JPH06501385A - 生物の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物の同定 本発明は、生物、特に微生物、とりわけユウバクテリア（ＥｕｂａｃＬｅｒｉ　 ａ）の同定に関するものである。

試験サンプル中に微生物が存在するか否かを同定したいと思う場合、および／ま たは、微生物のｌｍを同定したいと思う場合が多々ある。例えば、何らかの病気 における細菌との掛わり合いが予測され、未だ証明されずにいる場合や、細胞培 養が、従来の方法では培養および同定が困難な生物によって汚染された場合であ る。例えば、リボノームＲＮＡに交雑し、それによって微生物の存在や種類を同 定するためのプローブの使用に関連する米国特許第４８５１３３０号、ゴベルら （Ｇｏｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ　（１９８７　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ ．　１３３．　１９６９−１９７４１）とチェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｉ　ａｌ　（ １１８９　ＦＥＭＳ　Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．　５７．　１９−２４ ））を参照されたい。これらのプローブは、大体１７〜３０ヌクレオチド長で、 調べている生物のｒＲＮＡに特有であるように設計されている。何らかの与えら れた分析に使用されるのは、ただ一つの、あるいは幾つかの特定のプローブであ る。

ＤＮＡ“フィンガープラノティング１法では、比較的短く、またそのためにしば しば結合したプローブが使用されてきたが、制限酵素によって生成し、大きさで 分類された断片を同定する印としてのみ使用されたわけではない。プローブの使 用は、それだｌすで有益な情報を与えるものではなかった。

それと対昭的に、我々は、与えられた生物に対して、′交雑サイン”を生じるた めの比較的多数の短いプローブを使用するごとの利点を見い出した。′交雑サイ ン”とは、プローブが、サンプルとなる核酸に結合したか否かぐまた結合したな らば、それが幾重に結合したか）によって、各プローブの交雑の確実性を決定す ることから構成される。

このように、本発明の一つのｇ様は、生物を同定する方法を提供することにある 。その方法とは、（１）生物から誘導された核酸を得ることと、（２ン少なくと も５つのヌクレオチドプローブのそれぞれに対して、ブローブカｆ前紀核酸に交 雑したか否かを決定することを含んでいる。

好ましくは、使用されるプローブの数は、少なくとも１０、ｌ５、２０、２５か 、あるいは多数のサンプル間での分類を欲する場合には、それ以上（例えばｌ０ ０）である。試験中の、また区別したいと欲しているすべてのサンプルに対して 、同じように高い負あるいは正の交雑サインを与えるには、あまりにも、あるい はめったに、各プローブが、サンプルとなる核酸に交雑しないならば、意味のあ るサインを確立する場合に、ＩＯ〜２０が、典型的に充分であろう。しかしなが ら、もし、生物を幾つかのカテゴリー、例えば２つのうちの１つに分類しようと するならば、通常はより少ない数のプローブが必要となる。これは、プローブが 、サンプルとなる核酸の１つ以上の面に結合した場合である。というのは、各プ ローブが、′イエスか／一か”という二者択一の結果以上の結果を得ることが可 能で、３回プローブに結合した核酸が、たった１回か２団結合しただけの核酸か ら区別できるためである。本発明の方法の鍵となる特徴は、多数の短いプローブ が、有益な情報を与える“交雑サイン”をもたらすために、協力的に使用される ということである。

また、第２のＩｉ様は、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブに対する交雑パ ターンに基づいて、与えられた生物の核酸に、“交雑サイン”を指定する方法を 提供することにある。

各プローブは、適当な交雑条件下で、分析されるべき種類のすべての核酸の約２ ５〜７５％、好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは４０〜６０％、そして 最も好ましくは４０〜５０％に結合することが適当である。各プローブは、プロ ーブ長に対応して与えられた配列にとって特異的（交雑条件にしたがって）であ るならば、それ自身は、プローブよりもかなり長くそれぞれ長さの翼なる核酸の 間で精度良く識別するために使うことはできないという点で非特異的である。

