JP2014195456A - 原核および真核生物に関する核酸プローブに基づく診断アッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】生存原核及び真核生物に関する核酸プローブに基づく診断アッセイの提供。【解決手段】原核又は真核生物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出及び同定するための核酸プローブアッセイにおける標的領域としてのｓｓｒＡ遺伝子又は少なくとも１０ヌクレオチドから成るその断片の使用。ＤＮＡ分子の５’端又は３’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が普遍的標的領域として用いられ、種間及び属特異的な核酸プローブアッセイにおける領域として用いられる。【選択図】なし

Description

本発明は、原核および／または真核生物の検出および同定のための核酸アッセイにおける使用のための標的配列の同定に関する。

背景技術
小さい安定多コピー数ＲＮＡ転写物（ｔｍＲＮＡ）をコードするｓｓｒＡ遺伝子は、すべての細菌に見られ、そして最近、葉緑体および珪藻類で同定されてきている。ｔｍＲＮＡは、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ分子両方としての二重の機能を有し、そして、停止コドンが欠失した一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｍＲＮＡを救出し、プロテアーゼ分解前に一部切除ペプチドのトランス翻訳（ｔｒａｎｓ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を促進するのに関与する（Ｋｅｉｌｅｒ， Ｋ．Ｃ．ら（１９９６）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７１， ９９０−９９３）。ｔｍＲＮＡの特有の機能のため、研究者は、これらの分子の二次構造とその機能の関係を解析してきた。これらの研究は、異なる微生物由来のｔｍＲＮＡ二次構造の保存、並びにこうした構造的保存の進化的有意性および機能的関連性に焦点を置いてきた。Ｍａｔｖｅｅｖａ， Ｏら（１９９８）， Ｖｏｌ．１６， Ｎｏ．１３， １３７４−１３７５により、ＲＮＡ含有二次構造のモデルとしてｔｍＲＮＡを用い、ＲＮＡ分子に結合するオリゴヌクレオチドを調べる研究が行われた。該研究は、ｔｍＲＮＡにおける部位の同定を目的とせず、療法目的のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計を目的とした。

細菌診断法のための核酸標的／プローブの数は、現在限定されている。こうしたものとして、診断目的のための新規ＤＮＡおよびＲＮＡ標的を同定し、そして性質決定する必要性が、現在、優先事項とみなされている。プローブの開発のための標的核酸配列は、例えば、プラスミド、リボソームＲＮＡ遺伝子、遺伝子間領域、ビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）因子をコードする遺伝子またはランダムゲノムＤＮＡ断片であってもよい。さらに、ＲＮＡに基づく検出のための標的として用いられる、いくつかのＲＮＡ分子が記載されてきており、例えば、リボソームＲＮＡおよびＲＮアーゼＰがある。

いかなるものでもよい核酸に基づくプローブアッセイの基礎は、研究されている原核および真核生物すべてに存在するよく性質決定された核酸配列を必要とする。原核または真核生物の信頼できる検出のため、用いられる核酸プローブは、非常に特異的であり（すなわち、他の生物由来の核酸と交差反応せず）、そして非常に感受性でなければならない（すなわち、検出しようとする生物のほとんどまたはすべての株がプローブと反応しなければならない）。したがって、好ましい標的配列は、問題の生物のすべての株に存在するであろう。こうした配列は、他の密接に関連する種と問題の種の区別を可能にする有意な配列多様性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を有するが、一方、問題の種のすべての株の検出を可能にするのに十分な配列保存性を有するであろう。一般的に、特異的核酸プローブアッセイの基礎を形成することが可能な、核酸配列の正確な同定は、冗長で困難であり、そして不確実である。現在まで、非常に多様な微生物のための核酸プローブの開発を促進するであろう、一般的なアプローチはほとんどない。プローブ開発のための潜在的に有用な標的として同定されてきている核酸配列は、例えば、ｒＲＮＡ遺伝子およびＲＮＡ、並びにｒＲＮＡ １６Ｓ／２３Ｓ遺伝子間領域である。

大部分の核酸プローブ／標的アッセイは、検出および同定の目的のため、細菌細胞の高コピー数リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびｒＲＮＡ １６Ｓ／２３Ｓスペーサー領域（欧州特許第０ ３９５ ２９２号）に焦点を置く。多様な微生物の検出のため、これら
のｒＲＮＡプローブ／標的に基づく、いくつかの成功した商業的細菌診断キットが、販売されている。これらには、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴが販売する、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく商業的プローブキット、およびＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎ．Ｖ．、ベルギー・ヘントが販売する、１６Ｓ／２３Ｓスペーサー領域に基づくＤＮＡプローブの範囲が含まれる。しかし、これらの診断キットの多くには制限があり、多くの場合において、低コピー数標的配列のための感受性の欠如および密接に関連する生物間の配列同一性のための特異性の欠如が含まれる。

存在するいかなるものでもよい微生物の生存度の指標を提供するため、試料に直接適用することが可能な、核酸に基づく方法は、食品、産業、環境および医学的適用に、非常に重要であろう。

ＤＮＡに基づく方法の不都合な点は、これらが生存および死亡生物間を区別しないことである。いくつかの研究は、細胞生存度の指標としてｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを用いることに、焦点を置いている（Ｓｈｅｒｉｄａｎ， Ｇ．Ｅ．Ｃ．ら（１９９８）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６４， １３１３−１３１８）。しかし、これらの配列は、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡが細胞死後４８時間まで細菌細胞に存在する可能性があるため、満足できる標的ではない。

多核酸標的の同時モニターを取り込んだ、核酸に基づくマイクロアレイ様形式の出現により、現在、生存原核および真核細胞を検出し、そして同定する、プローブおよび／または標的領域として使用するための新規核酸配列を同定し、そして性質決定する、明らかな必要性がある。

発明の開示
本発明は、原核または真核生物に関する核酸プローブアッセイにおける標的領域としてのｓｓｒＡ遺伝子またはその断片の使用を提供する。

したがって、本発明は、ウイルス以外のすべての生物に関する適用を有する。
原核および真核生物の種を検出し、そして同定する標的領域として、ｓｓｒＡ遺伝子の領域を用いる、付随する利点を有する、他のいかなる核酸プローブアッセイも報告されてきていない。

本発明の１つの態様にしたがい、ＤＮＡ分子の５’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。
本発明の別の態様において、ＤＮＡ分子の３’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。

本発明のさらなる態様において、低相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片を、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いてもよい。

本発明のさらなる態様において、低相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片を、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いてもよい。
本明細書において、以後記載されるように、異なる生物由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のヌクレオチド配列並列は、これらの分子の５’および３’領域が、高い度合いの相同性を示し、そしてしたがって、普遍的標的領域として有用であることを示す。ｓｓｒＡ遺伝子はまた、いかなる他の細菌高コピー数ＲＮＡより、密接に関連した生物間の、より有意な度合いのヌクレオチド配列多様性も示す。これらの可変領域は、種間を区別する核酸アッ
セイの、理想的な標的である。

