CN102382886A - 霍乱弧菌的链置换扩增恒温扩增(sda)快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种霍乱弧菌恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒内有模板预处理反应液、链置换扩增反应液Ⅰ、Bst DNA Polymerase，BsoBI。方法包括细菌DNA的提取、模板预处理、SDA链置换恒温扩增、核酸检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及恒温扩增快速检测霍乱弧菌的试剂盒及检测方法。
背景技术
霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病，属于国际检疫传染病之一，也是我国法定管理的甲类传染病。它可引起流行、爆发和大流行。临床特征为剧烈腹泻、呕吐、大量米泔样排泄物、水电解质紊乱和周围循环衰竭，严重休克者可并发急性肾功能衰竭。由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。霍乱在我国主要发生在夏秋季节，高峰期在7-8月间。2004年年末印度洋大地震和海啸中遇难人数突破15万，重灾区最先出现的疫情就有霍乱。
霍乱弧菌现有的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。目前尚未见用链置换扩增(SDA)技术快速、准确地检测上述菌株的试剂盒及其检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。
本发明的另一目的是提供一种霍乱弧菌的快速检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明提供的霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括：
(1)模板预处理反应液：包括1×NEB buffer 2，1.0μM上游内引物S1、1.0μM下游内引物S2、3％(V/V)二甲基亚砜、和ddH2O。
所述1×NEB buffer 2为：5mM NaCl、1mM Tris-HCl、1mM MgCl2、0.1mM二硫苏糖醇、和ddH2O，pH 7.9。
所述引物S1、S2分别如SEQ ID NO：1和2所示。
(2)链置换扩增反应液I：3％(V/V)二甲基亚砜，0.1mg/mL牛血清白蛋白，浓度分别为0.2mM的dATP、dGTP和dTTP，1.0mM dCTPαS，1×NEB buffer 2，和ddH2O。
(3)Bst DNA聚合酶；
(4)限制性内切酶BsoBI。
使用上述试剂盒检测霍乱弧菌的方法，包括步骤：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
(2)模板预处理程序：
取模板预处理反应液23μL，加入待检DNA 2μL，放入94℃水浴5min后迅速放入59℃的水浴中45s；然后94℃水浴25s和59℃水浴45s过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板。
(3)SDA扩增：首先将上述预处理的25μL模板溶液加入24.2μL链置换扩增反应液I中，95℃水浴加热5min，温度迅速冷却到0℃，然后加入0.4μL Bst DNA Polymerase与0.4μLBsoBI，置于59℃水浴反应1h。
(4)核酸凝胶电泳检测：
反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测；电泳板上出现100bp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。
本发明的试剂盒根据目标菌株的保守基因序列设计引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的链置换扩增技术(SDA)技术，特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特别适用于基层医疗机构及食品公司与相关检测部门。
附图说明
图1：其中，1阴性对照 2-3霍乱弧菌样品 4霍乱弧菌阳性对照 5 DNA Marker
具体实施方式
SDA(Strand displacement amplification)反应是一种恒温、酶控的体外核酸扩增技术，主要依据限制性内切酶识别并切割半硫代磷酸化DNA的未修饰链以形成一个切口，在具有链置换能力的DNA聚合酶的作用下从切口处聚合延伸并取代下游DNA链。被置换下的单链DNA再与引物结合并由DNA聚合酶延伸成双链DNA。这种“切口一扩增一置换”不断循环往复达到靶序列高效扩增的目的。
基于上述原理，本发明提供的霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括：
(1)模板预处理反应液：包括1×NEB buffer2，1.0μM上游内引物(S1)、1.0μM下游内引物(S2)、体积比3％DMSO(二甲基亚砜)、和ddH2O。
所述1×NEB buffer 2为：5mM NaCl、1mM Tris-HCl、1mM MgCl2、0.1mM Dithiothreitol(二硫苏糖醇)、和ddH2O，pH 7.9。
霍乱弧菌引物：
S1 5’-CAGCCTGACACCAGACAA-
-3’(SEQ ID NO：1)
S2 5’-ACCGCATCGAATGCATGT--3’(SEQ ID NO：2)
(注：其中黑体部分为与霍乱弧菌hlyA基因片段匹配的序列)
(2)链置换扩增反应液I：体积比3.0％DMSO，0.1mg/mL BSA(牛血清白蛋白)，浓度分别为0.2mM的dATP、dGTP和dTTP，1.0mM dCTPαS(购自BIOLOG公司(德国)、2’-deoxyeytidine-5’-O-(1-thiotriphosphate)、100μL(100mM))，1×NEB buffer 2，ddH2O。
(3)Bst DNA Polymerase(购自NewEnglandBiolabsLTD、链延伸DNA聚合酶、8000U/mL)
