CN105154532A - 一种大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重lamp检测方法 - Google Patents

一种大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重lamp检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双重LAMP检测方法，该方法可同时检测大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌。属于分子生物学技术领域。所述LAMP检测体系中含有检测大菱鲆弧菌luxR和鱼肠道弧菌ToxR基因的引物组，该引物组分别包含luxR基因和ToxR基因的一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP；内引物BIP上分别含有EcoR？Ⅰ和EcoR？Ⅴ酶切位点。该发明方法灵敏度高，特异型好，检测成本低廉，检测速度快。

Description

一种大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重LAMP检测方法
技术领域
本发明涉及大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的检测方法，具体涉及大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重LAMP检测方法。
背景技术
大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)是一种革兰氏阴性菌，呈短杆状，现已知该菌是大菱鲆、牙鲆等重要经济鱼类的致病菌，病鱼症状为皮肤变黑、肝脏和小肠出血、并伴有腹水和腹胀；鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)是水产养殖中新发现的一种革兰氏阴性致病菌,呈杆状,两端钝圆,散在或成双,无芽孢,可感染大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、石鲽(Kareiusbicoloratus)等多种名贵海水养殖鱼类，造成严重的经济损失。
目前，针对大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的检测技术主要是PCR法、DNA杂交法和菌落杂交法。然而，由于这些方法通常需要昂贵的仪器设备，且操作繁琐、费时费力，很难推广应用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年由Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术，该技术根据靶序列设计四条特异性引物，可以特异性识别靶序列的六个特定区域，在等温条件下，通过BstDNA聚合酶的链置换和链延伸作用，可以在1小时内对靶序列实现109倍的扩增，扩增产物加入荧光染料SYBRGreenI后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可以通过肉眼直接观察，实现了大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的快速检测，且操作简便，特异性好，适合基层养殖场对病原的快速检测。
发明内容
本发明提供了一种大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重LAMP的检测方法，目的是实现对大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌进行特异、灵敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
1、提供2组LAMP引物序列，大菱鲆弧菌长度分别为49bp，43bp，18bp，20bp的核苷酸序列，分别命名为luxR-FIP、luxR-BIP、luxR-F3、luxR-B3，鱼肠道弧菌长度分别为46bp，46bp，18bp，19bp的核苷酸序列，分别命名为ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3；
2、配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳反应体系和反应条件；
3、反应产物的鉴定：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。
具体包括如下步骤：
1、设计LAMP引物：根据GeneBank中已知V.scophthalmi的luxR(GenBank:JN684209.1)和V.ichthyoenteri的ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物,对于V.scophthalmi，在FIP的F1c和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子；对于V.ichthyoenteri，在FIP的F1c和F2之间在BIP的B1c和B2之间添加EcorV酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子。设计以下两组引物：
2、配制LAMP反应体系
反应体系的终浓度为：总体系25μl,包括BstDNA聚合酶1μl(8000U/ml)，10×BstDNABuffer2.5μl，PCR级甜菜碱4μl(5M)，dNTPs(2.5mMeach)2.5μl,DNA模版1μl，FIP/BIP各1μl(0.8μM)，F3/B3各1μl(0.2μM)，加灭菌双蒸水使反应体系总体积达到25μl。
3、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58到65℃，反应时间为15到90min.。
4、扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。
