CN110387428A - Ifi44l基因和pi3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途 - Google Patents

Ifi44l基因和pi3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途。本发明首次证明了IFI44L基因和PI3基因在细菌感染和病毒感染疾病中存在特征性变化，提供了一种诊断细菌/病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含TaqMan聚合酶链式反应体系、用于扩增IFI44L基因和PI3基因以及内参基因的引物对和TaqMan荧光探针；所述TaqMan聚合酶链式反应体系包含qPCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。与现有技术相比，利用本发明中的诊断试剂盒进行细菌感染和病毒感染的诊断，准确性达到90％以上，具有快速、可靠、特异性强、敏感性高的特点，有利于感染性疾病的早期诊断。

Description

IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的 用途
技术领域
本发明涉及IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途，属于生物医药技术领域。
背景技术
细菌感染是威胁人类健康的主要疾病之一，古埃及的木乃伊上就有细菌感染的痕迹。从中世纪欧洲肆虐多年的“黑死病”，到上世纪我国多次霍乱爆发流行，都是细菌感染严重威胁人类健康的惨痛记忆。2017年数据显示：全球直接死于细菌感染的人数超过15000000人。
自1929年英国人弗莱明发现青霉素以来，人类进入抗生素时代，抗生素挽救了千千万万的生命，然而半个多世纪后的今天，抗感染治疗并没有变得越来越简单，恰恰相反，我们正面临着更加严峻的挑战—越来越严重的细菌耐药问题。根据我国近年来CHINET数据：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)超过35％，超广谱beta内酰胺酶(ESBL)阳性肠杆菌超过50％，特别是2009年报道的“超级细菌(superbug)”，对几乎所有已知抗菌药物耐药。因此世界卫生组织2011提出口号：“抗击耐药—今天不采取行动，明天就无药可用！”同时，耐药菌治疗也会导致沉重的卫生负担，根据我国的报道，耐药菌治疗平均住院天数33.9天，比对照组住院时间延长15％，平均住院费用74511.7元，比对照组增加3.75倍。
病毒感染是指病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程，病毒感染常因病毒种类、机体状态不同产生轻重不一的损害。病毒感染是严重危害人类健康的重要疾病，1918年流感大流行导致2000万-5000万人死亡，近年来，“非典”、发热伴血小板减少综合征、寨卡病毒、高致病性禽流感、埃博拉等病毒性疾病流行造成大量人员死亡。目前对大多数病毒感染缺乏特效药物治疗，早期诊断至关重要。
由于诊断技术的局限，造成大量细菌感染漏诊或病毒感染的病人经验性使用抗生素、甚至激素，这些药物联用也很普遍，不仅造成细菌耐药，二重感染等药物继发损害，也会掩盖病情延误治疗，同时导致医疗负担加重。解决细菌耐药问题的根本措施，是要求抗菌药物合理使用，也就是“有的放矢”。抗菌药物应该用于确诊细菌感染的病人，而避免应用于非细菌感染病人。因此如何快速准确诊断细菌感染，对于治疗细菌感染性疾病以及遏制细菌耐药，都具有重要的临床价值和社会现实意义。
目前临床上用于诊断细菌感染的常用指标包括：血常规、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)。根据2018年权威医学综述，血常规诊断准确性57.4％，CRP诊断准确性64.3％，PCT诊断准确性65.6％，这些指标特异性和敏感性均不能满足临床需要，造成很多患者的误诊和漏诊。医学界一直试图找到更好的细菌感染诊断指标，然而无论蛋白水平还是细胞水平的检测方法均无法满足临床需要。因此，迫切需要建立一个可靠、快速、特异性强、敏感性高、易于推广、高性价比的细菌/病毒感染诊断方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途，本发明利用高通量测序技术发现IFI44L基因和PI3基因在细菌感染和病毒感染患者的外周血中的表达存在差异，通过检测IFI44L基因和PI3基因转录水平的表达情况，可以从感染患者中快速准确的区分细菌感染和病毒感染。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途，其特征在于，所述用途为IFI44L和PI3基因的检测试剂在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途。
根据本发明优选的，所述试剂盒包含TaqMan聚合酶链式反应体系、用于扩增IFI44L基因和PI3基因以及内参基因的引物对和TaqMan荧光探针；所述TaqMan聚合酶链式反应体系包含qPCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，一般包含MgSO4和一些稳定剂。
根据本发明优选的，所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的技术方案中，所述用于扩增IFI44L基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-AATGGTACGGAAATATGGAGGG-3'，反向引物序列5'-GAGATAAGTTGCCTTGATTCTGACA-3'；所述用于扩增PI3基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-CAAAGGTCCAGTCTCCACTAAG-3'，反向引物序列5'-GATTCCTGGGCAGTCAGTATC-3'。
根据本发明优选的，所述TaqMan荧光探针的核苷酸序列如下：IFI44L基因的TaqMan荧光探针序列5'-TCTCATTGCGGCACAC-3'，PI3基因的TaqMan荧光探针序列5'-TATCTTGATCCGGTGCGCCATGTT-3'，其中，IFI44L基因和PI3基因的TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC。
根据本发明优选的，所述内参基因为ACTB基因，用于扩增ACTB基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物序列5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'；ACTB基因的TaqMan荧光探针序列为5'-ACCTAACTTGCGCAGAAAACAAGAT-3'，其中，ACTB基因的TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为FAM。
本发明是同时进行IFI44L、PI3、ACTB单管单基因检测，再对IFI44L、PI3基因进行相对定量。
根据本发明优选的，所述试剂盒还包括M-MLV逆转录体系，所述逆转录体系包含：Random Primer p(dN)6、逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
