CN109136404A - 一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和m5株的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和m5株的引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的引物组、试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明所述引物组包括两条外引物F3和B3；两条内引物FIP和BIP，所述内引物FIP具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述内引物BIP具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述外引物F3具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述外引物B3具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本发明采用LAMP法进行鉴别，能够有效的鉴别出布鲁氏菌新疆流行株和M5疫苗株。特异性好、灵敏度高，且操作简单，快捷，在1h左右即可完成。

Description

一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的引物组、试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
布鲁氏菌病控制一直以来是我国政府所关注的重要工作之一，该病的暴发不仅给所在国家和地区带来巨大的社会、经济和人民生命与财产损失，而且成为影响国际贸易和国家之间关系的重要因素之一。布鲁氏菌病是一种严重危害人和家畜健康的动物源性传染病，被《中华人民共和国传染病防治法》列为乙类传染病，属《家畜家禽防疫条例实施细则》中二类传染病之首。人感染后表现为持续性感染，引发“波浪热”和多系统功能损伤，严重感染者可致残甚至危及生命，慢性感染尚无法根治。动物感染后公畜引起睾丸炎和附睾炎，母畜多数发生流产、早产、死胎等，是造成畜牧业重大损失的主要原因之一。近年来，布鲁氏菌病的人畜疫情在世界范围内均出现了回升势头，并呈持续增长态势。新疆等西部地区布鲁氏菌病动物的发病率为10％左右，有些养殖场的发病率为40％以上。2011年我国人新发病例达42,654例，是为布鲁氏菌病的“重灾区”。全世界每年因布鲁氏菌病造成的直接经济损失近30亿美元，我国布鲁氏菌病引起的畜牧业经济损失也十分严重，主要集中在我国的西北、华北和东北地区。以新疆为例，每年因布鲁氏菌病造成经济损失超过2亿元。研制新型布鲁氏菌病鉴别诊断技术，对该病的防控具有重要意义。
疫苗是防控布病最有效、最经济的手段，当前使用的布病疫苗为畜用减毒活疫苗如M5-90，是我国自主研发的弱毒活疫苗，具有较好的免疫保护性，为布鲁氏菌病的预防和控制提供了物质基础，但是，M5-90存在重大缺陷：不能区分自然感染和疫苗免疫，干扰布病的检疫，导致不能也无法广泛应用，致使当前布病趋年上升。建立有效的可以区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌病鉴别诊断方法迫在眉睫。细菌分离鉴定方法是检测布鲁氏菌的“金标准”，但不能鉴别流行株与疫苗株，并且花费时间周期较长，操作复杂，危险性较高。血清学方法大多作为初检与普检使用，简单快捷，应用较广，亦不能鉴定布鲁氏菌种型，并且存在灵敏性低与特异性差的缺点。不能区分流行株感染和疫苗免疫，干扰布病的检疫，危害畜牧业经济安全。国内外学者在布鲁氏菌菌株鉴别领域多采用多重PCR方法或RT-PCR等分子生物学方法，需要检测仪器，不适宜基层检疫，限制了这些方法在兽医临床中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的引物组、试剂盒及其应用，能够有效地鉴别出布鲁氏菌中的M5疫苗株。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的引物组，所述引物组包括两条外引物F3和B3；两条内引物FIP和BIP，所述内引物FIP具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；
所述内引物BIP具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
所述外引物F3具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
所述外引物B3具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的试剂盒，包括上述方案所述的引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BST DNA酶溶液和去离子水。
优选的，所述外引物和内引物的浓度独立的为25μm/L；所述MgSO4的浓度为6mmol/L；所述dNTP的浓度为7mmol/L；所述甜菜碱的浓度为3mmol/L。
优选的，每25μL反应体系中包括如下组分：上述方案所述的外引物F3和B30.5μL、上述方案所述的内引物FIP和BIP3.5μL，MgSO42.7μL、dNTP1.90μL、甜菜碱2.5μL、BST DNA酶1.2μL和余量的去离子水。
本发明提供了一种上述方案所述的试剂盒鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的检测方法，包括如下步骤：
1)提取待测菌DNA，得到DNA模板；