本発明はまた、原核または真核生物に関する核酸プローブアッセイにおける標的領域としての、ｓｓｒＡ遺伝子のＲＮＡ転写物であるｔｍＲＮＡまたはその断片の使用も提供する。

本発明の本側面の１つの態様にしたがい、ｔｍＲＮＡ分子の５’端由来の高相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。

あるいは、ｔｍＲＮＡ分子の３’端由来の高相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。
本発明の本側面のさらなる態様にしたがい、低相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片を、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いてもよい。

さらなる態様にしたがい、低相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片を、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いてもよい。
本発明にしたがった核酸プローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、典型的には、ｓｓｒＡ遺伝子および／またはｔｍＲＮＡ転写物あるいはその相補的配列の少なくとも１０ヌクレオチドからなり、そして原核または真核生物に関する核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイで用いられる。その相補的配列へのプローブハイブリダイゼーションは、典型的には、放射性または非放射性（例えば、比色または蛍光）標識で核酸プローブを標識することにより、明らかにされる。

好ましい態様において、前記ｓｓｒＡ遺伝子断片または前記ｔｍＲＮＡ断片は、増幅法において用いようとするプライマーの基礎として用いてもよい。
ｓｓｒＡ遺伝子またはｔｍＲＮＡ配列いずれかの５’および３’領域に向けられる普遍的オリゴヌクレオチドプライマーを用い、本発明にしたがい、非常に多様な細菌からｓｓｒＡ遺伝子またはそのコードｔｍＲＮＡを増幅し、同時に広い範囲の生物の増幅を促進する一方、また、特異的な核酸プローブハイブリダイゼーションおよび検出を可能にしてもよい。

好ましくは、増幅法の産物は、核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる。
さらに好ましくは、ｔｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ転写物は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして用いられる。

こうしたアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで行ってもよい。
本明細書に定義されるような標的領域は、生存および死亡原核または真核生物間を区別するためのアッセイの基礎として用いてもよい。

細胞死後に細菌細胞に存在する可能性があるｒＲＮＡおよびｍＲＮＡと対照的に、ｔｍＲＮＡは死んだ生物において、迅速に分解される。したがって、ｔｍＲＮＡは、単離細菌ＲＮＡへの核酸プローブハイブリダイゼーションにより直接、またはＲＮＡ増幅および増幅産物への核酸プローブハイブリダイゼーションの組み合わせにより、生存および死亡原核または真核生物間を区別するのに、有用な標的である可能性がある。

好ましくは、標的領域は、原核または真核生物の広規模検出および／または同定のための多プローブ形式で用いられる。
ｓｓｒＡ遺伝子プローブまたはｔｍＲＮＡ転写物プローブを、本発明にしたがい、原核または真核生物の広規模ハイスループット検出および同定のためのマイクロアレイ遺伝子
チップ系に関連させてもよい。

本発明にしたがった標的領域はまた、問題の試料中の原核または真核生物を検出するアッセイにおけるプローブとして用いてもよい。
こうした問題の試料には、呼吸管、泌尿生殖管または胃腸管由来の組織の試料、あるいは血液および血液分画、痰または脳脊髄液などの体液試料のような生物学的試料を含んでもよい。

本発明にしたがったアッセイはまた、食品試料、空気、水、海洋および土壌試料を含む環境試料、並びに植物および動物由来試料に対して行ってもよい。
本発明にしたがい、ｓｓｒＡ遺伝子またはｔｍＲＮＡ転写物の断片はまた、原核または真核生物のＤＮＡプロフィールを得て、そしてそれにより、同種の株間を区別するアッセイにおいて用いてもよい。

核酸配列並列は、個々の種内で、ｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡ転写物において、配列変動が起こることを示している。この種内配列変動を用い、疫学のため、同一種の株間を区別し、例えば、病気の突発（ｏｕｔｂｒｅａｋ）において、または集団研究のため、感染性病原体を追跡することが可能である。

本発明の他の適用には、療法目的のため、感染性原核または真核生物に対して向けられる剤を設計するためのｓｓｒＡ遺伝子、ｔｍＲＮＡ転写物またはそれに相補的なＤＮＡ配列、あるいはその断片の使用が含まれる。

こうした剤には、アンチセンスｍＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド、リボザイム、および拮抗性ペプチドが含まれてもよく、そしていかなる種類の医学的状態における使用にも適している。

したがって、本発明は、ｔｍＲＮＡ標的を用い、生物学的試料においてのみ多様な生物の検出に用いることが可能である。したがって、いかなる抗感染性病原体薬剤治療中および該治療後に、ｔｍＲＮＡ標的を用い、これらの特定の感染性病原体に対する療法（例えば、抗微生物および／または抗寄生虫治療）の有効性をモニターしてもよい。

１つの態様において、標的領域を用い、感染性病原体に対する薬剤療法の有効性をモニターする。
別の態様において、標的領域を用い、胃腸管における健康促進生物の生存度およびレベルをモニターする。

本発明の本側面は、例えばヨーグルトまたは健康状態を改善する他の食品に含まれる、例えば健康促進（生菌（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ））生物の腸フロラへの導入に関する。これらの生物の存在およびレベルを連続してモニターし、健康促進におけるこれらの連続した機能を確実にする目的および必要性がある。ｔｍＲＮＡ領域は、健康促進生物の存在をモニターするため、例えば糞便中の、生存生物を検出する標的として用いることが可能である。

さらなる態様において、アッセイは、原核または真核生物の定量化のために用いられる。
試料において生物を検出するプローブハイブリダイゼーションおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅を用いる際、シグナル強度に基づき、存在する生物の数を決定することが可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅のリアルタイム法もまた、試料中の生物の定量を可能にするのに用いてもよい。したがって、試料中の生物の数を定量化する能力は、治療目的の
ため、例えば、抗生物質または他の治療のため、あるいは治療有効性をモニターするため、臨床状況において、重要である可能性がある。

本発明のさらなる適用は、原核または真核生物を同定するためのｓｓｒＡ遺伝子配列データベースの使用である。
本発明は、ｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡ配列の５’および３’相同領域、並びに可変領域のための多様なプローブを提供し、該プローブは、これらの配列またはそれに相補的な配列に由来する。代表的な配列は以下のとおりである：
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）ｓｓｒＡ

アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスｔｍＲＮＡ

エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）ｓｓｒＡ、内部部分的

エロモナス・サルモニシダｔｍＲＮＡ、内部部分的

アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ｓｓｒＡ

アルカリゲネス・ユートロファスｔｍＲＮＡ

アクイフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）ｓｓｒＡ

アクイフェクス・エオリクスｔｍＲＮＡ

巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ｓｓｒＡ、内部部分的

巨大菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的

枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｓｒＡ

枯草菌ｔｍＲＮＡ

百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ｓｓｒＡ

百日咳菌ｔｍＲＮＡ

ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓｓｒＡ

ライム病ボレリアｔｍＲＮＡ

カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）ｓｓｒＡ

カンピロバクター・ジェジュニｔｍＲＮＡ

トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸ）ｓｓｒＡ

トラコーマクラミジア（Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸ）ｔｍＲＮＡ

トラコーマクラミジア（マウス肺炎）ｓｓｒＡ

トラコーマクラミジア（マウス肺炎）ｔｍＲＮＡ

クロロビウム・テピドゥム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）ｓｓｒＡ

クロロビウム・テピドゥムｔｍＲＮＡ

シアノフォラ・パラドキサ（Ｃｙａｎｏｐｈｏｒａ ｐａｒａｄｏｘａ）（藻類）シアネラ（ｃｙａｎｅｌｌｅ）ｓｓｒＡ

シアノフォラ・パラドキサ（藻類）シアネラｔｍＲＮＡ

アセトン・ブタノール生産菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ｓｓｒＡ、３’部分的

アセトン・ブタノール生産菌ｔｍＲＮＡ、３’部分的

デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）ｓｓｒＡ

デイノコッカス・ラディオデュランスｔｍＲＮＡ

デサルフォビブリオ・デサルフリカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

デサルフォビブリオ・デサルフリカンスｔｍＲＮＡ、内部部分的

ディケロバクター・ノドスス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｄｏｓｕｓ）ｓｓｒＡ、３’部分的

ディケロバクター・ノドススｔｍＲＮＡ、３’部分的

エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ｓｓｒＡ

エンテロコッカス・フェカリスｔｍＲＮＡ

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｓｓｒＡ

大腸菌ｔｍＲＮＡ

インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｓｓｒＡ

インフルエンザ菌ｔｍＲＮＡ

ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＡＴＣＣ ４３５０４）ｓｓｒＡ、内部部分的

ヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ ４３５０４）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

ヘリコバクター・ピロリ（株２６６９５）ｓｓｒＡ

ヘリコバクター・ピロリ（株２６６９５）ｔｍＲＮＡ

クレブシエラ・エロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（ＮＣＴＣ
９５２８）ｓｓｒＡ、内部部分的

クレブシエラ・エロゲネス（ＮＣＴＣ ９５２８）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＮＣＴＣ ６６２）ｓｓｒＡ、内部部分的

乳酸杆菌（ＮＣＴＣ ６６２）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ｓｓｒＡ、内部部分的

レジオネラ・ニューモフィラｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・グライ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・グライｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・イノキュアｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＮＣＴＣ
７９７３）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア菌（ＮＣＴＣ ７９７３）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア菌（ＮＣＴＣ １１９９４）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア菌（ＮＣＴＣ １１９９４）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・ムライ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｕｒｒａｙｉ）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・ムライｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・ウェルシメリｔｍＲＮＡ、内部部分的

マリノバクター・ヒドロカーボノクラスティクス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ
ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

マリノバクター・ヒドロカーボノクラスティクスｔｍＲＮＡ、内部部分的

鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）ｓｓｒＡ、内部部分的

鳥型結核菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的

ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

ウシ型結核菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的

らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）ｓｓｒＡ

らい菌ｔｍＲＮＡ

パラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

パラ結核菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的

ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓｓｒＡ

ヒト型結核菌ｔｍＲＮＡ

ヤギ伝染性胸膜肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）ｓｓｒＡ

ヤギ伝染性胸膜肺炎菌ｔｍＲＮＡ

性器マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）（ＡＴＣＣ ３３５３０、＃１）ｓｓｒＡ

性器マイコプラズマ（ＡＴＣＣ ３３５３０、＃１）ｔｍＲＮＡ

性器マイコプラズマ（ＡＴＣＣ ３３５３０、＃２）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

性器マイコプラズマ（ＡＴＣＣ ３３５３０、＃２）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ｓｓｒＡ

肺炎マイコプラズマｔｍＲＮＡ

淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＡＴＣＣ １９４２４）ｓｓｒＡ、内部部分的

淋菌（ＡＴＣＣ １９４２４）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

淋菌（ＦＡ １０９０）ｓｓｒＡ

淋菌（ＦＡ １０９０）ｔｍＲＮＡ

髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｓｓｒＡ

髄膜炎菌ｔｍＲＮＡ

ノストック・ムスコルム（Ｎｏｓｔｏｃ ｍｕｓｃｏｒｕｍ）ＰＣＣ７１２０
ｓｓｒＡ

ノストック・ムスコルムＰＣＣ７１２０ ｔｍＲＮＡ

オドンテラ・シネンシス（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（珪藻）葉緑体ｓｓｒＡ

オドンテラ・シネンシス（珪藻）葉緑体ｔｍＲＮＡ

ポルフィラ・プルプレウム（Ｐｏｒｐｈｙｒａ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（紅藻）葉緑体ｓｓｒＡ

ポルフィラ・プルプレウム（紅藻）葉緑体ｔｍＲＮＡ

ポルフィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ｓｓｒＡ

ポルフィロモナス・ギンギバリスｔｍＲＮＡ

プロテウス・レットゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ｓｓｒＡ（ＮＣＴＣ １０９７５）、内部部分的

プロテウス・レットゲリｔｍＲＮＡ（ＮＣＴＣ １０９７５）、内部部分的

シュードアルテロモナス・ハロプランクトニ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｏｎｉ）ｓｓｒＡ、内部部分的