进一步优选的，所述逆转录反应液包含：250mM Tris-HCI(pH 8.3)，375mM KCl，15mM MgCl2，50mM DTT。
本发明的第二方面，提供了一种诊断细菌/病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含TaqMan聚合酶链式反应体系、用于扩增IFI44L基因和PI3基因以及内参基因的引物对和TaqMan荧光探针；所述TaqMan聚合酶链式反应体系包含qPCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公认的现有技术，一般包含MgSO4和一些稳定剂。
根据本发明优选的，所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的实施方案中，所述用于扩增IFI44L基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-AATGGTACGGAAATATGGAGGG-3'，反向引物序列5'-GAGATAAGTTGCCTTGATTCTGACA-3'；所述用于扩增PI3基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-CAAAGGTCCAGTCTCCACTAAG-3'，反向引物序列5'-GATTCCTGGGCAGTCAGTATC-3'。
根据本发明优选的，所述TaqMan荧光探针的核苷酸序列如下：IFI44L基因的TaqMan荧光探针序列5'-TCTCATTGCGGCACAC-3'，PI3基因的TaqMan荧光探针序列5'-TATCTTGATCCGGTGCGCCATGTT-3'，其中，IFI44L基因和PI3基因的TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC。
根据本发明优选的，所述内参基因为ACTB基因，用于扩增ACTB基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物序列5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'；ACTB基因的TaqMan荧光探针序列为5'-ACCTAACTTGCGCAGAAAACAAGAT-3'，ACTB基因的TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为FAM。
根据本发明优选的，所述试剂盒还包括M-MLV逆转录体系，所述逆转录体系包含：Random Primer p(dN)6、逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
进一步优选的，所述逆转录缓冲液包含：250mM Tris-HCI(pH 8.3)，375mM KCl，15mM MgCl2，50mM DTT。
本发明的试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的第三方面，提供了上述试剂盒在诊断细菌/病毒感染中的应用。
本发明的优点和有益效果在于：
(1)本发明首次发现了IFI44L基因和PI3基因在细菌感染和病毒感染疾病中存在差异性表达，并证明了IFI44L基因和PI3基因在细菌感染和病毒感染疾病中存在特征性变化。与细菌感染患者相比，病毒感染患者的IFI44L基因的表达量明显升高；与细菌感染患者相比，病毒感染患者的PI3基因的表达量明显降低。IFI44L基因和PI3基因联合检测可以快速诊断细菌感染和病毒感染，同时为研究细菌感染和病毒感染的分子机理提供新的思路。
(2)与现有技术相比，利用本发明中的诊断试剂盒进行细菌感染和病毒感染的诊断，准确性达到90％以上，具有快速、可靠、特异性强、敏感性高的特点，有利于感染性疾病的早期诊断。
附图说明
图1为实施例2中IFI44L基因在细菌感染患者和病毒感染患者中相对表达量柱状图；图中，纵坐标为相对表达量，BI为细菌感染患者，VI为病毒感染患者；
图2为实施例2中PI3基因在细菌感染患者和病毒感染患者中相对表达量柱状图；图中，纵坐标为相对表达量，BI为细菌感染患者，VI为病毒感染患者；
图3为实施例2中IFI44L、PI3两个基因在菌感染患者和病毒感染患者中表达积分柱状图；图中，纵坐标为表达积分，BI为细菌感染患者，VI为病毒感染患者；
图4为实施例2中IFI44L、PI3两个基因在区分细菌感染和病毒感染中的ROC曲线；图中，纵坐标为敏感度，即真阳性率，横坐标为假阳性率，即100％-特异度％；
图5为实施例3中IFI44L基因在细菌感染患者、病毒感染患者以及健康对照中相对表达量柱状图；图中，纵坐标为相对表达量，BI为细菌感染患者，VI为病毒感染患者，HC为健康对照；
图6为实施例3中PI3基因在细菌感染患者、病毒感染患者以及健康对照中相对表达量柱状图；图中，纵坐标为相对表达量，BI为细菌感染患者，VI为病毒感染患者，HC为健康对照；
图7为实施例3中IFI44L、PI3两个基因在菌感染患者和病毒感染患者中表达积分柱状图；图中，纵坐标为表达积分，BI为细菌感染患者，VI为病毒感染患者。
图8为实施例3中IFI44L、PI3两个基因在区分细菌感染和病毒感染中的ROC曲线；图中，纵坐标为敏感度，即真阳性率，横坐标为假阳性率，即100％-特异度％。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、筛选细菌感染和病毒感染状态下的差异表达基因
1、临床研究对象：
选取明确细菌感染和明确病毒感染且在发热期的两组患者，每组患者各30例。
诊断标准：
(1)明确的细菌感染组为经培养证实细菌感染的患者；
(2)明确的病毒感染组仅包括经培养、分子或免疫荧光检测证实的病毒感染的患者，且无共存细菌感染的特征。
排除标准：有可能影响基因表达的骨髓移植、免疫缺陷或免疫抑制治疗的患者。
所有研究对象均签署了知情同意书。
2、样本采集
所有研究对象于发热期，进行临床血液化验检查时，同时抽取血液样本，EDTA抗凝。
3、血液样本总RNA提取
使用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒进行血液总RNA的提取，提取步骤如下：
(1)EDTA抗凝血2-3mL全血，立即使用无RNA酶的EP管进行分装并加入三倍体积的Trizol裂解液(Trizol Reagent)，充分振荡混匀；
(2)将裂解后样品室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离，12000rpm离心10min，取上清；
(3)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30s，室温放置3min，12000rpm 4℃离心10min；
(4)吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍体积无水乙醇，混匀；
(5)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维悬浮物全部加至吸附柱中，静置2min，12000rpm离心3min，倒掉收集管中废液；
(6)将吸附柱放回收集管中，加入500μL RPE Solution，静置2min，10000rpm离心30s，倒掉收集管中废液；
(7)重复步骤(6)一次；
(8)将吸附柱放回收集管中，10000rpm离心2min；
