸ほぼ1〜19であり、ネイティブなヒトPD−L2のアミノ酸配列中に確認された。シグナル配列は配列番号:5(図3)のアミノ酸ほぼ1〜19であり、ネイティブなマウスPD−L2のアミノ酸配列中にも確認された。
【0087】
本発明のもう1つの具体例において、本発明のPD−L2ポリペプチドが「膜貫通ドメイン」の存在に基づいて同定される。本明細書の用語「膜貫通ドメイン」は、細胞質膜を貫通する長さ約15アミノ酸残基のアミノ酸配列を包含する。より詳細には、膜貫通ドメインは少なくとも約20、25、30、35、40または45個のアミノ酸を含み、細胞質膜を貫通する。膜貫通ドメインは疎水性残基に富み、典型的には、α−ヘリックス構造を有する。好ましい具体例において、膜貫通ドメインの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上のアミノ酸が疎水性、例えば、ロイシン、イソロイシン、チロシンまたはトリプトファンである。膜貫通ドメインは、例えば、Zagotta, W.N. et al. (1996) Annu. Rev. Neurosci. 19:235−263に記載されており、参照によりその内容を本明細書に一体化させる。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基220〜243、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基201〜243は膜貫通ドメインを構成すると推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基220〜242、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基201〜223は膜貫通ドメインを構成すると推定される(図3参照)。したがって、ヒトPD−L2の膜貫通ドメインに対して少なくとも71〜80%、より好ましくは約80〜90%の相同性を有するPD−L2ポリペプチドは本発明の範囲内である。
【0088】
もう1つの具体例において、ポリペプチドまたは対応核酸分子中の「IgCドメイン」または「IgVドメイン」の存在に基づいて本発明のPD−L2分子が同定される。本明細書の用語、IgCドメインおよびIgVドメインはIgスーパーファミリーのメンバーのドメインとして当該分野において認識されている。これらのドメインは、Igフォールドと呼ばれる特徴的なフォールディングパターンを有する構造ユニットに対応する。Igフォールドは2つのβシートのサンドイッチから構成されており、各々は5〜10個のアミノ酸の逆平行β鎖からなり、すべてではないが大部分のドメインにおいて2つのβシート間に保存されたジスルフィド結合がある。Ig、TCRおよびMHC分子のIgCドメインは同じタイプの配列パターンを共有し、Igスーパーファミリー中のC1セットと呼ばれている。他のIgCドメインは他のセットに属する。IgVドメインも配列パターンを共有しており、Vセットドメインと呼ばれている。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基20〜120、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基1〜101はIgVドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基20〜120、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基1〜101もIgVドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基121〜219、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基102〜200はIgCドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基121〜219、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基102〜200もIgCドメインを含むと推定される(図3参照)。好ましい具体例において、IgVドメインの存在はPD−L2のその本来の結合パートナー、例えばPD−1への結合に必要とされる。
【0089】
もう1つの具体例において、ポリペプチドまたは対応核酸分子中の「細胞外ドメイン」の存在に基づいて本発明のPD−L2分子が同定される。本明細書の用語「細胞外ドメイン」は、細胞表面から尾部として伸長しているN末端アミノ酸を示す。本発明の細胞外ドメインはIgVドメインおよびIgCドメインを含み、シグナルペプチドドメインを含んでいてもよい。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基1〜219、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基1〜200は細胞外ドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基1〜219、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基1〜200も細胞外ドメインを含むと推定される(図3参照)。
【0090】
さらにもう1つの具体例において、ポリペプチドまたは対応核酸分子中の「細胞質ドメイン」の存在に基づいて本発明のPD−L2分子が同定される。本明細書の用語「細胞質ドメイン」は、細胞の細胞質中の尾部として伸長しているC末端アミノ酸を示す。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基244〜273、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基225〜273は細胞質ドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基243〜247、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基224〜228も細胞質ドメインを含むと推定される(図3参照)。
好ましい具体例において、本発明のPD−L2分子は少なくとも1個またはそれ以上の下記ドメインを含む:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0091】
本発明の単離ポリペプチド、好ましくはPD−L2ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列に対して十分に同一であるアミノ酸配列を有し、あるいは配列番号:1または3に対して十分に同一であるヌクレオチド配列によりコードされる。本明細書の用語「十分に同一」は、第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分または最小の数の同一または同等なアミノ酸残基(例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基)またはヌクレオチドを含む第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列をいい、第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列は共通の構造ドメインまたはモチーフおよび/または共通の機能活性を有する。例えば、ドメインのアミノ酸配列間において少なくとも30%、40%または50%の相同性、好ましくは60%の相同性、より好ましくは70〜80%の相同性、さらに好ましくは90〜95%の相同性を有し、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つの構造ドメインまたはモチーフを含む共通の構造ドメインを共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は十分に同一であると定義される。さらにそのうえ、少なくとも30%、40%または50%の相同性、好ましくは60%の相同性、より好ましくは70〜80%の相同性、さらに好ましくは90〜95%の相同性を有し、共通の機能的活性を共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は十分に同一であると定義される。
【0092】
本明細書の用語「PD−L2活性」、「PD−L2の生物学的活性」または「PD−L2の機能的活性」は、PD−L2応答性細胞または組織に対し、あるいはPD−L2ポリペプチド結合パートナーに対し、PD−L2蛋白、ポリペプチドまたは核酸分子により発揮される活性であって、標準的方法によりインビボまたはインビトロにおいて決定される活性をいう。1の具体例において、PD−L2活性は、PD−L2結合パートナーとの結合のごとき直接的活性である。本明細書の用語「標的分子」または「結合パートナー」は、本来的にPD−L2ポリペプチドが結合または相互作用してPD−L2により媒介される機能が発揮される分子である。典型的な具体例において、PD−L2標的分子は受容体PD−1である。あるいはまた、PD−L2活性は、PD−L2ポリペプチドとその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用により媒介される細胞シグナリング活性のごとき間接的活性である。PD−L2の生物学的活性は本明細書に記載されている。例えば、本発明のPD−L2ポリペプチドは1またはそれ以上の下記活性を有しうる:1)受容体PD−1または他のPD−L2の本来の結合パートナーに結合し、そして/あるいはその活性をモジュレーションする、2)細胞内または細胞間シグナリングをモジュレーションする、3)免疫細胞、例えば、Tリンパ球の活性化をモジュレーションする、4)生物、例えばマウスまたはヒト生物の免疫応答をモジュレーションする。
【0093】
したがって、本発明のもう1つの具体例は、PD−L2活性を有する単離PD−L2蛋白およびポリペプチドに関する。他の好ましいポリペプチドは、1またはそれ以上の下記ドメインを有するPD−L2ポリペプチドであり、好ましくはPD−L2活性を有するものである:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0094】
さらなる好ましいPD−L2ポリペプチドは少なくとも1つの細胞外ドメイン、および1つまたはそれ以上のシグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを有し、好ましくは、ストリンジェントな条件下において配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列の相補配列を含む核酸分子とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
【0095】
単離ヒトPD−L2 cDNAのヌクレオチド配列およびヒトPD−L2ポリペプチドの推定アミノ酸配列はそれぞれ図1ならびに配列番号:1および2に示されている。単離マウスPD−L2 cDNAのヌクレオチド配列およびマウスPD−L2ポリペプチドの推定アミノ酸配列はそれぞれ図2ならびに配列番号:4および5に示されている。
【0096】
ヒトPD−L2遺伝子は約1223ヌクレオチドの長さであり、約30.0kDの分子量を有し、約273アミノ酸の長さのポリペプチドをコードする。マウスPD−L2遺伝子は約1655ヌクレオチドの長さであり、約27.2kDの分子量を有し、約247アミノ酸の長さのポリペプチドをコードする。
【0097】
本発明の種々の態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明する:
【0098】
I.単離核酸分子
本発明の1の態様は、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分をコードする単離核酸分子、ならびにPD−L2をコードする核酸分子(例えば、PD−L2 mRNA)を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するに十分な核酸フラグメントおよびPD−L2核酸分子の増幅または突然変異のためのPCRプライマーとして使用されるフラグメントに関する。本明細書の用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNA)ならびにヌクレオチドアナログを用いて得られるDNAまたはRNAのアナログをいう。核酸分子は1本鎖または2本鎖でありうるが、好ましくは2本鎖DNAである。
【0099】
用語「単離核酸分子」は、核酸の天然ソース中に存在する他の核酸から分離されている核酸分子を包含する。例えば、ゲノムDNAに関して、用語「単離」は、ゲノムDNAは本来的に結合している染色体から分離されている核酸分子を包含する。好ましくは、「単離」核酸分子は、当該核酸が由来した生物のゲノムDNA中の本来的に隣接している配列(すなわち、当該核酸分子の5’および3’末端に存在する配列)を含まない。例えば、種々の具体例において、単離PD−L2核酸分子は、その核酸分子が由来した細胞のゲノムDNA中のその核酸分子に隣接した約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチド配列を含むことができる。そのうえ、組換え法により製造される場合にはDNA分子のごとき「単離」核酸分子は細胞性物質または培地を実質的に含まないものであってもよく、化学合成される場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【0100】
標準的な分子生物学の方法および本明細書に示される配列の情報を用いて、本発明の核酸分子、例えば、配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列またはその一部を有する核酸分子を単離することができる。配列番号:1、3、4または6の核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング方法を用いて、PD−L2核酸分子を単離することができる(例えば、Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されたようにして)。
そのうえ、配列番号:1、3、4または6の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、配列番号:1、3、4または6の全部または一部を含む核酸分子を単離することができる。
【0101】
cDNA、mRNAを鋳型として用いて、別法としてゲノムDNAを鋳型として用い、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なPCR増幅法により本発明の核酸分子を増幅することができる。そのようにして増幅された核酸分子を適当なベクター中にクローン化して、DNA配列分析により特徴づけることができる。さらにそのうえ、標準的な合成方法により、例えば、自動DNA合成装置を用いてPD−L2ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【0102】
好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列を含む。このcDNAは配列番号:1のヒトPD−L2ポリペプチドをコードする配列(すなわち、ヌクレオチド274〜1092のコーディング領域)ならびに5’非翻訳配列(ヌクレオチド1〜273)および3’非翻訳配列(ヌクレオチド1093〜1223)を含んでいてもよい。あるいは、核酸分子は、配列番号:1のコーディング領域のみ(すなわち、ヌクレオチド274〜1092、配列番号:3に対応)を含んでいてもよい。したがって、もう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は配列番号:3および配列番号:1のヌクレオチド1〜274を含む。さらにもう1つの具体例において、単離核酸分子は配列番号:3および配列番号:1のヌクレオチド1093〜1223を含む。さらにもう1つの具体例において、核酸分子は配列番号:1または配列番号:3に示すヌクレオチド配列からなる。さらにもう1つの具体例におて、核酸分子は配列番号:1のコーディング領域(例えば、ヌクレオチド274〜1092、配列番号:3に対応)ならびに停止コドン(例えば、配列番号:1のヌクレオチド1093〜1095)を含んでいてもよい。
【0103】
このcDNAは、配列番号:4のマウスPD−L2をコードする配列(すなわち、ヌクレオチド210〜950のコーディング領域)ならびに5’非翻訳配列(ヌクレオチド)および3’非翻訳配列(ヌクレオチド1〜209)を含んでいてもよい。あるいは、核酸分子は、配列番号:4のコーディング領域のみ(すなわち、ヌクレオチド210〜950、配列番号:6に対応)を含んでいてもよい。したがって、もう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は配列番号:6および配列番号:4のヌクレオチド1〜210を含む。さらにもう1つの具体例において、単離核酸分子は配列番号:6および配列番号:4のヌクレオチド951〜1655を含む。さらにもう1つの具体例において、核酸分子は配列番号:4または配列番号:6に示すヌクレオチド配列からなる。さらにもう1つの具体例におて、核酸分子は配列番号:4のコーディング領域(例えば、ヌクレオチド210〜950、配列番号:4に対応)ならびに停止コドン(例えば、配列番号:4のヌクレオチド951〜953)を含んでいてもよい。
【0104】
もう1つの好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列またはそれらのヌクレオチド配列の一部の相補配列である核酸分子を含む。配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子は、配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列に対して十分に相補的である核酸分子であり、その結果、それはそれぞれ配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションでき、そのことにより安定な2本鎖を形成する。
【0105】
さらにもう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列の全長またはこれらのヌクレオチド配列の一部に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。
そのうえ、本発明の核酸分子は配列番号:1、3、4または6の核酸配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用できるフラグメントあるいはPD−L2ポリペプチドの一部、例えばPD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分をコードするフラグメントのみを含んでいてもよい。ヒトPD−L2遺伝子のクローニングにより決定されたヌクレオチド配列は、他のPD−L2ファミリーのメンバーならびに他の種由来のPD−L2ホモログの同定および/またはクローニングに使用するように設計されたプローブおよびプライマーの取得を可能にする。典型的には、プローブ/プライマーは実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。典型的には、オリゴヌクレオチドは、配列番号:1、3、4または6のセンス配列の、あるいは配列番号:1、3、4または6のアンチセンス配列の、あるいは配列番号:1、3、4または6の天然に存在する対立遺伝子変種の少なくとも約12または15個の、好ましくは約20または25個の、より個の約30、35、40、45、50、55、60、65または75個の連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の領域を含む。
【0106】
1の具体例において、本発明の核酸分子は、約50−100、100−150、150−200、200−250、250−300、300−350、350−400、400−450、450−500、500−550、550−600、600−650、650−700、700−750、750−800、800−850、850−900、900−950、950−1000、1000−1050、1050−1100、1100−1150ヌクレオチドまたはそれ以上のものよりも大きく、ストリンジェントな条件下で配列番号:1、3、4または6の核酸分子にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列またはその相補配列を含む。さらなる具体例において、本発明の核酸分子は約880−900、900−950、950−1000、1000−1050、1050−1100、1100−1150ヌクレオチドまたはそれ以上のものよりも大きく、ストリンジェントな条件下で配列番号:1または3の核酸分子にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列またはその相補配列を含む。さらにもう1つの具体例において、本発明の核酸分子は約50−100、100−150、150−200、200−250、250−300ヌクレオチドまたはそれ以上のものよりも大きく、ストリンジェントな条件下で配列番号:1のヌクレオチド1〜358を含む核酸分子にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列またはその相補配列を含む。さらなる具体例において、本発明の核酸分子は約50−100、100−150、150−200、200−250、250−300、300−350、350−400、400−450、450−500、500−550、550−600、600−650、650−700、700−750、750−800、850−900、900−950、950−1000−1050−1100、1100−1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、配列番号:1のヌクレオチド1〜358を含む配列の少なくとも約15個の(すなわち、連続した15個の)ヌクレオチドまたはその相補配列を含み、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその相補配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を含む。
【0107】
PD−L2ヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて同じまたは相同的なポリペプチドをコードする転写物またはゲノム配列を検出することができる。好ましい具体例において、プローブは、それに結合した標識基をさらに含み、例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターであってもよい。かかるプローブを診断試験キットの一部として用いて、例えば、対象からの細胞試料中のPD−L2をコードする核酸のレベル、例えば、PD−L2 mRNAレベルを測定し、あるいはゲノムPD−L2遺伝子が変異または欠失しているかどうかを調べることにより、PD−L2ポリペプチドを誤って発現する細胞または組織を同定することができる。
【0108】
PD−L2の生物学的活性(例えば、その本来の結合パートナー(例えばPD−1)に結合し、そして/あるいは免疫細胞活性をモジュレーションする能力)を有するポリペプチドをコードする配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列の一部分を単離し、PD−L2ポリペプチドのコードされた部分を発現させ(例えば、インビトロでの組換え発現により)、次いで、PD−L2ポリペプチドのコードされた部分の活性を評価することにより、「PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分」をコードする核酸フラグメントを調製することができる。
【0109】
さらに本発明は、遺伝暗号の縮重により配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列とは異なっているが、配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列によりコードされるのと同じPD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。もう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は配列番号:2または5に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
【0110】
配列番号:1、3、4または6に示すPD−L2ヌクレオチド配列のほかに、PD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を導くDNA配列多型が集団(例えば、ヒト集団)中に存在してもよいことが当業者に理解されよう。PD−L2遺伝子中のかかる遺伝学的多型が、天然の対立遺伝子変化により集団中の個体間に存在してもよい。本明細書の用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、PD−L2ポリペプチド、好ましくは哺乳動物PD−L2ポリペプチドをコードする読み取り枠を含み、さらに非コーディング調節配列おおびイントロンを含んでもよい核酸分子をいう。
【0111】
ヒトまたはマウスのPD−L2の対立遺伝子変種は機能的ならびに非機能的PD−L2ポリペプチドを包含する。機能的対立遺伝子変種は、本来のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1に結合し、そして/あるいはリンパ球活性化をモジュレーションする能力を維持しているヒトまたはマウスのPD−L2ポリペプチドの天然に存在するアミノ酸配列変種である。典型的には、機能的対立遺伝子変種は、配列番号:2または5の1個またはそれ以上のアミノ酸の保存的置換のみを含み、あるいはポリペプチドの重要でない領域の重要でない残基の置換、欠失または挿入を含む。
【0112】
非機能的対立遺伝子変種は、本来のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1に結合せず、本明細書記載のPD−L2活性をモジュレーションしないヒトまたはマウスのPD−L2ポリペプチドの天然に存在するアミノ酸配列変種である。典型的には、非機能的対立遺伝子変種は、配列番号:2または5のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入あるいは未成熟な末端切断、あるいはポリペプチドの重要な残基または重要な領域、例えばIgV領域における置換、挿入または欠失を含む。
【0113】
さらに本発明は、ヒトまたはマウスPD−L2ポリペプチドの非ヒト、非マウスオーソログを提供する。ヒトまたはマウスPD−L2ポリペプチドのオーソログは、非ヒト、非マウス生物から単離され、PD−L2ポリペプチドと同じPS−1結合活性および/またはリンパ球活性化モジュレーション活性を有するポリペプチドである。ヒトまたはマウスPD−L2ポリペプチドのオーソログは配列番号:2または5と実質的に同じアミノ酸配列を含むものと容易に同定される。
【0114】
そのうえ、他のPD−L2ファミリーのメンバーをコードする核酸分子、よって配列番号:1、3、4または6のPD−L2配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は本発明の範囲内にある。例えば、マウスまたはヒトのPD−L2のヌクレオチド配列に基づいて別のPD−L2 cDNAを同定することができる。そのうえ、異なる種由来のPD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子、かくして配列番号:1、3、4または6のPD−L2配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は本発明の範囲内である。例えば、マウスまたはヒトPD−L2のヌクレオチド配列に基づいてサルPD−L2 cDNAを同定することができる。
【0115】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において標準的なハイブリダイゼーション法により、本明細書開示のcDNAあるいはその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書開示のPD−L2核酸に対する相同性に基づいて、本発明のPD−L2 cDNAの天然の対立遺伝子変種およびホモログに対応する核酸分子を単離することができる。さらに、PD−L2遺伝子と同じ染色体または遺伝子座にマッピングすることにより、本発明のPD−L2 cDNAの天然の対立遺伝子変種およびホモログに対応する核酸分子を単離することができる。
【0116】
したがって、もう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は少なくとも15、20、25、30ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1のヌクレオチド配列のヌクレオチド1〜358または配列番号:3のヌクレオチド1〜85を含む核酸分子にハイブリダイゼーションする。他の具体例において、核酸は少なくとも880−900、900−950、950−1000、1000−1050、1050−1100、1100−1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。
【0117】
本明細書の用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする」は、有意に同一または相同的であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイゼーションしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件をいう。好ましくは、少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80%、さらに好ましくは少なくとも約85%または90%同一である配列が互いにハイブリダイゼーションしたままである条件である。かかるストリンジェントな上官は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), セクション 2, 4 および 6中に見られる。さらなるストリンジェントな条件はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 第 7, 9 および 11 章中に見られる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、4X または 6X 塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム (SSC)中, 約 65−70℃でのハイブリダイゼーション(あるいは 4X SSC プラス 50% ホルムアミド中、約 42−50℃でのハイブリダイゼーション)、次いで、1X SSC中, 約 65−70℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい非限定的な例は、6X SSC、45℃でのハイブリダイゼーション, 次いで、0.2X SSC, 0.1% SDS中、65℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、1X SSC中, 約 65−70℃でのハイブリダイゼーション (あるいは 1X SSC プラス 50% ホルムアミド中、約42−50℃でのハイブリダイゼーション)、次いで、0.3X SSC中, 約 65−70℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。ストリンジェンシーを減じたハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、4X または 6X SSC中, 約50−60℃でのハイブリダイゼーション(あるいは6X SSC プラス 50% ホルムアミド中、約40−45℃でのハイブリダイゼーション)、次いで、2X SSC中, 約50−60℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。上記値の間の範囲、例えば、65−70℃または42−50℃もまた本発明の範囲内である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファー中のSSC(1xSSC は 0.15M NaCl および 15mM クエン酸ナトリウム)に代えてSSPE(1xSSPE は 0.15M NaCl, 10mM NaH2PO4, および 1.25mM EDTA, pH 7.4)を用いることができ、ハイブリダイゼーション完了後、各回15分の洗浄を行なう。長さ50塩基対未満と予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度はハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5−10℃低くすべきである。ここにTmは以下の等式により決定される。長さ18塩基対未満のハイブリッドの場合、Tm(℃) = 2(A + T 塩基数) + 4(G + C 塩基数)。長さ18ないし49塩基対のハイブリッドの場合、Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) − (600/N)、ここにNはハイブリッド中の塩基数、[Na+]はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオン濃度(1xSSCの[Na+]は0.165M)である。ブロッキング剤(例えばBSAまたはサケもしくはニシンの精子キャリアDNA)、界面活性剤(例えばSDS)、キレート剤(例えばEDTA)、Ficoll、PVP等のさらなる試薬(これらに限らない)をハイブリダイゼーションおよび/または洗浄バッファーに添加して核酸分子の膜、例えばニトロセルロースまたはナイロン膜への非特異的ハイブリダイゼーションを減少させてもよいことが当業者により理解されるであろう。ナイロン膜を用いる場合、詳細には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい非限定的な例は、0.25−0.5M NaH2PO4, 7% SDS中、約65℃でのハイブリダイゼーション、次いで、0.02M NaH2PO4, 1% SDS中、65℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄である。例えば、Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991−1995 参照(あるいは 0.2X SSC, 1% SDS)。
【0118】
好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号:1、3、4または6の配列にハイブリダイゼーションする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書の用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子をいう。
【0119】
集団中に存在してもよいPD−L2配列の天然に存在する対立遺伝子変種のほかに、当業者は、配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列中に突然変異により変化を導入し、そのことによりPD−L2ポリペプチドの機能能力を変化させることなく、コードされるPD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くことが可能であることをさらに認識するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を配列番号:1、3、4または6において作成することができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなくPD−L2の野生型配列(例えば、配列番号:2または5の配列)から変化させることのできる残基であり、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のPD−L2ポリペプチド間で保存されているアミノ酸残基、例えば、細胞外ドメイン中に存在するものは特に変化に適さないと推定される。さらにそのうえ、本発明のPD−L2間およびPD−L2ファミリーの他のメンバー間で保存されているさらなるアミノ酸残基も変化に適する可能性が低い。
【0120】
したがって、本発明のもう1つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含むPD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。かかるPD−L2ポリペプチドは配列番号:2または5のアミノ酸配列において異なっているが、やはり生物学的活性を保持している。1の具体例において、単離核酸分子は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは配列番号:2または5に対して少なくとも約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【0121】
配列番号:2または5のポリペプチドと同一のPD−L2ポリペプチドをコードする単離核酸を、配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列中に1またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作成して、1またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるポリペプチド中に導入されるようにすることができる。部位特異的突然変異方およびPCRによる突然変異法のごとき標準的方法により配列番号:1、3、4または6中に変異を導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、1つまたはそれ以上の非必須アミノ酸残基で起こる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換する方法の1つである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義され、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷の極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。したがって、好ましくは、PD−L2ポリペプチド中の非必須なアミノ酸残基は、同様の側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基に置換される。あるいは、もう1つの具体例において、例えば飽和突然変異法によりPD−L2コーディング配列の全体または一部にランダムに変異を導入することができ、得られた変異体をPD−L2生物学的活性に関してスクリーニングして、活性を保持している変異体を同定することができる。配列番号:1、3、4または6の変異後、コードされるポリペプチドを組換え方により発現させ、ポリペプチドの活性を調べることができる。
【0122】
好ましい具体例において、本来のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1への結合および/またはその活性をモジュレーションする能力、細胞内または細胞間シグナリングをモジュレーションする能力、Tリンパ球の活性化をモジュレーションする能力、ならびに/あるいは生物の免疫応答をモジュレーションする能力に関して変異PD−L2ポリペプチドをアッセイすることができる。
【0123】
さらにもう1つの本発明の態様は、PD−L2融合蛋白をコードする単離核酸分子に関する。非PD−L2ポリペプチド、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列に作動可能に結合される、少なくともPD−L2ポリペプチド、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列を含むこのような核酸分子は、標準的な組み換えDNA法により調製できる。
【0124】
上記PD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子のほかに、本発明のもう1つの態様は、それらに対してアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は蛋白をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列、またはmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合しうる。アンチセンス核酸は、PD−L2コーディング鎖全体、あるいはその蛋白にのみ相補的であり得る。1の具体例において、アンチセンス核酸分子は、PD−L2をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスである。用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。他の具体例において、アンチセンス核酸分子は、PD−L2をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」にアンチセンスである。用語「非コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する5’および3’配列をいう(5’および3’非翻訳領域ともいう)。
【0125】
本明細書で開示されたヒトまたはマウスのPD−L2をコードするコーディング配列(例えば、それぞれ配列番号:3または配列番号:6)が得られたならば、本発明のアンチセンス核酸を、WatsonおよびCrickの塩基対合の法則により設計できる。アンチセンス核酸分子は、PD−L2 mRNAの全コーディング領域に相補的であってよい、より好ましくは、PD−L2 mRNAのコーディング領域または非コーディング領域だけにアンチセンスなオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PD−L2 mRNAの翻訳開始部位の周辺領域に相補的であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドの長さであってよい。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および当該分野で公知の工程を使用する酵素により連結反応を使用して構築できる。例えば、天然に存するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させ、アンチセンスとセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用してアンチセンス核酸分子(例えば、アンチセンスヌクレオチド)を化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸の生成に使用しうる修飾ヌクレオチドの例は、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨウドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデシン、1−メチルグアニン、1−メチルリノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルクエオシン、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6−ジアミノプリンを包含する。別法として、核酸をアンチセンス方向(すなわち、挿入核酸から転写されたRNAは、対象とする標的核酸に対してアンチセンス方向であろう。これは以下のサブセクションにさらに記載する。)にサブクローニングする発現ベクターを使用してアンチセンス核酸を生物学的に生産できる。
【0126】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与され、またはin situにおいて産生され、これらはハイブリッド形成し、またはPD−L2ポリペプチドをコードする細胞のmRNAおよび/またはゲノムDNAに結合し、そのことにより、例えば、転写および/または翻訳を阻害することにより、蛋白の発現を阻害する。ハイブリッド形成は、保存ヌクレオチド相補性により、あるいは例えば、DNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重螺旋の主要な溝での特別な相互作用により、安定な二本鎖を形成することができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接注入を含む。別法として、アンチセンス核酸分子を修飾して選択された細胞を標的化し、ついで、全身投与することができる。例えば、全身投与するために、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合することにより、アンチセンス分子が選択された細胞表面で発現した受容体または抗原に結合するように特異的に修飾することができる。また、アンチセンス核酸分子を、本明細書記載のベクターを使用して細胞にデリバリーすることができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を実現させるため、アンチセンス核酸分子が強力なpolIIまたはpolIIIプロモーターの制御下に置かれるベクター構造が好ましい。
【0127】
さらなる具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的なRNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは通常のβ−ユニットとは対照的に鎖は互いに平行に伸長する(Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625−6641)。また、アンチセンス核酸分子は、2’−o−メチルリボヌクレオチドを含んでいてもよく(Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6431−6148)あるいはキメラRNA−DNAアナログを含んでいてもよい(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327−330)。
【0128】
さらなる他の具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、リボザイムである。リボザイムは、それに相補的な領域を有するmRNAのごとき1本鎖核酸分子を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。したがって、リボザイム(例えば、ハンマーヘッドリボザイム(hammerhead ribozymes)(Haseloff and Gerlach (1988) Nature 334:585−591に記載)を用いてPD−L2 mRNA転写物を触媒的に切断することができ、そのことによりPD−L2 mRNAの翻訳を阻害することができる。PD−L2をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムを、本明細書に記載のPD−L2のヌクレオチド配列(すなわち、配列番号:1、3、4または6)に基づいて設計することができる。例えば、Tetrahymena L−19 IVS RNAの誘導体を、活性部位のヌクレオチド配列がPD−L2をコードするmRNA中で切断されるヌクレオチド配列に相補的であるように構築できる。例えば、Cech らの米国特許第4,987,071号;およびCechらの米国特許第5,116,742号参照。別法として、PD−L2 mRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することができる。例えば、Bartel, D. and Szostak, J. W. (1993) Science 261:1411−1418参照。
【0129】
別法として、PD−L2の調節領域(例えば、PD−L2プロモーターおよび/またはエンハンサー;例えば、配列番号:1のヌクレオチド1〜273または配列番号:4のヌクレオチド1〜209)に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞中のPD−L2遺伝子の転写を防ぐ三重螺旋構造を形成することにより、PD−L2遺伝子発現を阻害することができる。一般的には、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569−84; Helene, C. et al (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27−36; and Maher, L. J. (1992) Bioessays 14(12):807−15参照。
【0130】
さらなる他の具体例において、本発明のPD−L2核酸分子を、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾して、例えば、安定性、ハイブリッド形成、または分子の溶解性を改善することができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾してペプチド核酸を得ることができる(Hyrup, B. and Nielsen, P. E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1):5−23参照)。本明細書の用語「ペプチド核酸」または「PNA」は、デオキシリボースリン酸骨格を、擬似ペプチド骨格により置換し、4つの天然ヌクレオベースだけが維持された核酸模倣物、例えば、DNA模倣物を意味する。PNAの天然の骨格は、低イオン強度の環境下でDNAおよびRNAに特異的なハイブリッド形成を可能にすることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、標準的な、Hyrup and Nielsen (1996) supra and Perry−O’Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670−675に記載のように固相ペプチド法を使用して実行できる。
【0131】
PD−L2核酸分子のPNAを治療および診断用に使用できる。例えば、PNAは、例えば、転写または翻訳の停止を誘発し、または複製を阻害することにより、アンチセンスまたは抗原作用剤として、遺伝子発現の配列特異的なモジュレーションに使用可能である。また、PD−L2核酸分子のPNAは、遺伝子中の単塩基対突然変異体の分析に(例えば、PNA−指向性PCRクランピング)、他の酵素と組み合わせて使用される場合には「人工制限酵素」として(例えば、上記S1ヌクレアーゼ(上で引用したHyrup and Nielsen (1996)))、あるいはDNA配列またはハイブリッド形成用のプローブまたはプライマーとして(上で引用したHyrup and Nielsen (1996); Perry−O’Keefe et al. (1996) supra)使用可能である。
【0132】
PD−L2核酸分子のPNAを治療および診断用途に使用することができる。例えば、転写または翻訳停止を誘導することにより、あるいは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的モジュレーションのためのアンチセンスまたは抗原としてPNAを使用することができる。また、PD−L2核酸分子のPNAを、遺伝子中の単一塩基対変異の分析に(例えば、PNAに指向されたPCRクランピングにより);他の酵素(例えば、S1ヌクレアーゼ(上記Hyrup and Nielsen (1996)))と組み合わせた場合に人工制限酵素として;あるいはDNA配列決定またはハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして(上記Hyrup and Nielsen (1996); 上記Perry−O’Keefe (1996))使用することもできる。
【0133】
他の具体例において、親油性または他のヘルパー基をPNAに付着させることにより、PNA−DNAキメラの形成により、またはリポソームまたは当業者に公知の薬剤デリバリーの他の方法により、PD−L2のPNAを修飾することができる(例えば、安定性または細胞摂取を高めるために)。例えば、PNAおよびDNAの有利な特性を組み合わせることができるPD−L2核酸分子のPNA−DNAキメラを得ることができる。このようなキメラは、DNA認識酵素(例えば、RNAse HおよびDNAポリメラーゼ)に、DNA部分との相互作用を可能ならしめ、その一方で、PNA部分は、高い結合アフィニティーおよび特異性を提供するであろう。塩基スタッキング、ヌクレオベース間の結合の数、および方向に関して選択される適当な長さのリンカーを使用してPNA−DNAキメラを連結することができる(Hyrup B. and Nielsen (1996) supra)。PNA−DNAキメラの合成を、Hyrup B. and Nielsen(1996) supra および Finn P. J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357−63に記載のように行なうことができる。例えば、標準的なホスホラミダイトカップリング化学物質を使用して、固体支持体上でDNA鎖を合成することができる。修飾ヌクレオシドアナログ(例えば、5’−(4−メトキシトリチル)アミノ−5’−デオキシ−チミジンホスホラミダイト)を、PNAとDNAの5’末端との間のリンカーとして使用できる(Mag, M. et al. (1989) Nucleic acid Res. 17:5973−88)。ついで、キメラ分子を生成する段階的な方法で、PNAモノマーを5’PNAセグメントおよび3’DNAセグメントとカップリングさせる(上記Finn P. J. et al. (1996))。別法として、5’DNAセグメントおよび3’PNAセグメントを用いてキメラ分子を合成することができる(Peterser, K. H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119−11124)。
【0134】
他の具体例において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのごとき他の付加基(例えば、インビボでの宿主細胞受容体の標的化のために)、あるいは細胞膜(例えば、Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553−6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648−652; PCT出願WO88/09810参照)または血液脳関門(例えば、PCT出願WO89/10134)を越えた輸送を容易ならしめる作用剤を包含する。さらに、オリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成により誘発される開裂剤(例えば、Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958−976参照)または挿入剤(例えば、Zon (1988) Pharm. Res. 5:539−549参照)を用いて修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、他の分子(例えば、ペプチド、ハイブリッド形成により誘発される架橋剤、輸送剤またはハイブリッド形成により誘発される切断剤)に結合させることができる。
【0135】
別法として、安定な細胞系またはクローン化された微生物のゲノム中に異種DNA調節エレメントを挿入して、挿入された調節エレメントが内在性PD−L2遺伝子に作動可能に連結されるようにすることにより、細胞系または微生物中の内在性PD−L2遺伝子の発現特性を修飾してもよい。例えば、通常には「転写的にはサイレント」な内在性PD−L2遺伝子、すなわち、通常には細胞系または微生物において発現されないかあるいは非常に低レベルでしか発現されないPD−L2遺伝子を、当該細胞系または微生物において通常に発現される遺伝子産物の発現を促進しうる調節エレメントを挿入することにより活性化させてもよい。別法として、転写的にサイレントな内在性PD−L2遺伝子を、細胞タイプを超えて作用する汎用調節エレメントを挿入することにより活性化させてもよい。
【0136】
当業者によく知られ、例えば、Chappel, 米国特許第5,272,071号; PCT公開第WO 91/06667号(1991年5月16日公開)に記載されている標的化相同組換え法のごとき方法を用いて、異種調節エレメントを安定な細胞系またはクローン化された微生物中に挿入して、それが内在性PD−L2遺伝子に連結されるようにしてもよい。
【0137】
II.単離PD−L2ポリペプチドおよび抗−PD−L2抗体
本発明の1の態様は、単離されたPD−L2ポリペプチド、およびその生物学的に活性のある部分、ならびに抗PD−L2抗体を生じさせる免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントに関する。1の具体例において、ネイティブなPD−L2ポリペプチドは、標準的な蛋白精製技術を用いた適当な精製計画により細胞または組織供給源から単離され得る。別の具体例において、PD−L2ポリペプチドは、組換えDNA技術により製造される。組換え発現に代わるものとして、PD−L2ポリペプチドまたはポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【0138】
「単離」または「精製」された蛋白またはその生物学的に活性のある蛋白は、PD−L2ポリペプチドが由来した細胞または組織源由来の細胞性物質または他の混入蛋白を実質的に含まず、あるいは化学合成の場合には化学前駆体または他の化学試薬を含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、PD−L2ポリペプチドが単離されあるいは組み換え法により製造される細胞の細胞性成分から分離されているPD−L2ポリペプチドの調合物を意味する。1の具体例において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、約30%(乾燥重量で)未満の非PD−L2ポリペプチド(本明細書において「混入蛋白」ともいう)、より好ましくは約20%の非PD−L2ポリペプチド、さらに好ましくは約10%未満の非PD−L2ポリペプチド、最も好ましくは約5%未満の非PD−L2ポリペプチドを有するPD−L2ポリペプチドの調合物を包含する。また、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分が組み換え法により製造される場合、好ましくは、それは培地を含まないものであり、すなわち、培地が蛋白調合物の体積の約20%未満、より好ましくは約10%未満、最も好ましくは約5%未満である。
【0139】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、蛋白合成に使用される化学前駆体または化学物質から蛋白が分離されているPD−L2ポリペプチドの調合物を包含する。1の具体例において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は約30%(乾燥重量で)未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質、より好ましくは約20%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質、さらに好ましくは約10%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質、最も好ましくは約5%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有するPD−L2蛋白調合物を包含する。
【0140】
本明細書の用語、PD−L2ポリペプチドの「生物学的に活性のある部分」は、PD−L2分子と非PD−L2分子、例えば、PD−L2の本来のリガンド、例えばPD−1との間の相互作用に関与するPD−L2ポリペプチドのフラグメントを包含する。PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分は、PD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列、例えば配列番号:2または5に示すアミノ酸配列に対して十分に同一である、あるいはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを包含し、それは完全長のPD−L2ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、少なくとも1つのPD−L2ポリペプチドの活性を示す。典型的には、生物学的に活性のある部分は、少なくとも1つのPD−L2の活性、例えば、PD−1活性のモジュレーション活性を有するドメインまたはモチーフを含む。PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分は、例えば、25、50、75、100、125、150、175、200、225個またはそれ以上のアミノ酸の長さである。PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分を、PD−L2により媒介される活性、例えば、免疫細胞活性化をモジュレーションする作用剤の開発のための標的として使用することができる。
【0141】
1の具体例において、PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分は少なくとも細胞外ドメインの一部を含む。本発明のPD−L2ポリペプチドの好ましい生物学的に活性のある部分が、少なくとも、1の細胞外ドメイン(例えば、IgVおよび/またはIgCドメインを含む)、および1またはそれ以上の下記ドメイン:シグナルペプチドドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含んでいてもよいことが理解されるはずである。そのうえ、ポリペプチドの他の領域が欠失されている他の生物学的に活性のある部分を、組換え法により調製し、ネイティブなPD−L2ポリペプチドの1またはそれ以上の機能的活性について評価することができる。
【0142】
好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドは配列番号:2または5に示すアミノ酸配列を有し、配列番号:2または5のポリペプチドの機能的活性を保持しており、上のサブセクションIで詳述したように、自然発生的な対立遺伝子変化または突然変異によりアミノ酸配列が異なるものである。したがって、もう1つの具体例において、PD−L2ポリペプチドは、配列番号:2または5に対して少なくとも約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【0143】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントを測定するため、最適な比較を目的として配列を並置する(例、ギャップは、最適なアラインメント(並置)のために第1および第2アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、非相同性配列は比較目的に関しては無視され得る)。好ましい態様において、比較目的用に並置させたレファレンス配列の長さは、レファレンス配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、80%または90%である(例えば、第2の配列を、273個のアミノ酸残基、少なくとも82個、好ましくは少なくとも109個、より好ましくは少なくとも137個、さらにより好ましくは少なくとも164個、ずっと好ましくは少なくとも191個、218個、246個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する配列番号:2のヒトPD−L2アミノ酸配列と並置比較する場合;第2のアミノ酸配列を、247個のアミノ酸残基、少なくとも74個、好ましくは少なくとも99個、より好ましくは少なくとも124個、さらにより好ましくは少なくとも148個、ずっと好ましくは少なくとも173個、198個、222個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する配列番号:2のヒトPD−L2アミノ酸配列と並置比較する場合)。次いで、対応する位置にある残基を比較し、一配列における位置を他の配列で対応する位置と同じ残基が占めるとき、分子はその位置において同一である。2つの配列間の同一性%は、2つの配列の最適並置比較のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した上での、配列が共有する同一位置の数の関数である(本明細書で使用されているアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と均等内容である)。2つの配列の最適並置比較を行なうために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮すると、2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列が共有する同一位置の数の関数である。
【0144】
数学的アルゴリズムを用いて2つの配列間の配列の比較および同一性%の決定を行なうことができる。好ましい具体例において、GCGソフトウェアパッケージ(Genetics Computer Groupからオンラインで利用可能)中のGAPプログラム中に含まれるNeedleman and Wunschアルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:444−453 (1970))を用い、Blosum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ重量16、14、12、10、8、6、または4および長さ重量1、2、3、4、5、または6として、2つのアミノ酸配列間の同一性%が決定される。さらにもう1つの好ましい具体例において、GCGソフトウェアパッケージ(Genetics Computer Groupからオンラインで利用可能)中のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMPマトリックスを用いて、ギャップ重量40、50、60、70、または80および長さ重量1、2、3、4、5、または6として、2つのヌクレオチド配列間の同一性%が決定される。もう1つの具体例において、ALIGNプログラム(バージョン2.0または2.0U)中に含まれるMeyers, E. and Moller, W.のアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci. 4:11−17 (1988))を用い、PAM120重量残基表、ギャップ長さペナルティー12およびギャップペナルティー4を用いて、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性%が決定される。
【0145】
さらに本発明の核酸および蛋白配列を「クエリー(query)配列」として使用することにより、パブリックデータベースに対する検索が遂行され、例えば他のファミリー構成員または関連配列が同定され得る。かかる検索は、Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて遂行され得る。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12で遂行することにより、本発明のPD−L2核酸分子と相同的なヌクレオチド配列が得られる。BLAST蛋白検索を、XBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=3で遂行することにより、本発明のPD−L2ポリペプチド分子と相同的なアミノ酸配列が得られる。比較目的用のギャップトアラインメントを得るためには、Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389−3402記載の要領でギャップトBLASTが利用され得る。BLASTおよびギャップトBLASTプログラムを用いるとき、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォールトパラメーターが使用され得る。National Center for Biotechnology Informationのインターネットウェブサイト参照。
【0146】
本発明はまた、PD−L2キメラまたは融合蛋白を提供する。ここで使用されているPD−L2「キメラ蛋白」または「融合蛋白」は、非PD−L2ポリペプチドに作動可能に結合されたPD−L2ポリペプチドを含む。「PD−L2ポリペプチド」は、PD−L2ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含し、「非PD−L2ポリペプチド」は、PD−L2ポリペプチドと実質的に相同的ではない蛋白、例えばPD−L2ポリペプチドとは異なり、同一または異なる生物に由来する蛋白に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。PD−L2融合蛋白内では、PD−L2ポリペプチドは、PD−L2ポリペプチドの全部または一部に対応し得る。好ましい態様において、PD−L2融合蛋白は、PD−L2ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を有する部分を含む。もう1つの好ましい具体例において、PD−L2融合蛋白は、PD−L2ポリペプチドの少なくとも2つのドメインを含む。融合蛋白内で、「作動可能に結合された」の語は、PD−L2ポリペプチドおよび非PD−L2ポリペプチドが互いにインフレーム(in−frame)で融合されていることを示すものとする。非PD−L2ポリペプチドをPD−L2ポリペプチドのN−末端またはC−末端に融合させることができ、非PD−L2ポリペプチドはPD−L2ポリペプチドの溶解度、結合アフィニティー、安定性またはバレンシー(valency)を変化させる部分に対応する。
例えば、1の具体例において、融合蛋白は、PD−L2配列がGST配列のC末端に融合したGST−PD−L2融合蛋白である。かかる融合蛋白は、組換えPD−L2の精製を容易ならしめることができる。
【0147】
もう1つの具体例において、融合蛋白は、異種シグナル配列をN末端に含むPD−L2ポリペプチドである。ある種の宿主細胞(例えば、哺乳動物宿主細胞)において、異種シグナル配列を使用することによりPD−L2の発現および/または分泌を増加させることができる。
【0148】
好ましい具体例において、融合蛋白は、PD−L2配列がIg分子の一部分に融合したIg−PD−L2融合蛋白である。融合蛋白のIg部分は免疫グロブリン不変領域、例えば、ヒトCγ1ドメインまたはCγ4ドメイン(例えば、ヒトIgCγ1またはヒトIgCγ4ドメインのヒンジ、CH2およびCH3領域)を含むことができる(例えば、Capon et al., U.S. Patent No. 5,116,964; 5,580,756; 5,844,095等を参照、参照により本明細書に一体化させる)。得られる融合蛋白は変化したPD−L2溶解度、結合アフィニティー、安定性および/またはバレンシー(すなわち、1分子あたりの結合部位数)を有していてもよく、蛋白精製効率が高まっていてもよい。
【0149】
特に好ましいPD−L2Ig融合蛋白は、免疫グロブリン不変領域(例えば、Fc領域)とカップリングしたPD−L2の細胞外部分を含む。免疫グロブリン不変領域は、免疫グロブリン構造における固有のエフェクター活性を低下または除去する遺伝学的修飾を含んでいてもよい。例えば、PD−L2ポリペプチドの細胞外部分をコードするDNAを、例えば、WO97/28267中に教示されたように部位特異的突然変異法により修飾されたヒトIgGγ1および/またはIgGγ4のヒンジ、CH2、およびCH3領域をコードするDNAに連結することができる。
【0150】
本発明のPD−L2融合蛋白を医薬組成物中に含有させ、インビボにて対象に投与することができる。PD−L2融合蛋白を用いてPD−L2結合パートナー、例えば、PD−1の生体利用性に影響を及ぼしてもよい。PD−L2融合蛋白の使用は、免疫応答のモジュレーションにより利益を受けるであろう症状または疾病の治療に治療的に有用でありうる。
そのうえ、本発明のPD−L2融合蛋白を免疫原として用いて対象中に抗−PD−L2抗体を産生させ、PD−L2結合蛋白を精製し、スクリーニングアッセイにおいて本来の結合パートナー、例えば、PD−1との相互作用を阻害する分子を同定することができる。
【0151】
好ましくは、本発明のPD−L2キメラまたは融合蛋白は標準的な組換えDNA技術により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントが、慣用的技術によりインフレームにて一緒に連結され、例えば平滑末端またはスタガー末端を用いて連結され、制限酵素消化により適当な末端が提供され、適当な場合には付着末端がフィルイン(fill−in)され、アルカリ性ホスファターゼ処理により望ましくない連結が回避され、酵素により連結される。別の態様において、融合遺伝子を自動DNA合成装置を含む慣用的技術により合成することができる。別法として、遺伝子フラグメントのPCR増幅を、アンカープライマーを用いて実施してもよく、これにより2つの連続遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせ、次いで、アニーリング、再増幅を行なってキメラ遺伝子配列を得ることができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ:1992参照)。さらに、既に融合部分(例、GSTポリペプチドまたはHAエピトープ標識)をコードする多くの発現ベクターが市販されている。PD−L2をコードする核酸を、融合部分がPD−L2ポリペプチドにインフレームで融合されるように、かかる発現ベクター中へクローン化することができる。
【0152】
また本発明は、PD−L2アゴニスト(模倣物)またはPD−L2アンタゴニストのいずれかとして機能するPD−L2ポリペプチドの変種に関する。突然変異法、例えば、PD−L2ポリペプチドの別個の点突然変異または末端切断によりPD−L2ポリペプチドの変種を得ることができる。PD−L2ポリペプチドのアゴニストは、天然に存在する形態のPD−L2ポリペプチドと実質的に同じ生物学的活性またはその一部の活性を保持しうる。PD−L2ポリペプチドのアンタゴニストは、例えば、PD−L2ポリペプチドのPD−L2により媒介される活性を競争的にモジュレーションすることにより、天然に存在する形態のPD−L2ポリペプチドの1またはそれ以上の活性を阻害しうる。かくして、機能が限定された変種で処理することにより、特定の生物学的効果が誘発されうる。1の具体例において、天然に存在する形態のポリペプチドの生物学的活性の一部を有する変種での対象の治療は、天然に存在する形態のPD−L2ポリペプチドでの治療に比べて対象における副作用が少ない。
【0153】
1の具体例において、PD−L2アゴニスト(模倣物)としてまたはPD−L2アンタゴニストとして機能するPD−L2ポリペプチドの変異体を、PD−L2ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてPD−L2ポリペプチドの突然変異体、例えば末端切断突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。1の具体例において、PD−L2変異体の雑多なライブラリーは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異導入により生成され、雑多な(variegated)遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的に連結させることにより、PD−L2変異体の雑多なライブラリーを製造することができ、その場合、潜在的なPD−L2配列の縮重セットは、個々のポリペプチドとして発現可能であり、あるいは別法として、PD−L2配列のセットを含むより大きな融合蛋白のセットとして(例えば、ファージディスプレイ用に)発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なPD−L2変異体のライブラリーを製造するのに使用できる様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成装置で行なうことができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターに結合することができる。遺伝子の縮重セットの使用により、1の混合物中に、潜在的なPD−L2配列の目的とするセットをコードする配列がすべて提供され得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該分野で公知である(例えば、Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3、Itakuraら(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323、Itakuraら(1984)Science198:1056、Ikeら(1983)Nucleic Acid Res.11:477参照)。
【0154】
さらに、PD−L2ポリペプチドコーディング配列のフラグメントのライブラリーを用いて、PD−L2フラグメントの雑多な集団を得ることにより、PD−L2ポリペプチドの変異体をスクリーニングし、次いで、選択することができる。1の具体例において、ニッキングが1分子につき約1回だけ起こる条件下においてPD−L2をコードする配列の2本鎖PCRフラグメントを処理し、2本鎖DNAを変性させ、DNAを再生させて、異なるニック産物由来のセンス/アンチセンス対を含みうる2本鎖DNAを得て、S1ヌクレアーゼ処理により再形成された2本鎖から1本鎖部分を除去し、次いで、得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより、コーディング配列フラグメントのライブラリーを得ることができる。この方法により、様々なサイズのPD−L2ポリペプチドのN−末端、C−末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【0155】
点突然変異または末端切断により製造された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ならびに選択された特性を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該分野において知られている。上記技術は、PD−L2ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異法により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合し得る。高処理量分析が可能な、大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広範に使用されている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターへクローニングし、生成したベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換し、そして目的とする活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。再帰アンサンブル突然変異導入法(Recursive ensemble mutagenesis, REM)という、ライブラリーにおける機能性突然変異体の頻度を高める新規技術を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用することにより、PD−L2変異体を同定することができる(ArkinおよびYouvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811−7815、Delagraveら(1993)Protein Eng.6(3):327−331)。
【0156】
1の具体例において、細胞に基くアッセイを利用することにより、雑多なPD−L2ライブラリーを分析することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを細胞系中にトランスフェクションすることができる。次いで、トランスフェクションされた細胞をPD−1発現細胞と接触させ、野生型PD−L2と本来のリガンド、例えば、PD−1との相互作用による変異体の発現効果を検出することができる。次いで、PD−1によるシグナリングの阻害(T細胞アップレギュレーションを導く)あるいはPD−1によるシグナリングの強化(T細胞ダウンレギュレーションを導く)に関して評点をつけた細胞からプラスミドDNAを回収し、個々のクローンをさらに特徴づけることができる。
【0157】
天然に存するアミノ酸のみで構成されるPD−L2ポリペプチドに加えて、PD−L2ペプチド模倣物も提供される。ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの場合と類似した特性をもつ非ペプチド薬剤として製薬業界では常用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド・ミメティクス」または「ペプチド模倣物」と呼ばれ(Fauchere,J.(1986)Adv.Drug Res.15:29、Veberおよび Freidinger(1985)TINS 392頁、および Evansら、(1987)J.Med.Chem.30:1229、出典明示により本明細書の一部とする)、通常には、コンピューター化分子モデリングの助けにより開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣物を用いることにより、同等内容の治療または予防効果が生じうる。一般的に、ペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド(すなわち、生物または薬理活性を有するポリペプチド)、例えばヒトPD−L2と構造的に類似しているが、当業界では公知であり、さらに次の参考文献:Spatola,A.F.、“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins”中、Weinstein,B.編、Marcel Dekker、ニューヨーク、267(1983)、Spatola,A.F.、Vega Data(1983年3月)、第1巻、3刷、“Peptide Backbone Modifications”(レビュー)、Morley,J.S.(1980)Trends Pharm.Sci.463−468頁(レビュー)、Hudson,D.ら(1979)Int.J.Pept.Prot.Res.14:177−185(−CH2NH、CH2CH2−)、Spatola,A.F.ら(1986)Life Sci.38:1243−1249(−CH2−S)、Hann,M.M.(1982)J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.307−314(−CH−CH−、シスおよびトランス)、Almquist,R.G.ら(190)J.Med.Chem.23:1392−1398(−COCH2−)、Jennings−White,C.ら(1982)Tetrahedron Lett.23:2533(−COCH2−)、Szelke,M.ら、ヨーロッパ出願EP45665(1982)CA:97:39405(1982)(−CH(OH)CH2−)、Holladay,M.W.ら(1983)Tetrahedron Lett.(1983)24:4401−4404(−C(OH)CH2−)、および Hruby,V.J.(1982)Life Sci.(1982)31:189−199(−CH2−S−)に記載されている方法により(各々、出典明示により本明細書の一部とする)、−CH2NH−、CH2S−、−CH2−CH2−、−CH=CH−(シスおよびトランス)、−COCH2−、−CH(OH)CH2−および−CH2SO−から成る群から選択された結合によって所望により置換されていてもよい1個またはそれ以上のペプチド結合を有する。特に好ましい非ペプチド結合は−CH2NH−である。かかるペプチド模倣体は、例えば、生産性がより経済的である、化学的安定性が大きい、薬理学的特性(半減期、吸収、有効性、効力等)が高い、特異性が改変されている(例、広域スペクトルの生物活性)、抗原性が低いことなどを含め、ポリペプチド態様を凌ぐ顕著な利点を有し得る。ペプチド模倣体の標識は、直接的またはスペーサー(例、アミド基)を介して、定量的構造活性データおよび/または分子モデリングにより予測されるペプチド模倣物上の非干渉性位置(non−interfering position)への1個またはそれ以上の標識の共有結合を通常伴う。上記非干渉性位置は、一般的にペプチド模倣物が結合することにより治療効果を生じる高分子との直接接触を形成しない位置である。ペプチド模倣物の誘導体化(例えば、標識化)は、ペプチド模倣物の目的とする生物学的または薬理学的活性に実質的には干渉するものであってはならない。
【0158】
PD−L2アミノ酸配列の1個またはそれ以上のアミノ酸を同じタイプのD−アミノ酸(例、L−リジンの代わりにD−リジン)と系統的に置換する方法を用いることにより、さらに安定したペプチドが生成され得る。さらに、PD−L2アミノ酸配列または実質的に同一となる配列変化を含む束縛(constrained)ペプチドを、例えば、ペプチドを閉環する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによる、当該分野で公知の方法により、得ることができる(RizoおよびGierasch(1992)Annu.Rev.Biochem. 61:387、出典明示により本明細書の一部とする)。