このように、分析方法の特異性は、比較的多数のプローブが使われるという事実 から導かれるものである。プローブは、典型的には４〜＋５ｙＬクレオチド長、 好ましくは５〜１０、またしばしば８あるいは９ヌクレオチド長である。２つあ るいはそれ以上のプローブ（例えば５’　−ＴＧＣＡＴＧＧＣ−３’　と５’　 −ＴＧＣＡＴＧＧＧ−３゜）の混合物は、撞きプローブがサンプルとなる核酸に 結合する頻度を増加させるために、単一のプローブとして扱う（すなわち、単一 の交雑段階において使用する）ことができる。本明細書では、′プローブという 言葉は、このような複合プローブを含んで使用される。

種から種へ著しく変化する′生物ゲノムの部分では、プローブが、翼なる種の生 物の間の類似性および差異を同定することにおいて特に有用であることが、既に 見出されている。もし、このような変異性の部分が、不変性部分の損にあるなら ば、生物の種々変化する配列が未知であっても、ＰＣＲ法によってＤＮＡ増幅の ためのプライマーを生成することは、比較的容易なことである。我々は、リポソ ームＲ，Ｎ　Ａ遺伝子、特に１６３遺伝子が、これら両方の基準にしたがって適 当であることを見出した。特異的なＰＣＲプライマーは、（Ａ）５’　−ＧＡＧ ＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３゜（Ｂ）５’　−ＴＧＣＣＴＣＣＣ ＧＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３゜（Ｃ）５’　−ＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧ ＴＡＡＡＣＧ−３°及び（Ｄ）５’　−ＡＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧ ＡＣＧ−３’と類似物とその断片を含んでいる。類似物と断片は、前記４つのｅ Ｘ的プライマーが交雑した隣接ＤＮＡのＰＣＨによる特異的な増幅に対して供給 されるものである。

プローブとプライマーとは、公知の手段、１ＦＩＩえばアプライド　バイオンス テム社によって供給された装置を使った間車な化学合成によって作製することが できる。

各サンプル中の核酸の量が、各々の場合において同一となるように調整できない ならば、あるいは何らかの他の方法によって測定できないならば、分析中のサン プルすべてに共通であることが知られるプローブ、例えば高度に保存された部分 におけるプローブの結合程麿を決定することによって、その量を１準化すること が便利である。以下、このようなプローブは、前述した“変異性プローブと対照 的に、′不変性プローブと呼ばれる。変異性ブａ−ブの結合は、不変性プローブ の結合に対する比として表される。不変性ブＣ−ブは、変異性プローブと同じ大 きさの制約を条件としているのではない。

プローブは、ＰＣＲプライマーの配列の全部あるいは一部を含んでいる。

本発明にしたがう方法によって行われた生物の同定は、いかに多くのプローブが 使われたかによって多少正確で、また同じ生物の場合と他の生物の場合の参照デ ータによって多少有益なものとなっている。こうして、この方法は、生物を、分 類学的グループのいずれか（界、門、綱、亜綱、目、亜目、族、属、種、亜種） に入れたり、また望ましいあるいは望ましくない特徴を持つ生物との類似性を同 定したり、さらに生物の特定の種族を同定したりするために使われるのである。

特に、この方法は、微生物、特にこの微生物が以前研究されたことがあるか否か を同定したり、特に興味深いと考えられる微生物の範喝に入るか否かを同定した りするために、自然界から多少ラノダムに集められた細菌をスクリーニングする 場合に有用である。今までは、以前研究されたことがあったり、興味のないこと が知られる範−〇ものだったりに終わった細菌を特徴付けることに、多大な労力 を浪費してきた。高い抗生作用を分泌することを見いだすために、細菌や菌の研 究をすることは、本発明の方法をスクリーニングの第１段階として使用する一つ の特別な方法である。幾つかの小さいプローブを使う本発明の方法は、欲する遺 伝子に対して個性や特性に合う唯一の範囲を同定するために大きな特別のプロー ブを使用する方法とは異なるものである。全体として、スクリーニングは、前述 のように行使され、研究される生物の数は、典型的に多く（１回で数百）なり、 そしてそれらの間で適切に識別を行うのには、約１０〜２０のプローブが通常側 われる。

