CN115850387B - 超高亲和力的靶向pd-l1的小蛋白及药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类靶向PD‑L1的超高亲和力小蛋白及用途。具体地，本发明提供了一类靶向PD‑L1且具有超高亲和力的结合蛋白，本发明的蛋白能够与野生型PD‑1竞争性结合，其亲和力远高于野生型PD‑1对PD‑L1的亲和力。本发明还提供了包括所述靶向PD‑L1的超高亲和力的融合蛋白。

Description

超高亲和力的靶向PD-L1的小蛋白及药物组合物
本申请是申请日为2021年8月13日、申请号为202110932884.4、发明名称为“一类靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白及用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术和医药领域，具体涉及靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白及其融合蛋白。
背景技术
PD-1/PD-L1信号通路是机体调控免疫，发挥免疫抑制作用的重要信号通路之一。阻断PD-1/PD-L1免疫抑制信号已经成为目前抗肿瘤治疗的重要策略之一。
然而，由于目前借助单克隆抗体技术阻断PD-1/PD-L1免疫抑制信号，无法实现对PD-1/PD-L1相互接触作用面的完全覆盖。更重要的是，虽然阿维鲁单抗(avelumab)、杜鲁伐单抗(durvalumab)、阿妥珠单抗(atezolizumab)这些PD-L1抗体都能够阻断PD-1/PD-L1的结合，但是由于其阻断结合的位点各不相同，其在临床试验和临床治疗中的疗效却各不相同。
抗体的结合表位是影响其疗效的重要因素之一。虽然阿维鲁单抗(avelumab)与杜鲁伐单抗(durvalumab)、阿妥珠单抗(atezolizumab)相比具有相似的结合位点和更高的亲和力，然而其在肺癌、胃癌的III期临床试验却都是以失败告终。
这些数据表明，PD-L1抗体结合表位的细微差别很有可能对其疗效产生显著影响。因此，如何更加有效地阻断PD-1/PD-L1结合，进而更加有效的抑制PD-1/PD-L1免疫抑制信号是目前亟待解决的问题。
此外，PD-L1的表达水平是PD-1/PD-L1抗体疗法的重要预后判断指标之一。
综上所述，本领域迫切需要开发出一种能够更高效地阻断PD-1/PD-L1结合的，从而更加有效地抑制PD-1/PD-L1免疫抑制信号的药物，以及更加精准、动态检测肿瘤PD-L1表达的候选药物。
发明内容
本发明的目的就是提供了一类靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白，所述小蛋白能够更加高效地阻断PD-1/PD-L1结合。
本发明的另一目的是提供一类基于靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白的融合蛋白及其制备方法。
在本发明的第一方面，提供了一种靶向PD-L1的小蛋白，所述小蛋白能特异性靶向结合PD-L1，表现出超强的亲和力，并且能够与野生型PD-1竞争性结合PD-L1，有效阻断PD-1与PD-L1的结合。
在另一优选例中，所述的小蛋白有一条肽链构成，主要形成三个α-螺旋二级结构。
在另一优选例中，所述的小蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、5或7所示。
本发明还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白包括串联在一起的两个或多个本发明的靶向PD-L1的小蛋白。
在本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一多肽和/或第二多肽；
其中，所述第一多肽从N端到C端具有如式I所示的结构，所述第二多肽从N端到C端具有如式II所示的结构，
S-Mx-H-Fc (式I)
S-Fc-H-Mx (式II)
其中，
S为无或信号肽序列；
M为PD-L1结合区(或结合元件)，所述PD-L1结合区的氨基酸序列来自如第一方面所述的靶向PD-L1的小蛋白的氨基酸序列；
H为铰链区；
Fc为无或免疫球蛋白的恒定区，或其片段；
“-”表示连接上述元件的肽键或连接肽；
x为1-4的正整数。
在另一优选例中，所述的“来自所述的靶向PD-L1的小蛋白的氨基酸序列”指，所述PD-L1结合区(或结合元件)的氨基酸序列与所述的靶向PD-L1的小蛋白的氨基酸序列相同或基本相同(即同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且所述的PD-L1结合区(或结合元件)保留与野生型PD-L1的结合活性(较佳地，保留≥70％，更佳地≥80％的结合活性)。
在另一优选例中，所述S的氨基酸序列选自下组：
(i)如SEQ ID NO:21所示的序列；
(ii)在SEQ ID NO:21的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列。
在另一优选例中，编码所述S的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
在另一优选例中，所述融合蛋白为单体或二聚体。
在另一优选例中，所述融合蛋白是同源二聚体或异源二聚体。
在另一优选例中，所述第一多肽与第一多肽之间、所述第二多肽与第二多肽之间，或第一多肽与第二多肽之间，可通过各自Fc上的半胱氨酸C形成二硫键。
在另一优选例中，所述二聚体选自下组：两条第一多肽形成的同源二聚体、两条第二多肽形成的同源二聚体，或由第一多肽和第二多肽形成的异源二聚体。
在另一优选例中，所述融合蛋白是两条第一多肽形成的同源二聚体。
在另一优选例中，所述M的序列为SEQ ID No:1、3、5或7。
在另一优选例中，所述x为1、2、3或4个，较佳地为2个。
在另一优选例中，所述H为人免疫球蛋白的铰链区。
在另一优选例中，所述人免疫球蛋白选自下组：IgG1、IgG4，或其组合。
在另一优选例中，所述人免疫球蛋白是IgG1。
在另一优选例中，所述H的氨基酸序列选自下组：
(i)如SEQ ID NO:9所示的序列；
(ii)在SEQ ID NO:9的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列。
在另一优选例中，编码所述H的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中，所述的Fc为人免疫球蛋白的恒定区或其片段。
在另一优选例中，所述Fc是人免疫球蛋白的CH2区和CH3区的串联序列，或仅为人免疫球蛋白的CH3区。