【0159】
本明細書において同定されたPD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列によると、当業者であれば、PD−L2ペプチド配列およびその配列変異型に対応するポリペプチドを製造することが可能なはずである。多くの場合、PD−L2ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現により、原核生物または真核生物宿主細胞中で上記ポリペプチドが大型ポリペプチドの一部として製造され得る。別法として、上記ペプチドを化学的方法により合成することもできる。組換え宿主における異種蛋白の発現、ポリペプチドの化学合成およびインビトロ翻訳に関する方法は、当該分野でよく知られており、Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989)、第2版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、Bergerおよび Kimmel、Methods in Enzymology、152巻、Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)、アカデミック・プレス、インコーポレイテッド、サンディエゴ、カリフォルニア、Merrifield,J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91:501、Chaiken I.M.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.11:255、Kaiserら(1989)Science 243:187、Merrifield,B.(1986)Science232:342、Kent,S.B.H.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:957、および Offord,R.E.(1980)Semisynthetic Proteins、ウィリー・パブリッシング(これらは出典明示により本明細書の一部とする)にさらに詳述されている。
【0160】
典型的には、ペプチドを直接化学合成により製造することができ、例えば、PD−L2/PD−1相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして使用することができる。非ペプチド部分がN−末端および/またはC−末端への共有結合により結合している修飾ペプチドとして、ペプチドを製造することができる。ある好ましい具体例において、カルボキシ末端またはアミノ末端、またはその両方が化学的に修飾されている。末端アミノおよびカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化およびアミド化である。アミノ末端修飾、例えばアシル化(例、アセチル化)またはアルキル化(例、メチル化)およびカルボキシ末端修飾、例えばアミド化、ならびに他の末端修飾、例えば閉環は、本発明の様々な態様に組込まれ得る。ある種のアミノ末端および/またはカルボキシ末端修飾および/またはコア配列へのペプチド伸長により、有利な物理的、化学的、生化学的および薬理学的特性、例えば高い安定性、強い効力および/または有効性、血清プロテアーゼに対する耐性、望ましい薬物動態学的特性などが提供され得る。ペプチドを治療的に使用して、例えば患者における共刺激を改変することによって病気を治療することができる。
【0161】
単離されたPD−L2ポリペプチド、またはその一部もしくはフラグメント(またはかかるポリペプチドをコードする核酸分子)を免疫原として使用して、標準的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造技術を用いることによりPD−L2に結合する抗体を得ることができる。完全長PD−L2ポリペプチドを使用することもでき、あるいはまた、本発明は、免疫原として使用されるPD−L2の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。1の具体例において、PD−L2の抗原性ペプチドは、配列番号:2または5に示すアミノ酸配列の少なくとも8個のアミノ酸残基を含み、PD−L2のエピトープを含むことから、ペプチドに対して産生した抗体はPD−L2との特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも20個のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも30個のアミノ酸残基を含む。
抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、蛋白表面に位置するPD−L2の領域、例えば親水性領域、ならびに高抗原性を有する領域である。
【0162】
典型的には、PD−L2免疫原を用いて、適当な対象(例、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類)を免疫原で免疫することにより抗体が産生される。適当な免疫原性調合物は、例えば、組換え発現PD−L2ポリペプチドまたは化学合成PD−L2ペプチドを含み得る。さらにこの調合物は、アジュバント、例えばフロイント完全または不完全アジュバント、または同様の免疫刺激剤を含み得る。免疫原性PD−L2調合物で適当な対象を免疫化すると、ポリクローナル抗PD−L2抗体応答が誘導される。
【0163】
したがって、本発明のもう1つの態様は抗−PD−L2抗体に関する。本明細書の用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、PD−L2のごとき抗原と特異的に結合(免疫反応)する抗原結合部を含む分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分の例は、F(ab)およびF(ab’)2フラグメントであり、それらはペプシンのごとき酵素で抗体を処理することにより得ることができる。本発明は、PD−L2分子に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書の用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、PD−L2の特定のエピトープと免疫反応しうるたった1種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。よって、典型的には、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する特定のPD−L2ポリペプチドに対する単一の結合アフィニティーを示す。
【0164】
ポリクローナル抗PD−L2抗体を、適当な対象をPD−L2免疫原で免疫化することにより上記要領で製造することができる。免疫化対象における抗PD−L2抗体力価を、標準的技術、例えば固定化PD−L2ポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により時間経過とともにモニターすることができる。所望ならば、PD−L2ポリペプチドに対して指向した抗体分子を、哺乳類から(例えば、血液から)単離し、さらに公知技術、例えばプロテインAクロマトグラフィーにより精製すると、IgGフラクションが得られる。免疫後適当な時点で、例えば抗PD−L2抗体力価が最高であるときに、抗体産生細胞を対象から得ることができ、標準的技術、例えばKohlerおよびMilstein(1975)Nature 256:495−497により最初に報告されたハイブリドーマ技術(また、Brownら(1981)J.Immunol.127:539−46、Brownら(1980)J.Biol.Chem. 255:4980−83、Yehら(1976)Proc.Natl.Acad.Sci. 76:2927−31、および Yehら(1982)Int.J.Cancer 29:269−75も参照)、さらに最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら(1983)Immunol.Today 4:72)、EBV−ハイブリドーマ技術(Coleら(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、アラン R.リス、インコーポレイテッド、77−96頁)またはトリオーマ技術によるモノクローナル抗体の製造に使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマ製造技術は公知である(一般的には、Kenneth,R.H.、Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses、プレナム・パブリッシング・コーポレーション、ニューヨーク、ニューヨーク(1980)、Lerner,E.A.(1981)Yale J.Biol.Med.54:387−402、Gefter,M.L.ら(1977)Somatic Cell Genet.3:231−36参照)。簡単に述べると、不死細胞系(典型的にはミエローマ)を、上記要領でPD−L2免疫原で免疫した哺乳類由来のリンパ球(典型的には脾臓細胞)に融合させ、生成したハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、PD−L2に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【0165】
リンパ球および不死化細胞系の融合に用いられる多くの公知プロトコルのいずれかを、抗PD−L2モノクローナル抗体産生目的に適用することができる(例えば、Galfre,G.ら(1977)Nature 266:55052、Gefterら(1977)前出、Lerner(1981)前出、Kenneth(1980)前出参照)。さらに、当業者にとって、同様に有用である上記方法の多くの変法があることは明らかである。典型的には、不死細胞系(例、骨髄種細胞系)は、リンパ球と同じ種の哺乳類に由来する。例えば、ネズミハイブリドーマは、本発明の免疫原性調合物により免疫化したマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞系と融合させることにより製造され得る。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地(「HAT培地」)に感受性を示すマウスミエローマ細胞系である。若干の骨髄種細胞系を標準的技術による融合相手として使用することができ、例えばP3−NS1/1−Ag4−1、P3−x63−Ag8.653またはSp2/O−Ag14骨髄種系がある。これらの骨髄種系は、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手可能である。典型的には、HAT感受性マウス骨髄種細胞を、ポリエチレングリコール(「PEG」)を用いてマウス脾臓細胞に融合させる。次いで、融合から生成したハイブリドーマ細胞はHAT培地を用いて選択し、この場合、非融合および非生産的融合骨髄種細胞は死滅する(非融合脾臓細胞は、形質転換されていないため数日後に死滅する)。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISAアッセイを用いて、PD−L2分子と結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
PD−L2に結合する抗体のさらなる製造方法を実施例4および5において説明する。
【0166】
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ製造のための別法として、PD−L2を伴う組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例、抗体ファージディスプレーライブラリー)のスクリーニングによって、PD−L2ポリペプチドと結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより、モノクローナル抗−PD−L2抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレーライブラリーを作成し、スクリーニングするキットは市販されている(例えば、ファルマシア・レコンビナント・ファージ・アンチボディー・システム、カタログ番号27−9400−01、およびストラタジーンSurfZAP(商標)ファージ・ディスプレー・キット、カタログ番号240612)。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作成およびスクリーニングにおいて特に使用しやすい方法および試薬の例は、例えばLadnerら、米国特許第5223409号、Kangら、国際公開番号WO92/18619、Dowerら、国際公開番号WO91/17271、Winterら、国際公開WO92/20791、Marklandら、国際公開番号WO92/15679、Breitlingら、国際公開WO93/01288、McCaffertyら、国際公開番号WO92/01047、Garrardら、国際公開番号WO92/09690、Ladnerら、国際公開番号WO90/02809、Fuchsら(1991)Biotechnology(NY)9:1369−1372、Hayら(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81−85、Huseら(1989)Science246:1275−1281、Griffithsら(1993)EMBO J. 12:725−734、Hawkinsら(1992)J.Mol.Biol.226:889−896、Clarksonら(1990)Nature352:624−628、Gramら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576−3580、Garrardら(1991)Biotechnology(NY)9:1373−1377、Hoogenboomら(1991)Nucleic Acids Res.19:4133−4137、Barbasら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978−7982、および McCaffertyら(1990)Nature348:552−554において見出され得る。
【0167】
さらに、組換え抗PD−L2抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含み、標準的組換えDNA技術を用いて製造され得るものであり、本発明の範囲内に包含される。上記キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えばRobinsonら、国際特許公開PCT/US86/02269、Akiraら、欧州特許出願第184187号、Taniguchi,M.、欧州特許出願第171496号、Morrisonら、欧州特許出願第173494号、Neubergerら、PCT出願WO86/01533、Cabillyら、米国特許第4816567号、Cabillyら、欧州特許出願第125023号、Betterら(1988)Science 240:1041−1043、Liuら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439−3443、Liuら(1987)J.Immunol. 139:3521−3526、Sunら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci. 84:214−218、Nishimuraら(1987)Cancer Res.47:999−1005、Woodら(1985)Nature 314:446−449、およびShawら(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553−1559、Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202−1207、Oiら(1986)Biotechniques 4:214、Winter 米国特許5225539、Jonesら(1986)Nature 321:552−525、Verhoeyanら(1988)Science 239:1534、およびBeidlerら(1988)J.Immunol.141:4053−4060に記載された方法を用いることにより、当該分野で公知の組換えDNA技術により製造され得る。
【0168】
抗−PD−L2抗体(例、モノクローナル抗体)を用いて、標準的技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によりPD−L2ポリペプチドを単離することができる。抗−PD−L2抗体により、細胞からの天然PD−L2ポリペプチド、および宿主細胞において発現される遺伝的組換えにより製造されたPD−L2ポリペプチドの精製は容易になり得る。そのうえ、抗−PD−L2抗体を用いて、PD−L2ポリペプチドを検出(例えば、細胞溶解物または細胞上清において)することができる。抗−PD−L2抗体を臨床試験手順の一部として診断的に用いて、組織中のポリペプチドレベルをモニターすることができ、例えば、特定の治療の有効性を調べることができる。検出可能な物質に抗体をカップリング(すなわち、物理的結合)させることにより検出は容易になり得る。従って、1の具体例において、本発明の抗PD−L2抗体は、検出可能な物質により標識される。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス(発光)物質および放射性物質がある。適当な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼがあり、適当な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンがあり、適当な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンがあり、ルミネセンス物質の例にはルミノールがあり、そして適当な放射性物質の例には125I、131I、35Sおよび3Hがある。
【0169】
III.組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう1つの態様は、PD−L2ファミリーの蛋白(またはその一部分)をコードする核酸分子を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。ここで使用されている「ベクター」の語は、それに結合されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を包含する。ベクターの1のタイプは「プラスミド」であり、付加的DNAセグメントが連結され得る環状二本鎖DNAループを包含する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、その場合、付加的DNAセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製し得る(例えば、細菌性複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ組込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に結合されている遺伝子の発現を指令し得る。上記ベクターは、ここでは「発現ベクター」と称される。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが多い。本明細書の場合、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから、「プラスミド」および「ベクター」は混用され得る。しかしながら、本発明は、かかる他の形態の発現ベクターであって同様の機能を果たすもの、例えばウイルスベクター(例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を包含する。
【0170】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基いて選択された1つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味するもので、調節配列は、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結されている」は、興味の対象であるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の(例えば、インビトロ転写/翻訳系における、またはベクターが宿主細胞へ導入されたとき宿主細胞における)発現を可能にする状態で調節配列(複数も可)に連結されていることを意味する。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を包含する。上記調節配列は、例えば Goeddel(1990)Methods Enzymol.185:3−7に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するものおよびある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの(例、組織特異的調節配列)がある。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、目的蛋白の発現レベルなどの因子により異なり得ることを認識するはずである。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載されたように(例えば、PD−L2ファミリーの蛋白、変異形態のPD−L2蛋白、融合蛋白など)、核酸によりコードされる融合蛋白またはペプチドを包含する蛋白またはペプチドを得ることができる。
【0171】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞におけるPD−L2ポリペプチドの発現を目的として設計され得る。例えば、PD−L2ポリペプチドは、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ(E.coli)、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを用いる)、酵母細胞または哺乳類細胞において発現され得る。適当な宿主細胞については、前出のGoeddel(1990)でさらに検討されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳され得る。
【0172】
原核生物における蛋白の発現を、融合または非融合蛋白の発現を指令する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターによりエシェリシア・コリ(E.coli)において行なうことが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされた蛋白に若干のアミノ酸を、通常には組換え蛋白のアミノ末端に付加する。上記融合ベクターは、典型的には、1)組換え蛋白の発現を高める、2)組換え蛋白の溶解性を高める、および3)アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換え蛋白の精製で有用である、といった3つの目的に適うものである。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、蛋白分解性開裂部位が融合部分および組換え蛋白の接合点に導入されることにより、融合蛋白の精製後に組換え蛋白を融合部分から分離することが可能となる。上記酵素およびそれらの同族認識配列には、因子Xa、トロンビンおよびエンテロキナーゼがある。典型的融合発現ベクターには、pGEX(ファルマシア・バイオテク・インコーポレイテッド、Smith,D.B.および Johnson,K.S.(1988)Gene67:31−40)、pMAL(ニューイングランド・バイオラブズ、ベヴァリー、マサチューセッツ)およびpRIT5(ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)があり、それぞれグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合蛋白またはプロテインAを標的組換え蛋白に融合させる。
精製融合蛋白は、PD−L2活性アッセイ(例、下記で詳述されている直接アッセイまたは競争的アッセイ)に、あるいは例えばPD−L2ポリペプチドに特異的な抗体の生成に使用され得る。好ましい具体例において、本発明のレトロウイルス発現ベクター中で発現されたPD−L2融合蛋白を用いて骨髄細胞に感染させ、次いで、それを放射線照射されたレシピエント中に移植する。次いで、十分時間(例えば、6ヶ月)経過後、対象レシピエントの病状を調べる。
【0173】
適当な誘導性非融合エシェリシア・コリ(E.coli)発現ベクターの例には、pTrc(Amannら(1988)Gene69:301−315)およびpET11d(Studierら(1990)Methods Enzymol.185:60−89)がある。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp−lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存する。pET11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルス性RNAポリメラーゼ(T7gn1)が介在するT7gn10−lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、lacUV5プロモーターの転写制御下T7gn1遺伝子をもつ内在プロファージから宿主株BL21(DE3)またはHMS174(DE3)により供給される。
【0174】
エシェリシア・コリ(E.coli)における組換え蛋白発現を最大化させる1の戦略は、蛋白分解的に組換え蛋白を開裂する能力が損なわれた宿主細菌において蛋白を発現させることである(Gottesman,S.(1990)Methods Enzymol.185:119−128)。別の戦略は、発現ベクターへ挿入される核酸の核酸配列を改変することにより、各アミノ酸に関する個々のコドンが優先的にエシェリシア・コリ(E.coli)で利用されるものとなるようにする方法である(Wadaら(1992)Nucleic Acids Res.20:2111−2118)。本発明の核酸配列の上記改変は、標準的なDNA合成技術により実施され得る。
【0175】
もう1つの具体例において、PD−L2発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母S.cerevisiaeにおいて発現するベクターの例には、pYepSec1(Baldariら(1987)EMBO J.6:229−234)、pMFa(KurjanおよびHerskowitz(1982)Cell30:933−943)、pJRY88(Schultzら(1987)Gene54:113−123)、pYES2(インビトロゲン・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア)およびpicZ(インビトロゲン・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア)がある。
【0176】
別法として、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞においてPD−L2ポリペプチドを発現させることができる。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)における蛋白発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、pAcシリーズ(Smithら(1983)Mol.Cell Biol.3:2156−2165)およびpVLシリーズ(Lucklow,V.A.および Summers,M.D.(1989)Virology170:31−39)がある。
【0177】
さらに別の具体例において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例には、pMex−NeoI、pCDM8(Seed,B.(1987)Nature329:840)およびpMT2PC(Kaufmanら(1987)EMBO J.6:187−195)がある。哺乳類細胞で使用する場合には、発現ベクターの制御機能がウイルス調節エレメントにより提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40から誘導される。原核生物および真核生物の両細胞に関する他の適当な発現系については、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)の16および17章参照。
【0178】
もう1つの具体例において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を指令し得る(例、組織特異的調節エレメントは核酸の発現に使用される)。組織特異的調節エレメントは当業界では公知である。適当な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター(肝臓特異的、Pinkertら(1987)Genes Dev.1:268−277)、リンパ特異的プロモーター(Calameおよび Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235−275)、特にT細胞受容体プロモーター(Winotoおよび Baltimore(1989)EMBO J.8:729−733)および免疫グロブリン(Banerjiら(1983)Cell33:729−740、Queenおよび Baltimore(1983)Cell33:741−748)、ニューロン特異的プロモーター(例、ニューロフィラメントプロモーター、Byrneおよび Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473−5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlundら(1985)Science 230:912−916)、および乳腺特異的プロモーター(例、乳漿プロモーター、米国特許第4873316号およびヨーロッパ出願公開第264166号)がある。また、発達的調節(developmentally−regulated)プロモーター、例えばネズミホックス(hox)プロモーター(Kesselおよび Gruss(1990)Science249:374−379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campesおよび Tilghman(1989)Genes Dev.3:537−546)も包含される。
【0179】
さらに本発明は、アンチセンス方向で発現ベクター中にクローン化された本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、DNA分子は、PD−L2 mRNAに対してアンチセンスであるRNA分子の発現(DNA分子の転写による)を可能にする形で調節配列に作動可能に結合されている。アンチセンス方向でクローン化された核酸に作動可能に結合された調節配列であって、様々な細胞タイプにおけるアンチセンスRNA分子の連続発現を指令するもの、例えばウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサー、あるいはアンチセンスRNAの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を指令する調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で製造される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルス形態であってもよく、その活性はベクターが導入されている細胞タイプにより決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節を検討したものについては、Weintraub,H.ら(1986)“Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis”Reviews−Trends in Genetics、第1巻(1)を参照。
【0180】
本発明のもう1つの態様は、本発明のPD−L2核酸分子、例えば、組換え発現ベクター中のPD−L2核酸分子、あるいは宿主細胞のゲノムの特異部位中に相同組換えが起こるようにする配列を含むPD−L2核酸分子が導入されている宿主細胞に関するものである。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」の語は、本明細書で混用される。上記の語は特定対象細胞だけでなくかかる細胞の子孫または潜在的子孫も包含するものと理解すべきである。突然変異または環境的影響故にある種の修飾が後続の世代で行われ得るため、上記子孫は事実上親細胞と同一ではないかもしれないが、依然としてここで使用されている語の範囲内に包含される。
【0181】
宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。例えば、PD−L2ポリペプチドは、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ(E.coli)、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞(例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)またはCOS細胞)で発現され得る。他の適当な宿主細胞も当業者に公知である。
【0182】
ベクターDNAは、慣用的形質転換またはトランスフェクション技術により原核生物または真核生物細胞中に導入され得る。ここで使用されている「形質転換」および「トランスフェクション」の語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション(脂質小胞を介する遺伝子導入)または電気穿孔を含め、外来核酸(例、DNA)を宿主細胞へ導入するための様々な当業界公認の技術を包含する。宿主細胞の適当な形質転換またはトランスフェクション方法は、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1989)、および他の研究室マニュアルに見出され得る。
【0183】
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションを行うために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小フラクションのみが外来DNAをそれらのゲノム中に組み込まれうることが知られている。これらの成分を同定および選択するために、選択マーカー(例、抗生物質に対する耐性)をコードする遺伝子を、一般的に興味の対象である遺伝子と一緒に宿主細胞へ導入する。好ましい選択マーカーには、薬剤、例えばG418、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートに対する耐性を付与するものがある。選択マーカーをコードする核酸を、PD−L2ポリペプチドをコードするものと同じベクターで宿主細胞へ導入することができ、あるいは別々のベクターで導入することができる。導入された核酸により安定してトランスフェクションされた細胞を薬剤選別により同定することができる(例えば、選択マーカー遺伝子が組込まれた細胞は生残り、他の細胞は死滅する)。
【0184】
本発明の宿主細胞、例えば培養された原核生物または真核生物宿主細胞を、PD−L2ポリペプチドの製造(すなわち発現)に使用することができる。従って、本発明は、さらに本発明の宿主細胞を用いたPD−L2ポリペプチドの製造方法を提供する。1の具体例において、PD−L2ポリペプチドが製造されるように、本発明の宿主細胞(PD−L2ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された)を適当な培養培地で培養することを含む。別の具体例において、前記方法はさらに、培地または宿主細胞からのPD−L2ポリペプチドの単離を含む。
【0185】
ある種の宿主細胞を用いて、ヒト以外のトランスジェニック動物を製造することもできる。例えば、1の具体例において、宿主細胞は、PD−L2コーディング配列が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、上記宿主細胞を用いることにより、外来性PD−L2配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物あるいは内在性PD−L2配列が改変された相同的組換え動物が製造され得る。上記動物は、PD−L2ポリペプチドの機能および/または活性を研究ならびにPD−L2活性のモジュレーターを同定および/または評価するのに有用である。ここで使用されている「トランスジェニック動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはげっ歯動物、例えばラットまたはマウスであり、この場合動物の細胞の1個またはそれ以上が導入遺伝子(トランスジーン)を含んでいる。トランスジェニック動物の他の例には、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニワトリ、両生類などがある。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組込まれており、成熟動物のゲノムに残存している外性DNAであり、それによってトランスジェニック動物の1種またはそれ以上の細胞タイプまたは組織におけるコードされた遺伝子産物の発現が指令される。ここで使用されている「相同的組換え動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスであり、この場合内在性PD−L2遺伝子は、動物の発生前に、動物の1の細胞、例えば動物の胚性細胞へ導入された内在性遺伝子および外来性DNA分子間の相同的組換えにより改変されている。
【0186】
トランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により、PD−L2をコードする核酸分子を受精卵母細胞の雄性前核へ導入し、偽妊娠した雌フォスター(養育)動物において卵母細胞を発達させることによりトランスジェニック動物を製造することができる。配列番号1または4のPD−L2 cDNA配列を、非ヒト動物のゲノムへ導入遺伝子として導入することができる。別法として、ヒトPD−L2遺伝子の非ヒトホモログ、例えばマウスまたはラットPD−L2遺伝子を導入遺伝子として使用することができる。別法として、PD−L2遺伝子ホモログ、例えば別のPD−L2ファミリーのメンバーを、配列番号1、3、4または6のPD−L2 cDNA配列とのハイブリダイゼーションに基いて単離し(さらに上記サブセクションIで詳記されている)、導入遺伝子として使用することができる。また、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを導入遺伝子に含ませることにより、導入遺伝子の発現効率を高ることができる。組織特異的調節配列(複数も可)は、PD−L2導入遺伝子に作動可能に連結されることにより、特定細胞に対してPD−L2ポリペプチドの発現を指令し得る。胚マニピュレーションおよびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物、特に例えばマウスといった動物の製造方法は、当業界では既に慣用的なものになっており、例えば、両方ともLederらによる米国特許第4736866号および同4870009号、Wagnerらによる米国特許第4873191号および Hogan,B. Manipulating the Mouse Embryo(コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1986)で報告されている。他のトランスジェニック動物の製造には類似方法も使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおけるPD−L2導入遺伝子の存在および/または動物の組織または細胞におけるPD−L2 mRNAの発現に基いて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物を用いることにより、導入遺伝子を有する動物が追加的に産み出され得る。さらに、PD−L2ポリペプチドをコードする導入遺伝子をもつトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子をもつ他のトランスジェニック動物へとさらに繁殖され得る。
【0187】
相同組換え動物を作製するために、PD−L2遺伝子の少なくとも一部分を含むもので、そこに欠失、付加または置換が導入されていることによりPD−L2遺伝子が改変、例えば機能的に崩壊されているベクターを製造する。PD−L2遺伝子はヒト遺伝子(例えば、配列番号1または3)であり得るが、さらに好ましくはヒトPD−L2遺伝子の非ヒト相同体である(例えば、配列番号1、3、4または6のヌクレオチド配列とのストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離されたcDNA)。例えば、マウスPD−L2遺伝子(例えば、配列番号:3または配列番号:6のcDNA)を用いることにより、マウスゲノムにおいて内在性PD−L2遺伝子を改変するのに適した相同組換えベクターを構築することができる。好ましい具体例において、相同組換えが起こると内在性PD−L2遺伝子が機能崩壊されるようにベクターが設計される(すなわち、もはや機能性蛋白をコードしない、「ノックアウト」ベクターとも称される)。別法として、相同組換えが起こると内在性PD−L2遺伝子は突然変異誘発または他の形で改変されるが、依然として機能性蛋白をコードするようにベクターが設計され得る(例えば、上流調節領域を改変することにより、内在性PD−L2ポリペプチドの発現が改変され得る)。相同的組換えベクターでは、PD−L2遺伝子の改変部分の5’および3’両末端にPD−L2遺伝子の付加的核酸配列が隣接していることにより、ベクターが担持する内在性PD−L2遺伝子と胚性幹細胞中の内在性PD−L2遺伝子との間で相同組換えが行われ得る。付加的な隣接PD−L2核酸配列は、内在性遺伝子との有効な相同的組換えにとって充分な長さを有する。典型的には、数キロベースのフランキングDNA(5’および3’の両末端)がベクターに含まれている(例えば、相同的組換えベクターの記載については、Thomas,K.R.および Capecchi,M.R.(1987)Cell51:503参照)。ベクターは胚性幹細胞系中に(例えば、電気穿孔により)導入され、導入されたPD−L2遺伝子が内在性PD−L2遺伝子と相同的に組換えられている細胞が選択される(例えば、Li,E.ら(1982)Cell69:915参照)。次いで、選択された細胞は動物(例、マウス)の未分化胚芽細胞中に注入され、凝集キメラが形成される(例えば、Bradley,A.、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、Robertson,E.J.編(IRL、オクスフォード、1987)113−152頁参照)。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌養育(フォスター)動物へ移植し、胚を分娩させ得る。生殖細胞中に相同的組換えDNAをもつ子孫を用いることにより、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的組換えDNAを含む動物が産み出され得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Bradley,A.(1991)Curr.Opin.Biotechnol.2:823−829および Le MouellecらによるPCT国際公開第WO90/11354号、Smithiesらによる同第WO91/01140号、Zijlstraらによる同第WO92/0968号、および Bernsらによる同第WO93/04169号に詳述されている。
【0188】
もう1つの具体例において、導入遺伝子の発現調節を可能にすべく選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が製造され得る。かかる系の一例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である。cre/loxPリコンビナーゼ系の記述については、例えば Laksoら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6232−6236参照。リコンビナーゼ系の別の例は、Saccharomyces cerebvisiaeのFLPリコンビナーゼ系である(O’Gormanら(1991)Science251:1351−1355)。cre/loxPリコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Creリコンビナーゼおよび選択された蛋白の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が要求される。上記動物は、例えば、一方は選択された蛋白をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む2種のトランスジェニック動物を交配させることにより、「二重」トランスジェニック動物の構築により提供され得る。
【0189】
また、ここに記載されているヒト以外のトランスジェニック動物のクローンを、Wilmut,I.ら(1997)Nature385:810−813およびPCT国際公開第WO97/07668号および同第WO97/07669号記載の方法により製造することができる。簡単に述べると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、成長周期を脱してG0期へ入るように誘導することができる。次いで、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞を、静止細胞が単離されたのと同種の動物に由来する除核卵母細胞と融合させることができる。次いで、再構築された卵母細胞を培養して桑実胚または芽細胞にまで発達するようにし、次いで、偽妊娠した雌フォスター動物に移す。この雌フォスター動物から生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンとなる。
【0190】
IV.医薬組成物
本発明のPD−L2分子、例えば、PD−L2核酸分子、PD−L2ポリペプチドのフラグメントおよび抗−PD−L2抗体(本明細書において「活性化合物」または「モジュレーション作用剤」ともいう)を、投与に適した医薬組成物に含有させることができる。上記組成物は、典型的には核酸分子、蛋白または抗体および医薬的に許容される担体を含む。ここで使用されている「医薬的に許容される担体」の語は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などをすべて包含するものとする。医薬活性物質に関する上記媒質および薬剤の使用については当該分野では公知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物中におけるその使用が考えられる。補足的な活性化合物を組成物中に含有させることもできる。
【0191】
本発明医薬組成物は、意図されたその投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例、吸入)、経皮(局所)、経粘膜および直腸投与がある。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、次の成分:滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび等張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムによりpHを調節することができる。非経口製剤を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器またはマルチプルドーズバイアル(multiple dose vial)に封入することができる。
【0192】
注射可能用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液をその場で製造するための滅菌粉末が含まれ得る。静脈内投与の場合、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォーEL(商標)(BASF、パーシッパニー、ニュージャージー)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)がある。どの場合も、組成物は無菌状態でなくてはならず、容易に注射できる程度には流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)を含む溶媒または分散液媒質およびその適当な混合物であり得る。例えば、レシチンのごときコーティングの使用により、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成され得る。 必要ならば上記成分の1つまたは組み合わせとともに所望量の適当な溶媒に活性化合物(例えば、PD−L2核酸分子、PD−L2ポリペプチドのフラグメント、抗−PD−L2抗体、または抗−PD−L2抗体と抗−PD−1抗体との組み合わせ)を含ませて、次いで、濾過滅菌することにより、滅菌注射可能溶液を調製することができる。一般的には、塩基性分散媒質および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌賦形剤中に活性化合物を含ませることにより分散液を製造する。滅菌注射可能溶液製造用滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過しておいたその溶液から有効成分に加えて所望の追加的成分からなる粉末を得ることができる。
【0193】
一般的には、経口組成物は不活性希釈剤または可食性担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入、あるいは錠剤に圧縮成型することができる。経口治療投与を目的とする場合、活性化合物は賦形剤と混合され、錠剤、トローチまたはカプセル形態で使用され得る。口内洗浄剤として使用される流動担体を用いて経口組成物を製造することもでき、流動担体中の化合物は経口適用され、スイッシュ(swish)され、吐き出されるかまたは嚥下される。医薬的に適合し得る結合剤、および/またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記成分のいずれか、または似た性質の化合物:結合剤、例えば微晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン、賦形剤、例えば澱粉または乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス(Sterotes)、滑剤、例えばコロイド状二酸化珪素、甘味剤、例えばしょ糖またはサッカリン、または香味料、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料を含み得る。
【0194】
吸入投与の場合、化合物は、適当な推進剤、例えば気体、例えば二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態でデリバリーされる。
【0195】
全身投与を経粘膜または経皮手段で行なってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤を製剤中に使用する。上記浸透剤は一般的に当業界では公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を包含する。鼻用スプレーまたは坐薬の使用により経粘膜投与を行なうことができる。経皮投与の場合、当該分野で一般的に知られているように、活性化合物を軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームとして製剤化する。
化合物を直腸デリバリー用の坐薬(例、慣用的坐薬基剤、例えばカカオバターおよび他のグリセリド類による)または停留浣腸形態として調合することもできる。
【0196】
1の具体例において、活性化合物は、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調合され、例えばインプラントおよびマイクロカプセル封入デリバリー系を包含する除放性製剤がある。生物分解性、生物適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。上記製剤の製造方法は、当業者に明らかであろう。これらの材料を、アルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッドから購入することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含む)を医薬的に許容され得る担体として使用することもできる。例えば米国特許第4522811号に記載されたような当業者に公知の方法に従ってこれらを調合することができる。
投与し易く用量を均一にするために単位用量形態で経口または非経口組成物を製剤するのは特に有利である。本明細書で使用されている単位用量形態とは、処置される対象にとって単位用量として適する物理的に独立した単位を包含しており、各単位は必要とされる医薬用担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性化合物を含むものをいう。本発明の単位用量形態に関する詳細は、活性化合物特有の特徴および達成すべき特定治療効果、および個体の処置を目的としたかかる活性化合物調合の当該分野における制限に直接的に左右される。
【0197】
上記化合物の毒性および治療効率を細胞培養物または実験動物における標準製薬方法により測定して、例えば、LD50(集団の50%に対する致死用量)およびED50(集団の50%における治療有効量)を決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物を使用してもよい場合、かかる化合物を罹病組織の部位に標的化させるデリバリーシステムを設計して、未感染細胞に対する潜在的ダメージを最小化し、そのことにより副作用を減らすように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトで使用するための範囲の用量を製剤化するために用いることができる。好ましくは、かかる化合物の用量は、毒性を全くまたはほとんど伴わないED50値を包含する循環濃度の範囲内である。使用される用量形態および使用される投与経路に応じて用量をこの範囲内で変化させてもよい。本発明方法で使用される化合物の場合、先ず、細胞培養アッセイから治療有効量を評価することができる。用量を動物モデルで製剤化することにより、細胞培養で測定されたIC50(すなわち、徴候の半−最大阻害を達成する試験化合物の濃度)をを包含する循環血漿濃度範囲が得られる。上記情報を使用することにより、ヒトにおける有用な用量をより正確に測定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【0198】
本明細書で定義するように、蛋白またはポリペプチドの治療上有効量(すなわち、有効用量)は、体重1kgあたり約0.001ないし30mg、好ましくは体重1kgあたり約0.01ないし25mg、より好ましくは体重1kgあたり約0.1ないし20mg、さらにより好ましくは体重1kgあたり約1ないし10mg、2ないし9mg、3ないし8mg、4ないし7mg、5ないし6mgの範囲である。疾病または疾患の重さ、以前受けていた治療、対象の一般的健康状態および/または年齢、ならびに存在する他の疾病(これらに限らない)を包含する特定の因子が、対象を有効に治療するために必要な容量に影響する可能性があることを、当業者は理解するであろう。そのうえ、治療上有効量の蛋白、ポリペプチド、あるいは抗体での対象の治療は、単一回の治療を包含しうるが、好ましくは一連の治療を包含しうる。
【0199】
好ましい例において、体重1kgあたり約0.1ないし20mgの範囲の抗体、蛋白またはポリペプチドで、1週間に1回、約1ないし10週間にわたり、好ましくは2ないし8週間にわたり、より好ましくは約3ないし7週間、さらにより好ましくは約4、5または6週間にわたり対象を治療する。治療に使用される抗体、蛋白またはポリペプチドの有効量を個々の治療コースに応じて増加または減少させてもよいことも理解されよう。用量の変更は、本明細書記載の診断アッセイの結果によるものであり、該アッセイから明白なものとなる。
【0200】
本発明は、PD−L2の発現または活性をモジュレーションする作用剤を包含する。例えば、作用剤は小型分子であってもよい。例えば、かかる小型分子は、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、1モルあたり約10000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を包含)、1モルあたり約5000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約1000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびに塩、エステル、ならびに医薬上許容される形態のかかる化合物等であるが、これらに限らない。小型分子の適当な用量は当業者、獣医、または研究者の知識の範囲内の多くの因子に依存することが理解される。小型分子の用量は、例えば、治療すべき対象またはサンプルの同一性、サイズ、および状態に依存するであろうし、さらに、適用可能な場合には組成物が投与される経路、本発明の核酸またはポリペプチドにより得られる医師が望む小型分子の効果にも依存するであろう。
【0201】
典型的な用量は、対象またはサンプルの体重1kgあたりミリグラムまたはマイクログラム量の小型分子(例えば、1kgあたり約1マイクログラムないし約500ミリグラム、1kgあたり約100マイクログラムないし約5ミリグラム、1kgあたり約1マイクログラムないし約50マイクログラム)である。小型分子の用量は、モジュレーションすべき発現または活性に関する小型分子の有効性に依存することがさらに理解される。本明細書記載のアッセイを用いてかかる適当な用量を決定してもよい。1またはそれ以上のこれらの小型分子を動物(例えば、ヒト)に投与して本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性をモジュレーションしようとする場合、医師、獣医、または研究者は、先ず比較的低用量を処方し、次いで、適当な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。さらに、個々の動物対象に関する個々のレベルは、使用される個々の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事療法、投与期間、投与経路、排泄速度、併用薬剤、ならびにモジュレーションすべき発現または活性の程度を包含する種々の因子に依存するであろうことが理解される。
【0202】
さらに、抗体(またはそのフラグメント)を、サイトトキシン、治療剤または放射性金属イオンのごとき治療部分に抱合させてもよい。サイトトキシンまたは細胞毒性作用剤は細胞に損傷を与える薬剤を包含する。例は、トクソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポサイド、テノポサイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイsンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プイロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロールおよびプロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログを包含する。治療剤は、アンチメタボライト(例えば、メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオペアクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU) および ロムスチン(CCNU)、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、および白金(II)cis−ジクロロジアミン(DDP)シスプラチン)、アンスラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシンと呼ばれた)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシンと呼ばれた)、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアンスラマイシン(AMC))、ならびに抗−分裂剤(例えば、ブンクリスチンおよびビンブラスチン)を包含するが、これらに限らない。
【0203】
本発明の抱合体を用いてある種の生物学的応答を修飾することができ、その薬剤部分は古典的な化学療法剤に限らない。例えば、薬剤部分は消耗生物学的活性を有する蛋白またはポリペプチドであってもよい。かかるポリペプチドは、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素またはジフテリアトキシンのごときトキシン;腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベーターのごとき蛋白;あるいは例えばリンホカイン、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−6(IL−6)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)または他の成長因子のごとき生物学的応答修飾剤を包含する。
【0204】
かかる治療部分を抗体に抱合させる方法はよく知られており、例えば、Arnon et al., ”Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243−56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., ”Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623−53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, ”Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475−506 (1985); ”Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303−16 (Academic Press 1985); および Thorpe et al. ”The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody−Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62:119−58 (1982)参照。別法として、米国特許第4676980号においてSegalにより記載されたように、抗体を第2の抗体に抱合させて抗体ヘテロ抱合体を得てもよい。
【0205】
本発明核酸分子をベクター中に挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。例えば静脈内注射、局所投与(米国特許5328470参照)または定位注射(例えば Chenら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054−3057参照)により遺伝子治療ベクターを対象にデリバリーすることができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される希釈液中に遺伝子治療ベクターを含んでいてもよく、あるいは遺伝子デリバリービークルが埋封された遅速放出マトリックスを含んでいてもよい。別法として、完全な遺伝子デリバリーベクターを組換え細胞から無傷で製造できる場合(例えば、レトロウイルスベクター)、医薬製剤は遺伝子デリバリー系を生産する1個またはそれ以上の細胞を含んでいてもよい。
医薬組成物を投与に関する使用説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサー中に入れることができる。
【0206】
V.本発明の用途および方法
PD−L2分子、例えば、本明細書記載のPD−L2核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチドホモログ、および抗体を下記方法の1つまたはそれ以上に使用することができる:a)スクリーニングアッセイ;b)予測医学(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験のモニタリング);ならびにc)治療方法(例えば、免疫応答をアップまたはダウンレギュレーションすることによる治療方法および予防方法)。本明細書に記載のように、本発明のPD−L2ポリペプチドは下記活性の1つまたはそれ以上を有する:1)本来の結合パートナー、例えばPD−1に結合し、そして/あるいはその活性をモジュレーションする、2)細胞内または細胞間シグナリングをモジュレーションする、3)Tリンパ球の活性化をモジュレーションする、4)生物、例えば、マウスまたはヒトのごとき哺乳動物の免疫応答をモジュレーションする。
【0207】
本発明の単離核酸分子を用いて、例えば、本明細書においてさらに後で説明するように、PD−L2ポリペプチドを発現させ(例えば、遺伝子治療用途において宿主細胞中の組換え発現ベクターにより)、PD−L2 mRNA(例えば、生物学的試料中の)またはPD−L2遺伝子における遺伝学的変化を検出し、PD−L2活性をモジュレーションすることができる。PD−L2ポリペプチドを用いて、PD−L2ポリペプチドの不十分または過剰な発現あるいはPD−L2阻害剤の産生により特徴付けられる症状または疾病を治療することができる。さらに、PD−L2ポリペプチドを用いて、天然に存在するPD−L2結合パートナー(PD−1のほかに)をスクリーニングし、PD−L2活性をモジュレーションする薬剤または化合物をスクリーニングし、PD−L2ポリペプチドの不十分または過剰な産生あるいはPD−L2野生型ポリペプチドと比較して低下した、異常なまたは望ましくない活性を有するPD−L2ポリペプチド形態の産生により特徴づけられる症状または疾病(例えば、重篤な合併免疫不全、多発性硬化症、全身性狼瘡、I型糖尿病、リンパ球増殖症候群、炎症性腸疾患、アレルギー、喘息、移植片対宿主疾患および移植拒絶反応のごとき免疫系疾患;細菌およびウイルスのごとき感染性病原体に対する免疫応答;ならびにリンパ腫および白血病のごとき免疫系の癌)を治療することができる。そのうえ、本発明の抗−PD−L2抗体を用いてPD−L2ポリペプチドを検出および単離し、PD−L2ポリペプチドの生体利用性を調節し、例えばPD−L2とその本来の結合パートナー(例えば、PD−1)との間の相互作用をモジュレーションすることによりPD−L2活性をモジュレーションすることができる。
【0208】
A.スクリーニングアッセイ
本発明は、PD−L2ポリペプチドに結合し、例えば、PD−L2発現またはPD−L2活性に刺激または阻害効果を有し、あるいはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との間の相互作用に刺激または阻害効果を有するモジュレーター、すなわち候補化合物または試験化合物または作用剤(例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小型分子または他の薬剤)を同定するための方法(本明細書で「スクリーニングアッセイ」という)を提供する。
1の具体例において、本発明により、PD−L2ポリペプチドもしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分に結合する、例えば、その本来の結合パートナーと相互作用するPD−L2ポリペプチドの能力をモジュレーションする候補もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。もう1つの具体例において、本発明は、PD−L2蛋白またはポリペプチドまたは生物学的に活性のある部分(例えば、コファクターまたはコレンザイムアナログ、あるいは阻害性分子)に結合し、あるいはその活性をモジュレーションする候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【0209】
好ましい具体例において、本発明は、PD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用に対して刺激または阻害効果を有する候補化合物または試験化合物のアッセイ方法を提供する。典型的な具体例において、結合パートナーはPD−1である。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー;空間的にアドレス可能な平行(spatially addressable parallel)固相または液相ライブラリー;デコンボリューションを要する合成ライブラリー法;「1−ビーズ1−化合物」ライブラリー法;およびアフィニティクロマトグラフィー選抜を用いる合成ライブラリー法を含む、当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くの方法のいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリー法はペプチドのライブラリーに限定されるが、他の4つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小型分子ライブラリーに適用することができる(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【0210】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該分野において、例えばDeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233において見出すことができる。
【0211】
化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412−421)またはビーズ(Lam (1991) Nature 354:82−84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555−556)、細菌(Ladner USP 5,223,409)、胞子(Ladner USP ’409)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865−1869)またはファージ上に(Scott and Smith (1990) Science 249:386−390)提供され得る(Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378−6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301−310); (Ladner 既出)。
【0212】
1の具体例において、アッセイは、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分を発現している細胞を試験化合物と接触させること、および試験化合物がPD−L2活性をモジュレーションする能力を測定する、細胞に基づくアッセイである。例えば、試験化合物がPD−L2活性をモジュレーションする能力の決定は、例えば、PD−L2がその本来の結合パートナー、例えばPD−1に結合し、免疫細胞活性をモジュレーションする能力をモニターすることにより行うことができる。免疫細胞は、例えば、T細胞、B細胞またはミエロイド細胞であってよい。PD−L2のPD−1への結合をモジュレーションする試験化合物の能力の決定は、例えば、PD−1をラジオアイソトープまたは酵素標識とカップリングさせることにより行なうことができ、複合体中に標識PD−1を検出することによりPD−1のPD−L2への結合を検出することができる。別法として、PD−L2をラジオアイソトープまたは酵素標識とカップリングさせて、複合体中のPD−1へのPD−L2結合をモジュレーションする試験化合物の能力をモニターすることもできる。PD−L2に結合する試験化合物の能力の決定は、例えば、化合物をラジオアイソトープまたは酵素標識とケップリングさせることにより行なうことができ、複合体中の標識PD−L2化合物を検出することにより化合物のPD−L2への結合を検出することができる。例えば、化合物(例えば、PD−1)を125I、35S、14Cまたは3Hで、直接的または間接的に標識することができ、放射能を直接カウントすることにより、あるいはシンチレーション計測により検出することができる。別法として、化合物を、例えばセイヨウワサビペルキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで標識し、適当な基質の生成物への変換を調べることにより酵素標識を検出することができる。
【0213】
相互作用物質を標識せずに化合物(例えば、PD−1)がPD−L2と相互作用する能力を調べることも本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、PD−L2も標的分子も標識せずに、化合物とPD−L2との相互作用を検出することができる。McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257: 1906−1912。本明細書中に用いる「マイクロフィジオメーター」(例えば、サイトセンサー)は、細胞がその周囲を酸性化する速度を、光−アドレス可能電位差センサー(light−addressable potentiometric sensor)(LAPS)を用いて測定する分析装置である。この酸性化速度の変化を、化合物とPD−L2との間の相互作用の指標として用いることができる。
【0214】
もう1つの具体例において、アッセイは、PD−L2結合パートナーを発現している細胞を試験化合物と接触させ、次いで、試験化合物がPD−L2結合パートナーの活性をモジュレーションする(例えば、刺激または阻害する)能力を調べることを特徴とする細胞に基づくアッセイである。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。試験化合物がPD−L2結合パートナーの活性をモジュレーションする能力の決定は、例えば、PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーに結合し、あるいは相互作用する能力を決定することにより行なうことができる。
【0215】
PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のあるフラグメントがPD−L2結合パートナー、例えばPD−1に結合し、あるいは相互作用する能力の決定は、直接結合を調べるための上記方法の1つにより行なうことができる。好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーに結合あるいは相互作用する能力の決定は、結合パートナーの活性を調べることにより行なうことができる。例えば、細胞の第2のメッセンジャー(例えば、チロシンキナーゼまたはホスファターゼ活性)の誘導を検出することにより、適当な基質の触媒/酵素活性を検出することにより、リポーター遺伝子(検出可能マーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された標的応答性調節エレメントを含む)の誘導を検出することにより、あるいは標的により調節される細胞の応答を検出することにより、結合パートナーの活性を調べることができる。例えば、PD−L2ポリペプチドが本来のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1に結合あるいは相互作用する能力の決定を、増殖アッセイにおおいて免疫細胞同時刺激または阻害をモジュレーションする化合物の能力を測定することにより、あるいはPD−L2ポリペプチドの一部分を認識する抗体へのPD−L2ポリペプチドの結合能を妨害することにより、行なうことができる。1の具体例において、T細胞活性化をモジュレーションする化合物を、T細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする化合物の能力を調べることにより同定することができる。好ましい具体例において、T細胞活性化をモジュレーションする化合物を、1またはそれ以上の抗原濃度においてT細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする化合物の能力を調べることにより同定することができる。
【0216】
さらにもう1つの具体例において、本発明のアッセイは、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分を試験化合物と接触させ、次いで、試験化合物がPD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合する能力を決定する無細胞アッセイである。本発明のアッセイに用られるPD−L2ポリペプチドの好ましい生物学的に活性のある部分は、非PD−L2分子との相互作用に関与するフラグメント、例えば、PD−L2結合パートナーに結合する細胞外ドメインの少なくとも一部分を包含する。試験化合物のPD−L2ポリペプチドへの結合は、前記のように直接または間接的に決定することができる。好ましい具体例では、アッセイは、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、PD−L2ポリペプチドと結合してアッセイ混合物を形成する既知化合物と接触させること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、次いで、試験化合物がPD−L2ポリペプチドと相互作用する能力を決定することを特徴とするが、該アッセイにおいては、試験化合物がPD−L2ポリペプチドと相互作用する能力を決定することは、既知化合物と比較して試験化合物がPD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に選択的に結合する能力を決定することを特徴とする。
【0217】
もう1つの具体例では、アッセイは、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、次いで、試験化合物がPD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性をモジュレーション(例えば、刺激または阻害)する能力を決定する無細胞アッセイである。試験化合物がPD−L2ポリペプチドの活性をモジュレーションする能力の決定は、例えば、PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーに結合する能力を、前記の直接的に結合を決定するための方法の一つにより測定することにより行なうことができる。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーに結合する能力の決定は、リアルタイム・バイオモレキュラー・インターラクション分析(BIA)などの方法を用いて行なうこともできる。Anal. Chem. 63:2338−2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699−705。本明細書中に用いる「BIA」は、生物特異的な相互作用をリアルタイムで、相互作用物質(例えばBIAコア)を標識することなく研究するための方法である。表面プラズモン共鳴(SPR)の視覚現象を、生物分子間のリアルタイムの反応の指標として用いることができる。
【0218】
別の具体例では、試験化合物がPD−L2ポリペプチドの活性を調節する能力の測定は、PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーの下流エフェクター(例えば、PD−1の下流エフェクター)の活性をさらに調節する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適当な標的に対するエフェクター分子の活性、または適当な標的へのエフェクターの結合を、前記のように決定することができる。
【0219】
本発明の無細胞アッセイには、可溶性形態および/または膜結合形態の両方の蛋白(例えば、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分、またはPD−L2が結合する結合パートナー、例えばPD−1)を用いることもできる。膜結合形態のポリペプチド(例えば、細胞表面PD−L2)を用いる無細胞アッセイの場合、膜結合形態の蛋白が溶液中で維持されるように可溶化剤を用いることが望ましい。そのような可溶化剤の例には、n−オクチルグルコシド、n−ドデシルマルトシド、オクタノイル−N−メチルグルカミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、トライトン(登録商標)X−100、トライトン(登録商標)X−114、テシト(登録商標)、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)n、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ]−1−プロパンスルホネート(CHAPS)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート(DHAPSO)または、N−ドデシル=N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネートなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【0220】
本発明の前記アッセイ法の1よりも多い具体例において、1または両方の蛋白の、複合体を形成していない形態からのその複合体形態の分離を促進するため、ならびにアッセイの自動化を図るために、PD−L2またはその結合パートナーいずれかを固定化することが望ましい。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。試験化合物のPD−L2ポリペプチドに対する結合、または候補化合物の存在下および不在下でのPD−L2ポリペプチドと標的分子との相互作用は、反応物を入れるのに適したいずれかの容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が含まれる。1の具体例において、1または両方の蛋白がマトリックスに結合するのを可能とするドメインを付加する融合蛋白を提供することができる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/PD−L2融合蛋白またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ/標的融合蛋白をグルタチオンセファローゼビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ、次いでこれを試験化合物、または試験化合物および非吸着標的蛋白もしくはPD−L2ポリペプチドのいずれかと結合させ、次いで、混合物を複合体形成に資する条件下(例えば、塩およびpHの生理的条件)でインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、全ての結合していない成分を除き、ビーズの場合、マトリックスを固定化し、複合体形成を、例えば前記のように直接的または間接的に調べる。別法として、複合体をマトリックスから分離し、PD−L2結合または活性のレベルを標準的な方法を用いて決定することができる。
【0221】
蛋白をマトリックス上に固定するための他の方法を、本発明のスクリーニングアッセイに用いることもできる。例えば、PD−L2ポリペプチドまたはPD−L2結合パートナーのいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化PD−L2ポリペプチドまたは標的分子は、当該分野で周知の方法(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を用いてビオチン−NHS(N−ヒドロキシ−スクシンイミド)から調製することができ、ストレプトアビジンでコートされた96ウェルのプレート(Pierce Chemical)に固定することができる。別法として、PD−L2ポリペプチドまたは結合パートナーと反応するが、PD−L2ポリペプチドのその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化して、未結合結合パートナーまたはPD−L2ポリペプチドをウェル中で抗体結合によりトラップすることができる。GST−固定化複合体に関する前記方法に加え、そのような複合体を検出するための方法には、PD−L2ポリペプチドまたは結合パートナーと反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにPD−L2ポリペプチドまたは結合パートナーに関連する酵素活性を検出することに依存する酵素−結合アッセイが含まれる。
【0222】
別の具体例において、試験化合物がPD−L2ポリペプチドの活性をモジュレーションする能力の決定は、PD−L2の下流で機能する分子の活性をモジュレーションする試験化合物の能力を調べることにより、例えば、PD−L2結合パートナー、例えばPD−1の細胞質ドメインと相互作用させることにより、行なうことができる。例えば、第2のメッセンジャーのレベル、適当な標的に対する相互作用分子の活性、あるいは適当な標的に対する相互作用物質の結合を、上記のごとく調べることができる。