本発明の他の使用は、病原体の性質を少なくともある程度まで同定することにあ る。例えば、頚管スミアのスクリーニングにおいて、見いだされた乳頭腫ウィル スは、それがタイプ１６であるかタイプ１８であるかを決定するために、分類さ れなければならない。これら２つのタイプは、子宮頚癌やその他の異常の原因と なると考えられるからである。このようなスミアにおいてはこれまで分離されて きた３５以上の乳頭腫ウィルスのタイプがある。もし、１対の交雑サインしか生 成しないプローブを使用（結合してもしなくても）するならば、３５〜６０タイ プ（２６が６４である）を識別するのには６つのプローブが必要である。しかし ながら、もしプローブが幾重にも結合するならば、あるいはただウィルスがタイ プ１６なのか１８なのかそれ以外のタイプなのかを知りたいと思うのであれば、 より少ない数のプローブを使用してよい。このような場合、２．３．４、あるい は５のプローブを使用して、その結果、時間と材料を節約することができる。

プローブは、それぞれ、問題のタイプのウィルスに唯一の配列モチーフに特異的 に結合することはできないということが記録されている。それはまた要求された 情報を搏るプローブを多数使用することによって得られた交雑サインでもある。

また他の使用は、池の病原体、例えばＨＩＶ、ライノウィルス、連鎖球５１１１ ９Ｉの分類をすることと、チーズ製造における望ましいあるいは望ましくない細 菌やウィルス性種族、例えば溶解素生成バクテリオファージや、望ましい細菌で あるラフトコｌカス　ラクチス（Ｌａｃｔｏｅｏｃｅｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕ ｂｓｐ、　１ａｃｔｉｓや５ｕｂ５Ｃｒｅ＋＋ｏｒｉｓ）を分類すること含んで いる。

本発明の方法は、一般には、ウィルス、細菌、マイコプラズマ（アニルプラズマ を含む）、スピロヘータ、ｓｌ、原生動物、植物および動物を同定したり分類し たりすることに適用される。植物（木を含む）は、ある情況において有用であろ うそれら（例えば、小麦のパン製造に望ましい小麦橿、油や製薬を含有する植物 、栄養学的に価値のある、あるいは病気に対する抵抗力のある穀物種）を同定す るための最初のスクリーニングプロセスとして分類される。そしてこれは、特性 を同定することができるようになる前に、雑種が成長するまで、待たなければな らない植物育種のプログラムの一部として価値のあるものである。

プローブとされる核酸は、ＤＮＡ＋ＲＮＡあるいはｃＤＮＡである。

その方法は、核酸とプローブの適当な組み合わせを伴うものである。制限はない ものの、これは、この方法の悸度を高めるために、（ＤＮＡ）全体として分離し た染色体核酸、リボ核酸、あるいは増幅した特異的な核酸部分を含んでいる。