(9)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treatedddH2O，静置5min，12000rpm离心2min，将所得到的溶液置于-70℃保存或用于后续实验。
4、RNA样品的质量分析
使用Agilent2100 Bioanalyzer(Agilent RNA 6000Nano kit)检测总RNA的浓度、RIN值28/18S和片段大小，单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8-2.2之间。
5、mRNA纯化
提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA.。
6、mRNA片段化
加入适量打断试剂高温条件下使mRNA片段化。
7、cDNA合成
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以片段化后的mRNA为模板合成一链cDNA，然后配置二链合成反应体系合成二链cDNA。
8、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3'末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
9、文库质检
使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI stepOnePlus Real-Time PCR System质检。
10、高通量测序
Illumina X Ten测序平台进行2×150bp测序。
11、生物信息学分析
高通量测序数据rawdata分析过程如下：
(1)去除包含接头的reads，去除未知碱基N含量大于5％的reads，去除低质量reads(质量值低于15的碱基占该reads总碱基数的比例大于20％的reads为低质量的reads)；
(2)Tophat比对到参考基因组上，所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
(3)Cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；
(4)在R环境下用DEGseq包比较细菌感染组跟病毒感染组mRNA的表达差异；显著差异mRNA筛选条件：p-value＜0.05。
(5)结果
用以上标准筛选得到差异表达基因275个，其中表达上调的基因为165个，表达下调的基因有110个；再通过弹性网技术和前向最小二乘法，筛选出2个反向变化基因：IFI44L基因和PI3基因。IFI44L基因在病毒感染时上调，PI3基因在细菌感染时上调，下面通过实施例2和实施例3进行进一步验证。
其中，IFI44L基因(NCBI登录号：NM_006820.4)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PI3基因(NCBI登录号：NM_002638.4)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，均为公知的核苷酸序列。
实施例2、qPCR验证IFI44L基因和PI3基因与细菌感染、病毒感染疾病的关系
1、研究对象：
选择发热期确诊细菌感染病人35例、确诊病毒感染病人36例。
诊断标准：
(1)明确的细菌感染组为经培养证实细菌感染的患者；
(2)明确的病毒感染组仅包括经培养、分子或免疫荧光检测证实的病毒感染的患者，且无共存细菌感染的特征。
2、血液总RNA提取
使用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒进行上述发热患者血液总RNA的提取，提取步骤如下：
(1)EDTA抗凝血2-3mL全血，立即使用无RNA酶的EP管进行分装并加入三倍体积的Trizol裂解液(Trizol Reagent)，充分振荡混匀；
(2)将裂解后样品室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离，12000rpm离心10min，取上清；
(3)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30s，室温放置3min，12000rpm 4℃离心10min；
(4)吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍体积无水乙醇，混匀；
(5)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维悬浮物全部加至吸附柱中，静置2min，12000rpm离心3min，倒掉收集管中废液；
(6)将吸附柱放回收集管中，加入500μL RPE Solution，静置2min，10000rpm离心30s，倒掉收集管中废液；
(7)重复步骤(6)一次。
(8)将吸附柱放回收集管中，10000rpm离心2min；
(9)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treatedddH2O,静置5min，12000rpm离心2min，将所得到的溶液置于-70℃保存或用于后续实验。
3、测量总RNA浓度及纯度
用nanodrop 2000仪器测量样本RNA的浓度及纯度，OD260/280介于1.8-2.2之间。
4、逆转录
采用M-MLV逆转录体系对提取到的总RNA进行逆转录。用逆转录缓冲液对300ng总RNA进行逆转录合成cDNA，采用20μL反应体系，每个样品取300ng总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：0.2μg/μL Random Primer p(dN)6 1.0μL、10mmol/L dNTPs1.0μL、加Rnase-free ddH2O定容至14.5μL，65℃温育5min，冰浴2min；再加入以下试剂：5×逆转录缓冲液4.0μL、40U RNA酶抑制剂0.5μL、200U M-MLV逆转录酶1.0μL，总的反应体系为20μL，25℃孵育10min，50℃孵育30min，85℃孵育5min，处理后得cDNA，置于冰上保存。
5、qPCR扩增检验
采用20μL反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：qPCR缓冲液10μL、10uM正向引物0.4μL、10uM反向引物0.4μL、10uM TaqMan荧光探针0.4μL、ddH2O 7.8μL、模板cDNA 1.0μL。
其中，扩增IFI44L基因的正向引物序列为：5'-AATGGTACGGAAATATGGAGGG-3'，反向引物序列为：5'-GAGATAAGTTGCCTTGATTCTGACA-3'，TaqMan荧光探针序列为：5'-TCTCATTGCGGCACAC-3'，TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC；
扩增PI3基因的正向引物序列为：5'-CAAAGGTCCAGTCTCCACTAAG-3'，反向引物序列为：5'-GATTCCTGGGCAGTCAGTATC-3'，TaqMan荧光探针序列为：5'-TATCTTGATCCGGTGCGCCATGTT-3'，TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC；