【0223】
他の具体例では、細胞を候補化合物と接触させ、そしてPD−L2 mRNAまたは蛋白の細胞中での発現を決定する方法にて、PD−L2の発現のモジュレーターを同定する。候補化合物の存在下でのPD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現のレベルを、候補化合物の不在下でのPD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現のレベルと比較する。次いで、この比較に基づき、候補化合物をPD−L2の発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、PD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現が、候補化合物の存在下において、その不在下におけるよりも大きい(例えば、統計学的に有意に大きい)場合、候補化合物は、PD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現の刺激物質と同定される。あるいは、PD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現が、候補化合物の存在下において、その不在下におけるよりも少ない(例えば、統計学的に有意に少ない)場合、候補化合物はPD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現の阻害物質と同定される。細胞中でのPD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現のレベルは、本明細書中に開示するPD−L2 mRNAまたはポリペプチドを検出するための方法により決定することができる。
【0224】
本発明のさらに別の態様において、PD−L2ポリペプチドを、2−ハイブリッドアッセイまたは3−ハイブリッドアッセイにおいて「エサ(bait)蛋白」として用いて(U.S. 特許No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223−232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046−12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920−924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693−1696; and Brent WO94/10300を参照されたい)、PD−L2と結合あるいは相互作用する他のポリペプチド(「PD−L2結合蛋白」、「PD−L2結合パートナー」または「PD−L2bp」)、ならびにPD−L2活性に関与する他のポリペプチドを同定することができる。そのような結合蛋白の例はPD−1である。かかるPD−L2結合蛋白は、例えば、PD−L2により媒介される情報伝達経路のダウンストリームエレメントとして、PD−L2ポリペプチドまたはPD−L2標的によるシグナルの伝達に関与している可能性もある。あるいは、かかるPD−L2結合ポリペプチドはPD−L2阻害物質である可能性がある。
【0225】
2−ハイブリッドシステムは、分離可能なDNA結合および活性化ドメインからなる、大部分の転写因子の基本単位性に基づく。簡単には、アッセイは2つの異なるDNA構築物を利用する。一構築物において、PD−L2ポリペプチドをコードする遺伝子を公知の転写因子(例えば、GAL−4)のDNA結合ドメインをコードしている遺伝子に結合させる。他の構築物において、DNA配列のライブラリー由来の、同定されていないポリペプチド(「プレイ(prey)」または「サンプル」)をコードするDNA配列を、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に結合させる。「バイト(bait)」と「プレイ」ポリペプチドがインビボで相互作用してPD−L2−依存性複合体を形成することができる場合、転写因子のDNA結合ドメインと活性化ドメインが接近する。この接近により、転写因子に反応する転写調節部位に作動可能な状態で連結されているレポーター遺伝子(例えば、LacZ)の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現は検出することができ、機能的転写因子を含んでいる細胞コロニーを単離し、そしてそれを用いてPD−L2ポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
【0226】
もう1つの態様において、本発明は、本明細書記載の2またはそれ以上のアッセイの組み合わせに関する。例えば、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイを用いてモジュレーション物質を同定することができ、PD−L2ポリペプチドの活性をモジュレーションするその物質の能力をインビボにおいて、例えば、細胞変形または腫瘍発生に関する動物モデルのごとき動物において確認することができる。
【0227】
本発明は、前記スクリーニングアッセイにより同定される新規な作用剤に関する。従って、本明細書中に開示するように同定された薬剤を適当な動物モデルでさらに用いることは、本発明の範囲内のことである。例えば、本明細書中に開示するように同定される作用剤(例えば、PD−L2モジュレーション剤、アンチセンスPD−L2核酸分子、PD−L2特異的抗体、またはPD−L2結合パートナー)を動物モデルに用いて、そのような作用剤を用いた治療の効力、毒性または副作用を決定することができる。別に、本明細書中に記載するように、同定された作用剤を動物モデルに用いて、そのような作用剤の活性のメカニズムを決定することができる。さらに、本発明は、前記スクリーニングアッセイにより同定される新規作用剤の、本明細書に記載する治療のための使用に関する。
【0228】
B.検出アッセイ
本明細書中で同定されるcDNA配列(および対応完全遺伝子配列)の部分またはフラグメントを、多くの方法でポリヌクレオチド試薬として用いることができる。例えば、これらの配列を用いて、(i)染色体上にそのそれぞれの遺伝子をマッピングし、かくして遺伝的疾患に関連する遺伝子領域の位置を確認し;(ii)微量な生物試料から個体を同定する(組織タイピング);ならびに(iii)生物試料の法医学的同定に役立てることができる。これらの適用を、以下のサブセクションに記載する。
【0229】
1.染色体マッピング
遺伝子の配列(または配列の一部分)が単離されたならば、この配列を用いて染色体上の遺伝子位置をマッピングすることができる。このプロセスは染色体マッピングと呼ばれる。したがって、本明細書記載のPD−L2ヌクレオチド配列の部分またはフラグメントを用いて染色体上のPD−L2遺伝子位置をマッピングすることができる。PD−L2配列の染色体へのマッピングは、これらの配列と疾病関連遺伝子とを関連づける重要な最初の工程である。
【0230】
簡単に説明すると、PD−L2ヌクレオチド配列からPCRプライマー(好ましくは長さ15〜25bp)を調製することによりPD−L2遺伝子を染色体にマッピングすることができる。PD−L2配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムDNA中の1個よりも多いエキソンを含まないプライマーを予想することができ、かくして、増幅プロセスを複雑化することができる。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに用いることができる。PD−L2配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じるであろう。
【0231】
異なる哺乳動物(ヒトおよびマウス細胞)由来の体細胞を融合させることにより体細胞ハイブリッドを調製する。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するにつれ、それらは徐々にランダムなオーダーでヒト染色体を失うが、マウス染色体を保持する。マウス細胞が増殖できない培地を用いることにより、所望酵素をコードする遺伝子を含む1のヒト染色体が保持されるであろう。なぜならマウス細胞は特定の酵素を欠いているが、ヒト細胞は有している可能性があるからである。種々の培地を用いることにより、ハイブリッド細胞系のパネルを確立することができる。パネル中の各細胞系は単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、ならびにマウス染色体の全セットを含み、個々の遺伝子を特定のヒト染色体に簡単にマッピングすることができる(D’Eustachio, P. et al. (1983) Science 220: 919−924)。トランスロケーションおよび欠失を有するヒト染色体を用いることにより、ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドを得ることもできる。
【0232】
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、個々の染色体に個々の配列を割り当てるための迅速な方法である。単一のサーマルサイクルを用いて1日に3つまたはそれ以上の配列を割り当てることができる。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにPD−L2ヌクレオチド配列を使用して、特定の染色体に由来するフラグメントのパネルを用いて、サブローカライゼーションを遂行することができる。PD−L2配列をその染色体にマッピングするために同様に使用される他のマッピング方法は、in situハイブリダイゼーション(Fan, Y. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6223−27)、標識フロー−ソーテッド(flow−sorted)染色体を用いるスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ−セレクションを包含する。
【0233】
中期染色体スプレッドへのDNA配列の蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)をさらに用いて、1工程で正確な染色体位置を得ることができる。紡錘糸を破壊するコルセミドのごとき化学薬剤により中期で分裂を停止された細胞を用いることにより、染色体スプレッドを作成することができる。染色体を短時間トリプシン処理し、次いで、ギムザ染色することができる。明暗バンドのパターンが各染色体上に出現し、その結果、染色体を個々に同定することができる。500または600塩基程度の短いDNA配列にFISH法を使用するとこができる。しかしながら、1000塩基よりも大きいクローンは、十分なシグナル強度でもってユニークな染色体位置に結合する可能性が高く、検出が容易である。好ましくは、1000塩基以上、より好ましくは2000塩基以上であれば、合理的な時間内に良好な結果を得るに十分であろう。この方法のレビューには、Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, Nwe York 1988)参照。
【0234】
染色体マッピング用試薬を個々に用いて、単一の染色体または染色体上の単一部位をマークすることができ、あるいは試薬のパネルを複数部位および/または複数染色体のマーキングに用いることができる。実際には、遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬がマッピング目的に好ましい。コーディング配列は遺伝子ファミリー内で保存されている可能性がさらに高く、よって、染色体マッピングの間にクロスハイブリダイゼーションのチャンスが高い。
【0235】
染色体上の配列の物理的な位置を、遺伝子マップデータと関連付けることができる。(そのようなデータは、例えば、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryよりオンラインで入手できるV. McKusick, Mendelian Inheritance in Manに見出される。)同じ染色体領域にマップされた場合、遺伝子と疾患の間の関連性を、次いで、例えばEgeland, J. et al. (1987) Nature, 325: 783−787に開示されている連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝)により同定することができる。
【0236】
そのうえ、PD−L2遺伝子に関連する疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のDNA配列の相違を調べることができる。罹患している個体のいくつかまたはすべてに変異が認められるが、罹患していない個体には変異が全く認められない場合、変異が特定疾患の原因であることが考えられる。一般的には、罹患している個体と罹患していない個体の比較には、染色体スプレッドから見ることのできる、あるいはDNA配列に基づくPCRを用いて検出可能な欠失またはトランスロケーションのごとき染色体中の構造変化を先ず探すことを用いる。最終的には、いくつかの個体からの遺伝子の完全な配列決定を行なって、変異の存在を確認し、変異と多型とを区別することができる。
【0237】
2.組織タイピング
本発明のPD−L2配列を用いて、微量生物試料から個体を同定することもできる。例えば、合衆国軍は、その人員の同定のために制限酵素フラグメント長遺伝子多型(RFLP)を用いることを考えている。この方法では、個人のゲノムDNAを1またはそれ以上の制限酵素で消化し、サザンブロットにおけるプローブとし、同定のためのユニークなバンドを得る。この方法は、ポジティブな同定を困難にしている、失われる、切断される、または盗用される可能性のある「ドッグ・タグ(Dog Tags)」の現在の制限に影響されない。本発明の配列は、RFLPのための追加的DNAマーカ(米国特許第5,272,057号に記載されている)ーとして有用である。
【0238】
さらにそのうえ、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩基−対−塩基DNA配列を決定するための別法を提供することができる。つまり、本明細書中に開示するPD−L2ヌクレオチド配列を用いて、配列の5’および3’末端から2つのPCRプライマーを調製することができる。次いで、これらのプライマーを用いて個体のDNAを増幅し、その後、それを配列決定することができる。
この方法で調製された、個体からの対応するDNA配列のパネルより、各個体は対立遺伝子の違いによりそのようなDNA配列のユニークなセットを有するので、ユニークに個体を同定することができる。本発明の配列を用いて、個体および組織からそのような同定配列を得ることができる。本発明のPD−L2ヌクレオチド配列は、ヒトゲノムの部分をユニークに表す。対立遺伝子の変化は、ある程度はこれらの配列のコーディング領域に生じるが、大部分は非コーディング領域に生じる。個体間の対立遺伝子の変化は、各500塩基につき約1つの頻度で起こることが見積もられる。本明細書中に開示する配列のそれぞれは、ある程度まで、個人からのDNAを同定目的のために比較することができるスタンダードとして用いることができる。より多くの遺伝子多型は非コーディング領域に生じるので、個体を識別するにはより少数の配列が必要である。それぞれが100塩基の非コーディング増幅配列を生じるおそらく10ないし1000個のプライマーのパネルを用いると、配列番号:1または4の非コーディング配列によりポジティブな個体の同定が可能となる。配列番号:3または6のごとき予想されたコーディング配列を用いる場合、ポシティブな個体の同定のためのプライマーのより適当な数は500ないし2000個であろう。
【0239】
本明細書に記載するPD−L2ヌクレオチド配列由来の試薬のパネルを用いて個体に関するユニークな同定データベースを作成する場合、それらの同じ試薬を後で用いてその個体からの組織を同定することができる。ユニークな同定データベースを用いて、生存している、または死亡した個体のポジティブな同定を、極端に少量の組織試料から行なうことができる。
【0240】
3.法生物学(forensic biology)における部分PD−L2配列の使用
DNAに基づく同定法は、法生物学にも用いることができる。法生物学は、犯罪現場で見出される生物学的証拠の遺伝学的分類を、例えば犯罪の犯人をポジティブに同定するための手段として用いている科学分野である。そのような同定を行うのに、PCR技術を用いて、犯罪現場で見出される組織、例えば髪もしくは皮膚、または体液、例えば血液、唾液、または精液などの非常に少量の生物学的試料から採取されたDNA配列を増幅することができる。次いで、増幅された配列をスタンダードと比較することができ、これにより生物試料の起源を同定することが可能となる。
【0241】
本発明の配列を用いて、ヒトゲノムの特定の位置に標的され、例えば別の「同定マーカー」(即ち、特定の個体にユニークな他のDNA配列)を提供することによりDNAに基づく法的同定の確実性を高めることができるポリヌクレオチド試薬、例えばPCRプライマーを提供することができる。前記のように、実際の塩基配列情報を、制限酵素により作成されたフラグメントにより形成されるパターンに確実に代わるものとして同定に用いることができる。遺伝子多型の大部分は非コーディング領域に生じるので、配列番号:1または配列番号:4の非コーディング領域に標的化される配列がこの使用のために特に適当であり、この方法を用いて、個体を区別することがいっそう容易になる。ポリヌクレオチド試薬の例は、PD−L2ヌクレオチド配列またはその部分、例えば、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基の長さを有する配列番号:1または4の非コーディング領域由来のフラグメントを包含する。
【0242】
本明細書中に開示するPD−L2ヌクレオチド配列をさらに用いて、特定組織、例えば脳組織を同定するために、例えばin situハイブリダイゼーション法で用いることができるポリヌクレオチド試薬、例えば標識プローブ、または標識可能なプローブを提供することができる。これは、法病理学者が未知起源の組織を与えられる場合に非常に有用であり得る。そのようなPD−L2プローブのパネルを用いて、種により、および/または器官のタイプにより組織を同定することができる。
同様に、これらの試薬、例えばPD−L2プライマーまたはプローブを用いて、コンタミネーションに関して組織培養物をスクリーニングする(即ち、培養物中の異なるタイプの細胞の混合物の存在をスクリーニングする)ことができる。
【0243】
C.予測医学
本発明は、予後(予測)目的のために診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験をモニターすることを用い、それにより個体を予防的に処置する予測医学の分野にも適する。従って、本発明の一態様は、生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)中でのPD−L2ポリペプチドおよび/または核酸の発現ならびにPD−L2の活性を測定し、それにより、個体が異常なPD−L2の発現または活性に関連する病気または疾患に罹患しているかどうか、または疾患が進行する危険にあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。本発明により、個体がPD−L2ポリペプチド、核酸の発現または活性に関連する疾患を進行させる危険にあるかどうかを決定するための予後(または予測)アッセイも提供される。例えば、PD−L2遺伝子の変異を、生物試料中でアッセイすることができる。そのようなアッセイを予後または予測目的のために用い、それにより個体を、PD−L2ポリペプチド、核酸の発現または活性により特徴付けられる、またはそれに関連する疾患の発症前に予防的に処置することができる。
本発明の他の態様は、臨床試験で、PD−L2の発現または活性における試薬(例えば、薬剤、化合物)の影響をモニターすることに関する。
これらおよび他の試薬を、以下のセクションにさらに詳細に記載する。
【0244】
1.診断アッセイ
PD−L2ポリペプチドまたは核酸の生物試料中での存在または不在を検出するための典型的な方法は、生物試料を試験対象から得て、次いでPD−L2ポリペプチドまたはPD−L2ポリペプチドをコードする核酸(例えば、mRNA,ゲノムDNA)を検出することができる化合物または試薬と生物試料と接触させて、生物試料中のPD−L2ポリペプチドまたは核酸の存在を検出することを特徴とする。PD−L2 mRNAまたはゲノムDNAを検出するのに好ましい試薬は、PD−L2 mRNAまたはゲノムDNAにハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号1、3、4または6の核酸のようなhPD−L2核酸、またはその部分、例えば少なくとも15、30、50、100、250または500ヌクレオチドの長さの、およびPD−L2 mRNAまたはゲノムDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであってよい。本発明の診断アッセイにおける使用に適した他のプローブを、本明細書中に記載する。
【0245】
PD−L2ポリペプチドを検出するのに好ましい試薬は、PD−L2ポリペプチドに結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであってよい。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えばFabまたはF(ab’)2)を用いることができる。プローブまたは抗体に関して「標識された」なる用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を結合させる(即ち、物理的に結合させる)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに、プローブまたは抗体を直接標識される他の試薬と反応させることにより間接的に標識することが含まれるものとする。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、およびDNAプローブをビオチンで末端標識して、それを蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することが含まれる。「生物学的試料」なる用語には、対象から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに対象中に存在する組織、細胞および体液が含まれるものとする。即ち、本発明の検出方法を用いて生物試料においてPD−L2 mRNA、蛋白またはゲノムDNAを、インビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、PD−L2 mRNAのインビトロでの検出法には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションが含まれる。PD−L2ポリペプチドのインビトロでの検出法には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISAs)、ウェスタン・ブロット、免疫沈降および免疫蛍光法が含まれる。PD−L2ゲノムDNAのインビトロでの検出法にはサザンハイブリダイゼーションが含まれる。PD−L2ゲノムDNAの検出のためのインビトロ法には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、PD−L2ポリペプチドのインビボでの検出法には、標識された抗−PD−L2抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置を標準的な画像処理法で検出することができる放射活性マーカーで標識することができる。
【0246】
1の具体例において、生物試料は試験対象からの蛋白分子を含む。別法として、生物試料には試験対象からのmRNA分子または試験対象からのゲノムDNA分子を含むことができる。好ましい生物試料は、対象から慣用的方法により単離される血清試料である。
もう1つの具体例では、該方法はさらに、対照生物試料を対照の対象から得ること、対照試料をPD−L2ポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAを検出することができる化合物または試薬と接触させて、生物試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの存在を検出すること、ついで、対照試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの存在を、試験試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの存在と比較することを特徴とする。
【0247】
本発明には、生物試料中のPD−L2の存在を検出するためのキットも包含される。例えば、該キットには、生物試料中のPD−L2ポリペプチドまたはmRNAを検出することができる標識化合物または試薬、試料中のPD−L2の量を測定する装置、および試料中のPD−L2の量をスタンダードと比較する装置を含めることができる。該化合物または試薬は適当な容器に封入することができる。キットには、さらに、キットをPD−L2ポリペプチドまたは核酸を検出するのに用いるための使用説明書を含めることができる。
【0248】
2.予後アッセイ
さらにそのうえ、本明細書記載の診断方法を用いて、異常なまたは望ましくないPD−L2発現または活性に関連した疾病または疾患を有する、あるいは発症する危険性のある対象を同定することができる。本明細書の用語「異常な」は、野生型PD−L2発現または活性から逸脱したPD−L2発現または活性を包含する。異常な発現または活性は、増加または減少した発現または活性、ならびに野生型の発達パターンの発現またはサブ細胞(subcellular)パターンの発現に従わない発現または活性を包含する。例えば、異常なPD−L2発現または活性は、PD−L2中の変異がPD−L2遺伝子の発現不足または過剰発現を引き起こす場合、ならびに変異が、無機能PD−L2ポリペプチドまたは野生型の様式で機能しないポリペプチド、例えば、PD−L2結合パートナー(例えばPD−1)と相互作用しないポリペプチド、または非PD−L2結合パートナーと相互作用するポリペプチドを生じさせる状況を包含する。本明細書の用語「望ましくない」は、免疫細胞活性化のごとき生物学的応答に関与する望ましくない現象を包含する。例えば、用語「望ましくない」は、対象において望ましくないPD−L2発現または活性を包含する。
【0249】
上記診断アッセイまたは下記アッセイのごとき本明細書中に記載のアッセイを用いて、PD−L2活性または核酸発現の誤調節に関連した疾病、例えば、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系の癌を有する、あるいは発症する危険性のある、あるいは自発的に流産する傾向のある対象を同定することができる。別法として、予後アッセイを用いて、PD−L2活性または核酸発現の誤調節に関連した疾病、例えば、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系の癌を有する、あるいは発症する危険性のある、あるいは自発的に流産する傾向のある対象を同定することができる。かくして、本発明は、異常なPD−L2の発現または活性に関連する病気または疾患を同定するための方法であって、試験試料を対象から得て、PD−L2ポリペプチドまたは核酸(例えば、mRNA、ゲノムRNA)を検出する方法が提供し、ここで、PD−L2ポリペプチドまたは核酸の存在は、異常なPD−L2の発現または活性に関連する病気または疾患を有する、あるいはそれらを進行させる危険にある患者の診断的特徴である。本明細書中で使用する「試験試料」は、関心の持たれる対象から得られる生物試料をいう。例えば、試験試料は、生物学的液体(例えば、脳脊髄液または血清)、細胞試料、または組織から得ることができる。
【0250】
さらにそのうえ、本明細書に記載する予後アッセイを用いて、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、蛋白、ペプチド、核酸、小型分子または他の薬物候補)を対象に投与して、異常なまたは望ましくないPD−L2の発現または活性に関連する病気または疾患を処置することができるかどうかを決定することができる。例えば、かかる方法を用いて、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系の癌、または自発的流産傾向に対する薬剤で対象を効果的に治療しうるかどうかを決定することができる。つまり、本発明は、異常なPD−L2の発現または活性に関連する疾患のための薬剤を用いて対象を効果的に処置することができるかどうかを決定するための方法を提供するものであり、該方法は、試験試料を得、PD−L2ポリペプチドまたは核酸の発現または活性を検出する方法(例えば、ここで、PD−L2ポリペプチドまたは核酸の発現または活性が大きいことは、異常なPD−L2の発現または活性に関連する疾患を治療するための薬剤を投与することができる対象の診断的特徴である)である。
【0251】
本発明の方法を用いて、PD−L2遺伝子の遺伝学的変化を検出し、それにより、変化した遺伝子を有する対象がPD−L2ポリペプチド活性または核酸発現の誤調節により特徴づけられる疾患、例えば、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系の癌、または自発的流産傾向の危険性があるかどうかを決定することができる。好ましい具体例において、該方法は、対象からの細胞の試料において、PD−L2ポリペプチドをコードしている遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも一つの変化により特徴付けられる遺伝学的変化の存在または不在、またはPD−L2遺伝子の誤発現を検出することを特徴とする。例えば、そのような遺伝学的変化は、1)PD−L2遺伝子からの1またはそれ以上のヌクレオチドの欠失;2)PD−L2遺伝子への1またはそれ以上のヌクレオチドの付加;3)PD−L2遺伝子の1またはそれ以上のヌクレオチドの置換;4)PD−L2遺伝子の染色体転位;5)PD−L2遺伝子のメッセンジャーRNA転写のレベルでの変化;6)PD−L2遺伝子、例えばゲノムDNAのメチル化パターンの異常な変化;7)PD−L2遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライシングパターンの存在;8)PD−L2ポリペプチドの非野生型レベル;9)PD−L2遺伝子の対立遺伝子欠失、および10)PD−L2ポリペプチドの翻訳後の不適当な修飾、の少なくとも一つの存在を確認することにより検出することができる。本明細書に記載するように、PD−L2遺伝子の変化を検出するのに用いることができる、当該分野で公知の多数のアッセイ法が存在する。好ましい生物試料は、対象から慣用的手段により単離された組織または血清試料である。
【0252】
ある具体例において、変化の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、U.S.特許第4,683,195および4,683,202を参照されたい)、例えばアンカーPCRまたはRACE・PCRにおける、あるいは、ライゲーション連鎖反応(LCR)(例えば、Landegran et al. (1988) Science 241: 1077−1080; and Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360−364参照)におけるプローブ/プライマーの使用が含まれ、後者はPD−L2遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用であり得る(Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675−682を参照されたい)。この方法は、対象から細胞の試料を収集すること、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、mRNAまたは両方)を単離すること、PD−L2遺伝子(存在する場合)のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で、PD−L2遺伝子に特異的にハイブリダイズする1またはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触させること、次いで増幅産物の存在または不存在を検出すること、あるいは増幅産物のサイズを検出し、および対照試料と長さを比較することを特徴とする。PCRおよび/またはLCRは、本明細書に記載する変異を検出するのに用いられる方法のいずれかと組み合わせて予備的増幅ステップとして用いることが望ましいと考えてもよい。
【0253】
別の増幅法には、自己保存配列複製(Guatelli, J. C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874−1878)、転写増幅システム(Kwoh, D. Y. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173−1177)、Q−ベータレプリカーゼ(Lizardi, P. M. et al. (1988) Bio−Technology 6: 1197)またはいずれかの他の核酸増幅法が含まれ、この後、当業者に周知の方法を用いる増幅分子の検出を行う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数で存在している場合に核酸分子を検出するのに特に有用である。
【0254】
別の具体例において、試料細胞からのPD−L2遺伝子における変異は、制限酵素開裂パターンの変化により同定することができる。例えば、試料および対照DNAを単離し、増幅し(所望により)、1またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメントの長さのサイズをゲル電気泳動により決定し、そして比較する。フラグメントの長さのサイズに関する試料および対照DNA間の違いが、試料DNAにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイムを使用して(例えば、U.S.特許第5,498,531号を参照されたい)、リボザイム開裂部位の発生または消失により特異的変異の存在を評価することができる。
【0255】
他の具体例において、PD−L2の遺伝的変異は、試料および対照の核酸、例えばDNAまたはRNAを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイゼーションさせることにより同定することができる(Cronin, M. T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244−255; Kozal, M. J. et al. (1996) Nature Medicine 2: 753−759)。例えば、PD−L2の遺伝的変異は、Cronin, M. T. et al(既出)に開示されているような光により生成する(light−generated)DNAプローブを含む二次元アレイ中にて同定することができ、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料および対照中のDNAの長い鎖を探査し、配列がオーバーラップしているプローブの線状アレイ(array)を作成することにより配列間の塩基変化を同定することができる。この工程により点突然変異の同定が可能となる。この工程を行った後に、検出されたすべての変種または変異に相補的な、小さな、特異化されたプローブアレイを用いることにより特異的変異の特定を可能とする二次ハイブリダイゼーションアレイを用いる。各変異アレイはパラレルなプローブのセットから構成され、一方は野生型遺伝子に相補的であり、もう一方は、変異遺伝子に相補的である。
【0256】
さらにもう一つの具体例において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを用いてPD−L2遺伝子を直接配列決定し、試料PD−L2の配列を対応する野生型(対照)の配列と比較することにより変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Maxam and Gilbert((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)またはSanger((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)により開発された方法に基づくものが含まれる。診断アッセイ((1995) Biotechniques 19: 448)を行う場合、質量スペクトル分析(例えば、PCT国際公開NO.WO94/16101;Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127−162; およびGriffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147−159を参照されたい)を含む種々の自動配列決定法のいずれかを用いることができることも考えられる。
【0257】
PD−L2遺伝子の変異を検出するための他の方法には、開裂試薬からの保護を用いてRNA/RNAまたはRNA/DNAヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基対を検出する方法が含まれる(Myers et al. (1985) Science 230: 1242)。一般に、「ミスマッチ開裂」の当該分野における方法は、野生型PD−L2配列を含む(標識された)RNAまたはDNAを、組織試料から得られる潜在的に変異したRNAまたはDNAとハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロ二本鎖を提供することで始まる。二本鎖の分子を、対照および試料鎖間の塩基対ミスマッチのために存在しているであろう二本鎖分子の一本鎖領域を開裂する薬剤を用いて処理する。例えば、RNA/DNA二本鎖はRNaseで処理することができ、およびDNA/DNAハイブリッドはS1ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を酵素消化することができる。他の具体例では、ミスマッチ領域を消化するために、DNA/DNAまたはRNA/DNA二本鎖のいずれかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化後、生じた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分けし、変異の部位を決定する。例えば、Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleeba et al.(1992) Methods Enzumol. 217: 286−295を参照されたい。好ましい具体例において、対照DNAまたはRNAを、検出のために標識することができる。
【0258】
さらにもう1つの具体例において、ミスマッチ開裂反応は、二本鎖DNAにおけるミスマッチ塩基対を認識する1またはそれ以上の蛋白(いわゆる「DNAミスマッチ修復」酵素)を、細胞の試料から得られたPD−L2における点突然変異を検出およびマッピングするために規定されたシステムにおいて利用する。例えば、イー・コリのmutY酵素はG/AミスマッチでAを開裂し、ヒーラ細胞由来のチミジンDNAグリコシラーゼはG/TミスマッチでTを開裂する(Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657−1662)。典型的な具体例に従い、PD−L2配列、例えば野生型PD−L2配列に基づくプローブを、試験細胞からのcDNAまたは他のDNA産物にハイブリダイズさせる。二本鎖をDNAミスマッチ修復酵素で処理し、そして開裂産物を、それが存在する場合には、電気泳動プロトコールなどから検出することができる。例えば、U.S.特許第5,459,039号を参照されたい。
【0259】
他の具体例において、電気泳動の移動度の変化を用いてPD−L2遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖構造遺伝子多型(SSCP)を用いて変異型および野生型核酸間の電気泳動の移動度の違いを検出してもよい(Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA: 86: 2766、Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125−144; およびHayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73−79)。試料および対照のPD−L2核酸の一本鎖DNAフラグメントを変性させ、次いで復元させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列によって異なり、電気泳動の移動度に関して結果的に生じる変化から、わずか一つの塩基変化も検出することができる。DNAフラグメントは標識プローブを用いて標識または検出することができる。アッセイの感度は、(DNAよりも)二次構造が配列の変化に対してよりセンシティブなRNAを用いることにより高めることができる。好ましい具体例では、目的の方法は、ヘテロ二本鎖の分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二本鎖分子を分離するものである(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5)。
【0260】
さらにもう1つの具体例において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異型または野生型フラグメントの移動を、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)を用いてアッセイする(Myers et al. (1985) Nature 313: 495)。DGGEを分析法として用いる場合、例えば約40bpの高融点のGCに富むDNAのGCクランプをPCRにより追加することによりDNAを修飾して、DNAが完全に変性しないことを保証する。さらなる具体例では、温度勾配を変性勾配の代わりに用いて、対照と試料DNAの移動度の違いを同定する(Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753)。
【0261】
点突然変異を検出するための他の方法の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が包含されるが、これらに限らない。例えば、知られた変異が中心に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが認められる場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的DNAにハイブリダイズさせることができる(Saiki et al. (1986) Nature 324: 164); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230)。オリゴヌクレオチドがハイブリダイジング膜に結合し、そして標識された標的DNAとハイブリダイズする場合、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、PCR増幅された標的DNAまたは多くの異なる変異体にハイブリダイズする。
【0262】
別法として、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅法を、本発明と組み合わせて用いてよい。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、興味ある変異を分子の中心に有していてもよく(その結果、増幅はディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する)(Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437−2448)、あるいは、適当な条件下でミスマッチによりポリメラーゼの伸張が妨げられ、または減じられ得る場合には、ある種のプライマーの3’末端に興味ある変異を有していてもよい(Prossner et al. (1993) Tibtech 11: 238)。さらに、新規な制限酵素部位を変異の領域に導入して、切断に基づいて検出を行うことが望ましい可能性もある(Gasparini et al. (1992) nol. Cell Probes 6:1)。ある具体例において、増幅用Taqリガーゼを用いて増幅を行ってもよいことが予想される(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189)。そのような場合、ライゲーションは、5’配列の3’末端に完全なマッチ(match)が存在する場合にのみ起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定部位での知られた変異の存在を検出することができる。
【0263】
例えば、本明細書に記載する少なくとも一つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予め包装された診断用キットであって、例えばPD−L2遺伝子に関与する疾患または病気の兆項または家族歴を示している患者を診断するために臨床環境で簡便に用いることができる診断用キットを利用することにより、本明細書に記載した方法を行うことができる。
さらに、PD−L2を発現するあらゆる細胞タイプまたは組織を本明細書に記載する予後アッセイに用いてよい。
【0264】
3.臨床試験の間の効果のモニタリング
PD−L2ポリペプチドの発現または活性に対する作用剤(例えば、薬剤)の影響(例えば、細胞増殖および/または移動のモジュレーション)のモニタリングを、基本的な薬剤スクリーニングのみならず臨床試験に適用することができる。例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより決定された作用剤の、PD−L2遺伝子発現、ポリペプチドレベルを増大させ、あるいはPD−L2活性をアップレギュレーションする有効性を、PD−L2遺伝子発現、ポリペプチドレベルの低下、あるいはPD−L2活性のダウンレギュレーションを示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。別法として、スクリーニングアッセイにより決定された作用剤の、PD−L2遺伝子発現、ポリペプチドレベルを減少させ、あるいはPD−L2活性をダウンレギュレーションする有効性を、PD−L2遺伝子発現、ポリペプチドレベル、またはPD−L2活性の上昇を示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。かかる臨床試験において、PD−L2遺伝子、および好ましくは例えばPD−L2関連疾患に関連する他の遺伝子の発現または活性を、特定細胞の表現型の「リードアウト(read out)」またはマーカーとして用いることができる。
【0265】
例えば、そして限定するものではないが、PD−L2活性をモジュレーションする作用剤(例えば、化合物、薬剤または小型分子)(例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される)での処理により細胞においてモジュレーションされるPD−L2などの遺伝子を同定することができる。かくして、例えば臨床試験において、PD−L2関連疾患(例えば、誤調節されたPD−1活性により特徴づけられる)に対する作用剤の影響を研究するために、細胞を単離し、RNAを調製し、PD−L2およびPD−L2関連疾患に関与する他の遺伝子の発現レベルをそれぞれ分析することができる。本明細書記載のノーザンブロット分析またはRT−PCRにより、あるいは別法として産生ポリペプチド量を測定することにより、本明細書に記載の方法の1つにより、あるいはPD−L2または他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより、遺伝子発現のレベル(例えば、遺伝子発現パターン)を定量することができる。このようにして、遺伝子発現パターンは、作用剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして役立ちうる。したがって、個体を作用剤で治療する前および治療中の種々に時点においてこの応答状態を調べてもよい。
【0266】
好ましい具体例において、本発明は、作用剤(例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小型分子、または他の薬剤候補)での対象の治療の有効性をモニタリングする方法を提供し、該方法は、(i)作用剤の投与の前に対象から投与前試料を得る;(ii)投与前試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNA、またはゲノムDNAの発現レベルを調べる;(iii)対象から1またはそれ以上の投与後試料を得る;(iv)PD−L2ポリペプチド、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性のレベルを調べる;(v)投与前試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性のレベルと、投与後試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性のレベルを比較する;次いで(vi)適宜、対象に対する作用剤の投与を変更する工程を含む。例えば、作用剤の投与増加は、PD−L2の発現または活性を検出レベルよりも高いレベルにまで上昇させる、すなわち、作用剤の有効性を高めるために望ましい。あるいはまた、作用剤の投与減少は、PD−L2の発現または活性を検出レベルよりも低いレベルにまで低下させる、すなわち、作用剤の有効性を低くするために望ましい。かかる具体例によれば、観察可能な表現型応答の不存在下においてさえも、PD−L2活性または発現を作用剤の有効性のインジケーターとして用いることができる。
【0267】
D.治療方法:
本発明は、不十分または過剰なPD−L2蛋白の産生あるいはPD−L2野生型蛋白と比較して低いまたは異常な活性を有するPD−L2蛋白形態の産生により特徴付けられる疾病の危険性のある(感受性のある)対象の予防的ならびに治療的処置方法を提供する。そのうえ、本発明の抗−PD−L2抗体を用いてPD−L2蛋白を検出し単離し、PD−L2蛋白の生体利用性を調節し、例えばPD−L2とPD−1との相互作用をモジュレーションすることによりPD−L2活性をモジュレーションすることができる。
【0268】
1.予防方法
1の態様において、本発明は、PD−L2ポリペプチドあるいはPD−L2ポリペプチド発現または少なくとも1つのPD−L2活性をモジュレーションする薬剤を対象に投与することによる、対象において異常なPD−L2発現または活性に関連する疾患または病状を防ぐ方法を提供する。異常なPD−L2発現または活性により誘発されるかまたはそれに起因する疾患の危険がある対象は、例えばここに記載されている診断または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせにより確認され得る。予防薬の投与は、疾患または障害を阻止するかまたは他の場合その進行を遅らせるように、PD−L2の異常を特徴とする徴候が現れる前に行うことができる。PD−L2の異常または症状のタイプにより、例えば、PD−L2ポリペプチド、PD−L2アゴニストまたはPD−L2アンタゴニスト薬剤を、対象処置のために使用することができる。適当な薬剤は、臨床的徴候に基いて決定することができ、例えば本明細書に記載されているスクリーニングアッセイを用いて確認することができる。
【0269】
2.治療方法
本発明のもう1つの態様は、治療目的でPD−L2の発現または活性またはその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用をモジュレーションする方法に関する。PD−L2は、活性化免疫細胞の同時刺激および増殖を阻害し、PD−1を介して阻害性シグナルを免疫細胞に伝達することが示されている。したがって、PD−L2の活性および/または発現、ならびにPD−L2とPD−1との間の相互作用をモジュレーションして、免疫応答をモジュレーションすることができる。PD−L2は阻害性受容体に結合するので、PD−L2活性のアップレギュレーションは免疫応答のダウンレギュレーションを引き起こし、PD−L2活性のダウンレギュレーションは免疫応答のアップレギュレーションを引き起こす。好ましい具体例において、PD−L2は阻害性受容体に結合する。特に好ましい具体例において、PD−L2はPD−1に結合する。
【0270】
本発明のモジュレーション方法は、PD−L2ポリペプチドまたは細胞に結合したPD−L2ポリペプチドの1またはそれ以上の活性をモジュレーションする作用剤と細胞とを接触させることを含む。作用剤は、例えば、PD−L2の発現または活性をモジュレーションするもの、および/またはPD−L2とその本来の結合パートナーとの相互作用をモジュレーションするものである。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。PD−L2ポリペプチド活性をモジュレーションする作用剤は本明細書に記載の作用剤、例えば、核酸またはポリペプチド、PD−L2ポリペプチドの本来の結合パートナー(例えば、PD−1)、PD−L2抗体、PD−L2アゴニストまたはアンタゴニスト、PD−L2アゴニストまたはアンタゴニストのペプチド模倣物、あるいは他の小型分子でありうる。可溶性形態のPD−L2を用いて、PD−1のその本来の結合パートナーまたはリガンドへの結合を妨害してもよい。
【0271】
PD−L2の発現をモジュレーションする作用剤は、例えば、アンチセンス核酸分子、三重鎖オリゴヌクレオチド、リボザイム、またはPD−L2ポリペプチド発現のための組み換えベクターである。例えば、PD−L2翻訳開始部位周辺領域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。典型的には200μg/mlの1またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞培地に添加することができ、あるいは1またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与してPD−L2ポリペプチドの合成を防止することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞により摂取され、PD−L2 mRNAとハイブリダイゼーションし、翻訳を妨害する。別法として、二本鎖DNAに結合して三重鎖構築物を構成し、DNAの巻き戻しおよび転写を妨害するオリゴヌクレオチドを用いることもできる。いずれにせよ結果として、PD−L2ポリペプチドの合成がブロックされる。PD−L2発現がモジュレーションされる場合、かかるモジュレーションはPD−L2遺伝子のノックアウト以外の手段により引き起こされる。
【0272】
作用剤が細胞におけるPD−L2量を制御するという事実により、発現をモジュレーションする作用剤はまた細胞におけるPD−L2活性の全量をモジュレーションする。
1の具体例において、PD−L2をモジュレーションする作用剤は、1またはそれ以上のPD−L2活性を刺激する。かかる刺激剤の例は、活性PD−L2ポリペプチドおよび細胞に導入されたPD−L2をコードする核酸分子を包含する。もう1つの具体例において、作用剤は1またはそれ以上のPD−L2活性を阻害する。好ましい具体例において、作用剤はPD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害または促進する。特に好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。かかる阻害剤の例は、アンチセンスPD−L2核酸分子、抗−PD−L2抗体、PD−L2阻害剤、および主題のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を包含する。さらに好ましい具体例において、阻害剤は抗−PD−L2抗体と抗−PD−1抗体の組み合わせである。
【0273】
これらのモジュレーション方法をインビトロで行なうことができ(例えば、細胞を作用剤と接触させることにより)、あるいはまた、インビボで作用剤と細胞を接触させることにより行なうこともできる(例えば、作用剤を対象に投与することにより)。そのようなものとして、本発明は、PD−L2ポリペプチドのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションから利益を受けるであろう症状または疾病、例えば、PD−L2ポリペプチドまたは核酸分子の望ましくない、不十分な、あるいは異常な発現または活性により特徴付けられる疾病にかかっている個体の治療方法を提供する。1の具体例において、該方法は、PD−L2発現または活性をモジュレーション(例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション)する作用剤(例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより同定される作用剤)または作用剤の組み合わせを投与することを含む。もう1つの具体例において、該方法は、PD−L2ポリペプチドまたは核酸分子を治療薬として投与して、低下した、異常な、あるいは望ましくないPD−L2発現または活性を補償することを含む。
【0274】
PD−L2活性の刺激は、PD−L2が異常にダウンレギュレーションされる状況、および/または増大したPD−L2活性が有益な効果をもたらす可能性のある状況において望ましい。同様に、PD−L2活性の阻害は、PD−L2が異常にアップレギュレーションされる状況、および/または減少したPD−L2活性が有益な効果をもたらす可能性のある状況において望ましい。
【0275】
PD−L2をダウンレギュレーションするのに使用される典型的な作用剤(すなわち、PD−L2アンタゴニスト)は、例えば、アンチセンス核酸、PD−L2を認識しブロックする抗体、PD−L2を認識しブロックする抗体とPD−1を認識しブロックする抗体との組み合わせ、ならびにPD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用をブロックする化合物(例えば、可溶性、1価のPD−L2分子;抗原提示細胞上のFc受容体に結合しない可溶性形態のPD−L2;可溶性形態のPD−L2結合パートナー;または主題のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物)を包含する。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。PD−L2をダウンレギュレーションするのに使用される典型的な作用剤(すなわち、PD−L2アゴニスト)は、例えば、PD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子、多価形態のPD−L2、PD−L2の発現を増加させる化合物、PD−L2とその本来の結合パートナー(例えば、PD−1)との相互作用を促進する化合物、ならびにPD−L2を発現する細胞を包含する。
【0276】
3.免疫応答のダウンレギュレーション
PD−L2ポリペプチドの阻害的機能をアップレギュレーションすることにより免疫応答をダウンレギュレーションする本発明の具体例が多く存在する。ダウンレギュレーションは、すでに進行している免疫応答を阻害または抑制する形態であってもよく、あるいは免疫応答の誘導を妨害することを含むものであってもよい。免疫細胞応答をダウンレギュレーションすることにより、あるいは免疫細胞における特異的アネルギーを誘導することにより、あるいはそれら両方により、活性化された免疫細胞の機能を阻害することができる。
【0277】
例えば、PD−L2が阻害性受容体、例えば、PD−1に結合する具体例において、阻害性受容体に結合するPD−L2の形態、例えば、細胞上の多価PD−L2を用いて免疫応答をダウンレギュレーションすることができる。同様に、さらなる作用剤、例えば、PD−L1とPD−1との相互作用をブロックする作用剤を用いることにより、PD−L2−PD−1相互作用を促進し、さらに免疫応答をダウンレギュレーションすることもできる。
【0278】
1の具体例において、本発明は、PD−L2活性を刺激するために用いられる活性化抗体は二特異的(bispecific)抗体である。例えば、かかる抗体は、PD−L2結合部位および免疫細胞、例えばT細胞、B細胞またはミエロイド細胞上の細胞表面受容体を標的とするもう1つの結合部位を含むものであってよい。1の具体例において、かかる抗体は、PD−L2結合部位のほかに、B細胞抗原受容体、T細胞抗原受容体、またはFc受容体に結合する結合部位をさらに含んでいて、特定の細胞集団に対する分子を標的とするものであってもよい。二特異的抗体に対するこの第2の抗原の選択は、阻害されるべき細胞集団の選択に柔軟性を与える。
【0279】
PD−L2活性を促進する作用剤、あるいはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を促進する作用剤(例えば、PD−L2活性化抗体またはPD−L2活性化小型分子)を、免疫細胞増殖および/またはエフェクター機能を抑制する能力、あるいはインビトロアッセイに付け加えられる場合にはアネルギー誘導能により同定することができる。例えば、活性化受容体を介してシグナルトランスダクションを刺激する作用剤の存在下において細胞を培養することができる。多くの当該分野で認識された細胞活性化のリードアウトを用いて、活性化剤の存在下において例えば細胞増殖またはエフェクター機能(例えば、抗体産生、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス)を測定することができる。この活性をブロックする試験作用剤の能力を、測定すべき増殖またはエフェクター機能の低下に対する作用剤の影響能を測定することにより決定することができる。1の具体例において、低い抗原濃度において、PD−L2−PD−1相互作用は強力なB7−CD28シグナルを阻害する。もう1つの具体例において、高い抗原濃度において、PD−L2−PD−1相互作用はサイトカイン産生を減少させるが、T細胞増殖を阻害しない。したがって、異なった抗原濃度においてサイトカイン産生および/または増殖を測定することにより、活性をグロックする試験化合物の能力を決定することができる。
【0280】
本発明の1の具体例において、抗原とPD−L2アゴニストとの同時投与により特異的抗原に対する寛容が誘導される。例えば、特定のポリペプチドに対して寛容を誘導することができる。1の具体例において、免疫応答が望ましくないアレルゲンまたは外来ポリペプチドに対する免疫応答を抑制することができる。例えば、因子VIIIを受け取った患者は高い頻度でこの凝血因子に対する抗体を産生する。PD−L2活性、またはその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激する作用剤と組換え因子VIIIとの同時投与(または例えば架橋による因子VIIIへのPD−L2の物理的結合)は免疫応答のダウンレギュレーションを引き起こす可能性がある。
【0281】
1の具体例において、PD−L2アゴニストおよび免疫細胞上の同時刺激受容体の活性をブロックする別の作用剤を用いて免疫応答をダウンレギュレーションすることができる。典型的な分子は下記のものを包含する:アゴニスト形態の他のPD−1リガンド(例えば、PD−L1)、可溶性形態のCTLA−4、抗−B7−1抗体、抗−B7−2抗体、またはそれらの組み合わせ。あるいはまた、2つの別個のペプチド(例えば、PD−L2ポリペプチドとブロッキング形態のB7−2および/またはB7−1)、または抗体の組み合わせ(例えば、PD−L2ポリペプチドに対する活性化抗体とブロッキング抗−B7−2および/またはB7−1モノクローナル抗体)を1つの組成物にまとめて、あるいは別個に投与(同時投与または逐次投与)して、対象における免疫細胞により媒介される免疫応答をダウンレギュレーションすることができる。さらにそのうえ、PD−L2ポリペプチド活性を有する治療的に活性のある量の1またはそれ以上のペプチドを、B7−1および/またはB7−2活性を有する1またはそれ以上のポリペプチドと一緒に、他のダウンレギュレーション薬剤とともに使用して免疫応答に影響を及ぼすことができる。他の免疫モジュレーション薬剤の例は、同時刺激シグナルをブロックする抗体(例えば、CD28またはICOSに対するもの)、CTLA4を介して阻害性シグナルを活性化させる抗体、および/または他の免疫細胞マーカーに対する抗体(CD40、CD40リガンド、またはサイトカインに対するもの)、融合蛋白(例えば、CTLA4−FcまたはPD−1−Fc)、ならびに免疫抑制剤(例えば、ラパマイシン、サイクロスポリンA、またはFK506)を包含する。
【0282】
PD−L2ポリペプチドは、細胞の破壊により免疫細胞機能をブロックする治療薬の構築においても有用でありうる。例えば、PD−L2ポリペプチドの部分をトキシンに連結して、結合すべき細胞の破壊の引き金を引くことのできる細胞毒性作用剤を作成することができる。
【0283】
細胞毒性作用剤を作成するために、当該分野で知られた方法、例えば、架橋または組換えDNA法により本発明のポリペプチドをトキシンに連結あるいは作動可能に結合させてもよい。一般的には、免疫トキシンの調製は当該分野においてよく知られている(例えば、米国特許第4340535号および欧州特許第44167号、両方を参照により本明細書に一体化させる)。多くのタイプのジスルフィド結合含有リンカーが知られており、それらをうまく用いてトキシン部分とポリペプチドとを抱合させることができる。1の具体例において、インビボにおいてより高い安定性があり、それゆえ作用部位における結合の前のトキシン放出を防止るするので、立体的に「隠れた」ジスルフィド結合含有リンカーが好ましい。
【0284】
広範なトキシンが当該分野で知られており、それらを本発明のポリペプチドまたは抗体に抱合させてもよい。例は下記のものを包含する:多くの有用な植物、真菌または細菌由来のトキシン。それらは、例えば、以下のものを包含する:種々のA鎖トキシン、特にリシンA鎖;サポニンまたはゲロニンのごときリボソーム不活性化蛋白;アルファ−サルシン;アスペルギリン;レストリクトシン;および胎盤リボヌクレアーゼのごときリボヌクレアーゼ、血管形成剤、ジフテリアトキシン、あるいはシュードモナス外毒素。本発明における使用に好ましいトキシン部分は、炭水化物残基を修飾または除去するように処理されたトキシンA鎖、脱糖鎖A鎖(米国特許第5776427号)である。
【0285】
かかる細胞毒性作用剤の1またはそれ以上の組み合わせ(後、PD−L2−リシン単独またはPD−L1−リシンとの組み合わせ)を患者に輸液することは、特に、活性化免疫細胞が多量のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1を産生するという事実を考慮すれば、免疫細胞の死滅を引き起こしうる。例えば、PD−1は活性化リンパ球の表面上で誘導されるので、PD−L2ポリペプチドを用いて、Fc−R依存的機構によりあるいはPD−L2への細胞毒性薬剤(例えば、リシン、サポニン、またはカリヘアミシン)を抱合させることによる剥奪により、これらの特定細胞の枯渇を標的とすることができる。もう1つの具体例において、トキシンを抗−PD−L2抗体に抱合させて、PD−L2を発現する抗原提示細胞の死滅を標的とすることができる。さらなる具体例において、PD−L2抗体−トキシンは二特異的抗体でありうる。かかる二特異的抗体は、例えば、特定タイプの細胞上、例えば、Bリンパ球、単球、樹状細胞、またはランゲルハンス細胞上にのみ見出されるマーカーを用いて、特定の細胞集団を標的化するのに有用である。
【0286】
PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の活性化による免疫応答のダウンレギュレーション(かくしてPD−1の負のシグナリング機能を刺激する)は、免疫応答、例えば、in situでの組織、皮膚および器官移植、対宿主移植片疾患(GVHD)、またはアレルギー、または全身性エリトマトーデスおよび多発性硬化症のごとき自己免疫疾患における免疫応答のダウンレギュレーションに有用である。典型的には、組織移植において、移植片拒絶反応は、免疫細胞がそれを外来物と認識しすることから生じ、次いで、移植片を破壊する免疫反応が起こる。PD−L2の活性または免疫細胞上の本来の結合パートナー(例えばPD−1)とPD−L2との相互作用を促進する分子(例えば、可溶性、多価形態のPD−L2ポリペプチド)の投与は、移植の前の時点で、単独あるいは別のダウンレギュレーション作用剤と一緒になって、同時刺激シグナルの発生を阻害しうる。そのうえ、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の促進(よって、PD−1の阻害性シグナル)は免疫細胞に拮抗するに十分であり得、そのことにより対象に寛容が誘導される。PD−1により媒介される阻害性シグナルを促進することによる長期寛容の誘導は、これらの活性化剤の繰り返し投与の必要性を回避しうる。
【0287】
十分な免疫抑制または寛容を対象中で達成するには、他の分子の同時刺激機能をブロックすることが望ましいかもしれない。例えば、移植前の時点で、これらの抗原の各々の活性を有する可溶性形態のペプチドの組み合わせ、あるいはこれらの抗原に対するブロッキング抗体を投与することにより(別個にあるいは1の組成物として)、B7−1およびB7−2の機能をブロックすることが望ましいかもしれない。別法として、PD−L2の阻害活性を促進し、B7−1および/またはB7−2の同時刺激活性を阻害することが望ましいかもしれない。本発明のダウンレギュレーション法と一緒に使用されうる他のダウンレギュレーション作用剤は、例えば、CTLA4を介して阻害性シグナルを伝達する作用剤、可溶性形態のCTLA4、CTLA4を介して阻害性シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーに対するブロッキング抗体、または可溶性形態の他の受容体リガンドペアー(例えば、CD40とCD40リガンドとの間の相互作用を破壊する作用剤(例、抗CD40リガンド抗体))、サイトカインに対する抗体、または免疫抑制剤を包含する。
【0288】
例えば、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を活性化させること(かくして該結合パートナーの阻害性機能)は、自己免疫疾患の治療において有用でありうる。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対し上反応性があり、疾病の病理に関与するサイトカインおよびい自己抗体の産生を促進する免疫細胞の不適当な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を防止することは疾病の徴候を減少または除去しうる。PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を活性化させる作用剤の投与は、疾病からの長期寛解を誘導しうる自己反応性免疫細胞の抗原特異的寛容を誘導しうる。さらに、B7分子と同時刺激受容体との受容体−リガンド相互作用を破壊することにより免疫細胞の同時刺激をブロックする作用剤の同時投与は、免疫細胞活性化において有用であり得、その結果、疾病プロセスに関与しうる自己抗体またはサイトカインの産生が防止される。自己免疫疾患を防止または改善することにおける薬剤の有効性を、ヒト自己免疫疾患に関する十分に特徴付けられた多くの動物モデルを用いて調べることができる。例は、ネズミ実験自己免疫脳炎、MRL/lpr/lprマウスまたはNZBハイブリッドマウスにおける全身性エリトマトーデス、ネズミ自己免疫コラーゲン関節炎、NODマウスおよびBBラットにおける真性糖尿病、ならびにネズミ実験重症筋無力症(Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp.840−856参照)を包含する。
【0289】
免疫細胞活性化の阻害は、例えば、IgE産生を阻害することにより、アレルギーおよびアレルギー性反応の治療において有用である。PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を促進する作用剤をアレルギーの対象に投与して、対象における免疫細胞により媒介されるアレルギー性応答を阻害することができる。PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激することを、適当なMHC分子と一緒にアレルゲンに曝露することにより行なうことができる。アレルゲンの侵入経路および肥満細胞または好塩基球上のIgE沈着パターンにより、アレルギー性反応は全身的または局所的な性質であってよい。かくして、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用を促進する作用剤の投与により、免疫細胞により媒介されるアレルギー性応答を全身的または局所的に阻害することができる。
【0290】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の刺激による免疫細胞活性化の阻害は、免疫細胞の病原体感染(ウイルスまたは細菌による)において治療的に重要でもある。例えば、後天性免疫不全症候群(AIDS)において、免疫細胞活性化によりウイルス複製が刺激される。PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の刺激はウイルス複製を阻害する可能性があり、そのことによりAIDSの経過が改善されうる。
【0291】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の刺激による免疫応答のダウンレギュレーションは、妊娠の維持を促進することにおいても有用でありうる。通常には、PD−L2は胎盤栄養芽胞、すなわち母体と胎児との間の界面を形成する層において高発現され、胎児の母体拒絶反応を防止する役割を果たしている。胚または胎児の免疫学的拒絶反応により自発的流産の危険のあるメス(例えば、「予後アッセイ」に記載のPD−L2活性のスクリーニングにより同定されるメス、すでに自発的流産をしたことのあるメス、あるいは妊娠混合物延性を有するメス)を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激する作用剤で処置することができる。
【0292】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の刺激による免疫応答のダウンレギュレーションは、自己由来の組織の自己免疫攻撃の治療にも有用でありうる。例えば、通常には、PD−L2は心臓で高発現され、心臓を自己免疫攻撃から防御する。このことは、Balb/c PD−1ノックアウトマウスが激しい自己免疫攻撃により心臓に血栓を生じるという事実により明らかである。かくして、自己免疫攻撃により引き起こされあるいは悪化させられる症状(好ましくは例において、心臓疾患、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化)が、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の増加により改善または軽快されうる。それゆえ、自己免疫疾患のごとき自己免疫攻撃により悪化させられる症状(ならびに心臓疾患、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化のごとき症状)を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激することによりモジュレーションすることは本発明の範囲内である。
【0293】
さらなる具体例において、本明細書記載のいずれかの方法を実施する場合、PD−L2およびPD−L1の両方の活性を刺激することにより免疫応答をダウンレギュレーションすることは本発明の範囲内である。PD−L1はさらなるPD−1リガンドであり、同時係属の米国出願第09/644934号;国際公開第WO01/14557号;Dong, H. et al. (1999) Nat. Med. 5: 1365−1369;およびFreemen, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034に記載されており、それぞれの内容を参照により本明細書に一体化させる。さらなる具体例において、本明細書記載のいずれかの方法を実施する場合、1またはそれ以上のさらなる薬剤を投与することにより免疫応答をダウンレギュレーションすることは本発明の範囲内である。例えば、免疫応答をダウンレギュレーションすることが知られている他の作用剤を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激する作用剤と一緒に使用することができる。
【0294】
4.免疫応答のアップレギュレーション
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の阻害は、免疫応答をアップレギュレーションする手段として、治療においても有用である。免疫応答のアップレギュレーションは、存在している免疫応答を高めるかまたは初期免疫応答を誘導する形態であり得る。例えば、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の阻害により免疫応答を促進することは、微生物、例えば細菌、ウイルス、または奇生体の感染の場合において、あるいは免疫抑制の場合において有用でありうる。例えば、1の具体例において、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用を阻害する作用剤、例えば、PD−L2に対する非活性化抗体(すなわち、ブロッキング抗体)、PD−L2およびPD−L1に対する非活性化抗体の組み合わせ、あるいは可溶性形態のPD−L2は、より迅速かつ完全なウイルス、細菌または寄生体のクリアランスを生じさせる抗体および細胞により媒介される応答のアップレギュレーションが有益であろう場合に、in situにおいて治療的に有用である。これらの症状は、ウイルス性皮膚疾患、例えばヘルペスまたは帯状疱疹を包含し、それらの場合において、かかる作用剤を局所的に皮膚にデリバリーすることができる。さらに、インフルエンザ、通常のカゼ、および脳炎のごとき全身性ウイルス疾患を、かかる作用剤を全身投与することにより改善することができる。特定の例において、免疫応答をアプレギュレーションする他の作用剤、例えば、同時刺激受容体を介してシグナルを伝達するB7ファミリーのメンバーの形態の他の作用剤をさらに投与して免疫応答をさらに改善することが望ましいかもしれない。
【0295】
別法として、免疫細胞を患者から取り、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤と免疫細胞をインビトロで接触させ、次いで、インビトロで刺激された免疫細胞を患者中に再導入することにより、感染患者における免疫応答を促進することができる。もう1つの具体例において、免疫応答を促進する方法は、感染細胞、例えばウイルス感染細胞を患者から単離し、本来の結合パートナー、例えばPD−1に結合できない形態のPD−2をコードする核酸分子でそれらの感染細胞をトランスフェクションして、細胞がその表面にPD−L2分子の全体または一部を発現するようにし、次いで、トランスフェクションされた細胞を患者に再導入することを含む。トランスフェクションされた細胞は阻害性シグナルを妨害し、そのことによりインビボで免疫細胞を活性化しうる可能性がある。
【0296】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤を、種々のポリペプチド、例えば、病原体由来のポリペプチドに対するワクチン中に予防的に使用することができる。適当なアジュバント中のPD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤とともにウイルスポリペプチドを接種することにより、病原体、例えば、ウイルスに対する免疫を誘導することができる。別法として、病原性抗原およびPD−L2−PD−1相互作用をブロックする形態のPD−L2の両方をコードする遺伝子を含むベクターを接種に使用することもできる。例えば、注射(例えば、筋肉内、経皮注射、あるいは粒子を皮膚に注入するための特殊な加速装置または圧縮空気を用いる遺伝子銃でのDNA被覆金粒子の表皮中への注入)により核酸ワクチンを投与することができる。別法として、非侵襲的手段により核酸ワクチンを投与することもできる。例えば、純粋または脂質処方されたDNAを呼吸器系にデリバリーし、あるいは他の場所、例えば、DNAの経口デリバリーによりパイエル板を標的とすることができる(Schubbert (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:961)。弱毒化微生物を用いて粘膜表面にデリバリーすることができる(Sizemore et al (1995) Science 270:29)。
【0297】
もう1つの具体例において、ワクチン中の抗原は自己抗原である。かかるワクチンは生物における寛容のモジュレーションにおいて有用である。自己抗原およびPD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー(例えばPD−1)との相互作用をブロックする作用剤での免疫は、寛容を破壊(すなわち、自己抗原に対する寛容を妨害)する可能性がある。かかるワクチンは、アラム(alum)のごときアジュバントまたはサイトカイン(例えば、GM−CSF、IL−12、B7−1、またはB7−2)を含んでいてもよい。
【0298】
1の具体例において、例えば、PD−L2ポリペプチドまたはブロッキング抗体およびMHCクラスIα鎖ポリペプチドおよびβ2ミクログロブリンを同時発現するようにトランスフェクションされた細胞により、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤をクラスI MHCポリペプチドとともに投与して、T細胞を活性化させ、感染に対する免疫を生じさせることができる。例えば、ワクチンが有用であるウイルス病原体は以下のものを包含する:B型肝炎、C型肝炎、Epstein−Barrウイルス、サイトメガロウイルス、HIV−1、HIV−2、結核、マラリアおよび住血吸虫。
【0299】
もう1つの適用例において、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の阻害は、腫瘍免疫の治療において有用でありうる。腫瘍細胞(例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血球、神経芽腫、または癌腫)を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する核酸分子でトランスフェクションすることができる。これらの分子は、例えば、PD−L2に対してアンチセンスである核酸分子であってもよく、あるいは非活性化抗−PD−L2抗体または抗−PD−L2および抗−PD−1抗体の組み合わせをコードするものであってもよい。これらの分子は抗−PD−L2抗体および/または抗−PD−1抗体の可変領域であってもよい。所望ならば、同時刺激を活性化させる他のポリペプチド(例えば、B7−1またはB7−2)で腫瘍細胞をトランスフェクションすることもできる。トランスフェクションされた腫瘍細胞を患者に戻し、そのことによりPD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の阻害(例えば、局所的阻害)が起こる。別法として、遺伝子治療法を用いて標的腫瘍細胞をインビボでトランスフェクションすることもできる。
【0300】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤で患者を処置することによって、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害することにより、腫瘍細胞に対する免疫応答の刺激を行なうことができる。かかる作用剤の好ましい例は、例えば、アンチセンス核酸分子、PD−L2を認識しブロックする抗体、PD−L2を認識しブロックする抗体とPD−L1を認識しブロックする抗体との組み合わせ、ならびに免疫細胞上の本来の結合パートナーとPD−L2との相互作用をブロックする化合物(例えば、可溶性の1価PD−L2分子;抗原提示細胞上のFc受容体に結合しない可溶性形態のPD−L2分子;可溶性形態のPD−L2結合パートナー;および主題スクリーニングにおいて同定される化合物)を包含する。最も好ましい具体例において、PD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0301】
さらに、MHCクラスIまたはMHCクラスII分子を欠くか、または十分な量のMHCクラスIまたはMHCクラスII分子を発現し得ない腫瘍細胞は、MHCクラスIα鎖蛋白およびβ2ミクログロブリン蛋白またはMHCクラスIIα鎖蛋白およびMHCクラスIIβ鎖蛋白の全部または一部(例えば、細胞質−ドメイン末端切断部分)をコードする核酸でトランスフェクションされることにより、細胞表面でMHCクラスIまたはMHCクラスII蛋白を発現し得る。PD−L2阻害性ポリペプチドまたはアンチセンス核酸と共に適当なクラスIまたはクラスII MHCを発現させると、トランスフェクション腫瘍細胞に対してT細胞媒介免疫応答が誘導される。所望により、MHCクラスII関連蛋白、例えば不変鎖の発現をブロックするアンチセンス構築物をコードする遺伝子はまた、PD−L2ポリペプチドをコードするDNAと共トランスフェクションされることにより、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘導し得る。B7陰性ネズミ腫瘍細胞によるB7−1の発現は、腫瘍拒絶および長期間防御を伴うT細胞により媒介される特異的免疫を誘導することにより、マウスにおける腫瘍攻撃を行うことが示された(Chen,L.ら(1992)Cell71、1093−1102、Townsend,S.E.および Allison,J.P.(1993)Science259、368−370、Baskar,S.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90、5687−5690)。かくして、ヒト対象における免疫細胞により媒介される免疫応答の誘導は、対象において腫瘍特異的寛容を打ち負かすのに十分であり得る。