シュードアルテロモナス・ハロプランクトニｔｍＲＮＡ、内部部分的

緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｓｓｒＡ

緑膿菌ｔｍＲＮＡ

ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｓｓｒＡ

ネズミチフス菌ｔｍＲＮＡ

シーワネラ・ピュートリファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ｓｓｒＡ

シーワネラ・ピュートリファシエンスｔｍＲＮＡ

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ｓｓｒＡ

黄色ブドウ球菌ｔｍＲＮＡ

ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）ｓｓｒＡ

ストレプトコッカス・ゴルドニｔｍＲＮＡ

ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ｓｓｒＡ

ミュータンス連鎖球菌ｔｍＲＮＡ

肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｓｓｒＡ

肺炎連鎖球菌ｔｍＲＮＡ

化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｓｓｒＡ

化膿連鎖球菌ｔｍＲＮＡ

シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ． ＰＣＣ６３０１ ｓｓｒＡ

シネココッカスｓｐ． ＰＣＣ６３０１ ｔｍＲＮＡ

ラン藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ． ＰＣＣ６８０３ ｓｓｒＡ

ラン藻ｓｐ． ＰＣＣ６８０３ ｔｍＲＮＡ

テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ｓｓｒＡ

テルモトガ・マリティマｔｍＲＮＡ

サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｓｓｒＡ

サーマス・サーモフィルスｔｍＲＮＡ

梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）ｓｓｒＡ

梅毒トレポネーマｔｍＲＮＡ

コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ｓｓｒＡ

コレラ菌ｔｍＲＮＡ

ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）ｓｓｒＡ

ペスト菌ｔｍＲＮＡ

カンピロバクター・フィタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

カンピロバクター・フィタスｔｍＲＮＡ、内部部分的

カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）（ＢＭ２５０９）ｓｓｒＡ、内部部分的

カンピロバクター・コリ（ＢＭ２５０９）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

カンピロバクター、ニワトリ単離体ｓｓｒＡ、内部部分的

カンピロバクター、ニワトリ単離体ｔｍＲＮＡ、内部部分的

ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

ウェルチ菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的

デュクレー菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）（ＮＣＴＣ １０９４５）
ｓｓｒＡ、内部部分的

デュクレー菌（ＮＣＴＣ １０９４５）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（食品単離体＃１）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（食品単離体＃１）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（食品単離体＃２）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（食品単離体＃２）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（食品単離体＃３）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（食品単離体＃３）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ １２２１０）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ １２２１０）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）（ＮＣＴＣ １１８４６）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・イバノビ（ＮＣＴＣ １１８４６）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・シーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（ＮＣＴＣ １１８５６）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・シーリゲリ（ＮＣＴＣ １１８５６）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

腸炎菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的

表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＮＣＴＣ １１０４７）ｓｓｒＡ、内部部分的

表皮ブドウ球菌（ＮＣＴＣ １１０４７）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（ＮＣＴＣ ８１８１）ｓｓｒＡ、内部部分的

ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＮＣＴＣ ８１８１）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ｓｓｒＡ

気管支敗血症菌ｔｍＲＮＡ

肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＣＷＬ０２９）、ｓｓｒＡ

肺炎クラミジア（ＣＷＬ０２９）ｔｍＲＮＡ

野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ｓｓｒＡ

野兎病菌ｔｍＲＮＡ

グイラルディア・テタ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ）（プラスチド）ｓｓｒＡ

グイラルディア・テタ（プラスチド）ｔｍＲＮＡ

タラシオシラ・ワイスフロッギ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ Ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ）（プラスチド）ｓｓｒＡ

タラシオシラ・ワイスフロッギ（プラスチド）ｔｍＲＮＡ

ヘリコバクター・ピロリｓｓｒＡ、（臨床的単離体１）、内部部分的

ヘリコバクター・ピロリｔｍＲＮＡ、（臨床的単離体１）、内部部分的

ヘリコバクター・ピロリｓｓｒＡ、（臨床的単離体２）、内部部分的

ヘリコバクター・ピロリｔｍＲＮＡ、（臨床的単離体２）、内部部分的

リステリア・シーリゲリ（ＮＣＴＣ １１８５６）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・シーリゲリ（ＮＣＴＣ １１８５６）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

リステリア・イバノビ（ＮＣＴＣ １１８４６）ｓｓｒＡ、内部部分的

リステリア・イバノビ（ＮＣＴＣ １１８４６）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

アフリカ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的

アフリカ菌（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・ゴルドネ（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・カンサシ（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・ケロネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・ケロネｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・スズルガイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｚｕｌｇａｉ）（ＡＴＣＣ ３５７９９）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・スズルガイ（ＡＴＣＣ ３５７９９）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・マルモエンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・マルモエンセ（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・フラベセンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・フラベセンスｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・マリヌムｔｍＲＮＡ、内部部分的

ネズミ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ）（環境単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的

ネズミ型結核菌（環境単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（ＡＴＣＣ
１０１４３）ｓｓｒＡ、内部部分的

スメグマ菌（ＡＴＣＣ １０１４３）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・キセノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・キセノピ（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（ＮＣＴＣ １０４２５）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・イントラセルラレ（ＮＣＴＣ １０４２５）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）（ＮＣＴＣ １０８０３）ｓｓｒＡ、内部部分的

マイコバクテリウム・スクロフラセウム（ＮＣＴＣ １０８０３）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的

ノカルジア・アステロイデスｔｍＲＮＡ、内部部分的

腸炎菌ｓｓｒＡ、内部部分的

腸炎菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的

表皮ブドウ球菌（ＮＣＴＣ １１０４７）ｓｓｒＡ、内部部分的

表皮ブドウ球菌（ＮＣＴＣ １１０４７）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＮＣＴＣ ８１８１）ｓｓｒＡ、内部部分的

ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＮＣＴＣ ８１８１）ｔｍＲＮＡ、内部部分的

上記配列のうち、配列番号４７から６２、６５から６８、７１および７２、９８および９９、１５９から１６８並びに１７６−２１７は、新規配列である。
上述の配列を用い、細菌種を同定するのに用いることが可能な、または核酸診断アッセイの生成のためのｓｓｒＡ遺伝子配列のデータベースを形成してもよい。

本発明にしたがって同定される代表的なプローブは以下のとおりである：
サルモネラ属：
１）属特異的プローブ：

（化２１１）
５’−ＣＧＡＡＴＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＧ−３’ 配列番号２１８
マイコバクテリア：
２）結核複合体検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ

（化２１２）
ＴＢ０１ ５’−ＡＣＴＣＣＴＣＧＧＡＣＡ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＣＡＧＣＧＡ−３’ 配列番号２１９
３）鳥型結核菌およびパラ結核菌配列検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ

（化２１３）
プローブ１： ＰＡＶ１−５’−ＧＴＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＡＧＣＧＣＣ−３’ 配列番号２２０
プローブ２： ＰＡＶ２−５’−ＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＣＣ−３’ 配列番号２２１
リステリア属：
４）細胞の熱殺処理後のｔｍＲＮＡ完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）決定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ：

（化２１４）
ＬＶｔｍ： ５’−ＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡ−３’ 配列番号２２２
大腸菌：
５）細胞の熱殺処理後のｔｍＲＮＡ完全性決定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ：

（化２１５）
Ｅｖｔｍ： ５’−ＡＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＣＧＡ−３’ 配列番号２２３
本発明にしたがって同定されるさらなる代表的なプライマーは以下のとおりである：
マイコバクテリア：
１）すべてのマイコバクテリア配列増幅のための縮重オリゴヌクレオチドプライマー

