CN101386885A - 产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法 - Google Patents

产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；其中的反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5－TGAATCCACGGCTCTTCCCT－TGGTTATGGATTGGCAGG－3、下游内引物5－GGTT GTGGGAATGCTCCAAG－ACTTTGGGTTTTTTCATCGC－3、上游外引物5－GATATTGCTCCAGCAGCA－3、下游外引物5－CGTCAAGGAATTTTACACCTAG－3和甜菜碱；检测产霍乱毒素霍乱弧菌的方法包括细菌DNA的提取、产霍乱毒素霍乱弧菌的环介导等温扩增、显色检测。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

Description

产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法。
背景技术
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)属于弧菌科、革兰氏阴性菌，菌体细小呈现弯曲状，是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病，曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高。根据菌体(O)抗原的不同，霍乱弧菌可分出200个以上的O血清群(O serogroups)，但仅发现01和0139群霍乱弧菌能引发霍乱。1992年以前，仅01群霍乱弧菌(V.cholerae 01)的两个生物型，即古典生物型(Classical biotype)和埃尔托生物型(El Tor biotype)引发了七次霍乱世界大流行，而对01群以外的其他血清群，统称为非01群霍乱弧菌(V.cholerae non-01)，这些弧菌广泛分布于自然界水体中，一般不致病或仅引起散发性腹泻病例和肠道外感染。1992年10月以后，印度首次发生了由非01群霍乱弧菌引起的霍乱大暴发，其病原被鉴定为0139血清群霍乱弧菌(V.cholerae 0139)，这个新确认的0139血清群与其他非01群霍乱弧菌的最大不同点，是它能产生与01群霍乱弧菌相同的霍乱毒素(Choleratoxin，CT)，所引起的霍乱在临床和流行病学上也与01群霍乱弧菌所致霍乱基本相同。因此，世界卫生组织确认霍乱应包括古典霍乱、埃尔托霍乱和0139霍乱，并同样按《国际卫生条例》中有关霍乱的规定报告和处理。霍乱弧菌主要通过水、食物、日常生活接触和苍蝇等不同途径传播或蔓延，其中水作用最为突出。霍乱弧菌经口进入人体后，在小肠定位繁殖，并产生毒素，由于毒素作用于机体而产生一系列反应，导致霍乱症状的发生。
现有霍乱弧菌的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等，常规方法耗时长，胶体金免疫层析试验法灵敏度较差，PCR虽可弥补上述不足，但它的成本又较高。环介导等温扩增方法特异性好、灵敏度高，可以进行快速检测，目前尚未见用环介导等温扩增方法检测霍乱弧菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法，其中包括的试剂如下(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液：
其中包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引内物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游内引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜碱；
上游内引物：
5-TGAATCCACGGCTCTTCCCT-TGGTTATGGATTGGCAGG-3、
下游内引物：
5-GGTTGTGGGAATGCTCCAAG-ACTTTGGGTTTTTTCATCGC-3、
上游外引物：5-GATATTGCTCCAGCAGCA-3、
下游外引物：5-CGTCAAGGAATTTTACACCTAG-3、
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。
其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷—盐酸(Tris—HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X—100(Triton X—100)；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREENI或者DNAGreen。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有22μL，其最佳组成为：2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL 25mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、4.0μL 10μmol/L上游内引物(FIP)、4.0μL 10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL 10μmol/L下游外引物(B3)、2μL 100mmol/LMgSO4、5μL 5M甜菜碱和2.1μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
使用上述方法检测产霍乱毒素霍乱弧菌，依次包括下列步骤(1)-(3)：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
(2)进行产霍乱毒素霍乱弧菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置3—5min，立即置于冰上1—3min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60—65℃扩增反应45—90min；
C.将水浴调到80—85℃终止反应，3—5min后取出待检；
(3)显色检测；
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为产霍乱毒素霍乱弧菌。
本发明是根据产霍乱毒素霍乱弧菌ctxA基因的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为产霍乱毒素霍乱弧菌所共有，以保证检测不同来源的产霍乱毒素霍乱弧菌的可靠性。本发明采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，特别适用于基层医疗机构。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
实施例1
按下列配方制作产霍乱毒素霍乱弧菌的环介导等温扩增反应液：
(1)LAMP反应液：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL 25mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、4.0μL 10μmol/L上游内引物(FIP)、4.0μL 10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL 10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL 10μmol/L下游外引物(B3)、2μL 100mmol/L MgSO4、5μL 5M甜菜碱和2.1μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物：
5-TGAATCCACGGCTCTTCCCT-TGGTTATGGATTGGCAGG-3、
下游内引物：
5-GGTTGTGGGAATGCTCCAAG-ACTTTGGGTTTTTTCATCGC-3、
上游外引物：5-GATATTGCTCCAGCAGCA-3、
下游外引物：5-CGTCAAGGAATTTTACACCTAG-3
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
按照以下(1)-(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取
检测菌种01血清型霍乱弧菌(V.cholerae 01)，菌种来源中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，编号GD98204。
使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。
(2)进行01血清型霍乱弧菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在各反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65℃扩增反应1小时；
C.将水浴调到80℃终止反应，3min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品为01血清型霍乱弧菌。
实施例2
按下列配方制作产霍乱毒素霍乱弧菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)LAMP反应液：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL 25mmol/L dNTP、4.0μL10μmol/L上游内引物(FIP)、4.0μL 10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL 10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL 10μmol/L下游外引物(B3)、2μL 100mmol/L MgSO4、5μL 5mol/L甜菜碱和2.1μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。
上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料DNAGreen。
按照以下(1)-(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取
检测菌种0139血清型霍乱弧菌(V.cholerae 0139)，菌种来源中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，编号JS9803。
使用大连宝生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。
(2)进行0139血清型霍乱弧菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在各反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65℃扩增反应1h；
C.将水浴调到80℃终止反应，3min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，则待检样品也为0139血清型霍乱弧菌。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法
<160>4
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(38)
<400>1
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(40)
<400>2
Figure A200810157500D00092
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(18)
<400>3
Figure A200810157500D00093
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(22)
<400>4

Claims (3)

1.环介导等温扩增检测产霍乱毒素霍乱弧菌的试剂，其特征是该试剂包括(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增反应液：
包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引内物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游内引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷—盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X—100；
其中上游内引物：
5-TGAATCCACGGCTCTTCCCT-TGGTTATGGATTGGCAGG-3；
下游内引物：
5-GGTTGTGGGAATGCTCCAAG-ACTTTGGGTTTTTTCATCGC-3；
上游外引物：5-GATATTGCTCCAGCAGCA-3；
下游外引物：5-CGTCAAGGAATTTTACACCTAG-3；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.环介导等温扩增检测产霍乱毒素霍乱弧菌的试剂，其特征是上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。
3、利用权利要求1中所述的试剂进行等温快速检测产霍乱毒素霍乱弧菌的方法，其特征是依次包括(1)-(3)下列步骤：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内；
(2)进行产霍乱毒素霍乱弧菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温95℃放置3—5min，立即置于冰上1—3min；
B.再在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温65℃扩增反应45—90min；
C.将温度调到80℃终止反应，3—5min后取出待检；
(3)显色检测：
在每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为产霍乱毒素霍乱弧菌。
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