CN101008038A - 用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
涉及一种用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒及方法，试剂盒包括LAMP反应液A、Bst DNA聚合酶B、显色剂C，其LAMP反应液A中上游内引物为：gcggtcgtgggttacatttccattttaaggccaacaaagacgct；下游内引物为：cagcatactgagtggttgccgcttttgcgatggtactaactgcgt；上游外引物为：tcggataatgtggcgaaagc；下游外引物为：tcacccatgtctgggtgtt。检测方法包括细菌DNA的提取、拟态弧菌的环介导等温扩增、显色检测。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高，且成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒，进一步涉及一种使用该种试剂盒快速检测拟态弧菌的方法。
背景技术
拟态弧菌(Vibrio mimicus)是在生化特性上与非01-霍乱弧菌类似的革兰氏阴性菌，广泛分布于自然水域和水产动物体内。该菌通过产生多种毒力因子而引起鱼类、甲壳类等水产动物严重的腹水病，还可通过水产动物或水产品感染人类，引起人类的发烧、腹泻、呕吐、腹部痉挛等疾病，给人类健康和水产养殖业构成严重威胁，是重要的人类食源性疾病和水产养殖动物疾病病原。
以往检测拟态弧菌主要有两种办法：1.生化鉴定法，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；2.聚合酶链式反应法(PCR法)，该法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未有用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒及方法的报道。
发明的内容
本发明的目的是提供一种快速、特异性强、灵敏度高且成本低的用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法检测拟态弧菌的试剂盒，并提供一种使用该试剂盒快速检测拟态弧菌的方法，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始的茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的有两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的一种用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒，其试剂包括：
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A：
含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500uM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、2-4mM硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.2uM上游内引物(mim-FIP)、0.8-1.2uM下游内引物(mim-BIP)、0.2-0.3uM上游外引物(mim-F3)、0.2-0.3uM下游外引物(mim-B3)和1-1.5M甜菜碱；
其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾(KCl)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、20mM硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；
上游内引物(mim-FIP)为：gcggtcgtgggttacatttccattttaaggccaacaaagacgct；
下游内引物(mim-BIP)为：cagcatactgagtggttgccgcttttgcgatggtactaactgcgt：
上游外引物(mim-F3)为：tcggataatgtggcgaaagc；
下游外引物(mim-B3)为：tcacccatgtctgggtgtt；
(2)Bst DNA聚合酶B：每微升含8个活性单位(8U/uL)；
(3)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23uL的最佳组成为：2.5uL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游内引物(mim-FIP)、1.0uL 20uM下游内引物(mim-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(mim-F3)、0.25uL20uM下游外引物(mim-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜碱和4uL ddH2O(灭菌双蒸水)。
使用上述环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒检测拟态弧菌的方法，依次包括下列步骤：
(1)细菌DNA的提取
A.取1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；
B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；
C.加入100-150uL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴10-15分钟；
D.用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。
(2)拟态弧菌的环介导等温扩增
A.在装有23uLLAMP反应液A的反应管中加入1uL待检模板DNA，于恒温金属浴上95℃放置3-5分钟，立即置于冰上1-3分钟；
B.在反应管中加入1uL下游内引物(para-BIP)DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上60-65℃放置45-90分钟；
D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5分钟后取出；
(3)显色检测
在反应管中加入1uL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检细菌不是拟态弧菌，如颜色变为绿色，则说明样品为拟态弧菌。
本发明的优点：
本发明建立了拟态弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，本试剂盒根据拟态弧菌的基因保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，以保证检测不同来源拟态弧菌株的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于拟态弧菌的检测，特别适合于基层医疗机构以及养殖现场应用。
具体实施方式
下列实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。
按下列配方制作拟态弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒：
(1)LAMP反应液A：
2.5uL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游内引物(mim-FIP)、1.0uL 20uM下游内引物(mim-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(mim-F3)、0.25uL 20uM下游外引物(mim-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜碱和4uL ddH2O(灭菌双蒸水)。
(2)Bst DNA聚合酶B：浓度为8U/uL。
(3)显色剂C：10％的SYBR GREEN I。
按照以下程序进行检测：
(1)细菌DNA的提取
A.取1.0mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机12000转/分离心5分钟，弃上清液；
B.加入1.0mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5分钟，弃上清液；
C.加入100uL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴10分钟；
D.用台式离心机12000转/分离心10分钟，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。
(2)拟态弧菌的环介导等温扩增
A.在装有23uLLAMP反应液A的反应管中加入1uL待检模板DNA，于恒温金属浴上95℃放置5分钟，立即置于冰上1分钟；
B.在反应管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上65℃放置1小时；
D.将金属浴调到80℃中止反应，3分钟后取出。
(3)显色检测
在反应管中加入1uL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检细菌不是拟态弧菌，如颜色变为绿色，则说明样品为拟态弧菌。
Claims (3)
1.一种用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒，其试剂包括：
(1)环介导等温扩增反应液A：
含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500uM dNTP、2-4mM硫酸镁、0.8-1.2uM上游内引物、0.8-1.2uM下游内引物、0.2-0.3uM上游外引物、0.2-0.3uM下游外引物和1-1.5M甜菜碱；
其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
上游内引物为：gcggtcgtgggttacatttccattttaaggccaacaaagacgct；
下游内引物为：cagcatactgagtggttgccgcttttgcgatggtactaactgcgt；
上游外引物为：tcggataatgtggcgaaagc；
下游外引物为：tcacccatgtctgggtgtt；
(2)Bst DNA聚合酶B：每微升含8个活性单位；
(3)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
2.根据权利要求中1中所述的一种用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒，其特征是环介导等温扩增反应液A每管23uL的组成为：2.5uL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mMdNTP、1.0uL 20uM上游内引物、1.0uL 20uM下游内引物、0.25uL 20uM上游外引物、0.25uL20uM下游外引物、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜碱和4uL ddH2O。
3.一种使用权利要求1或2中所述的用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的试剂盒检测拟态弧菌的方法，依次包括下列步骤：
(1)细菌DNA的提取
A.取1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；
B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；
C.加入100-150 uL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴10-15分钟；
D.用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA；
(2)拟态弧菌的环介导等温扩增
A.在装有23uLLAMP反应液A的反应管中加入1uL待检模板DNA，于恒温金属浴上95℃放置3-5分钟，立即置于冰上1-3分钟；
B.在反应管中加入1uL下游内引物DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上60-65℃放置45-90分钟；
D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5分钟后取出；
(3)显色检测
在反应管中加入1uL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检细菌不是拟态弧菌，如颜色变为绿色，则说明样品为拟态弧菌。
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|---|---|---|---|---|
| CN102154469A (zh) * | 2011-01-14 | 2011-08-17 | 浙江大学 | 致病性弧菌通用检测法及所用的核酸等温扩增检测试剂盒 |
| CN113981051A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-01-28 | 厦门倍博特医学科技有限公司 | 用于hla-dpb*0202基因检测的引物组、试剂盒及其方法 |
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