内参基因选择ACTB基因(SEQ ID NO.3，NCBI登录号：NM_001101.5)，扩增ACTB基因的正向引物为：5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物为：5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'，TaqMan荧光探针序列为：5'-ACCTAACTTGCGCAGAAAACAAGAT-3'，TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为FAM。
本实施例同时对IFI44L、PI3、ACTB基因进行单管单基因检测，再对IFI44L、PI3基因进行相对定量。
扩增程序为：95℃预变性3min；95℃10S，57℃15s，72℃30s，共45个循环。在ABIStepone plus型荧光定量PCR仪中进行反应，ΔCT法进行相对定量，结果如图1-3所示，图中，IFI44L基因的相对表达量为：ΔCt,1＝Ct,1-Ct,3，PI3基因的的相对表达量为：ΔCt,2＝Ct,2-Ct,3，IFI44L和PI3基因的表达积分(expression score,ES)：ES＝ΔCt,1-ΔCt,2，其中，Ct,1为IFI44L基因的Ct值，Ct,2为PI3基因的Ct值，Ct,3为ACTB基因的Ct值，ΔCT越大，表达量越低；ES是为了将2个基因的表达变化情况用1个指标表示出来，ES定义是：ES＝IFI44L基因的相对表达量-PI3基因的的相对表达量。
同时通过绘制ROC曲线(图4)，利用曲线下面积AUC评价ES在区分细菌感染和病毒感染中的诊断价值。
图1表明，与细菌感染患者(BI)相比，病毒感染患者(VI)的IFI44L基因的表达量明显升高(P＜0.0001)。
图2表明，与细菌感染患者(BI)相比，病毒感染患者(VI)的PI3基因的表达量明显降低(P＝0.0055)。
图3表明，与细菌感染患者(BI)相比，病毒感染患者(VI)的IFI44L、PI3基因的ES明显高于细菌感染患者(P＜0.0001)。
图4表明，通过IFI44L、PI3两个基因的ES区分细菌感染和病毒感染的诊断效能为0.9464，95％CI为0.8895-1.003，说明ES在区分细菌感染和病毒感染中具有较高的诊断价值。
实施例3、qPCR再次验证IFI44L基因和PI3基因与细菌感染、病毒感染疾病的关系
1.研究对象：
选择发热期确诊细菌感染病人42例、确诊病毒感染病人56例以及健康对照(HC)31例。
诊断标准：
(1)明确的细菌感染组为经培养证实细菌感染的患者；
(2)明确的病毒感染组仅包括经培养、分子或免疫荧光检测证实的病毒感染的患者，且无共存细菌感染的特征。
2.血液总RNA提取
使用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒进行上述发热患者血液总RNA的提取，提取步骤如下：
(1)EDTA抗凝血2-3mL全血，立即使用无RNA酶的EP管进行分装并加入三倍体积的Trizol裂解液(Trizol Reagent)，充分振荡混匀；
(2)将裂解后样品室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离，12000rpm离心10min，取上清；
(3)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30s，室温放置3min，12000rpm 4℃离心10min；
(4)吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍体积无水乙醇，混匀；
(5)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维悬浮物全部加至吸附柱中，静置2min，12000rpm离心3min，倒掉收集管中废液；
(6)将吸附柱放回收集管中，加入500μL RPE Solution，静置2min，10000rpm离心30s,倒掉收集管中废液；
(7)重复步骤(6)一次；
(8)将吸附柱放回收集管中，10000rpm离心2min；
(9)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treatedddH2O，静置5min，12000rpm离心2min，将所得到的溶液置于-70℃保存或用于后续实验。
3.测量总RNA浓度及纯度
用nanodrop 2000仪器测量样本RNA的浓度及纯度，OD260/280介于1.8-2.2之间。
4.逆转录
采用M-MLV逆转录体系对提取到的总RNA进行逆转录。用逆转录缓冲液对300ng总RNA进行逆转录合成cDNA，采用20μL反应体系，每个样品取300ng总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：2μg/μL Random Primer p(dN)6 1.0μL、10mmol/L dNTPs1.0μL、加Rnase-free ddH2O定容至14.5μL，65℃温育5min，冰浴2min；再加入以下试剂：5×逆转录缓冲液4.0μL、40U RNA酶抑制剂0.5μL、200U M-MLV逆转录酶1.0μL。25℃孵育10min，50℃孵育30min，85℃孵育5min，处理后得cDNA，置于冰上保存。
6、qPCR扩增检验
采用20μL反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：qPCR缓冲液10μL、10uM正向引物0.4μL、10uM反向引物0.4μL、10uM TaqMan荧光探针0.4μL、ddH2O 7.8μL、模板cDNA 1.0μL。
其中，扩增IFI44L基因的正向引物序列为：5'-AATGGTACGGAAATATGGAGGG-3'，反向引物序列为：5'-GAGATAAGTTGCCTTGATTCTGACA-3'，TaqMan荧光探针序列为：5'-TCTCATTGCGGCACAC-3'，TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC；
扩增PI3基因的正向引物序列为：5'-CAAAGGTCCAGTCTCCACTAAG-3'，反向引物序列为：5'-GATTCCTGGGCAGTCAGTATC-3'，TaqMan荧光探针序列为：5'-TATCTTGATCCGGTGCGCCATGTT-3'，TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC；
内参基因选择ACTB基因(SEQ ID NO.3，NCBI登录号：NM_001101.5)，扩增ACTB基因的正向引物为：5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物为：5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'，TaqMan荧光探针序列为：5'-ACCTAACTTGCGCAGAAAACAAGAT-3'，TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为FAM。
本实施例同时对IFI44L、PI3、ACTB基因进行单管单基因检测，再对IFI44L、PI3基因进行相对定量。