特異的に増幅した核酸の場合、核酸の変異性の部分が、高度に保存された核酸配 列の間に位置していること、すなわち、オリゴヌクレオチドブライマーが、保存 部分を補足し、それらの間に位！する変異性部分の増幅を可能にするように設計 されていることが重要な概念である。適当な遺伝子座の例に、細菌性１６Ｓと２ ３６遺伝子、およびそれらの間の部分などのリポソームＲＮＡ遺伝子が含まれる 。プライマーは、おそらく、ポリメラーゼ連鎖反応における使用に適した長さの オリゴヌクレオチドで構成される。プローブは、おそらく、放射性あるいは非放 射性の樟識を付けられた長さ６から１０の塩基の間にあるオリゴヌクレオチド核 酸で構成される。プローブされるべき核酸は、ナイロンフィルター膜のような支 持体上に置かれる。核酸へのプローブの交雑は、十分に特異的な交雑分子が形成 し検出されることを可能とする。それぞれの核酸に結合したプローブの量を正確 に測定することは、重要なことであり、そして、貯蔵蛍光体スラリ１ノのオート ラジオグラフィの使用によって、あるいはその他の方法によって成し得るもので ある。　さて、本発明の実施例を、添付の図を参照して記述する。

図１は、４つの細菌の１６　Ｓ　ＩＪボノームＲＮＡ遺伝子からの部分的ＤＮＡ 配列を示すものである。

図２は、ただ２つのプローブを使用することにより、４つの細菌の明白な交雑サ インの生成を図示したものである。

図３は、６つの生物のそれぞれの交雑サインを生じさせるための６つのプローブ の使用を図式的に示したものである。

図４は、数名の人の乳頭腫ウィルスからの部分的なりＮＡ配列を示すものである 。

図５は、４名の人のライノウィルスからの部分的配列（それらは、反対に転写さ れて表現されている）を示すものである。

Ｌ息医上 図１は、翼なる生物からの幾つかの１６ｓリボンームＲＮＡ遺伝子の初めのヌク レオチド配列を示している。大腸！１６　Ｓ　ｒ　ＲＮＡ遺伝子の配列は、参照 配列（ＧｅｎＥＭＢＬ　受人番号ＪＯ１６９５）である。次の３つの配列は、遠 い関係にある細ｓｌ！（ストレプトマイセス　コエリカラ−（Ｓｔｒｅｐｔｏ＋ ＊ｙｅｅｓ　ｃｏｅｌｉｅｏｌｏｒ）、ＱｅｎＥＭＢＬ　受人番号ＹＯＯ４１１ ；／ａ−トモナス　アエルジ／−サ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎ ｏｓａ）　、　Ｇ　ｅ　ｎ　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　受人番号Ｘ０６６８４；／ｘ−ト モナス　テストステロニ（Ｐｓｅｕｄｓ＋ｏｎｘｓ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ）　、　Ｇ　ｅ　ｎ　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　受人番号Ｍ１１２２４　からのものであ る。コロンは、これらの種と大腸菌の１６ＳｒＲＮＡ配列の間の配列保存を示す ために使われる。最後の２つの配列（Ｐ、ａｅｒｕ、　とＰ、ｔｅｓｔ、）は、 同じ遺伝子の２種からのものであり、変異性部分が、２つの密接な関係にある種 の間で変異し続けるということを図示している。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）のプライマーとして使用されたオリゴヌクレオチドの配列の例は、矢印を付け ることで示されており、それぞれプライマーＡとプライマーＢである。交織のプ ローブとして使用されたオリゴヌクレオチドの配列の例は、プローブ１　（ＧＡ ＣＣＣＴＣＧ、Ｓ、ｃｏｅ　ｌ、）とプローブ２（ＣＴＧＡＧＡＣＡＣ，示され ているすべての種に存在する）として、下線が引か増幅した１６５　ｒＲＮＡ核 酸部分の準備。

使用した生物からの全ＤＮＡは、Ｄ、　Ａ、　ナフプウ１ド教授によりて、快く 提供されたものである。標的ＤＮＡ　（３ナノグラム）は、各増幅プライマー５ ｏ。

ナノグラムとのＰＣＲ反応に使われた。ＰＣＲは、工業化条件にしたがって、５ ０μｌの反応Ｇ中に、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼ（バーキ／−エルマーンートス ）２５ユニツトを使用して行われた。その反応は、９４℃で１分、５５℃で１分 、そして７３℃で２分というサイクル３０回よりなる。特異的なｒＲＮＡ部分の 増幅を可能にする対をなすオリゴスクレオチドプライマーは、ｎＭしたように、 プライマ一対ＡとＢとして使用される。プライ７一対ＣとＤは、配列５′−ＧＧ ＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧ−３’と５’　−ＡＴＣＴＣＡＣＧＡＣ ＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧ−３’　のオリゴヌクレオチドで構成される。