2)将所述步骤1)的2μLDNA模板与引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BSTDNA酶溶液和去离子混合，进行LAMP反应，反应结束后判断检测结果；
所述LAMP反应的条件为：在63.9～64.7℃恒温扩增55min后升温至80～81℃终止反应。
优选的，所述步骤2)中扩增的温度为64.1℃。
优选的，所述步骤2)中在80.5℃终止反应。
优选的，所述步骤2)中判断检测结果的方法为：采用3％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
优选的，所述步骤2)中将DNA模板与引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BST DNA酶溶液和去离子水混合时还包括加入1μL钙黄绿素，反应终止后通过颜色变化判断检测结果。
本发明提供了一种上述方案所述的试剂盒在鉴别布鲁氏菌流行株和M5疫苗株中的应用。
本发明提供了一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5疫苗株的引物组、试剂盒及其应用。本发明中，采用LAMP法进行鉴别，操作简单，快捷，在1h左右即可完成。采用本发明提供的方法特异性好、灵敏度高，在布鲁氏菌中能够有效鉴别出布鲁氏菌新疆流行株与M5疫苗株。实施例结果表明：采用LAMP鉴别方法检测大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌和M5疫苗株均为阴性，而布鲁氏菌新疆流行株027和S2菌株为阳性。LAMP法的检测极限在7.5fg/μL左右，而PCR方法的检测极限为7.5pg/μL，实验结果表明本发明提供的方法的灵敏性为PCR方法的1000倍。同时，本发明提供的引物设计合理，在特定反应体系及反应条件下进行扩增，使凝胶条带清晰，成功率高。
附图说明
图1为实施例1中布鲁氏菌属内LAMP特异性电泳检测图(图1中M:DNAMarker 500；1:阴性对照；2为布鲁氏菌M5株；3为布鲁氏菌M5株；4为布鲁氏菌S2株；5为布鲁氏菌027株阳性对照)；
图2为实施例1中布鲁氏菌027株、S2菌株、M5菌株与苍白杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌及链球菌LAMP特异性电泳检测图(图2中M:DNAMarker2000；1为布鲁氏菌S2株；2为布鲁氏菌027株；3为布鲁氏菌M5株；4为大肠杆菌；5为沙门氏菌；6为苍白杆菌；7为链球菌；8为阴性)；
图3为实施例1中采用钙黄绿素验证LAMP特异性图(图3中7个离心管从左至右依次为布鲁氏菌027株、阴性对照、S2、M5、沙门氏菌、苍白杆菌和大肠杆菌)；
图4为实施例2中不同浓度样本采用LAMP法扩增后的检测电泳(图4中M为DNAMarker 1000；1为75ng/μL；2为7.5ng/μL；3为750pg/μL；4为75pg/μL；5为7.5pg/μL；6为750fg/μL；7为75fg/μL；8为7.5fg/μL；9为750ag/μL；10为75ag/μL；11为7.5ag/μL；12为阴性对照)；
图5为实施例2中不同浓度样本采用PCR法扩增后的检测电泳图(图5中M为DNAMarker 1000；1为阴性对照；2为75ng/μL；3为7.5ng/μL；4为750pg/μL；5为75pg/μL；6为7.5pg/μL；7为750fg/μL；8为75fg/μL；9为7.5fg/μL；10为750ag/μL；11为75ag/μL；12为7.5ag/μL)；
图6为实施例3中采用Omp22引物检测布鲁氏菌混匀奶样电泳图(M为DNAMarker1000；1为阴性对照；2～3为027混匀血样；4为M5混匀血样；5为S2混匀血样；6～9为PBS混匀血样)；
图7为实施例3中采用LAMP法检测检测布鲁氏菌混匀奶样电泳图(M为DNAMarker500；1为布鲁氏菌027株混匀血样；2为布鲁氏菌S2株混匀血样；3～4为布鲁氏菌M5株混匀血样；5为PBS混匀血样)；
图8为实施例3中采用PCR法检测检测布鲁氏菌M5株混匀奶样电泳图(M为DNAMarker 1000；1为阴性对照；2为PBS混匀血样；3～7为M5混匀血样；8为S2混匀血样；9为027混匀血样)。
具体实施方式
本发明提供了一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的引物组，所述引物组包括两条外引物F3和B3；两条内引物FIP和BIP，所述内引物FIP具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述内引物BIP具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
所述外引物F3具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
所述外引物B3具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述内引物FIP具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
ACAAACGCCTCAACAGTGGGCATGAACTCTGGAAAACCCCG。
在本发明中，所述内引物BIP具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
TTGATGTGGCGGATAGGCAGCAAGCAAGCCCGCACAATG。
在本发明中，所述外引物F3具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：AACCTGGCTAAAGAGCAGC。