(4)BsoBI(购自NewEnglandBiolabsLTD、限制性内切酶BsoBI、10000U/mL)
使用上述试剂盒检测霍乱弧菌的方法，包括步骤：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
(2)模板预处理程序：
取模板预处理反应液23μL，加入待检DNA 2μL，放入94℃水浴5min后迅速放入59℃的水浴中45s；然后94℃水浴25s和59℃水浴45s过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板。
(3)SDA扩增：首先将上述预处理的25μL模板溶液加入24.2μL链置换扩增反应液I中，95℃水浴加热5min，温度迅速冷却到0℃，然后加入0.4μL Bst DNA Polymerase与0.4μLBsoBI，置于59℃水浴反应1h。
(4)核酸凝胶电泳检测：
反应结束后，在反应管中加入6×Loading buffer(组分：30mM EDTA；36％(v/v)Glycerol；0.05％(w/v)Xylene Cyanol FF；0.05％(w/v)Bromophenol Blue)，自然冷却至室温，用琼脂糖凝胶电泳检测产物，电泳40分钟，电泳成像系统拍照。
电泳板上出现100bp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作为本发明的限制。
实施例(霍乱弧菌的检测)
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
(2)模板预处理程序：
取模板预处理反应液23μL，加入待检DNA 2μL，放入94℃水浴5min后迅速放入59℃的水浴中45s；然后94℃水浴25s和59℃水浴45s过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板。
取2份模板预处理反应液23μL，分别加入2μL ddH2O和霍乱弧菌DNA，重复上述步骤，产物用作SDA模板，作为阴性对照和阳性对照；
(3)SDA扩增：首先将上述预处理的25μL模板溶液加入24.2μL链置换扩增反应液I中，95℃水浴加热5min，温度迅速冷却到0℃，然后加入0.4μL Bst DNA Polymerase与0.4μLBsoBI，置于59℃水浴反应1h。
(4)核酸凝胶电泳检测：
反应结束后，在反应管中加入6×Loading buffer，自然冷却至室温，用琼脂糖凝胶电泳检测产物，电泳40分钟，电泳成像系统拍照。结果如图1所示。说明此检测方法特异性强，快速可靠，具有简单快速的特点。
Claims (2)
1.一种霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：
(1)模板预处理反应液：1×NEB buffer 2，1.0μM上游内引物S1、1.0μM下游内引物S2、3％(V/V)二甲基亚砜、和ddH2O；
所述1×NEB buffer 2为：5mM NaCl、1mM Tris-HCl、1mM MgCl2、0.1mM二硫苏糖醇、和ddH2O，pH 7.9；
所述引物S1、S2分别如SEQ ID NO：1和2所示；
(2)链置换扩增反应液I：3％(V/V)二甲基亚砜，0.1mg/mL牛血清白蛋白，浓度分别为0.2mM的dATP、dGTP和dTTP，1.0mM dCTPαS，1×NEB buffer 2，和ddH2O；
(3)Bst DNA聚合酶；
(4)限制性内切酶BsoBI。
2.使用权利要求1所述试剂盒检测霍乱弧菌的方法，其特征在于包括步骤：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内；
(2)模板预处理程序：
取模板预处理反应液23μL，加入待检DNA 2μL，放入94℃水浴5min后迅速放入59℃的水浴中45s；然后94℃水浴25s和59℃水浴45s过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板；
(3)SDA扩增：首先将上述预处理的25μL模板溶液加入24.2μL链置换扩增反应液I中，95℃水浴加热5min，温度迅速冷却到0℃，然后加入0.4μL Bst DNA聚合酶与0.4μLBsoBI，置于59℃水浴反应1h；
(4)核酸凝胶电泳检测：
反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测；电泳板上出现100bp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。
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|---|---|---|---|---|
| CN107385057A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-24 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 检测霍乱弧菌的rpa‑iac引物及方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101113475A (zh) * | 2007-05-30 | 2008-01-30 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增 |
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| CN101113475A (zh) * | 2007-05-30 | 2008-01-30 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增 |
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| CN107385057B (zh) * | 2017-08-10 | 2020-11-13 | 广州海关技术中心 | 检测霍乱弧菌的rpa-iac引物及方法 |
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