本发明提供的大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌双重LAMP检测方法，有以下优势：
一、灵敏度高对大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的检测可低至12CFU/ml,比普通PCR高100倍。
二、特异性强所需的特异性引物分别根据大菱鲆弧菌的luxR基因和鱼肠道弧菌的ToxR基因六个不同区域进行设计，特异性比常规PCR强。
三、检测时间段1h左右即可获得检测结果，比普通PCR省时。
四、仪器设备要求低不需要PCR仪等昂贵仪器，产物可以进行电泳，也可以直接加入SYBRGreenI染料，观察颜色变化，从而确定反应与否。
五、操作简单、结果易观察：整个检测过程不涉及复杂仪器设备，产物加入SYBRGreenI染料，可以直接用肉眼观察判断。
综上所述，本发明具有比现有的PCR技术检测大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的方法，有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在实际生产中用于现场检测，有利于及时发现鱼类养殖中的大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的感染。
附图说明
图1双重LAMP反应体系温度的优化(A:V.scophthalmi；B：V.ichthyoenteri)
反应温度温度梯度从左往右依次58℃到65℃8个梯度1，3，5，7，9，11，13，15分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃的阴性对照；2，4，6，8，10，12，14，16分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃加模版。M：marker。。
图2双重LAMP反应体系时间的优化(A:V.scophthalmi；B：V.ichthyoenteri)
反应时间1—6分别代表15min,30min,45min,60min,75min,90min；M为marker。
图3双重LAMP反应的琼脂糖凝胶电泳图谱及酶切分析
A:V.scophthalmi，1：酶切图谱，2：LAMP扩增产物，M:Marker；
B:V.ichthyoenteri，1：酶切图谱，2：LAMP扩增产物M:Marker。
图4大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌双重LAMP检测方法与普通PCR检测方法的灵敏度比较M:Marker；1-81.2×107CFU/ml-1.2×100CFU/mlCFU/ml；N:negativecontrol。
图5特异性结果统计只有大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌有扩增，其他菌均没有扩增。
图6双重LAMP检测方法的应用-SYBRGreenI法显色反应对人工感染的大菱鲆鱼的肝、肾、脾、血进行双重LAMP扩增，产物加入SYBRGreenI，感染组显示绿色，对照组无变化。1，3，5，7：(感染组A:感染大菱鲆弧菌；B:感染鱼肠道弧菌)脾、肾、肝、血。2，4，6，8：(健康组)脾、肾、肝、血。
图7双重LAMP检测方法的应用-平板计数法结合双重LAMP计数细菌的最低检出率。
具体实施方式：
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1
1大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌双重LAMP方法的建立
1.1材料
dNTPs、BstDNA聚合酶(含10×缓冲液)、PCR级甜菜碱
1.2方法
1.2.1引物设计与合成
设计LAMP引物：根据GeneBank中已知V.scophthalmi的luxR(GenBank:JN684209.1)和V.ichthyoenteri的ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物,对于V.scophthalmi，在FIP的F1c和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子；对于V.ichthyoenteri，在FIP的F1c和F2之间添加EcorV酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。
1.2.2LAMP扩增条件的优化
优化反应温度和反应时间。检测所用的模板用煮沸裂解法制备。分别在温度和时间上设置的不同梯度，进行优化。温度上从58℃到65℃每隔1℃设置一个梯度；时间上15min一个梯度，设置6个梯度。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
分析温度电泳图：大菱鲆弧菌在58℃到65℃均可发生反应，产生阶梯状扩增条带，且电泳条带亮度接近；鱼肠道弧菌在65℃均无明显阶梯状扩增条带，但在58℃到64℃有阶梯状扩增条带，且条带亮度相当(见图1-A和图1-B)。
分析时间电泳图：大菱鲆弧菌在30min时，出现明显的阶梯状条带，鱼肠道弧菌在45min时，出现明显的阶梯状扩增条带(见图2-A和图2-B)。
比较V.vulnificus和V.parahaemolyticus两种弧菌的电泳图谱，选择62℃反应45min即可产生清晰的阶梯状扩增条带。
实施例2
限制性内切酶酶切分析
为了构建双重LAMP的检测方法，在V.scophthalmi和V.ichthyoenteri两种弧菌的内在引物FIP的F1c和F2之间分别添加EcorI限制性酶切位点和EcorV限制性酶切位点(两种弧菌的靶序列中都不含该两种限制性酶切位点)，利用限制性酶切分析来确定反应的正确性和特异性。在双重LAMP反应体系中只添加一种模板，并分别对扩增产物进行一种限制性酶切。结果表明：大菱鲆弧菌的扩增产物能够被EcorI限制性内切酶酶切，酶切得到的特异性条带见(图3-A1泳道)；鱼肠道弧菌能够被EcorV限制性内切酶酶切，酶切得到的特异性条带(见图3-B1泳道)，证明了双重LAMP扩增结果的正确性。