扩增程序为95℃预变性3min；95℃10S，57℃15s，72℃30s，共45个循环。在ABIStepone plus型荧光定量PCR仪中进行反应，ΔCT法进行相对定量，结果如图5-7所示，图中，IFI44L基因的相对表达量为：ΔCt,1＝Ct,1-Ct,3，PI3基因的的相对表达量为：ΔCt,2＝Ct,2-Ct,3，IFI44L、PI3基因的表达积分(expression score,ES)：ES＝Ct,1-Ct,2，其中，Ct,1为IFI44L基因的Ct值，Ct,2为PI3基因的Ct值，Ct,3为ACTB基因的Ct值，ΔCT越大，表达量越低；ES是为了将2个基因的表达变化情况用1个指标表示出来，ES定义是：ES＝IFI44L基因的相对表达量-PI3基因的的相对表达量。
同时通过绘制ROC曲线(图8)，利用曲线下面积AUC评价ES在区分细菌感染和病毒感染中的诊断价值。
图5表明，细菌感染患者(BI)、病毒感染患者(VI)以及健康对照组中IFI44L基因的表达量均有明显差异(P＜0.0001)。
图6表明，细菌感染患者(BI)、病毒感染患者(VI)以及健康对照组中PI3基因的表达量均有明显差异(P＜0.0001)。
图7表明，与细菌感染患者(BI)相比，病毒感染患者(VI)的IFI44L、PI3基因的ES分明显高于细菌感染患者(P＜0.0001)。
图8表明，通过IFI44L、PI3两个基因的ES区分细菌感染和病毒感染的诊断效能为0.9745，95％CI为0.9371-1.012，说明ES在区分细菌感染和病毒感染中具有较高的诊断价值。
实施例4、诊断细菌/病毒感染试剂盒的制备
根据IFI44L基因和PI3基因在细菌感染和病毒感染患者的外周血中的表达存在差异，提供一种诊断细菌/病毒感染的试剂盒，该试剂盒包括：TaqMan聚合酶链式反应体系、用于扩增IFI44L基因和PI3基因以及内参基因ACTB的引物对和TaqMan荧光探针、M-MLV逆转录体系；所述TaqMan聚合酶链式反应体系包含qPCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶；所述M-MLV逆转录体系包含：Random Primer p(dN)6、逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所述逆转录缓冲液包含：250mM Tris-HCI(pH 8.3at 25℃)，375mM KCl，15mMMgCl2，50mM DTT。
其中，用于扩增IFI44L基因的引物对核苷酸序列如下：
正向引物序列5'-AATGGTACGGAAATATGGAGGG-3'，
反向引物序列5'-GAGATAAGTTGCCTTGATTCTGACA-3'；
IFI44L基因的TaqMan荧光探针序列为：5'-TCTCATTGCGGCACAC-3'；其5'端携带的荧光基团为VIC；
用于扩增PI3基因的引物对核苷酸序列如下：
正向引物序列5'-CAAAGGTCCAGTCTCCACTAAG-3'，
反向引物序列5'-GATTCCTGGGCAGTCAGTATC-3'，
PI3基因的TaqMan荧光探针序列为：5'-TATCTTGATCCGGTGCGCCATGTT-3'，TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC；
用于扩增ACTB基因的引物对核苷酸序列如下：
正向引物序列5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，
反向引物序列5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'；
ACTB基因的TaqMan荧光探针序列为：5'-ACCTAACTTGCGCAGAAAACAAGAT-3'，其5'端携带的荧光基团为FAM。
利用本发明提供的试剂盒可以进行细菌干扰和病毒感染的检测，准确率达到90％以上，具有快速、可靠、特异性强、敏感性高的特点。上述实施例的说明只是用于解释本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 王刚
<120> IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5829
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctttcctaga gtctctgaag ccacagatct cttaagaact ttctgtctcc aaaccgtggc 60
tgctcgataa atcagacaga acagttaatc ctcaatttaa gcctgatcta acccctagaa 120
acagatatag aacaatggaa gtgacaacaa gattgacatg gaatgatgaa aatcatctgc 180
gcaagctgct tggaaatgtt tctttgagtc ttctctataa gtctagtgtt catggaggta 240
gcattgaaga tatggttgaa agatgcagcc gtcagggatg tactataaca atggcttaca 300
ttgattacaa tatgattgta gcctttatgc ttggaaatta tattaattta catgaaagtt 360
ctacagagcc aaatgattcc ctatggtttt cacttcaaaa gaaaaatgac accactgaaa 420
tagaaacttt actcttaaat acagcaccaa aaattattga tgagcaactg gtgtgtcgtt 480
tatcgaaaac ggatattttc attatatgtc gagataataa aatttatcta gataaaatga 540
taacaagaaa cttgaaacta aggttttatg gccaccgtca gtatttggaa tgtgaagttt 600
ttcgagttga aggaattaag gataacctag acgacataaa gaggataatt aaagccagag 660
agcacagaaa taggcttcta gcagacatca gagactatag gccctatgca gacttggttt 720
cagaaattcg tattcttttg gtgggtccag ttgggtctgg aaagtccagt tttttcaatt 780
cagtcaagtc tatttttcat ggccatgtga ctggccaagc cgtagtgggg tctgatatca 840
ccagcataac cgagcggtat aggatatatt ctgttaaaga tggaaaaaat ggaaaatctc 900
tgccatttat gttgtgtgac actatggggc tagatggggc agaaggagca ggactgtgca 960
tggatgacat tccccacatc ttaaaaggtt gtatgccaga cagatatcag tttaattccc 1020
gtaaaccaat tacacctgag cattctactt ttatcacctc tccatctctg aaggacagga 1080
ttcactgtgt ggcttatgtc ttagacatca actctattga caatctctac tctaaaatgt 1140
tggcaaaagt gaagcaagtt cacaaagaag tattaaactg tggtatagca tatgtggcct 1200
tgcttactaa agtggatgat tgcagtgagg ttcttcaaga caacttttta aacatgagta 1260