膜のｍ備。

等モル■の２ｘ変性剤（３Ｍ　ＮａＣ１，ＩＮ　Ｎａｐ）（）を、ＰＣＲ反応物 に直接添加した。それから、各反応物約２μｍを、０．５Ｎ　ＮａＯＨ，１，５ ＭＮａＣｌで予め濡らされたノーンスフ＋Ｊ　７　メノブラ／（デュポン製）の 上に、手で点々と付けた。濾過物を、５０ｍ１のＮａ２ＨＰＯａ、ｐＨ６，５で 中和し、乾燥し、その後８０℃で１時間焼結し、２分間Ｕｖ照射を行った。

放射性オリゴヌクレオチド　プローブの準備。

オリゴヌクレオチドを、アプライド　バイオ／ステム社の３８ＯＡ装置で合成し 、［ａ−３２ｐ］　ＡＴＰ　（３０００ＣＩ／ｍｍｏ＋−１；アマ−／ヤム　イ ／ターナショナル製）と、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでラベル化した。プロ ーブＰ３とＰ４ｆ７）配列は、それぞれ、５’　−ＣＣＡＣＧＴＴＧ−３’　と ５’　−ＴＧＣＡＴプローブのａ過物への交雑。

濾過物は、交Ｍｍ液（４Ｘ　ＳＳＣ，７％サルコノル）中で室温で３０分間予備 交雑し、その後、ａ過’Ｉｊ２Ｂｃｍ２当り２５０μＪの溶液中で、８０℃で３ 時間、３ｎＭの濃度で、プローブと交雑して得た。濾過物は、２つの取り替え用 の交雑溶液１００ｍ１の中で、１２℃で１時間洗い、その後フィルムあるいは貯 蔵蛍光スクリーンのいずれかに露光した。

交雑信号の分析。

貯蔵蛍光スクリーンを定量化（Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　１ｍａｇｅｒ、モレキ二う− 　ダイナミックス１２）　Ｌ、蛍光体映像装置のソフトウェアを使用して分析し た。信号の比は、変異性部分のプローブ（例えば前述したようにプローブＩ）に よって生じた信号の量を、不変性ブＱ−ブ（前述したようにプローブ２）によっ て生じた信号の量で割った値として計算した。

図２は、ＰＣＲ法を点々と付けたナイロンフィルター膜に対し、４つのオリゴヌ クレオチドプローブ（図１では２つ示されている）を使用して、得られた交雑情 報の概略図である。１６３　ｒＲＮＡ遺伝子の２つの分離部分は、それぞれプラ イマ一対人と８（図１に図示されている）、あるいはプライマー対ＣとＤを使用 して増幅した。プローブｐＩとｐ２は、プライマー対Ａと６を使用して増幅した 部分から、核酸サンプルのプローブとして使用されるものとして設計した。同様 にして、プローブｐ３とｐ４は、プライマー対ＣとＤから＋ＤＮＡのプローブｐ ３とｐ４として使用されるものである。交雑は、全く同じように２回行い、平均 をとった。交Ｎ信号は、貯蔵蛍光スクリーン放射能写真術によって定量化し、変 異性部分ブａ−ブ（ｐｌと９３）からの信号を、不変性部分プローブ（ｐ２とｐ ４）からの信号に対して棟卓化した。このようにして分類された４つの生物は、 ４つの異なる交雑サインで指定されるものであることが示されている。