在另一优选例中，所述Fc的氨基酸序列选自下组：
(i)如SEQ ID NO:11所示的序列；
(ii)在SEQ ID NO:11的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至30个氨基酸序列，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列。
在另一优选例中，编码所述Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在另一优选例中，所述第一多肽的氨基酸序列选自下组：
(i)如SEQ ID NO:13、15、17或19所示的序列；
(ii)在SEQ ID NO:13、15、17或19的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至30个氨基酸序列，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列。
在另一优选例中，编码所述第一多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:14、16、18或20所示。
在另一优选例中，所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，编码所述第一多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面靶向PD-L1的小蛋白或重组蛋白或本发明第二方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、14、16、18或20所示。
在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:4或14所示。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体中含有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体为：pET载体、pGEM-T载体、pcDNA3.1，或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有第四方面所述的载体，或基因组中整合有第三方面所述的多核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)本发明第一方面所述的靶向PD-L1的小蛋白或其串联式的重组蛋白或第二方面所述的融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，其包括：
(a)本发明第一方面所述的靶向PD-L1的小蛋白或其重组蛋白或第二方面所述的融合蛋白，或其编码基因；或第六方面所述的免疫偶联物；和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于示踪或治疗表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述组分(a)的含量为0.1-99.9wt％,较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。
在另一优选例中，所述药物组合物或制剂选自下组：混悬制剂、液体制剂或冻干制剂。
在另一优选例中，所述液体制剂为水针制剂。
在另一优选例中，所述液体制剂的保存期限为一年至三年，较佳地一年至两年，更佳地一年。
在另一优选例中，所述液体制剂的保存温度为0℃-16℃，较佳地0℃-10℃，更佳地2℃-8℃。
在另一优选例中，所述冻干制剂的保存期限为半年至两年，较佳地半年至一年，更佳地半年。
在另一优选例中，所述冻干制剂的保存温度为≤42℃，较佳地≤37℃，更佳地≤30℃。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂、缓冲液，或其组合。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
在另一优选例中，所述溶液稳定剂选自下组：糖类溶液稳定剂、氨基酸类溶液稳定剂、醇类溶液稳定剂，或其组合。
在另一优选例中，所述糖类溶液稳定剂选自下组：还原性糖类溶液稳定剂或非还原性糖类溶液稳定剂。
在另一优选例中，所述氨基酸类溶液稳定剂选自下组：谷氨酸单钠或组氨酸。
在另一优选例中，所述醇类溶液稳定剂选自下组：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇，或其组合。
在另一优选例中，所述等渗调节剂选自下组：氯化钠或甘露醇。
在另一优选例中，所述缓冲液选自下组：TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液，或其组合。
在另一优选例中，所述药物组合物或制剂的施用对象为包括人或非人动物。
在另一优选例中，所述非人动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。
在另一优选例中，在所述药物组合物或制剂的施用中，施用的量为0.01-10g/天，较佳地0.05-5000mg/天，更佳地0.1-3000mg/天。
在另一优选例中，所述药物组合物或制剂用于抑制和/或治疗肿瘤。
在另一优选例中，所述抑制和/或治疗肿瘤包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低。
在另一优选例中，所述抑制和/或治疗肿瘤还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现。
在另一优选例中，对于肿瘤的治疗，所述药物组合物或制剂可以和其他的抗肿瘤药联合给药。
在另一优选例中，所述联合给药的抗肿瘤药选自下组：细胞毒类药物、激素类抗雌激素、生物反应调节剂、单克隆抗体、或其他一些目前机制不明和有待进一步研究的药物。
在另一优选例中，所述细胞毒类药物包括：作用于DNA化学结构的药物、影响核酸合成的药物、作用于核酸转录的药物、主要作用于微管蛋白合成的药物，或其他细胞毒药。
在另一优选例中，所述作用于DNA化学结构的药物包括：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂、草酸铂；丝裂霉素(MMC)。
在另一优选例中，所述影响核酸合成的药物包括：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等。
