CN101245375A - 创伤弧菌快速检测试剂盒的制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种创伤弧菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。其中试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、Bst DNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5－ACCTGTGTTCCATGCTGCTTCTATT CGCAACTGACATGTCGG－3、下游内引物5－TAACAA AGGTCACCGTCCAGGCCAGAACGCAGGTCTTGTGAA－3、上游外引物5－CCAGAGCCAGAGTTCTTCCT－3、下游外引物5－GGCCCATCTCTTCCATCAC－3和甜菜碱；检测创伤弧菌的方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、创伤弧菌的环介导等温扩增反应和显色检测。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种创伤弧菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。
背景技术
创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)是一种广泛分布于亚热带浅海水域及海产品如贝类、虾、蟹等，气候温暖的六月至十月，海中此类菌浓度高。创伤弧菌是革兰氏阴性菌，具移动性、弯曲的杆菌，单独存在或尾端连接成“C”或者“S”型。对酸性敏感，pH6以下就不生长。目前已发现100多种，其中至少11种会致病。创伤弧菌的感染造成临床上的病症有两种：
1原发性败血症(primary septicemia)此由肠胃感染引起的，是由于吃入生的或未煮熟的鱼虾类或生蚝，病人会有发热、恶心、呕吐、皮肤病变、坏死性溃烂及败血症休克等症状。创伤弧菌可放出强烈毒素进入血液，将引起败血病及休克，诱发全身器官衰竭导致死亡，死亡率高达50％以上，如果因而休克，死亡率更是在百分之九十以上。2伤口感染(infected wound)慢性肝病患者或者免疫力弱的人，若皮肤有伤口又接触到含有病菌的海水或被虾、蟹类刺伤，就有可能被创伤弧菌感染。感染该菌种的初期，在感染部位有肿胀、红斑、进而形成水泡，之后伤口溃烂蔓延，创伤弧菌会入侵筋膜和肌肉的间隙，出现组织坏死或严重的蜂窝性组织炎，然后病菌顺着间隙直上继续感染。创伤弧菌感染病情发展快速，通常从脚趾头蔓延到大腿只需一到两天时间。有时候甚至需要截肢来阻止感染蔓延，如果不幸很可能会引发次发性败血症造成死亡，死亡率约为24％。
目前病原性创伤弧菌的检测方法主要有、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验和16srRNA基因探针杂交技术，这些方法在检测时间、稳定性、敏感性等方面存在着一些不足。以往检测创伤弧菌的主要方法有三种：1.生理生化鉴定技术，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；2.酶联免疫吸附试验，3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该方法较前两种方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未见用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒及其方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、特异性强、灵敏度高而且成本低的用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法检测创伤弧菌的试剂盒，并提供一种创伤弧菌快速检测试剂盒的检测使用方法，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的创伤弧菌快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A：
其中含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.2μmol/L上游内引物(FIP)、0.8-1.2μmol/L下游内引物(BIP)、0.2-0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2-0.3μmol/L下游外引物(B3)和1-1.5mol/L甜菜碱；
其中所述的上游内引物5-ACCTGTGTTCCATGCTGCTTCTATTCGCAACTGACATGTCGG-3；
下游内引物5-TAACAAAGGTCACCGTCCAGGCCAGAACGCAGGTCTTGTGAA-3；
上游外引物5-CCAGAGCCAGAGTTCTTCCT-3；
下游外引物5-GGCCCATCTCTTCCATCAC-3。
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶B：每微升含8个活性单位(8U/μL)；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
上面所述的介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23μL的最佳组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
使用上述创伤弧菌的试剂盒检测创伤弧菌的方法，依次包括下列(1)-(3)步骤：
(1)样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取
A.取200mg待检样品或者1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；
B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；
C.加入100-150μL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴中加热10-15min；
D.然后用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，取上清至一个新的1.5mL离心管中，即为待检样品模板DNA；
(2)进行创伤弧菌的环介导等温扩增反应
A.在装有23μLLAMP反应液A的反应管中加入1μL待检样品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温金属浴上50℃放置3min，再于恒温金属浴上95℃放置3-5min，然后立即置于冰上1-3min；
B.在上述反应管中加入1μLBst DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上60-65℃放置45-90min；
D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者不是创伤弧菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品或者细菌含有或者为创伤弧菌。
本发明的优点在于建立了创伤弧菌快速检测试剂盒的制备和使用方法，本试剂盒根据创伤弧菌的glnA基因的基本保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为创伤弧菌各不同血清型和菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的创伤弧菌株的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于创伤弧菌的检测，特别适用于基层医疗机构以及养殖场现场。
具体实施方式
下列实例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
实施例1
按下列配方制作创伤弧菌快速检测试剂盒包括如下(1)-(4)：
(1)LAMP反应液A：
包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μ/L 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物5-ACCTGTGTTCCATGCTGCTTCT-ATTCGCAACTGAC ATGTCGG-3；
下游内引物5-TAACAAAGGTCACCGTCCAGGC-CAGAACGCAGGTCTTGTG AA-3；