すでに知られている配列の制御生物を使用することは、その生物に対して何らか のプローブを使用して得られた比を、他のすべての生物に同じプローブを使用し て得られた比と比較することを可能にするものである。対照標準の“正７の比に 近い比は、正として分類され、対ａｍ準の“負“の比に近い比は、負として分類 される。対＠ｔｊＡ’ｊ４の単一コピー配列を２倍した比は、プローブ配列の２ つのコピーを表すものとして分類される。

図２に示した図式と比の説明は、この時点で１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列がまだ知られ ていなかった２つ（Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓとＳ、　ｇｌａｕｅｃｓｃｅｎｓ） を含めて、４つの生物すべてが、異なる交雑サインを得て、これらの生物がここ に記載した方法によって分類できることを実験的に確認したことを示している。

より多くの（異なる）生物への応用においては、もっと早く論じられるように、 より多くのプローブが使用されるべきである。

図３は、核酸プローブの配列に対して分析された６個それぞれのプローブに正あ るいは負を指定し、その累積に基づいて、交雑サインを指定する概念を図式的に 表現したものである。１セツトの実験において可能な興なる交雑サインの数は、 ただ存在するか否かを測定するだけの実験では、２〜である。Ｎは、使用したプ ローブの数である。このような実験において２０のプローブを使用すると、２２ ｏ、すなわち１．　Ｑ　Ｏ万以上（この場合、２進法）の具なる交雑サインが得 られる。それぞれのタイプの核酸サンプルは、これらのサインのうち一つを、復 元的に指定するのである。核酸サンプル中のプローブ配列の存在は、サンプル中 に配列が独立して存在し、また交雑サインの数がより大きくなる回数を示すこと に加えて、精製され得るのである。ここで図に示したように、分析結果は、試験 した生物の核酸中のプローブの０．１あるいは２コピーを検知した。

Ｌ五五主 図４は、進行子宮頚癌（ｐｐｈ　ｌ　６とＰｐｈｌ８）の高い危険性に関連する ２人を含めて、異なる数人の人の乳＋ｉ１！１１ウィルスのゲノム部分のヌクレ オチド配列を示している。図１と同様に、コロンは、示された配列間でのヌクレ オチドの保存を示している。Ｐｐｈｌ　１．ｐｐｈｌｓ、Ｐｐｈｌ８および２９ ６３３０ｇの配列はＧｅｎＥＭＢＬ（受は入れ番号はそれぞれＭ１４１１９、Ｋ Ｏ２）１８、Ｘ　０５０１５、およびＭ　１２７３２）からのものである。一対 の電位差ＰＣＲプライマーは、プライマーＥ、Ｆと記され、非保存部分（プロー ブ５）と保存部分（プローブ６）の両プローブが示される。そのプローブは準備 され、前記の実施例１と同様に使用さＬ血立１ 図５は、４人の人のライ／ウィルスゲノムのヌクレオチド配列を、反転転写後に 現われた通りに示している。人ライノウィルスタイプ１４．８９、ＩＢおよび２ からの配列（ＧｅｎＥＭＢＬ配列からのもので、受は入れ番号はそれぞれ、Ｘ０ １０１１７１．　Ｍ１６２４ｇ、Ｄ００２３９、およびＸ０２３１６）が示され る。前述しナノと同様に、潜在プライマー（プライマーＧとＨ）が、示され、こ の例は、変異性部分からのプローブ（プローブ７と保存部分（プローブ８））に ついて示される。プローブは、前記実施例１と同様にＩＩ備され、また使用され る。