在另一优选例中，所述作用于核酸转录的药物包括：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等。
在另一优选例中，所述主要作用于微管蛋白合成的药物包括：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱。
在另一优选例中，所述其他细胞毒药包括：主要抑制蛋白质的合成的门冬酰胺酶。
在另一优选例中，所述激素类抗雌激素包括：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等。
在另一优选例中，所述生物反应调节剂包括：干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类。
在另一优选例中，所述单克隆抗体包括：美罗华(MabThera)、西妥昔单抗(Cetuximab)(C225)、赫赛汀(曲妥珠单抗(Trastuzumab))、贝伐单抗(Bevacizumab，Avastin)、耶尔韦(Yervoy，伊匹单抗(Ipilimumab))、尼武单抗(Nivolumab，OPDIVO)、派姆单抗(Pembrolizumab，Keytruda))、阿妥珠单抗(Atezolizumab，Tecentriq))。
在本发明的第八方面，提供了一种制备本发明靶向PD-L1的小蛋白或其重组蛋白或其融合蛋白的方法，包括步骤：
(a)在合适的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述小蛋白或其重组蛋白或融合蛋白的培养物；和
(b)对步骤(a)中得到的培养物进行纯化和/或分离，获得所述的靶向PD-L1的小蛋白或其重组蛋白或融合蛋白。
在本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的靶向PD-L1的小蛋白或其重组蛋白或第二方面所述的融合蛋白、或第六方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中的PD-L1；其中，所述药剂用于治疗或预防表达PD-L1(即PD-L1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述的试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
在另一优选例中，所述检测样品中PD-L1的试剂为(体内)检测PD-L1分子的造影剂。
在另一优选例中，所述的检测为体内检测或体外检测。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测，或其组合。
在另一优选例中，所述的药剂用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用。
在另一优选例中，所述的肿瘤为表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括但不限于：急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓病、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤，或其组合。
在本发明的第十方面，提供了治疗疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的靶向PD-L1的小蛋白或其重组蛋白或第二方面所述的融合蛋白、或第六方面所述的免疫偶联物、或第七方面所述的药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了靶向PD-L1的超高亲和力结合小蛋白与人PD-L1复合物结构模拟图。
其中，A为人PD-1与PD-L1复合物蛋白结构。
B为小蛋白PD-L1-③与人PD-L1结合复合物结构模拟图。
C为小蛋白PD-L1-①与人PD-L1结合复合物结构模拟图。
D为小蛋白PD-L1-⑤与人PD-L1结合复合物结构模拟图。
E为小蛋白PD-L1-②与人PD-L1结合复合物结构模拟图。
图2显示了高亲和力PD-1小蛋白及其融合蛋白的几种结构组合示意图。
其中，A为靶向PD-L1小蛋白的短肽链。
B为靶向PD-L1小蛋白与抗体铰链区(hinge)或接头(linker)以及CH2、CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的高亲和力PD-1蛋白(或片段)形成靶向PD-L1的单/多靶向融合蛋白。
C为靶向PD-L1小蛋白与抗体铰链区(hinge)或接头(linker)以及CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的高亲和力PD-1蛋白(或片段)形成靶向PD-L1的单/多靶向融合蛋白。
D为靶向PD-L1小蛋白与抗体铰链区(hinge)或接头(linker)以及CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的高亲和力小蛋白(或片段)形成靶向PD-L1的单/多靶向融合蛋白。
E为靶向PD-L1小蛋白通过接头序列与靶向PD-L1小蛋白连接后，与抗体铰链区(hinge)或接头(linker)以及CH2和CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的高亲和力PD-1蛋白(或片段)形成靶向PD-L1的单/多靶向融合蛋白。
F为靶向PD-L1小蛋白通过接头序列与靶向PD-L1小蛋白连接后，与抗体铰链区(hinge)或接头(linker)以及CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的高亲和力靶向PD-L1小蛋白(或片段)形成靶向PD-L1的单/多靶向融合蛋白。
G为靶向PD-L1小蛋白通过接头序列与靶向PD-L1小蛋白连接后，与抗体铰链区(hinge)或接头(linker)以及CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的高亲和力靶向PD-L1小蛋白(或片段)形成靶向PD-L1的单/多靶向融合蛋白。
图3显示了采用流式法检测的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白的结合活性。
其中，将靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白展示在酵母表面，用anti-Myc tagantibody FITC(ab1394)将展示小蛋白的酵母进行示踪；用Avidin,NeutrAvidinTM,PEconjugate(A2660)将能够与生物素标记的人PD-L1蛋白结合的酵母细胞进行示踪。