在本发明中，所述外引物B3具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列CGGATACGATTGCCGATCAG。
本发明提供了一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的试剂盒，包括上述方案所述的引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BST DNA酶溶液和去离子水。
在本发明中，所述外引物和内引物的浓度独立优选为25μm/L。在本发明中，所述外引物和内引物由上海祥音生物科技技术公司合成。
在本发明中，所述MgSO4的浓度优选为6mmol/L。本发明对所述MgSO4的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述dNTP的浓度优选为7mmol/L。在本发明中，所述dNTP购自北京康为世纪生物科技有限公司。在本发明中，所述甜菜碱的浓度优选为3mmol/L。本发明对所述甜菜碱的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
在本发明中，每25μL反应体系中包括如下组分：上述方案所述的外引物F3和B30.5μL、上述方案所述的内引物FIP和BIP3.5μL，MgSO42.7μL、dNTP 1.90μL、甜菜碱2.5μL、BSTDNA酶1.2μL和余量的去离子水。
本发明提供了一种上述方案所述的试剂盒鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的检测方法，包括如下步骤：
1)提取待测菌DNA，得到DNA模板；
2)将所述步骤1)的2μLDNA模板与引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BSTDNA酶溶液和去离子混合，进行LAMP反应，反应结束后判断检测结果；
所述LAMP反应的条件为：在63.9～64.7℃恒温扩增55min后升温至80～81℃终止反应。
本发明提取待测菌DNA，得到DNA模板。在本发明中，提取待测菌DNA的方法优选为采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。本发明对所述提取试剂盒的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中购自北京天根生物科技股份公司。本发明中，所述提取待测菌DNA的方法按照试剂盒说明书进行即可。
得到DNA模板后，本发明将2μLDNA模板与引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BST DNA酶溶液和去离子水混合，进行LAMP反应，反应结束后判断检测结果；所述LAMP反应的条件为：在63.9～64.7℃恒温扩增55min后升温至80～81℃终止反应。在本发明中，所述扩增的温度优选为64.1℃。所述终止反应的温度优选为80.5℃。在本发明中，将DNA模板加入到反应体系中时优选还包括加入1μL钙黄绿素，反应终止后通过颜色变化判断检测结果。通过颜色变化判断检测结果时，当待测布鲁氏菌颜色为黄绿色，则检测结果为非M5疫苗株。或者通过3％琼脂糖凝胶电泳进行检测判断待测菌是否为M5菌株，当待测布鲁氏菌进行电泳检测后，无梯形条带出现，则为M5菌株。在本发明中，所述钙黄绿素购自北京蓝谱生物科技公司。在本发明中，所述琼脂糖凝胶用琼脂糖粉购自香港BD公司。
本发明提供了一种上述方案所述的试剂盒在鉴别布鲁氏菌流行株和M5株中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
引物的设计与具体实施方式中的引物设计相同，在此不再赘述，引物序列与具体实施方式中的引物的序列相同，在此不再赘述。
配制反应体系：外引物0.5μL、内引物3.5μL，MgSO42.7μL、dNTP 1.90μL、甜菜碱2.5μL、BST DNA酶1.2μL，补加去离子水至25μL。
以布鲁氏菌027株为阳性对照，以布鲁氏菌M5株，S2株，沙门氏菌，大肠杆菌，苍白杆菌为实验组，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，分别吸取上述得到的DNA2μL，分别加入到反应体系中，在64.1℃扩增55min后升温至80.5℃终止反应，通过3％琼脂糖凝胶电泳观察实验结果，具体结果如图1～2所示。由图1可以看出，布鲁氏菌027株，S2株出现较为明显的梯形条带，M5无梯形条带出现。实验结果表明：在布鲁氏菌属内，可以鉴别区分布鲁氏菌M5株，但不能鉴别出布鲁氏菌027株与S2株。由图2可以看出，以苍白杆菌，沙门氏菌，大肠杆菌、链球菌及M5基因组DNA为扩增模板时未出现梯形条带，而布鲁氏菌027株，S2株出现较为明显的梯形条带。实验结果表明：本发明提供的方法能够鉴别出M5菌株，本发明提供的检测方法特异性好。
同时，分别吸取上述布鲁氏菌027株、S2、M5、沙门氏菌、苍白杆菌和大肠杆菌提取的DNA2μL，分别加入到反应体系中，同时在每个反应体系中分别加入1μL钙黄绿素，同时设置以无RNA水为模板的阴性对照。在64.1℃扩增55min后升温至80.5℃终止反应，在紫外灯下照射，检测试验结果，具体结果如图3所示(图3中7个离心管从左至右依次为布鲁氏菌027株、阴性对照、S2、M5、沙门氏菌、苍白杆菌和大肠杆菌)。由图3可以看出，在紫外灯下照射发现阳性对照与S2株为黄绿色，而M5株与其他阴性对照菌株与阳性对照颜色差异特别明显。实验结果表明：本发明提供的检测方法能够有效鉴别诊断布鲁氏菌新疆流行株与M5疫苗株，检测方法特异性好。
实施例2
