CN111440889A - 一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物及侧流层析检测方法 - Google Patents

一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物及侧流层析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物，主要解决现有环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的技术存在核酸扩增反应耗时长的问题。本发明包括引物F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB，所有引物的序列分别如下：F3：TTGACACCAACGAACAGAGB3：TTGGTCAACACATCAACCTTFIP：TGACTGGAGGCCGTTAACGTTCAGGTCAATCCGAATBIP：GTGTTGCCGTTAGCGATAATGGCAAGTCCTAAGGTAACLoopF：CAGTGGTAAGAAGTCACCGTTLoopB：CCTATTGTTGTGATTGTGCTCAG。同时，根据上述特异性引物，本发明还提供了基于等温扩增的肺炎支原体侧流层析检测方法。通过上述方案，本发明不仅大幅缩短了核酸扩增反应的时间，而且能快速、有效地实现核酸检测，从而为支原体肺炎患者的准确诊疗提供了强有力的帮助，并且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，因此具备大规模推广应用的条件。

Description

一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物及侧流层析 检测方法
技术领域
本发明涉及核酸扩增技术领域，具体涉及的是一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物及侧流层析检测方法。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是呼吸道感染最常见的致病菌之一，是引起原发性支原体肺炎(MPP)的病原体。Mp由于体积小，其通常通过飞沫传播，疾病流行因季节、性别、年龄、地区的不同而不同，但其感染在全球呈上升趋势。
目前，据不完全统计，MP所引起的肺炎占所有社区获得性肺炎的比例高达40％，且容易在儿童中引起爆发流行。MP不仅可引起发热、咳嗽等急慢性呼吸道感染症状，部分患者可因感染肺炎支原体而患哮喘，亦可引起中枢神经系统、关节等一系列肺外系统疾病，严重的可导致死亡。
由于肺炎支原体感染的临床症状并不典型，无法与其他肺炎相区别，且Mp缺乏细胞壁，常用的抗生素如β-内酰胺类等药物的治疗效果不明显，因此支原体肺炎的诊断主要靠实验室检测，常用的方法包括：金标准支原体培养、血清学方法(IgM和IgG)及分子诊断方法(以核酸PCR扩增为主)，其中：
支原体培养：(1)由于支原体生长缓慢，培养时间较长，因而通常需要数天至数周；(2)对操作者技术要求较高；(3)敏感性较差，培养阳性率低。
血清学方法：(1)特异性较差，有可能出现假阳性；(2)通常需要急性期和恢复期双份血清才能确诊；(3)样本周转时间较长，可能会影响临床的诊断及治疗；(4)部分病人IgM抗体持续阴性或者IgG抗体持续增高会影响诊断。
PCR诊断方法：(1)价格比较贵，且需要特殊的设备和技术；(2)检测没有标准化，缺乏临床比较验证。
可见，上述常用的检测方法主要存在耗时长、需要特殊仪器(PCR仪)、成本高的问题，只能靠实验室检测，并不能满足实际的检测需求，更不具备大规模推广应用的条件。
环介导恒温扩增技术(简称LAMP)是2000年开发出来的一种新的核酸扩增技术，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。采用LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，然后通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果，不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，也不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。因此，LAMP具有简单、快速、特异性强的特点，是能代替PCR方法的最新技术。目前，运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体已有相关文献记载，例如专利公开号：CN101665827A(肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法)、CN107236798A(环介导等温扩增技术检测肺炎支原体的方法)等。
然而，随着社会的不断发展和进步，现有的运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的技术由于核酸扩增反应至少需要1个小时，反应时间依然较长，已经逐渐难以适应当前的检测需要，尤其是支原体肺炎核酸快速检测的需要。为此，本领域技术人员有必要对现有技术做出改进，以期缩短核酸扩增的反应时长。
发明内容
本发明旨在提供一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物及侧流层析检测方法，主要解决现有环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的技术存在核酸扩增反应耗时长的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物，包括6条引物F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB，其中，F3为正向外引物，B3为反向外引物，FIP为正向内引物，BIP为反向内引物，LoopF、LoopB均为成环引物，所有引物的序列分别如下：
F3：TTGACACCAACGAACAGAG
B3：TTGGTCAACACATCAACCTT
FIP(F1c+F2)：TGACTGGAGGCCGTTAACGTTCAGGTCAATCCGAAT
BIP(F1c+F2)：GTGTTGCCGTTAGCGATAATGGCAAGTCCTAAGGTAAC
LoopF：CAGTGGTAAGAAGTCACCGTT
LoopB：CCTATTGTTGTGATTGTGCTCAG。
根据上述特异性引物，本发明还提供了基于等温扩增的肺炎支原体侧流层析检测方法，包括以下步骤：
(1)在链置换DNA聚合酶作用下，将上述特异性印务以肺炎支原体基因组DNA为模板，将反应液置于60～65℃的恒温条件下于15-30min实现109～1010倍的核酸扩增；