【0302】
もう1つの具体例において、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の阻害により免疫応答を刺激して、すでに存在している寛容を克服することができる。例えば、対象が有意な免疫応答をマウントできない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤を投与することにより誘導することができる。PD−1アンタゴニストをアジュバントとして用いて、能動免疫のプロセスにおいて外来抗原に対する応答を増強することができる。
【0303】
1の具体例において、免疫細胞を対象から入手し、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤の存在下、エクスビボで培養してT細胞集団を増大させる。さらなる具体例において、その後、免疫細胞を対象に投与する。例えば、当該分野において知られているように、T細胞に一次活性化シグナルおよび同時刺激シグナルを提供することにより、T細胞をインビトロで刺激して増殖させることができる。また、様々な形態のPD−L2ポリペプチドを用いてT細胞の増殖を同時刺激することもできる。1の具体例において、PCT出願第WO94/29436号記載の方法に従い免疫細胞をエクスビボで培養する。共刺激分子は、可溶性であってもよく、細胞膜に結合されるかまたは固体表面、例えばビーズに結合され得る。
【0304】
さらなる具体例において、本明細書記載のいずれかの方法を実施する場合、1またはそれ以上のさらなる薬剤を投与することにより免疫応答をアップレギュレーションすることは本発明の範囲内である。例えば、サイトカイン、アジュバント、または刺激性形態の同時刺激分子またはそれらのリガンドのごとき免疫応答を刺激することが知られている他の作用剤を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤と一緒に使用することができる。例えば、PD−L1を阻害する作用剤(例えば、PD−L1に対するブロッキング抗体)をPD−L2を阻害する作用剤(例えば、PD−L2に対するブロッキング抗体)と一緒に使用することができる。PD−L1は同時係属米国出願第09/644934号;国際公開第WO01/14557号;Dong, H. et al. (1999) Nat. Med. 5:1365−1369;およびFreemen, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034(各内容を参照により本明細書に一体化させる)に記載されている、さらなるPD−1リガンドである。
【0305】
E.PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用のモジュレーションによりモジュレーションされるサイトカインの同定
本明細書記載のPD−L2分子を用いて、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用のモジュレーションに応答した免疫細胞により産生されるサイトカイン、あるいは産生がそのような免疫細胞中で促進されるサイトカインを同定することができる。T細胞は1次活性化シグナルで最適以下にインビトロ刺激され得、例えば、T細胞は、ホルボールエステル、抗CD3抗体または好ましくはMHCクラスII分子を随伴した抗原で刺激されることができ、刺激性形態のGL50抗原により同時刺激シグナルを与えられることができ、例えばGL50ポリペプチドをコードしその表面でペプチドを発現させる核酸でトランスフェクションされた細胞により、または可溶性、刺激性の形態のペプチドにより、同時刺激シグナルを与えられることができる。次いで、細胞を、PD−L2発現細胞と接触させ、そして/あるいはPD−L2−PD−1相互作用を阻害する作用剤(例えば、PD−L2に対する抗体、またはPD−L2に対する抗体とPD−L1に対する抗体との組み合わせ)で処理することができる。培地中に放出された知られたサイトカインを、ELISAにより、あるいはサイトカインをブロックして免疫細胞の増殖または該サイトカインにより誘導される他の細胞タイプの増殖を阻害する抗体の能力により同定することができる。例えば、IL−4 ELISAキットはIL−7ブロッキング抗体の場合と同様ジェンザイム(ケンブリッジ、マサチューセッツ)から入手できる。IL−9およびIL−12に対するブロッキング抗体は、ジェネティクス・インスティテュート(ケンブリッジ、マサチューセッツ)から入手できる。次いで、サイトカインのプロファイルに基づいてPD−L2活性またはPD−L2とPD−1との相互作用の刺激またはブロッキングの効果を調べることができる。
【0306】
上記のインビトロでの免疫細胞同時刺激アッセイを、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用のモジュレーションによりモジュレーションされうる新規サイトカインを同定する方法に使用することができる。例えば、CD28/CTLA4経路の刺激がIL−2分泌を促進すると思われる場合、ICOS経路の刺激はIL−10分泌を促進すると思われる(Hutloffら、199、Nature 397:263)。同時刺激により誘導される特定の活性、例えば免疫細胞増殖を既知サイトカインに対するブロッキング抗体の添加により阻害できない場合、その活性は未知サイトカインの作用から生じるものである可能性がある。同時刺激後、慣用的方法によりこのサイトカインを培地から精製し、免疫細胞増殖を誘導する活性によりその活性を測定することができる。
【0307】
寛容の誘導においてある一定の役割を演じ得るサイトカインを同定するために、上記のインビトロT細胞共刺激性アッセイを使用することができる。この場合、T細胞は、1次活性化シグナルを与えられ、選択されたサイトカインと接触させられるが、共刺激性シグナルは与えられない。免疫細胞を洗浄し、休止させた後、細胞を1次活性化シグナルおよび共刺激性シグナルの両方により再攻撃する。免疫細胞が応答(例、サイトカインを増殖または生産)しない場合、それらは寛容にされており、サイトカインは寛容の誘導を妨害していない。しかしながら、免疫細胞が応答する場合、寛容の誘導はサイトカインにより妨害されている。寛容の誘導を妨害し得るそれらのサイトカイン類は、移植レシピエントまたは自己免疫疾患対象において寛容を誘導するより有効な手段としてBリンパ球抗原をブロックする試薬と共にインビボでのブロックに関して標的化され得る。例えば、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用を促進する作用剤とともにサイトカインブロッキング抗体を投与することができる。
【0308】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、実施例は限定的なものとして解釈されるべきではない。本出願中に引用される全文献、特許および公開された特許出願の内容ならびに図および配列表を参照により本明細書に一体化させる。
【0309】
実施例
下記の材料および方法は実施例1〜9に使用された。
【0310】
材料および方法
マウス
Hoffman−La Roche, Nutley, NJにより、IAdに関連してOVAペプチド(323−339)に特異的なTCR導入遺伝子(DO11.10)が提供された。Taconic Farms (Germantown, NY)からBalb/cマウスを得た。すべてのマウスは生後6〜12週目のものを用いた。協会のガイドラインに従ってマウスを世話した。
【0311】
分子クローニング
PD−L1に対して38%のアミノ酸同一性を有するものとして同定されたGenbank受託番号AF142780(本明細書において、マウスPD−L2ともいう)をクエリー配列として、ヒトPD−L1蛋白配列を用いて、Center for Biotechnology Information (NCBI)の非重複データベースのBLAST検索を行なった。PD−L1は、同時係属の米国出願第09/644,934号; 国際公開第WO 01/14557号; Dong, H. et al. (1999) Nat. Med. 5:1365−1369; および Freeman, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034(各内容を参照により本明細書に一体化させる)に記載されているPD−1リガンドである。5’−dGtcgaccaccatgctgctcctgctgccgata−3’ (配列番号:7)および5’−dGTCGACTCACTAGATCCTCTTTCTCTGGATTATCAC−3’ (配列番号:8)をプライマーとして用いるPCRによりAF142780コーディング領域を増幅し、pEF6(Invitrogen, Carlsbad, CA)中にクローン化した。NCBI ESTデータベースの検索により、ネズミPD−L2に対して相同性がある2つのヒト胎児心臓EST(GenBank受託番号AA247117およびAA247128)が同定された。5’−dGTACATAATAGAGCATGGCAGCA−3’ (配列番号:9)および5’−dCCACCTTTTGCAAACTGGCTGT−3’ (配列番号:10)をプライマーとして用いて101bpの領域を増幅した。PCR生成物をビオチン標識し、pAXEFベクター中のヒト胎盤cDNAライブラリー(Freeman, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med.192:1027−1034)からCloncapture(Clontech, Palo Alto, CA)から完全長cDNAを単離するために使用した。完全長ヒトPD−L2 cDNA配列はGenBankに寄託されている(受託番号が付与される)。
【0312】
融合蛋白および細胞トランスフェクション
Ig融合蛋白は、ネズミIgγ2aのヒンジ−CH2−CH3ドメインに連結された受容体の完全な細胞外領域からなっており(Fc受容体および補体結合をブロックする4つの点突然変異を伴う)、その結果、Ig(γ2a)融合物が得られる(Duncan, A.R. et al. (1988) Nature 332:563−564; Morgan, A. et al. (1995) Immunology 86:319−324)。対照Igは、ネズミIgγ2aに連結したオンコスタチン−Mリーダー配列からなる。これらの組換え蛋白は安定にトランスフェクションされたCHO細胞系において産生され、プロテインA−セファロースを用いて馴らし培地から精製された。pEF6中のネズミPD−L2 cDNAをScaIにより線状とし、ホスホグリセラートキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にあるプロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド構築物とともにCHO.I−AdまたはCHO.I−Ad.mB7−2細胞中に同時エレクトロポレーションした。pAXEF中のヒトPD−L2 cDNAをApaIで線状にし、ホスホグリセラートキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にあるプロマイシン耐性遺伝子とともにCHO.K1細胞中に同時トランスフェクションした。10μg/mlプロマイシン中でトランスフェクション体を選択し、hPDI.Igで染色し、ソーティングし、次いで、限界希釈法によりクローン化した。
【0313】
ノーザンブロット分析
製造者の指示に従って、マウスおよびヒトの多数の組織のノーザンブロット(Clontech, Palo Alto, CA)を、QuikHyb (Stratagene, La Jolla, CA)中の32P−dCTP放射性標識cDNAプローブでプローブした。ヒトPD−L2プローブは、コーディング領域および3’UTR配列を含む1.2kbのXbaIフラグメントからなっていた。マウスPD−L2プローブは、コーディング領域を含む444kbのKpnI/EcoRV cDNAフラグメントからなっていた。2X SSC, 0.1% SDS中室温で、次いで、0.1X SSC, 0.1% SDS中、65℃で、ブロットを室温で2回洗浄し、そしてラジオオートグラフィーにより試験した。
【0314】
フローサイトメトリー
PD−L2を検出するために、5x104個のトランスフェクションされた細胞を、5μg/mlのヒトPD−1Ig(hPD−1.Ig)(Genetics Institute, Cambridge, MA)とともにインキュベーションし、ヤギ抗−マウスIgG2a−フィコエリスリン(PE)(Southern Biotechnology Associates Inc, Birmingham, AL)で発色させた。さらに、5μg/mlの抗−IAd−PEまたはB7.2−PE(Pharmingen, San Diego, CA)で別々に染色した。
CD4+T細胞をビオチン化抗−PD−1(またはビオチン化抗−CD28(Pharmingen)もしくはビオチン化抗−CD25(Pharmingen)とともにインキュベーションし、ストレプトアビジン−PE(Pharmingen)で染色した。Pharmingenからすべてのイソタイプ対照を得た。各工程後、PBS/1% BSA/0.02% アジ化ナトリウムで細胞を3回洗浄した。最終インキュベーション後、細胞を1%パラホルムアルデヒドで固定した。FACSCalibar(Becton Dickinson, Mountain View, CA)にて1万のイベントを分析した。すべてのイソタイプ対照をPharmingenから得た。
【0315】
T細胞の活性化
活性化された抗原に特異的なT細胞を得るために、DO11.10マウスから脾臓細胞を調製し、Tris−NH4Clで処理して赤血球を枯渇させた。10% FCS (Sigma, St Louis, MO), 2 mM L−グルタミン, 100 U/ml ペニシリン,l00 mg/ml ストレプトマイシン, 250 ng/ml アンホテリシンB, l0 mM Hepes, 50 pM 2−ME (すべてLife Technologiesから得た) および 15 mg/ml of ゲンタマイシン (BioWhittaker, Walkersville, MD)を補足したRPMI 1640(Life Technologies, Grand Island, NY)中で、1μg/mgのOVAペプチド(Analytical Biotechnology Services, Boston, MA)とともに細胞を72時間培養した。磁気活性化細胞ソーティング分離カラム(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用いるポジティブセレクションによりCD4+T細胞を精製して、98%よりも高純度とした。再刺激の前に細胞を一晩休止させた。
【0316】
T細胞のビーズ刺激
抗−CD Ab(2C11; Pharmingen, La Jolla, CA)、mPD−L2.Igおよび対照Igをポリウレタン被覆トシル−活性化Dynabeads(Dynal, Lake Success, NY)に共有結合させた。一定の最適以下の抗−CD3 Ab濃度(全結合蛋白の60%)およびmPD−L2.Igまたは対照Ig(全結合蛋白の40%)を用いてビーズを調製した。ビーズは、ビーズ107個あたり5μgの蛋白結合能を有する。細胞エンリッチメントカラム(R & D Systems, Minneapolis, MN)を用いるネガティブセレクションによりBalb/cリンパ節からT細胞を精製した。示された被覆トシルビーズ:細胞比を2:1として、96ウェルプレート中でウェル1個あたり0.5〜1x105個のT細胞を培養した。72時間の培養中最後の10時間における[3H]−チミジン取りこみにより増殖を測定した。
【0317】
T細胞のCHO細胞刺激
50μg/mlのマイトマイシンC(Bristol Laboratories, Princeton, NJ)とともに37℃で16時間インキュベーションすることにより、トランスフェクションされたCHO細胞の増殖を阻害した。インキュベーション期間の終わりに、PBS中の10mM EDTAとともに細胞を収穫し、2回洗浄し、氷上で1時間放置した。次いで、細胞を3回洗浄し、培地に再懸濁した。105個のすでに活性化されているCD4+T細胞を、種々の濃度のOVAペプチドおよび104個のマイトマイシン処理されたCHOトランスフェクション対とともに培養した。増殖をアッセイするために、培養物を48時間インキュベーションし、1μCi/ウェルの[3H]チミジン(New England Nuclear, Boston, MA)で少なくとも6時間のインキュベーション期間の間パルスした。
【0318】
サイトカインELISA
培養後種々の時点で上清の一部を取った。Pharmingenから得たmAbsおよび組換えサイトカイン標準を用いてIL−2、IL−4、IFN−γおよびIL−10レベルを分析した。検出限界は以下のおり:IL−2:20pg/ml;IL−4:40pg/ml;IFN−γ:100pg/ml;およびIL−10:200pg/ml。
【0319】
RNAase保護アッセイ(RPA)
種々のCHO細胞トランスフェクション体および0.01μg/ml OVAペプチドでCD4+T細胞を再度刺激した。48時間後、細胞を取り、TRIzolR試薬(Life Technologies, Grand Island, NY)を用いてmRNAを単離した。製造者(Pharmingen, San Diego, CA)の指示に従ってRiboQuantマルチポアキット mCK1を用いてRNAase保護アッセイにより5μgのmRNAをサイトカインレベルに関して分析した。
【0320】
細胞周期分析
上記のごとく0.01μg/mlペプチドおよびCHO細胞トランスフェクション体でCD4+T細胞を再刺激した。培養36時間後、細胞を回収し、抗−CD4−FITCで染色した。細胞をPBSで洗浄し、氷上で70%エタノールで1時間固定し、次いで、10μg/ml RNase(Sigma, St. Louis, MO)および50μg/mlヨウ化プロピジウム(Sigma)を含有するPBSに再懸濁した。染色から1時間以内にFACSalibarを用いて分析を行なった。
【0321】
実施例1:ヒトおよびマウスのPD−L2 cDNAの同定および特徴付け
この実施例において、ヒトPD−L2およびマウスPD−L2をコードする遺伝子の同定および特徴付けを説明する。
【0322】
ヒトPD−L2 cDNAの単離
本発明は、少なくとも一部には、本明細書でヒトPD−L2と称する新規ポリペプチドをコードするヒト遺伝子の発見に基づく。ヒトPD−L2 cDNAはヒト胎盤cDNAライブラリーから、ヒトEST AA247117をプローブとして用いて単離された。ヒトPD−L2の全配列を決定し、ヒト「PD−L2」と呼ばれる読み取り枠を含むことがわかった。
ヒトPD−L2をコードするヌクレオチド配列を図1および配列番号:1に示す。この核酸によりコードされるポリペプチドは約273個のアミノ酸を含み、図1および配列番号:2に示すアミノ酸配列を有する。配列番号:1のコーディング領域(読み取り枠)を配列番号:3に示す。
マウスPD−L2をコードするヌクレオチド配列を図2および配列番号:4に示す。この核酸によりコードされるポリペプチドは約247個のアミノ酸を含み、図2および配列番号:5に示すアミノ酸配列を有する。配列番号:4のコーディング領域(読み取り枠)を配列番号:6に示す。
【0323】
ヒトおよびマウスのPD−L2分子の分析
シグナルペプチドの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ1〜19にアミノ酸配列中のシグナルペプチドドメインが同定された(図3)。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ1〜19にアミノ酸配列中のシグナルペプチドドメインがさらに同定された(図3)。
また、IgVドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ20〜120(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ1〜101のアミノ酸配列中にIgVドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ20〜120(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ1〜101のアミノ酸配列中にIgVドメインが同定された。
さらに、IgCドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ121〜219(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ102〜200のアミノ酸配列中にIgCドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ121〜219(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ102〜200のアミノ酸配列中にIgCドメインが同定された。
さらに、細胞外ドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ1〜219(図1)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ1〜200のアミノ酸配列中に細胞外ドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ1〜219(図2)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ1〜200のアミノ酸配列中に細胞外ドメインが同定された。
さらに、膜貫通ドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ220〜243(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ201〜224のアミノ酸配列中に膜貫通ドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ220〜242(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ201〜223のアミノ酸配列中に膜貫通ドメインが同定された。
さらに、細胞質ドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ244〜273(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ225〜254のアミノ酸配列中に細胞質ドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ243〜247(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ224〜228のアミノ酸配列中に細胞質ドメインが同定された。
マウスPD−L2蛋白は、マウスPD−L1に対して38%のアミノ酸同一性を有する(図6参照)。マウスおよびヒトのPD−L2は70%のアミノ酸同一性を有し(図6)、ヒトおよびネズミのB7−1またはB7−2の間の46〜50%よりも高い。
【0324】
実施例2:細菌細胞における組換えPD−L2ポリペプチドの発現
この実施例において、ヒトPD−L2がE. coliにおいてグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合蛋白として発現され、該融合蛋白が単離され特徴付けされる。特別には、PD−L2がGSTと融合され、この融合蛋白がE. coli、例えばPEB199株において発現される。PEB199株におけるGST−PD−L2融合蛋白の発現をIPTGで誘導する。誘導されたPEB199株の粗細菌溶解物から、グルタチオンビーズ上のアフィニティークロマトグラフィーにより組換え融合ポリペプチドを精製する。細菌溶解物から精製されたポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて、得られた融合ポリペプチドの分子量を決定する。
【0325】
実施例3:PD−1へのPD−L2の結合
AF142780、マウスPD−L2 cDNA、または対照マウスPD−1リガンドを含有する発現プラスミドでCOS細胞をトランスフェクションした。72時間後、0.5mM EDTAを含有するPBS中、37℃で30分インキュベーションすることによりトランスフェクションしたCOS細胞を剥離させた。
種々のIg融合蛋白に結合するPD−L2発現COS細胞の能力を試験した。PD−L2でトランスフェクションされたCOS細胞によるIgG2a(対照Ig)、ICOS−IgG、およびPD−1−Igの結合についてのFACS分析は、IgG2aまたはICOS−IgGのいずれもがPD−L2または対照PD−1リガンドにより結合されないことを示した。しかしながら、PD−1−Igは、PD−L2および対照PD−1リガンドへの結合が示された(図4)。
ヒトPD−L2 cDNAを用いる実験により、マウスPD−L2 cDNAを用いて得られた結果と同様の結果が得られた。
CHO細胞を用いる実験も行なった。フローサイトメトリーの研究により、hPD−1−IgがPD−L2で安定にトランスフェクションされたCHO細胞を認識することが示されている(図7)。対照トランスフェクション体(CHO−IAd、CHO−IAd/B7.2)への結合が存在しないので、この染色は特異的である。PD−L2でトランスフェクションされたCHO細胞はCTLA4−Ig、CD28−IgまたはICOS−Igでの染色を示さなかった。IgVエクソンが欠失されているネズミPD−L2の別スプライシングされた変種も単離した。この変種はPD−1−Igに結合せず、IgVドメインがPD−1へのPD−L2の結合に必要であることが示された。
【0326】
実施例4:PD−L2に対する全ヒト抗体の取得
この実施例において、ヒト免疫グロブリンフレームワーク遺伝子が導入されているマウスにおいてPD−L2に対する全ヒト抗体を作成する。標準的的方法、例えば、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(参照により本明細書に一体化させる)に従ってトランスジェニックマウスを作成、あるいは購入する。公表された手順(Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, Robertson, E.J. ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987; Zijlstra et al. (1989) Nature 342:435−438; and Schwartzberg et al. (1989) Science 246:799−803, 参照によりそれぞれを本明細書に一体化させる)に従って胚性幹細胞を処理する。Sambrook, J. et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(参照により本明細書に一体化させる)に従ってDNAクローニング手順を行なう。例えば製造者の指示に従ってAplied Bio Systemsオリゴヌクレオチド合成装置によりオリゴヌクレオチドを合成、あるいは購入する。
精製または組換えPD−L2あるいは少なくともPD−L2の細胞外ドメインの免疫原部分を含む融合蛋白を用いてトランスジェニックマウスを免疫する。100μgのリン酸塩緩衝化セイライン(PBS)中約400μgのPD−L2を各マウスに腹腔内注射する。眼窩後部からの採血により血清試料を集める。
間接的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いてPD−L2に対する抗体の反応性および特異性を評価する。いくつかの免疫グロブリンスーパーファミリー分子を対照(例えば、CTLA4およびCD28)として試験して、PD−L2に対する抗体の抗体特異性を分析する。マウス免疫グロブリンに対して交差反応性を示さないヒトIgMおよびヒトIgGサブクラスに対して特異的な酵素抱合体により、PD−L2に結合するヒトフレームワーク領域を有する抗体を検出する。簡単に説明すると、PBS中5μg/mlのPD−L2にて、37℃で一晩ウェルを被覆することにより、PVCマイクロタイタープレートをPD−L2で被覆する。PBS,5%血清,0.5%ツイン−20で血清試料を希釈し、ウェル中で室温にて1時間インキュベーションし、次いで、抗−ヒトIgG FcおよびIgG F(ab’)−セイヨウワサビペルオキシダーゼまたは抗−ヒトIgM Fc−セイヨウワサビペルオキシダーゼを同じ希釈液中でインキュベーションする。室温で1時間後、ABTS基質(Sigma, St. Louis, Mo.)の添加により酵素活性を測定し、30分後に415〜490nmを読む。同じマウスからのプレ−免疫血清試料中の、同じ標的抗原に対するヒト抗体力価も試験する。
適切な抗体力価を有するマウスから単離された脾臓細胞を集める。脾臓細胞を適当な融合パートナー(例えば、ミエローマ細胞)と融合させてハイブリドーマを作成する。Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)(参照により本明細書に一体化させる)に従って、ハイブリドーマおよび抗体を処理する。
【0327】
実施例5:PD−L2に対する抗体の取得
抗−ヒトPD−L2抗体
マウスのcDNA免疫により抗−DP−L2抗体を調製することもできる。抗−ヒトPD−L2抗体を製造するために、0.9%セイライン中10mMのカルジオトキシン(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)50μlを各後足の前けい骨筋に注射することによりメスのBalb/cマウス(Harlan Sprague−Dawley, Inc., Indianapolis, IN)をcDNA免疫用に調製した。5日後、0.9%セイライン中1mg/mlのpAXEF中の精製hPD−L2 cDNA50μlを各マウスの再生している各前けい骨筋に注射した。cDNA免疫を2週間間隔で2回繰り返した。次いで、マウスを4週間休息させ、その後、マウス1匹あたり100μgのcDNAを3〜4週間間隔で3回追加免疫した。融合の5日前に、融合用に選択された1匹のマウスにcDNAを腹腔内注射して追加免疫した。脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞と融合させ、クローン化させ、次いで、hPD−L2−mIgG2a融合蛋白との反応性に関してハイブリドーマをELISAによりスクリーニングし、その後、hPD−L2でトランスフェクションされた300.19およびCOS細胞の細胞表面染色を行なって、未トランスフェクション細胞およびhPD−L1でトランスフェクションされた細胞との反応性の欠如を調べた。
9種のマウス抗−ヒトPD−L2モノクローナル抗体(mAbs)を単離した。PD−1/PD−L2相互作用をブロックするこれらの抗体の能力を決定するために、抗−PD−L2 mAbsをPD−L2でトランスフェクションされた細胞とともにプレインキュベーションした。PD−L2でトランスフェクションされた細胞へのビオチン化PD−1−Igの結合を減じるmAbの能力として、相互作用の阻害を測定した。最良のmAbsは抗体24F.10C12(本明細書において10C12ともいう)および24F7G12(本明細書において7G12ともいう)であった。結果は次のとおり:
【0328】
抗−マウスPD−L2抗体
抗−マウスPD−L2抗体を製造するために、0.9%セイライン中10mMのカルジオトキシン(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)100μlを各後足の前けい骨筋に注射することによりメスのLewis株ラット(Harlan Sprague−Dawley, Inc., Indianapolis, IN)をcDNA免疫用に調製した。5日後、0.9%セイライン中1mg/mlのpEF6中の精製ネズミPD−L2 cDNA100μlを各マウスの再生している各前けい骨筋に注射した。cDNA免疫を2〜3週間間隔で3回繰り返した。次いで、1〜5x107個のCHO−mPD−L2トランスフェクション体で4回、2〜5週間間隔でラットを免疫した。融合の5日前に、融合用に選択された1匹のラットにcDNA(200μl)および細胞(5x107個)の両方を腹腔内注射して免疫した。脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞と融合させ、クローン化させ、次いで、mPD−L2でトランスフェクションされた300.19およびCOS細胞の細胞表面染色によりスクリーニングし、未トランスフェクション細胞およびmPD−L1でトランスフェクションされた細胞との反応性の欠如を調べた。mPD−L2を特異的に認識するモノクローナル抗体が産生された。
【0329】
実施例6:PD−L2の発現
PD−L2の発現を分析するために、種々の組織および活性化抗原提示細胞におけるノーザンブロットハイブリダイゼーションによりmRNA発現を分析した。ヒトおよびネズミのPD−L2 mRNAは正常胎盤で多く発現されており、正常脾臓、リンパ節および胸腺において少なく発現されている。PD−L2はヒト心臓においても発現されているが、マウス心臓では低レベルで発現されている。PD−L2が発現される他の組織はヒト膵臓、肺および肝臓である。PD−L2 mRNAは刺激されていないヒト単球では検出されなかったが、IFN−γ刺激によりアップレギュレーションされた。PD−L1のアップレギュレーション(Freeman, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034)と比較すると、PD−L2の誘導はキネティクスにおいてわずかに遅れた。ネズミ腫瘍細胞系のノーザンブロット分析により、PU5−1.8(ミエロイドリンパ腫)、RAW264.7(マクロファージリンパ腫)、R1.1(Tリンパ種)、L1210(リンパ球性白血病)、P338D1(単球/マクロファージリンパ腫)、およびP815(肥満細胞種)のごときリンパ球起源の系におけるPD−L2発現が明らかとなった。線維芽細胞系(M−MSV Balb/3T3、K−Balb、LM)およびP19奇形癌腫細胞系においてPD−L2はあまり発現されないか、あるいは全く発現されなかった。PD−L2は肝細胞種(Hepa1−6)および神経芽腫(NB41A3)細胞系においても発現されている。
【0330】
実施例7:PD−L2−PD−1相互作用はTCRにより媒介される応答を阻害する
T細胞活性化におけるPD−L2−PD−1経路の役割を調べるために、DynalビーズによるT細胞活性化系を用いた。Balb/cリンパ節からの精製T細胞を、抗−CD3プラス対照.IgまたはmPD−L2.Igで被覆したビーズで活性化させた。3H−チミジン取りこみにより増殖を測定した。抗−CD3プラスmPD−L2.Igで被覆したビーズで活性化されたT細胞は、抗−CD3プラス対照.Igで活性化された細胞と比較して著しい増殖の低下を示した(図8)。かくして、PD−L2Tによる細胞上のPD−1の利用はT細胞増殖の阻害を導く。
抗原特異的シグナルを研究するために、PD−L2およびI−Adを同時発現するCHO細胞ならびに同様のレベルのI−Adのみを発現するCHO細胞(図7)を、DO11.10CD4+T細胞を活性化させる能力に関して比較した。活性化後にPD−1がアップレギュレーションされるので、前もって活性化されたDO11.10T細胞を用いて最大PD−L2相互作用を可能ならしめた。前もって活性化されたCD4+T細胞を一定濃度範囲のOVA(323−339)ペプチドおよびマイチマイシンC処理CHOトランスフェクション体とともにインキュベーションした。図9からわかるように、前もって活性化されたDO11.10CD4+T細胞は、CHO.I−Adにより提示されたOVAペプチドに対して中庸の増殖応答を与えた。対照的に、PD−L2存在下においてこの応答は有意に低下した。インターロイキン(IL)−4、IFN−γおよびIL−10産生もまた著しく低下した(図9)。これらの活性化条件下ではIL−2は検出されなかった。これらのデータは、PD−1−PD−L2相互作用がTCRにより媒介される増殖およびサイトカイン産生を阻害できることを示すものである。PD−1−PD−L2経路の阻害効果および非リンパ器官におけるPD−L2の発現は、自己免疫反応の制御における役割を示すものである。
【0331】
実施例8:PD−L2はTCR−CD28シグナルを阻害しうる
最適T細胞クローン増殖にはTCRおよびCD28両方のシグナルが必要なので、TCRプラスCD28ならびにPD−L2−PD−1シグナル間の相互作用を調べた。この問題を解決するために、下記のCHO細胞を用いた:CHO.I−Ad.B7−2およびCHO.I−Ad.B7−2.PD−L2。すでにOVAで活性化されているDO11.10CD4+T細胞を刺激するこれらのCHOトランスフェクション体の能力を比較した。I−AdおよびB7−2の発現はこれらのCHOトランスフェクション体上で同様に高かった(図7)。PD−1.Ig結合により測定されたPD−L2発現レベルは高かった。予想とおり、B7−2の導入は、すべての抗原濃度においてT細胞による増殖応答の増加を導き、低い抗原濃度において最も著しい刺激がみられた(図10)。CHO細胞上のPD−L2の同時発現は、低いペプチド濃度(0.01μg/mlおよび0.001μg/ml)におけるTCRおよびB7−2により媒介される増殖応答を阻害した(図10)。0.01μg/mlのペプチド濃度では、PD−L2はTCR−B7−2により媒介されるサイトカイン産生を有意に阻害し、増殖の阻害と矛盾しなかった(図11)。ごく弱い増殖の阻害が存在した0.1μg/mlのペプチド濃度では、DO11.10CD4+T細胞がペプチドおよびCHO.I−Ad.B7−2.PD−L2トランスフェクション体とともに培養された場合にサイトカイン産生が阻害された(図12)。それゆえ、PD−L2によるPD−1の利用はTCR−CD28により媒介されるサイトカイン産生刺激をダウンレギュレーションしうる。
低下したサイトカイン産生が低下したmRNAレベルによるものであるかどうかを決定するために、RNAase保護アッセイによりサイトカインmRNAレベルを測定した。CHO.I−Ad.B7−2により提示された0.01μg/ml OVAペプチドでの刺激後に、インターロイキン−4、IL−10、IL−13、IL−2、IL−6およびIFN−γ mRNAは、すでに活性化されているDO11.10CD4+T細胞において容易に検出された。しかしながら、CHO.I−Ad.B7−2トランスフェクション体中へのPD−L2の導入は、Th1およびTh2両方のサイトカインに関してmRNAレベルを有意に低下させた。すでに活性化されているT細胞を単独で、あるいはCHO.I−Adにより発現されるペプチドとともにインキュベーションした場合に、サイトカインmRNAの発現は最低であった。これらの結果は、抗原刺激が弱いかあるいは限定的である場合におけるB7−CD28シグナルに拮抗するPD−L2−PD−1経路の能力をさらに示すものである。
低い抗原濃度におけるPD−L2−PD−1経路の阻害能が異なる抗原濃度におけるCD28およびPD−1発現レベルの変化に関連しているかどうかを調べるために、PD−1およびCD28の表面発現を調べた。表1は、異なった活性化条件に置いた後の、DO11.10CD4+T細胞上のPD−1、CD28およびCD25の平均蛍光強度を示す。
【0332】
【表1】
【0333】
新たに単離されたDO11.10CD4+T細胞はCD28を発現したが、PD−1もCD25も発現しなかった。脾臓APCsにより提示される1μg/mlのペプチドで刺激されたT細胞はCD28を中庸にアップレギュレーションし、PD−1およびCD25を強くアップレギュレーションした。すでに活性化されているDO11.10CD4+T細胞をCHO.I−Ad.B7−2により提示される種々の濃度のペプチドで再刺激した後、より高いペプチド濃度においてCD28およびCD25の発現がCD4+T細胞上で増大した。対照的に、PD−1発現は低いペプチド濃度で活性化されたT細胞上で最高であり、より高いペプチド濃度においては減少した。より低い抗原用量におけるより高いPD−1発現は、PD−L2−PD−1経路が弱い抗原応答を弱体化させうる機構をさらに示唆する。
【0334】
実施例9:PD−1−PD−L2経路の作用機構
CTLA−4の架橋はネイティブなT細胞において細胞周期進行を阻害することが示されている(Krummel, M.F. and Allison, J.P. (1996) J. Exp. Med. 183:2533−2540; Walunas, T.L. et al. (1996) J. Exp. Med. 183:2541−2550)。アポトーシス中のネズミ細胞系からPD−1が単離されたので、PD−1:PD−L2経路の可能な作用機構は,プログラムされた細胞死(例えば、活性化により誘導される細胞死またはAICD)を増加させることである可能性がある。この問題に取りかかるために、DO11.10CD4+T細胞を0.01μg/mlのペプチドおよび種々のCHOトランスフェクション体で再刺激し、細胞周期進行を分析した。48時間後、細胞を回収し、CD4−FITCで染色し、透過性にし、次いで、ヨウ化プロピジウムとともにインキュベーションして、G0/G1、S/G2およびサブ−2倍体(sub−diploid)集団を分析した。CHO−IAdまたはCHO−IAd/PD−L2により提示されるペプチドで再刺激されたCD4+T細胞はいずれも大集団のサブ−2倍体集団を有し、アポトーシスが示された(図13)。これらの結果はアネキシン染色により確認された。CHO−IAdにより提示されるペプチド(1μg/ml)によりCD4+T細胞が刺激される培養物において、S/G2期の細胞数が増加しており、細胞がサイクル中にあることが示された。I−Adトランスフェクション体中へのPD−L2の導入は、G0/G1期の細胞数の増加を導き、細胞周期停止が示唆された。
次いで、B7−2およびPD−L2シグナル存在下での細胞周期進行を比較した。CHO.I−Ad.B7−2により提示される0.01μg/mlのペプチドにより刺激されたCD4+T細胞は、S/G2期の細胞数の増加およびサブ−2倍体集団数の減少を示し、細胞がサイクル中にあり、B7−CD28同時刺激によりアポトーシスからレスキューされることが示された(図14)。高いペプチド濃度におけるCHO.I−Adトランスフェクション体に関して見られるのと同様に、B7−2トランスフェクション体中へのPD−L2の導入は、G0/G1期の細胞数の増加およびS期の細胞数の減少を導いた。B7−2およびB7−2.PD−L2刺激T細胞間のアポトーシス細胞集団に違いはなく、PD−1架橋は細胞死の増加を導かなかったことが示された。
【0335】
実施例10:PD−1:PD−リガンド相互作用の阻害によるT細胞活性化の刺激
上に示したように、PD−1を介するシグナリングは強力なTCR/CD28同時刺激シグナルにより支配されており;PD−1シグナリング経路は中庸のTCR/CD28同時刺激シグナルを阻害し、最初はT細胞増殖の減少なしにサイトカイン産生が低下する。TCR/CD28同時刺激シグナルが弱まるにつれ、PD−1経路が支配的となり、サイトカイン産生の大幅な減少が増殖の低下とともに起こる。したがって、PD−L1またはPd−L2との相互作用の阻害によりPD−1経路の阻害がT細胞活性化を促進するかどうかを調べるために、弱く機能する抗原提示細胞(APCs)(すなわち、弱いTCR/CD28同時刺激を有する抗原提示細胞)を用いて混合リンパ球反応(MLRs)を行なった。
成熟樹状細胞は強力なAPCsである。しかしながら、IL−10での処理はそれらの能力を低下させる。以前の報告は、IL−10が細胞APC能を大幅に低下させることを示しており、このことがMHC、B7−1およびB7−2の発現低下によるものであるとしている。しかしながら、本明細書の実験は、低下は中庸であり、そのうえ、IL−10処理された樹状細胞はPD−L1およびPD−L2を発現することを示すものである。
ヒト末梢血単球をIL−4およびGM−CSF中で培養することにより未成熟ミエロイド樹状細胞を単離した。IL−1β、TNF−α、IL−6およびPGE2の炎症性カクテルへの未成熟樹状細胞の曝露は、APCsとして機能する成熟樹状細胞の発達を誘導する。しかしながら、成熟期にある炎症性サイトカインへのIL−10の添加は、1/6ないし1/3しか機能しないAPCsを生じさせる。
上で一般的に説明したようにして、PD−L1および/またはPD−L2に対する抗体、あるいは対照抗体の存在下において、IL−10処理樹状細胞をAPCsとして用いてT細胞活性化アッセイ(MLRs)を行なった。IL−10処理樹状細胞プラス同種T細胞への抗−PD−L1またはPD−L2 mAbの添加は、対照IgG処理培養物と比較した場合、3倍のT細胞増殖の増加を生じさせた(図15)。抗−PD−L1および抗−PD−L2抗体の組み合わせは、いずれかの抗体のみの場合に見られるよりも大幅な刺激の増大を生じさせた(図16)。この刺激は、PD−1へのPD−L1および/またはPD−L2の結合により媒介される免疫阻害性シグナルのブロックから予想される結果と矛盾しない。
【0336】
均等物
当業者は、常套的な実験異常のことを行なわずに、本明細書記載の本発明の個々の具体例に対する均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。かかる均等物は請求の範囲により包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、ヒトPD−L2のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列は配列番号:1の核酸1〜1223に対応する。アミノ酸配列は配列番号:2のアミノ酸1〜273に対応する。ヒトPD−L2遺伝子の5’または3’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号:3に示す。
【図2】図2は、マウスPD−L2のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列は配列番号:4の核酸1〜1655に対応する。アミノ酸配列は配列番号:5のアミノ酸1〜247に対応する。マウスPD−L2遺伝子の5’または3’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号:6に示す。
【図3】図3は、ヒトおよびマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列を示し(それぞれ配列番号:2および配列番号:5)、シグナルペプチド、IgV、IgC、細胞外、膜貫通、および細胞質ドメインを示す。
【図4】図4は、マウスPD−L2または対照マウスPD−1リガンドでトランスフェクションされたCOS細胞へのIgG2a(対照Ig)、ICOS−IgG、および対照PD−1−Igの結合のFACS分析結果を示す。
【図5】図5は、マウスおよびヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列(それぞれ配列番号:5および配列番号:2)の並置比較を示す。2つの配列間の同一アミノ酸が示されている。
【図6】図6は、マウスPD−L2(配列番号:5)、ヒトPD−L2(配列番号:2)、マウスPD−L1(配列番号:11)、およびヒトPD−L1(配列番号:12)のアミノ酸配列の並置比較を示す。
【図7】図7はPD−L2へのPD−1の結合を示す。I−AdのみまたはI−AdおよびB7−2を発現するCHO細胞はマウスPD−L2でトランスフェクションされず、あるいは安定にトランスフェクションされなかった。細胞をhPD−1−Igで染色し、PE−ヤギ抗−マウスIgG2aで染色(太線)した。PE−抗−I−AdまたはPE−抗−B7−2で(太線)別個にCHO細胞を染色した。細線はイソタイプ対照モノクローナル抗体での染色を示す。1万のイベントを分析した。
【図8】図8は、TCRにより媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。BALB/cリンパ節からの精製T細胞を、2:1のビーズ:細胞比で、抗−CD3+対照Igまたは抗−CD3+mPD−L2−Igで被覆したトシルビーズで刺激した。72時間後に増殖を測定した。これらのデータは8回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図9】図9は、TCRにより媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。DO11.10トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞をOVAペプチド(1μg/ml)で活性化した。CD4+T細胞を単離し、一晩休止させた。前もって活性化させたT細胞(105個)を、CHO−I−AdまたはCHO−I−Ad−PD−L2により提示されたペプチド(1または0.1μg/ml)で48時間再刺激した。[3H]チミジン取りこみを3つの同じ実験で試験した。培養開始後36時間目に上清の一部を集め、ELISAによりサイトカインを測定した。これらのデータは4回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図10】図10は、TCRおよびCD28により媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。DO11.10トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞をOVAペプチド(1μg/ml)で4日間活性化した。CD4+T細胞を単離し、一晩休止させた。前もって活性化させたT細胞(105個)を、示されたCHOトランスフェクション体により、ペプチドの濃度を種々変更して、48時間再刺激した。[3H]チミジン取りこみを3つの同じ実験で試験した。これらのデータは6回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図11】図11は、TCRおよびCD28により媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。前もって活性化されたT細胞(105個)を、示されたCHOトランスフェクション体により提示された0.01μg/mlのOVAペプチドとともに培養した。培養開始後36時間目に上清の一部を集め、ELISAによりサイトカインを測定した。破線はELISAの感度を示す。
【図12】図12は、TCRおよびCD28により媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。前もって活性化されたT細胞(105個)を、示されたCHOトランスフェクション体により提示された0.1μg/mlのOVAペプチドとともに培養した。培養開始後36時間目に上清の一部を集め、ELISAによりサイトカインを測定した。破線はELISAの感度を示す。
【図13】図13は、PD−L2−PD−1経路の使用の結果としての細胞周期停止およびアポトーシスを示す。前もって活性化されたT細胞を、OVAペプチド(1μg/ml)および示されたCHOトランスフェクション体で再刺激した。培養36時間目に細胞を集め、抗−CD4で染色し、70%エタノール中で固定した。細胞をヨウ化プロピジウム溶液中で再懸濁した。FACSプロファイルはCD4+集団のヨウ化プロピジウム染色である。2倍体未満(subdiploid)、2倍体(diploid)、および2倍体超(supradiploid)の集団を示す。一定流速で1万のイベントを集め、分析した。これらのデータは3回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図14】図14は、PD−L2−PD−1経路の使用の結果としての細胞周期停止およびアポトーシスを示す。前もって活性化されたT細胞を、OVAペプチド(0.01μg/ml)および示されたCHOトランスフェクション体で再刺激した。培養36時間目に細胞を集め、抗−CD4で染色し、70%エタノール中で固定した。細胞をヨウ化プロピジウム溶液中で再懸濁した。FACSプロファイルはCD4+集団のヨウ化プロピジウム染色である。2倍体未満(subdiploid)、2倍体(diploid)、および2倍体超(supradiploid)の集団を示す。一定流速で1万のイベントを集め、分析した。これらのデータは3回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図15】図15は、抗−PD−L1または抗−PD−L2抗体の存在下でのT細胞増殖の促進を示す。同種CD4+T細胞を、IL−10処理樹状細胞による混合リンパ球反応において刺激した。
【図16】図16は、抗−PD−L1、抗−PD−L2抗体、あるいは抗−PD−L1および抗−PD−L2抗体の組み合わせの存在下でのT細胞増殖の促進を示す。同種CD4+T細胞を、IL−10処理樹状細胞による混合リンパ球反応において刺激した。
関連出願
本願は、2000年6月28日出願の米国仮出願第60/214563号、2001年2月23日出願の米国仮出願第60/270822号、2001年2月23日出願の米国仮出願第60/271114号に対して優先権を主張するものである。これらの各出願の全内容をこの参照により本明細書に一体化させる。
【0002】
政府の資金援助
本明細書に記載された研究は、National Institute of Healthにより与えられたAI39671、CA84500、AI41584、AI38310およびAI40614の下で援助された。
【0003】
発明の背景
T細胞が外来ポリペプチドに応答するためには、抗原提示細胞(APCs)により休止Tリンパ球に2つのシグナルが提供されなくてはならない(Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302−319; Mueller, D.L. et al. (1990) J. Immunol. 144:3701−3709)。最初のシグナルは免疫応答に特異性を付与するものであり、主要組織適合抗原系において提示された外来抗原の認識後にT細胞受容体を介して伝達される。次のシグナルは同時刺激と呼ばれるものであり、T細胞が増殖し、機能的となることを誘導する(Lenschow et al. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233)。同時刺激は抗原特異的でもなく、MHCにより制限されず、APCsにより発現される1またはそれ以上の異なる表面分子により提供されると考えられている(Jenkins, M.K. et al. (1988) J. Immunol. 140:3324−3330; Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721−730; Gimmi, C.D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575−6579; Young, J.W. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:229−237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:759−762; Reiser, H. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:271−275; van−Seventer, G.A. et al. (1990) J. Immunol. 144:4579−4586; LaSalle, J.M. et al. (1991) J. Immunol. 147:774−80; Dustin, M.I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:503; Armitage, R.J. et al. (1992) Nature 357:80−82; Liu, Y. et al. (1992) J. Exp. Med. 175:437−445)。
【0004】
APCs上に発現されるCD80(B7−1)およびCD86(B7−2)蛋白は重要な同時刺激分子である(Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143:2714; Azuma et al. (1993) Nature 366:76; Freeman et al. (1993) Science 262:909)。B7−2は一次免疫応答において主な役割を果たしていると思われ、B7−1は免疫応答の後期にアップレギュレーションされるものであり、一次T細胞応答の延長あるいは二次T細胞応答の同時刺激に重要である可能性がある(Bluestone (1995) Immunity 2:555)。
【0005】
B7−1およびB7−2が結合する1のリガンドであるCD28は休止T細胞上に構成的に発現され、活性化後の発現において増加する。T細胞受容体を介するシグナリング後、CD28と同時シグナルの伝達との連結により、T細胞の増殖およびIL−2分泌が誘導される(Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721−730; Gimmi, C.D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575−6579; June, C.H. et al. (1990) Immunol. Today 11:211−6; Harding, F.A. et al. (1992) Nature 356:607−609)。CTLA4(CD152)と呼ばれる第2のリガンドはCD28と相同的であるが、休止T細胞上には発現されず、T細胞活性化後に出現する(Brunet, J.F. et al. (1987) Nature 328:267−270)。CTLA4はT細胞応答の負の調節に重要であると思われている(Waterhouse et al. (1995) Science 270:985)。CTLA4のブロックは阻害シグナルを除去することがわかっているが、CTLA4の凝集は、T細胞応答をダウンレギュレーションする阻害シグナルを提供することがわかっている(Allison and Krummel (1995) Science 270:932)。B7分子はCD28よりもCTLA4に対して高いアフィニティーを有し(Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561−569)、B7−1およびB7−2はCTLA4分子の異なる領域に結合し、CTLA4への結合に関して異なるキネティクスを有することがわかっている(Linsley et al. (1994) Immunity 1:793)。CD28およびCTLA4に関連している新たな分子ICOSが、そのリガンドを有するものとして同定されており(Hutloff et al. (1999) Nature 397:263; WO 98/38216)、ICOSはB7ファミリーの新たなメンバーである(Aicher A. et al. (2000) J. Immunol. 164:4689−96; Mages H.W. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:1040−7; Brodie D. et al. (2000) Curr. Biol. 10:333−6; Ling V. et al. (2000) J. Immunol. 164:1653−7; Yoshinaga S.K. et al. (1999) Nature 402:827−32)。T細胞が、さらなる同時刺激シグナルを受け取ることなくT細胞受容体を介して刺激されるだけならば、それらは無応答性で、アネルギー性となり、あるいは死滅して免疫応答のダウンレギュレーションを引き起こすようになる。
【0006】
免疫細胞は活性化シグナルを伝達する受容体を有している。例えば、T細胞はT細胞受容体およびCD3複合体を有し、B細胞はB細胞受容体を有し、ミエロイド細胞はFc受容体を有している。さらに、免疫細胞は、同時刺激シグナルを提供するシグナルを伝達する受容体あるいは受容体により媒介されるシグナリングを阻害するシグナルを伝達する受容体を有している。例えば、CD28は同時刺激シグナルをT細胞に伝達する。T細胞受容体の連結後、CD28の連結は、例えば、IL−2rα、IL−2rβおよびIL−2rγ受容体のアップレギュレーション、IL−2メッセンジャーRNA転写増加、ならびにサイトカイン(IL−2、IFN−γ、GM−CSFおよびTNF−αを包含)遺伝子発現増加により特徴づけられる同時刺激シグナルを生じさせる。同時刺激シグナルの伝達により、細胞が細胞周期を経るようになり、かくして、T細胞増殖が増大する(Greenfield et al. (1998) Crit. Rev. Immunol. 18:389)。同時刺激シグナルを細胞に伝達するT細胞上の受容体の同時刺激リガンドによる結合(例えば、サイトカイン分泌および/またはT細胞増殖を誘導する同時刺激受容体の連結)は同時刺激を引き起こす。かくして、同時刺激リガンドと同時刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体との間の相互作用の阻害は、免疫応答のダウンレギュレーションおよび/または免疫細胞アネルギーと呼ばれる特異的無応答を引き起こす。例えば、抗−CD28 Fabフラグメント、B7ファミリー分子に対する抗体を用いて、あるいはB7ファミリーのメンバーの分子が競争的阻害剤として結合しうる可溶性形態の受容体(例えばCTLA4)を用いてこの相互作用の阻害が行なわれうる。
【0007】
同時刺激分子に結合する阻害性受容体も免疫細胞上において同定されている。例えば、CTLA4の活性化はT細胞に負のシグナルを伝達する。CTLA4を用いることはIL−2産生を阻害し、細胞周期停止を誘導しうる(Krummel and Allison (1996) J. Exp. Med. 183:2533)。さらに、CTLA4欠損マウスはリンパ球増殖性の疾病を発症する(Tivol et al. (1995) Immunity 3:541; Waterhouse et al. (1995) Science 270:985)。抗体でのCTLA4のブロックは阻害性シグナルを除去する可能性があり、抗体とのCTLA4の凝集は阻害性シグナルを伝達する。それゆえ、同時刺激分子が結合する受容体に応じて(すなわち、CD28のごとき同時刺激受容体またはCTLA4のごとき阻害性受容体)、B7−4を包含するB7分子はT細胞同時刺激または阻害を促進しうる。
【0008】
PD−1は免疫グロブリン分子のファミリーのメンバーである(Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704)。PD−1は以前、プログラムされた細胞死のモジュレーターを同定するための設計されたアプローチに基づく引き算クローニングを用いて同定された(Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887−95; Woronicz et al. (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 200:137)。PD−1は、リンパ球生存調節、例えば、クローン選択に間において役割を果たしている(Honjo (1992) Science 258:591; Agata et al. (1996) Int. Immunology 8:765; Nishimura et al. (1996) Int. Immunology 8:773)。PD−1は免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、膜貫通ドメインを含む細胞外領域、ならびに免疫受容体チロシンキナーゼに基づく阻害モチーフ(ITIM)を含む細胞内領域を有している(Ishida et al. (1992) supra; Shinohara et al. (1994) supra; US Patent 5,698,520)。この特徴は、免疫阻害性受容体と呼ばれる分子のより大きなファミリーも定義し、該ファミリーはgp49B、PIR−Bおよびキラー阻害性受容体(KIRs)をも包含する(Vivier and Daeron (1997) Immunology Today 18:286)。これらの受容体のチロシルリン酸化ITIMモチーフが、阻害性シグナルを誘導するSH2ドメイン含有ホスファターゼと相互作用すると仮定されることが多い。これらの免疫阻害性受容体の一部のものはMHC分子、例えばKIRsに結合し、CTLA4はB7−1およびB7−2に結合する。MHCとB7遺伝子との間に系統発生的関連性があると提案されている(Henry et al. (1999) Immunology Today 20:285−288)。
【0009】
PD1はB細胞応答のレギュレーターとしても関与している(Nishimura (1998) Int. Immunology 10:1563)。T細胞上でのみ見出されるCTLA4とは異なり、PD−1はB細胞(抗−IgMに応答)上ならびに胸腺細胞およびミエロイド細胞の一部のものの上にも見出される(Agata et al. (1996) supra; Nishimura et al. (1996) Int. Immunology 8:773)。
【0010】
B7:CD28/CTLA4同時刺激経路の重要性がインビトロおよびいくつかのインビボモデル系において示されている。この同時刺激経路のブロックは、メズミおよびヒトの系において抗原特異的耐性を発生させる(Harding, F.A. et al. (1992) Nature 356:607−609; Lenschow, D.J. et al. (1992) Science 257:789−792; Turka, L.A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102−11105; Gimmi, C.D. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6586−6590; Boussiotis, V. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1753−1763)。逆に、B7陰性ネズミ腫瘍細胞によるB7の発現は、T細胞により媒介される特異的免疫を生じさせ、それは腫瘍拒絶および腫瘍攻撃に対する長期防御を伴う(Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093−1102; Townsend, S.E. and Allison, J.P. (1993) Science 259:368−370; Baskar, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci 90:5687−5690.)。それゆえ、同時刺激経路を操作することにより、ヒトの免疫応答を刺激または抑制する大きな可能性が得られる。
【0011】
発明の概要
本発明は、少なくとも一部には、本明細書においてPD−L2核酸およびポリヌクレオチド分子と称される新規核酸分子およびかかる核酸分子によりコードされるポリペプチドの発見に基づくものであり、それらはB7ファミリーのメンバーでありPD−1のリガンドである。PD−L2とPD−1との相互作用は負のシグナルを免疫細胞に伝達し、免疫応答をダウンレギュレーションする。好ましいPD−L2分子はプロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、Bリンパ球、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞)および他の抗原提示細胞(例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞およびオリゴデンドロサイト)表面上に発現され、リンパ球活性化をダウンレギュレーションし、そして/あるいはPD−L2分子を認識する抗体により結合されるものである。本発明のPD−L2核酸およびポリペプチド分子は、例えば免疫応答のモジュレーションにおいて有用である。したがって、1の態様において、本発明はPD−L2ポリペプチドをコードする単離核酸分子ならびにPD−L2をコードする核酸の検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適当な核酸フラグメントを提供する。
【0012】
1の具体例において、本発明のPD−L2核酸分子は配列番号:1または3に示すヌクレオチド配列またはその相補配列に対して(例えば、ヌクレオチド配列全長に対して)少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一である。
【0013】
好ましい具体例において、単離核酸分子は配列番号:1または3に示すヌクレオチド配列、あるいはその相補配列を包含する。もう1つの具体例において、核酸分子は配列番号:3に示す核酸配列および配列番号:1のヌクレオチド1〜273を包含する。さらなる具体例において、核酸分子は配列番号:3に示す核酸配列および配列番号:1のヌクレオチド1096〜1223を包含する。もう1つの好ましい具体例において、核酸分子は配列番号:1または3に示すヌクレオチド配列からなる。
【0014】
もう1つの具体例において、PD−L2核酸分子は、配列番号:2のアミノ酸配列に対して十分に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。好ましい具体例において、PD−L2核酸分子は、配列番号:2のアミノ酸配列の全長に対して少なくとも約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。
【0015】
もう1つの好ましい具体例において、単離核酸分子はヒトPD−L2のアミノ酸配列をコードする。さらにもう1つの好ましい具体例において、核酸分子は配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。さらにもう1つの好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも約50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。さらなる好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも約50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、PD−L2活性(本明細書に記載)を有するポリペプチドをコードする。
【0016】
本発明のもう1つの具体例は核酸分子、好ましくはPD−L2核酸分子に関するものであり、それらは非PD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子と比較してPD−L2核酸分子を検出する。例えば、1の具体例において、かかる核酸分子は少なくとも880、900、950、1000、1050、1100、1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。もう1つの具体例において、かかる核酸分子は少なくとも20、30、40、50、100、150、200、250、300ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1のヌクレオチド1〜358を含む核酸分子またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。さらなる具体例において、かかる核酸分子は少なくとも20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、配列番号:1のヌクレオチド1〜358を含む配列の少なくとも15個のヌクレオチドまたはその相補配列を含み、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。
【0017】
好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも約880ヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド分子(すなわち、配列番号:の少なくとも880個の連続したヌクレオチド)またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。他の好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも約15ヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド分子のヌクレオチド1〜358(すなわち、配列番号:1のヌクレオチド1〜358の少なくとも15個の連続したヌクレオチド)またはその相補配列とハイブリダイゼーションする。さらなる好ましい具体例において、核酸分子は少なくとも15ヌクレオチドの長さであり、配列番号:1のヌクレオチド1〜358またはその相補配列を含む配列の少なくとも15個(すなわち、連続した15個)のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を含む核酸分子とハイブリダイゼーションする。
【0018】
さらに他の好ましい具体例において、核酸分子は配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種をコードし、該核酸分子は配列番号:1または3を含む核酸分子の相補配列あるいはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする。
【0019】
本発明のもう1つの具体例は、PD−L2核酸分子に対するアンチセンスである、例えば、配列番号:1または3に示すPD−L2核酸分子のコーディング鎖に対してアンチセンスである単離核酸分子を提供する。
【0020】
本発明のもう1つの態様は、PD−L2核酸分子を含むベクターを提供する。ある具体例において、ベクターは組換え発現ベクターである。もう1つの具体例において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。さらにもう1つの具体例において、本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。また本発明は、適当な培地中で宿主細胞、例えば組換え発現ベクターを含む本発明の非ヒト哺乳動物細胞のごとき哺乳動物宿主細胞を培養して、ポリペプチドを得ることによる、ポリペプチド、好ましくはPD−L2ポリペプチドの製造方法を提供する。
【0021】
本発明のもう1つの態様は、単離または組換えPD−L2ポリペプチド(例えば、蛋白、ポリペプチド、ペプチドまたはそれらのフラグメントもしくは部分)に関する。1の具体例において、単離PD−L2ポリペプチドは少なくとも1またはそれ以上の下記ドメインを含む:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0022】
好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドは少なくとも1またはそれ以上の下記ドメインを含み、配列番号:2のアミノ酸配列に対して少なくとも約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。もう1つの好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドは少なくとも1またはそれ以上の下記ドメインを含み、PD−L2活性(本明細書に記載)を有する:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0023】
さらにもう1つの好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドは少なくとも1またはそれ以上の下記ドメインを含み、配列番号:1または3のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0024】
もう1つの具体例において、本発明は、配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントまたは部分に関し、フラグメントは配列番号:2のアミノ酸配列の少なくとも15個のアミノ酸(すなわち、連続したアミノ酸)を含む。もう1つの具体例において、PD−L2ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれよりなる。
【0025】
もう1つの具体例において、本発明は、配列番号:1または3のヌクレオチド配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる核酸分子によりコードされるPD−L2ポリペプチドに関する。さらに本発明は、配列番号:1または3のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列からなる核酸分子によりコードされるPD−L2ポリペプチドに関する。
【0026】
本発明のポリペプチドまたはその部分、例えば、その生物学的に活性のある分部を、非PD−L2ポリペプチド(例えば、異種アミノ酸配列)に作動可能に連結して、融合ポリペプチドを得ることができる。さらに本発明は、本発明のポリペプチド、好ましくはPD−L2ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体のごとき抗体に関する。さらに、PD−L2ポリペプチド(またはその生物学的に活性のあるフラグメント)またはPD−L2分子のモジュレーターを、医薬上許容される担体を含んでいてもよい医薬組成物中に含有させることができる。
【0027】
もう1つの態様において、本発明は、生物学的試料をPD−L2核酸分子を検出しうる作用剤と接触させて、生物学的試料中のPD−L2核酸分子、蛋白またはポリペプチドを検出することによる、生物学的試料中のPD−L2核酸分子、蛋白またはポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。
【0028】
もう1つの態様において、本発明は、生物学的試料をPD−L2活性のインジケーターを検出しうる作用剤と接触させて、生物学的試料中のPD−L2活性の存在を検出することによる、生物学的試料中のPD−L2活性の存在を検出する方法を提供する。
【0029】
もう1つの態様において、本発明は、PD−L2を発現しうる細胞をPD−L2活性をモジュレーションする作用剤と接触させて、細胞中のPD−L2活性をモジュレーションすることを特徴とする、PD−L2活性をモジュレーションする方法を提供する。1の具体例において、作用剤はPD−L2活性を阻害する。もう1つの具体例において、作用剤はPD−L2活性を刺激する。さらなる具体例において、作用剤はPD−L2ポリペプチドとその本来の結合パートナー、例えばPD−1との間の相互作用を妨害または促進する。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。1の具体例において、作用剤はPD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体である。さらなる具体例において、作用剤は、PD−L2に特異的に結合する抗体と、PD−L1ポリペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである。もう1つの具体例において、作用剤はPD−L2ポリペプチドに結合するペプチド、ペプチド模倣物、または他の小型分子である。さらにもう1つの具体例において、作用剤は、PD−L2とPD−1との間の相互作用をモジュレーションしうるもう1つのPD−1リガンドである。さらにもう1つの具体例において、作用剤は、PD−L2遺伝子の転写、PD−L2 mRNAの翻訳、あるいはPD−L2ポリペプチドの翻訳後修飾をモジュレーションすることによりPD−L2の発現をモジュレーションする。もう1つの具体例において、作用剤はPD−L2 mRNAまたはPD−L2遺伝子のコーディング鎖に対するアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【0030】
1の具体例において、PD−L2モジュレーターである作用剤を対象に投与することにより、異常な、不十分な、あるいは望ましくないPD−L2ポリペプチドまたは核酸の発現または活性により特徴づけられる疾病または症状を有する対象を治療するために本発明が用いられる。1の具体例において、PD−L2モジュレーターはPD−L2ポリペプチドである。もう1つの具体例において、PD−L2モジュレーターはPD−L2核酸分子である。さらなる具体例において、PD−L2モジュレーターはPD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体である。もう1つの具体例において、PD−L2モジュレーターはPD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体と、PD−L1ポリペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである。さらにもう1つの具体例において、PD−L2モジュレーターはペプチド、ペプチド模倣物、または他の小型分子である。好ましい具体例において、異常な、不十分な、あるいは望ましくないPD−L2ポリペプチドまたは核酸の発現または活性により特徴づけられる疾病または症状は、PD−L2活性のモジュレーションにより恩恵を受けるであろう免疫応答疾患または症状である。もう1つの具体例において、本発明は、免疫応答をモジュレーションするさらなる作用剤を用いて対象を治療することをさらに提供する。
【0031】
さらにもう1つの具体例において、本発明は、抗原と、PD−L2活性を低下あるいは阻害する作用剤とを含むワクチンを提供する。好ましい具体例において、ワクチンはPD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する。より好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。
【0032】
また本発明は、(i)PD−L2ポリペプチドをコードする遺伝子の異常な修飾または変異;(ii)該遺伝子の誤調節;および(iii)PD−L2ポリペプチドの異常な翻訳後修飾により特徴づけられる遺伝学的変化の存在または不存在を同定するための診断アッセイを提供し、ここに該遺伝子の野生型形態はPD−L2活性を有するポリペプチドをコードするものである。
【0033】
本発明のもう1つの態様は、PD−L2活性を有するPD−L2ポリペプチドを含むインジケーター組成物を用意し、インジケーター組成物を試験化合物と接触させ、ついで、インジケーター組成物中のPD−L2活性に対する試験化合物の影響を調べて、PD−L2ポリペプチドの活性をモジュレーションする化合物を同定することによる、PD−L2ポリペプチドに結合し、あるいはその活性をモジュレーションする化合物を同定する方法を提供する。
【0034】
もう1つの態様において、本発明は、PD−1とPD−L2との間の相互作用をモジュレーションすることによる、免疫応答をモジュレーションする方法を提供する。
【0035】
1の態様において、本発明は、PD−L2を発現する抗原提示細胞を、PD−L2の1形態およびPD−1の1形態からなる群より群より選択される作用剤、あるいはPD−L2とその本来の結合パートナーとの相互作用をモジュレーションする作用際と接触させて、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用をモジュレーションすることを特徴とする、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用をモジュレーションする方法に関する。好ましい具体例において、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナー(例えばPD−1)との相互作用をモジュレーションする作用剤は、PD−L2に特異的に結合する抗体である。もう1つの好ましい具体例において、作用剤はPD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体と、PD−L1ポリペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである。
【0036】
1の具体例において、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用がアップレギュレーションされる。もう1つの具体例において、PD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用がダウンレギュレーションされる。
【0037】
1の具体例において、該方法は、免疫細胞または抗原提示細胞を、免疫応答をモジュレーションするさらなる作用剤と接触させることを特徴とする。
1の具体例において、接触工程がインビトロで行なわれる。もう1つの具体例において、接触工程がインビボで行なわれる。
1の具体例において、免疫細胞はT細胞、B細胞およびミエロイド細胞からなる群より選択される。
1の具体例において、PD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0038】
もう1つの態様において、本発明は、細胞におけるPD−L2の活性または発現を増大させて免疫細胞活性化を阻害することを特徴とする、非アポトーシス機構による免疫細胞における活性化の阻害方法に関する。
【0039】
さらにもう1つの態様において、本発明は、抗原およびPD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する作用剤を含むワクチンに関する。
さらにもう1つの態様において、本発明は、抗原およびPD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を促進する作用剤を含むワクチンに関する。
1の具体例においてPD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0040】
もう1つの態様において、本発明は、免疫応答のアップレギュレーションにより恩恵を受けるであろう症状を有する対象の治療方法に関し、該方法は、PD−L2と対象細胞上のその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する作用剤を投与して、免疫応答のアップレギュレーションにより恩恵を受けるであろう症状を治療することを特徴とする。
【0041】