（化２１６）
５’プライマー
１０ＳＡＡＭ３−５’−ＣＡＧＧＣＡＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ／Ｃ）ＧＡＣＣＡＣＣＧＴＡＡ−３’ 配列番号２２４
３’プライマー
１０ＳＡＡＭ４−５’ＧＧＡＴＣＴＣＣ（Ｃ／Ｔ）Ｇ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｔ）Ｃ（Ａ／Ｇ）ＣＧ（Ａ／Ｇ）ＡＣ（Ａ／Ｔ）Ａ−３’ 配列番号２２５
２）鳥型結核菌およびパラ結核菌増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー

（化２１７）
５’プライマー： ＡＰ１ｆｏｒ−５’−ＴＧＣＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＡＣＴＧ−３’
配列番号２２６
３’プライマー： ＡＰ２ｒｅｖ−５’−ＣＡＣＧＣＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡ−３’
配列番号２２７
本発明は、以下の実施例により、さらに例示されるであろう。

実施例１
入手可能ｔｍＲＮＡ配列の一次ヌクレオチド配列の検査
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ核酸並列プログラムを用いた入手可能ｔｍＲＮＡ配列の比較一次ヌクレオチド配列並列により、表１に示されるように、原核生物由来のｔｍＲＮＡが、他の細菌高コピー数ＲＮＡより、より有意な度合いのヌクレオチド配列多様性および非相同性を示すことが立証された。

表１
異なる細菌由来のＲＮＡ分子間のヌクレオチド配列相同性パーセント

異なる細菌由来のｔｍＲＮＡ配列間のこれらの非相同性領域は、分子の中央に位置し、そしてｔｍＲＮＡ分子内の非相同なヌクレオチド配列の度合いにより、属特異的と共に種特異的プローブを生成し、細菌間の区別をし、および／または細菌を検出することが可能であることが示された。

ヌクレオチド配列並列により、先に、ｔｍＲＮＡ分子の５’および３’隣接領域が種内および属内で、高い度合いの相同性を共有することが示されてきている。本観察により、普遍的オリゴヌクレオチドプライマーを生成し、多様な細菌からｓｓｒＡ遺伝子またはそのコードｔｍＲＮＡを増幅すること可能であることが示された。

我々は現在、異なる生物由来のｔｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列内のこれらの相同性および非相同性領域を、分子レベルで生物を同定し、そして検出する基礎として用いることが可能であることを立証した。

実施例２
コレラ菌ｔｍＲＮＡ特異的プローブの開発
図１に示されるような、大腸菌（配列番号３７）およびコレラ菌（配列番号１２７）ｓｓｒＡ配列のヌクレオチド配列並列は、これらの２つの細菌種が、系統発生的に密接に関連していることを示す。しかし、アステリスクマークの非存在により明示されるように、配列間に非相同性領域がある。図１に下線で示した、コレラ菌ｓｓｒＡヌクレオチド配列の可変領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを合成した。

コレラ菌ｔｍＲＮＡ特異的プローブの配列は

（化２１８）
５’−ＡＡＣＧＡＡＴＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡ−３’ 配列番号１６９
である。

増殖の対数中期および定常期で、大腸菌およびコレラ菌の液体培養から総ＲＮＡを単離した。図２に示すように、同等の量の単離総ＲＮＡを、変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動し、そしてＨＹＢＯＮＤ−Ｎナイロン膜上にブロッティングした。レーン１−４は以下に相当する：
レーン１：総大腸菌ＲＮＡ対数中期
レーン２：総コレラ菌ＲＮＡ対数中期
レーン３：総大腸菌ＲＮＡ定常期
レーン４：総コレラ菌ＲＮＡ定常期
その後、生じたノーザンブロットを、γＰ³²で末端標識したコレラ菌ｔｍＲＮＡ特異的プローブとハイブリダイズさせた。図３に示されるハイブリダイゼーション実験結果は、コレラ菌ｔｍＲＮＡのみが検出されたため、プローブの特異性を立証する。さらに、増殖の定常期中の培養から単離されたコレラ菌ｔｍＲＮＡで、より高い度合いのハイブリダイゼーションシグナル強度が観察され、この期間中、より高いコピー数のｔｍＲＮＡ分子がコレラ菌細胞に存在することが示された。

実施例３
未知のｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡ配列の性質決定のための普遍的ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡオリゴヌクレオチド増幅プライマーの生成
すべての入手可能なｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡ配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ並列により、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、多様な生物に関し、ｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡヌクレオチド配列を増幅することが可能であることが示された。

縮重オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、広い範囲の細菌由来の総ゲノムＤＮＡ調製から、ｓｓｒＡ遺伝子配列をＰＣＲ増幅した。
合成縮重オリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである：

（化２１９）
（ａ）ｔｍＵ５’： ５’ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅プライマー
５’−ＧＧＧ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ）ＴＡＣＧＧ（Ａ／Ｔ）ＴＴＣＧＡＣ−３’ 配列番号１７０
（ｂ）ｔｍＵ３’： ３’ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅プライマー
５’−ＧＧＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＣＧＡＡＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）ＧＴＣＣ−３’
配列番号１７１
縮重塩基位は、括弧内である。

ＰＣＲ反応の産物をアガロースゲル上で電気泳動し、そして図４に示されるように、すべての場合で３５０塩基対（およそ）のＰＣＲ産物が増幅され、縮重ｔｍＲＮＡプライマーの「普遍性」が立証された。

図４において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ
レーン１：大腸菌
レーン２：サルモネラ・プーナ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐｏｏｎａ）
レーン３：クレブシエラ・エロゲネス
レーン４：プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）
レーン５：プロテウス・レットゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）
レーン６：エロモナス・ヒドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）
レーン７：黄色ブドウ球菌
レーン８：エンテロコッカス・フェカリス
レーン９：乳酸杆菌
レーン１０：枯草菌
レーン１１：リステリア菌
レーン１２：リステリア・イノキュア
レーン１３：リステリア・ムライ
レーン１４：リステリア・ウェルシメリ
レーン１５：リステリア・グライ
レーン１６：ウシ型結核菌
レーンＢ：分子量マーカーＶ
表２に示されるように、普遍的プライマーは、グラム陽性およびグラム陰性細菌両方から、ｓｓｒＡ遺伝子を増幅した。

表２
普遍的増幅プライマーで試験した細菌種

実施例４
以前未知であった細菌ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡヌクレオチド配列の単離および性質決定
実施例２由来の、細菌のリステリア種およびウシ型結核菌細菌由来のゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定の目的のためのＴ−テール化プラスミドベクターにサブクローニングした。各種に関し、３つの組換えクローンを選択し、そしてジデオキシ配列決定法により、配列決定した。各サブクローンに関し、両ＤＮＡ鎖の配列を決定した。