(2)将扩增反应产物滴加到胶体金检测试纸条的样品垫上进行层析，若NC膜上的T线和C线均显色，则表示扩增反应产物中存在目标核酸，且检测有效；若T线不显色、C线显色，则表示扩增反应产物中不存在目标核算，且检测有效。
作为一种优选，所述步骤(1)中，于下列条件下实现109～1010倍的核酸扩增：
温度：65℃，恒温
时间：30min
Buffer：1X
MgSO4：8mM
dNTP：1.4m/每种
FIP/BIP：1.6um
F3/B3：0.2um
LoopF/B：0.4um
Bst：320U/ml
DNA：>10copies or more。
作为一种优选，所述T线和C线上所用的标记物为生物素和荧光素。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明设计了一种快速、低成本、准确判断Mp感染的特异性方法，该方法具有操作便捷、无需特殊仪器、成本低廉的特点，不仅能为支原体肺炎患者的准确诊疗提供强有力的帮助，而且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，具备大规模推广应用的条件。
(2)本发明通过设计与现有引物序列不同的内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，并巧妙加入了2条成环引物LoopF和LoopB(有利于增加DNA扩增的起点)，大幅缩短了核酸扩增反应的时间，试验表明：采用本发明设计的特异性引物，15-30分钟即可实现109～1010倍的核酸扩增(最佳反应温度为65℃恒温，最佳反应时间为30分钟)，相比原有的核酸扩增反应所需时间至少缩短了一半以上。同时，基于本发明设计的6条引物，由于其具有高度的特异性，只需根据扩增反应产物有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断，因而结合胶体金法的检测手段后，可以快速实现核酸检测，完全满足了当前支原体肺炎核酸检测的需要。
附图说明
图1为本发明-实施例中采用特异性引物扩增后的胶体金检测试验结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例
本发明提供了一种针对肺炎支原体进行核酸检测的方案，其首先设计了6条引物，包括F3(正向外引物)、B3(反向外引物)、FIP(正向内引物)、BIP(反向内引物)、LoopF(成环引物)、LoopB(成环引物)，所有引物的序列分别如下：
F3：TTGACACCAACGAACAGAG
B3：TTGGTCAACACATCAACCTT
FIP(F1c+F2)：TGACTGGAGGCCGTTAACGTTCAGGTCAATCCGAAT
BIP(F1c+F2)：GTGTTGCCGTTAGCGATAATGGCAAGTCCTAAGGTAAC
LoopF：CAGTGGTAAGAAGTCACCGTT
LoopB：CCTATTGTTGTGATTGTGCTCAG。
设计6条引物后，在链置换DNA聚合酶作用下，将特异性引物以肺炎支原体基因组DNA为模板，将反应液置于60～65℃的恒温条件下于15-30min实现109～1010倍的核酸扩增。
而后，制备通用胶体金试纸条，具体为：将试纸条固定于PVC底板上，试纸条上从左往右依次是样品垫、金垫、NC膜、吸水垫，其中，NC膜上有T线(检测线)和C线(质控线)，检测线上包被有特异性标记物I的分子(能特异性结合核酸特定片段的物质)，质控线上包被能特异性结合标记物II的分子。本实施例中的标记物II不同于标记物I，并且标记物为生物素和荧光素。
接着，将扩增反应产物(待测样品)滴加到胶体金检测试纸条的样品垫上进行层析，扩增反应产物被亲和素-金捕获，当待测样品中存在目标核酸时，每条核酸都带有生物素和荧光素特异性标记，并通过毛细现象沿纤维膜向前流动，当流到T线处时，带有荧光素特异性标记的核酸片段与荧光素抗体分子结合，将带有荧光素标记特异性核酸片段滞留在T线上，形成肉眼可见的有色条带；同时只带有生物素标记的特异性核酸片段滞留在C线上，形成肉眼可见的有色条带，即为阳性。
当待测样品中不存在目标核酸时，T线不会形成肉眼可见的条带，即为阴性，并且待测样品中存在的能与C线包被的生物素结合的标记物会越过T线继续沿着纤维膜向前流动，到达C线，与C线包被的特异性标记物结合，从而滞留在C线，形成肉眼可见的有色条带，此为检测有效。
图1为采用本发明设计的特异性引物扩增后的胶体金检测试验结果，图中，显示两条横线的为阳性，显示一条横线的为阴性，其前置的核酸扩增条件为：
温度：65℃，恒温
时间：30min
Buffer：1X
MgSO4：8mM
dNTP：1.4m/每种
FIP/BIP：1.6um
F3/B3：0.2um
LoopF/B：0.4um
Bst：320U/ml
DNA：>10copies or more。
可见，本发明通过设计与现有引物序列不同的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，并加入了2条成环引物(LoopF和LoopB)，不仅大幅缩短了核酸扩增反应的时间，而且能快速、有效地实现核酸检测。本发明能为支原体肺炎患者的准确诊疗提供强有力的帮助，而且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，更适合大规模推广应用。因此，与现有技术相比，本发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 卢涛
<120> 一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物及侧流层析检测方法
<130> 2020
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
ttgacaccaa cgaacagag 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
ttggtcaaca catcaacctt 20
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
tgactggagg ccgttaacgt tcaggtcaat ccgaat 36
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
gtgttgccgt tagcgataat ggcaagtcct aaggtaac 38
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
cagtggtaag aagtcaccgt t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
cctattgttg tgattgtgct cag 23