gatctatgac ttctcaaagc cgggtcatga atgtccataa aatgctaggc attcctattt 1320
ccaatatttt gatggttgga aattatgctt cagatttgga actggacccc atgaaggata 1380
ttctcatcct ctctgcactg aggcagatgc tgcgggctgc agatgatttt ttagaagatt 1440
tgcctcttga ggaaactggt gcaattgaga gagcgttaca gccctgcatt tgagataagt 1500
tgccttgatt ctgacatttg gcccagcctg tactggtgtg ccgcaatgag agtcaatctc 1560
tattgacagc ctgcttcaga ttttgctttt gttcgttttg ccttctgtcc ttggaacagt 1620
catatctcaa gttcaaaggc caaaacctga gaagcggtgg gctaagatag gtcctactgc 1680
aaaccacccc tccatatttc cgtaccattt acaattcagt ttctgtgaca tctttttaaa 1740
ccactggagg aaaaatgaga tattctctaa tttattcttc tataacactc tatatagagc 1800
tatgtgagta ctaatcacat tgaataatag ttataaaatt attgtataga catctgcttc 1860
ttaaacagat tgtgagttct ttgagaaaca gcgtggattt tacttatctg tgtattcaca 1920
gagcttagca cagtgcctgg taatgagcaa gcatacttgc cattactttt ccttcccact 1980
ctctccaaca tcacattcac tttaaatttt tctgtatata gaaaggaaaa ctagcctggg 2040
caacatgatg aaaccccatc tccactgcaa aaaaaaaaaa aaaaaataag aaagaacaaa 2100
acaaacccca caaaaattag ctgggtatga tggcacgtgc ctgtagtccc agttactcag 2160
gatgattgat tgagccttgg aggtggaggc tacagtgagc tgagattgtg ccactgtact 2220
ctagccaggg agaaagagtg agatcctggc tcaaaaaaac caaataaaac aaaacaaaca 2280
aacgaaaaac agaaaggaag actgaaagag aatgaaaagc tggggagagg aaataaaaat 2340
aaagaaggaa gagtgtttca tttatatctg aatgaaaata tgaatgactc taagtaattg 2400
aattaattaa aatgagccaa ctttttttta acaatttaca ttttatttct atgggaaaaa 2460
ataaatattc ctcttctaac aaacccatgc ttgattttca ttaattgaat tccaaatcat 2520
cctagccatg tgtccttcca tttaggttac tggggcaaat cagtaagaaa gttcttatat 2580
ttatgctcca aataattctg aagtcctctt actagctgtg aaagctagta ctattaagaa 2640
agaaaacaaa attcccaaaa gatagctttc actttttttt ttccttaaag acttcctaat 2700
tctcttctcc aaattcttag tcttcttcaa aataatatgc tttggttcaa tagttatcca 2760
cattctgaca gtctaattta gttttaatca gaattatact catcttttgg gtagtcatag 2820
atattaagaa agcaagagtt tcttatgtcc agttatggaa tatttcctaa agcaaggctg 2880
caggtgaagt tgtgctcaag tgaatgttca ggagacacaa ttcagtggaa gaaattaagt 2940
ctttaaaaaa gacctaggaa taggagaacc atggaaattg aggaggtagg cctacaagta 3000
gatattggga acaaaattag agaggcaacc agaaaaagtt attttaggct caccagagtt 3060
gttcttattg cacagtaaca caccaatata ccaaaacagc aggtattgca gtagagaaag 3120
agtttaataa ttgaatggca gaaaaatgag gaaggttgag gaaacctcaa atctacctcc 3180
ctgctgagtc taagtttagg atttttaaga gaaaggcagg taaggtgctg aaggtctgga 3240
gctgctgatt tgttggggta tagggaatga aatgaaacat acagagatga aaactggaag 3300
tttttttttg tttgttttgt tttttttttg ttgttgtttt tttttttttt tgtttttttg 3360
ctgagtcaat tccttggagg gggtcttcag actgactggt gtcagcagac ccatgggatt 3420
ccaagatctg gaaaactttt tagatagaaa cttgatgttt cttaacgtta catatattat 3480
cttatagaaa taactaaggg aagttagtgc cttgtgacca catctatgtg acttttaggc 3540
agtaagaaac tataaggaaa ggagctaaca gtcatgctgt aagtagctac agggaattgg 3600
cttaaagggc aagttggtta gtacttagct gtgtttttat tcaaagtcta cattttatgt 3660
agtggttaat gtttgctgtt cattaggatg gtttcacagt taccatacaa atgtagaagc 3720
aacaggtcca aaaagtaggg catgattttc tccatgtaat ccagggagaa aacaagccat 3780
gaccattgtt ggttgggaga ctgaaggtga ttgaaggttc accatcatcc tcaccaactt 3840
ttgggccata attcacccaa ccctttggtg gagcctgaaa aaaatctggg cagaatgtag 3900
gacttcttta ttttgtttaa aggggtaaca cagagtgccc ttatgaagga gttggagatc 3960
ctgcaaggaa gagaaggagt gaaggagaga tcaagagaga gaaacaatga ggaacatttc 4020