图4显示了采用流式法检测的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白与野生型人PD-1的竞争结合活性。
其中，将不同浓度的人PD-1蛋白与生物素标记的PD-L1室温孵育后，与展示靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白的酵母进行孵育。采用流式细胞仪，借助anti-Myc tagantibody FITC(ab1394)和Avidin,NeutrAvidinTM,PE conjugate(A2660)双染色评估靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白与人PD-1的竞争结合活性。
图5显示了采用生物膜干涉技术(BLI)测定靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白靶向PD-L1的亲和力。
其中，将生物素标记的人PD-L1包被在检测探头上后，检测不同浓度的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白与人PD-L1的亲和力。
图6显示了采用CD光谱仪测定靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白的热稳定性。
其中，观察PD-L1-③在25℃、升温至95℃、降温至25℃三种温度下的蛋白圆二色性，进而评估该蛋白在升温前后，蛋白二级结构发生的改变。
图7显示了CD光谱仪测定靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白的Tm值。
其中，观察PD-L1-③在25℃逐渐升温至95℃过程中检测蛋白的圆二色信号。根据随时间点变化的蛋白圆二色信号，计算出该蛋白的Tm值。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，本发明人基于野生型PD-1/PD-L1蛋白结构，针对PD-1与PD-L1相互作用面，经过大量筛选，获得了一类靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白。该小蛋白的结合位点能够几乎完全覆盖野生型PD-1/PD-L1结合位点。实验表明，具有本发明的高亲和力小蛋白其亲和力远高于野生型PD-1蛋白，并且本发明的小蛋白较传统抗体来讲，分子量更小，具有潜在更好的肿瘤穿透性。在此基础上完成了本发明。
具体地，代表性的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白，长度小于约60个氨基酸，分子量远小于常规抗体，且无抗体Fc部分，因此具有更好的肿瘤穿透性。此外，本发明的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白，具有更高的亲和力，可以作为潜在的肿瘤PD-L1表达示踪探针。
本发明靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白以及融合蛋白
在本发明中，提供了一类靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白以及一种包含所述小蛋白的融合蛋白或其偶联物。
如本文所用，术语“本发明的小蛋白”、“本发明的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白”可互换使用，均指具有本发明第一方面中所述的对人PD-L1具有超高亲和力的小蛋白。
优选地，本发明所述的小蛋白具有如SEQ ID NO:1、3、5或7所示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“本发明融合蛋白”是指本发明所述的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白与其他融合元件形成的融合蛋白，例如，本发明的小蛋白可以与铰链区、Fc区等元件形成的融合蛋白。本发明的融合蛋白对PD-L1具有超高亲和力。
如本文所用，术语“对PD-L1具有超高亲和力”指，本发明的小蛋白或融合蛋白对野生型人PD-L1蛋白的亲和力远远高于野生型PD-1蛋白与野生型人PD-L1蛋白的亲和力，例如本发明小蛋白或融合蛋白对野生型人PD-L1蛋白的亲和力Q1是野生型PD-1蛋白对野生型人PD-L1蛋白的亲和力Q0的至少1.5，至少2倍或更多；或者，本发明小蛋白或融合蛋白对野生型人PD-L1蛋白的Kd值Z1与野生型PD-1蛋白对野生型人PD-L1蛋白的Kd值Z0的比值(Z1/Z0)≤1/1.5，更佳地≤1/2或≤1/3或更多。优选地，本发明的超高亲和力的融合蛋白可以是任何至少包含完整的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或其部分氨基酸片段(通常至少70％长度的氨基酸片段)。
典型地，本发明融合蛋白可具有下述结构：
靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或片段-Hinge-CH2-CH3的Y字形结构；
靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或片段-Hinge-CH3的Y字形结构；
靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或片段-示踪标记；
靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或片段。
应理解，以上结构类型仅为示例形式，并不限制本发明。一些代表性的结构如图2所示。其中，靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或其片段可以为单个或多个(如串联形式的2个、3个或4个超高亲和力小蛋白或其片段，例如图2E、2F和2G)。