采用无RNA酶水对被检基因质粒10倍梯度稀释至7.5ag/μL后，以各稀释度的质粒为模板采用实施例1的反应条件进行LAMP扩增，反应结束后采用3％琼脂糖凝胶电泳，检测LAMP法的灵敏性，具体检测结果如图4所示。由图4可以看出，经3％琼脂糖凝胶电泳后，梯形条带从75ng/μL的稀释度至7.5fg/μL稀释度明亮度依次降低。当稀释度为7.5fg/μL梯形条带几乎消失，实验结果表明本发明提供的LAMP法的检测极限在750ag/μL左右。同时使用外引物用PCR法进行检测。PCR方法的反应体系如表1所示，具体反应条件如表2所示。反应结束后采用3％琼脂糖凝胶电泳检测PCR法的灵敏性，具体检测结果如图5所示。由图5可以看出，采用PCR法的检测极限为7.5pg/μL。由图4和图5比较可知，本发明提供的LAMP法的灵敏性为PCR方法的1000倍。
表1 PCR反应体系
组分 用量
无RNA酶水 9.5μL
F3 0.5μL
B3 0.5μL
模板 1μL
MIX 12.5μL
表2 PCR反应条件
实施例3
分别将200μL已鉴定过无布鲁氏菌核酸的绵羊全血，与20μL布鲁氏菌027株，M5株，S2株及PBS混匀。使用血液基因组DNA试剂盒提取基因组DNA，采用提取的基因组DNA为扩增模板。使用Omp22引物(所述Omp22的正向引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：TGATGGGAGGGACCGACTA；所述Omp22的反向引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：TGGTTCTTCAGGTTGTTACGC)，采用上述提取的基因组DNA为扩增模板进行扩增，具体反应体系如表3所示，具体反应条件如表4所示，验证待测液中是否含有布鲁氏菌。具体检测结果如图6所示。由图6可以看出：027组、M5组与S2组均出现526bp大小的条带与预期条带大小一致。实验结果表明：027组、M5组和S2组均含有布鲁氏菌。在检测PBS组混匀奶样时，无条带出现，实验结果表明PBS组无布鲁氏菌。
表3 Omp22反应体系(25μL)
组分 用量
无RNA酶水 9.7μL
上游引物 0.4μL
下游引物 0.4μL
模板 2.0μL
Mix 12.5μL
表4 Omp22反应条件
温度 循环数 时间
95℃ 1 5min
94℃ 40s
58℃ 30 30s
72℃ 30s
72℃ 1 10min
4℃ 1 1min
使用血液基因组DNA试剂盒提取基因组DNA，采用提取的基因组DNA为扩增模板，采用实施例1的扩增条件与反应体系进行LAMP反应，反应结束后采用3％琼脂糖凝胶电泳检测结果，具体如图7所示。由图7可以看出：采用本发明提供的LAMP法检测混匀奶样时，检测布鲁氏菌027组与S2组时为阳性，出现梯形条带，而检测布鲁氏菌M5组与PBS组时为阴性，未出现梯形条带。
同时，采用F3，B3为引物采用PCR法进行检测，具体反应体系如表5所示，具体反应条件如表6所示。具体检测结果如图8所示。由图8可以得出：布鲁氏菌027组与S2组223bp大小的条带与预期条带大小一致。M5组与PBS组无条带出现。实验结果表明：本发明提供的LAMP法与PCR法检测含有布鲁氏菌027株、M5株、S2株与PBS混匀血样的检测结果相一致。实验结果表明：本发明提供的方法能够有效鉴别出布鲁氏菌新疆流行株。
表5 PCR反应体系
组分 用量
无RNA酶水 9.5μL
F3 0.5μL
B3 0.5μL
模板 1μL
MIX 12.5μL
表6 PCR反应条件
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的引物组、试剂盒及其应用
<130> GW2018I2556
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaaacgcct caacagtggg catgaactct ggaaaacccc g 41
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgatgtggc ggataggcag caagcaagcc cgcacaatg 39
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacctggcta aagagcagc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggatacgat tgccgatcag 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgatgggagg gaccgacta 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggttcttca ggttgttacg c 21

Claims (10)

1.一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的引物组，所述引物组包括两条外引物F3和B3；两条内引物FIP和BIP，其特征在于，所述内引物FIP具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述内引物BIP具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
所述外引物F3具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
所述外引物B3具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