上游外引物5-CCAGAGCCAGAGTTCTTCCT-3；
下游外引物5-GGCCCATCTCTTCCATCAC-3。
其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；
(2)U NG酶：1U/μL
(3)Bst DNA聚合酶B：每微升含8个活性单位(8U/μL)；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
按照以下程序进行检测：
(1)细菌DNA的提取
A.取200mg待检样品或者1.0mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000转/分离心10min，弃上清液；
B.加入1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清液；
C.加入100μL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴中加热10min；
D.用台式离心机12000转/分离心5min，取上清液至另一个1.5mL离心管中，即为待检模板DNA；
(2)进行创伤弧菌的环介导等温扩增反应
A.在装有23μLLAMP反应液A的反应管中加入1μL待检模板DNA和0.5μL的UNG酶，于恒温金属浴上50℃放置3min，然后再在95℃的条件下放置5min，立即置于冰上1min；
B.在反应管中加入1μLBst DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上65℃放置1小时；
D.将金属浴调到80℃中止反应，3min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者不是创伤弧菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品或者细菌含有或者为创伤弧菌。
实施例2
按下列配方制作创伤弧菌快速检测试剂盒包括如下(1)-(4)：
(1)LAMP反应液A：
包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μ/L 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μLddH2O(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。
其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；
(2)UNG酶：1U/μL
(3)Bst DNA聚合酶B：每微升含8个活性单位(8U/μL)；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料DNAGreen。
按照以下程序进行检测：
(1)细菌DNA的提取
A.取200mg待检样品或者1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清液；
B.加入1.0-同意去掉)1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000转/分离心10min，弃上清液；
C.加入150μL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴中加热10min；
D.用台式离心机100000转/分离心10min，取上清液至另一个1.5mL离心管中，即为待检模板DNA；
(2)进行创伤弧菌的环介导等温扩增反应
A.在装有23μLLAMP反应液A的反应管中加入1μL待检模板DNA和0.5μL的UNG酶，于恒温金属浴上50℃放置3min，然后再在95℃的条件下放置5min，立即置于冰上1min；
B.在上述反应管中加入1μLBst DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上60℃放置1小时；
D.将金属浴调到90℃中止反应，3min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者不是创伤弧菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品或者细菌含有或者为创伤弧菌。
Claims (4)
1.一种金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括如下(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增反应液A：
含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol/L上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；
其中上游内引物5-TGCATTCCTGGAATAATGACGCGTTAAAGAAGATGGTATGTGGAAG-3、
下游内引物5-CAGAACGTGGTAAAATTTTAGACCGATCTCATATGCTGTTCCTGTA-3、
上游外引物5-CATTGATCGCAACGTTCAA-3、
下游外引物5-TTCTTTGGAACGATGCCT-3；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶B：8U/μL；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.根据权利要求1中所述的金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒，其特征是上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
3.根据权利要求1中所述的金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒，其特征是上述的环介导等温扩增反应液A每管23μL的组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物、1.0μL 20μmol/L下游内引物、0.25μL 20μmol/L上游外引物、0.25μL 20μmol/L下游外引物、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O。
4.一种金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒的使用方法，其特征是依次包括下列步骤：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
A.取200mg待检样品或者1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；
B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；
C.加入100-150μL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴中加热10-15min；
D.然后用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，取上清至一个新的1.5mL离心管中，即为待检样品模板DNA。
(2)进行金黄色葡萄糖球菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液A的反应管中加入1μL待检样品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温金属浴上95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；
B.在上述反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶B；
C.再于恒温金属浴上60-65℃放置45-90min；
D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5min后取出待检；
(3)显色检测：
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者是金黄色葡萄糖球菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品或细菌为金黄色葡萄糖球菌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080820 |