atttgaccca acatccttta ggagcataaa tgttgacact aagttatccc ttttgtgcta 4080
aaatggacag tattggcaaa atgataccac aacttcttat tctctggctc tatattgctt 4140
tggaaacact taaacatcaa atggagttaa atacatattt gaaatttagg ttaggaaata 4200
ttggtgagga ggcctcaaaa agggggaaac atcttttgtc tgggaggata ttttccattt 4260
tgtggatttc cctgatcttt ttctaccacc ctgaggggtg gtgggaatta tcattttgct 4320
acattttaga ggtcatccag gatttttgaa actttacatt ctttacggtt aagcaagatg 4380
tacagctcag tcaaagacac taaattcttc ttagaaaaat agtgctaagg agtatagcag 4440
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gacagttgaa atgtcaatgc tagagcctct gtggtgtgaa tgggcacgtt aggttgttgc 4560
attagaaagt gactgtttct gacagaaatt tgtagctttg tgcaaactca cccaccatct 4620
acctcaataa aatatagaga aaagaaaaat agagcagttt gagttctatg aggtatgcag 4680
gcccagagag acataagtat gttcctttag tcttgcttcc tgtgtgccac actgcccctc 4740
cacaaccata gctgggggca attgtttaaa gtcattttgt tcccgactag ctgccttgca 4800
cattatcttc attttcctgg aatttgatac agagagcaat ttatagccaa ttgatagctt 4860
atgctgtttc aatgtaaatt cgtggtaaat aacttaggaa ctgcctcttc tttttctttg 4920
aaaacctact tataactgtt gctaataaga atgtgtattg ttcaggacaa cttgtctcca 4980
tacagttggg ttgtaaccct catgcttggc ccaaataaac tctctactta tatcagtttt 5040
tcctacactt cttcctttta ggtcaacaat accaagaggg gttactgtgc tgggtaatgt 5100
gtaaacttgt gtcttgttta gaaagataaa tttaaagact atcacattgc tttttcataa 5160
aacaagacag gtctacaatt aatttatttt gacgcaaatt gatagggggg ccaagtaagc 5220
cccatatgct taatgatcag ctgatgaata atcatctcct agcaacataa ctcaatctaa 5280
tgctaaggta cccacaagat ggcaaggctg atcaaagtcg tcatggaatc ctgcaaccaa 5340
aagccatggg aatttggaag ccctcaaatc ccattcctaa tctgatgagt ctatggacca 5400
atttgtggag gacagtagat taaatagatc tgatttttgc catcaatgta aggaggataa 5460
aaacttgcat accaattgta cacccttgca aaatctttct ctgatgttgg agaaaatggg 5520
ccagtgagat catggatata gaagtacagt caatgttcag ctgtaccctc ccacaatccc 5580
acttccttcc tcaacacaat tcaaacaaat agactcagac tgtttcaggc tccaggacag 5640
gaagtgcagt gtaggcaaaa ttgcaaaaat tgagggcaca ggggtggagg tgggggggtt 5700
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<211> 551
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aaaggtcaag ataaagtcaa agcgcaagag ccagtcaaag gtccagtctc cactaagcct 240
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ggccccatct ggtcctaagt ccctgctgcc cttccccttc ccacactgtc cattcttcct 480
cccattcagg atgcccacgg ctggagctgc ctctctcatc cactttccaa taaagagttc 540
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<212> DNA
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accgccgaga ccgcgtccgc cccgcgagca cagagcctcg cctttgccga tccgccgccc 60
gtccacaccc gccgccagct caccatggat gatgatatcg ccgcgctcgt cgtcgacaac 120
ggctccggca tgtgcaaggc cggcttcgcg ggcgacgatg ccccccgggc cgtcttcccc 180
tccatcgtgg ggcgccccag gcaccagggc gtgatggtgg gcatgggtca gaaggattcc 240
tatgtgggcg acgaggccca gagcaagaga ggcatcctca ccctgaagta ccccatcgag 300
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gagcggttcc gctgccctga ggcactcttc cagccttcct tcctgggcat ggagtcctgt 900
ggcatccacg aaactacctt caactccatc atgaagtgtg acgtggacat ccgcaaagac 960
ctgtacgcca acacagtgct gtctggcggc accaccatgt accctggcat tgccgacagg 1020
atgcagaagg agatcactgc cctggcaccc agcacaatga agatcaagat cattgctcct 1080
cctgagcgca agtactccgt gtggatcggc ggctccatcc tggcctcgct gtccaccttc 1140
cagcagatgt ggatcagcaa gcaggagtat gacgagtccg gcccctccat cgtccaccgc 1200