2.一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BST DNA酶溶液和去离子水。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述外引物和内引物的浓度独立的为25μm/L；所述MgSO4的浓度为6mmol/L；所述dNTP的浓度为7mmol/L；所述甜菜碱的浓度为3mmol/L。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，每25μL反应体系中包括如下组分：权利要求1所述的外引物F3和B30.5μL、权利要求1所述的内引物FIP和BIP3.5μL，MgSO42.7μL、dNTP 1.90μL、甜菜碱2.5μL、BST DNA酶1.2μL和余量的去离子水。
5.权利要求2～4任意一项所述的试剂盒鉴别布鲁氏菌流行株和M5株的检测方法，包括如下步骤：
1)提取待测菌DNA，得到DNA模板；
2)将所述步骤1)的2μLDNA模板与引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BST DNA酶溶液和去离子混合，进行LAMP反应，反应结束后判断检测结果；
所述LAMP反应的条件为：在63.9～64.7℃恒温扩增55min后升温至80～81℃终止反应。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中扩增的温度为64.1℃。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中在80.5℃终止反应。
8.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中判断检测结果的方法为：采用3％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
9.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中将DNA模板与引物组、MgSO4溶液、dNTP溶液、甜菜碱溶液、BST DNA酶溶液和去离子水混合时还包括加入1μL钙黄绿素，反应终止后通过颜色变化判断检测结果。
10.权利要求2～4任意一项所述的试剂盒在鉴别布鲁氏菌中M5疫苗株中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113481311A (zh) * 2021-09-07 2021-10-08 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 用于鉴定布鲁氏菌疫苗株m5的snp分子标记及其应用
NL2034043B1 (en) * 2023-01-30 2023-09-11 Univ Shihezi Primer group, kit and method for identifying brucella epidemic strain and m5 strain and application thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018489A (zh) * 2015-08-07 2015-11-04 山东省农业科学院奶牛研究中心 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒
US10072309B1 (en) * 2015-05-08 2018-09-11 Dougbeh-Chris Nyan Methods for real-time multiplex isothermal detection and identification of bacterial, viral, and protozoan nucleic acids

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10072309B1 (en) * 2015-05-08 2018-09-11 Dougbeh-Chris Nyan Methods for real-time multiplex isothermal detection and identification of bacterial, viral, and protozoan nucleic acids
CN105018489A (zh) * 2015-08-07 2015-11-04 山东省农业科学院奶牛研究中心 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DI,D 等: "Brucella suis bv. 1 str. S2 chromosome I, complete sequence", 《GENBANK: CP006961.1》 *
张辉等: "羊种布鲁氏菌的分离鉴定及其ugpB基因的原核表达", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113481311A (zh) * 2021-09-07 2021-10-08 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 用于鉴定布鲁氏菌疫苗株m5的snp分子标记及其应用
NL2034043B1 (en) * 2023-01-30 2023-09-11 Univ Shihezi Primer group, kit and method for identifying brucella epidemic strain and m5 strain and application thereof

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