＞＞　＞＞＞＞＞　’）、５イ？−Ａ＞＞＞ｚ＞＞　４８図１ フ＠Ｏ−７”　グ雑 ｐ＋　９３　Ｗイン ’Ａｒｅｐ（Ｏｍ’ｆＣｅＳ　ＣＯｅ！ＩＣ０ＩＯｒ　Ｏ○　１１図２ ）０ローフ゛°　（及辻イン ま物　ｐｌ　ｐ２　ｐ３ｐ４　ｐ５　ｐ６主、、ｓ＋　”　十　〜　−−＋　１ １０００１１相＃２　−　＋＋　−−＋　＋　０２００ｉ１１鞠、３　＋　−＋ ＋＋　＋　−１０１２１０′４１−’ｈ＃４　＋　−−＋　−−１００１００Ｌ ＠均＃５　−　＋　＋　＋　−−０１１１００主”６　＋　−＋　−＋　＋＋　 ’ｌ’ｃＮＯｉ２図３ 図４ 図５ 国際調査報告 ｂ１ｍｍｗＩＩＡＴｗｌｌ曽ｎｍＮ５　ＯｒＴ／Ｉ’：；ｌ　０１／ｎｌＧ＋Ｉ ＋国際調査報告 フロントページの続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物を同定する方法であって、（１）生物から誘導された核酸を得ることと 、（２）各プローブが４〜７ヌクレオチド長である多数の短いオリゴヌクレオチ ドプローブを、前記核酸に交雑しようと試みることと、（３）各プローブが前記 核酸に交雑したか否かを決定することを含む上記方法。 ２．生物を同定する方法であって、（１）生物から誘導された核酸を得ることと 、（２）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを前記核酸に交雑しようと試み ることと、（３）各プローブが何回前記核酸に結合したかを定量化することと、 （４）プローブが０、１、２回あるいはそれ以上、前記核酸に結合したことを示 す交雑サインとして、工程（３）の結果を記録することを含む上記方法。 ３．前記交雑の前に、核酸の選ばれた部分の量を定量化する工程を含む請求の範 囲第１項又は第２項記載の方法。 ４．ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマー対、すなわち進展中高度に保存さ れたゲノム部分に交雑するのに適応される対としての使用に適する一本鎖ＤＮＡ 断片を選択することと、それより低い程度に保存された部分の横に位置させるこ とを含むことを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。 ５．各プローブが、複合生物の核酸に交雑することを特徴とする前記請求の範囲 第１項から第４項のいずれか１項に記載の方法。 ６．プローブが、４〜１５ヌクレオチドで構成されることを特徴とする請求の範 囲第２項から第５項のいずれか１項に記載の方法。 ７．濾過物上の全核酸に共通の保存プローブを使用して交雑の分析を行うことを 含めて、与えられた濾過物の与えられた位置の核酸の量を標準化することを有す ることを特徴とする請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項に記載の方法。 ８．リボソームＲＮＡ遺伝子配列への交雑に適する一本鎖ＤＮＡ片から成るＰＣ Ｒプライマー。 ９．（Ａ）【配列があります】 （Ｂ）【配列があります】 （Ｃ）【配列があります】 （Ｄ）【配列があります】 から選ばれた請求の範囲第８項に記載のＰＣＲプライマーと、ＰＣＲ反応におい て有用な断片。 １０．（Ａ）【配列があります】 （Ｂ）【配列があります】 （Ｃ）【配列があります】 （Ｄ）【配列があります】 から選ばれた一本鎖ＤＮＡプローブ。 １１．請求の範囲第４項にしたがうポリメラーゼ連鎖反応においてプライマー対 として使用される請求の範囲第９項に記載の一本鎖ＤＮＡ片。 １２．それぞれが４〜７ヌクレオチド長である多数の核酸変異性プローブを有す る生物分類のためのキット。 １３．各プローブが５〜６ヌクレオチド長である請求の範囲第１２項に記載のキ ット。 １４．分類するべき生物中の核酸の保存部分に交雑する保存プローブを付加的に 有することを特徴とする請求の範囲第１２項又は第１３項に記載のキット。 １５．１つあるいはそれ以上のＰＣＲプライマー対を付加的に有することを特徴 とする請求の範囲第１２項から第１４項のいずれか１項に記載のキット。