CN101200757A - 一种人类重大病原菌-霍乱弧菌快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人类重大病原菌—霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的快速检测试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以霍乱弧菌16S－23SrRNA间区基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对人类的病原菌—霍乱弧菌的特异性DNA片断进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于人类烈性肠道传染病霍乱的临床检测，也用于水产动物各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。

Description

一种人类重大病原菌-霍乱弧菌快速检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种人类重大病原菌—霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的快速检测试剂盒，进一步涉及使用霍乱弧菌快速检测的试剂盒快速检测霍乱弧菌的方法。

背景技术

霍乱弧菌(V.cholerae)是引起烈性传染病霍乱的病原体，二千多年前已有记载。自1817年以来，已发生过7次世界性霍乱大流行，前6次均由霍乱弧菌古典生物型引起，1961年开始的第7次大流行由霍乱弧菌El Tor生物型引起。1992年一个新的流行株O139(Bengal)在沿孟加拉弯的印度和孟加拉一些城市出现，并很快传遍亚洲，这是首次由非O1群霍乱弧菌引起的流行霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病，经口感染。感染霍乱弧菌的病人主要临床表现为腹泻及呕吐等。严重的可发生剧烈的吐泻，排大量米汤样大便，容易造成严重失水，肌肉痉挛，甚至循环衰竭而死亡。可以说霍乱弧菌是细菌中对人类健康安全危害最大的种类之一，此菌引起的霍乱为我国的甲类法定传染病。另外，非O1群霍乱弧菌还是中国对虾，长毛对虾等对虾的烂眼病，鳗脱粘病的病原体，给水产养殖业带来较大的危害。霍乱弧菌引起的霍乱及其它病具有暴发快、流行广、死亡率高等特点，由于细菌极易对抗生素产生抗药性，因此对霍乱弧菌病应以预防为主，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对弧菌的检测技术主要包括传统的TCBS培养及进一步的形态及生理生化鉴定法、免疫学方法(主要有单克隆抗体技术、酶联免疫检测法(ELISA))、免疫电镜技术、分子生物学方法(主要有分子杂交技术、限制性内切酶长度多态(RELP))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长。有些所需的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大医务人员和水产养殖业主掌握的技术难度很大，很难推广，限制了这些技术的应用和发展。

早期快速检测人类重大病原菌-霍乱弧菌是目前预防霍乱暴发流行的主要措施和水产经济动物养殖业减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的检测试剂盒及其检测方法是广大医务工作者和水产养殖者急切盼望的。

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是上世纪80年代发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快就被应用于实践中。

发明内容

本发明的目的是利用霍乱弧菌16S-23S rRNA间区基因保守序列设计的一对引物，建立霍乱弧菌PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供一种人类重大病原菌-霍乱弧菌的快速检测试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于人类烈性传染病霍乱的临床检测，也可用于水产动物各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，也还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。

本发明的主要原理为：试剂A和B将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，试剂C和D为多聚酶链式反应技术试剂，通过试剂D中所含的霍乱弧菌特异DNA片断引物和试剂C中的热聚合酶等成分，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，由于我们设计的引物为霍乱弧菌所特有，因此，如果样品中含有霍乱弧菌，那么它的DNA的特异片断在经过扩增后，浓度将达到10⁸mol(克分子)以上，这样，在电泳和溴化乙锭染色后，紫外光检测就可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有霍乱弧菌，则不能扩增到同样分子量的目的条带。

为实现上述目的本发明采取的技术方案是：该人类重大病原菌-霍乱弧菌的检测试剂盒，由如下试剂组成：

(a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，

试剂A：含有NaCl 0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的乙二胺四乙酸0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通X-100；

试剂B：含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM的三羟基甲基氨基甲烷；

(b)聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂C和反应引物试剂D，

试剂C：含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl；

试剂D：包括特异引物对VcF和VcR、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl₂，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；

(c)电泳和显色试剂，包括试剂E和试剂F，

试剂E：为50倍TAE(电泳缓冲液)，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；

试剂F：含W/V为0.8-2％的琼脂糖和0.5-20μg/ml溴化乙锭；

试剂D中的特异引物对VcF和VcR为进行PCR反应的特异引物和必需成分，

VcF特指5′-TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG，

VcR特指5′-AGTCACTT AACCATACAACCCG。

每管反应试剂的最佳组成为：试剂C：5.0μl 10 x PCRBuffer，0.5μlTaqE(浓度5U/μl)，35.5μlddH₂O，试剂D：4.0μldNTP(2.5mM each)，3.0μlMgCl₂(25mM)，10pM VcF，10pM VcR。