如本文所用，术语“靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白”或“融合蛋白”还包括具有PD-L1结合活性以及PD-1/PD-L1阻断活性的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸，或在小蛋白N端或C端添加氨基酸侧链较小的氨基酸片段作为linker(如甘氨酸、丝氨酸等)。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述PD-1靶向PD-L1的小蛋白或融合蛋白(尤其是与Fc片段形成的融合蛋白)的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或融合蛋白的功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外，还可以对本发明靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或融合蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
术语“本发明的多核苷酸”可以是包括编码本发明靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或融合蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或融合蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或融合蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或融合蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
在本发明的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或其融合蛋白制备方法中，可以使用任何合适的载体，可选自pET、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
真核/原核宿主细胞均可用于本发明的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或其融合蛋白的表达，真核宿主细胞优选哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统，优选COS、CHO、NS0、sf9及sf21等细胞均；原核宿主细胞优选为DH5a、BL21(DE3)、TG1之一。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的一类靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或其融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或其融合蛋白。
利用上述方法，可以将靶向PD-L1的超高亲和力小蛋白或其融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
药物组合物
在本发明中，还提供了一种含有本发明靶向PD-L1的小蛋白或融合蛋白或其免疫偶联物的药物组合物。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明的小蛋白或融合蛋白(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。所述的靶向PD-L1小蛋白或融合蛋白或其免疫偶联物可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明的靶向PD-L1小蛋白或其融合蛋白的氨基酸核心序列的结构完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。所述制剂可以是各种形态，通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下至少稳定保存一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。
对于本发明的靶向PD-L1的药物组合物(如水针或冻干制剂)，其中药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到在稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的小蛋白或融合蛋白或其免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约50微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约100毫克/千克体重，较佳地该剂量是约100微克/千克体重-约50毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。典型地，通常，总给药量不能超过一定范围，例如静脉注射的剂量是10至3000mg/天/50kg，较佳地100至1000mg/天/50kg。
本发明的靶向PD-L1小蛋白或其融合蛋白和含有其的药物制剂可以作为抗肿瘤药物用于肿瘤治疗，本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。
上述靶向PD-L1小蛋白或其融合蛋白及其药物制剂还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些用于联合给药的抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)；Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)；Bevacizumab(Avastin)；Yervoy(Ipilimumab)；Nivolumab(OPDIVO)；Pembrolizumab(Keytruda)；Atezolizumab(Tecentriq)；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。
本发明的主要优点包括：
1)本发明所提供的靶向PD-L1的小蛋白，其结合位点能够覆盖野生型PD-1与PD-L1的结合。
2)本发明的小蛋白分子量较小，长度小于约60个氨基酸，拥有更好的肿瘤穿透性。
3)本发明的小蛋白对人PD-L1具有超高的亲和力，远高于野生型PD-1对PD-L1的亲和力。
4)本发明的小蛋白具有超高的结构稳定性，其Tm值大于95℃。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明序列
PD-L1-③的氨基酸序列(SEQ ID No:1)
DRERARELARILLKVIKLSDSPEARRQLLRNLEELAEKYKDPEVRRILEEAERYIK
PD-L1-③的核苷酸序列(SEQ ID No:2)