ウシ型結核菌ｓｓｒＡ遺伝子に関し決定したヌクレオチド配列は、ヒト型結核菌ｓｓｒＡ遺伝子配列と、１００％相同性を共有した。
リステリア種に関し得られた新規ｓｓｒＡ遺伝子配列（配列番号５１、５３、５５、５９および６１）のｃｌｕｓｔａｌ Ｗ並列を図５に示す。本解析により、リステリア細菌に関し、属特異的プローブおよびオリゴヌクレオチド増幅プライマーを生成することが可能であることが示された。さらに、該並列により、他のリステリア種からリステリア菌を区別するであろう、種特異的オリゴヌクレオチドプローブを生成することが可能であることもまた、示された。

図５において、提唱される属特異的オリゴヌクレオチドプライマー、Ｌｔｍ １およびＬｔｍ ２は、囲みで示され、属特異的リステリア・オリゴヌクレオチドプローブＬＧｔｍも同様である。提唱されるリステリア菌種特異的オリゴヌクレオチドプローブ配列、ＬＳｔｍは、下線および斜字で示される。

ｓｓｒＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡ核酸標的が、細菌診断法に適した標的であることをさらに例示するため、リステリア菌ｓｓｒＡ遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号５５）と、入手可能な枯草菌ｓｓｒＡ遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号１１）（リステリアに系統発生的に密接に関連する細菌）の比較並列を、図６に示すように行った。配列並列の解析は、４１％のヌクレオチド配列相同性パーセントを示し、一方、対応する１６Ｓ ｒＲＮＡ並列は、８７％のヌクレオチド配列相同性パーセントを示す（データ未提示）。

実施例５
リステリア細菌種に関するｓｓｒＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡ属特異的増幅プライマー、属特
異的および種特異的プローブの生成および適用
実施例４のリステリア属ｓｓＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡヌクレオチド配列並列を用い、ｓｓｒＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡヌクレオチド配列の領域を解析し、属特異的増幅プライマー、並びに属特異的および種特異的オリゴヌクレオチドプローブの生成の適切性を決定した。本解析中、これらの増幅プライマーおよびプローブの設計において、枯草菌に対し、最大配列相違を示す領域を選択した。

合成オリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである：

（化２２０）
（ａ）Ｌｔｍｌ： ５’リステリア属特異的増幅プライマー
５’−ＡＡＡＧＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＧＧ−３’ 配列番号１７２
（ｂ）Ｌｔｍ２： ３’リステリア属特異的増幅プライマー
５’−ＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＧＧＣＡＣＴＴ−３’ 配列番号１７３
（ｃ）ＬＧｔｍ：リステリア属特異的ハイブリダイゼーションプローブ
５’−ＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＴＡＣＣＧＴＡＧ−３’ 配列番号１７４
（ｄ）ＬＳｔｍ：リステリア菌種特異的ハイブリダイゼーションプローブ
５’−ＴＣＴＡＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＣＧ−３’ 配列番号１７５
属特異的増幅プライマーＬｔｍ１およびＬｔｍ２を、各場合で、テンプレートとして２０の異なる株由来の総ゲノムＤＮＡを用いた、一連のＰＣＲ反応で用いた。これらのプライマーを用い、リステリア種由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のみが増幅され（２６０塩基対産物）（図７および表３）、ｓｓｒＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡが、細菌属の特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅に適した標的であることが立証された。試験したいかなる他の細菌種に関しても、増幅産物は観察されなかったが、実施例２に記載される普遍的プライマー（ｔｍＵ５’およびｔｍＵ３’）を用いると、これらの細菌種由来のＤＮＡからＰＣＲ産物が得られた。

図７において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ
レーン１：大腸菌
レーン２：Ｓ．プーナ
レーン３：Ｋ．エロゲネス
レーン４：Ｐ．ミラビリス
レーン５：Ｐ．レットゲリ
レーン６：Ａ．ヒドロフィリア
レーン７：黄色ブドウ球菌
レーン８：Ｅ．フェカリス
レーン９：乳酸杆菌
レーン１０：枯草菌
レーン１１：リステリア菌株１
レーン１２：リステリア菌株２
レーン１３：リステリア菌株３
レーン１４：リステリア菌株４
レーン１５：リステリア菌、臨床的単離体
レーン１６：Ｌ．イノキュア
レーン１７：Ｌ．ムライ
レーン１８：Ｌ．ウェルシメリ
レーン１９：Ｌ．グライ
レーン２０：ウシ型結核菌
レーンＢ：分子量マーカーＶ
表３
リステリア特異的増幅プライマーで試験した細菌種

リステリア属特異的オリゴヌクレオチドプローブ、ＬＧｔｍを、図4に示されるサザン
ブロットにハイブリダイズさせた。陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、図８および表４に示されるように、リステリア種のみで観察され、特定の属を検出する際の標的としてのｔｍＲＮＡ配列の有用性が立証された。

図８において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ
レーン１：大腸菌
レーン２：サルモネラ・プーナ
レーン３：クレブシエラ・エロゲネス
レーン４：プロテウス・ミラビリス
レーン５：プロテウス・レットゲリ
レーン６：エロモナス・ヒドロフィリア
レーン７：黄色ブドウ球菌
レーン８：エンテロコッカス・フェカリス
レーン９：乳酸杆菌
レーン１０：枯草菌
レーン１１：リステリア菌
レーン１２：リステリア・イノキュア
レーン１３：リステリア・ムライ
レーン１４：リステリア・ウェルシメリ
レーン１５：リステリア・グライ
レーン１６：ウシ型結核菌
レーンＢ：分子量マーカーＶ
本実施例に記載され、そして図７に示される、属特異的増幅を用いて生成されたＰＣＲ産物をサザンブロッティングし、そしてリステリア菌種特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。図９および表４に示されるように、リステリア菌の４つの型決定株のうち３つおよび臨床単離体で、陽性ハイブリダイゼーションシグナルが観察された。

図９において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ
レーン１：大腸菌
レーン２：Ｓ．プーナ
レーン３：Ｋ．エロゲネス
レーン４：Ｐ．ミラビリス
レーン５：Ｐ．レットゲリ
レーン６：Ａ．ヒドロフィリア
レーン７：黄色ブドウ球菌
レーン８：Ｅ．フェカリス
レーン９：乳酸杆菌
レーン１０：枯草菌
レーン１１：リステリア菌株１
レーン１２：リステリア菌株２
レーン１３：リステリア菌株３
レーン１４：リステリア菌株４
レーン１５：リステリア菌、臨床的単離体
レーン１６：Ｌ．イノキュア
レーン１７：Ｌ．ムライ
レーン１８：Ｌ．ウェルシメリ
レーン１９：Ｌ．グライ
レーン２０：ウシ型結核菌
レーンＢ：分子量マーカーＶ
表４
リステリア属特異的プローブおよびリステリア菌種特異的プローブの特異性