1の具体例において、作用剤は、PD−L2に結合し、PD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害するブロッキング抗体または小型分子を含む。もう1つの具体例において、作用剤は、PD−L2ポリペプチドに特異的に結合する抗体と、PD−L1ポリペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである。
【0042】
もう1つの具体例において、該方法は、免疫応答をアップレギュレーションする第2の作用剤を対象に投与することをさらに特徴とする。
1の具体例において、症状は腫瘍、病原体感染または免疫抑制性疾患からなる群より選択される。
もう1つの具体例において、PD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0043】
1の態様において、本発明は、本発明は、免疫応答のダウンレギュレーションにより恩恵を受けるであろう症状を有する対象の治療方法に関し、該方法は、PD−L2と対象細胞上のその本来の結合パートナーとの間の相互作用を刺激する作用剤を投与して、免疫応答のダウンレギュレーションにより恩恵を受けるであろう症状を治療することを特徴とする。
【0044】
1の具体例において、作用剤は、PD−L2に結合し、PD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を刺激するブロッキング抗体または小型分子を含む。
【0045】
もう1つの具体例において、該方法は、免疫応答をダウンレギュレーションする第2の作用剤を対象に投与することをさらに特徴とする。
1の具体例において、症状は移植、アレルギー、および自己免疫疾患からなる群より選択される。
もう1つの具体例において、PD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0046】
もう1つの態様において、本発明は、PD−L2標的分子を発現する細胞を試験化合物と接触させ、ついで、PD−L2標的分子の活性をモジュレーションする試験化合物の能力を調べることを特徴とする、PD−L2の活性をモジュレーションする化合物のスクリーニングのための細胞に基づくアッセイに関する。
【0047】
さらにもう1つの態様において、本発明は、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分を試験化合物と接触させ、ついで、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分への試験化合物の結合能を調べることを特徴とする、PD−L2の標的分子への結合をモジュレーションする化合物のスクリーニングのための無細胞アッセイに関する。
【0048】
もう1つの具体例において、本発明は、PD−L2標的分子を発現するT細胞を第1の抗原濃度において試験化合物と接触させ、第1の濃度においてT細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする試験化合物の能力を調べ、PD−L2標的分子を発現するT細胞を第2の抗原濃度において試験化合物と接触させ、ついで、第2の濃度においてT細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする試験化合物の能力を調べ、そのことにより第1および第2の抗原濃度においてT細胞活性化をモジュレーションする化合物を同定することを特徴とする、第1および第2の抗原濃度においてT細胞活性化をモジュレーションする化合物を同定する方法に関する。
1の具体例において、PD−L2標的分子はPD−1である。
【0049】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【0050】
発明の詳細な説明
すでに特徴付けられているBリンパ球活性化抗原、例えば、B7−1およびBN7−2のほかに、抗原提示細胞(例えば、B細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、およびオリゴデンドロサイト)の表面上に、B細胞、T細胞、および他の免疫細胞の活性化をモジュレーションする他の抗原が存在する。本発明は、少なくとも一部には、本明細書でPD−L2ポリペプチドと称される新規分子の発見にも基づくものであり、該分子はPD−1受容体に結合し、これらの免疫細胞の活性化をダウンレギュレーションし、そして/あるいは免疫応答をダウンレギュレーションする。これらの新規分子は免疫応答のモジュレーションにおいて役割を果たす。
【0051】
PD−L2がPD−1に結合するという今回の知見は、PD−L2を阻害性リガンドのファミリー中に置くものであり、配列の分析はPD−L2をB7ファミリー中に置くものである。同時刺激受容体の使用は免疫細胞中に同時刺激シグナルを生じさせるが、阻害性受容体、例えば、CTLA−4またはPD−1の使用(架橋による、あるいは凝集による)は、免疫細胞において阻害性シグナルの伝達を誘導し、免疫細胞応答のダウンレギュレーションおよび/または細胞アネルギーを生じさせる。免疫細胞における阻害性シグナルの伝達は免疫細胞応答のダウンレギュレーションを導く(そして免疫応答全体をダウンレギュレーションする)が、免疫細胞における阻害性シグナルの妨害(例えば、PD−1に対する非活性化抗体(non−activating antibody)を用いることによる)は、免疫細胞応答のアップモジュレーションを誘導する(そして免疫応答のアップモジュレーションを引き起こす)。
【0052】
PD−L2は、すでに記載されているPD−1に対するリガンドであるPD−L1に対して相同性を有する(同時係属米国出願第09/644,934号; 国際公開WO 01/14557; Dong, H. et al. (1999) Nat. Med. 5:1365−1369; and Freeman, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034参照、参照により各内容を本明細書に一体化させる)。
【0053】
本発明は、PD−L2の活性および/または発現をモジュレーションするのに有用な作用剤;PD−L2とその本来の結合パートナー(例えば、PD−1)との間の相互作用をモジュレーションするための作用剤、ならびにPD−L2とその本来の結合パートナー(例えば、PD−1)との間の相互作用のモジュレーションにより免疫応答をモジュレーションするための作用剤を利用するものである。これらの方法に使用される典型的な調節作用剤を以下においてさらに説明する。
【0054】
定義
本明細書の用語「免疫細胞」は、造血系起源の細胞であって、免疫応答において役割を果たす細胞を包含する。免疫細胞はB細胞およびT細胞のごときリンパ球;ナチュラルキラー細胞;ならびに単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球のごときミエロイド細胞を包含する。
【0055】
本明細書の用語「T細胞」はCD4+T細胞およびCD8+T細胞を包含する。また用語T細胞はTヘルパー1タイプのT細胞およびTヘルパー2タイプのT細胞の両方を包含する。用語「抗原提示細胞」は、プロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、Bリンパ球、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞)ならびに他の抗原提示細胞(例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞およびオリゴデンドロサイト)を包含する。
【0056】
本明細書の用語「免疫応答」は、T細胞同時刺激のモジュレーションにより影響を受ける、T細胞により媒介される免疫応答および/またはB細胞により媒介される免疫応答を包含する。典型的な免疫応答はB細胞応答(例えば、抗体産生)、T細胞応答(例えば、サイトカイン産生、および細胞性の細胞毒性)およびサイトカイン応答細胞、例えばマクロファージの活性化を包含する。本明細書の免疫応答に関する用語「ダウンレギュレーション」は、1またはそれ以上の免疫応答の減少を包含し、免疫応答に関する用語「アップレギュレーション」は、1またはそれ以上の免疫応答の増加を包含する。1のタイプの免疫応答のアップモジュレーションは別のタイプの免疫応答における対応ダウンモジュレーションを誘導しうることが理解されよう。例えば、ある種のサイトカイン(例えば、IL−10)の産生のアップモジュレーションは細胞性免疫応答のダウンモジュレーションを誘導しうる。
【0057】
本明細書の用語「同時刺激受容体」は、同時刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体、例えば、CD28またはICOSを包含する。本明細書の用語「阻害性受容体」は、免疫細胞に負のシグナルを伝達する受容体を包含する(例えば、CLTA−4またはPD−1)。
【0058】
本明細書の用語「同時刺激」は、活性化された免疫細胞に関しては、増殖またはエフェクター機能を誘導する、第2の、活性化しない(non−activating)、受容体により媒介されるシグナル(「同時刺激シグナル」)を提供する同時刺激分子の能力を包含する。例えば、同時刺激シグナルはサイトカイン分泌を引き起こし、例えば、T細胞受容体により媒介されるシグナルを受け取ったT細胞におけるサイトカインにおけるサイトカイン分泌を引き起こす。細胞受容体により媒介、例えば、活性化受容体を介して伝達されるシグナルを受け取った免疫細胞を、本明細書において、「活性化された免疫細胞」という。
【0059】
同時刺激受容体(CD28またはICOSのごとき)が免疫細胞上に存在しない場合でさえも、阻害性受容体により伝達される阻害性シグナルが生じることがあり、それは同時刺激分子の結合に関する阻害性受容体と同時刺激受容体との間の競争の単なる関数ではない(Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205)。免疫細胞への阻害性シグナルの伝達は免疫細胞における無応答、アネルギーまたはプログラムされた細胞死を生じさせる。好ましくは、阻害性シグナルの伝達は、アポトーシスに関連しない機構を通して機能するものである。用語「アポトーシス」は、当該分野で知られた方法を用いて特徴づけされうるプログラムされた細胞死を包含する。例えば、細胞収縮、膜の水泡、および細胞断片化の際の顕著なクロマチン濃縮により、アポトーシスによる細胞死を特徴づけることができる。アポトーシスを受けている細胞は特徴的なヌクレオソーム間DNA開裂のパターンも示す。
【0060】
受容体に結合するPD−L2分子の形態に応じて、例えば、受容体に結合するためのPD−L2分子の活性化形態との競争により、シグナルが伝達(例えば、受容体の架橋を生じさせる多価形態のPD−L2分子により、あるいは抗原提示細胞上のFc受容体に結合する可溶性のPD−L2により)あるいは阻害(例えば、当該分野で知られた方法を用いて抗原提示細胞上のFc受容体に結合しないように変化させられた可溶性の1価形態のPD−L2分子または可溶性形態のPD−L2により)されうる。しかしながら、可溶性分子が刺激性でありうる例が存在する。本明細書に記載のように常套的なスクリーニングアッセイを用いて種々のモジュレーション作用剤の効果を容易に示すことができる。
【0061】
本明細書の用語「活性化受容体(activating receptor)」は、抗原、複合体化抗原(例えば、MHC分子の意味において)、または抗体に結合する免疫細胞受容体を包含する。かかる活性化受容体はT細胞受容体(TCRs)、B細胞受容体(BCRs)、サイトカイン受容体、LPS受容体、補体受容体、ならびにFc受容体を包含する。
【0062】
例えば、T細胞受容体はT細胞上に存在し、CD3分子と結合する。T細胞受容体はMHC分子の意味において抗原により(ならびにポリクローナルT細胞活性化試薬により)刺激される。TCRを介するT細胞活性化は多くの変化を生じさせ,例えば、蛋白リン酸化、膜脂質変化、イオンフラックス、環状ヌクレオチド変化、RNA転写変化、蛋白合成変化、ならびに細胞体積変化を生じさせる。
【0063】
本明細書の用語「B細胞受容体(BCR)」は、B細胞上に見られる膜Ig(mIg)と他の膜貫通ポリペプチド(例えば、IgαおよびIgβ)との間の複合体を包含する。mIgのシグナル伝達機能は、オリゴマーまたはマルチマー抗原による受容体分子の架橋により引き金を引かれる。B細胞は抗−免疫グロブリン抗体によっても活性化される。BCR活性化により、チロシンリン酸化をはじめとする多くの変化がB細胞において生じる。
【0064】
用語「Fc受容体」(FcRs)は免疫グロブリン分子(Igs)のFc部分に対する細胞表面受容体を包含する。Fc受容体は免疫応答に関与する多くの細胞上に見られる。これまで同定されたヒトFcRsにはIgGを認識するもの(FcγRと命名された)、IgEを認識するもの(FcεR1)、IgAを認識するもの(FcαR)、およびポリマー化IgM/Aを認識するもの(FcμαR)がある。FcRsは下記の細胞タイプにおいて見られる:FcεRI(肥満細胞)、FcεRII(多くの白血球)、FcαR(好中球)、およびFcμαR(顆粒内皮、肝細胞)(Hogg, N. (1988) Immunol. Today 9:185−86)。広く研究されたFcγRsは細胞性免疫防御の中枢であり、炎症メディエイタおよび自己免疫疾患の発症に関与している加水分解酵素の放出を刺激する(Unkeless, J.C. (1988) Annu. Rev. Immunol. 6:251−87)。FcγRsは、エフェクター細胞とIgを分泌するリンパ球との間の重要なリンクを提供する。なぜならマクロファージ/単球、多型核白血球、およびナチュラルキラー(NK)細胞のFcγRsはIgGにより媒介される特異的認識のエレメントを付与するからである。ヒト白血球はIgGに対する少なくとも3つの異なる受容体を有する:それらはhFcγRI(単球/マクロファージ上に見られる)、hFcγRII(単球、好中球、好酸球、血小板、おそらくB細胞、およびK562細胞系)、およびhFcγRIII(NK細胞、好中球、好酸球、およびマクロファージ)である。
【0065】
T細胞に関して、T細胞への同時刺激シグナルの伝達には、シクロスポリンAにより阻害されないシグナリング経路が用いられる。さらに、同時刺激シグナルはT細胞におけるサイトカイン分泌を誘導することができ、そして/あるいは抗原に対する無応答の誘導、アネルギーの誘導、あるいはT細胞における細胞死の誘導を防止することができる。
【0066】
本明細書の用語「阻害性シグナル」は、免疫細胞上の阻害性受容体(例えば、CTLA4またはPD−1)分子を介して伝達されるシグナルをいう。かかるシグナルは、活性化受容体を介する(例えば、TCR、CD3、BCR、またはFc分子)シグナルに拮抗し、例えば、下記のものの阻害を引き起こす:第2のメッセンジャー発生、増殖、または免疫細胞におけるエフェクター機能、例えば減少したファゴサイトーシス、抗体産生、あるいは細胞性の細胞毒性、あるいはサイトカイン(例えばIL−2)および/またはアレルギー性応答のメディエイタのごときメディエイタを免疫細胞が産生しないこと、あるいはアネルギーの発生。
【0067】
本明細書の用語「無応答」は、刺激、例えば、活性化受容体またはサイトカインを介する刺激に対する免疫細胞の無反応を包含する。無応答は、例えば、免疫抑制剤または高用量の抗原への曝露により生じうる。本明細書の用語「アネルギー」または「寛容」は、活性化受容体により媒介される刺激への無反応を包含する。一般的には、かかる無反応は抗原特異的であり、寛容化剤への曝露が終わってからも持続する。例えば、T細胞におけるアネルギー(無応答に対抗するものとしての)はサイトカイン、例えばIL−2産生欠乏により特徴づけられる。T細胞アネルギーは、T細胞が抗原に曝露され、第2のシグナル(同時刺激シグナル)の不存在下で最初のシグナル(T細胞受容体またはCD3により媒介されるシグナル)を受け取った場合に生じる。これらの条件下において、同じ抗原への細胞の再曝露(同時刺激分子の存在下で再曝露が行なわれたとしても)は、サイトカイン無産生を引き起こし、かくして、増殖が起こらなくなる。しかしながら、アネルギー性T細胞は無関係な抗原に対して応答をマウントでき、サイトカイン(例えばIL−2)とともに培養された場合に増殖できる。例えば、ELISAにより測定する場合にはTリンパ球によるIL−2産生欠如により、あるいはインジケーター細胞系を用いる増殖アッセイにより、T細胞アネルギーを観察できる。別法として、リポーター遺伝子構築物を用いることもできる。例えば、アネルギー性T細胞は、5’IL−2遺伝子エンハンサーの制御下の異種プロモーターによりあるいはエンハンサー中に見出されうるAP1配列のマルチマーにより誘導されるIL−2遺伝子転写を開始させることができない(Kang et al. (1992) Science 257:1134)。
【0068】
同時刺激シグナルのモジュレーションは免疫細胞のエフェクター機能のモジュレーションを引き起こす。かくして、用語「PD−L2活性」は、PD−L2ポリペプチドがその本来の結合パートナー、例えばPD−1に結合する能力、免疫細胞同時刺激または阻害性シグナルをモジュレーションする能力、ならびに免疫応答をモジュレーションする能力を包含する。
【0069】
PD−1に関して、用語「活性」は、例えば抗原提示細胞上の本来のリガンドを用いることにより、活性化された免疫細胞における阻害性シグナルをモジュレーションするPD−1の能力を包含する。PD−1は、CTLA4と類似の様式で、阻害性シグナルを免疫細胞に伝達する。免疫細胞における阻害性シグナルのモジュレーションは、免疫細胞の増殖および/または免疫細胞によるサイトカイン分泌のモジュレーションを引き起こす。PD−1は、その本来のリガンドを求めて同時刺激受容体と競争することにより、同時刺激シグナルをモジュレーションすることもできる。かくして、用語「PD−1活性」は、PD−1ポリペプチドがその本来のリガンドに結合する能力、免疫細胞同時刺激または阻害性シグナルをモジュレーションする能力、ならびに免疫応答をモジュレーションする能力を包含する。
【0070】
本明細書の用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子(例えば、天然蛋白をコードするもの)をいう。
【0071】
本明細書の用語「アンチセンス」は、蛋白をコードする「センス」核酸に対して相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に対して相補的な配列、mRNA配列に対して相補的な配列、あるいは遺伝子のコーディング鎖に対して相補的な配列を含む。したがって、アンチセンス核酸分子はセンス核酸分子に水素結合しうる。
【0072】
本明細書の用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基中に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいい、用語「非コーディング領域」はアミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域(例えば、5’および3’非翻訳領域)をいう。
【0073】
本明細書の用語「ベクター」は、別の核酸分子が結合しており、それを輸送可能な核酸分子をいう。1のタイプのベクターは「プラスミド」であり、それは環状二本鎖DNAループをいい、その中にさらなるDNAセグメントが連結されうる。もう1つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、その中のウイルスゲノム中にさらなるDNAセグメントが連結されうる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的複製が可能である(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)は、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そのことにより、宿主ゲノムとともに複製される。そのうえ、ある種のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指令しうる。かかるベクターを本明細書において「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」という。一般的には、組換えDNA法において有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが多い。プラスミドはベクターの形態として最も普通に用いられるので、本明細書において「プラスミド」および「ベクター」を混用する。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−随伴ウイルス)のような他の形態の発現ベクターも包含する。
【0074】
本明細書の用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターのごとき本発明の核酸分子が導入された細胞をいう。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を本明細書において混用する。かかる用語は特定の対象細胞のみならずかかる細胞の子孫または潜在的子孫をもいうことが理解されるべきである。突然変異または環境の影響によりある種の修飾が継代の間に生じうるので、実際には、かかる子孫は親細胞と同一でないかもしれないが、やはり本明細書に用いられる用語の範囲内である。
【0075】
本明細書の用語「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、その動物の1またはそれ以上の細胞が「導入遺伝子」を含んでいるものである。用語「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれており、成熟動物のゲノム中に残り、例えば、トランスジェニック動物の1またはそれ以上の細胞タイプまたは組織においてコードする遺伝子産物の発現を指令する外来DNAをいう。
【0076】
本明細書の用語「相同組換え動物」は、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスをいい、動物中において、動物の発生に先立って動物の細胞、例えば動物の胚性細胞中に導入された外来DNA分子と内在遺伝子との間の相同組換えによって内在遺伝子が変化しているものをいう。
【0077】
本明細書の用語「単離蛋白」は、細胞から単離された場合、あるいは組換えDNA法により製造された場合に他の蛋白、細胞性物質および培地を実質的に含まず、あるいは化学合成された場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない蛋白をいう。
【0078】
「単離」または「精製」された蛋白またはその生物学的に活性のある部分は、PD−L2蛋白が得られた細胞または組織ソースに由来する細胞性物質または他の混入蛋白を実質的に含まず、あるいは化学合成された場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、PD−L2蛋白が単離または組換え法により得られた細胞の細胞性成分からPD−L2蛋白が分離されているPD−L2調合物を包含する。1の具体例において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、約30%(乾燥重量)未満の非PD−L2蛋白(本明細書において「混入蛋白」ともいう)を有する、より好ましくは約20%未満の非PD−L2蛋白を有する、さらにより好ましくは約10%未満の非PD−L2蛋白を有する、最も好ましくは約5%未満の非PD−L2蛋白を有するPD−L2の調合物を包含する。PD−L2蛋白またはその生物学的に活性のある部分を組換え法により製造する場合、それが培地を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培地が蛋白調合物の体積の約20%未満、より好ましくは約10%未満、最も好ましくは約5%未満を占める。
【0079】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、蛋白合成に使用される化学前駆体または他の化学物質から蛋白が分離されているPD−L2調合物を包含する。1の具体例において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、約30%(乾燥重量)未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有し、より好ましくは約20%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有し、さらにより好ましくは約10%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有し、最も好ましくは約5%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有するPD−L2蛋白の調合物を包含する。
【0080】
本明細書の用語「抗体」は、抗体の「抗原結合部分」(あるいは単に「抗体部分」)ならびに抗体分子全体を包含する。本明細書の用語「抗原結合部分」は、抗原(例えば、PD−L2)に特異的に結合する能力を保持している抗体の1またはそれ以上のフラグメントをいう。完全長抗体のフラグメントによって抗体の抗原結合機能が果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの例は、(i)VL、VHCLおよびCH1ドメインからなる1価フラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された2つのFabフラグメントを含む2価フラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al. (1989) Nature 341:544−546);および(vi)単離された相補性決定領域(CDR)を包含する。さらにそのうえ、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは別個の遺伝子によりコードされるが、組換え法を用いて、それらを単一蛋白鎖にすることのできる合成リンカーによりVLとVH領域のペアーを1価分子にすることにより、それらを結合することができる(1本鎖Fv(scFv)として知られる。例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423−426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883; and Osbourn et al. 1998 Nat. Biotechnol. 16:778参照)。かかる1本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される。特定のscFvのVHおよびVL配列をヒト免疫グロブリン不変領域cDNAまたはゲノム配列に連結して、完全なIgG分子または他のイソタイプをコードする発現ベクターを得ることができる。蛋白化学または組換えDNA法のいずれかを用いて、VHおよびVLをFab、Fv、または免疫グロブリンの他のフラグメントの生成に使用することもできる。ダイアボディー(diabody)のごとき他の形態の1本鎖抗体も包含される。ダイアボディーは2価の二特異性抗体であり、その中で、VHおよびVLドメインが1本のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短かすぎるリンカーを用いて、それらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて2つの抗原結合部位が創生されている(例えば、Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444−6448; Poljak, R.J. et al. (1994) Structure 2:1121−1123参照)。
【0081】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、1またはそれ以上の他の蛋白またはペプチドとの抗体または抗体部分の共有結合または非共有結合により形成されるより大きな免疫接着分子の一部であってもよい。かかる免疫接着分子の例は、テトラマーscFvを生成するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov, S.M. et al. (1995) Hum. Antibodies Hybridomas 6:93−101)ならびに2価のビオチン化scFv分子を生成するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov, S.M. et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047−1058)を包含する。抗体全体のパパインまたはペプシン消化のごとき慣用的方法を用いてFabおよびF(ab’)2フラグメントのごとき抗体部分を抗体全体から調製することができる。そのうえ、本明細書記載の標準的な組換えDNA法を用いて抗体、抗体部分および免疫接着分子を得ることができる。
【0082】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナル;異種、同種、または同系;あるいはそれらの修飾形態、例えば、ヒト化、キメラ等であってもよい。好ましくは、本発明の抗体はPD−L2分子に特異的あるいは実質的に特異的に結合する。本明細書の用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特定のエピトープと免疫反応しうるだた1つの種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいい、用語「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」は特定抗原と相互作用しうる複数種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特異抗原に対する単一の結合アフィニティーを示す。
【0083】
本明細書の用語「ヒト化抗体」は、ヒト細胞により作られるであろう抗体に近似するように変化させられた可変領域および不変領域を有する非ヒト細胞により作られる抗体を包含する。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を変化させてヒト生殖系免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を含むようにしてもよい。本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムあるいは部位特異的突然変異による、あるいはインビボでの体細胞突然変異による)を、例えばCDRs中に含んでいてもよい。本明細書の用語「ヒト化抗体」は、マウスのごとき別の哺乳動物種の生殖系に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体も包含する。
【0084】
本明細書の用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう(例えば、特異的にPD−L2に結合する単離抗体は、PD−L2以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。そのうえ、単離抗体は他の細胞性物質および/または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【0085】
PD−L2核酸およびポリペプチド分子
用語「ファミリー」は、本発明のポリペプチドおよび核酸分子についていう場合、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、本明細書で定義するように十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する2種またはそれ以上のポリペプチドまたは核酸分子を意味する。かかるファミリーのメンバーは天然または非天然のものであってよく、同じまたは異なる種に由来するものであってもよい。例えば、ファミリーはヒト起源の第1のポリペプチドならびにヒト起源の他の異なるポリペプチドを含んでいてもよく、あるいは非ヒト起源のホモログ、例えば、サルのポリペプチドを含んでいてもよい。ファミリーのメンバーは共通の機能的特徴を有していてもよい。
【0086】
例えば、本発明のPD−L2ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも1つの「シグナルペプチドドメイン」を含む。本明細書の用語「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、分泌および膜結合ポリペプチドのN末端に存在し、多くの疎水性アミノ酸残基を含んでいる約15個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドを包含する。例えば、シグナル配列は少なくとも約10〜30個のアミノ酸残基,好ましくは約15〜25個のアミノ酸残基、より好ましくは約18〜20個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは約19個のアミノ酸残基を含み、少なくとも約35〜65%、好ましくは約38〜50%、より好ましくは約40〜45%の疎水性アミノ酸残基(例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはフェニルアラニン)を有する。かかる「シグナル配列」は、当該分野において「シグナルペプチド」とも呼ばれ、かかる配列を含むポリペプチドを脂質二重層に指向させるのに役立ち、分泌および膜結合ポリペプチド中にあって開裂される。シグナル配列は配列番号:2(図3)のアミノ酸ほぼ1〜19であり、ネイティブなヒトPD−L2のアミノ酸配列中に確認された。シグナル配列は配列番号:5(図3)のアミノ酸ほぼ1〜19であり、ネイティブなマウスPD−L2のアミノ酸配列中にも確認された。
【0087】
本発明のもう1つの具体例において、本発明のPD−L2ポリペプチドが「膜貫通ドメイン」の存在に基づいて同定される。本明細書の用語「膜貫通ドメイン」は、細胞質膜を貫通する長さ約15アミノ酸残基のアミノ酸配列を包含する。より詳細には、膜貫通ドメインは少なくとも約20、25、30、35、40または45個のアミノ酸を含み、細胞質膜を貫通する。膜貫通ドメインは疎水性残基に富み、典型的には、α−ヘリックス構造を有する。好ましい具体例において、膜貫通ドメインの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上のアミノ酸が疎水性、例えば、ロイシン、イソロイシン、チロシンまたはトリプトファンである。膜貫通ドメインは、例えば、Zagotta, W.N. et al. (1996) Annu. Rev. Neurosci. 19:235−263に記載されており、参照によりその内容を本明細書に一体化させる。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基220〜243、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基201〜243は膜貫通ドメインを構成すると推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基220〜242、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基201〜223は膜貫通ドメインを構成すると推定される(図3参照)。したがって、ヒトPD−L2の膜貫通ドメインに対して少なくとも71〜80%、より好ましくは約80〜90%の相同性を有するPD−L2ポリペプチドは本発明の範囲内である。
【0088】
もう1つの具体例において、ポリペプチドまたは対応核酸分子中の「IgCドメイン」または「IgVドメイン」の存在に基づいて本発明のPD−L2分子が同定される。本明細書の用語、IgCドメインおよびIgVドメインはIgスーパーファミリーのメンバーのドメインとして当該分野において認識されている。これらのドメインは、Igフォールドと呼ばれる特徴的なフォールディングパターンを有する構造ユニットに対応する。Igフォールドは2つのβシートのサンドイッチから構成されており、各々は5〜10個のアミノ酸の逆平行β鎖からなり、すべてではないが大部分のドメインにおいて2つのβシート間に保存されたジスルフィド結合がある。Ig、TCRおよびMHC分子のIgCドメインは同じタイプの配列パターンを共有し、Igスーパーファミリー中のC1セットと呼ばれている。他のIgCドメインは他のセットに属する。IgVドメインも配列パターンを共有しており、Vセットドメインと呼ばれている。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基20〜120、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基1〜101はIgVドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基20〜120、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基1〜101もIgVドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基121〜219、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基102〜200はIgCドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基121〜219、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基102〜200もIgCドメインを含むと推定される(図3参照)。好ましい具体例において、IgVドメインの存在はPD−L2のその本来の結合パートナー、例えばPD−1への結合に必要とされる。
【0089】
もう1つの具体例において、ポリペプチドまたは対応核酸分子中の「細胞外ドメイン」の存在に基づいて本発明のPD−L2分子が同定される。本明細書の用語「細胞外ドメイン」は、細胞表面から尾部として伸長しているN末端アミノ酸を示す。本発明の細胞外ドメインはIgVドメインおよびIgCドメインを含み、シグナルペプチドドメインを含んでいてもよい。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基1〜219、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基1〜200は細胞外ドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基1〜219、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基1〜200も細胞外ドメインを含むと推定される(図3参照)。
【0090】
さらにもう1つの具体例において、ポリペプチドまたは対応核酸分子中の「細胞質ドメイン」の存在に基づいて本発明のPD−L2分子が同定される。本明細書の用語「細胞質ドメイン」は、細胞の細胞質中の尾部として伸長しているC末端アミノ酸を示す。ネイティブなヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基244〜273、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基225〜273は細胞質ドメインを含むと推定される(図3参照)。ネイティブなマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸残基243〜247、ならびに推定成熟ポリペプチドのアミノ酸残基224〜228も細胞質ドメインを含むと推定される(図3参照)。
好ましい具体例において、本発明のPD−L2分子は少なくとも1個またはそれ以上の下記ドメインを含む:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0091】
本発明の単離ポリペプチド、好ましくはPD−L2ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列に対して十分に同一であるアミノ酸配列を有し、あるいは配列番号:1または3に対して十分に同一であるヌクレオチド配列によりコードされる。本明細書の用語「十分に同一」は、第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分または最小の数の同一または同等なアミノ酸残基(例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基)またはヌクレオチドを含む第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列をいい、第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列は共通の構造ドメインまたはモチーフおよび/または共通の機能活性を有する。例えば、ドメインのアミノ酸配列間において少なくとも30%、40%または50%の相同性、好ましくは60%の相同性、より好ましくは70〜80%の相同性、さらに好ましくは90〜95%の相同性を有し、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つの構造ドメインまたはモチーフを含む共通の構造ドメインを共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は十分に同一であると定義される。さらにそのうえ、少なくとも30%、40%または50%の相同性、好ましくは60%の相同性、より好ましくは70〜80%の相同性、さらに好ましくは90〜95%の相同性を有し、共通の機能的活性を共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は十分に同一であると定義される。
【0092】
本明細書の用語「PD−L2活性」、「PD−L2の生物学的活性」または「PD−L2の機能的活性」は、PD−L2応答性細胞または組織に対し、あるいはPD−L2ポリペプチド結合パートナーに対し、PD−L2蛋白、ポリペプチドまたは核酸分子により発揮される活性であって、標準的方法によりインビボまたはインビトロにおいて決定される活性をいう。1の具体例において、PD−L2活性は、PD−L2結合パートナーとの結合のごとき直接的活性である。本明細書の用語「標的分子」または「結合パートナー」は、本来的にPD−L2ポリペプチドが結合または相互作用してPD−L2により媒介される機能が発揮される分子である。典型的な具体例において、PD−L2標的分子は受容体PD−1である。あるいはまた、PD−L2活性は、PD−L2ポリペプチドとその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用により媒介される細胞シグナリング活性のごとき間接的活性である。PD−L2の生物学的活性は本明細書に記載されている。例えば、本発明のPD−L2ポリペプチドは1またはそれ以上の下記活性を有しうる:1)受容体PD−1または他のPD−L2の本来の結合パートナーに結合し、そして/あるいはその活性をモジュレーションする、2)細胞内または細胞間シグナリングをモジュレーションする、3)免疫細胞、例えば、Tリンパ球の活性化をモジュレーションする、4)生物、例えばマウスまたはヒト生物の免疫応答をモジュレーションする。
【0093】
したがって、本発明のもう1つの具体例は、PD−L2活性を有する単離PD−L2蛋白およびポリペプチドに関する。他の好ましいポリペプチドは、1またはそれ以上の下記ドメインを有するPD−L2ポリペプチドであり、好ましくはPD−L2活性を有するものである:シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。
【0094】
さらなる好ましいPD−L2ポリペプチドは少なくとも1つの細胞外ドメイン、および1つまたはそれ以上のシグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、IgCドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを有し、好ましくは、ストリンジェントな条件下において配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列の相補配列を含む核酸分子とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
【0095】
単離ヒトPD−L2 cDNAのヌクレオチド配列およびヒトPD−L2ポリペプチドの推定アミノ酸配列はそれぞれ図1ならびに配列番号:1および2に示されている。単離マウスPD−L2 cDNAのヌクレオチド配列およびマウスPD−L2ポリペプチドの推定アミノ酸配列はそれぞれ図2ならびに配列番号:4および5に示されている。
【0096】
ヒトPD−L2遺伝子は約1223ヌクレオチドの長さであり、約30.0kDの分子量を有し、約273アミノ酸の長さのポリペプチドをコードする。マウスPD−L2遺伝子は約1655ヌクレオチドの長さであり、約27.2kDの分子量を有し、約247アミノ酸の長さのポリペプチドをコードする。
【0097】
本発明の種々の態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明する:
【0098】
I.単離核酸分子
本発明の1の態様は、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分をコードする単離核酸分子、ならびにPD−L2をコードする核酸分子(例えば、PD−L2 mRNA)を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するに十分な核酸フラグメントおよびPD−L2核酸分子の増幅または突然変異のためのPCRプライマーとして使用されるフラグメントに関する。本明細書の用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNA)ならびにヌクレオチドアナログを用いて得られるDNAまたはRNAのアナログをいう。核酸分子は1本鎖または2本鎖でありうるが、好ましくは2本鎖DNAである。
【0099】
用語「単離核酸分子」は、核酸の天然ソース中に存在する他の核酸から分離されている核酸分子を包含する。例えば、ゲノムDNAに関して、用語「単離」は、ゲノムDNAは本来的に結合している染色体から分離されている核酸分子を包含する。好ましくは、「単離」核酸分子は、当該核酸が由来した生物のゲノムDNA中の本来的に隣接している配列(すなわち、当該核酸分子の5’および3’末端に存在する配列)を含まない。例えば、種々の具体例において、単離PD−L2核酸分子は、その核酸分子が由来した細胞のゲノムDNA中のその核酸分子に隣接した約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチド配列を含むことができる。そのうえ、組換え法により製造される場合にはDNA分子のごとき「単離」核酸分子は細胞性物質または培地を実質的に含まないものであってもよく、化学合成される場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【0100】
標準的な分子生物学の方法および本明細書に示される配列の情報を用いて、本発明の核酸分子、例えば、配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列またはその一部を有する核酸分子を単離することができる。配列番号:1、3、4または6の核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング方法を用いて、PD−L2核酸分子を単離することができる(例えば、Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されたようにして)。
そのうえ、配列番号:1、3、4または6の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、配列番号:1、3、4または6の全部または一部を含む核酸分子を単離することができる。
【0101】
cDNA、mRNAを鋳型として用いて、別法としてゲノムDNAを鋳型として用い、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なPCR増幅法により本発明の核酸分子を増幅することができる。そのようにして増幅された核酸分子を適当なベクター中にクローン化して、DNA配列分析により特徴づけることができる。さらにそのうえ、標準的な合成方法により、例えば、自動DNA合成装置を用いてPD−L2ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【0102】
好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列を含む。このcDNAは配列番号:1のヒトPD−L2ポリペプチドをコードする配列(すなわち、ヌクレオチド274〜1092のコーディング領域)ならびに5’非翻訳配列(ヌクレオチド1〜273)および3’非翻訳配列(ヌクレオチド1093〜1223)を含んでいてもよい。あるいは、核酸分子は、配列番号:1のコーディング領域のみ(すなわち、ヌクレオチド274〜1092、配列番号:3に対応)を含んでいてもよい。したがって、もう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は配列番号:3および配列番号:1のヌクレオチド1〜274を含む。さらにもう1つの具体例において、単離核酸分子は配列番号:3および配列番号:1のヌクレオチド1093〜1223を含む。さらにもう1つの具体例において、核酸分子は配列番号:1または配列番号:3に示すヌクレオチド配列からなる。さらにもう1つの具体例におて、核酸分子は配列番号:1のコーディング領域(例えば、ヌクレオチド274〜1092、配列番号:3に対応)ならびに停止コドン(例えば、配列番号:1のヌクレオチド1093〜1095)を含んでいてもよい。
【0103】
このcDNAは、配列番号:4のマウスPD−L2をコードする配列(すなわち、ヌクレオチド210〜950のコーディング領域)ならびに5’非翻訳配列(ヌクレオチド)および3’非翻訳配列(ヌクレオチド1〜209)を含んでいてもよい。あるいは、核酸分子は、配列番号:4のコーディング領域のみ(すなわち、ヌクレオチド210〜950、配列番号:6に対応)を含んでいてもよい。したがって、もう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は配列番号:6および配列番号:4のヌクレオチド1〜210を含む。さらにもう1つの具体例において、単離核酸分子は配列番号:6および配列番号:4のヌクレオチド951〜1655を含む。さらにもう1つの具体例において、核酸分子は配列番号:4または配列番号:6に示すヌクレオチド配列からなる。さらにもう1つの具体例におて、核酸分子は配列番号:4のコーディング領域(例えば、ヌクレオチド210〜950、配列番号:4に対応)ならびに停止コドン(例えば、配列番号:4のヌクレオチド951〜953)を含んでいてもよい。
【0104】
もう1つの好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列またはそれらのヌクレオチド配列の一部の相補配列である核酸分子を含む。配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子は、配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列に対して十分に相補的である核酸分子であり、その結果、それはそれぞれ配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションでき、そのことにより安定な2本鎖を形成する。
【0105】
さらにもう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列の全長またはこれらのヌクレオチド配列の一部に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。
そのうえ、本発明の核酸分子は配列番号:1、3、4または6の核酸配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用できるフラグメントあるいはPD−L2ポリペプチドの一部、例えばPD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分をコードするフラグメントのみを含んでいてもよい。ヒトPD−L2遺伝子のクローニングにより決定されたヌクレオチド配列は、他のPD−L2ファミリーのメンバーならびに他の種由来のPD−L2ホモログの同定および/またはクローニングに使用するように設計されたプローブおよびプライマーの取得を可能にする。典型的には、プローブ/プライマーは実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。典型的には、オリゴヌクレオチドは、配列番号:1、3、4または6のセンス配列の、あるいは配列番号:1、3、4または6のアンチセンス配列の、あるいは配列番号:1、3、4または6の天然に存在する対立遺伝子変種の少なくとも約12または15個の、好ましくは約20または25個の、より個の約30、35、40、45、50、55、60、65または75個の連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の領域を含む。
【0106】
1の具体例において、本発明の核酸分子は、約50−100、100−150、150−200、200−250、250−300、300−350、350−400、400−450、450−500、500−550、550−600、600−650、650−700、700−750、750−800、800−850、850−900、900−950、950−1000、1000−1050、1050−1100、1100−1150ヌクレオチドまたはそれ以上のものよりも大きく、ストリンジェントな条件下で配列番号:1、3、4または6の核酸分子にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列またはその相補配列を含む。さらなる具体例において、本発明の核酸分子は約880−900、900−950、950−1000、1000−1050、1050−1100、1100−1150ヌクレオチドまたはそれ以上のものよりも大きく、ストリンジェントな条件下で配列番号:1または3の核酸分子にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列またはその相補配列を含む。さらにもう1つの具体例において、本発明の核酸分子は約50−100、100−150、150−200、200−250、250−300ヌクレオチドまたはそれ以上のものよりも大きく、ストリンジェントな条件下で配列番号:1のヌクレオチド1〜358を含む核酸分子にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列またはその相補配列を含む。さらなる具体例において、本発明の核酸分子は約50−100、100−150、150−200、200−250、250−300、300−350、350−400、400−450、450−500、500−550、550−600、600−650、650−700、700−750、750−800、850−900、900−950、950−1000−1050−1100、1100−1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、配列番号:1のヌクレオチド1〜358を含む配列の少なくとも約15個の(すなわち、連続した15個の)ヌクレオチドまたはその相補配列を含み、ストリンジェントな条件下で配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその相補配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を含む。
【0107】
PD−L2ヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて同じまたは相同的なポリペプチドをコードする転写物またはゲノム配列を検出することができる。好ましい具体例において、プローブは、それに結合した標識基をさらに含み、例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターであってもよい。かかるプローブを診断試験キットの一部として用いて、例えば、対象からの細胞試料中のPD−L2をコードする核酸のレベル、例えば、PD−L2 mRNAレベルを測定し、あるいはゲノムPD−L2遺伝子が変異または欠失しているかどうかを調べることにより、PD−L2ポリペプチドを誤って発現する細胞または組織を同定することができる。
【0108】
PD−L2の生物学的活性(例えば、その本来の結合パートナー(例えばPD−1)に結合し、そして/あるいは免疫細胞活性をモジュレーションする能力)を有するポリペプチドをコードする配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列の一部分を単離し、PD−L2ポリペプチドのコードされた部分を発現させ(例えば、インビトロでの組換え発現により)、次いで、PD−L2ポリペプチドのコードされた部分の活性を評価することにより、「PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分」をコードする核酸フラグメントを調製することができる。
【0109】
さらに本発明は、遺伝暗号の縮重により配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列とは異なっているが、配列番号:1、3、4または6に示すヌクレオチド配列によりコードされるのと同じPD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。もう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は配列番号:2または5に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
【0110】
配列番号:1、3、4または6に示すPD−L2ヌクレオチド配列のほかに、PD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を導くDNA配列多型が集団(例えば、ヒト集団)中に存在してもよいことが当業者に理解されよう。PD−L2遺伝子中のかかる遺伝学的多型が、天然の対立遺伝子変化により集団中の個体間に存在してもよい。本明細書の用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、PD−L2ポリペプチド、好ましくは哺乳動物PD−L2ポリペプチドをコードする読み取り枠を含み、さらに非コーディング調節配列おおびイントロンを含んでもよい核酸分子をいう。
【0111】
ヒトまたはマウスのPD−L2の対立遺伝子変種は機能的ならびに非機能的PD−L2ポリペプチドを包含する。機能的対立遺伝子変種は、本来のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1に結合し、そして/あるいはリンパ球活性化をモジュレーションする能力を維持しているヒトまたはマウスのPD−L2ポリペプチドの天然に存在するアミノ酸配列変種である。典型的には、機能的対立遺伝子変種は、配列番号:2または5の1個またはそれ以上のアミノ酸の保存的置換のみを含み、あるいはポリペプチドの重要でない領域の重要でない残基の置換、欠失または挿入を含む。
【0112】
非機能的対立遺伝子変種は、本来のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1に結合せず、本明細書記載のPD−L2活性をモジュレーションしないヒトまたはマウスのPD−L2ポリペプチドの天然に存在するアミノ酸配列変種である。典型的には、非機能的対立遺伝子変種は、配列番号:2または5のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入あるいは未成熟な末端切断、あるいはポリペプチドの重要な残基または重要な領域、例えばIgV領域における置換、挿入または欠失を含む。
【0113】
さらに本発明は、ヒトまたはマウスPD−L2ポリペプチドの非ヒト、非マウスオーソログを提供する。ヒトまたはマウスPD−L2ポリペプチドのオーソログは、非ヒト、非マウス生物から単離され、PD−L2ポリペプチドと同じPS−1結合活性および/またはリンパ球活性化モジュレーション活性を有するポリペプチドである。ヒトまたはマウスPD−L2ポリペプチドのオーソログは配列番号:2または5と実質的に同じアミノ酸配列を含むものと容易に同定される。
【0114】
そのうえ、他のPD−L2ファミリーのメンバーをコードする核酸分子、よって配列番号:1、3、4または6のPD−L2配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は本発明の範囲内にある。例えば、マウスまたはヒトのPD−L2のヌクレオチド配列に基づいて別のPD−L2 cDNAを同定することができる。そのうえ、異なる種由来のPD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子、かくして配列番号:1、3、4または6のPD−L2配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は本発明の範囲内である。例えば、マウスまたはヒトPD−L2のヌクレオチド配列に基づいてサルPD−L2 cDNAを同定することができる。
【0115】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において標準的なハイブリダイゼーション法により、本明細書開示のcDNAあるいはその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書開示のPD−L2核酸に対する相同性に基づいて、本発明のPD−L2 cDNAの天然の対立遺伝子変種およびホモログに対応する核酸分子を単離することができる。さらに、PD−L2遺伝子と同じ染色体または遺伝子座にマッピングすることにより、本発明のPD−L2 cDNAの天然の対立遺伝子変種およびホモログに対応する核酸分子を単離することができる。
【0116】
したがって、もう1つの具体例において、本発明の単離核酸分子は少なくとも15、20、25、30ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号:1のヌクレオチド配列のヌクレオチド1〜358または配列番号:3のヌクレオチド1〜85を含む核酸分子にハイブリダイゼーションする。他の具体例において、核酸は少なくとも880−900、900−950、950−1000、1000−1050、1050−1100、1100−1150ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。
【0117】
本明細書の用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする」は、有意に同一または相同的であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイゼーションしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件をいう。好ましくは、少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80%、さらに好ましくは少なくとも約85%または90%同一である配列が互いにハイブリダイゼーションしたままである条件である。かかるストリンジェントな上官は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), セクション 2, 4 および 6中に見られる。さらなるストリンジェントな条件はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 第 7, 9 および 11 章中に見られる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、4X または 6X 塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム (SSC)中, 約 65−70℃でのハイブリダイゼーション(あるいは 4X SSC プラス 50% ホルムアミド中、約 42−50℃でのハイブリダイゼーション)、次いで、1X SSC中, 約 65−70℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい非限定的な例は、6X SSC、45℃でのハイブリダイゼーション, 次いで、0.2X SSC, 0.1% SDS中、65℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、1X SSC中, 約 65−70℃でのハイブリダイゼーション (あるいは 1X SSC プラス 50% ホルムアミド中、約42−50℃でのハイブリダイゼーション)、次いで、0.3X SSC中, 約 65−70℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。ストリンジェンシーを減じたハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、4X または 6X SSC中, 約50−60℃でのハイブリダイゼーション(あるいは6X SSC プラス 50% ホルムアミド中、約40−45℃でのハイブリダイゼーション)、次いで、2X SSC中, 約50−60℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。上記値の間の範囲、例えば、65−70℃または42−50℃もまた本発明の範囲内である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファー中のSSC(1xSSC は 0.15M NaCl および 15mM クエン酸ナトリウム)に代えてSSPE(1xSSPE は 0.15M NaCl, 10mM NaH2PO4, および 1.25mM EDTA, pH 7.4)を用いることができ、ハイブリダイゼーション完了後、各回15分の洗浄を行なう。長さ50塩基対未満と予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度はハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5−10℃低くすべきである。ここにTmは以下の等式により決定される。長さ18塩基対未満のハイブリッドの場合、Tm(℃) = 2(A + T 塩基数) + 4(G + C 塩基数)。長さ18ないし49塩基対のハイブリッドの場合、Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) − (600/N)、ここにNはハイブリッド中の塩基数、[Na+]はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオン濃度(1xSSCの[Na+]は0.165M)である。ブロッキング剤(例えばBSAまたはサケもしくはニシンの精子キャリアDNA)、界面活性剤(例えばSDS)、キレート剤(例えばEDTA)、Ficoll、PVP等のさらなる試薬(これらに限らない)をハイブリダイゼーションおよび/または洗浄バッファーに添加して核酸分子の膜、例えばニトロセルロースまたはナイロン膜への非特異的ハイブリダイゼーションを減少させてもよいことが当業者により理解されるであろう。ナイロン膜を用いる場合、詳細には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい非限定的な例は、0.25−0.5M NaH2PO4, 7% SDS中、約65℃でのハイブリダイゼーション、次いで、0.02M NaH2PO4, 1% SDS中、65℃での1回またはそれ以上の回数の洗浄である。例えば、Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991−1995 参照(あるいは 0.2X SSC, 1% SDS)。
【0118】
好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号:1、3、4または6の配列にハイブリダイゼーションする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書の用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子をいう。
【0119】
集団中に存在してもよいPD−L2配列の天然に存在する対立遺伝子変種のほかに、当業者は、配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列中に突然変異により変化を導入し、そのことによりPD−L2ポリペプチドの機能能力を変化させることなく、コードされるPD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くことが可能であることをさらに認識するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を配列番号:1、3、4または6において作成することができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなくPD−L2の野生型配列(例えば、配列番号:2または5の配列)から変化させることのできる残基であり、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のPD−L2ポリペプチド間で保存されているアミノ酸残基、例えば、細胞外ドメイン中に存在するものは特に変化に適さないと推定される。さらにそのうえ、本発明のPD−L2間およびPD−L2ファミリーの他のメンバー間で保存されているさらなるアミノ酸残基も変化に適する可能性が低い。
【0120】
したがって、本発明のもう1つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含むPD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。かかるPD−L2ポリペプチドは配列番号:2または5のアミノ酸配列において異なっているが、やはり生物学的活性を保持している。1の具体例において、単離核酸分子は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは配列番号:2または5に対して少なくとも約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【0121】
配列番号:2または5のポリペプチドと同一のPD−L2ポリペプチドをコードする単離核酸を、配列番号:1、3、4または6のヌクレオチド配列中に1またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作成して、1またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるポリペプチド中に導入されるようにすることができる。部位特異的突然変異方およびPCRによる突然変異法のごとき標準的方法により配列番号:1、3、4または6中に変異を導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、1つまたはそれ以上の非必須アミノ酸残基で起こる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換する方法の1つである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義され、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷の極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。したがって、好ましくは、PD−L2ポリペプチド中の非必須なアミノ酸残基は、同様の側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基に置換される。あるいは、もう1つの具体例において、例えば飽和突然変異法によりPD−L2コーディング配列の全体または一部にランダムに変異を導入することができ、得られた変異体をPD−L2生物学的活性に関してスクリーニングして、活性を保持している変異体を同定することができる。配列番号:1、3、4または6の変異後、コードされるポリペプチドを組換え方により発現させ、ポリペプチドの活性を調べることができる。
【0122】
好ましい具体例において、本来のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1への結合および/またはその活性をモジュレーションする能力、細胞内または細胞間シグナリングをモジュレーションする能力、Tリンパ球の活性化をモジュレーションする能力、ならびに/あるいは生物の免疫応答をモジュレーションする能力に関して変異PD−L2ポリペプチドをアッセイすることができる。
【0123】
さらにもう1つの本発明の態様は、PD−L2融合蛋白をコードする単離核酸分子に関する。非PD−L2ポリペプチド、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列に作動可能に結合される、少なくともPD−L2ポリペプチド、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列を含むこのような核酸分子は、標準的な組み換えDNA法により調製できる。
【0124】
上記PD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子のほかに、本発明のもう1つの態様は、それらに対してアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は蛋白をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列、またはmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合しうる。アンチセンス核酸は、PD−L2コーディング鎖全体、あるいはその蛋白にのみ相補的であり得る。1の具体例において、アンチセンス核酸分子は、PD−L2をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスである。用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。他の具体例において、アンチセンス核酸分子は、PD−L2をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」にアンチセンスである。用語「非コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する5’および3’配列をいう(5’および3’非翻訳領域ともいう)。
【0125】
本明細書で開示されたヒトまたはマウスのPD−L2をコードするコーディング配列(例えば、それぞれ配列番号:3または配列番号:6)が得られたならば、本発明のアンチセンス核酸を、WatsonおよびCrickの塩基対合の法則により設計できる。アンチセンス核酸分子は、PD−L2 mRNAの全コーディング領域に相補的であってよい、より好ましくは、PD−L2 mRNAのコーディング領域または非コーディング領域だけにアンチセンスなオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PD−L2 mRNAの翻訳開始部位の周辺領域に相補的であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドの長さであってよい。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および当該分野で公知の工程を使用する酵素により連結反応を使用して構築できる。例えば、天然に存するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させ、アンチセンスとセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用してアンチセンス核酸分子(例えば、アンチセンスヌクレオチド)を化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸の生成に使用しうる修飾ヌクレオチドの例は、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨウドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデシン、1−メチルグアニン、1−メチルリノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルクエオシン、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6−ジアミノプリンを包含する。別法として、核酸をアンチセンス方向(すなわち、挿入核酸から転写されたRNAは、対象とする標的核酸に対してアンチセンス方向であろう。これは以下のサブセクションにさらに記載する。)にサブクローニングする発現ベクターを使用してアンチセンス核酸を生物学的に生産できる。
【0126】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与され、またはin situにおいて産生され、これらはハイブリッド形成し、またはPD−L2ポリペプチドをコードする細胞のmRNAおよび/またはゲノムDNAに結合し、そのことにより、例えば、転写および/または翻訳を阻害することにより、蛋白の発現を阻害する。ハイブリッド形成は、保存ヌクレオチド相補性により、あるいは例えば、DNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重螺旋の主要な溝での特別な相互作用により、安定な二本鎖を形成することができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接注入を含む。別法として、アンチセンス核酸分子を修飾して選択された細胞を標的化し、ついで、全身投与することができる。例えば、全身投与するために、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合することにより、アンチセンス分子が選択された細胞表面で発現した受容体または抗原に結合するように特異的に修飾することができる。また、アンチセンス核酸分子を、本明細書記載のベクターを使用して細胞にデリバリーすることができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を実現させるため、アンチセンス核酸分子が強力なpolIIまたはpolIIIプロモーターの制御下に置かれるベクター構造が好ましい。
【0127】
さらなる具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的なRNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは通常のβ−ユニットとは対照的に鎖は互いに平行に伸長する(Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625−6641)。また、アンチセンス核酸分子は、2’−o−メチルリボヌクレオチドを含んでいてもよく(Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6431−6148)あるいはキメラRNA−DNAアナログを含んでいてもよい(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327−330)。
【0128】
さらなる他の具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、リボザイムである。リボザイムは、それに相補的な領域を有するmRNAのごとき1本鎖核酸分子を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。したがって、リボザイム(例えば、ハンマーヘッドリボザイム(hammerhead ribozymes)(Haseloff and Gerlach (1988) Nature 334:585−591に記載)を用いてPD−L2 mRNA転写物を触媒的に切断することができ、そのことによりPD−L2 mRNAの翻訳を阻害することができる。PD−L2をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムを、本明細書に記載のPD−L2のヌクレオチド配列(すなわち、配列番号:1、3、4または6)に基づいて設計することができる。例えば、Tetrahymena L−19 IVS RNAの誘導体を、活性部位のヌクレオチド配列がPD−L2をコードするmRNA中で切断されるヌクレオチド配列に相補的であるように構築できる。例えば、Cech らの米国特許第4,987,071号;およびCechらの米国特許第5,116,742号参照。別法として、PD−L2 mRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することができる。例えば、Bartel, D. and Szostak, J. W. (1993) Science 261:1411−1418参照。
【0129】
別法として、PD−L2の調節領域(例えば、PD−L2プロモーターおよび/またはエンハンサー;例えば、配列番号:1のヌクレオチド1〜273または配列番号:4のヌクレオチド1〜209)に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞中のPD−L2遺伝子の転写を防ぐ三重螺旋構造を形成することにより、PD−L2遺伝子発現を阻害することができる。一般的には、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569−84; Helene, C. et al (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27−36; and Maher, L. J. (1992) Bioessays 14(12):807−15参照。
【0130】
さらなる他の具体例において、本発明のPD−L2核酸分子を、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾して、例えば、安定性、ハイブリッド形成、または分子の溶解性を改善することができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾してペプチド核酸を得ることができる(Hyrup, B. and Nielsen, P. E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1):5−23参照)。本明細書の用語「ペプチド核酸」または「PNA」は、デオキシリボースリン酸骨格を、擬似ペプチド骨格により置換し、4つの天然ヌクレオベースだけが維持された核酸模倣物、例えば、DNA模倣物を意味する。PNAの天然の骨格は、低イオン強度の環境下でDNAおよびRNAに特異的なハイブリッド形成を可能にすることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、標準的な、Hyrup and Nielsen (1996) supra and Perry−O’Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670−675に記載のように固相ペプチド法を使用して実行できる。
【0131】
PD−L2核酸分子のPNAを治療および診断用に使用できる。例えば、PNAは、例えば、転写または翻訳の停止を誘発し、または複製を阻害することにより、アンチセンスまたは抗原作用剤として、遺伝子発現の配列特異的なモジュレーションに使用可能である。また、PD−L2核酸分子のPNAは、遺伝子中の単塩基対突然変異体の分析に(例えば、PNA−指向性PCRクランピング)、他の酵素と組み合わせて使用される場合には「人工制限酵素」として(例えば、上記S1ヌクレアーゼ(上で引用したHyrup and Nielsen (1996)))、あるいはDNA配列またはハイブリッド形成用のプローブまたはプライマーとして(上で引用したHyrup and Nielsen (1996); Perry−O’Keefe et al. (1996) supra)使用可能である。
【0132】
PD−L2核酸分子のPNAを治療および診断用途に使用することができる。例えば、転写または翻訳停止を誘導することにより、あるいは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的モジュレーションのためのアンチセンスまたは抗原としてPNAを使用することができる。また、PD−L2核酸分子のPNAを、遺伝子中の単一塩基対変異の分析に(例えば、PNAに指向されたPCRクランピングにより);他の酵素(例えば、S1ヌクレアーゼ(上記Hyrup and Nielsen (1996)))と組み合わせた場合に人工制限酵素として;あるいはDNA配列決定またはハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして(上記Hyrup and Nielsen (1996); 上記Perry−O’Keefe (1996))使用することもできる。
【0133】