GACCGTGAACGTGCACGTGAACTGGCTCGCATTCTGCTGAAAGTAATTAAACTGAGCGACTCCCCAGAAGCACGTCGTCAGCTGCTGCGCAACCTGGAAGAACTGGCGGAAAAATATAAAGATCCGGAGGTTCGTCGTATCCTGGAAGAAGCCGAACGTTATATCAAA
PD-L1-①的氨基酸序列(SEQ ID No:3)
SREAVRQLLEDARKSKDPELVRILLKVARNLAELLNDPELRRLVEEIEEILRRLR
PD-L1-①的核苷酸序列(SEQ ID No:4)
AGCCGTGAAGCAGTACGTCAGCTGCTGGAAGACGCACGTAAATCTAAAGACCCGGAACTGGTACGCATCCTGCTGAAGGTGGCACGTAACCTGGCGGAGCTGCTGAACGACCCAGAACTGCGTCGTCTGGTGGAAGAAATTGAAGAAATCCTGCGCCGTCTGCGT
PD-L1-⑤的氨基酸序列(SEQ ID No:5)
SAREEADRLLQEIARLRKEGDREKAEEIVKRLRELVERLNDPLLRIILKVAENILKELN
PD-L1-⑤的核苷酸序列(SEQ ID No:6)
TCTGCTCGTGAAGAAGCTGATCGTCTGCTGCAGGAAATCGCTCGTCTGCGCAAGGAAGGCGATCGTGAAAAAGCAGAAGAAATCGTAAAACGTCTGCGTGAACTGGTTGAACGTCTGAACGATCCGCTGCTGCGTATCATCCTGAAAGTTGCTGAAAACATCCTGAAGGAACTGAAC
PD-L1-②的氨基酸序列(SEQ ID No:7)
SKEEALEQLLRDLKESTDPELIRILLKVIENLARLANNPEYLERAEKIYREL
PD-L1-②的核苷酸序列(SEQ ID No:8)
TCTAAGGAAGAAGCTCTGGAACAGCTGCTGCGCGATCTGAAAGAATCTACCGATCCGGAACTGATCCGTATTCTGCTGAAGGTTATTGAAAACCTGGCACGCCTGGCAAATAACCCGGAATACCTGGAACGTGCGGAAAAAATTTACCGTGAACTG
铰链区氨基酸序列(SEQ ID No:9)
EPKSGDKTHTCPPCP
铰链区核苷酸序列(SEQ ID No:10)
GAGCCCAAATCTGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
Fc氨基酸序列(SEQ ID No:11)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc核苷酸序列(SEQ ID No:12)
GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
PD-L1-③-铰链区-CH2-CH3氨基酸序列(SEQ ID No:13)
DRERARELARILLKVIKLSDSPEARRQLLRNLEELAEKYKDPEVRRILEEAERYIK
EPKSGDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PD-L1-③-铰链区-CH2-CH3核苷酸序列(SEQ ID No:14)
GACCGTGAACGTGCACGTGAACTGGCTCGCATTCTGCTGAAAGTAATTAAACTGAGCGACTCCCCAGAAGCACGTCGTCAGCTGCTGCGCAACCTGGAAGAACTGGCGGAAAAATATAAAGATCCGGAGGTTCGTCGTATCCTGGAAGAAGCCGAACGTT
ATATCAAA
GAGCCCAAATCTGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
PD-L1-①-铰链区-CH2-CH3氨基酸序列(SEQ ID No:15)
SREAVRQLLEDARKSKDPELVRILLKVARNLAELLNDPELRRLVEEIEEILRRLR
EPKSGDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PD-L1-①-铰链区-CH2-CH3核苷酸序列(SEQ ID No:16)
AGCCGTGAAGCAGTACGTCAGCTGCTGGAAGACGCACGTAAATCTAAAGACCCGGAACTGGTACGCATCCTGCTGAAGGTGGCACGTAACCTGGCGGAGCTGCTGAACGACCCAGAACTGCGTCGTCTGGTGGAAGAAATTGAAGAAATCCTGCGCCGTC
TGCGT
GAGCCCAAATCTGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
PD-L1-⑤-铰链区-CH2-CH3氨基酸序列(SEQ ID No:17)
SAREEADRLLQEIARLRKEGDREKAEEIVKRLRELVERLNDPLLRIILKVAENILKELN
EPKSGDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PD-L1-⑤-铰链区-CH2-CH3核苷酸序列(SEQ ID No:18)
TCTGCTCGTGAAGAAGCTGATCGTCTGCTGCAGGAAATCGCTCGTCTGCGCAAGGAAGGCGATCGTGAAAAAGCAGAAGAAATCGTAAAACGTCTGCGTGAACTGGTTGAACGTCTGAACGATCCGCTGCTGCGTATCATCCTGAAAGTTGCTGAAAACA
TCCTGAAGGAACTGAAC
GAGCCCAAATCTGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
PD-L1-②-铰链区-CH2-CH3氨基酸序列(SEQ ID No:19)
SKEEALEQLLRDLKESTDPELIRILLKVIENLARLANNPEYLERAEKIYREL
EPKSGDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PD-L1-②-铰链区-CH2-CH3核苷酸序列(SEQ ID No:20)
TCTAAGGAAGAAGCTCTGGAACAGCTGCTGCGCGATCTGAAAGAATCTACCGATCCGGAACTGATCCGTATTCTGCTGAAGGTTATTGAAAACCTGGCACGCCTGGCAAATAACCCGGAATACCTGGAACGTGCGGAAAAAATTTACCGTGAACTG
GAGCCCAAATCTGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
信号肽氨基酸序列(SEQ ID No:21)
MGWSCIILFLVATATGVHS
信号肽核苷酸序列(SEQ ID No:22)
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCC
实施例1：高亲和力人PD-1蛋白的合成
1.1高亲和力人PD-1蛋白的筛选
采用酵母展示文库技术对候选蛋白进行筛选。首先将合成的候选蛋白基因借助电转法与pETCON载体片段按照2：1的比例，电转至EBY-100酵母细胞。借助双缺陷(-Ura/-Trp)培养板30℃培养2天后，确认其电转效率(大于1×105)。电转后的酵母细胞在双缺陷培养基(30℃，250rpm)培养两天后。按照1：100稀释比例，在富含乳糖的诱导培养基中进行展示蛋白的诱导表达。当OD600＝0.5时，采用生物素标记的PD-L1作为靶蛋白(PD1-H82E5-200ug)，借助Avidin,NeutrAvidinTM,PE conjugate(A2660)和anti-Myc tag antibody FITC(ab1394)进行双色流式染色。其中FITC阳性细胞为展示蛋白的酵母细胞，PE/FITC双阳性表示该展示蛋白能够与靶蛋白PD-L1发生亲和结合。按亲和力大小，将对应于超高亲和力的PE/FITC双阳性酵母细胞筛选出来，进而通过基因测序获得能够与靶蛋白结合的候选蛋白(即PD-L1超高亲和力小蛋白)的基因序列。
1.2高亲和力人PD-1蛋白的合成
采用全基因合成的方法，合成靶向PD-L1超高亲和力小蛋白基因，命名为PD-L1-③、PD-L1-①、PD-L1-⑤和PD-L1-②。PD-L1-③的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。PD-L1-①的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其核苷酸序列如SEQID NO：4所示。PD-L1-⑤的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。PD-L1-②的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。将合成好的核苷酸序列的N端加上起始密码子后，在XhoI和NedI酶切位点处装入pET29b(+)表达载体。
实施例2：超高亲和力小蛋白的表达纯化
将该载体转化大肠杆菌后，在LB培养基37℃，270rpm培养至OD600＝0.6。然后采用1mM的IPTG诱导菌液蛋白表达过夜。收菌后，加入Protease Inhibitor Cocktail和核酸酶，借助超声破菌(6分钟，10s on，10s off，80％Amp)后取上清。借助Ni柱纯化后，将浓缩后的样品过分子筛进一步纯化。采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估蛋白表达与纯化。借助BCA法进一步确定蛋白的浓度。
通过该方法获得高纯度候选蛋白用于后续试验。
实施例3：靶向PD-L1高亲和力小蛋白结合活性检测
在本实施例中，将合成的小蛋白核苷酸序列N端加上起始密码子后，在XhoI和NedI酶切位点处装入pETCON载体。借助酵母转化试剂盒将装入小蛋白基因的载体转至EBY-100酵母细胞。借助双缺陷(-Ura/-Trp)培养板30℃培养2天后，确认其电转效率(大于1×105)。电转后的酵母细胞在双缺陷培养基(30℃，225rpm)培养两天后。按照1：100稀释比例，在富含乳糖的诱导培养基中进行展示蛋白的诱导表达。当OD600＝0.5时，采用生物素标记的PD-L1作为靶蛋白(PD1-H82E5-200ug)，按照1.44nM、144pM、14.4pM浓度稀释后与酵母细胞室温孵育45分钟。借助Avidin,NeutrAvidinTM,PE conjugate(A2660)和anti-Myc tag antibodyFITC(ab1394)进行双色流式染色。其中FITC阳性细胞为展示蛋白的酵母细胞，PE/FITC双阳性表示该展示蛋白能够与靶蛋白结合。
如图3所示，展示在酵母细胞表面的候选蛋白在靶蛋白PD-L1浓度在1.44nM和144pM浓度下能够与靶蛋白结合，表现出PE/FITC双阳性信号。通过分选靶蛋白PD-L1在144pM浓度下的PE/FITC双阳性酵母细胞并进行基因测序，进而获得靶向PD-L1高亲和力候选蛋白基因序列。
人PD-1以及本发明的几种优选的小蛋白与人PD-L1复合物结构的结合模拟情况如图1所示。与人PD-1的二级结构不同，本发明的小蛋白的肽链主要包括三个α-螺旋二级结构。
实施例4：靶向PD-L1高亲和力小蛋白竞争结合活性检测
在本实施例中，为了进一步确证靶向PD-L1高亲和力小蛋白与人PD-1的竞争结合活性。我们先将过不同浓度的PD-1-Fc融合蛋白Human PD-1/PDCD1Protein,Fc Tag(PD1-H5257-100ug)与生物素标记的PD-L1室温孵育20分钟后，然后与展示靶向PD-L1的高亲和力小蛋白的酵母细胞进行孵育，然后借助Avidin,NeutrAvidinTM,PE conjugate(A2660)和anti-Myc tag antibody FITC(ab1394)进行双色流式评估竞争结合活性。其中FITC阳性细胞为展示蛋白的酵母细胞，PE/FITC双阳性表示展示的小蛋白与人PD-L1的结合。
如图4所示，选择靶蛋白PD-L1浓度在14.4nM情况下，PD-1蛋白浓度分别从864nM、86.4nM、8.64nM和0nM，与靶蛋白PD-L1在室温孵育30分钟。然后将该蛋白孵育混合物与表达候选蛋白的酵母细胞进行室温孵育45分钟。通过双色流式评估候选蛋白的竞争结合活性。竞争蛋白PD-1在864nM浓度下(过饱和浓度)，候选结合蛋白依然能够表现出较好的竞争保护活性。
实施例5：靶向PD-L1高亲和力小蛋白亲和力测定
在本实施例中，借助ForteBio Octet对高亲和力阻断蛋白进行亲和力检测。首先将3μg/ml的生物素标记的人PD-L1蛋白装载到偶联亲和素的检测探头上(300s)，在PBST溶液中洗脱尚未结合的生物素标记的人PD-L1蛋白。然后将带有人PD-L1蛋白的检测探头同时浸没在等两倍比稀释的靶向PD-L1高亲和力小蛋白溶液中，检测结合信号(300s)。再将探头浸没PBST中，检测结合蛋白的解离信号。最终计算出高亲和力阻断结合蛋白的亲和力。
如图5所示，PD-L1-③和PD-L1-①表现出超强的结合活性，其亲和力分别为3.17×10-11M和4.07×10-10M。PD-L1-⑤和PD-L1-②的亲和力为7.82×10-9M和1.62×10-6M。