实施例3
大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌双重LAMP检测方法的灵敏度测定
1煮沸法提取DNA。
2为了检测LAMP方法的灵敏度，将提取大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，共8个梯度，各浓度级分别取1μL作为模版,进行优化条件后的LAMP扩增,扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
3分别取1μL作为PCR模板，F3/B3各1μl(20mM)，Taq酶0.5μl，dNTPs(2.5mMeach)1μl，Taq10×buffer2.5μl,ddH2O18μl，进行PCR扩增，94℃预变性5min；94℃变性30s,57℃退火40s，72℃延伸40s,25个循环；72℃延伸5min。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
PCR方法对2种致病菌不同稀释度的菌悬液进行灵敏度的检测，结果发现：大菱鲆弧菌最低均能检测到1.2x103CFU/ml，分别产生175bp的扩增条带(图4C)；副溶血弧菌最低均能检测到1.2x103CFU/ml，分别产生223bp的扩增条带(图4D)。双重LAMP检测方法灵敏度高，创伤弧菌最低能够检测到12CFU/ml，是普通PCR方法的102倍；副溶血弧菌最低能够检测到12CFU/ml，是普通PCR方法的102倍。
实施例4
1用煮沸法制备鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)，创伤弧菌(Vibriovulnificus)，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，大肠杆菌(E.coli)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，藤黄微球菌(Micrococcusluteus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的DNA模板,进行LAMP扩增，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。结果只有大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌有扩增条带(见图5)。
实施例5
双重LAMP方法具体检测鱼体内的大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌
1选取大菱鲆作为试验动物，通过腹腔注射方式分别人工感染2种弧菌。感染12h后，无菌操作，分别取血、肾、肝及脾组织，匀浆。匀浆液进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布LB固体培养基平板，计数。剩余血、肾、肝及脾组织的匀浆液经煮沸，进行10倍梯度稀释，双重LAMP方法检测其最低检出率，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶分析。
结果显示，双重LAMP方法可以在所有的感染组样品中，检测到2种弧菌的存在。向双重LAMP扩增反应管中加入1μl(1:10)SYBRGreenI，目测反应管中颜色的变化。结果发现，感染组的所有组织的反应管中均发生了阳性反应，颜色变为典型的绿色；对照组健康大菱鲆的所有组织的反应管中颜色变为橙色(图6)。
2结合平板计数和双重LAMP方法，计算各细菌感染组中所取组织细菌检出率(图7)。结果表明：感染大菱鲆弧菌的大菱鲆，脾、肾、肝和血液中大菱鲆弧菌的最低检出率分别为20CFU/ml、21CFU/ml、18CFU/ml和28CFU/ml；感染鱼肠道弧菌的大菱鲆，脾、肾、肝和血液中创伤弧菌的最低检出率分别为26CFU/ml、21CFU/ml、25CFU/ml和29CFU/ml。

Claims (2)

1.大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重LAMP检测方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)根据GeneBank中已知的大菱鲆弧菌luxR基因(GenBank:JN684209.1)和鱼肠道弧菌的ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物,对于大菱鲆弧菌，在FIP的F1c和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子；对于鱼肠道弧菌，在FIP的F1c和F2之间在BIP的B1c和B2之间添加EcorV酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子，设计以下两组引物：
(2)配制LAMP反应体系
反应体系的终浓度为：总体系25μl,包括BstDNA聚合酶1μl(8000U)，10×BstDNABuffer2.5μl，PCR级甜菜碱4μl(5M)，dNTPs(2.5mMeach)2.5μl,DNA模版1μl，FIP/BIP各1μl(0.8μM)，F3/B3各1μl(0.2μM)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl；
(3)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58℃到65℃，反应时间为45min到90min；
(4)扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI，观察反应管中颜色变化。
2.如权利要求1所叙述的大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重LAMP检测方法，其特征在于步骤3中的最适反应温度是62℃，最适反应时间45min。
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