Claims (4)

1.一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物，其特征在于，包括6条引物F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB，其中，F3为正向外引物，B3为反向外引物，FIP为正向内引物，BIP为反向内引物，LoopF、LoopB均为成环引物，所有引物的序列分别如下：
F3：TTGACACCAACGAACAGAG
B3：TTGGTCAACACATCAACCTT
FIP(F1c+F2)：TGACTGGAGGCCGTTAACGTTCAGGTCAATCCGAAT
BIP(F1c+F2)：GTGTTGCCGTTAGCGATAATGGCAAGTCCTAAGGTAAC
LoopF：CAGTGGTAAGAAGTCACCGTT
LoopB：CCTATTGTTGTGATTGTGCTCAG。
2.一种基于等温扩增的肺炎支原体侧流层析检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在链置换DNA聚合酶作用下，将权利要求1所述的特异性印务以肺炎支原体基因组DNA为模板，将反应液置于60～65℃的恒温条件下于15-30min实现109～1010倍的核酸扩增；
(2)将扩增反应产物滴加到胶体金检测试纸条的样品垫上进行层析，若NC膜上的T线和C线均显色，则表示扩增反应产物中存在目标核酸，且检测有效；若T线不显色、C线显色，则表示扩增反应产物中不存在目标核算，且检测有效。
3.根据权利要求2所述的一种基于等温扩增的肺炎支原体侧流层析检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，于下列条件下实现109～1010倍的核酸扩增：
温度：65℃，恒温
时间：30min
Buffer：1X
MgSO4：8mM
dNTP：1.4m/每种
FIP/BIP：1.6um
F3/B3：0.2um
LoopF/B：0.4um
Bst：320U/ml
DNA：>10copies or more。
4.根据权利要求2或3所述的一种基于等温扩增的肺炎支原体侧流层析检测方法，其特征在于，所述T线和C线上所用的标记物为生物素和荧光素。
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