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ttgttgtttt tttaatagtc attccaaata tgagatgcgt tgttacagga agtcccttgc 1500
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cacaggggag gtgatagcat tgctttcgtg taaattatgt aatgcaaaat ttttttaatc 1620
ttcgccttaa tactttttta ttttgtttta ttttgaatga tgagccttcg tgccccccct 1680
tccccctttt ttgtccccca acttgagatg tatgaaggct tttggtctcc ctgggagtgg 1740
gtggaggcag ccagggctta cctgtacact gacttgagac cagttgaata aaagtgcaca 1800
ccttaaaaat ga 1812

Claims (10)

1.IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途，其特征在于，所述用途为IFI44L和PI3基因的检测试剂在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途；所述试剂盒包含TaqMan聚合酶链式反应体系、用于扩增IFI44L基因和PI3基因以及内参基因的引物对和TaqMan荧光探针；所述TaqMan聚合酶链式反应体系包含qPCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
2.如权利要求1所述的IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途，其特征在于，所述用于扩增IFI44L基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-AATGGTACGGAAATATGGAGGG-3'，反向引物序列5'-GAGATAAGTTGCCTTGATTCTGACA-3'；所述用于扩增PI3基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-CAAAGGTCCAGTCTCCACTAAG-3'，反向引物序列5'-GATTCCTGGGCAGTCAGTATC-3'。
3.如权利要求1所述的IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途，其特征在于，所述TaqMan荧光探针的核苷酸序列如下：IFI44L基因的TaqMan荧光探针序列5'-TCTCATTGCGGCACAC-3'，PI3基因的TaqMan荧光探针序列5'-TATCTTGATCCGGTGCGCCATGTT-3'，其中，IFI44L基因和PI3基因的TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC。
4.如权利要求1所述的IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因，用于扩增ACTB基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物序列5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'；ACTB基因的TaqMan荧光探针序列为5'-ACCTAACTTGCGCAGAAAACAAGAT-3'，其中，ACTB基因的TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为FAM。
5.如权利要求1所述的IFI44L基因和PI3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV逆转录体系，所述逆转录体系包含：RandomPrimer p(dN)6、逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；优选的，所述逆转录反应液包含：250mM Tris-HCI(pH 8.3)，375mM KCl，15mM MgCl2，50mM DTT。
6.一种诊断细菌/病毒感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含TaqMan聚合酶链式反应体系、用于扩增IFI44L基因和PI3基因以及内参基因的引物对和TaqMan荧光探针；所述TaqMan聚合酶链式反应体系包含qPCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
7.如权利要求6所述的诊断细菌/病毒感染的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增IFI44L基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-AATGGTACGGAAATATGGAGGG-3'，反向引物序列5'-GAGATAAGTTGCCTTGATTCTGACA-3'；所述用于扩增PI3基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-CAAAGGTCCAGTCTCCACTAAG-3'，反向引物序列5'-GATTCCTGGGCAGTCAGTATC-3'。
8.如权利要求6所述的诊断细菌/病毒感染的试剂盒，其特征在于，所述TaqMan荧光探针的核苷酸序列如下：IFI44L基因的TaqMan荧光探针序列5'-TCTCATTGCGGCACAC-3'，PI3基因的TaqMan荧光探针序列5'-TATCTTGATCCGGTGCGCCATGTT-3'，其中，IFI44L基因和PI3基因的TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为VIC。
9.如权利要求6所述的诊断细菌/病毒感染的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因，用于扩增ACTB基因的引物对核苷酸序列如下：正向引物序列5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物序列5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'；ACTB基因的TaqMan荧光探针序列为5'-ACCTAACTTGCGCAGAAAACAAGAT-3'，ACTB基因的TaqMan荧光探针5'端携带的荧光基团为FAM。
10.如权利要求6所述的诊断细菌/病毒感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV逆转录体系，所述逆转录体系包含：Random Primer p(dN)6、逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；优选的，所述逆转录缓冲液包含：250mM Tris-HCI(pH 8.3)，375mM KCl，15mM MgCl2，50mM DTT。
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