试剂A为DNA提取缓冲液，为DNA的提取提供适宜的缓冲环境并抑制DNA的降解；试剂B为细胞裂解试剂，使细菌裂解并释放出DNA；试剂C为PCR反应预混试剂，为PCR反应试剂的主要成分之一，试剂D为PCR引物试剂，也是PCR反应的主要成分，包含有本试剂盒最为关键的特异引物VcF和VcR。试剂E为50倍TAE(电泳缓冲液)，为样品电泳提供合适的pH值、离子强度等的缓冲体系；试剂F为电泳介质琼脂糖+显色剂溴化乙锭。

使用快速检测霍乱弧菌的试剂盒快速检测霍乱弧菌的方法，依次按下列步骤：

(a)样品处理：取0.1-0.5克样品，用100-400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-5分钟，弃上清；

(b)DNA提取：用100-300μl试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-100μl试剂B混匀，室温放置2分钟以上，再在沸水浴中保温1-10分钟，使细胞完全破裂，释放出DNA；10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2倍即240-800μl的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5-10分钟，10000-12000g离心3-8分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10-50μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液；

(c)PCR扩增：以0.5-1μl提取的DNA作为聚合酶链式反应扩增的模板；取21-42μl试剂C与4-8μl试剂D混合；在热循环仪上对提取的DNA模板进行扩增，通过94℃-98℃解链2-5分钟；然后用93-95℃变性30秒-1分钟，58-62℃复性30秒-1分钟，72℃延伸30秒-1.5分钟，如此循环30-35次，最后在72℃保温8-10分钟，将霍乱弧菌的特异片断增加到10⁸mol以上；

(d)电泳和显色检测：取5-10μl扩增后的样品，与2-6μlV/V为0.25％的溴酚蓝混合，W/V为0.8-1.2％的琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条300核苷酸对的条带，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有霍乱弧菌感染或污染，反之则没有。

本发明的优点和积极效果：

基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术(聚合酶链式反应技术)，相对其它的弧菌病原检测技术和其它的病原检测技术而言，本方法有几个显著的优点：首先，该方法检测十分快速，3-4小时即可得知检测结果，而其它方法则至少需要3天或一个星期以上；其次，该方法检测灵敏度极高，检测下限低至10个左右的细菌，其它方法必须要有一定时间的纯培养增殖达到10⁵后才能进行检测。本发明可用于人类烈性传染病霍乱的临床检测，也可用于检测水产动物各时期养殖过程中的受霍乱弧菌感染的情况，也还可以监测各种环境中的病原霍乱弧菌，还可以检测各种水产品或医用器具是否受霍乱弧菌污染。

具体实施方式

下列实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。

实施例1：

按以下配方制作快速检测霍乱弧菌的试剂盒：

试剂A：0.1M NaCl，10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，5％TritonX-100；

试剂B：10mg/ml溶菌酶，10mM Tris.Cl(pH8.0)；

试剂C：5.0μl 10 x PCR Buffer，0.5μlTaqE(浓度5U/μl)，35.5μlddH₂O；

试剂D：4.0μldNTP(2.5mM each)，3.0μlMgCl₂(25mM)，10pM VcF，10pM VcR；

试剂E：50 x TAE；

试剂F：琼脂糖(1％)+溴化乙锭(0.5μg/ml)。

按照以下程序进行操作：

1.样品处理和DNA的提取：取虾组织约0.1-0.5克，在样品中加入400μl试剂A，灭菌牙签捣碎，12000g离心2分钟，弃上清，用350μl试剂A和50μl试剂B重新悬浮沉淀，混匀。室温放置5分钟，100℃水浴5分钟，冷却至室温。12000g离心10分钟，取上清，加入800μl无水乙醇，室温放置5分钟，彻底去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇挥发，将沉淀溶于30μl灭菌双蒸水，即为DNA提取液。

2.霍乱弧菌的特异片断扩增

在一管试剂C中加入1μlDNA提取液，再加入8μl试剂D，10000g离心30秒，在PCR热循环反应仪上进行如下反应：

94℃加热变性4分钟；然后在95℃解链1分钟，58℃复性45秒，72℃延伸30秒，共循环35次；在72℃保温8分钟后停止反应。

3.电泳和显色检测：反应结束后，取5-10μl反应液，与4μl V/V为0.25％溴酚蓝混合，用W/V为1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下检测，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有霍乱弧菌感染或污染；反之则没有。

实施例2：

按以下配方制作快速检测霍乱弧菌的试剂盒：

试剂A：0.3M NaCl，10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，5％TritonX-100：