型決定されたリステリア株の１つ、株４は、本プローブで陽性シグナルを生成するのに失敗した。本株由来のＰＣＲ増幅ｓｓｒＡ遺伝子のＤＮＡ配列決定は、本株が、Ｌ．イノキュアと同一のプローブ標的領域を含むことを立証した。しかし、本株由来のｓｓｒＡ遺伝子は、先に性質決定されたリステリア菌株と同一の配列の他の領域を含み、そしてこれらの配列は、図１５に示されるように、Ｌ．イノキュアの配列とは異なる。したがって、種、例えばリステリア菌内の各株種（単離体）を認識するであろう、これらの可変領域の１つに向けられる種特異的オリゴヌクレオチドを合成してもよい。

実施例６
リステリアｓｓｒＡ遺伝子配列の多比色プローブ検出
ＬＧＴｍ（Ａ）、ＬＳｔｍ（Ｂ）およびカンピロバクター・ウプサリエンシス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓ）１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー（Ｃ−５’ＣＡＴＴＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧ
３’）配列番号２２８オリゴヌクレオチドプローブを、ナイロン膜片に不可逆的に結合させ、そして属特異的プライマーＬｔｍ１およびＬｔｍ２（Ｌｔｍ１は５’端でビオチン標識した）を用いた、リステリア菌（１−６）、Ｌ．イノキュア（７−１０）、Ｌ．イバノビ（１１）、Ｌ．ムライ（１２）、Ｌ．シーリゲリ（１３）、Ｌ．ウェルシメリ（１４）およびＬ．グライ（１５）由来の増幅ｓｓｒＡ ＰＣＲ産物と、ハイブリダイズさせた。ｔｍＵ５’およびｔｍＵ３’（ｔｍＵ５’は５’端でビオチン標識した）を用いた、グラム陽性細菌、枯草菌、乳酸杆菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、Ｅ．フェカリス、Ｃ．ペルフリンジンズ（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｉｎｓ）（１６−２１）およびグラム陰性細菌、大腸菌、腸炎菌、Ｐ．レットゲリ、Ｋ．エロゲネス（２２−２５）由来のｓｓｒ
Ａ増幅ＰＣＲ産物もまた、ナイロン膜片にハイブリダイズさせた。図１０に示されるように、ハイブリダイゼーション後、ビオチンに対する比色アッセイの現像により、以下が明らかになった：片１−６は、リステリア菌に由来するｓｓｒＡ増幅ＰＣＲ産物と合わせ、増幅ＰＣＲ産物が属リステリア由来のものであることの確認を示し−ＡおよびＢは色検出を提供し；片７−１５は、これらのＰＣＲ産物が属リステリアに由来することを示し−Ａのみが色検出を提供し；そして片１６−２５は、ＰＣＲ産物が属リステリア由来でないことを示す−色検出はない。Ｃは陰性オリゴヌクレオチドコントロールプローブであり、そしてＤはすべての試料に関する陽性コントロール比色検出アッセイである。

実施例７
生物の種間を区別するｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡ配列の使用
図１１（配列番号１９および２１）、１２（配列番号４１および４３）、１３（配列番号７７および７９）、１４（配列番号８３および８５）、１５および１６（配列番号５３、５５および５７）に示されるようなＣｌｕｓｔａｌ Ｗ並列は、同一細菌の異なる株のｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡ配列内にヌクレオチド相違があることを示す。これは、ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡ配列を用い、細菌種内の個々の株および／または株群間を区別することが潜在的に可能であることを示唆する。これは、疫学および細菌集団解析に有用な適用を有する可能性がある。

実施例８
細菌細胞の中程度のおよび極端な熱処理後のｔｍＲＮＡ完全性解析
大腸菌およびリステリア菌培養を、一晩培養後、大腸菌の場合、８０℃で２０分間、そしてリステリア菌の場合、４０分間、そして両方の菌を１２０℃で１５分間（オートクレーブ）熱処理し、そして生存度に関し、熱処理の０時間、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間および４８時間後に試験した。試験した各時点で、いかなる生存度も観察されなかった。これらの時点で、また、総ＲＮＡを単離し、そして変性１．２％ アガロースゲル上で電気泳動し、そしてノーザンブロッティングした。各ブロットを、大腸菌の場合（図１７および１８）、放射能標識オリゴヌクレオチドプローブＥｖｔｍで、そしてリステリア菌の場合（図１９および２０）、放射標識ＬＶｔｍにハイブリダイズさせた。試験した各試料で、いかなるｔｍＲＮＡ転写物も検出されず、ｔｍＲＮＡ転写物が熱処理後、分解されたことが立証された。表記＋ｖｅに相当するレーンは、陽性コントロール総ＲＮＡ試料である。

実施例９
生存および非生存細菌間を区別する際のｔｍＲＮＡ転写物の使用
リステリア菌の１００ ｍｌ培養を、液体培養中で一晩増殖させた。増殖後、細胞の連続希釈を行い、そして栄養寒天プレート上にスプレッドプレーティングすることにより、生存度を決定した。同時に、これらの細胞の１ ｍｌアリコットから総ＲＮＡを単離した。細胞の残りを、６５℃で２０分間加熱した。その後、生存度解析および総ＲＮＡ単離のため、細胞を除去した。生存度およびＲＮＡ単離のための試料は、処理後、０時間、２時間、６時間および２４時間後の時点で採取した。

栄養寒天プレート上のスプレッドプレーティングにより、生存コロニー形成単位はまったく観察されず、熱処理がリステリア菌細胞を殺したことが示された。単離された各ＲＮＡ試料をその後、ＤＮアーゼで処理し、いかなる混入ＤＮＡも除去し、そして総ＲＮＡ試料（１００ ｎｇ）を、リステリア属特異的ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマー、Ｌｔｍ１およびＬｔｍ２を用いた逆転写酵素−ＰＣＲ増幅に供した。陰性コントロール増幅反応には、プライマー、標的、およびＴａｑポリメラーゼが含まれたが、逆転写酵素は含まれなかった。増幅反応の結果を図１２に示す。

増幅ｔｍＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ産物は、熱処理されないＲＮＡ試料のみで観察された。すべての他の試料は、いかなるＲＴ−ＰＣＲ産物も提供せず、これらの試料中のｔｍＲＮＡ分子は、非生存熱処理細胞中で分解していた可能性があることを示す。

図２１において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ；
レーン１：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（細胞の熱処理なし）、−逆転写酵素（ＲＴ）、＋Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＰ）；
レーン２：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（細胞の熱処理なし）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン３：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後０時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン４：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後０時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン５：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後１時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン６：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後１時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン７：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後２時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン８：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後２時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン９：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後６時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン１０：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後６時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン１１：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後２４時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン１２：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後２４時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーンＢ：分子量マーカーＶ。