他の具体例において、親油性または他のヘルパー基をPNAに付着させることにより、PNA−DNAキメラの形成により、またはリポソームまたは当業者に公知の薬剤デリバリーの他の方法により、PD−L2のPNAを修飾することができる(例えば、安定性または細胞摂取を高めるために)。例えば、PNAおよびDNAの有利な特性を組み合わせることができるPD−L2核酸分子のPNA−DNAキメラを得ることができる。このようなキメラは、DNA認識酵素(例えば、RNAse HおよびDNAポリメラーゼ)に、DNA部分との相互作用を可能ならしめ、その一方で、PNA部分は、高い結合アフィニティーおよび特異性を提供するであろう。塩基スタッキング、ヌクレオベース間の結合の数、および方向に関して選択される適当な長さのリンカーを使用してPNA−DNAキメラを連結することができる(Hyrup B. and Nielsen (1996) supra)。PNA−DNAキメラの合成を、Hyrup B. and Nielsen(1996) supra および Finn P. J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357−63に記載のように行なうことができる。例えば、標準的なホスホラミダイトカップリング化学物質を使用して、固体支持体上でDNA鎖を合成することができる。修飾ヌクレオシドアナログ(例えば、5’−(4−メトキシトリチル)アミノ−5’−デオキシ−チミジンホスホラミダイト)を、PNAとDNAの5’末端との間のリンカーとして使用できる(Mag, M. et al. (1989) Nucleic acid Res. 17:5973−88)。ついで、キメラ分子を生成する段階的な方法で、PNAモノマーを5’PNAセグメントおよび3’DNAセグメントとカップリングさせる(上記Finn P. J. et al. (1996))。別法として、5’DNAセグメントおよび3’PNAセグメントを用いてキメラ分子を合成することができる(Peterser, K. H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119−11124)。
【0134】
他の具体例において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのごとき他の付加基(例えば、インビボでの宿主細胞受容体の標的化のために)、あるいは細胞膜(例えば、Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553−6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648−652; PCT出願WO88/09810参照)または血液脳関門(例えば、PCT出願WO89/10134)を越えた輸送を容易ならしめる作用剤を包含する。さらに、オリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成により誘発される開裂剤(例えば、Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958−976参照)または挿入剤(例えば、Zon (1988) Pharm. Res. 5:539−549参照)を用いて修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、他の分子(例えば、ペプチド、ハイブリッド形成により誘発される架橋剤、輸送剤またはハイブリッド形成により誘発される切断剤)に結合させることができる。
【0135】
別法として、安定な細胞系またはクローン化された微生物のゲノム中に異種DNA調節エレメントを挿入して、挿入された調節エレメントが内在性PD−L2遺伝子に作動可能に連結されるようにすることにより、細胞系または微生物中の内在性PD−L2遺伝子の発現特性を修飾してもよい。例えば、通常には「転写的にはサイレント」な内在性PD−L2遺伝子、すなわち、通常には細胞系または微生物において発現されないかあるいは非常に低レベルでしか発現されないPD−L2遺伝子を、当該細胞系または微生物において通常に発現される遺伝子産物の発現を促進しうる調節エレメントを挿入することにより活性化させてもよい。別法として、転写的にサイレントな内在性PD−L2遺伝子を、細胞タイプを超えて作用する汎用調節エレメントを挿入することにより活性化させてもよい。
【0136】
当業者によく知られ、例えば、Chappel, 米国特許第5,272,071号; PCT公開第WO 91/06667号(1991年5月16日公開)に記載されている標的化相同組換え法のごとき方法を用いて、異種調節エレメントを安定な細胞系またはクローン化された微生物中に挿入して、それが内在性PD−L2遺伝子に連結されるようにしてもよい。
【0137】
II.単離PD−L2ポリペプチドおよび抗−PD−L2抗体
本発明の1の態様は、単離されたPD−L2ポリペプチド、およびその生物学的に活性のある部分、ならびに抗PD−L2抗体を生じさせる免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントに関する。1の具体例において、ネイティブなPD−L2ポリペプチドは、標準的な蛋白精製技術を用いた適当な精製計画により細胞または組織供給源から単離され得る。別の具体例において、PD−L2ポリペプチドは、組換えDNA技術により製造される。組換え発現に代わるものとして、PD−L2ポリペプチドまたはポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【0138】
「単離」または「精製」された蛋白またはその生物学的に活性のある蛋白は、PD−L2ポリペプチドが由来した細胞または組織源由来の細胞性物質または他の混入蛋白を実質的に含まず、あるいは化学合成の場合には化学前駆体または他の化学試薬を含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、PD−L2ポリペプチドが単離されあるいは組み換え法により製造される細胞の細胞性成分から分離されているPD−L2ポリペプチドの調合物を意味する。1の具体例において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、約30%(乾燥重量で)未満の非PD−L2ポリペプチド(本明細書において「混入蛋白」ともいう)、より好ましくは約20%の非PD−L2ポリペプチド、さらに好ましくは約10%未満の非PD−L2ポリペプチド、最も好ましくは約5%未満の非PD−L2ポリペプチドを有するPD−L2ポリペプチドの調合物を包含する。また、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分が組み換え法により製造される場合、好ましくは、それは培地を含まないものであり、すなわち、培地が蛋白調合物の体積の約20%未満、より好ましくは約10%未満、最も好ましくは約5%未満である。
【0139】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、蛋白合成に使用される化学前駆体または化学物質から蛋白が分離されているPD−L2ポリペプチドの調合物を包含する。1の具体例において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は約30%(乾燥重量で)未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質、より好ましくは約20%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質、さらに好ましくは約10%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質、最も好ましくは約5%未満の化学前駆体または非PD−L2化学物質を有するPD−L2蛋白調合物を包含する。
【0140】
本明細書の用語、PD−L2ポリペプチドの「生物学的に活性のある部分」は、PD−L2分子と非PD−L2分子、例えば、PD−L2の本来のリガンド、例えばPD−1との間の相互作用に関与するPD−L2ポリペプチドのフラグメントを包含する。PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分は、PD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列、例えば配列番号:2または5に示すアミノ酸配列に対して十分に同一である、あるいはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを包含し、それは完全長のPD−L2ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、少なくとも1つのPD−L2ポリペプチドの活性を示す。典型的には、生物学的に活性のある部分は、少なくとも1つのPD−L2の活性、例えば、PD−1活性のモジュレーション活性を有するドメインまたはモチーフを含む。PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分は、例えば、25、50、75、100、125、150、175、200、225個またはそれ以上のアミノ酸の長さである。PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分を、PD−L2により媒介される活性、例えば、免疫細胞活性化をモジュレーションする作用剤の開発のための標的として使用することができる。
【0141】
1の具体例において、PD−L2ポリペプチドの生物学的に活性のある部分は少なくとも細胞外ドメインの一部を含む。本発明のPD−L2ポリペプチドの好ましい生物学的に活性のある部分が、少なくとも、1の細胞外ドメイン(例えば、IgVおよび/またはIgCドメインを含む)、および1またはそれ以上の下記ドメイン:シグナルペプチドドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含んでいてもよいことが理解されるはずである。そのうえ、ポリペプチドの他の領域が欠失されている他の生物学的に活性のある部分を、組換え法により調製し、ネイティブなPD−L2ポリペプチドの1またはそれ以上の機能的活性について評価することができる。
【0142】
好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドは配列番号:2または5に示すアミノ酸配列を有し、配列番号:2または5のポリペプチドの機能的活性を保持しており、上のサブセクションIで詳述したように、自然発生的な対立遺伝子変化または突然変異によりアミノ酸配列が異なるものである。したがって、もう1つの具体例において、PD−L2ポリペプチドは、配列番号:2または5に対して少なくとも約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【0143】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントを測定するため、最適な比較を目的として配列を並置する(例、ギャップは、最適なアラインメント(並置)のために第1および第2アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、非相同性配列は比較目的に関しては無視され得る)。好ましい態様において、比較目的用に並置させたレファレンス配列の長さは、レファレンス配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、80%または90%である(例えば、第2の配列を、273個のアミノ酸残基、少なくとも82個、好ましくは少なくとも109個、より好ましくは少なくとも137個、さらにより好ましくは少なくとも164個、ずっと好ましくは少なくとも191個、218個、246個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する配列番号:2のヒトPD−L2アミノ酸配列と並置比較する場合;第2のアミノ酸配列を、247個のアミノ酸残基、少なくとも74個、好ましくは少なくとも99個、より好ましくは少なくとも124個、さらにより好ましくは少なくとも148個、ずっと好ましくは少なくとも173個、198個、222個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する配列番号:2のヒトPD−L2アミノ酸配列と並置比較する場合)。次いで、対応する位置にある残基を比較し、一配列における位置を他の配列で対応する位置と同じ残基が占めるとき、分子はその位置において同一である。2つの配列間の同一性%は、2つの配列の最適並置比較のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した上での、配列が共有する同一位置の数の関数である(本明細書で使用されているアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と均等内容である)。2つの配列の最適並置比較を行なうために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮すると、2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列が共有する同一位置の数の関数である。
【0144】
数学的アルゴリズムを用いて2つの配列間の配列の比較および同一性%の決定を行なうことができる。好ましい具体例において、GCGソフトウェアパッケージ(Genetics Computer Groupからオンラインで利用可能)中のGAPプログラム中に含まれるNeedleman and Wunschアルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:444−453 (1970))を用い、Blosum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ重量16、14、12、10、8、6、または4および長さ重量1、2、3、4、5、または6として、2つのアミノ酸配列間の同一性%が決定される。さらにもう1つの好ましい具体例において、GCGソフトウェアパッケージ(Genetics Computer Groupからオンラインで利用可能)中のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMPマトリックスを用いて、ギャップ重量40、50、60、70、または80および長さ重量1、2、3、4、5、または6として、2つのヌクレオチド配列間の同一性%が決定される。もう1つの具体例において、ALIGNプログラム(バージョン2.0または2.0U)中に含まれるMeyers, E. and Moller, W.のアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci. 4:11−17 (1988))を用い、PAM120重量残基表、ギャップ長さペナルティー12およびギャップペナルティー4を用いて、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性%が決定される。
【0145】
さらに本発明の核酸および蛋白配列を「クエリー(query)配列」として使用することにより、パブリックデータベースに対する検索が遂行され、例えば他のファミリー構成員または関連配列が同定され得る。かかる検索は、Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて遂行され得る。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12で遂行することにより、本発明のPD−L2核酸分子と相同的なヌクレオチド配列が得られる。BLAST蛋白検索を、XBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=3で遂行することにより、本発明のPD−L2ポリペプチド分子と相同的なアミノ酸配列が得られる。比較目的用のギャップトアラインメントを得るためには、Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389−3402記載の要領でギャップトBLASTが利用され得る。BLASTおよびギャップトBLASTプログラムを用いるとき、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォールトパラメーターが使用され得る。National Center for Biotechnology Informationのインターネットウェブサイト参照。
【0146】
本発明はまた、PD−L2キメラまたは融合蛋白を提供する。ここで使用されているPD−L2「キメラ蛋白」または「融合蛋白」は、非PD−L2ポリペプチドに作動可能に結合されたPD−L2ポリペプチドを含む。「PD−L2ポリペプチド」は、PD−L2ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含し、「非PD−L2ポリペプチド」は、PD−L2ポリペプチドと実質的に相同的ではない蛋白、例えばPD−L2ポリペプチドとは異なり、同一または異なる生物に由来する蛋白に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。PD−L2融合蛋白内では、PD−L2ポリペプチドは、PD−L2ポリペプチドの全部または一部に対応し得る。好ましい態様において、PD−L2融合蛋白は、PD−L2ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を有する部分を含む。もう1つの好ましい具体例において、PD−L2融合蛋白は、PD−L2ポリペプチドの少なくとも2つのドメインを含む。融合蛋白内で、「作動可能に結合された」の語は、PD−L2ポリペプチドおよび非PD−L2ポリペプチドが互いにインフレーム(in−frame)で融合されていることを示すものとする。非PD−L2ポリペプチドをPD−L2ポリペプチドのN−末端またはC−末端に融合させることができ、非PD−L2ポリペプチドはPD−L2ポリペプチドの溶解度、結合アフィニティー、安定性またはバレンシー(valency)を変化させる部分に対応する。
例えば、1の具体例において、融合蛋白は、PD−L2配列がGST配列のC末端に融合したGST−PD−L2融合蛋白である。かかる融合蛋白は、組換えPD−L2の精製を容易ならしめることができる。
【0147】
もう1つの具体例において、融合蛋白は、異種シグナル配列をN末端に含むPD−L2ポリペプチドである。ある種の宿主細胞(例えば、哺乳動物宿主細胞)において、異種シグナル配列を使用することによりPD−L2の発現および/または分泌を増加させることができる。
【0148】
好ましい具体例において、融合蛋白は、PD−L2配列がIg分子の一部分に融合したIg−PD−L2融合蛋白である。融合蛋白のIg部分は免疫グロブリン不変領域、例えば、ヒトCγ1ドメインまたはCγ4ドメイン(例えば、ヒトIgCγ1またはヒトIgCγ4ドメインのヒンジ、CH2およびCH3領域)を含むことができる(例えば、Capon et al., U.S. Patent No. 5,116,964; 5,580,756; 5,844,095等を参照、参照により本明細書に一体化させる)。得られる融合蛋白は変化したPD−L2溶解度、結合アフィニティー、安定性および/またはバレンシー(すなわち、1分子あたりの結合部位数)を有していてもよく、蛋白精製効率が高まっていてもよい。
【0149】
特に好ましいPD−L2Ig融合蛋白は、免疫グロブリン不変領域(例えば、Fc領域)とカップリングしたPD−L2の細胞外部分を含む。免疫グロブリン不変領域は、免疫グロブリン構造における固有のエフェクター活性を低下または除去する遺伝学的修飾を含んでいてもよい。例えば、PD−L2ポリペプチドの細胞外部分をコードするDNAを、例えば、WO97/28267中に教示されたように部位特異的突然変異法により修飾されたヒトIgGγ1および/またはIgGγ4のヒンジ、CH2、およびCH3領域をコードするDNAに連結することができる。
【0150】
本発明のPD−L2融合蛋白を医薬組成物中に含有させ、インビボにて対象に投与することができる。PD−L2融合蛋白を用いてPD−L2結合パートナー、例えば、PD−1の生体利用性に影響を及ぼしてもよい。PD−L2融合蛋白の使用は、免疫応答のモジュレーションにより利益を受けるであろう症状または疾病の治療に治療的に有用でありうる。
そのうえ、本発明のPD−L2融合蛋白を免疫原として用いて対象中に抗−PD−L2抗体を産生させ、PD−L2結合蛋白を精製し、スクリーニングアッセイにおいて本来の結合パートナー、例えば、PD−1との相互作用を阻害する分子を同定することができる。
【0151】
好ましくは、本発明のPD−L2キメラまたは融合蛋白は標準的な組換えDNA技術により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントが、慣用的技術によりインフレームにて一緒に連結され、例えば平滑末端またはスタガー末端を用いて連結され、制限酵素消化により適当な末端が提供され、適当な場合には付着末端がフィルイン(fill−in)され、アルカリ性ホスファターゼ処理により望ましくない連結が回避され、酵素により連結される。別の態様において、融合遺伝子を自動DNA合成装置を含む慣用的技術により合成することができる。別法として、遺伝子フラグメントのPCR増幅を、アンカープライマーを用いて実施してもよく、これにより2つの連続遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせ、次いで、アニーリング、再増幅を行なってキメラ遺伝子配列を得ることができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ:1992参照)。さらに、既に融合部分(例、GSTポリペプチドまたはHAエピトープ標識)をコードする多くの発現ベクターが市販されている。PD−L2をコードする核酸を、融合部分がPD−L2ポリペプチドにインフレームで融合されるように、かかる発現ベクター中へクローン化することができる。
【0152】
また本発明は、PD−L2アゴニスト(模倣物)またはPD−L2アンタゴニストのいずれかとして機能するPD−L2ポリペプチドの変種に関する。突然変異法、例えば、PD−L2ポリペプチドの別個の点突然変異または末端切断によりPD−L2ポリペプチドの変種を得ることができる。PD−L2ポリペプチドのアゴニストは、天然に存在する形態のPD−L2ポリペプチドと実質的に同じ生物学的活性またはその一部の活性を保持しうる。PD−L2ポリペプチドのアンタゴニストは、例えば、PD−L2ポリペプチドのPD−L2により媒介される活性を競争的にモジュレーションすることにより、天然に存在する形態のPD−L2ポリペプチドの1またはそれ以上の活性を阻害しうる。かくして、機能が限定された変種で処理することにより、特定の生物学的効果が誘発されうる。1の具体例において、天然に存在する形態のポリペプチドの生物学的活性の一部を有する変種での対象の治療は、天然に存在する形態のPD−L2ポリペプチドでの治療に比べて対象における副作用が少ない。
【0153】
1の具体例において、PD−L2アゴニスト(模倣物)としてまたはPD−L2アンタゴニストとして機能するPD−L2ポリペプチドの変異体を、PD−L2ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてPD−L2ポリペプチドの突然変異体、例えば末端切断突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。1の具体例において、PD−L2変異体の雑多なライブラリーは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異導入により生成され、雑多な(variegated)遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的に連結させることにより、PD−L2変異体の雑多なライブラリーを製造することができ、その場合、潜在的なPD−L2配列の縮重セットは、個々のポリペプチドとして発現可能であり、あるいは別法として、PD−L2配列のセットを含むより大きな融合蛋白のセットとして(例えば、ファージディスプレイ用に)発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なPD−L2変異体のライブラリーを製造するのに使用できる様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成装置で行なうことができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターに結合することができる。遺伝子の縮重セットの使用により、1の混合物中に、潜在的なPD−L2配列の目的とするセットをコードする配列がすべて提供され得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該分野で公知である(例えば、Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3、Itakuraら(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323、Itakuraら(1984)Science198:1056、Ikeら(1983)Nucleic Acid Res.11:477参照)。
【0154】
さらに、PD−L2ポリペプチドコーディング配列のフラグメントのライブラリーを用いて、PD−L2フラグメントの雑多な集団を得ることにより、PD−L2ポリペプチドの変異体をスクリーニングし、次いで、選択することができる。1の具体例において、ニッキングが1分子につき約1回だけ起こる条件下においてPD−L2をコードする配列の2本鎖PCRフラグメントを処理し、2本鎖DNAを変性させ、DNAを再生させて、異なるニック産物由来のセンス/アンチセンス対を含みうる2本鎖DNAを得て、S1ヌクレアーゼ処理により再形成された2本鎖から1本鎖部分を除去し、次いで、得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより、コーディング配列フラグメントのライブラリーを得ることができる。この方法により、様々なサイズのPD−L2ポリペプチドのN−末端、C−末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【0155】
点突然変異または末端切断により製造された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ならびに選択された特性を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該分野において知られている。上記技術は、PD−L2ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異法により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合し得る。高処理量分析が可能な、大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広範に使用されている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターへクローニングし、生成したベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換し、そして目的とする活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。再帰アンサンブル突然変異導入法(Recursive ensemble mutagenesis, REM)という、ライブラリーにおける機能性突然変異体の頻度を高める新規技術を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用することにより、PD−L2変異体を同定することができる(ArkinおよびYouvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811−7815、Delagraveら(1993)Protein Eng.6(3):327−331)。
【0156】
1の具体例において、細胞に基くアッセイを利用することにより、雑多なPD−L2ライブラリーを分析することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを細胞系中にトランスフェクションすることができる。次いで、トランスフェクションされた細胞をPD−1発現細胞と接触させ、野生型PD−L2と本来のリガンド、例えば、PD−1との相互作用による変異体の発現効果を検出することができる。次いで、PD−1によるシグナリングの阻害(T細胞アップレギュレーションを導く)あるいはPD−1によるシグナリングの強化(T細胞ダウンレギュレーションを導く)に関して評点をつけた細胞からプラスミドDNAを回収し、個々のクローンをさらに特徴づけることができる。
【0157】
天然に存するアミノ酸のみで構成されるPD−L2ポリペプチドに加えて、PD−L2ペプチド模倣物も提供される。ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの場合と類似した特性をもつ非ペプチド薬剤として製薬業界では常用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド・ミメティクス」または「ペプチド模倣物」と呼ばれ(Fauchere,J.(1986)Adv.Drug Res.15:29、Veberおよび Freidinger(1985)TINS 392頁、および Evansら、(1987)J.Med.Chem.30:1229、出典明示により本明細書の一部とする)、通常には、コンピューター化分子モデリングの助けにより開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣物を用いることにより、同等内容の治療または予防効果が生じうる。一般的に、ペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド(すなわち、生物または薬理活性を有するポリペプチド)、例えばヒトPD−L2と構造的に類似しているが、当業界では公知であり、さらに次の参考文献:Spatola,A.F.、“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins”中、Weinstein,B.編、Marcel Dekker、ニューヨーク、267(1983)、Spatola,A.F.、Vega Data(1983年3月)、第1巻、3刷、“Peptide Backbone Modifications”(レビュー)、Morley,J.S.(1980)Trends Pharm.Sci.463−468頁(レビュー)、Hudson,D.ら(1979)Int.J.Pept.Prot.Res.14:177−185(−CH2NH、CH2CH2−)、Spatola,A.F.ら(1986)Life Sci.38:1243−1249(−CH2−S)、Hann,M.M.(1982)J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.307−314(−CH−CH−、シスおよびトランス)、Almquist,R.G.ら(190)J.Med.Chem.23:1392−1398(−COCH2−)、Jennings−White,C.ら(1982)Tetrahedron Lett.23:2533(−COCH2−)、Szelke,M.ら、ヨーロッパ出願EP45665(1982)CA:97:39405(1982)(−CH(OH)CH2−)、Holladay,M.W.ら(1983)Tetrahedron Lett.(1983)24:4401−4404(−C(OH)CH2−)、および Hruby,V.J.(1982)Life Sci.(1982)31:189−199(−CH2−S−)に記載されている方法により(各々、出典明示により本明細書の一部とする)、−CH2NH−、CH2S−、−CH2−CH2−、−CH=CH−(シスおよびトランス)、−COCH2−、−CH(OH)CH2−および−CH2SO−から成る群から選択された結合によって所望により置換されていてもよい1個またはそれ以上のペプチド結合を有する。特に好ましい非ペプチド結合は−CH2NH−である。かかるペプチド模倣体は、例えば、生産性がより経済的である、化学的安定性が大きい、薬理学的特性(半減期、吸収、有効性、効力等)が高い、特異性が改変されている(例、広域スペクトルの生物活性)、抗原性が低いことなどを含め、ポリペプチド態様を凌ぐ顕著な利点を有し得る。ペプチド模倣体の標識は、直接的またはスペーサー(例、アミド基)を介して、定量的構造活性データおよび/または分子モデリングにより予測されるペプチド模倣物上の非干渉性位置(non−interfering position)への1個またはそれ以上の標識の共有結合を通常伴う。上記非干渉性位置は、一般的にペプチド模倣物が結合することにより治療効果を生じる高分子との直接接触を形成しない位置である。ペプチド模倣物の誘導体化(例えば、標識化)は、ペプチド模倣物の目的とする生物学的または薬理学的活性に実質的には干渉するものであってはならない。
【0158】
PD−L2アミノ酸配列の1個またはそれ以上のアミノ酸を同じタイプのD−アミノ酸(例、L−リジンの代わりにD−リジン)と系統的に置換する方法を用いることにより、さらに安定したペプチドが生成され得る。さらに、PD−L2アミノ酸配列または実質的に同一となる配列変化を含む束縛(constrained)ペプチドを、例えば、ペプチドを閉環する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによる、当該分野で公知の方法により、得ることができる(RizoおよびGierasch(1992)Annu.Rev.Biochem. 61:387、出典明示により本明細書の一部とする)。
【0159】
本明細書において同定されたPD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列によると、当業者であれば、PD−L2ペプチド配列およびその配列変異型に対応するポリペプチドを製造することが可能なはずである。多くの場合、PD−L2ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現により、原核生物または真核生物宿主細胞中で上記ポリペプチドが大型ポリペプチドの一部として製造され得る。別法として、上記ペプチドを化学的方法により合成することもできる。組換え宿主における異種蛋白の発現、ポリペプチドの化学合成およびインビトロ翻訳に関する方法は、当該分野でよく知られており、Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989)、第2版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、Bergerおよび Kimmel、Methods in Enzymology、152巻、Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)、アカデミック・プレス、インコーポレイテッド、サンディエゴ、カリフォルニア、Merrifield,J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91:501、Chaiken I.M.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.11:255、Kaiserら(1989)Science 243:187、Merrifield,B.(1986)Science232:342、Kent,S.B.H.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:957、および Offord,R.E.(1980)Semisynthetic Proteins、ウィリー・パブリッシング(これらは出典明示により本明細書の一部とする)にさらに詳述されている。
【0160】
典型的には、ペプチドを直接化学合成により製造することができ、例えば、PD−L2/PD−1相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして使用することができる。非ペプチド部分がN−末端および/またはC−末端への共有結合により結合している修飾ペプチドとして、ペプチドを製造することができる。ある好ましい具体例において、カルボキシ末端またはアミノ末端、またはその両方が化学的に修飾されている。末端アミノおよびカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化およびアミド化である。アミノ末端修飾、例えばアシル化(例、アセチル化)またはアルキル化(例、メチル化)およびカルボキシ末端修飾、例えばアミド化、ならびに他の末端修飾、例えば閉環は、本発明の様々な態様に組込まれ得る。ある種のアミノ末端および/またはカルボキシ末端修飾および/またはコア配列へのペプチド伸長により、有利な物理的、化学的、生化学的および薬理学的特性、例えば高い安定性、強い効力および/または有効性、血清プロテアーゼに対する耐性、望ましい薬物動態学的特性などが提供され得る。ペプチドを治療的に使用して、例えば患者における共刺激を改変することによって病気を治療することができる。
【0161】
単離されたPD−L2ポリペプチド、またはその一部もしくはフラグメント(またはかかるポリペプチドをコードする核酸分子)を免疫原として使用して、標準的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造技術を用いることによりPD−L2に結合する抗体を得ることができる。完全長PD−L2ポリペプチドを使用することもでき、あるいはまた、本発明は、免疫原として使用されるPD−L2の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。1の具体例において、PD−L2の抗原性ペプチドは、配列番号:2または5に示すアミノ酸配列の少なくとも8個のアミノ酸残基を含み、PD−L2のエピトープを含むことから、ペプチドに対して産生した抗体はPD−L2との特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも20個のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも30個のアミノ酸残基を含む。
抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、蛋白表面に位置するPD−L2の領域、例えば親水性領域、ならびに高抗原性を有する領域である。
【0162】
典型的には、PD−L2免疫原を用いて、適当な対象(例、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類)を免疫原で免疫することにより抗体が産生される。適当な免疫原性調合物は、例えば、組換え発現PD−L2ポリペプチドまたは化学合成PD−L2ペプチドを含み得る。さらにこの調合物は、アジュバント、例えばフロイント完全または不完全アジュバント、または同様の免疫刺激剤を含み得る。免疫原性PD−L2調合物で適当な対象を免疫化すると、ポリクローナル抗PD−L2抗体応答が誘導される。
【0163】
したがって、本発明のもう1つの態様は抗−PD−L2抗体に関する。本明細書の用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、PD−L2のごとき抗原と特異的に結合(免疫反応)する抗原結合部を含む分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分の例は、F(ab)およびF(ab’)2フラグメントであり、それらはペプシンのごとき酵素で抗体を処理することにより得ることができる。本発明は、PD−L2分子に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書の用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、PD−L2の特定のエピトープと免疫反応しうるたった1種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。よって、典型的には、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する特定のPD−L2ポリペプチドに対する単一の結合アフィニティーを示す。
【0164】
ポリクローナル抗PD−L2抗体を、適当な対象をPD−L2免疫原で免疫化することにより上記要領で製造することができる。免疫化対象における抗PD−L2抗体力価を、標準的技術、例えば固定化PD−L2ポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により時間経過とともにモニターすることができる。所望ならば、PD−L2ポリペプチドに対して指向した抗体分子を、哺乳類から(例えば、血液から)単離し、さらに公知技術、例えばプロテインAクロマトグラフィーにより精製すると、IgGフラクションが得られる。免疫後適当な時点で、例えば抗PD−L2抗体力価が最高であるときに、抗体産生細胞を対象から得ることができ、標準的技術、例えばKohlerおよびMilstein(1975)Nature 256:495−497により最初に報告されたハイブリドーマ技術(また、Brownら(1981)J.Immunol.127:539−46、Brownら(1980)J.Biol.Chem. 255:4980−83、Yehら(1976)Proc.Natl.Acad.Sci. 76:2927−31、および Yehら(1982)Int.J.Cancer 29:269−75も参照)、さらに最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら(1983)Immunol.Today 4:72)、EBV−ハイブリドーマ技術(Coleら(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、アラン R.リス、インコーポレイテッド、77−96頁)またはトリオーマ技術によるモノクローナル抗体の製造に使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマ製造技術は公知である(一般的には、Kenneth,R.H.、Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses、プレナム・パブリッシング・コーポレーション、ニューヨーク、ニューヨーク(1980)、Lerner,E.A.(1981)Yale J.Biol.Med.54:387−402、Gefter,M.L.ら(1977)Somatic Cell Genet.3:231−36参照)。簡単に述べると、不死細胞系(典型的にはミエローマ)を、上記要領でPD−L2免疫原で免疫した哺乳類由来のリンパ球(典型的には脾臓細胞)に融合させ、生成したハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、PD−L2に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【0165】
リンパ球および不死化細胞系の融合に用いられる多くの公知プロトコルのいずれかを、抗PD−L2モノクローナル抗体産生目的に適用することができる(例えば、Galfre,G.ら(1977)Nature 266:55052、Gefterら(1977)前出、Lerner(1981)前出、Kenneth(1980)前出参照)。さらに、当業者にとって、同様に有用である上記方法の多くの変法があることは明らかである。典型的には、不死細胞系(例、骨髄種細胞系)は、リンパ球と同じ種の哺乳類に由来する。例えば、ネズミハイブリドーマは、本発明の免疫原性調合物により免疫化したマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞系と融合させることにより製造され得る。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地(「HAT培地」)に感受性を示すマウスミエローマ細胞系である。若干の骨髄種細胞系を標準的技術による融合相手として使用することができ、例えばP3−NS1/1−Ag4−1、P3−x63−Ag8.653またはSp2/O−Ag14骨髄種系がある。これらの骨髄種系は、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手可能である。典型的には、HAT感受性マウス骨髄種細胞を、ポリエチレングリコール(「PEG」)を用いてマウス脾臓細胞に融合させる。次いで、融合から生成したハイブリドーマ細胞はHAT培地を用いて選択し、この場合、非融合および非生産的融合骨髄種細胞は死滅する(非融合脾臓細胞は、形質転換されていないため数日後に死滅する)。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISAアッセイを用いて、PD−L2分子と結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
PD−L2に結合する抗体のさらなる製造方法を実施例4および5において説明する。
【0166】
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ製造のための別法として、PD−L2を伴う組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例、抗体ファージディスプレーライブラリー)のスクリーニングによって、PD−L2ポリペプチドと結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより、モノクローナル抗−PD−L2抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレーライブラリーを作成し、スクリーニングするキットは市販されている(例えば、ファルマシア・レコンビナント・ファージ・アンチボディー・システム、カタログ番号27−9400−01、およびストラタジーンSurfZAP(商標)ファージ・ディスプレー・キット、カタログ番号240612)。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作成およびスクリーニングにおいて特に使用しやすい方法および試薬の例は、例えばLadnerら、米国特許第5223409号、Kangら、国際公開番号WO92/18619、Dowerら、国際公開番号WO91/17271、Winterら、国際公開WO92/20791、Marklandら、国際公開番号WO92/15679、Breitlingら、国際公開WO93/01288、McCaffertyら、国際公開番号WO92/01047、Garrardら、国際公開番号WO92/09690、Ladnerら、国際公開番号WO90/02809、Fuchsら(1991)Biotechnology(NY)9:1369−1372、Hayら(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81−85、Huseら(1989)Science246:1275−1281、Griffithsら(1993)EMBO J. 12:725−734、Hawkinsら(1992)J.Mol.Biol.226:889−896、Clarksonら(1990)Nature352:624−628、Gramら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576−3580、Garrardら(1991)Biotechnology(NY)9:1373−1377、Hoogenboomら(1991)Nucleic Acids Res.19:4133−4137、Barbasら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978−7982、および McCaffertyら(1990)Nature348:552−554において見出され得る。
【0167】
さらに、組換え抗PD−L2抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含み、標準的組換えDNA技術を用いて製造され得るものであり、本発明の範囲内に包含される。上記キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えばRobinsonら、国際特許公開PCT/US86/02269、Akiraら、欧州特許出願第184187号、Taniguchi,M.、欧州特許出願第171496号、Morrisonら、欧州特許出願第173494号、Neubergerら、PCT出願WO86/01533、Cabillyら、米国特許第4816567号、Cabillyら、欧州特許出願第125023号、Betterら(1988)Science 240:1041−1043、Liuら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439−3443、Liuら(1987)J.Immunol. 139:3521−3526、Sunら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci. 84:214−218、Nishimuraら(1987)Cancer Res.47:999−1005、Woodら(1985)Nature 314:446−449、およびShawら(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553−1559、Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202−1207、Oiら(1986)Biotechniques 4:214、Winter 米国特許5225539、Jonesら(1986)Nature 321:552−525、Verhoeyanら(1988)Science 239:1534、およびBeidlerら(1988)J.Immunol.141:4053−4060に記載された方法を用いることにより、当該分野で公知の組換えDNA技術により製造され得る。
【0168】
抗−PD−L2抗体(例、モノクローナル抗体)を用いて、標準的技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によりPD−L2ポリペプチドを単離することができる。抗−PD−L2抗体により、細胞からの天然PD−L2ポリペプチド、および宿主細胞において発現される遺伝的組換えにより製造されたPD−L2ポリペプチドの精製は容易になり得る。そのうえ、抗−PD−L2抗体を用いて、PD−L2ポリペプチドを検出(例えば、細胞溶解物または細胞上清において)することができる。抗−PD−L2抗体を臨床試験手順の一部として診断的に用いて、組織中のポリペプチドレベルをモニターすることができ、例えば、特定の治療の有効性を調べることができる。検出可能な物質に抗体をカップリング(すなわち、物理的結合)させることにより検出は容易になり得る。従って、1の具体例において、本発明の抗PD−L2抗体は、検出可能な物質により標識される。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス(発光)物質および放射性物質がある。適当な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼがあり、適当な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンがあり、適当な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンがあり、ルミネセンス物質の例にはルミノールがあり、そして適当な放射性物質の例には125I、131I、35Sおよび3Hがある。
【0169】
III.組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう1つの態様は、PD−L2ファミリーの蛋白(またはその一部分)をコードする核酸分子を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。ここで使用されている「ベクター」の語は、それに結合されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を包含する。ベクターの1のタイプは「プラスミド」であり、付加的DNAセグメントが連結され得る環状二本鎖DNAループを包含する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、その場合、付加的DNAセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製し得る(例えば、細菌性複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ組込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に結合されている遺伝子の発現を指令し得る。上記ベクターは、ここでは「発現ベクター」と称される。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが多い。本明細書の場合、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから、「プラスミド」および「ベクター」は混用され得る。しかしながら、本発明は、かかる他の形態の発現ベクターであって同様の機能を果たすもの、例えばウイルスベクター(例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を包含する。
【0170】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基いて選択された1つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味するもので、調節配列は、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結されている」は、興味の対象であるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の(例えば、インビトロ転写/翻訳系における、またはベクターが宿主細胞へ導入されたとき宿主細胞における)発現を可能にする状態で調節配列(複数も可)に連結されていることを意味する。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を包含する。上記調節配列は、例えば Goeddel(1990)Methods Enzymol.185:3−7に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するものおよびある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの(例、組織特異的調節配列)がある。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、目的蛋白の発現レベルなどの因子により異なり得ることを認識するはずである。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載されたように(例えば、PD−L2ファミリーの蛋白、変異形態のPD−L2蛋白、融合蛋白など)、核酸によりコードされる融合蛋白またはペプチドを包含する蛋白またはペプチドを得ることができる。
【0171】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞におけるPD−L2ポリペプチドの発現を目的として設計され得る。例えば、PD−L2ポリペプチドは、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ(E.coli)、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを用いる)、酵母細胞または哺乳類細胞において発現され得る。適当な宿主細胞については、前出のGoeddel(1990)でさらに検討されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳され得る。
【0172】
原核生物における蛋白の発現を、融合または非融合蛋白の発現を指令する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターによりエシェリシア・コリ(E.coli)において行なうことが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされた蛋白に若干のアミノ酸を、通常には組換え蛋白のアミノ末端に付加する。上記融合ベクターは、典型的には、1)組換え蛋白の発現を高める、2)組換え蛋白の溶解性を高める、および3)アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換え蛋白の精製で有用である、といった3つの目的に適うものである。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、蛋白分解性開裂部位が融合部分および組換え蛋白の接合点に導入されることにより、融合蛋白の精製後に組換え蛋白を融合部分から分離することが可能となる。上記酵素およびそれらの同族認識配列には、因子Xa、トロンビンおよびエンテロキナーゼがある。典型的融合発現ベクターには、pGEX(ファルマシア・バイオテク・インコーポレイテッド、Smith,D.B.および Johnson,K.S.(1988)Gene67:31−40)、pMAL(ニューイングランド・バイオラブズ、ベヴァリー、マサチューセッツ)およびpRIT5(ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)があり、それぞれグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合蛋白またはプロテインAを標的組換え蛋白に融合させる。
精製融合蛋白は、PD−L2活性アッセイ(例、下記で詳述されている直接アッセイまたは競争的アッセイ)に、あるいは例えばPD−L2ポリペプチドに特異的な抗体の生成に使用され得る。好ましい具体例において、本発明のレトロウイルス発現ベクター中で発現されたPD−L2融合蛋白を用いて骨髄細胞に感染させ、次いで、それを放射線照射されたレシピエント中に移植する。次いで、十分時間(例えば、6ヶ月)経過後、対象レシピエントの病状を調べる。
【0173】
適当な誘導性非融合エシェリシア・コリ(E.coli)発現ベクターの例には、pTrc(Amannら(1988)Gene69:301−315)およびpET11d(Studierら(1990)Methods Enzymol.185:60−89)がある。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp−lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存する。pET11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルス性RNAポリメラーゼ(T7gn1)が介在するT7gn10−lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、lacUV5プロモーターの転写制御下T7gn1遺伝子をもつ内在プロファージから宿主株BL21(DE3)またはHMS174(DE3)により供給される。
【0174】
エシェリシア・コリ(E.coli)における組換え蛋白発現を最大化させる1の戦略は、蛋白分解的に組換え蛋白を開裂する能力が損なわれた宿主細菌において蛋白を発現させることである(Gottesman,S.(1990)Methods Enzymol.185:119−128)。別の戦略は、発現ベクターへ挿入される核酸の核酸配列を改変することにより、各アミノ酸に関する個々のコドンが優先的にエシェリシア・コリ(E.coli)で利用されるものとなるようにする方法である(Wadaら(1992)Nucleic Acids Res.20:2111−2118)。本発明の核酸配列の上記改変は、標準的なDNA合成技術により実施され得る。
【0175】
もう1つの具体例において、PD−L2発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母S.cerevisiaeにおいて発現するベクターの例には、pYepSec1(Baldariら(1987)EMBO J.6:229−234)、pMFa(KurjanおよびHerskowitz(1982)Cell30:933−943)、pJRY88(Schultzら(1987)Gene54:113−123)、pYES2(インビトロゲン・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア)およびpicZ(インビトロゲン・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア)がある。
【0176】
別法として、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞においてPD−L2ポリペプチドを発現させることができる。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)における蛋白発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、pAcシリーズ(Smithら(1983)Mol.Cell Biol.3:2156−2165)およびpVLシリーズ(Lucklow,V.A.および Summers,M.D.(1989)Virology170:31−39)がある。
【0177】
さらに別の具体例において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例には、pMex−NeoI、pCDM8(Seed,B.(1987)Nature329:840)およびpMT2PC(Kaufmanら(1987)EMBO J.6:187−195)がある。哺乳類細胞で使用する場合には、発現ベクターの制御機能がウイルス調節エレメントにより提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40から誘導される。原核生物および真核生物の両細胞に関する他の適当な発現系については、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)の16および17章参照。
【0178】
もう1つの具体例において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を指令し得る(例、組織特異的調節エレメントは核酸の発現に使用される)。組織特異的調節エレメントは当業界では公知である。適当な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター(肝臓特異的、Pinkertら(1987)Genes Dev.1:268−277)、リンパ特異的プロモーター(Calameおよび Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235−275)、特にT細胞受容体プロモーター(Winotoおよび Baltimore(1989)EMBO J.8:729−733)および免疫グロブリン(Banerjiら(1983)Cell33:729−740、Queenおよび Baltimore(1983)Cell33:741−748)、ニューロン特異的プロモーター(例、ニューロフィラメントプロモーター、Byrneおよび Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473−5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlundら(1985)Science 230:912−916)、および乳腺特異的プロモーター(例、乳漿プロモーター、米国特許第4873316号およびヨーロッパ出願公開第264166号)がある。また、発達的調節(developmentally−regulated)プロモーター、例えばネズミホックス(hox)プロモーター(Kesselおよび Gruss(1990)Science249:374−379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campesおよび Tilghman(1989)Genes Dev.3:537−546)も包含される。
【0179】
さらに本発明は、アンチセンス方向で発現ベクター中にクローン化された本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、DNA分子は、PD−L2 mRNAに対してアンチセンスであるRNA分子の発現(DNA分子の転写による)を可能にする形で調節配列に作動可能に結合されている。アンチセンス方向でクローン化された核酸に作動可能に結合された調節配列であって、様々な細胞タイプにおけるアンチセンスRNA分子の連続発現を指令するもの、例えばウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサー、あるいはアンチセンスRNAの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を指令する調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で製造される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルス形態であってもよく、その活性はベクターが導入されている細胞タイプにより決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節を検討したものについては、Weintraub,H.ら(1986)“Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis”Reviews−Trends in Genetics、第1巻(1)を参照。
【0180】
本発明のもう1つの態様は、本発明のPD−L2核酸分子、例えば、組換え発現ベクター中のPD−L2核酸分子、あるいは宿主細胞のゲノムの特異部位中に相同組換えが起こるようにする配列を含むPD−L2核酸分子が導入されている宿主細胞に関するものである。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」の語は、本明細書で混用される。上記の語は特定対象細胞だけでなくかかる細胞の子孫または潜在的子孫も包含するものと理解すべきである。突然変異または環境的影響故にある種の修飾が後続の世代で行われ得るため、上記子孫は事実上親細胞と同一ではないかもしれないが、依然としてここで使用されている語の範囲内に包含される。
【0181】
宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。例えば、PD−L2ポリペプチドは、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ(E.coli)、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞(例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)またはCOS細胞)で発現され得る。他の適当な宿主細胞も当業者に公知である。
【0182】
ベクターDNAは、慣用的形質転換またはトランスフェクション技術により原核生物または真核生物細胞中に導入され得る。ここで使用されている「形質転換」および「トランスフェクション」の語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション(脂質小胞を介する遺伝子導入)または電気穿孔を含め、外来核酸(例、DNA)を宿主細胞へ導入するための様々な当業界公認の技術を包含する。宿主細胞の適当な形質転換またはトランスフェクション方法は、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1989)、および他の研究室マニュアルに見出され得る。
【0183】
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションを行うために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小フラクションのみが外来DNAをそれらのゲノム中に組み込まれうることが知られている。これらの成分を同定および選択するために、選択マーカー(例、抗生物質に対する耐性)をコードする遺伝子を、一般的に興味の対象である遺伝子と一緒に宿主細胞へ導入する。好ましい選択マーカーには、薬剤、例えばG418、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートに対する耐性を付与するものがある。選択マーカーをコードする核酸を、PD−L2ポリペプチドをコードするものと同じベクターで宿主細胞へ導入することができ、あるいは別々のベクターで導入することができる。導入された核酸により安定してトランスフェクションされた細胞を薬剤選別により同定することができる(例えば、選択マーカー遺伝子が組込まれた細胞は生残り、他の細胞は死滅する)。
【0184】
本発明の宿主細胞、例えば培養された原核生物または真核生物宿主細胞を、PD−L2ポリペプチドの製造(すなわち発現)に使用することができる。従って、本発明は、さらに本発明の宿主細胞を用いたPD−L2ポリペプチドの製造方法を提供する。1の具体例において、PD−L2ポリペプチドが製造されるように、本発明の宿主細胞(PD−L2ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された)を適当な培養培地で培養することを含む。別の具体例において、前記方法はさらに、培地または宿主細胞からのPD−L2ポリペプチドの単離を含む。
【0185】
ある種の宿主細胞を用いて、ヒト以外のトランスジェニック動物を製造することもできる。例えば、1の具体例において、宿主細胞は、PD−L2コーディング配列が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、上記宿主細胞を用いることにより、外来性PD−L2配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物あるいは内在性PD−L2配列が改変された相同的組換え動物が製造され得る。上記動物は、PD−L2ポリペプチドの機能および/または活性を研究ならびにPD−L2活性のモジュレーターを同定および/または評価するのに有用である。ここで使用されている「トランスジェニック動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはげっ歯動物、例えばラットまたはマウスであり、この場合動物の細胞の1個またはそれ以上が導入遺伝子(トランスジーン)を含んでいる。トランスジェニック動物の他の例には、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニワトリ、両生類などがある。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組込まれており、成熟動物のゲノムに残存している外性DNAであり、それによってトランスジェニック動物の1種またはそれ以上の細胞タイプまたは組織におけるコードされた遺伝子産物の発現が指令される。ここで使用されている「相同的組換え動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスであり、この場合内在性PD−L2遺伝子は、動物の発生前に、動物の1の細胞、例えば動物の胚性細胞へ導入された内在性遺伝子および外来性DNA分子間の相同的組換えにより改変されている。
【0186】
トランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により、PD−L2をコードする核酸分子を受精卵母細胞の雄性前核へ導入し、偽妊娠した雌フォスター(養育)動物において卵母細胞を発達させることによりトランスジェニック動物を製造することができる。配列番号1または4のPD−L2 cDNA配列を、非ヒト動物のゲノムへ導入遺伝子として導入することができる。別法として、ヒトPD−L2遺伝子の非ヒトホモログ、例えばマウスまたはラットPD−L2遺伝子を導入遺伝子として使用することができる。別法として、PD−L2遺伝子ホモログ、例えば別のPD−L2ファミリーのメンバーを、配列番号1、3、4または6のPD−L2 cDNA配列とのハイブリダイゼーションに基いて単離し(さらに上記サブセクションIで詳記されている)、導入遺伝子として使用することができる。また、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを導入遺伝子に含ませることにより、導入遺伝子の発現効率を高ることができる。組織特異的調節配列(複数も可)は、PD−L2導入遺伝子に作動可能に連結されることにより、特定細胞に対してPD−L2ポリペプチドの発現を指令し得る。胚マニピュレーションおよびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物、特に例えばマウスといった動物の製造方法は、当業界では既に慣用的なものになっており、例えば、両方ともLederらによる米国特許第4736866号および同4870009号、Wagnerらによる米国特許第4873191号および Hogan,B. Manipulating the Mouse Embryo(コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1986)で報告されている。他のトランスジェニック動物の製造には類似方法も使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおけるPD−L2導入遺伝子の存在および/または動物の組織または細胞におけるPD−L2 mRNAの発現に基いて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物を用いることにより、導入遺伝子を有する動物が追加的に産み出され得る。さらに、PD−L2ポリペプチドをコードする導入遺伝子をもつトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子をもつ他のトランスジェニック動物へとさらに繁殖され得る。
【0187】
相同組換え動物を作製するために、PD−L2遺伝子の少なくとも一部分を含むもので、そこに欠失、付加または置換が導入されていることによりPD−L2遺伝子が改変、例えば機能的に崩壊されているベクターを製造する。PD−L2遺伝子はヒト遺伝子(例えば、配列番号1または3)であり得るが、さらに好ましくはヒトPD−L2遺伝子の非ヒト相同体である(例えば、配列番号1、3、4または6のヌクレオチド配列とのストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離されたcDNA)。例えば、マウスPD−L2遺伝子(例えば、配列番号:3または配列番号:6のcDNA)を用いることにより、マウスゲノムにおいて内在性PD−L2遺伝子を改変するのに適した相同組換えベクターを構築することができる。好ましい具体例において、相同組換えが起こると内在性PD−L2遺伝子が機能崩壊されるようにベクターが設計される(すなわち、もはや機能性蛋白をコードしない、「ノックアウト」ベクターとも称される)。別法として、相同組換えが起こると内在性PD−L2遺伝子は突然変異誘発または他の形で改変されるが、依然として機能性蛋白をコードするようにベクターが設計され得る(例えば、上流調節領域を改変することにより、内在性PD−L2ポリペプチドの発現が改変され得る)。相同的組換えベクターでは、PD−L2遺伝子の改変部分の5’および3’両末端にPD−L2遺伝子の付加的核酸配列が隣接していることにより、ベクターが担持する内在性PD−L2遺伝子と胚性幹細胞中の内在性PD−L2遺伝子との間で相同組換えが行われ得る。付加的な隣接PD−L2核酸配列は、内在性遺伝子との有効な相同的組換えにとって充分な長さを有する。典型的には、数キロベースのフランキングDNA(5’および3’の両末端)がベクターに含まれている(例えば、相同的組換えベクターの記載については、Thomas,K.R.および Capecchi,M.R.(1987)Cell51:503参照)。ベクターは胚性幹細胞系中に(例えば、電気穿孔により)導入され、導入されたPD−L2遺伝子が内在性PD−L2遺伝子と相同的に組換えられている細胞が選択される(例えば、Li,E.ら(1982)Cell69:915参照)。次いで、選択された細胞は動物(例、マウス)の未分化胚芽細胞中に注入され、凝集キメラが形成される(例えば、Bradley,A.、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、Robertson,E.J.編(IRL、オクスフォード、1987)113−152頁参照)。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌養育(フォスター)動物へ移植し、胚を分娩させ得る。生殖細胞中に相同的組換えDNAをもつ子孫を用いることにより、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的組換えDNAを含む動物が産み出され得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Bradley,A.(1991)Curr.Opin.Biotechnol.2:823−829および Le MouellecらによるPCT国際公開第WO90/11354号、Smithiesらによる同第WO91/01140号、Zijlstraらによる同第WO92/0968号、および Bernsらによる同第WO93/04169号に詳述されている。
【0188】
もう1つの具体例において、導入遺伝子の発現調節を可能にすべく選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が製造され得る。かかる系の一例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である。cre/loxPリコンビナーゼ系の記述については、例えば Laksoら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6232−6236参照。リコンビナーゼ系の別の例は、Saccharomyces cerebvisiaeのFLPリコンビナーゼ系である(O’Gormanら(1991)Science251:1351−1355)。cre/loxPリコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Creリコンビナーゼおよび選択された蛋白の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が要求される。上記動物は、例えば、一方は選択された蛋白をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む2種のトランスジェニック動物を交配させることにより、「二重」トランスジェニック動物の構築により提供され得る。
【0189】
また、ここに記載されているヒト以外のトランスジェニック動物のクローンを、Wilmut,I.ら(1997)Nature385:810−813およびPCT国際公開第WO97/07668号および同第WO97/07669号記載の方法により製造することができる。簡単に述べると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、成長周期を脱してG0期へ入るように誘導することができる。次いで、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞を、静止細胞が単離されたのと同種の動物に由来する除核卵母細胞と融合させることができる。次いで、再構築された卵母細胞を培養して桑実胚または芽細胞にまで発達するようにし、次いで、偽妊娠した雌フォスター動物に移す。この雌フォスター動物から生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンとなる。
【0190】
IV.医薬組成物
本発明のPD−L2分子、例えば、PD−L2核酸分子、PD−L2ポリペプチドのフラグメントおよび抗−PD−L2抗体(本明細書において「活性化合物」または「モジュレーション作用剤」ともいう)を、投与に適した医薬組成物に含有させることができる。上記組成物は、典型的には核酸分子、蛋白または抗体および医薬的に許容される担体を含む。ここで使用されている「医薬的に許容される担体」の語は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などをすべて包含するものとする。医薬活性物質に関する上記媒質および薬剤の使用については当該分野では公知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物中におけるその使用が考えられる。補足的な活性化合物を組成物中に含有させることもできる。
【0191】
本発明医薬組成物は、意図されたその投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例、吸入)、経皮(局所)、経粘膜および直腸投与がある。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、次の成分:滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび等張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムによりpHを調節することができる。非経口製剤を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器またはマルチプルドーズバイアル(multiple dose vial)に封入することができる。
【0192】
注射可能用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液をその場で製造するための滅菌粉末が含まれ得る。静脈内投与の場合、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォーEL(商標)(BASF、パーシッパニー、ニュージャージー)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)がある。どの場合も、組成物は無菌状態でなくてはならず、容易に注射できる程度には流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)を含む溶媒または分散液媒質およびその適当な混合物であり得る。例えば、レシチンのごときコーティングの使用により、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成され得る。 必要ならば上記成分の1つまたは組み合わせとともに所望量の適当な溶媒に活性化合物(例えば、PD−L2核酸分子、PD−L2ポリペプチドのフラグメント、抗−PD−L2抗体、または抗−PD−L2抗体と抗−PD−1抗体との組み合わせ)を含ませて、次いで、濾過滅菌することにより、滅菌注射可能溶液を調製することができる。一般的には、塩基性分散媒質および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌賦形剤中に活性化合物を含ませることにより分散液を製造する。滅菌注射可能溶液製造用滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過しておいたその溶液から有効成分に加えて所望の追加的成分からなる粉末を得ることができる。
【0193】
一般的には、経口組成物は不活性希釈剤または可食性担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入、あるいは錠剤に圧縮成型することができる。経口治療投与を目的とする場合、活性化合物は賦形剤と混合され、錠剤、トローチまたはカプセル形態で使用され得る。口内洗浄剤として使用される流動担体を用いて経口組成物を製造することもでき、流動担体中の化合物は経口適用され、スイッシュ(swish)され、吐き出されるかまたは嚥下される。医薬的に適合し得る結合剤、および/またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記成分のいずれか、または似た性質の化合物:結合剤、例えば微晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン、賦形剤、例えば澱粉または乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス(Sterotes)、滑剤、例えばコロイド状二酸化珪素、甘味剤、例えばしょ糖またはサッカリン、または香味料、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料を含み得る。
【0194】
吸入投与の場合、化合物は、適当な推進剤、例えば気体、例えば二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態でデリバリーされる。
【0195】
全身投与を経粘膜または経皮手段で行なってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤を製剤中に使用する。上記浸透剤は一般的に当業界では公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を包含する。鼻用スプレーまたは坐薬の使用により経粘膜投与を行なうことができる。経皮投与の場合、当該分野で一般的に知られているように、活性化合物を軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームとして製剤化する。
化合物を直腸デリバリー用の坐薬(例、慣用的坐薬基剤、例えばカカオバターおよび他のグリセリド類による)または停留浣腸形態として調合することもできる。
【0196】