实施例6：靶向PD-L1高亲和力小蛋白结构稳定性检测
借助JASCO-1500对蛋白结构稳定性进行检测。选择从190nm-260nm波长范围进行检测，首先测定PD-L1-③在25℃(0.1mg/ml)蛋白的圆二色信号，然后将蛋白升温至95℃后检测蛋白的圆二色信号，最后将温度恢复到25℃并静置5分钟后的圆二色信号。获得该蛋白在不同温度下，蛋白二级结构构象的变化，进而评估结合蛋白的结构稳定性。
如图6所示，PD-L1-③在25℃时呈现出较高的α螺旋蛋白二级结构。升温至95℃时，该蛋白的二级结构由于高温影响发生一定变化。但随着温度再次降温至25℃后，其圆二色信号几乎完全重叠，表明该蛋白的二级结构恢复至升温前的情况。该蛋白表现出超强的热稳定性。
实施例7：ACE2高亲和力阻断结合蛋白Tm值测定
借助JASCO-1500，测定PD-L1-③在25℃(0.1mg/ml)蛋白的圆二色信号。选择波长为222nm进行检测蛋白从25℃开始逐渐升温至95℃过程中的圆二色信号。其中，2℃/分钟且每分钟平衡30秒。进而获得该蛋白的Tm值。
如图7所示，虽然随着温度提高其圆二色信号有所升高，但在仪器检测极限温度95℃情况下，其圆二色信号仅有较小幅度的升高。根据该信号曲线，确定其Tm超过仪器检测温度上限，Tm大于95℃。该蛋白表现出超强的热稳定性。
实施例8：融合蛋白的表达纯化
在本实施例中，制备超高亲和力小蛋白的融合蛋白。所制备的融合蛋白的结构如图2中的B所示，氨基酸序列为SEQ ID No:13、15、17、或19。方法如下：
将融合蛋白的编码序列SEQ ID No:14、16、18或20，分别引入pcDNA3.1载体的多克隆位点，将该载体转染293F细胞后，在细胞培养摇床培养6天。收取细胞培养上清并过滤后，借助ProteinA柱纯化并将样品进一步超滤浓缩。采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估蛋白表达与纯化。
对获得的各个重组蛋白的分子量进行检测，分别与预测的分子量值相符。
此外，采用实施例5的方法测定融合蛋白与PD-L1的结合情况，结果表明，制备的融合蛋白可以与PD-L1以超高亲和力结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种靶向PD-L1的小蛋白，其特征是，所述小蛋白能特异性靶向结合PD-L1，表现出超强的亲和力，并且能够与野生型PD-1竞争性结合PD-L1，有效阻断PD-1与PD-L1的结合；
其中，所述的小蛋白有一条肽链构成，主要形成三个α-螺旋二级结构；
并且，所述的小蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括串联在一起的两个或多个权利要求1所述的靶向PD-L1的小蛋白。
3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为第一多肽和/或第二多肽；
其中，所述第一多肽的结构从N端到C端如式I所示，所述第二多肽的结果从N端到C端如式II所示，
S-Mx-H-Fc(式I)
S-Fc-H-Mx(式II)
其中，
S为无或信号肽序列；
M为PD-L1结合区，所述PD-L1结合区的氨基酸序列如权利要求1所述的靶向PD-L1的小蛋白的氨基酸序列；
H为铰链区；
Fc为免疫球蛋白的恒定区，或其片段；
“-”表示连接上述元件的肽键或连接肽；
x为1-4的正整数。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述S的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
5.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述x为1、2、3或4个。
6.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述H的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
7.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
8.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示。
9.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的靶向PD-L1的小蛋白、权利要求2所述的重组蛋白、或如权利要求3所述的融合蛋白。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:4或16所示。
11.一种载体，其特征在于，所述载体中含有如权利要求9所述的多核苷酸。
12.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有如权利要求11所述的载体，或基因组中整合有如权利要求9所述的多核苷酸。
13.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的靶向PD-L1的小蛋白、如权利要求2所述的重组蛋白、或如权利要求3所述的融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或酶。
14.如权利要求13所述的免疫偶联物，其特征在于，所述偶联部分为放射性核素。
15.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(a)如权利要求1所述的靶向PD-L1的小蛋白、或权利要求2所述的重组蛋白、或如权利要求3所述的融合蛋白，或其编码基因；或如权利要求13所述的免疫偶联物；和
(b)药学上可接受的载体。
16.一种制备如权利要求1所述的靶向PD-L1的小蛋白、或权利要求2所述的重组蛋白或如权利要求3所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在合适的条件下，培养如权利要求12所述的宿主细胞，从而获得含所述小蛋白或重组蛋白或融合蛋白的培养物；和
(b)对步骤(a)中得到的培养物进行纯化和/或分离，获得所述的靶向PD-L1的小蛋白或重组蛋白或融合蛋白。
17.如权利要求1所述的靶向PD-L1的小蛋白或如权利要求3所述的融合蛋白、或权利要求13所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中的PD-L1。
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