図１は、大腸菌およびコレラ菌ｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図２は、大腸菌およびコレラ菌細胞から調製した総細胞ＲＮＡのアガロースゲル写真である。 図３は、大腸菌およびコレラ菌のｔｍＲＮＡ転写物に対するコレラ菌オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションのオートラジオグラム写真である。 図４は、一団の生物由来の普遍的ｓｓｒＡ遺伝子増幅プライマーの増幅産物のアガロースゲル写真である。 図５Ａは、リステリア種由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図５Ｂは、リステリア種由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図６は、リステリア菌および枯草菌ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図７は、一団の生物由来のリステリア属特異的ＰＣＲ増幅プライマーの増幅産物のアガロースゲル写真である。 図８は、実施例４で調製されるような、一団の生物に対し、ハイブリダイズしたリステリア属特異的オリゴヌクレオチドプローブのオートラジオグラム写真である。 図９は、実施例７で調製されるような、一団の生物に対し、ハイブリダイズしたリステリア菌種特異的プローブのオートラジオグラム写真である。 図１０は、実施例６に記載されるような、リステリアｓｓｒＡ遺伝子配列の多比色プローブ検出で用いられるナイロン膜片のコンピュータースキャン画像である。 図１１Ａは、トラコーマクラミジア株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図１１Ｂは、トラコーマクラミジア株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図１２は、Ｈ．ピロリ株由来のｓｓｒＡ配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図１３は、性器マイコプラズマ株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図１４は、淋菌株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図１５は、リステリア菌株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図１６は、リステリア菌株およびＬ．イノキュア株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。 図１７は、大腸菌細胞の中程度の熱処理後に単離した総ＲＮＡ試料に対し、ハイブリダイズしたリステリア・オリゴヌクレオチドプローブ（Ｅｖｔｍ）のオートラジオグラム写真である。 図１８は、大腸菌細胞の極端な熱処理後に単離した総ＲＮＡ試料に対し、ハイブリダイズしたリステリア・オリゴヌクレオチドプローブ（Ｅｖｔｍ）のオートラジオグラム写真である。 図１９は、リステリア菌細胞の中程度の熱処理後に単離した総ＲＮＡ試料に対し、ハイブリダイズしたリステリア・オリゴヌクレオチドプローブ（Ｌｖｔｍ）のオートラジオグラム写真である。 図２０は、リステリア菌細胞の極端な熱処理後に単離した総ＲＮＡ試料に対し、ハイブリダイズしたリステリア・オリゴヌクレオチドプローブ（Ｌｖｔｍ）のオートラジオグラム写真である。 図２１は、熱処理後の多様な時点の、ＲＴ−ＰＣＲ生成ｔｍＲＮＡ産物のアガロースゲル写真である。

Claims (25)

1. 原核または真核生物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出及び同定するための核酸プローブアッセイにおける標的領域としてのｓｓｒＡ遺伝子または少なくとも１０ヌクレオチドから成るその断片の使用であって、標的領域は配列番号１〜２２７の配列またはそれらの断片から成る群より選択することができる、前記使用。
2. 標的配列が、配列番号１３〜１６、１９〜２２２、３５、３６、４９〜５２、６５〜７０、７３〜７４、８１〜８６、１５７〜１６２、１８４〜１８５、２００〜２０３、２１６〜２１７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、５５〜６２、１４９、１５０、１５１、１５２、３７、３８、１０１、１０２、１１５、１１６、またはそれらの断片から成る群より選択することができる、請求項１記載の使用。
3. ＤＮＡ分子の５’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項１記載の使用。
4. ＤＮＡ分子の３’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項１記載の使用。
5. 低相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項１記載の使用。
6. 低相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いられる、請求項１記載の使用。
7. 原核または真核生物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出及び同定するための核酸プローブアッセイにおける標的領域としての、ｓｓｒＡ遺伝子のＲＮＡ転写物であるｔｍＲＮＡまたは少なくとも１０ヌクレオチドから成るその断片の使用であって、標的領域は配列番号１〜２２７の配列またはそれらの断片から成る群より選択することができる、前記使用。
8. 標的配列が、配列番号１３〜１６、１９〜２２２、３５、３６、４９〜５２、６５〜７０、７３〜７４、８１〜８６、１５７〜１６２、１８４〜１８５、２００〜２０３、２１６〜２１７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、５５〜６２、１４９、１５０、１５１、１５２、３７、３８、１０１、１０２、１１５、１１６、またはそれらの断片から成る群より選択することができる、請求項７記載の使用。
9. ｔｍＲＮＡ分子の５’端由来の高相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項７記載の使用。
10. ｔｍＲＮＡ分子の３’端由来の高相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項７記載の使用。
11. 低相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片が、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項７記載の使用。
12. 低相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片が、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いられる、請求項７記載の使用。
13. 前記ｓｓｒＡ遺伝子断片または前記ｔｍＲＮＡ断片が、増幅法において用いようとするプライマーの基礎として用いられる、請求項１〜１２のいずれか１項記載の使用。
14. 増幅法の産物が、核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項１３記載の使用。
15. ｔｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ転写物が、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして用いられる、請求項７〜１４のいずれか１項記載の使用。
16. 標的領域が、生存および死亡原核または真核生物間を区別するためのアッセイの基礎として用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
17. 標的領域が、原核または真核生物の広規模検出および／または同定のための多プローブ形式で用いられる、請求項１〜１６のいずれか１項記載の使用。
18. ｓｓｒＡ遺伝子プローブまたはｔｍＲＮＡ転写物プローブを、原核または真核生物の広規模ハイスループット検出および同定のためのマイクロアレイ遺伝子チップ系に関連させる、請求項１７記載の使用。
19. 標的領域が、問題の試料中の原核または真核生物を検出するアッセイにおけるプローブとして用いられる、請求項１〜１８のいずれか１項記載の使用。
20. ｓｓｒＡ遺伝子またはｔｍＲＮＡ転写物が、原核または真核生物のＤＮＡプロフィールを得て、そしてそれにより、同種の株間を区別するアッセイにおいて用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
21. ｓｓｒＡ遺伝子、ｔｍＲＮＡ転写物またはそれに相補的なＤＮＡ配列、あるいはそれら断片が、感染性原核または真核生物に対する治療剤を設計するのに用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
22. 標的領域が、感染性病原体に対する薬剤療法の有効性をモニターするのに用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
23. 標的領域が、胃腸管における健康促進生物の生存度およびレベルをモニターするのに用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
24. アッセイが、原核または真核生物の定量化のために用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
25. ｓｓｒＡ遺伝子配列のデータベースが、原核または真核生物を同定するのに用いられる、請求項１〜６および１３〜１５のいずれか１項記載の使用。