1の具体例において、活性化合物は、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調合され、例えばインプラントおよびマイクロカプセル封入デリバリー系を包含する除放性製剤がある。生物分解性、生物適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。上記製剤の製造方法は、当業者に明らかであろう。これらの材料を、アルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッドから購入することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含む)を医薬的に許容され得る担体として使用することもできる。例えば米国特許第4522811号に記載されたような当業者に公知の方法に従ってこれらを調合することができる。
投与し易く用量を均一にするために単位用量形態で経口または非経口組成物を製剤するのは特に有利である。本明細書で使用されている単位用量形態とは、処置される対象にとって単位用量として適する物理的に独立した単位を包含しており、各単位は必要とされる医薬用担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性化合物を含むものをいう。本発明の単位用量形態に関する詳細は、活性化合物特有の特徴および達成すべき特定治療効果、および個体の処置を目的としたかかる活性化合物調合の当該分野における制限に直接的に左右される。
【0197】
上記化合物の毒性および治療効率を細胞培養物または実験動物における標準製薬方法により測定して、例えば、LD50(集団の50%に対する致死用量)およびED50(集団の50%における治療有効量)を決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物を使用してもよい場合、かかる化合物を罹病組織の部位に標的化させるデリバリーシステムを設計して、未感染細胞に対する潜在的ダメージを最小化し、そのことにより副作用を減らすように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトで使用するための範囲の用量を製剤化するために用いることができる。好ましくは、かかる化合物の用量は、毒性を全くまたはほとんど伴わないED50値を包含する循環濃度の範囲内である。使用される用量形態および使用される投与経路に応じて用量をこの範囲内で変化させてもよい。本発明方法で使用される化合物の場合、先ず、細胞培養アッセイから治療有効量を評価することができる。用量を動物モデルで製剤化することにより、細胞培養で測定されたIC50(すなわち、徴候の半−最大阻害を達成する試験化合物の濃度)をを包含する循環血漿濃度範囲が得られる。上記情報を使用することにより、ヒトにおける有用な用量をより正確に測定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【0198】
本明細書で定義するように、蛋白またはポリペプチドの治療上有効量(すなわち、有効用量)は、体重1kgあたり約0.001ないし30mg、好ましくは体重1kgあたり約0.01ないし25mg、より好ましくは体重1kgあたり約0.1ないし20mg、さらにより好ましくは体重1kgあたり約1ないし10mg、2ないし9mg、3ないし8mg、4ないし7mg、5ないし6mgの範囲である。疾病または疾患の重さ、以前受けていた治療、対象の一般的健康状態および/または年齢、ならびに存在する他の疾病(これらに限らない)を包含する特定の因子が、対象を有効に治療するために必要な容量に影響する可能性があることを、当業者は理解するであろう。そのうえ、治療上有効量の蛋白、ポリペプチド、あるいは抗体での対象の治療は、単一回の治療を包含しうるが、好ましくは一連の治療を包含しうる。
【0199】
好ましい例において、体重1kgあたり約0.1ないし20mgの範囲の抗体、蛋白またはポリペプチドで、1週間に1回、約1ないし10週間にわたり、好ましくは2ないし8週間にわたり、より好ましくは約3ないし7週間、さらにより好ましくは約4、5または6週間にわたり対象を治療する。治療に使用される抗体、蛋白またはポリペプチドの有効量を個々の治療コースに応じて増加または減少させてもよいことも理解されよう。用量の変更は、本明細書記載の診断アッセイの結果によるものであり、該アッセイから明白なものとなる。
【0200】
本発明は、PD−L2の発現または活性をモジュレーションする作用剤を包含する。例えば、作用剤は小型分子であってもよい。例えば、かかる小型分子は、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、1モルあたり約10000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を包含)、1モルあたり約5000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約1000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびに塩、エステル、ならびに医薬上許容される形態のかかる化合物等であるが、これらに限らない。小型分子の適当な用量は当業者、獣医、または研究者の知識の範囲内の多くの因子に依存することが理解される。小型分子の用量は、例えば、治療すべき対象またはサンプルの同一性、サイズ、および状態に依存するであろうし、さらに、適用可能な場合には組成物が投与される経路、本発明の核酸またはポリペプチドにより得られる医師が望む小型分子の効果にも依存するであろう。
【0201】
典型的な用量は、対象またはサンプルの体重1kgあたりミリグラムまたはマイクログラム量の小型分子(例えば、1kgあたり約1マイクログラムないし約500ミリグラム、1kgあたり約100マイクログラムないし約5ミリグラム、1kgあたり約1マイクログラムないし約50マイクログラム)である。小型分子の用量は、モジュレーションすべき発現または活性に関する小型分子の有効性に依存することがさらに理解される。本明細書記載のアッセイを用いてかかる適当な用量を決定してもよい。1またはそれ以上のこれらの小型分子を動物(例えば、ヒト)に投与して本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性をモジュレーションしようとする場合、医師、獣医、または研究者は、先ず比較的低用量を処方し、次いで、適当な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。さらに、個々の動物対象に関する個々のレベルは、使用される個々の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事療法、投与期間、投与経路、排泄速度、併用薬剤、ならびにモジュレーションすべき発現または活性の程度を包含する種々の因子に依存するであろうことが理解される。
【0202】
さらに、抗体(またはそのフラグメント)を、サイトトキシン、治療剤または放射性金属イオンのごとき治療部分に抱合させてもよい。サイトトキシンまたは細胞毒性作用剤は細胞に損傷を与える薬剤を包含する。例は、トクソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポサイド、テノポサイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイsンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プイロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロールおよびプロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログを包含する。治療剤は、アンチメタボライト(例えば、メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオペアクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU) および ロムスチン(CCNU)、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、および白金(II)cis−ジクロロジアミン(DDP)シスプラチン)、アンスラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシンと呼ばれた)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシンと呼ばれた)、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアンスラマイシン(AMC))、ならびに抗−分裂剤(例えば、ブンクリスチンおよびビンブラスチン)を包含するが、これらに限らない。
【0203】
本発明の抱合体を用いてある種の生物学的応答を修飾することができ、その薬剤部分は古典的な化学療法剤に限らない。例えば、薬剤部分は消耗生物学的活性を有する蛋白またはポリペプチドであってもよい。かかるポリペプチドは、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素またはジフテリアトキシンのごときトキシン;腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベーターのごとき蛋白;あるいは例えばリンホカイン、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−6(IL−6)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)または他の成長因子のごとき生物学的応答修飾剤を包含する。
【0204】
かかる治療部分を抗体に抱合させる方法はよく知られており、例えば、Arnon et al., ”Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243−56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., ”Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623−53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, ”Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475−506 (1985); ”Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303−16 (Academic Press 1985); および Thorpe et al. ”The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody−Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62:119−58 (1982)参照。別法として、米国特許第4676980号においてSegalにより記載されたように、抗体を第2の抗体に抱合させて抗体ヘテロ抱合体を得てもよい。
【0205】
本発明核酸分子をベクター中に挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。例えば静脈内注射、局所投与(米国特許5328470参照)または定位注射(例えば Chenら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054−3057参照)により遺伝子治療ベクターを対象にデリバリーすることができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される希釈液中に遺伝子治療ベクターを含んでいてもよく、あるいは遺伝子デリバリービークルが埋封された遅速放出マトリックスを含んでいてもよい。別法として、完全な遺伝子デリバリーベクターを組換え細胞から無傷で製造できる場合(例えば、レトロウイルスベクター)、医薬製剤は遺伝子デリバリー系を生産する1個またはそれ以上の細胞を含んでいてもよい。
医薬組成物を投与に関する使用説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサー中に入れることができる。
【0206】
V.本発明の用途および方法
PD−L2分子、例えば、本明細書記載のPD−L2核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチドホモログ、および抗体を下記方法の1つまたはそれ以上に使用することができる:a)スクリーニングアッセイ;b)予測医学(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験のモニタリング);ならびにc)治療方法(例えば、免疫応答をアップまたはダウンレギュレーションすることによる治療方法および予防方法)。本明細書に記載のように、本発明のPD−L2ポリペプチドは下記活性の1つまたはそれ以上を有する:1)本来の結合パートナー、例えばPD−1に結合し、そして/あるいはその活性をモジュレーションする、2)細胞内または細胞間シグナリングをモジュレーションする、3)Tリンパ球の活性化をモジュレーションする、4)生物、例えば、マウスまたはヒトのごとき哺乳動物の免疫応答をモジュレーションする。
【0207】
本発明の単離核酸分子を用いて、例えば、本明細書においてさらに後で説明するように、PD−L2ポリペプチドを発現させ(例えば、遺伝子治療用途において宿主細胞中の組換え発現ベクターにより)、PD−L2 mRNA(例えば、生物学的試料中の)またはPD−L2遺伝子における遺伝学的変化を検出し、PD−L2活性をモジュレーションすることができる。PD−L2ポリペプチドを用いて、PD−L2ポリペプチドの不十分または過剰な発現あるいはPD−L2阻害剤の産生により特徴付けられる症状または疾病を治療することができる。さらに、PD−L2ポリペプチドを用いて、天然に存在するPD−L2結合パートナー(PD−1のほかに)をスクリーニングし、PD−L2活性をモジュレーションする薬剤または化合物をスクリーニングし、PD−L2ポリペプチドの不十分または過剰な産生あるいはPD−L2野生型ポリペプチドと比較して低下した、異常なまたは望ましくない活性を有するPD−L2ポリペプチド形態の産生により特徴づけられる症状または疾病(例えば、重篤な合併免疫不全、多発性硬化症、全身性狼瘡、I型糖尿病、リンパ球増殖症候群、炎症性腸疾患、アレルギー、喘息、移植片対宿主疾患および移植拒絶反応のごとき免疫系疾患;細菌およびウイルスのごとき感染性病原体に対する免疫応答;ならびにリンパ腫および白血病のごとき免疫系の癌)を治療することができる。そのうえ、本発明の抗−PD−L2抗体を用いてPD−L2ポリペプチドを検出および単離し、PD−L2ポリペプチドの生体利用性を調節し、例えばPD−L2とその本来の結合パートナー(例えば、PD−1)との間の相互作用をモジュレーションすることによりPD−L2活性をモジュレーションすることができる。
【0208】
A.スクリーニングアッセイ
本発明は、PD−L2ポリペプチドに結合し、例えば、PD−L2発現またはPD−L2活性に刺激または阻害効果を有し、あるいはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との間の相互作用に刺激または阻害効果を有するモジュレーター、すなわち候補化合物または試験化合物または作用剤(例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小型分子または他の薬剤)を同定するための方法(本明細書で「スクリーニングアッセイ」という)を提供する。
1の具体例において、本発明により、PD−L2ポリペプチドもしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分に結合する、例えば、その本来の結合パートナーと相互作用するPD−L2ポリペプチドの能力をモジュレーションする候補もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。もう1つの具体例において、本発明は、PD−L2蛋白またはポリペプチドまたは生物学的に活性のある部分(例えば、コファクターまたはコレンザイムアナログ、あるいは阻害性分子)に結合し、あるいはその活性をモジュレーションする候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【0209】
好ましい具体例において、本発明は、PD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用に対して刺激または阻害効果を有する候補化合物または試験化合物のアッセイ方法を提供する。典型的な具体例において、結合パートナーはPD−1である。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー;空間的にアドレス可能な平行(spatially addressable parallel)固相または液相ライブラリー;デコンボリューションを要する合成ライブラリー法;「1−ビーズ1−化合物」ライブラリー法;およびアフィニティクロマトグラフィー選抜を用いる合成ライブラリー法を含む、当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くの方法のいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリー法はペプチドのライブラリーに限定されるが、他の4つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小型分子ライブラリーに適用することができる(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【0210】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該分野において、例えばDeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233において見出すことができる。
【0211】
化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412−421)またはビーズ(Lam (1991) Nature 354:82−84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555−556)、細菌(Ladner USP 5,223,409)、胞子(Ladner USP ’409)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865−1869)またはファージ上に(Scott and Smith (1990) Science 249:386−390)提供され得る(Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378−6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301−310); (Ladner 既出)。
【0212】
1の具体例において、アッセイは、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分を発現している細胞を試験化合物と接触させること、および試験化合物がPD−L2活性をモジュレーションする能力を測定する、細胞に基づくアッセイである。例えば、試験化合物がPD−L2活性をモジュレーションする能力の決定は、例えば、PD−L2がその本来の結合パートナー、例えばPD−1に結合し、免疫細胞活性をモジュレーションする能力をモニターすることにより行うことができる。免疫細胞は、例えば、T細胞、B細胞またはミエロイド細胞であってよい。PD−L2のPD−1への結合をモジュレーションする試験化合物の能力の決定は、例えば、PD−1をラジオアイソトープまたは酵素標識とカップリングさせることにより行なうことができ、複合体中に標識PD−1を検出することによりPD−1のPD−L2への結合を検出することができる。別法として、PD−L2をラジオアイソトープまたは酵素標識とカップリングさせて、複合体中のPD−1へのPD−L2結合をモジュレーションする試験化合物の能力をモニターすることもできる。PD−L2に結合する試験化合物の能力の決定は、例えば、化合物をラジオアイソトープまたは酵素標識とケップリングさせることにより行なうことができ、複合体中の標識PD−L2化合物を検出することにより化合物のPD−L2への結合を検出することができる。例えば、化合物(例えば、PD−1)を125I、35S、14Cまたは3Hで、直接的または間接的に標識することができ、放射能を直接カウントすることにより、あるいはシンチレーション計測により検出することができる。別法として、化合物を、例えばセイヨウワサビペルキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで標識し、適当な基質の生成物への変換を調べることにより酵素標識を検出することができる。
【0213】
相互作用物質を標識せずに化合物(例えば、PD−1)がPD−L2と相互作用する能力を調べることも本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、PD−L2も標的分子も標識せずに、化合物とPD−L2との相互作用を検出することができる。McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257: 1906−1912。本明細書中に用いる「マイクロフィジオメーター」(例えば、サイトセンサー)は、細胞がその周囲を酸性化する速度を、光−アドレス可能電位差センサー(light−addressable potentiometric sensor)(LAPS)を用いて測定する分析装置である。この酸性化速度の変化を、化合物とPD−L2との間の相互作用の指標として用いることができる。
【0214】
もう1つの具体例において、アッセイは、PD−L2結合パートナーを発現している細胞を試験化合物と接触させ、次いで、試験化合物がPD−L2結合パートナーの活性をモジュレーションする(例えば、刺激または阻害する)能力を調べることを特徴とする細胞に基づくアッセイである。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。試験化合物がPD−L2結合パートナーの活性をモジュレーションする能力の決定は、例えば、PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーに結合し、あるいは相互作用する能力を決定することにより行なうことができる。
【0215】
PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のあるフラグメントがPD−L2結合パートナー、例えばPD−1に結合し、あるいは相互作用する能力の決定は、直接結合を調べるための上記方法の1つにより行なうことができる。好ましい具体例において、PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーに結合あるいは相互作用する能力の決定は、結合パートナーの活性を調べることにより行なうことができる。例えば、細胞の第2のメッセンジャー(例えば、チロシンキナーゼまたはホスファターゼ活性)の誘導を検出することにより、適当な基質の触媒/酵素活性を検出することにより、リポーター遺伝子(検出可能マーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された標的応答性調節エレメントを含む)の誘導を検出することにより、あるいは標的により調節される細胞の応答を検出することにより、結合パートナーの活性を調べることができる。例えば、PD−L2ポリペプチドが本来のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1に結合あるいは相互作用する能力の決定を、増殖アッセイにおおいて免疫細胞同時刺激または阻害をモジュレーションする化合物の能力を測定することにより、あるいはPD−L2ポリペプチドの一部分を認識する抗体へのPD−L2ポリペプチドの結合能を妨害することにより、行なうことができる。1の具体例において、T細胞活性化をモジュレーションする化合物を、T細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする化合物の能力を調べることにより同定することができる。好ましい具体例において、T細胞活性化をモジュレーションする化合物を、1またはそれ以上の抗原濃度においてT細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする化合物の能力を調べることにより同定することができる。
【0216】
さらにもう1つの具体例において、本発明のアッセイは、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分を試験化合物と接触させ、次いで、試験化合物がPD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合する能力を決定する無細胞アッセイである。本発明のアッセイに用られるPD−L2ポリペプチドの好ましい生物学的に活性のある部分は、非PD−L2分子との相互作用に関与するフラグメント、例えば、PD−L2結合パートナーに結合する細胞外ドメインの少なくとも一部分を包含する。試験化合物のPD−L2ポリペプチドへの結合は、前記のように直接または間接的に決定することができる。好ましい具体例では、アッセイは、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、PD−L2ポリペプチドと結合してアッセイ混合物を形成する既知化合物と接触させること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、次いで、試験化合物がPD−L2ポリペプチドと相互作用する能力を決定することを特徴とするが、該アッセイにおいては、試験化合物がPD−L2ポリペプチドと相互作用する能力を決定することは、既知化合物と比較して試験化合物がPD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に選択的に結合する能力を決定することを特徴とする。
【0217】
もう1つの具体例では、アッセイは、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、次いで、試験化合物がPD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性をモジュレーション(例えば、刺激または阻害)する能力を決定する無細胞アッセイである。試験化合物がPD−L2ポリペプチドの活性をモジュレーションする能力の決定は、例えば、PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーに結合する能力を、前記の直接的に結合を決定するための方法の一つにより測定することにより行なうことができる。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーに結合する能力の決定は、リアルタイム・バイオモレキュラー・インターラクション分析(BIA)などの方法を用いて行なうこともできる。Anal. Chem. 63:2338−2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699−705。本明細書中に用いる「BIA」は、生物特異的な相互作用をリアルタイムで、相互作用物質(例えばBIAコア)を標識することなく研究するための方法である。表面プラズモン共鳴(SPR)の視覚現象を、生物分子間のリアルタイムの反応の指標として用いることができる。
【0218】
別の具体例では、試験化合物がPD−L2ポリペプチドの活性を調節する能力の測定は、PD−L2ポリペプチドがPD−L2結合パートナーの下流エフェクター(例えば、PD−1の下流エフェクター)の活性をさらに調節する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適当な標的に対するエフェクター分子の活性、または適当な標的へのエフェクターの結合を、前記のように決定することができる。
【0219】
本発明の無細胞アッセイには、可溶性形態および/または膜結合形態の両方の蛋白(例えば、PD−L2ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分、またはPD−L2が結合する結合パートナー、例えばPD−1)を用いることもできる。膜結合形態のポリペプチド(例えば、細胞表面PD−L2)を用いる無細胞アッセイの場合、膜結合形態の蛋白が溶液中で維持されるように可溶化剤を用いることが望ましい。そのような可溶化剤の例には、n−オクチルグルコシド、n−ドデシルマルトシド、オクタノイル−N−メチルグルカミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、トライトン(登録商標)X−100、トライトン(登録商標)X−114、テシト(登録商標)、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)n、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ]−1−プロパンスルホネート(CHAPS)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート(DHAPSO)または、N−ドデシル=N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネートなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【0220】
本発明の前記アッセイ法の1よりも多い具体例において、1または両方の蛋白の、複合体を形成していない形態からのその複合体形態の分離を促進するため、ならびにアッセイの自動化を図るために、PD−L2またはその結合パートナーいずれかを固定化することが望ましい。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。試験化合物のPD−L2ポリペプチドに対する結合、または候補化合物の存在下および不在下でのPD−L2ポリペプチドと標的分子との相互作用は、反応物を入れるのに適したいずれかの容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が含まれる。1の具体例において、1または両方の蛋白がマトリックスに結合するのを可能とするドメインを付加する融合蛋白を提供することができる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/PD−L2融合蛋白またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ/標的融合蛋白をグルタチオンセファローゼビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ、次いでこれを試験化合物、または試験化合物および非吸着標的蛋白もしくはPD−L2ポリペプチドのいずれかと結合させ、次いで、混合物を複合体形成に資する条件下(例えば、塩およびpHの生理的条件)でインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、全ての結合していない成分を除き、ビーズの場合、マトリックスを固定化し、複合体形成を、例えば前記のように直接的または間接的に調べる。別法として、複合体をマトリックスから分離し、PD−L2結合または活性のレベルを標準的な方法を用いて決定することができる。
【0221】
蛋白をマトリックス上に固定するための他の方法を、本発明のスクリーニングアッセイに用いることもできる。例えば、PD−L2ポリペプチドまたはPD−L2結合パートナーのいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化PD−L2ポリペプチドまたは標的分子は、当該分野で周知の方法(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を用いてビオチン−NHS(N−ヒドロキシ−スクシンイミド)から調製することができ、ストレプトアビジンでコートされた96ウェルのプレート(Pierce Chemical)に固定することができる。別法として、PD−L2ポリペプチドまたは結合パートナーと反応するが、PD−L2ポリペプチドのその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化して、未結合結合パートナーまたはPD−L2ポリペプチドをウェル中で抗体結合によりトラップすることができる。GST−固定化複合体に関する前記方法に加え、そのような複合体を検出するための方法には、PD−L2ポリペプチドまたは結合パートナーと反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにPD−L2ポリペプチドまたは結合パートナーに関連する酵素活性を検出することに依存する酵素−結合アッセイが含まれる。
【0222】
別の具体例において、試験化合物がPD−L2ポリペプチドの活性をモジュレーションする能力の決定は、PD−L2の下流で機能する分子の活性をモジュレーションする試験化合物の能力を調べることにより、例えば、PD−L2結合パートナー、例えばPD−1の細胞質ドメインと相互作用させることにより、行なうことができる。例えば、第2のメッセンジャーのレベル、適当な標的に対する相互作用分子の活性、あるいは適当な標的に対する相互作用物質の結合を、上記のごとく調べることができる。
【0223】
他の具体例では、細胞を候補化合物と接触させ、そしてPD−L2 mRNAまたは蛋白の細胞中での発現を決定する方法にて、PD−L2の発現のモジュレーターを同定する。候補化合物の存在下でのPD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現のレベルを、候補化合物の不在下でのPD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現のレベルと比較する。次いで、この比較に基づき、候補化合物をPD−L2の発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、PD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現が、候補化合物の存在下において、その不在下におけるよりも大きい(例えば、統計学的に有意に大きい)場合、候補化合物は、PD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現の刺激物質と同定される。あるいは、PD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現が、候補化合物の存在下において、その不在下におけるよりも少ない(例えば、統計学的に有意に少ない)場合、候補化合物はPD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現の阻害物質と同定される。細胞中でのPD−L2 mRNAまたはポリペプチドの発現のレベルは、本明細書中に開示するPD−L2 mRNAまたはポリペプチドを検出するための方法により決定することができる。
【0224】
本発明のさらに別の態様において、PD−L2ポリペプチドを、2−ハイブリッドアッセイまたは3−ハイブリッドアッセイにおいて「エサ(bait)蛋白」として用いて(U.S. 特許No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223−232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046−12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920−924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693−1696; and Brent WO94/10300を参照されたい)、PD−L2と結合あるいは相互作用する他のポリペプチド(「PD−L2結合蛋白」、「PD−L2結合パートナー」または「PD−L2bp」)、ならびにPD−L2活性に関与する他のポリペプチドを同定することができる。そのような結合蛋白の例はPD−1である。かかるPD−L2結合蛋白は、例えば、PD−L2により媒介される情報伝達経路のダウンストリームエレメントとして、PD−L2ポリペプチドまたはPD−L2標的によるシグナルの伝達に関与している可能性もある。あるいは、かかるPD−L2結合ポリペプチドはPD−L2阻害物質である可能性がある。
【0225】
2−ハイブリッドシステムは、分離可能なDNA結合および活性化ドメインからなる、大部分の転写因子の基本単位性に基づく。簡単には、アッセイは2つの異なるDNA構築物を利用する。一構築物において、PD−L2ポリペプチドをコードする遺伝子を公知の転写因子(例えば、GAL−4)のDNA結合ドメインをコードしている遺伝子に結合させる。他の構築物において、DNA配列のライブラリー由来の、同定されていないポリペプチド(「プレイ(prey)」または「サンプル」)をコードするDNA配列を、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に結合させる。「バイト(bait)」と「プレイ」ポリペプチドがインビボで相互作用してPD−L2−依存性複合体を形成することができる場合、転写因子のDNA結合ドメインと活性化ドメインが接近する。この接近により、転写因子に反応する転写調節部位に作動可能な状態で連結されているレポーター遺伝子(例えば、LacZ)の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現は検出することができ、機能的転写因子を含んでいる細胞コロニーを単離し、そしてそれを用いてPD−L2ポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
【0226】
もう1つの態様において、本発明は、本明細書記載の2またはそれ以上のアッセイの組み合わせに関する。例えば、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイを用いてモジュレーション物質を同定することができ、PD−L2ポリペプチドの活性をモジュレーションするその物質の能力をインビボにおいて、例えば、細胞変形または腫瘍発生に関する動物モデルのごとき動物において確認することができる。
【0227】
本発明は、前記スクリーニングアッセイにより同定される新規な作用剤に関する。従って、本明細書中に開示するように同定された薬剤を適当な動物モデルでさらに用いることは、本発明の範囲内のことである。例えば、本明細書中に開示するように同定される作用剤(例えば、PD−L2モジュレーション剤、アンチセンスPD−L2核酸分子、PD−L2特異的抗体、またはPD−L2結合パートナー)を動物モデルに用いて、そのような作用剤を用いた治療の効力、毒性または副作用を決定することができる。別に、本明細書中に記載するように、同定された作用剤を動物モデルに用いて、そのような作用剤の活性のメカニズムを決定することができる。さらに、本発明は、前記スクリーニングアッセイにより同定される新規作用剤の、本明細書に記載する治療のための使用に関する。
【0228】
B.検出アッセイ
本明細書中で同定されるcDNA配列(および対応完全遺伝子配列)の部分またはフラグメントを、多くの方法でポリヌクレオチド試薬として用いることができる。例えば、これらの配列を用いて、(i)染色体上にそのそれぞれの遺伝子をマッピングし、かくして遺伝的疾患に関連する遺伝子領域の位置を確認し;(ii)微量な生物試料から個体を同定する(組織タイピング);ならびに(iii)生物試料の法医学的同定に役立てることができる。これらの適用を、以下のサブセクションに記載する。
【0229】
1.染色体マッピング
遺伝子の配列(または配列の一部分)が単離されたならば、この配列を用いて染色体上の遺伝子位置をマッピングすることができる。このプロセスは染色体マッピングと呼ばれる。したがって、本明細書記載のPD−L2ヌクレオチド配列の部分またはフラグメントを用いて染色体上のPD−L2遺伝子位置をマッピングすることができる。PD−L2配列の染色体へのマッピングは、これらの配列と疾病関連遺伝子とを関連づける重要な最初の工程である。
【0230】
簡単に説明すると、PD−L2ヌクレオチド配列からPCRプライマー(好ましくは長さ15〜25bp)を調製することによりPD−L2遺伝子を染色体にマッピングすることができる。PD−L2配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムDNA中の1個よりも多いエキソンを含まないプライマーを予想することができ、かくして、増幅プロセスを複雑化することができる。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに用いることができる。PD−L2配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じるであろう。
【0231】
異なる哺乳動物(ヒトおよびマウス細胞)由来の体細胞を融合させることにより体細胞ハイブリッドを調製する。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するにつれ、それらは徐々にランダムなオーダーでヒト染色体を失うが、マウス染色体を保持する。マウス細胞が増殖できない培地を用いることにより、所望酵素をコードする遺伝子を含む1のヒト染色体が保持されるであろう。なぜならマウス細胞は特定の酵素を欠いているが、ヒト細胞は有している可能性があるからである。種々の培地を用いることにより、ハイブリッド細胞系のパネルを確立することができる。パネル中の各細胞系は単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、ならびにマウス染色体の全セットを含み、個々の遺伝子を特定のヒト染色体に簡単にマッピングすることができる(D’Eustachio, P. et al. (1983) Science 220: 919−924)。トランスロケーションおよび欠失を有するヒト染色体を用いることにより、ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドを得ることもできる。
【0232】
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、個々の染色体に個々の配列を割り当てるための迅速な方法である。単一のサーマルサイクルを用いて1日に3つまたはそれ以上の配列を割り当てることができる。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにPD−L2ヌクレオチド配列を使用して、特定の染色体に由来するフラグメントのパネルを用いて、サブローカライゼーションを遂行することができる。PD−L2配列をその染色体にマッピングするために同様に使用される他のマッピング方法は、in situハイブリダイゼーション(Fan, Y. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6223−27)、標識フロー−ソーテッド(flow−sorted)染色体を用いるスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ−セレクションを包含する。
【0233】
中期染色体スプレッドへのDNA配列の蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)をさらに用いて、1工程で正確な染色体位置を得ることができる。紡錘糸を破壊するコルセミドのごとき化学薬剤により中期で分裂を停止された細胞を用いることにより、染色体スプレッドを作成することができる。染色体を短時間トリプシン処理し、次いで、ギムザ染色することができる。明暗バンドのパターンが各染色体上に出現し、その結果、染色体を個々に同定することができる。500または600塩基程度の短いDNA配列にFISH法を使用するとこができる。しかしながら、1000塩基よりも大きいクローンは、十分なシグナル強度でもってユニークな染色体位置に結合する可能性が高く、検出が容易である。好ましくは、1000塩基以上、より好ましくは2000塩基以上であれば、合理的な時間内に良好な結果を得るに十分であろう。この方法のレビューには、Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, Nwe York 1988)参照。
【0234】
染色体マッピング用試薬を個々に用いて、単一の染色体または染色体上の単一部位をマークすることができ、あるいは試薬のパネルを複数部位および/または複数染色体のマーキングに用いることができる。実際には、遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬がマッピング目的に好ましい。コーディング配列は遺伝子ファミリー内で保存されている可能性がさらに高く、よって、染色体マッピングの間にクロスハイブリダイゼーションのチャンスが高い。
【0235】
染色体上の配列の物理的な位置を、遺伝子マップデータと関連付けることができる。(そのようなデータは、例えば、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryよりオンラインで入手できるV. McKusick, Mendelian Inheritance in Manに見出される。)同じ染色体領域にマップされた場合、遺伝子と疾患の間の関連性を、次いで、例えばEgeland, J. et al. (1987) Nature, 325: 783−787に開示されている連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝)により同定することができる。
【0236】
そのうえ、PD−L2遺伝子に関連する疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のDNA配列の相違を調べることができる。罹患している個体のいくつかまたはすべてに変異が認められるが、罹患していない個体には変異が全く認められない場合、変異が特定疾患の原因であることが考えられる。一般的には、罹患している個体と罹患していない個体の比較には、染色体スプレッドから見ることのできる、あるいはDNA配列に基づくPCRを用いて検出可能な欠失またはトランスロケーションのごとき染色体中の構造変化を先ず探すことを用いる。最終的には、いくつかの個体からの遺伝子の完全な配列決定を行なって、変異の存在を確認し、変異と多型とを区別することができる。
【0237】
2.組織タイピング
本発明のPD−L2配列を用いて、微量生物試料から個体を同定することもできる。例えば、合衆国軍は、その人員の同定のために制限酵素フラグメント長遺伝子多型(RFLP)を用いることを考えている。この方法では、個人のゲノムDNAを1またはそれ以上の制限酵素で消化し、サザンブロットにおけるプローブとし、同定のためのユニークなバンドを得る。この方法は、ポジティブな同定を困難にしている、失われる、切断される、または盗用される可能性のある「ドッグ・タグ(Dog Tags)」の現在の制限に影響されない。本発明の配列は、RFLPのための追加的DNAマーカ(米国特許第5,272,057号に記載されている)ーとして有用である。
【0238】
さらにそのうえ、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩基−対−塩基DNA配列を決定するための別法を提供することができる。つまり、本明細書中に開示するPD−L2ヌクレオチド配列を用いて、配列の5’および3’末端から2つのPCRプライマーを調製することができる。次いで、これらのプライマーを用いて個体のDNAを増幅し、その後、それを配列決定することができる。
この方法で調製された、個体からの対応するDNA配列のパネルより、各個体は対立遺伝子の違いによりそのようなDNA配列のユニークなセットを有するので、ユニークに個体を同定することができる。本発明の配列を用いて、個体および組織からそのような同定配列を得ることができる。本発明のPD−L2ヌクレオチド配列は、ヒトゲノムの部分をユニークに表す。対立遺伝子の変化は、ある程度はこれらの配列のコーディング領域に生じるが、大部分は非コーディング領域に生じる。個体間の対立遺伝子の変化は、各500塩基につき約1つの頻度で起こることが見積もられる。本明細書中に開示する配列のそれぞれは、ある程度まで、個人からのDNAを同定目的のために比較することができるスタンダードとして用いることができる。より多くの遺伝子多型は非コーディング領域に生じるので、個体を識別するにはより少数の配列が必要である。それぞれが100塩基の非コーディング増幅配列を生じるおそらく10ないし1000個のプライマーのパネルを用いると、配列番号:1または4の非コーディング配列によりポジティブな個体の同定が可能となる。配列番号:3または6のごとき予想されたコーディング配列を用いる場合、ポシティブな個体の同定のためのプライマーのより適当な数は500ないし2000個であろう。
【0239】
本明細書に記載するPD−L2ヌクレオチド配列由来の試薬のパネルを用いて個体に関するユニークな同定データベースを作成する場合、それらの同じ試薬を後で用いてその個体からの組織を同定することができる。ユニークな同定データベースを用いて、生存している、または死亡した個体のポジティブな同定を、極端に少量の組織試料から行なうことができる。
【0240】
3.法生物学(forensic biology)における部分PD−L2配列の使用
DNAに基づく同定法は、法生物学にも用いることができる。法生物学は、犯罪現場で見出される生物学的証拠の遺伝学的分類を、例えば犯罪の犯人をポジティブに同定するための手段として用いている科学分野である。そのような同定を行うのに、PCR技術を用いて、犯罪現場で見出される組織、例えば髪もしくは皮膚、または体液、例えば血液、唾液、または精液などの非常に少量の生物学的試料から採取されたDNA配列を増幅することができる。次いで、増幅された配列をスタンダードと比較することができ、これにより生物試料の起源を同定することが可能となる。
【0241】
本発明の配列を用いて、ヒトゲノムの特定の位置に標的され、例えば別の「同定マーカー」(即ち、特定の個体にユニークな他のDNA配列)を提供することによりDNAに基づく法的同定の確実性を高めることができるポリヌクレオチド試薬、例えばPCRプライマーを提供することができる。前記のように、実際の塩基配列情報を、制限酵素により作成されたフラグメントにより形成されるパターンに確実に代わるものとして同定に用いることができる。遺伝子多型の大部分は非コーディング領域に生じるので、配列番号:1または配列番号:4の非コーディング領域に標的化される配列がこの使用のために特に適当であり、この方法を用いて、個体を区別することがいっそう容易になる。ポリヌクレオチド試薬の例は、PD−L2ヌクレオチド配列またはその部分、例えば、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基の長さを有する配列番号:1または4の非コーディング領域由来のフラグメントを包含する。
【0242】
本明細書中に開示するPD−L2ヌクレオチド配列をさらに用いて、特定組織、例えば脳組織を同定するために、例えばin situハイブリダイゼーション法で用いることができるポリヌクレオチド試薬、例えば標識プローブ、または標識可能なプローブを提供することができる。これは、法病理学者が未知起源の組織を与えられる場合に非常に有用であり得る。そのようなPD−L2プローブのパネルを用いて、種により、および/または器官のタイプにより組織を同定することができる。
同様に、これらの試薬、例えばPD−L2プライマーまたはプローブを用いて、コンタミネーションに関して組織培養物をスクリーニングする(即ち、培養物中の異なるタイプの細胞の混合物の存在をスクリーニングする)ことができる。
【0243】
C.予測医学
本発明は、予後(予測)目的のために診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験をモニターすることを用い、それにより個体を予防的に処置する予測医学の分野にも適する。従って、本発明の一態様は、生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)中でのPD−L2ポリペプチドおよび/または核酸の発現ならびにPD−L2の活性を測定し、それにより、個体が異常なPD−L2の発現または活性に関連する病気または疾患に罹患しているかどうか、または疾患が進行する危険にあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。本発明により、個体がPD−L2ポリペプチド、核酸の発現または活性に関連する疾患を進行させる危険にあるかどうかを決定するための予後(または予測)アッセイも提供される。例えば、PD−L2遺伝子の変異を、生物試料中でアッセイすることができる。そのようなアッセイを予後または予測目的のために用い、それにより個体を、PD−L2ポリペプチド、核酸の発現または活性により特徴付けられる、またはそれに関連する疾患の発症前に予防的に処置することができる。
本発明の他の態様は、臨床試験で、PD−L2の発現または活性における試薬(例えば、薬剤、化合物)の影響をモニターすることに関する。
これらおよび他の試薬を、以下のセクションにさらに詳細に記載する。
【0244】
1.診断アッセイ
PD−L2ポリペプチドまたは核酸の生物試料中での存在または不在を検出するための典型的な方法は、生物試料を試験対象から得て、次いでPD−L2ポリペプチドまたはPD−L2ポリペプチドをコードする核酸(例えば、mRNA,ゲノムDNA)を検出することができる化合物または試薬と生物試料と接触させて、生物試料中のPD−L2ポリペプチドまたは核酸の存在を検出することを特徴とする。PD−L2 mRNAまたはゲノムDNAを検出するのに好ましい試薬は、PD−L2 mRNAまたはゲノムDNAにハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号1、3、4または6の核酸のようなhPD−L2核酸、またはその部分、例えば少なくとも15、30、50、100、250または500ヌクレオチドの長さの、およびPD−L2 mRNAまたはゲノムDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであってよい。本発明の診断アッセイにおける使用に適した他のプローブを、本明細書中に記載する。
【0245】
PD−L2ポリペプチドを検出するのに好ましい試薬は、PD−L2ポリペプチドに結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであってよい。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えばFabまたはF(ab’)2)を用いることができる。プローブまたは抗体に関して「標識された」なる用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を結合させる(即ち、物理的に結合させる)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに、プローブまたは抗体を直接標識される他の試薬と反応させることにより間接的に標識することが含まれるものとする。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、およびDNAプローブをビオチンで末端標識して、それを蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することが含まれる。「生物学的試料」なる用語には、対象から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに対象中に存在する組織、細胞および体液が含まれるものとする。即ち、本発明の検出方法を用いて生物試料においてPD−L2 mRNA、蛋白またはゲノムDNAを、インビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、PD−L2 mRNAのインビトロでの検出法には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションが含まれる。PD−L2ポリペプチドのインビトロでの検出法には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISAs)、ウェスタン・ブロット、免疫沈降および免疫蛍光法が含まれる。PD−L2ゲノムDNAのインビトロでの検出法にはサザンハイブリダイゼーションが含まれる。PD−L2ゲノムDNAの検出のためのインビトロ法には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、PD−L2ポリペプチドのインビボでの検出法には、標識された抗−PD−L2抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置を標準的な画像処理法で検出することができる放射活性マーカーで標識することができる。
【0246】
1の具体例において、生物試料は試験対象からの蛋白分子を含む。別法として、生物試料には試験対象からのmRNA分子または試験対象からのゲノムDNA分子を含むことができる。好ましい生物試料は、対象から慣用的方法により単離される血清試料である。
もう1つの具体例では、該方法はさらに、対照生物試料を対照の対象から得ること、対照試料をPD−L2ポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAを検出することができる化合物または試薬と接触させて、生物試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの存在を検出すること、ついで、対照試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの存在を、試験試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの存在と比較することを特徴とする。
【0247】
本発明には、生物試料中のPD−L2の存在を検出するためのキットも包含される。例えば、該キットには、生物試料中のPD−L2ポリペプチドまたはmRNAを検出することができる標識化合物または試薬、試料中のPD−L2の量を測定する装置、および試料中のPD−L2の量をスタンダードと比較する装置を含めることができる。該化合物または試薬は適当な容器に封入することができる。キットには、さらに、キットをPD−L2ポリペプチドまたは核酸を検出するのに用いるための使用説明書を含めることができる。
【0248】
2.予後アッセイ
さらにそのうえ、本明細書記載の診断方法を用いて、異常なまたは望ましくないPD−L2発現または活性に関連した疾病または疾患を有する、あるいは発症する危険性のある対象を同定することができる。本明細書の用語「異常な」は、野生型PD−L2発現または活性から逸脱したPD−L2発現または活性を包含する。異常な発現または活性は、増加または減少した発現または活性、ならびに野生型の発達パターンの発現またはサブ細胞(subcellular)パターンの発現に従わない発現または活性を包含する。例えば、異常なPD−L2発現または活性は、PD−L2中の変異がPD−L2遺伝子の発現不足または過剰発現を引き起こす場合、ならびに変異が、無機能PD−L2ポリペプチドまたは野生型の様式で機能しないポリペプチド、例えば、PD−L2結合パートナー(例えばPD−1)と相互作用しないポリペプチド、または非PD−L2結合パートナーと相互作用するポリペプチドを生じさせる状況を包含する。本明細書の用語「望ましくない」は、免疫細胞活性化のごとき生物学的応答に関与する望ましくない現象を包含する。例えば、用語「望ましくない」は、対象において望ましくないPD−L2発現または活性を包含する。
【0249】
上記診断アッセイまたは下記アッセイのごとき本明細書中に記載のアッセイを用いて、PD−L2活性または核酸発現の誤調節に関連した疾病、例えば、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系の癌を有する、あるいは発症する危険性のある、あるいは自発的に流産する傾向のある対象を同定することができる。別法として、予後アッセイを用いて、PD−L2活性または核酸発現の誤調節に関連した疾病、例えば、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系の癌を有する、あるいは発症する危険性のある、あるいは自発的に流産する傾向のある対象を同定することができる。かくして、本発明は、異常なPD−L2の発現または活性に関連する病気または疾患を同定するための方法であって、試験試料を対象から得て、PD−L2ポリペプチドまたは核酸(例えば、mRNA、ゲノムRNA)を検出する方法が提供し、ここで、PD−L2ポリペプチドまたは核酸の存在は、異常なPD−L2の発現または活性に関連する病気または疾患を有する、あるいはそれらを進行させる危険にある患者の診断的特徴である。本明細書中で使用する「試験試料」は、関心の持たれる対象から得られる生物試料をいう。例えば、試験試料は、生物学的液体(例えば、脳脊髄液または血清)、細胞試料、または組織から得ることができる。
【0250】
さらにそのうえ、本明細書に記載する予後アッセイを用いて、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、蛋白、ペプチド、核酸、小型分子または他の薬物候補)を対象に投与して、異常なまたは望ましくないPD−L2の発現または活性に関連する病気または疾患を処置することができるかどうかを決定することができる。例えば、かかる方法を用いて、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系の癌、または自発的流産傾向に対する薬剤で対象を効果的に治療しうるかどうかを決定することができる。つまり、本発明は、異常なPD−L2の発現または活性に関連する疾患のための薬剤を用いて対象を効果的に処置することができるかどうかを決定するための方法を提供するものであり、該方法は、試験試料を得、PD−L2ポリペプチドまたは核酸の発現または活性を検出する方法(例えば、ここで、PD−L2ポリペプチドまたは核酸の発現または活性が大きいことは、異常なPD−L2の発現または活性に関連する疾患を治療するための薬剤を投与することができる対象の診断的特徴である)である。
【0251】
本発明の方法を用いて、PD−L2遺伝子の遺伝学的変化を検出し、それにより、変化した遺伝子を有する対象がPD−L2ポリペプチド活性または核酸発現の誤調節により特徴づけられる疾患、例えば、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系の癌、または自発的流産傾向の危険性があるかどうかを決定することができる。好ましい具体例において、該方法は、対象からの細胞の試料において、PD−L2ポリペプチドをコードしている遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも一つの変化により特徴付けられる遺伝学的変化の存在または不在、またはPD−L2遺伝子の誤発現を検出することを特徴とする。例えば、そのような遺伝学的変化は、1)PD−L2遺伝子からの1またはそれ以上のヌクレオチドの欠失;2)PD−L2遺伝子への1またはそれ以上のヌクレオチドの付加;3)PD−L2遺伝子の1またはそれ以上のヌクレオチドの置換;4)PD−L2遺伝子の染色体転位;5)PD−L2遺伝子のメッセンジャーRNA転写のレベルでの変化;6)PD−L2遺伝子、例えばゲノムDNAのメチル化パターンの異常な変化;7)PD−L2遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライシングパターンの存在;8)PD−L2ポリペプチドの非野生型レベル;9)PD−L2遺伝子の対立遺伝子欠失、および10)PD−L2ポリペプチドの翻訳後の不適当な修飾、の少なくとも一つの存在を確認することにより検出することができる。本明細書に記載するように、PD−L2遺伝子の変化を検出するのに用いることができる、当該分野で公知の多数のアッセイ法が存在する。好ましい生物試料は、対象から慣用的手段により単離された組織または血清試料である。
【0252】
ある具体例において、変化の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、U.S.特許第4,683,195および4,683,202を参照されたい)、例えばアンカーPCRまたはRACE・PCRにおける、あるいは、ライゲーション連鎖反応(LCR)(例えば、Landegran et al. (1988) Science 241: 1077−1080; and Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360−364参照)におけるプローブ/プライマーの使用が含まれ、後者はPD−L2遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用であり得る(Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675−682を参照されたい)。この方法は、対象から細胞の試料を収集すること、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、mRNAまたは両方)を単離すること、PD−L2遺伝子(存在する場合)のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で、PD−L2遺伝子に特異的にハイブリダイズする1またはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触させること、次いで増幅産物の存在または不存在を検出すること、あるいは増幅産物のサイズを検出し、および対照試料と長さを比較することを特徴とする。PCRおよび/またはLCRは、本明細書に記載する変異を検出するのに用いられる方法のいずれかと組み合わせて予備的増幅ステップとして用いることが望ましいと考えてもよい。
【0253】
別の増幅法には、自己保存配列複製(Guatelli, J. C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874−1878)、転写増幅システム(Kwoh, D. Y. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173−1177)、Q−ベータレプリカーゼ(Lizardi, P. M. et al. (1988) Bio−Technology 6: 1197)またはいずれかの他の核酸増幅法が含まれ、この後、当業者に周知の方法を用いる増幅分子の検出を行う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数で存在している場合に核酸分子を検出するのに特に有用である。
【0254】
別の具体例において、試料細胞からのPD−L2遺伝子における変異は、制限酵素開裂パターンの変化により同定することができる。例えば、試料および対照DNAを単離し、増幅し(所望により)、1またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメントの長さのサイズをゲル電気泳動により決定し、そして比較する。フラグメントの長さのサイズに関する試料および対照DNA間の違いが、試料DNAにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイムを使用して(例えば、U.S.特許第5,498,531号を参照されたい)、リボザイム開裂部位の発生または消失により特異的変異の存在を評価することができる。
【0255】
他の具体例において、PD−L2の遺伝的変異は、試料および対照の核酸、例えばDNAまたはRNAを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイゼーションさせることにより同定することができる(Cronin, M. T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244−255; Kozal, M. J. et al. (1996) Nature Medicine 2: 753−759)。例えば、PD−L2の遺伝的変異は、Cronin, M. T. et al(既出)に開示されているような光により生成する(light−generated)DNAプローブを含む二次元アレイ中にて同定することができ、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料および対照中のDNAの長い鎖を探査し、配列がオーバーラップしているプローブの線状アレイ(array)を作成することにより配列間の塩基変化を同定することができる。この工程により点突然変異の同定が可能となる。この工程を行った後に、検出されたすべての変種または変異に相補的な、小さな、特異化されたプローブアレイを用いることにより特異的変異の特定を可能とする二次ハイブリダイゼーションアレイを用いる。各変異アレイはパラレルなプローブのセットから構成され、一方は野生型遺伝子に相補的であり、もう一方は、変異遺伝子に相補的である。
【0256】
さらにもう一つの具体例において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを用いてPD−L2遺伝子を直接配列決定し、試料PD−L2の配列を対応する野生型(対照)の配列と比較することにより変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Maxam and Gilbert((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)またはSanger((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)により開発された方法に基づくものが含まれる。診断アッセイ((1995) Biotechniques 19: 448)を行う場合、質量スペクトル分析(例えば、PCT国際公開NO.WO94/16101;Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127−162; およびGriffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147−159を参照されたい)を含む種々の自動配列決定法のいずれかを用いることができることも考えられる。
【0257】
PD−L2遺伝子の変異を検出するための他の方法には、開裂試薬からの保護を用いてRNA/RNAまたはRNA/DNAヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基対を検出する方法が含まれる(Myers et al. (1985) Science 230: 1242)。一般に、「ミスマッチ開裂」の当該分野における方法は、野生型PD−L2配列を含む(標識された)RNAまたはDNAを、組織試料から得られる潜在的に変異したRNAまたはDNAとハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロ二本鎖を提供することで始まる。二本鎖の分子を、対照および試料鎖間の塩基対ミスマッチのために存在しているであろう二本鎖分子の一本鎖領域を開裂する薬剤を用いて処理する。例えば、RNA/DNA二本鎖はRNaseで処理することができ、およびDNA/DNAハイブリッドはS1ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を酵素消化することができる。他の具体例では、ミスマッチ領域を消化するために、DNA/DNAまたはRNA/DNA二本鎖のいずれかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化後、生じた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分けし、変異の部位を決定する。例えば、Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleeba et al.(1992) Methods Enzumol. 217: 286−295を参照されたい。好ましい具体例において、対照DNAまたはRNAを、検出のために標識することができる。
【0258】
さらにもう1つの具体例において、ミスマッチ開裂反応は、二本鎖DNAにおけるミスマッチ塩基対を認識する1またはそれ以上の蛋白(いわゆる「DNAミスマッチ修復」酵素)を、細胞の試料から得られたPD−L2における点突然変異を検出およびマッピングするために規定されたシステムにおいて利用する。例えば、イー・コリのmutY酵素はG/AミスマッチでAを開裂し、ヒーラ細胞由来のチミジンDNAグリコシラーゼはG/TミスマッチでTを開裂する(Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657−1662)。典型的な具体例に従い、PD−L2配列、例えば野生型PD−L2配列に基づくプローブを、試験細胞からのcDNAまたは他のDNA産物にハイブリダイズさせる。二本鎖をDNAミスマッチ修復酵素で処理し、そして開裂産物を、それが存在する場合には、電気泳動プロトコールなどから検出することができる。例えば、U.S.特許第5,459,039号を参照されたい。
【0259】
他の具体例において、電気泳動の移動度の変化を用いてPD−L2遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖構造遺伝子多型(SSCP)を用いて変異型および野生型核酸間の電気泳動の移動度の違いを検出してもよい(Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA: 86: 2766、Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125−144; およびHayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73−79)。試料および対照のPD−L2核酸の一本鎖DNAフラグメントを変性させ、次いで復元させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列によって異なり、電気泳動の移動度に関して結果的に生じる変化から、わずか一つの塩基変化も検出することができる。DNAフラグメントは標識プローブを用いて標識または検出することができる。アッセイの感度は、(DNAよりも)二次構造が配列の変化に対してよりセンシティブなRNAを用いることにより高めることができる。好ましい具体例では、目的の方法は、ヘテロ二本鎖の分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二本鎖分子を分離するものである(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5)。
【0260】
さらにもう1つの具体例において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異型または野生型フラグメントの移動を、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)を用いてアッセイする(Myers et al. (1985) Nature 313: 495)。DGGEを分析法として用いる場合、例えば約40bpの高融点のGCに富むDNAのGCクランプをPCRにより追加することによりDNAを修飾して、DNAが完全に変性しないことを保証する。さらなる具体例では、温度勾配を変性勾配の代わりに用いて、対照と試料DNAの移動度の違いを同定する(Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753)。
【0261】
点突然変異を検出するための他の方法の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が包含されるが、これらに限らない。例えば、知られた変異が中心に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが認められる場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的DNAにハイブリダイズさせることができる(Saiki et al. (1986) Nature 324: 164); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230)。オリゴヌクレオチドがハイブリダイジング膜に結合し、そして標識された標的DNAとハイブリダイズする場合、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、PCR増幅された標的DNAまたは多くの異なる変異体にハイブリダイズする。
【0262】
別法として、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅法を、本発明と組み合わせて用いてよい。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、興味ある変異を分子の中心に有していてもよく(その結果、増幅はディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する)(Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437−2448)、あるいは、適当な条件下でミスマッチによりポリメラーゼの伸張が妨げられ、または減じられ得る場合には、ある種のプライマーの3’末端に興味ある変異を有していてもよい(Prossner et al. (1993) Tibtech 11: 238)。さらに、新規な制限酵素部位を変異の領域に導入して、切断に基づいて検出を行うことが望ましい可能性もある(Gasparini et al. (1992) nol. Cell Probes 6:1)。ある具体例において、増幅用Taqリガーゼを用いて増幅を行ってもよいことが予想される(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189)。そのような場合、ライゲーションは、5’配列の3’末端に完全なマッチ(match)が存在する場合にのみ起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定部位での知られた変異の存在を検出することができる。
【0263】
例えば、本明細書に記載する少なくとも一つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予め包装された診断用キットであって、例えばPD−L2遺伝子に関与する疾患または病気の兆項または家族歴を示している患者を診断するために臨床環境で簡便に用いることができる診断用キットを利用することにより、本明細書に記載した方法を行うことができる。
さらに、PD−L2を発現するあらゆる細胞タイプまたは組織を本明細書に記載する予後アッセイに用いてよい。
【0264】
3.臨床試験の間の効果のモニタリング
PD−L2ポリペプチドの発現または活性に対する作用剤(例えば、薬剤)の影響(例えば、細胞増殖および/または移動のモジュレーション)のモニタリングを、基本的な薬剤スクリーニングのみならず臨床試験に適用することができる。例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより決定された作用剤の、PD−L2遺伝子発現、ポリペプチドレベルを増大させ、あるいはPD−L2活性をアップレギュレーションする有効性を、PD−L2遺伝子発現、ポリペプチドレベルの低下、あるいはPD−L2活性のダウンレギュレーションを示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。別法として、スクリーニングアッセイにより決定された作用剤の、PD−L2遺伝子発現、ポリペプチドレベルを減少させ、あるいはPD−L2活性をダウンレギュレーションする有効性を、PD−L2遺伝子発現、ポリペプチドレベル、またはPD−L2活性の上昇を示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。かかる臨床試験において、PD−L2遺伝子、および好ましくは例えばPD−L2関連疾患に関連する他の遺伝子の発現または活性を、特定細胞の表現型の「リードアウト(read out)」またはマーカーとして用いることができる。
【0265】
例えば、そして限定するものではないが、PD−L2活性をモジュレーションする作用剤(例えば、化合物、薬剤または小型分子)(例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される)での処理により細胞においてモジュレーションされるPD−L2などの遺伝子を同定することができる。かくして、例えば臨床試験において、PD−L2関連疾患(例えば、誤調節されたPD−1活性により特徴づけられる)に対する作用剤の影響を研究するために、細胞を単離し、RNAを調製し、PD−L2およびPD−L2関連疾患に関与する他の遺伝子の発現レベルをそれぞれ分析することができる。本明細書記載のノーザンブロット分析またはRT−PCRにより、あるいは別法として産生ポリペプチド量を測定することにより、本明細書に記載の方法の1つにより、あるいはPD−L2または他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより、遺伝子発現のレベル(例えば、遺伝子発現パターン)を定量することができる。このようにして、遺伝子発現パターンは、作用剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして役立ちうる。したがって、個体を作用剤で治療する前および治療中の種々に時点においてこの応答状態を調べてもよい。
【0266】
好ましい具体例において、本発明は、作用剤(例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小型分子、または他の薬剤候補)での対象の治療の有効性をモニタリングする方法を提供し、該方法は、(i)作用剤の投与の前に対象から投与前試料を得る;(ii)投与前試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNA、またはゲノムDNAの発現レベルを調べる;(iii)対象から1またはそれ以上の投与後試料を得る;(iv)PD−L2ポリペプチド、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性のレベルを調べる;(v)投与前試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性のレベルと、投与後試料中のPD−L2ポリペプチド、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性のレベルを比較する;次いで(vi)適宜、対象に対する作用剤の投与を変更する工程を含む。例えば、作用剤の投与増加は、PD−L2の発現または活性を検出レベルよりも高いレベルにまで上昇させる、すなわち、作用剤の有効性を高めるために望ましい。あるいはまた、作用剤の投与減少は、PD−L2の発現または活性を検出レベルよりも低いレベルにまで低下させる、すなわち、作用剤の有効性を低くするために望ましい。かかる具体例によれば、観察可能な表現型応答の不存在下においてさえも、PD−L2活性または発現を作用剤の有効性のインジケーターとして用いることができる。
【0267】
D.治療方法:
本発明は、不十分または過剰なPD−L2蛋白の産生あるいはPD−L2野生型蛋白と比較して低いまたは異常な活性を有するPD−L2蛋白形態の産生により特徴付けられる疾病の危険性のある(感受性のある)対象の予防的ならびに治療的処置方法を提供する。そのうえ、本発明の抗−PD−L2抗体を用いてPD−L2蛋白を検出し単離し、PD−L2蛋白の生体利用性を調節し、例えばPD−L2とPD−1との相互作用をモジュレーションすることによりPD−L2活性をモジュレーションすることができる。
【0268】
1.予防方法
1の態様において、本発明は、PD−L2ポリペプチドあるいはPD−L2ポリペプチド発現または少なくとも1つのPD−L2活性をモジュレーションする薬剤を対象に投与することによる、対象において異常なPD−L2発現または活性に関連する疾患または病状を防ぐ方法を提供する。異常なPD−L2発現または活性により誘発されるかまたはそれに起因する疾患の危険がある対象は、例えばここに記載されている診断または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせにより確認され得る。予防薬の投与は、疾患または障害を阻止するかまたは他の場合その進行を遅らせるように、PD−L2の異常を特徴とする徴候が現れる前に行うことができる。PD−L2の異常または症状のタイプにより、例えば、PD−L2ポリペプチド、PD−L2アゴニストまたはPD−L2アンタゴニスト薬剤を、対象処置のために使用することができる。適当な薬剤は、臨床的徴候に基いて決定することができ、例えば本明細書に記載されているスクリーニングアッセイを用いて確認することができる。
【0269】
2.治療方法
本発明のもう1つの態様は、治療目的でPD−L2の発現または活性またはその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用をモジュレーションする方法に関する。PD−L2は、活性化免疫細胞の同時刺激および増殖を阻害し、PD−1を介して阻害性シグナルを免疫細胞に伝達することが示されている。したがって、PD−L2の活性および/または発現、ならびにPD−L2とPD−1との間の相互作用をモジュレーションして、免疫応答をモジュレーションすることができる。PD−L2は阻害性受容体に結合するので、PD−L2活性のアップレギュレーションは免疫応答のダウンレギュレーションを引き起こし、PD−L2活性のダウンレギュレーションは免疫応答のアップレギュレーションを引き起こす。好ましい具体例において、PD−L2は阻害性受容体に結合する。特に好ましい具体例において、PD−L2はPD−1に結合する。
【0270】