试剂B：5mg/ml溶菌酶，10mM Tris.Cl(pH8.0)；

试剂C：2.5μl 10 x PCR Buffer，0.25μlTaqE(浓度5U/μl)，35.5μlddH₂O；

试剂D：2.0μldNTP(2.5mM each)，1.5μlMgCl₂(25mM)，10pM VcF，10pM VcR；

试剂E：50 x TAE；

试剂F：琼脂糖(1.2％)+溴化乙锭(0.8μg/ml)。

按照以下程序进行操作：

1.样品处理和DNA的提取：取鱼组织约0.1-0.5克，在样品中加入200μl试剂A，灭菌牙签捣碎，12000g离心2分钟，弃上清，用150μl试剂A和50μl试剂B重新悬浮沉淀，混匀。室温放置5分钟，100℃水浴5分钟，冷却至室温。12000g离心10分钟，取上清，加入400μl无水乙醇，室温放置5分钟，彻底去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇挥发，将沉淀溶于30μl灭菌双蒸水，即为DNA提取液。

2.霍乱弧菌的特异片断扩增

在一管试剂C中加入1μlDNA提取液，再加入8μl试剂D，10000g离心30秒，在PCR热循环反应仪上进行如下反应：

94℃加热变性3分钟；然后在95℃解链45秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；在72℃保温8分钟后停止反应。

3.电泳和显色检测：反应结束后，取5-10μl反应液，与4μl V/V为0.25％溴酚蓝混合，用W/V为1.2％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下检测，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有霍乱弧菌感染或污染；反之则没有。

Claims (3)

1.一种人类重大病原菌-霍乱弧菌的快速检测试剂盒，由如下试剂组成：

(a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，

试剂A：含有NaCl 0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的乙二胺四乙酸0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通X-100；

试剂B：含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM的三羟基甲基氨基甲烷；

(b)聚合酶链式反应试剂：含有反应预混试剂C和反应引物试剂D，

试剂C：含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl；

试剂D：含有特异引物对VcF和VcR、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl₂，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；

(c)电泳和显色试剂，含试剂E和试剂F，

试剂E：为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；

试剂F：含W/V为0.8-2％的琼脂糖和0.5-20μg/ml溴化乙锭；

所述VcF特指5′-TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG；所述VcR特指5′-AGTCACTTAACCATACAACCCG。

2.根据权利要求1中所述的一种人类重大病原菌-霍乱弧菌的快速检测试剂盒，其特征是每管反应试剂的配方为5.0μl10倍聚合酶链式反应缓冲液，2.5单位热聚合酶，35.5μl灭菌双蒸水4.0μl 2.5mMdNTP，3.0μl25mM MgCl₂，10pM VcF，10pM VcR。

3.一种使用权利要求1中所述的试剂盒快速检测霍乱弧菌的方法，依次按下列步骤：

(1)按照下列配方配制试剂：

试剂A：含有NaCl 0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的7二胺四乙酸0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通X-100；试剂B：含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM的三羟基甲基氨基甲烷；

试剂C：含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl；

试剂D：含有特异引物对VcF5′-TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG和VcR5′-AGTCACTTAACCATACAACCCG、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl₂，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；

试剂E：为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；

试剂F：含W/V为0.8-2％的琼脂糖和0.5-20μg/ml溴化乙锭；(2)按照下列步骤依次进行检测：

(a)样品处理：取0.1-0.5克样品，用100-400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-5分钟，弃上清；

(b)DNA提取：用100-300μl试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-100μl试剂B混匀，室温放置2分钟以上，再在沸水浴中保温1-10分钟，使细胞完全破裂，释放出DNA；10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2倍即240-800μl的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5-10分钟，10000-12000g离心3-8分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10-50μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液；

(c)聚合酶链式反应扩增：以0.5-1μl提取的DNA作为聚合酶链式反应扩增的模板；取21-42μl试剂C与4-8μl试剂D混合；在热循环仪上对提取的DNA模板进行扩增，通过94℃-98℃解链2-5分钟；然后用93-95℃变性30秒-1分钟，58-62℃复性30秒-1分钟，72℃延伸30秒-1.5分钟，如此循环30-35次，最后在72℃保温8-10分钟，将霍乱弧菌的特异片断增加到10⁸mol以上；

(d)电泳和显色检测：取5-10μl扩增后的样品，与2-6μlV/V为0.25％的溴酚蓝混合，W/V为0.8-1.2％的琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条300核苷酸对的条带，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有霍乱弧菌感染或污染，反之则没有。