本発明のモジュレーション方法は、PD−L2ポリペプチドまたは細胞に結合したPD−L2ポリペプチドの1またはそれ以上の活性をモジュレーションする作用剤と細胞とを接触させることを含む。作用剤は、例えば、PD−L2の発現または活性をモジュレーションするもの、および/またはPD−L2とその本来の結合パートナーとの相互作用をモジュレーションするものである。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。PD−L2ポリペプチド活性をモジュレーションする作用剤は本明細書に記載の作用剤、例えば、核酸またはポリペプチド、PD−L2ポリペプチドの本来の結合パートナー(例えば、PD−1)、PD−L2抗体、PD−L2アゴニストまたはアンタゴニスト、PD−L2アゴニストまたはアンタゴニストのペプチド模倣物、あるいは他の小型分子でありうる。可溶性形態のPD−L2を用いて、PD−1のその本来の結合パートナーまたはリガンドへの結合を妨害してもよい。
【0271】
PD−L2の発現をモジュレーションする作用剤は、例えば、アンチセンス核酸分子、三重鎖オリゴヌクレオチド、リボザイム、またはPD−L2ポリペプチド発現のための組み換えベクターである。例えば、PD−L2翻訳開始部位周辺領域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。典型的には200μg/mlの1またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞培地に添加することができ、あるいは1またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与してPD−L2ポリペプチドの合成を防止することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞により摂取され、PD−L2 mRNAとハイブリダイゼーションし、翻訳を妨害する。別法として、二本鎖DNAに結合して三重鎖構築物を構成し、DNAの巻き戻しおよび転写を妨害するオリゴヌクレオチドを用いることもできる。いずれにせよ結果として、PD−L2ポリペプチドの合成がブロックされる。PD−L2発現がモジュレーションされる場合、かかるモジュレーションはPD−L2遺伝子のノックアウト以外の手段により引き起こされる。
【0272】
作用剤が細胞におけるPD−L2量を制御するという事実により、発現をモジュレーションする作用剤はまた細胞におけるPD−L2活性の全量をモジュレーションする。
1の具体例において、PD−L2をモジュレーションする作用剤は、1またはそれ以上のPD−L2活性を刺激する。かかる刺激剤の例は、活性PD−L2ポリペプチドおよび細胞に導入されたPD−L2をコードする核酸分子を包含する。もう1つの具体例において、作用剤は1またはそれ以上のPD−L2活性を阻害する。好ましい具体例において、作用剤はPD−L2とその本来の結合パートナーとの間の相互作用を阻害または促進する。特に好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。かかる阻害剤の例は、アンチセンスPD−L2核酸分子、抗−PD−L2抗体、PD−L2阻害剤、および主題のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を包含する。さらに好ましい具体例において、阻害剤は抗−PD−L2抗体と抗−PD−1抗体の組み合わせである。
【0273】
これらのモジュレーション方法をインビトロで行なうことができ(例えば、細胞を作用剤と接触させることにより)、あるいはまた、インビボで作用剤と細胞を接触させることにより行なうこともできる(例えば、作用剤を対象に投与することにより)。そのようなものとして、本発明は、PD−L2ポリペプチドのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションから利益を受けるであろう症状または疾病、例えば、PD−L2ポリペプチドまたは核酸分子の望ましくない、不十分な、あるいは異常な発現または活性により特徴付けられる疾病にかかっている個体の治療方法を提供する。1の具体例において、該方法は、PD−L2発現または活性をモジュレーション(例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション)する作用剤(例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより同定される作用剤)または作用剤の組み合わせを投与することを含む。もう1つの具体例において、該方法は、PD−L2ポリペプチドまたは核酸分子を治療薬として投与して、低下した、異常な、あるいは望ましくないPD−L2発現または活性を補償することを含む。
【0274】
PD−L2活性の刺激は、PD−L2が異常にダウンレギュレーションされる状況、および/または増大したPD−L2活性が有益な効果をもたらす可能性のある状況において望ましい。同様に、PD−L2活性の阻害は、PD−L2が異常にアップレギュレーションされる状況、および/または減少したPD−L2活性が有益な効果をもたらす可能性のある状況において望ましい。
【0275】
PD−L2をダウンレギュレーションするのに使用される典型的な作用剤(すなわち、PD−L2アンタゴニスト)は、例えば、アンチセンス核酸、PD−L2を認識しブロックする抗体、PD−L2を認識しブロックする抗体とPD−1を認識しブロックする抗体との組み合わせ、ならびにPD−L2と免疫細胞上のその本来の結合パートナーとの相互作用をブロックする化合物(例えば、可溶性、1価のPD−L2分子;抗原提示細胞上のFc受容体に結合しない可溶性形態のPD−L2;可溶性形態のPD−L2結合パートナー;または主題のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物)を包含する。好ましい具体例において、結合パートナーはPD−1である。PD−L2をダウンレギュレーションするのに使用される典型的な作用剤(すなわち、PD−L2アゴニスト)は、例えば、PD−L2ポリペプチドをコードする核酸分子、多価形態のPD−L2、PD−L2の発現を増加させる化合物、PD−L2とその本来の結合パートナー(例えば、PD−1)との相互作用を促進する化合物、ならびにPD−L2を発現する細胞を包含する。
【0276】
3.免疫応答のダウンレギュレーション
PD−L2ポリペプチドの阻害的機能をアップレギュレーションすることにより免疫応答をダウンレギュレーションする本発明の具体例が多く存在する。ダウンレギュレーションは、すでに進行している免疫応答を阻害または抑制する形態であってもよく、あるいは免疫応答の誘導を妨害することを含むものであってもよい。免疫細胞応答をダウンレギュレーションすることにより、あるいは免疫細胞における特異的アネルギーを誘導することにより、あるいはそれら両方により、活性化された免疫細胞の機能を阻害することができる。
【0277】
例えば、PD−L2が阻害性受容体、例えば、PD−1に結合する具体例において、阻害性受容体に結合するPD−L2の形態、例えば、細胞上の多価PD−L2を用いて免疫応答をダウンレギュレーションすることができる。同様に、さらなる作用剤、例えば、PD−L1とPD−1との相互作用をブロックする作用剤を用いることにより、PD−L2−PD−1相互作用を促進し、さらに免疫応答をダウンレギュレーションすることもできる。
【0278】
1の具体例において、本発明は、PD−L2活性を刺激するために用いられる活性化抗体は二特異的(bispecific)抗体である。例えば、かかる抗体は、PD−L2結合部位および免疫細胞、例えばT細胞、B細胞またはミエロイド細胞上の細胞表面受容体を標的とするもう1つの結合部位を含むものであってよい。1の具体例において、かかる抗体は、PD−L2結合部位のほかに、B細胞抗原受容体、T細胞抗原受容体、またはFc受容体に結合する結合部位をさらに含んでいて、特定の細胞集団に対する分子を標的とするものであってもよい。二特異的抗体に対するこの第2の抗原の選択は、阻害されるべき細胞集団の選択に柔軟性を与える。
【0279】
PD−L2活性を促進する作用剤、あるいはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を促進する作用剤(例えば、PD−L2活性化抗体またはPD−L2活性化小型分子)を、免疫細胞増殖および/またはエフェクター機能を抑制する能力、あるいはインビトロアッセイに付け加えられる場合にはアネルギー誘導能により同定することができる。例えば、活性化受容体を介してシグナルトランスダクションを刺激する作用剤の存在下において細胞を培養することができる。多くの当該分野で認識された細胞活性化のリードアウトを用いて、活性化剤の存在下において例えば細胞増殖またはエフェクター機能(例えば、抗体産生、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス)を測定することができる。この活性をブロックする試験作用剤の能力を、測定すべき増殖またはエフェクター機能の低下に対する作用剤の影響能を測定することにより決定することができる。1の具体例において、低い抗原濃度において、PD−L2−PD−1相互作用は強力なB7−CD28シグナルを阻害する。もう1つの具体例において、高い抗原濃度において、PD−L2−PD−1相互作用はサイトカイン産生を減少させるが、T細胞増殖を阻害しない。したがって、異なった抗原濃度においてサイトカイン産生および/または増殖を測定することにより、活性をグロックする試験化合物の能力を決定することができる。
【0280】
本発明の1の具体例において、抗原とPD−L2アゴニストとの同時投与により特異的抗原に対する寛容が誘導される。例えば、特定のポリペプチドに対して寛容を誘導することができる。1の具体例において、免疫応答が望ましくないアレルゲンまたは外来ポリペプチドに対する免疫応答を抑制することができる。例えば、因子VIIIを受け取った患者は高い頻度でこの凝血因子に対する抗体を産生する。PD−L2活性、またはその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激する作用剤と組換え因子VIIIとの同時投与(または例えば架橋による因子VIIIへのPD−L2の物理的結合)は免疫応答のダウンレギュレーションを引き起こす可能性がある。
【0281】
1の具体例において、PD−L2アゴニストおよび免疫細胞上の同時刺激受容体の活性をブロックする別の作用剤を用いて免疫応答をダウンレギュレーションすることができる。典型的な分子は下記のものを包含する:アゴニスト形態の他のPD−1リガンド(例えば、PD−L1)、可溶性形態のCTLA−4、抗−B7−1抗体、抗−B7−2抗体、またはそれらの組み合わせ。あるいはまた、2つの別個のペプチド(例えば、PD−L2ポリペプチドとブロッキング形態のB7−2および/またはB7−1)、または抗体の組み合わせ(例えば、PD−L2ポリペプチドに対する活性化抗体とブロッキング抗−B7−2および/またはB7−1モノクローナル抗体)を1つの組成物にまとめて、あるいは別個に投与(同時投与または逐次投与)して、対象における免疫細胞により媒介される免疫応答をダウンレギュレーションすることができる。さらにそのうえ、PD−L2ポリペプチド活性を有する治療的に活性のある量の1またはそれ以上のペプチドを、B7−1および/またはB7−2活性を有する1またはそれ以上のポリペプチドと一緒に、他のダウンレギュレーション薬剤とともに使用して免疫応答に影響を及ぼすことができる。他の免疫モジュレーション薬剤の例は、同時刺激シグナルをブロックする抗体(例えば、CD28またはICOSに対するもの)、CTLA4を介して阻害性シグナルを活性化させる抗体、および/または他の免疫細胞マーカーに対する抗体(CD40、CD40リガンド、またはサイトカインに対するもの)、融合蛋白(例えば、CTLA4−FcまたはPD−1−Fc)、ならびに免疫抑制剤(例えば、ラパマイシン、サイクロスポリンA、またはFK506)を包含する。
【0282】
PD−L2ポリペプチドは、細胞の破壊により免疫細胞機能をブロックする治療薬の構築においても有用でありうる。例えば、PD−L2ポリペプチドの部分をトキシンに連結して、結合すべき細胞の破壊の引き金を引くことのできる細胞毒性作用剤を作成することができる。
【0283】
細胞毒性作用剤を作成するために、当該分野で知られた方法、例えば、架橋または組換えDNA法により本発明のポリペプチドをトキシンに連結あるいは作動可能に結合させてもよい。一般的には、免疫トキシンの調製は当該分野においてよく知られている(例えば、米国特許第4340535号および欧州特許第44167号、両方を参照により本明細書に一体化させる)。多くのタイプのジスルフィド結合含有リンカーが知られており、それらをうまく用いてトキシン部分とポリペプチドとを抱合させることができる。1の具体例において、インビボにおいてより高い安定性があり、それゆえ作用部位における結合の前のトキシン放出を防止るするので、立体的に「隠れた」ジスルフィド結合含有リンカーが好ましい。
【0284】
広範なトキシンが当該分野で知られており、それらを本発明のポリペプチドまたは抗体に抱合させてもよい。例は下記のものを包含する:多くの有用な植物、真菌または細菌由来のトキシン。それらは、例えば、以下のものを包含する:種々のA鎖トキシン、特にリシンA鎖;サポニンまたはゲロニンのごときリボソーム不活性化蛋白;アルファ−サルシン;アスペルギリン;レストリクトシン;および胎盤リボヌクレアーゼのごときリボヌクレアーゼ、血管形成剤、ジフテリアトキシン、あるいはシュードモナス外毒素。本発明における使用に好ましいトキシン部分は、炭水化物残基を修飾または除去するように処理されたトキシンA鎖、脱糖鎖A鎖(米国特許第5776427号)である。
【0285】
かかる細胞毒性作用剤の1またはそれ以上の組み合わせ(後、PD−L2−リシン単独またはPD−L1−リシンとの組み合わせ)を患者に輸液することは、特に、活性化免疫細胞が多量のPD−L2結合パートナー、例えばPD−1を産生するという事実を考慮すれば、免疫細胞の死滅を引き起こしうる。例えば、PD−1は活性化リンパ球の表面上で誘導されるので、PD−L2ポリペプチドを用いて、Fc−R依存的機構によりあるいはPD−L2への細胞毒性薬剤(例えば、リシン、サポニン、またはカリヘアミシン)を抱合させることによる剥奪により、これらの特定細胞の枯渇を標的とすることができる。もう1つの具体例において、トキシンを抗−PD−L2抗体に抱合させて、PD−L2を発現する抗原提示細胞の死滅を標的とすることができる。さらなる具体例において、PD−L2抗体−トキシンは二特異的抗体でありうる。かかる二特異的抗体は、例えば、特定タイプの細胞上、例えば、Bリンパ球、単球、樹状細胞、またはランゲルハンス細胞上にのみ見出されるマーカーを用いて、特定の細胞集団を標的化するのに有用である。
【0286】
PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の活性化による免疫応答のダウンレギュレーション(かくしてPD−1の負のシグナリング機能を刺激する)は、免疫応答、例えば、in situでの組織、皮膚および器官移植、対宿主移植片疾患(GVHD)、またはアレルギー、または全身性エリトマトーデスおよび多発性硬化症のごとき自己免疫疾患における免疫応答のダウンレギュレーションに有用である。典型的には、組織移植において、移植片拒絶反応は、免疫細胞がそれを外来物と認識しすることから生じ、次いで、移植片を破壊する免疫反応が起こる。PD−L2の活性または免疫細胞上の本来の結合パートナー(例えばPD−1)とPD−L2との相互作用を促進する分子(例えば、可溶性、多価形態のPD−L2ポリペプチド)の投与は、移植の前の時点で、単独あるいは別のダウンレギュレーション作用剤と一緒になって、同時刺激シグナルの発生を阻害しうる。そのうえ、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の促進(よって、PD−1の阻害性シグナル)は免疫細胞に拮抗するに十分であり得、そのことにより対象に寛容が誘導される。PD−1により媒介される阻害性シグナルを促進することによる長期寛容の誘導は、これらの活性化剤の繰り返し投与の必要性を回避しうる。
【0287】
十分な免疫抑制または寛容を対象中で達成するには、他の分子の同時刺激機能をブロックすることが望ましいかもしれない。例えば、移植前の時点で、これらの抗原の各々の活性を有する可溶性形態のペプチドの組み合わせ、あるいはこれらの抗原に対するブロッキング抗体を投与することにより(別個にあるいは1の組成物として)、B7−1およびB7−2の機能をブロックすることが望ましいかもしれない。別法として、PD−L2の阻害活性を促進し、B7−1および/またはB7−2の同時刺激活性を阻害することが望ましいかもしれない。本発明のダウンレギュレーション法と一緒に使用されうる他のダウンレギュレーション作用剤は、例えば、CTLA4を介して阻害性シグナルを伝達する作用剤、可溶性形態のCTLA4、CTLA4を介して阻害性シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーに対するブロッキング抗体、または可溶性形態の他の受容体リガンドペアー(例えば、CD40とCD40リガンドとの間の相互作用を破壊する作用剤(例、抗CD40リガンド抗体))、サイトカインに対する抗体、または免疫抑制剤を包含する。
【0288】
例えば、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を活性化させること(かくして該結合パートナーの阻害性機能)は、自己免疫疾患の治療において有用でありうる。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対し上反応性があり、疾病の病理に関与するサイトカインおよびい自己抗体の産生を促進する免疫細胞の不適当な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を防止することは疾病の徴候を減少または除去しうる。PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を活性化させる作用剤の投与は、疾病からの長期寛解を誘導しうる自己反応性免疫細胞の抗原特異的寛容を誘導しうる。さらに、B7分子と同時刺激受容体との受容体−リガンド相互作用を破壊することにより免疫細胞の同時刺激をブロックする作用剤の同時投与は、免疫細胞活性化において有用であり得、その結果、疾病プロセスに関与しうる自己抗体またはサイトカインの産生が防止される。自己免疫疾患を防止または改善することにおける薬剤の有効性を、ヒト自己免疫疾患に関する十分に特徴付けられた多くの動物モデルを用いて調べることができる。例は、ネズミ実験自己免疫脳炎、MRL/lpr/lprマウスまたはNZBハイブリッドマウスにおける全身性エリトマトーデス、ネズミ自己免疫コラーゲン関節炎、NODマウスおよびBBラットにおける真性糖尿病、ならびにネズミ実験重症筋無力症(Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp.840−856参照)を包含する。
【0289】
免疫細胞活性化の阻害は、例えば、IgE産生を阻害することにより、アレルギーおよびアレルギー性反応の治療において有用である。PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を促進する作用剤をアレルギーの対象に投与して、対象における免疫細胞により媒介されるアレルギー性応答を阻害することができる。PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激することを、適当なMHC分子と一緒にアレルゲンに曝露することにより行なうことができる。アレルゲンの侵入経路および肥満細胞または好塩基球上のIgE沈着パターンにより、アレルギー性反応は全身的または局所的な性質であってよい。かくして、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用を促進する作用剤の投与により、免疫細胞により媒介されるアレルギー性応答を全身的または局所的に阻害することができる。
【0290】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の刺激による免疫細胞活性化の阻害は、免疫細胞の病原体感染(ウイルスまたは細菌による)において治療的に重要でもある。例えば、後天性免疫不全症候群(AIDS)において、免疫細胞活性化によりウイルス複製が刺激される。PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の刺激はウイルス複製を阻害する可能性があり、そのことによりAIDSの経過が改善されうる。
【0291】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の刺激による免疫応答のダウンレギュレーションは、妊娠の維持を促進することにおいても有用でありうる。通常には、PD−L2は胎盤栄養芽胞、すなわち母体と胎児との間の界面を形成する層において高発現され、胎児の母体拒絶反応を防止する役割を果たしている。胚または胎児の免疫学的拒絶反応により自発的流産の危険のあるメス(例えば、「予後アッセイ」に記載のPD−L2活性のスクリーニングにより同定されるメス、すでに自発的流産をしたことのあるメス、あるいは妊娠混合物延性を有するメス)を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激する作用剤で処置することができる。
【0292】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の刺激による免疫応答のダウンレギュレーションは、自己由来の組織の自己免疫攻撃の治療にも有用でありうる。例えば、通常には、PD−L2は心臓で高発現され、心臓を自己免疫攻撃から防御する。このことは、Balb/c PD−1ノックアウトマウスが激しい自己免疫攻撃により心臓に血栓を生じるという事実により明らかである。かくして、自己免疫攻撃により引き起こされあるいは悪化させられる症状(好ましくは例において、心臓疾患、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化)が、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の増加により改善または軽快されうる。それゆえ、自己免疫疾患のごとき自己免疫攻撃により悪化させられる症状(ならびに心臓疾患、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化のごとき症状)を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激することによりモジュレーションすることは本発明の範囲内である。
【0293】
さらなる具体例において、本明細書記載のいずれかの方法を実施する場合、PD−L2およびPD−L1の両方の活性を刺激することにより免疫応答をダウンレギュレーションすることは本発明の範囲内である。PD−L1はさらなるPD−1リガンドであり、同時係属の米国出願第09/644934号;国際公開第WO01/14557号;Dong, H. et al. (1999) Nat. Med. 5: 1365−1369;およびFreemen, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034に記載されており、それぞれの内容を参照により本明細書に一体化させる。さらなる具体例において、本明細書記載のいずれかの方法を実施する場合、1またはそれ以上のさらなる薬剤を投与することにより免疫応答をダウンレギュレーションすることは本発明の範囲内である。例えば、免疫応答をダウンレギュレーションすることが知られている他の作用剤を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を刺激する作用剤と一緒に使用することができる。
【0294】
4.免疫応答のアップレギュレーション
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の阻害は、免疫応答をアップレギュレーションする手段として、治療においても有用である。免疫応答のアップレギュレーションは、存在している免疫応答を高めるかまたは初期免疫応答を誘導する形態であり得る。例えば、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の阻害により免疫応答を促進することは、微生物、例えば細菌、ウイルス、または奇生体の感染の場合において、あるいは免疫抑制の場合において有用でありうる。例えば、1の具体例において、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用を阻害する作用剤、例えば、PD−L2に対する非活性化抗体(すなわち、ブロッキング抗体)、PD−L2およびPD−L1に対する非活性化抗体の組み合わせ、あるいは可溶性形態のPD−L2は、より迅速かつ完全なウイルス、細菌または寄生体のクリアランスを生じさせる抗体および細胞により媒介される応答のアップレギュレーションが有益であろう場合に、in situにおいて治療的に有用である。これらの症状は、ウイルス性皮膚疾患、例えばヘルペスまたは帯状疱疹を包含し、それらの場合において、かかる作用剤を局所的に皮膚にデリバリーすることができる。さらに、インフルエンザ、通常のカゼ、および脳炎のごとき全身性ウイルス疾患を、かかる作用剤を全身投与することにより改善することができる。特定の例において、免疫応答をアプレギュレーションする他の作用剤、例えば、同時刺激受容体を介してシグナルを伝達するB7ファミリーのメンバーの形態の他の作用剤をさらに投与して免疫応答をさらに改善することが望ましいかもしれない。
【0295】
別法として、免疫細胞を患者から取り、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤と免疫細胞をインビトロで接触させ、次いで、インビトロで刺激された免疫細胞を患者中に再導入することにより、感染患者における免疫応答を促進することができる。もう1つの具体例において、免疫応答を促進する方法は、感染細胞、例えばウイルス感染細胞を患者から単離し、本来の結合パートナー、例えばPD−1に結合できない形態のPD−2をコードする核酸分子でそれらの感染細胞をトランスフェクションして、細胞がその表面にPD−L2分子の全体または一部を発現するようにし、次いで、トランスフェクションされた細胞を患者に再導入することを含む。トランスフェクションされた細胞は阻害性シグナルを妨害し、そのことによりインビボで免疫細胞を活性化しうる可能性がある。
【0296】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤を、種々のポリペプチド、例えば、病原体由来のポリペプチドに対するワクチン中に予防的に使用することができる。適当なアジュバント中のPD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤とともにウイルスポリペプチドを接種することにより、病原体、例えば、ウイルスに対する免疫を誘導することができる。別法として、病原性抗原およびPD−L2−PD−1相互作用をブロックする形態のPD−L2の両方をコードする遺伝子を含むベクターを接種に使用することもできる。例えば、注射(例えば、筋肉内、経皮注射、あるいは粒子を皮膚に注入するための特殊な加速装置または圧縮空気を用いる遺伝子銃でのDNA被覆金粒子の表皮中への注入)により核酸ワクチンを投与することができる。別法として、非侵襲的手段により核酸ワクチンを投与することもできる。例えば、純粋または脂質処方されたDNAを呼吸器系にデリバリーし、あるいは他の場所、例えば、DNAの経口デリバリーによりパイエル板を標的とすることができる(Schubbert (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:961)。弱毒化微生物を用いて粘膜表面にデリバリーすることができる(Sizemore et al (1995) Science 270:29)。
【0297】
もう1つの具体例において、ワクチン中の抗原は自己抗原である。かかるワクチンは生物における寛容のモジュレーションにおいて有用である。自己抗原およびPD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー(例えばPD−1)との相互作用をブロックする作用剤での免疫は、寛容を破壊(すなわち、自己抗原に対する寛容を妨害)する可能性がある。かかるワクチンは、アラム(alum)のごときアジュバントまたはサイトカイン(例えば、GM−CSF、IL−12、B7−1、またはB7−2)を含んでいてもよい。
【0298】
1の具体例において、例えば、PD−L2ポリペプチドまたはブロッキング抗体およびMHCクラスIα鎖ポリペプチドおよびβ2ミクログロブリンを同時発現するようにトランスフェクションされた細胞により、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤をクラスI MHCポリペプチドとともに投与して、T細胞を活性化させ、感染に対する免疫を生じさせることができる。例えば、ワクチンが有用であるウイルス病原体は以下のものを包含する:B型肝炎、C型肝炎、Epstein−Barrウイルス、サイトメガロウイルス、HIV−1、HIV−2、結核、マラリアおよび住血吸虫。
【0299】
もう1つの適用例において、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の阻害は、腫瘍免疫の治療において有用でありうる。腫瘍細胞(例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血球、神経芽腫、または癌腫)を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する核酸分子でトランスフェクションすることができる。これらの分子は、例えば、PD−L2に対してアンチセンスである核酸分子であってもよく、あるいは非活性化抗−PD−L2抗体または抗−PD−L2および抗−PD−1抗体の組み合わせをコードするものであってもよい。これらの分子は抗−PD−L2抗体および/または抗−PD−1抗体の可変領域であってもよい。所望ならば、同時刺激を活性化させる他のポリペプチド(例えば、B7−1またはB7−2)で腫瘍細胞をトランスフェクションすることもできる。トランスフェクションされた腫瘍細胞を患者に戻し、そのことによりPD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用の阻害(例えば、局所的阻害)が起こる。別法として、遺伝子治療法を用いて標的腫瘍細胞をインビボでトランスフェクションすることもできる。
【0300】
PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤で患者を処置することによって、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害することにより、腫瘍細胞に対する免疫応答の刺激を行なうことができる。かかる作用剤の好ましい例は、例えば、アンチセンス核酸分子、PD−L2を認識しブロックする抗体、PD−L2を認識しブロックする抗体とPD−L1を認識しブロックする抗体との組み合わせ、ならびに免疫細胞上の本来の結合パートナーとPD−L2との相互作用をブロックする化合物(例えば、可溶性の1価PD−L2分子;抗原提示細胞上のFc受容体に結合しない可溶性形態のPD−L2分子;可溶性形態のPD−L2結合パートナー;および主題スクリーニングにおいて同定される化合物)を包含する。最も好ましい具体例において、PD−L2結合パートナーはPD−1である。
【0301】
さらに、MHCクラスIまたはMHCクラスII分子を欠くか、または十分な量のMHCクラスIまたはMHCクラスII分子を発現し得ない腫瘍細胞は、MHCクラスIα鎖蛋白およびβ2ミクログロブリン蛋白またはMHCクラスIIα鎖蛋白およびMHCクラスIIβ鎖蛋白の全部または一部(例えば、細胞質−ドメイン末端切断部分)をコードする核酸でトランスフェクションされることにより、細胞表面でMHCクラスIまたはMHCクラスII蛋白を発現し得る。PD−L2阻害性ポリペプチドまたはアンチセンス核酸と共に適当なクラスIまたはクラスII MHCを発現させると、トランスフェクション腫瘍細胞に対してT細胞媒介免疫応答が誘導される。所望により、MHCクラスII関連蛋白、例えば不変鎖の発現をブロックするアンチセンス構築物をコードする遺伝子はまた、PD−L2ポリペプチドをコードするDNAと共トランスフェクションされることにより、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘導し得る。B7陰性ネズミ腫瘍細胞によるB7−1の発現は、腫瘍拒絶および長期間防御を伴うT細胞により媒介される特異的免疫を誘導することにより、マウスにおける腫瘍攻撃を行うことが示された(Chen,L.ら(1992)Cell71、1093−1102、Townsend,S.E.および Allison,J.P.(1993)Science259、368−370、Baskar,S.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90、5687−5690)。かくして、ヒト対象における免疫細胞により媒介される免疫応答の誘導は、対象において腫瘍特異的寛容を打ち負かすのに十分であり得る。
【0302】
もう1つの具体例において、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用の阻害により免疫応答を刺激して、すでに存在している寛容を克服することができる。例えば、対象が有意な免疫応答をマウントできない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤を投与することにより誘導することができる。PD−1アンタゴニストをアジュバントとして用いて、能動免疫のプロセスにおいて外来抗原に対する応答を増強することができる。
【0303】
1の具体例において、免疫細胞を対象から入手し、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤の存在下、エクスビボで培養してT細胞集団を増大させる。さらなる具体例において、その後、免疫細胞を対象に投与する。例えば、当該分野において知られているように、T細胞に一次活性化シグナルおよび同時刺激シグナルを提供することにより、T細胞をインビトロで刺激して増殖させることができる。また、様々な形態のPD−L2ポリペプチドを用いてT細胞の増殖を同時刺激することもできる。1の具体例において、PCT出願第WO94/29436号記載の方法に従い免疫細胞をエクスビボで培養する。共刺激分子は、可溶性であってもよく、細胞膜に結合されるかまたは固体表面、例えばビーズに結合され得る。
【0304】
さらなる具体例において、本明細書記載のいずれかの方法を実施する場合、1またはそれ以上のさらなる薬剤を投与することにより免疫応答をアップレギュレーションすることは本発明の範囲内である。例えば、サイトカイン、アジュバント、または刺激性形態の同時刺激分子またはそれらのリガンドのごとき免疫応答を刺激することが知られている他の作用剤を、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用を阻害する作用剤と一緒に使用することができる。例えば、PD−L1を阻害する作用剤(例えば、PD−L1に対するブロッキング抗体)をPD−L2を阻害する作用剤(例えば、PD−L2に対するブロッキング抗体)と一緒に使用することができる。PD−L1は同時係属米国出願第09/644934号;国際公開第WO01/14557号;Dong, H. et al. (1999) Nat. Med. 5:1365−1369;およびFreemen, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034(各内容を参照により本明細書に一体化させる)に記載されている、さらなるPD−1リガンドである。
【0305】
E.PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用のモジュレーションによりモジュレーションされるサイトカインの同定
本明細書記載のPD−L2分子を用いて、PD−L2活性またはPD−L2とその本来の結合パートナー、例えばPD−1との相互作用のモジュレーションに応答した免疫細胞により産生されるサイトカイン、あるいは産生がそのような免疫細胞中で促進されるサイトカインを同定することができる。T細胞は1次活性化シグナルで最適以下にインビトロ刺激され得、例えば、T細胞は、ホルボールエステル、抗CD3抗体または好ましくはMHCクラスII分子を随伴した抗原で刺激されることができ、刺激性形態のGL50抗原により同時刺激シグナルを与えられることができ、例えばGL50ポリペプチドをコードしその表面でペプチドを発現させる核酸でトランスフェクションされた細胞により、または可溶性、刺激性の形態のペプチドにより、同時刺激シグナルを与えられることができる。次いで、細胞を、PD−L2発現細胞と接触させ、そして/あるいはPD−L2−PD−1相互作用を阻害する作用剤(例えば、PD−L2に対する抗体、またはPD−L2に対する抗体とPD−L1に対する抗体との組み合わせ)で処理することができる。培地中に放出された知られたサイトカインを、ELISAにより、あるいはサイトカインをブロックして免疫細胞の増殖または該サイトカインにより誘導される他の細胞タイプの増殖を阻害する抗体の能力により同定することができる。例えば、IL−4 ELISAキットはIL−7ブロッキング抗体の場合と同様ジェンザイム(ケンブリッジ、マサチューセッツ)から入手できる。IL−9およびIL−12に対するブロッキング抗体は、ジェネティクス・インスティテュート(ケンブリッジ、マサチューセッツ)から入手できる。次いで、サイトカインのプロファイルに基づいてPD−L2活性またはPD−L2とPD−1との相互作用の刺激またはブロッキングの効果を調べることができる。
【0306】
上記のインビトロでの免疫細胞同時刺激アッセイを、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用のモジュレーションによりモジュレーションされうる新規サイトカインを同定する方法に使用することができる。例えば、CD28/CTLA4経路の刺激がIL−2分泌を促進すると思われる場合、ICOS経路の刺激はIL−10分泌を促進すると思われる(Hutloffら、199、Nature 397:263)。同時刺激により誘導される特定の活性、例えば免疫細胞増殖を既知サイトカインに対するブロッキング抗体の添加により阻害できない場合、その活性は未知サイトカインの作用から生じるものである可能性がある。同時刺激後、慣用的方法によりこのサイトカインを培地から精製し、免疫細胞増殖を誘導する活性によりその活性を測定することができる。
【0307】
寛容の誘導においてある一定の役割を演じ得るサイトカインを同定するために、上記のインビトロT細胞共刺激性アッセイを使用することができる。この場合、T細胞は、1次活性化シグナルを与えられ、選択されたサイトカインと接触させられるが、共刺激性シグナルは与えられない。免疫細胞を洗浄し、休止させた後、細胞を1次活性化シグナルおよび共刺激性シグナルの両方により再攻撃する。免疫細胞が応答(例、サイトカインを増殖または生産)しない場合、それらは寛容にされており、サイトカインは寛容の誘導を妨害していない。しかしながら、免疫細胞が応答する場合、寛容の誘導はサイトカインにより妨害されている。寛容の誘導を妨害し得るそれらのサイトカイン類は、移植レシピエントまたは自己免疫疾患対象において寛容を誘導するより有効な手段としてBリンパ球抗原をブロックする試薬と共にインビボでのブロックに関して標的化され得る。例えば、PD−L2活性またはPD−L2−PD−1相互作用を促進する作用剤とともにサイトカインブロッキング抗体を投与することができる。
【0308】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、実施例は限定的なものとして解釈されるべきではない。本出願中に引用される全文献、特許および公開された特許出願の内容ならびに図および配列表を参照により本明細書に一体化させる。
【0309】
実施例
下記の材料および方法は実施例1〜9に使用された。
【0310】
材料および方法
マウス
Hoffman−La Roche, Nutley, NJにより、IAdに関連してOVAペプチド(323−339)に特異的なTCR導入遺伝子(DO11.10)が提供された。Taconic Farms (Germantown, NY)からBalb/cマウスを得た。すべてのマウスは生後6〜12週目のものを用いた。協会のガイドラインに従ってマウスを世話した。
【0311】
分子クローニング
PD−L1に対して38%のアミノ酸同一性を有するものとして同定されたGenbank受託番号AF142780(本明細書において、マウスPD−L2ともいう)をクエリー配列として、ヒトPD−L1蛋白配列を用いて、Center for Biotechnology Information (NCBI)の非重複データベースのBLAST検索を行なった。PD−L1は、同時係属の米国出願第09/644,934号; 国際公開第WO 01/14557号; Dong, H. et al. (1999) Nat. Med. 5:1365−1369; および Freeman, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034(各内容を参照により本明細書に一体化させる)に記載されているPD−1リガンドである。5’−dGtcgaccaccatgctgctcctgctgccgata−3’ (配列番号:7)および5’−dGTCGACTCACTAGATCCTCTTTCTCTGGATTATCAC−3’ (配列番号:8)をプライマーとして用いるPCRによりAF142780コーディング領域を増幅し、pEF6(Invitrogen, Carlsbad, CA)中にクローン化した。NCBI ESTデータベースの検索により、ネズミPD−L2に対して相同性がある2つのヒト胎児心臓EST(GenBank受託番号AA247117およびAA247128)が同定された。5’−dGTACATAATAGAGCATGGCAGCA−3’ (配列番号:9)および5’−dCCACCTTTTGCAAACTGGCTGT−3’ (配列番号:10)をプライマーとして用いて101bpの領域を増幅した。PCR生成物をビオチン標識し、pAXEFベクター中のヒト胎盤cDNAライブラリー(Freeman, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med.192:1027−1034)からCloncapture(Clontech, Palo Alto, CA)から完全長cDNAを単離するために使用した。完全長ヒトPD−L2 cDNA配列はGenBankに寄託されている(受託番号が付与される)。
【0312】
融合蛋白および細胞トランスフェクション
Ig融合蛋白は、ネズミIgγ2aのヒンジ−CH2−CH3ドメインに連結された受容体の完全な細胞外領域からなっており(Fc受容体および補体結合をブロックする4つの点突然変異を伴う)、その結果、Ig(γ2a)融合物が得られる(Duncan, A.R. et al. (1988) Nature 332:563−564; Morgan, A. et al. (1995) Immunology 86:319−324)。対照Igは、ネズミIgγ2aに連結したオンコスタチン−Mリーダー配列からなる。これらの組換え蛋白は安定にトランスフェクションされたCHO細胞系において産生され、プロテインA−セファロースを用いて馴らし培地から精製された。pEF6中のネズミPD−L2 cDNAをScaIにより線状とし、ホスホグリセラートキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にあるプロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド構築物とともにCHO.I−AdまたはCHO.I−Ad.mB7−2細胞中に同時エレクトロポレーションした。pAXEF中のヒトPD−L2 cDNAをApaIで線状にし、ホスホグリセラートキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にあるプロマイシン耐性遺伝子とともにCHO.K1細胞中に同時トランスフェクションした。10μg/mlプロマイシン中でトランスフェクション体を選択し、hPDI.Igで染色し、ソーティングし、次いで、限界希釈法によりクローン化した。
【0313】
ノーザンブロット分析
製造者の指示に従って、マウスおよびヒトの多数の組織のノーザンブロット(Clontech, Palo Alto, CA)を、QuikHyb (Stratagene, La Jolla, CA)中の32P−dCTP放射性標識cDNAプローブでプローブした。ヒトPD−L2プローブは、コーディング領域および3’UTR配列を含む1.2kbのXbaIフラグメントからなっていた。マウスPD−L2プローブは、コーディング領域を含む444kbのKpnI/EcoRV cDNAフラグメントからなっていた。2X SSC, 0.1% SDS中室温で、次いで、0.1X SSC, 0.1% SDS中、65℃で、ブロットを室温で2回洗浄し、そしてラジオオートグラフィーにより試験した。
【0314】
フローサイトメトリー
PD−L2を検出するために、5x104個のトランスフェクションされた細胞を、5μg/mlのヒトPD−1Ig(hPD−1.Ig)(Genetics Institute, Cambridge, MA)とともにインキュベーションし、ヤギ抗−マウスIgG2a−フィコエリスリン(PE)(Southern Biotechnology Associates Inc, Birmingham, AL)で発色させた。さらに、5μg/mlの抗−IAd−PEまたはB7.2−PE(Pharmingen, San Diego, CA)で別々に染色した。
CD4+T細胞をビオチン化抗−PD−1(またはビオチン化抗−CD28(Pharmingen)もしくはビオチン化抗−CD25(Pharmingen)とともにインキュベーションし、ストレプトアビジン−PE(Pharmingen)で染色した。Pharmingenからすべてのイソタイプ対照を得た。各工程後、PBS/1% BSA/0.02% アジ化ナトリウムで細胞を3回洗浄した。最終インキュベーション後、細胞を1%パラホルムアルデヒドで固定した。FACSCalibar(Becton Dickinson, Mountain View, CA)にて1万のイベントを分析した。すべてのイソタイプ対照をPharmingenから得た。
【0315】
T細胞の活性化
活性化された抗原に特異的なT細胞を得るために、DO11.10マウスから脾臓細胞を調製し、Tris−NH4Clで処理して赤血球を枯渇させた。10% FCS (Sigma, St Louis, MO), 2 mM L−グルタミン, 100 U/ml ペニシリン,l00 mg/ml ストレプトマイシン, 250 ng/ml アンホテリシンB, l0 mM Hepes, 50 pM 2−ME (すべてLife Technologiesから得た) および 15 mg/ml of ゲンタマイシン (BioWhittaker, Walkersville, MD)を補足したRPMI 1640(Life Technologies, Grand Island, NY)中で、1μg/mgのOVAペプチド(Analytical Biotechnology Services, Boston, MA)とともに細胞を72時間培養した。磁気活性化細胞ソーティング分離カラム(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用いるポジティブセレクションによりCD4+T細胞を精製して、98%よりも高純度とした。再刺激の前に細胞を一晩休止させた。
【0316】
T細胞のビーズ刺激
抗−CD Ab(2C11; Pharmingen, La Jolla, CA)、mPD−L2.Igおよび対照Igをポリウレタン被覆トシル−活性化Dynabeads(Dynal, Lake Success, NY)に共有結合させた。一定の最適以下の抗−CD3 Ab濃度(全結合蛋白の60%)およびmPD−L2.Igまたは対照Ig(全結合蛋白の40%)を用いてビーズを調製した。ビーズは、ビーズ107個あたり5μgの蛋白結合能を有する。細胞エンリッチメントカラム(R & D Systems, Minneapolis, MN)を用いるネガティブセレクションによりBalb/cリンパ節からT細胞を精製した。示された被覆トシルビーズ:細胞比を2:1として、96ウェルプレート中でウェル1個あたり0.5〜1x105個のT細胞を培養した。72時間の培養中最後の10時間における[3H]−チミジン取りこみにより増殖を測定した。
【0317】
T細胞のCHO細胞刺激
50μg/mlのマイトマイシンC(Bristol Laboratories, Princeton, NJ)とともに37℃で16時間インキュベーションすることにより、トランスフェクションされたCHO細胞の増殖を阻害した。インキュベーション期間の終わりに、PBS中の10mM EDTAとともに細胞を収穫し、2回洗浄し、氷上で1時間放置した。次いで、細胞を3回洗浄し、培地に再懸濁した。105個のすでに活性化されているCD4+T細胞を、種々の濃度のOVAペプチドおよび104個のマイトマイシン処理されたCHOトランスフェクション対とともに培養した。増殖をアッセイするために、培養物を48時間インキュベーションし、1μCi/ウェルの[3H]チミジン(New England Nuclear, Boston, MA)で少なくとも6時間のインキュベーション期間の間パルスした。
【0318】
サイトカインELISA
培養後種々の時点で上清の一部を取った。Pharmingenから得たmAbsおよび組換えサイトカイン標準を用いてIL−2、IL−4、IFN−γおよびIL−10レベルを分析した。検出限界は以下のおり:IL−2:20pg/ml;IL−4:40pg/ml;IFN−γ:100pg/ml;およびIL−10:200pg/ml。
【0319】
RNAase保護アッセイ(RPA)
種々のCHO細胞トランスフェクション体および0.01μg/ml OVAペプチドでCD4+T細胞を再度刺激した。48時間後、細胞を取り、TRIzolR試薬(Life Technologies, Grand Island, NY)を用いてmRNAを単離した。製造者(Pharmingen, San Diego, CA)の指示に従ってRiboQuantマルチポアキット mCK1を用いてRNAase保護アッセイにより5μgのmRNAをサイトカインレベルに関して分析した。
【0320】
細胞周期分析
上記のごとく0.01μg/mlペプチドおよびCHO細胞トランスフェクション体でCD4+T細胞を再刺激した。培養36時間後、細胞を回収し、抗−CD4−FITCで染色した。細胞をPBSで洗浄し、氷上で70%エタノールで1時間固定し、次いで、10μg/ml RNase(Sigma, St. Louis, MO)および50μg/mlヨウ化プロピジウム(Sigma)を含有するPBSに再懸濁した。染色から1時間以内にFACSalibarを用いて分析を行なった。
【0321】
実施例1:ヒトおよびマウスのPD−L2 cDNAの同定および特徴付け
この実施例において、ヒトPD−L2およびマウスPD−L2をコードする遺伝子の同定および特徴付けを説明する。
【0322】
ヒトPD−L2 cDNAの単離
本発明は、少なくとも一部には、本明細書でヒトPD−L2と称する新規ポリペプチドをコードするヒト遺伝子の発見に基づく。ヒトPD−L2 cDNAはヒト胎盤cDNAライブラリーから、ヒトEST AA247117をプローブとして用いて単離された。ヒトPD−L2の全配列を決定し、ヒト「PD−L2」と呼ばれる読み取り枠を含むことがわかった。
ヒトPD−L2をコードするヌクレオチド配列を図1および配列番号:1に示す。この核酸によりコードされるポリペプチドは約273個のアミノ酸を含み、図1および配列番号:2に示すアミノ酸配列を有する。配列番号:1のコーディング領域(読み取り枠)を配列番号:3に示す。
マウスPD−L2をコードするヌクレオチド配列を図2および配列番号:4に示す。この核酸によりコードされるポリペプチドは約247個のアミノ酸を含み、図2および配列番号:5に示すアミノ酸配列を有する。配列番号:4のコーディング領域(読み取り枠)を配列番号:6に示す。
【0323】
ヒトおよびマウスのPD−L2分子の分析
シグナルペプチドの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ1〜19にアミノ酸配列中のシグナルペプチドドメインが同定された(図3)。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ1〜19にアミノ酸配列中のシグナルペプチドドメインがさらに同定された(図3)。
また、IgVドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ20〜120(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ1〜101のアミノ酸配列中にIgVドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ20〜120(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ1〜101のアミノ酸配列中にIgVドメインが同定された。
さらに、IgCドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ121〜219(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ102〜200のアミノ酸配列中にIgCドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ121〜219(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ102〜200のアミノ酸配列中にIgCドメインが同定された。
さらに、細胞外ドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ1〜219(図1)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ1〜200のアミノ酸配列中に細胞外ドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ1〜219(図2)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ1〜200のアミノ酸配列中に細胞外ドメインが同定された。
さらに、膜貫通ドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ220〜243(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ201〜224のアミノ酸配列中に膜貫通ドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ220〜242(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ201〜223のアミノ酸配列中に膜貫通ドメインが同定された。
さらに、細胞質ドメインの存在に関して他のB7ファミリーのメンバーと比較することによりヒトおよびマウスのPD−L2の各アミノ酸配列を分析した。これらの分析により、ネイティブなヒトPD−L2(配列番号:2)の残基ほぼ244〜273(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ225〜254のアミノ酸配列中に細胞質ドメインが同定された。これらの分析により、ネイティブなマウスPD−L2(配列番号:5)の残基ほぼ243〜247(図3)および推定成熟ポリペプチド中の残基ほぼ224〜228のアミノ酸配列中に細胞質ドメインが同定された。
マウスPD−L2蛋白は、マウスPD−L1に対して38%のアミノ酸同一性を有する(図6参照)。マウスおよびヒトのPD−L2は70%のアミノ酸同一性を有し(図6)、ヒトおよびネズミのB7−1またはB7−2の間の46〜50%よりも高い。
【0324】
実施例2:細菌細胞における組換えPD−L2ポリペプチドの発現
この実施例において、ヒトPD−L2がE. coliにおいてグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合蛋白として発現され、該融合蛋白が単離され特徴付けされる。特別には、PD−L2がGSTと融合され、この融合蛋白がE. coli、例えばPEB199株において発現される。PEB199株におけるGST−PD−L2融合蛋白の発現をIPTGで誘導する。誘導されたPEB199株の粗細菌溶解物から、グルタチオンビーズ上のアフィニティークロマトグラフィーにより組換え融合ポリペプチドを精製する。細菌溶解物から精製されたポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて、得られた融合ポリペプチドの分子量を決定する。
【0325】
実施例3:PD−1へのPD−L2の結合
AF142780、マウスPD−L2 cDNA、または対照マウスPD−1リガンドを含有する発現プラスミドでCOS細胞をトランスフェクションした。72時間後、0.5mM EDTAを含有するPBS中、37℃で30分インキュベーションすることによりトランスフェクションしたCOS細胞を剥離させた。
種々のIg融合蛋白に結合するPD−L2発現COS細胞の能力を試験した。PD−L2でトランスフェクションされたCOS細胞によるIgG2a(対照Ig)、ICOS−IgG、およびPD−1−Igの結合についてのFACS分析は、IgG2aまたはICOS−IgGのいずれもがPD−L2または対照PD−1リガンドにより結合されないことを示した。しかしながら、PD−1−Igは、PD−L2および対照PD−1リガンドへの結合が示された(図4)。
ヒトPD−L2 cDNAを用いる実験により、マウスPD−L2 cDNAを用いて得られた結果と同様の結果が得られた。
CHO細胞を用いる実験も行なった。フローサイトメトリーの研究により、hPD−1−IgがPD−L2で安定にトランスフェクションされたCHO細胞を認識することが示されている(図7)。対照トランスフェクション体(CHO−IAd、CHO−IAd/B7.2)への結合が存在しないので、この染色は特異的である。PD−L2でトランスフェクションされたCHO細胞はCTLA4−Ig、CD28−IgまたはICOS−Igでの染色を示さなかった。IgVエクソンが欠失されているネズミPD−L2の別スプライシングされた変種も単離した。この変種はPD−1−Igに結合せず、IgVドメインがPD−1へのPD−L2の結合に必要であることが示された。
【0326】
実施例4:PD−L2に対する全ヒト抗体の取得
この実施例において、ヒト免疫グロブリンフレームワーク遺伝子が導入されているマウスにおいてPD−L2に対する全ヒト抗体を作成する。標準的的方法、例えば、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(参照により本明細書に一体化させる)に従ってトランスジェニックマウスを作成、あるいは購入する。公表された手順(Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, Robertson, E.J. ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987; Zijlstra et al. (1989) Nature 342:435−438; and Schwartzberg et al. (1989) Science 246:799−803, 参照によりそれぞれを本明細書に一体化させる)に従って胚性幹細胞を処理する。Sambrook, J. et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(参照により本明細書に一体化させる)に従ってDNAクローニング手順を行なう。例えば製造者の指示に従ってAplied Bio Systemsオリゴヌクレオチド合成装置によりオリゴヌクレオチドを合成、あるいは購入する。
精製または組換えPD−L2あるいは少なくともPD−L2の細胞外ドメインの免疫原部分を含む融合蛋白を用いてトランスジェニックマウスを免疫する。100μgのリン酸塩緩衝化セイライン(PBS)中約400μgのPD−L2を各マウスに腹腔内注射する。眼窩後部からの採血により血清試料を集める。
間接的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いてPD−L2に対する抗体の反応性および特異性を評価する。いくつかの免疫グロブリンスーパーファミリー分子を対照(例えば、CTLA4およびCD28)として試験して、PD−L2に対する抗体の抗体特異性を分析する。マウス免疫グロブリンに対して交差反応性を示さないヒトIgMおよびヒトIgGサブクラスに対して特異的な酵素抱合体により、PD−L2に結合するヒトフレームワーク領域を有する抗体を検出する。簡単に説明すると、PBS中5μg/mlのPD−L2にて、37℃で一晩ウェルを被覆することにより、PVCマイクロタイタープレートをPD−L2で被覆する。PBS,5%血清,0.5%ツイン−20で血清試料を希釈し、ウェル中で室温にて1時間インキュベーションし、次いで、抗−ヒトIgG FcおよびIgG F(ab’)−セイヨウワサビペルオキシダーゼまたは抗−ヒトIgM Fc−セイヨウワサビペルオキシダーゼを同じ希釈液中でインキュベーションする。室温で1時間後、ABTS基質(Sigma, St. Louis, Mo.)の添加により酵素活性を測定し、30分後に415〜490nmを読む。同じマウスからのプレ−免疫血清試料中の、同じ標的抗原に対するヒト抗体力価も試験する。
適切な抗体力価を有するマウスから単離された脾臓細胞を集める。脾臓細胞を適当な融合パートナー(例えば、ミエローマ細胞)と融合させてハイブリドーマを作成する。Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)(参照により本明細書に一体化させる)に従って、ハイブリドーマおよび抗体を処理する。
【0327】
実施例5:PD−L2に対する抗体の取得
抗−ヒトPD−L2抗体
マウスのcDNA免疫により抗−DP−L2抗体を調製することもできる。抗−ヒトPD−L2抗体を製造するために、0.9%セイライン中10mMのカルジオトキシン(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)50μlを各後足の前けい骨筋に注射することによりメスのBalb/cマウス(Harlan Sprague−Dawley, Inc., Indianapolis, IN)をcDNA免疫用に調製した。5日後、0.9%セイライン中1mg/mlのpAXEF中の精製hPD−L2 cDNA50μlを各マウスの再生している各前けい骨筋に注射した。cDNA免疫を2週間間隔で2回繰り返した。次いで、マウスを4週間休息させ、その後、マウス1匹あたり100μgのcDNAを3〜4週間間隔で3回追加免疫した。融合の5日前に、融合用に選択された1匹のマウスにcDNAを腹腔内注射して追加免疫した。脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞と融合させ、クローン化させ、次いで、hPD−L2−mIgG2a融合蛋白との反応性に関してハイブリドーマをELISAによりスクリーニングし、その後、hPD−L2でトランスフェクションされた300.19およびCOS細胞の細胞表面染色を行なって、未トランスフェクション細胞およびhPD−L1でトランスフェクションされた細胞との反応性の欠如を調べた。
9種のマウス抗−ヒトPD−L2モノクローナル抗体(mAbs)を単離した。PD−1/PD−L2相互作用をブロックするこれらの抗体の能力を決定するために、抗−PD−L2 mAbsをPD−L2でトランスフェクションされた細胞とともにプレインキュベーションした。PD−L2でトランスフェクションされた細胞へのビオチン化PD−1−Igの結合を減じるmAbの能力として、相互作用の阻害を測定した。最良のmAbsは抗体24F.10C12(本明細書において10C12ともいう)および24F7G12(本明細書において7G12ともいう)であった。結果は次のとおり:
【0328】
抗−マウスPD−L2抗体
抗−マウスPD−L2抗体を製造するために、0.9%セイライン中10mMのカルジオトキシン(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)100μlを各後足の前けい骨筋に注射することによりメスのLewis株ラット(Harlan Sprague−Dawley, Inc., Indianapolis, IN)をcDNA免疫用に調製した。5日後、0.9%セイライン中1mg/mlのpEF6中の精製ネズミPD−L2 cDNA100μlを各マウスの再生している各前けい骨筋に注射した。cDNA免疫を2〜3週間間隔で3回繰り返した。次いで、1〜5x107個のCHO−mPD−L2トランスフェクション体で4回、2〜5週間間隔でラットを免疫した。融合の5日前に、融合用に選択された1匹のラットにcDNA(200μl)および細胞(5x107個)の両方を腹腔内注射して免疫した。脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞と融合させ、クローン化させ、次いで、mPD−L2でトランスフェクションされた300.19およびCOS細胞の細胞表面染色によりスクリーニングし、未トランスフェクション細胞およびmPD−L1でトランスフェクションされた細胞との反応性の欠如を調べた。mPD−L2を特異的に認識するモノクローナル抗体が産生された。
【0329】
実施例6:PD−L2の発現
PD−L2の発現を分析するために、種々の組織および活性化抗原提示細胞におけるノーザンブロットハイブリダイゼーションによりmRNA発現を分析した。ヒトおよびネズミのPD−L2 mRNAは正常胎盤で多く発現されており、正常脾臓、リンパ節および胸腺において少なく発現されている。PD−L2はヒト心臓においても発現されているが、マウス心臓では低レベルで発現されている。PD−L2が発現される他の組織はヒト膵臓、肺および肝臓である。PD−L2 mRNAは刺激されていないヒト単球では検出されなかったが、IFN−γ刺激によりアップレギュレーションされた。PD−L1のアップレギュレーション(Freeman, G.J. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027−1034)と比較すると、PD−L2の誘導はキネティクスにおいてわずかに遅れた。ネズミ腫瘍細胞系のノーザンブロット分析により、PU5−1.8(ミエロイドリンパ腫)、RAW264.7(マクロファージリンパ腫)、R1.1(Tリンパ種)、L1210(リンパ球性白血病)、P338D1(単球/マクロファージリンパ腫)、およびP815(肥満細胞種)のごときリンパ球起源の系におけるPD−L2発現が明らかとなった。線維芽細胞系(M−MSV Balb/3T3、K−Balb、LM)およびP19奇形癌腫細胞系においてPD−L2はあまり発現されないか、あるいは全く発現されなかった。PD−L2は肝細胞種(Hepa1−6)および神経芽腫(NB41A3)細胞系においても発現されている。
【0330】
実施例7:PD−L2−PD−1相互作用はTCRにより媒介される応答を阻害する
T細胞活性化におけるPD−L2−PD−1経路の役割を調べるために、DynalビーズによるT細胞活性化系を用いた。Balb/cリンパ節からの精製T細胞を、抗−CD3プラス対照.IgまたはmPD−L2.Igで被覆したビーズで活性化させた。3H−チミジン取りこみにより増殖を測定した。抗−CD3プラスmPD−L2.Igで被覆したビーズで活性化されたT細胞は、抗−CD3プラス対照.Igで活性化された細胞と比較して著しい増殖の低下を示した(図8)。かくして、PD−L2Tによる細胞上のPD−1の利用はT細胞増殖の阻害を導く。
抗原特異的シグナルを研究するために、PD−L2およびI−Adを同時発現するCHO細胞ならびに同様のレベルのI−Adのみを発現するCHO細胞(図7)を、DO11.10CD4+T細胞を活性化させる能力に関して比較した。活性化後にPD−1がアップレギュレーションされるので、前もって活性化されたDO11.10T細胞を用いて最大PD−L2相互作用を可能ならしめた。前もって活性化されたCD4+T細胞を一定濃度範囲のOVA(323−339)ペプチドおよびマイチマイシンC処理CHOトランスフェクション体とともにインキュベーションした。図9からわかるように、前もって活性化されたDO11.10CD4+T細胞は、CHO.I−Adにより提示されたOVAペプチドに対して中庸の増殖応答を与えた。対照的に、PD−L2存在下においてこの応答は有意に低下した。インターロイキン(IL)−4、IFN−γおよびIL−10産生もまた著しく低下した(図9)。これらの活性化条件下ではIL−2は検出されなかった。これらのデータは、PD−1−PD−L2相互作用がTCRにより媒介される増殖およびサイトカイン産生を阻害できることを示すものである。PD−1−PD−L2経路の阻害効果および非リンパ器官におけるPD−L2の発現は、自己免疫反応の制御における役割を示すものである。
【0331】
実施例8:PD−L2はTCR−CD28シグナルを阻害しうる
最適T細胞クローン増殖にはTCRおよびCD28両方のシグナルが必要なので、TCRプラスCD28ならびにPD−L2−PD−1シグナル間の相互作用を調べた。この問題を解決するために、下記のCHO細胞を用いた:CHO.I−Ad.B7−2およびCHO.I−Ad.B7−2.PD−L2。すでにOVAで活性化されているDO11.10CD4+T細胞を刺激するこれらのCHOトランスフェクション体の能力を比較した。I−AdおよびB7−2の発現はこれらのCHOトランスフェクション体上で同様に高かった(図7)。PD−1.Ig結合により測定されたPD−L2発現レベルは高かった。予想とおり、B7−2の導入は、すべての抗原濃度においてT細胞による増殖応答の増加を導き、低い抗原濃度において最も著しい刺激がみられた(図10)。CHO細胞上のPD−L2の同時発現は、低いペプチド濃度(0.01μg/mlおよび0.001μg/ml)におけるTCRおよびB7−2により媒介される増殖応答を阻害した(図10)。0.01μg/mlのペプチド濃度では、PD−L2はTCR−B7−2により媒介されるサイトカイン産生を有意に阻害し、増殖の阻害と矛盾しなかった(図11)。ごく弱い増殖の阻害が存在した0.1μg/mlのペプチド濃度では、DO11.10CD4+T細胞がペプチドおよびCHO.I−Ad.B7−2.PD−L2トランスフェクション体とともに培養された場合にサイトカイン産生が阻害された(図12)。それゆえ、PD−L2によるPD−1の利用はTCR−CD28により媒介されるサイトカイン産生刺激をダウンレギュレーションしうる。
低下したサイトカイン産生が低下したmRNAレベルによるものであるかどうかを決定するために、RNAase保護アッセイによりサイトカインmRNAレベルを測定した。CHO.I−Ad.B7−2により提示された0.01μg/ml OVAペプチドでの刺激後に、インターロイキン−4、IL−10、IL−13、IL−2、IL−6およびIFN−γ mRNAは、すでに活性化されているDO11.10CD4+T細胞において容易に検出された。しかしながら、CHO.I−Ad.B7−2トランスフェクション体中へのPD−L2の導入は、Th1およびTh2両方のサイトカインに関してmRNAレベルを有意に低下させた。すでに活性化されているT細胞を単独で、あるいはCHO.I−Adにより発現されるペプチドとともにインキュベーションした場合に、サイトカインmRNAの発現は最低であった。これらの結果は、抗原刺激が弱いかあるいは限定的である場合におけるB7−CD28シグナルに拮抗するPD−L2−PD−1経路の能力をさらに示すものである。
低い抗原濃度におけるPD−L2−PD−1経路の阻害能が異なる抗原濃度におけるCD28およびPD−1発現レベルの変化に関連しているかどうかを調べるために、PD−1およびCD28の表面発現を調べた。表1は、異なった活性化条件に置いた後の、DO11.10CD4+T細胞上のPD−1、CD28およびCD25の平均蛍光強度を示す。
【0332】
【表1】
【0333】
新たに単離されたDO11.10CD4+T細胞はCD28を発現したが、PD−1もCD25も発現しなかった。脾臓APCsにより提示される1μg/mlのペプチドで刺激されたT細胞はCD28を中庸にアップレギュレーションし、PD−1およびCD25を強くアップレギュレーションした。すでに活性化されているDO11.10CD4+T細胞をCHO.I−Ad.B7−2により提示される種々の濃度のペプチドで再刺激した後、より高いペプチド濃度においてCD28およびCD25の発現がCD4+T細胞上で増大した。対照的に、PD−1発現は低いペプチド濃度で活性化されたT細胞上で最高であり、より高いペプチド濃度においては減少した。より低い抗原用量におけるより高いPD−1発現は、PD−L2−PD−1経路が弱い抗原応答を弱体化させうる機構をさらに示唆する。
【0334】
実施例9:PD−1−PD−L2経路の作用機構
CTLA−4の架橋はネイティブなT細胞において細胞周期進行を阻害することが示されている(Krummel, M.F. and Allison, J.P. (1996) J. Exp. Med. 183:2533−2540; Walunas, T.L. et al. (1996) J. Exp. Med. 183:2541−2550)。アポトーシス中のネズミ細胞系からPD−1が単離されたので、PD−1:PD−L2経路の可能な作用機構は,プログラムされた細胞死(例えば、活性化により誘導される細胞死またはAICD)を増加させることである可能性がある。この問題に取りかかるために、DO11.10CD4+T細胞を0.01μg/mlのペプチドおよび種々のCHOトランスフェクション体で再刺激し、細胞周期進行を分析した。48時間後、細胞を回収し、CD4−FITCで染色し、透過性にし、次いで、ヨウ化プロピジウムとともにインキュベーションして、G0/G1、S/G2およびサブ−2倍体(sub−diploid)集団を分析した。CHO−IAdまたはCHO−IAd/PD−L2により提示されるペプチドで再刺激されたCD4+T細胞はいずれも大集団のサブ−2倍体集団を有し、アポトーシスが示された(図13)。これらの結果はアネキシン染色により確認された。CHO−IAdにより提示されるペプチド(1μg/ml)によりCD4+T細胞が刺激される培養物において、S/G2期の細胞数が増加しており、細胞がサイクル中にあることが示された。I−Adトランスフェクション体中へのPD−L2の導入は、G0/G1期の細胞数の増加を導き、細胞周期停止が示唆された。
次いで、B7−2およびPD−L2シグナル存在下での細胞周期進行を比較した。CHO.I−Ad.B7−2により提示される0.01μg/mlのペプチドにより刺激されたCD4+T細胞は、S/G2期の細胞数の増加およびサブ−2倍体集団数の減少を示し、細胞がサイクル中にあり、B7−CD28同時刺激によりアポトーシスからレスキューされることが示された(図14)。高いペプチド濃度におけるCHO.I−Adトランスフェクション体に関して見られるのと同様に、B7−2トランスフェクション体中へのPD−L2の導入は、G0/G1期の細胞数の増加およびS期の細胞数の減少を導いた。B7−2およびB7−2.PD−L2刺激T細胞間のアポトーシス細胞集団に違いはなく、PD−1架橋は細胞死の増加を導かなかったことが示された。
【0335】
実施例10:PD−1:PD−リガンド相互作用の阻害によるT細胞活性化の刺激
上に示したように、PD−1を介するシグナリングは強力なTCR/CD28同時刺激シグナルにより支配されており;PD−1シグナリング経路は中庸のTCR/CD28同時刺激シグナルを阻害し、最初はT細胞増殖の減少なしにサイトカイン産生が低下する。TCR/CD28同時刺激シグナルが弱まるにつれ、PD−1経路が支配的となり、サイトカイン産生の大幅な減少が増殖の低下とともに起こる。したがって、PD−L1またはPd−L2との相互作用の阻害によりPD−1経路の阻害がT細胞活性化を促進するかどうかを調べるために、弱く機能する抗原提示細胞(APCs)(すなわち、弱いTCR/CD28同時刺激を有する抗原提示細胞)を用いて混合リンパ球反応(MLRs)を行なった。
成熟樹状細胞は強力なAPCsである。しかしながら、IL−10での処理はそれらの能力を低下させる。以前の報告は、IL−10が細胞APC能を大幅に低下させることを示しており、このことがMHC、B7−1およびB7−2の発現低下によるものであるとしている。しかしながら、本明細書の実験は、低下は中庸であり、そのうえ、IL−10処理された樹状細胞はPD−L1およびPD−L2を発現することを示すものである。
ヒト末梢血単球をIL−4およびGM−CSF中で培養することにより未成熟ミエロイド樹状細胞を単離した。IL−1β、TNF−α、IL−6およびPGE2の炎症性カクテルへの未成熟樹状細胞の曝露は、APCsとして機能する成熟樹状細胞の発達を誘導する。しかしながら、成熟期にある炎症性サイトカインへのIL−10の添加は、1/6ないし1/3しか機能しないAPCsを生じさせる。
上で一般的に説明したようにして、PD−L1および/またはPD−L2に対する抗体、あるいは対照抗体の存在下において、IL−10処理樹状細胞をAPCsとして用いてT細胞活性化アッセイ(MLRs)を行なった。IL−10処理樹状細胞プラス同種T細胞への抗−PD−L1またはPD−L2 mAbの添加は、対照IgG処理培養物と比較した場合、3倍のT細胞増殖の増加を生じさせた(図15)。抗−PD−L1および抗−PD−L2抗体の組み合わせは、いずれかの抗体のみの場合に見られるよりも大幅な刺激の増大を生じさせた(図16)。この刺激は、PD−1へのPD−L1および/またはPD−L2の結合により媒介される免疫阻害性シグナルのブロックから予想される結果と矛盾しない。
【0336】
均等物
当業者は、常套的な実験異常のことを行なわずに、本明細書記載の本発明の個々の具体例に対する均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。かかる均等物は請求の範囲により包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、ヒトPD−L2のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列は配列番号:1の核酸1〜1223に対応する。アミノ酸配列は配列番号:2のアミノ酸1〜273に対応する。ヒトPD−L2遺伝子の5’または3’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号:3に示す。
【図2】図2は、マウスPD−L2のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列は配列番号:4の核酸1〜1655に対応する。アミノ酸配列は配列番号:5のアミノ酸1〜247に対応する。マウスPD−L2遺伝子の5’または3’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号:6に示す。
【図3】図3は、ヒトおよびマウスPD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列を示し(それぞれ配列番号:2および配列番号:5)、シグナルペプチド、IgV、IgC、細胞外、膜貫通、および細胞質ドメインを示す。
【図4】図4は、マウスPD−L2または対照マウスPD−1リガンドでトランスフェクションされたCOS細胞へのIgG2a(対照Ig)、ICOS−IgG、および対照PD−1−Igの結合のFACS分析結果を示す。
【図5】図5は、マウスおよびヒトPD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列(それぞれ配列番号:5および配列番号:2)の並置比較を示す。2つの配列間の同一アミノ酸が示されている。
【図6】図6は、マウスPD−L2(配列番号:5)、ヒトPD−L2(配列番号:2)、マウスPD−L1(配列番号:11)、およびヒトPD−L1(配列番号:12)のアミノ酸配列の並置比較を示す。
【図7】図7はPD−L2へのPD−1の結合を示す。I−AdのみまたはI−AdおよびB7−2を発現するCHO細胞はマウスPD−L2でトランスフェクションされず、あるいは安定にトランスフェクションされなかった。細胞をhPD−1−Igで染色し、PE−ヤギ抗−マウスIgG2aで染色(太線)した。PE−抗−I−AdまたはPE−抗−B7−2で(太線)別個にCHO細胞を染色した。細線はイソタイプ対照モノクローナル抗体での染色を示す。1万のイベントを分析した。
【図8】図8は、TCRにより媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。BALB/cリンパ節からの精製T細胞を、2:1のビーズ:細胞比で、抗−CD3+対照Igまたは抗−CD3+mPD−L2−Igで被覆したトシルビーズで刺激した。72時間後に増殖を測定した。これらのデータは8回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図9】図9は、TCRにより媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。DO11.10トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞をOVAペプチド(1μg/ml)で活性化した。CD4+T細胞を単離し、一晩休止させた。前もって活性化させたT細胞(105個)を、CHO−I−AdまたはCHO−I−Ad−PD−L2により提示されたペプチド(1または0.1μg/ml)で48時間再刺激した。[3H]チミジン取りこみを3つの同じ実験で試験した。培養開始後36時間目に上清の一部を集め、ELISAによりサイトカインを測定した。これらのデータは4回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図10】図10は、TCRおよびCD28により媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。DO11.10トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞をOVAペプチド(1μg/ml)で4日間活性化した。CD4+T細胞を単離し、一晩休止させた。前もって活性化させたT細胞(105個)を、示されたCHOトランスフェクション体により、ペプチドの濃度を種々変更して、48時間再刺激した。[3H]チミジン取りこみを3つの同じ実験で試験した。これらのデータは6回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図11】図11は、TCRおよびCD28により媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。前もって活性化されたT細胞(105個)を、示されたCHOトランスフェクション体により提示された0.01μg/mlのOVAペプチドとともに培養した。培養開始後36時間目に上清の一部を集め、ELISAによりサイトカインを測定した。破線はELISAの感度を示す。
【図12】図12は、TCRおよびCD28により媒介される応答のPD−L2−PD−1相互作用による阻害を示す。前もって活性化されたT細胞(105個)を、示されたCHOトランスフェクション体により提示された0.1μg/mlのOVAペプチドとともに培養した。培養開始後36時間目に上清の一部を集め、ELISAによりサイトカインを測定した。破線はELISAの感度を示す。
【図13】図13は、PD−L2−PD−1経路の使用の結果としての細胞周期停止およびアポトーシスを示す。前もって活性化されたT細胞を、OVAペプチド(1μg/ml)および示されたCHOトランスフェクション体で再刺激した。培養36時間目に細胞を集め、抗−CD4で染色し、70%エタノール中で固定した。細胞をヨウ化プロピジウム溶液中で再懸濁した。FACSプロファイルはCD4+集団のヨウ化プロピジウム染色である。2倍体未満(subdiploid)、2倍体(diploid)、および2倍体超(supradiploid)の集団を示す。一定流速で1万のイベントを集め、分析した。これらのデータは3回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図14】図14は、PD−L2−PD−1経路の使用の結果としての細胞周期停止およびアポトーシスを示す。前もって活性化されたT細胞を、OVAペプチド(0.01μg/ml)および示されたCHOトランスフェクション体で再刺激した。培養36時間目に細胞を集め、抗−CD4で染色し、70%エタノール中で固定した。細胞をヨウ化プロピジウム溶液中で再懸濁した。FACSプロファイルはCD4+集団のヨウ化プロピジウム染色である。2倍体未満(subdiploid)、2倍体(diploid)、および2倍体超(supradiploid)の集団を示す。一定流速で1万のイベントを集め、分析した。これらのデータは3回以上の独立した実験の典型的なものである。
【図15】図15は、抗−PD−L1または抗−PD−L2抗体の存在下でのT細胞増殖の促進を示す。同種CD4+T細胞を、IL−10処理樹状細胞による混合リンパ球反応において刺激した。
【図16】図16は、抗−PD−L1、抗−PD−L2抗体、あるいは抗−PD−L1および抗−PD−L2抗体の組み合わせの存在下でのT細胞増殖の促進を示す。同種CD4+T細胞を、IL−10処理樹状細胞による混合リンパ球反応において刺激した。
Claims (2)
- a)第1の抗原濃度において、PD−L2標的分子を発現するT細胞を試験化合物と接触させ;
b)第1の抗原濃度において、T細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする試験化合物の能力を決定し;
c)第2の抗原濃度において、PD−L2標的分子を発現するT細胞を試験化合物と接触させ;ついで
d)第1の抗原濃度において、T細胞増殖またはサイトカイン産生をモジュレーションする試験化合物の能力を決定し、
そのことにより、第1および第2の抗原濃度においてT細胞活性化をモジュレーションする化合物を同定する
ことを特徴とする、第1および第2の抗原濃度においてT細胞活性化をモジュレーションする化合物を同定する方法。 - PD−L2標的分子がPD−1である請求項1のアッセイ。
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