JPH03130099A - 標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成 - Google Patents
標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成Info
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- JPH03130099A JPH03130099A JP2101858A JP10185890A JPH03130099A JP H03130099 A JPH03130099 A JP H03130099A JP 2101858 A JP2101858 A JP 2101858A JP 10185890 A JP10185890 A JP 10185890A JP H03130099 A JPH03130099 A JP H03130099A
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- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物に対して特異的であり、そして非実験的
方法で属と種との間を区別できるＤＮＡプローブを生成
するための方法に関する。
方法で属と種との間を区別できるＤＮＡプローブを生成
するための方法に関する。
サンプル中の生物の同定が重要である多の状況が存在す
る。これは、臨床、獣医、食品及び環境的サンプルにお
いて真実である。現在、従来の微生物学的方法（増殖特
徴及び／又は生化学的パラメーターがモニターされる）
、免疫診断方法又はＤＮＡに基づく方法のいづれかによ
りそのような同定を行なうことが可能である。
る。これは、臨床、獣医、食品及び環境的サンプルにお
いて真実である。現在、従来の微生物学的方法（増殖特
徴及び／又は生化学的パラメーターがモニターされる）
、免疫診断方法又はＤＮＡに基づく方法のいづれかによ
りそのような同定を行なうことが可能である。
ＤＮＡプローブは、ｗｏ８９１０６７０４及びアメリカ
特許筒４，８５１，３３０号に記載されるように生物の
同定のために使用されて来た。多くのそのようなプロー
ブは、１６Ｓ及び２３ＳリボゾームＲＮ Ａ （ｒＲＮ
Ａ）の一部が異なった種で異なる観察（Ｗｏｅｓｅ。
特許筒４，８５１，３３０号に記載されるように生物の
同定のために使用されて来た。多くのそのようなプロー
ブは、１６Ｓ及び２３ＳリボゾームＲＮ Ａ （ｒＲＮ
Ａ）の一部が異なった種で異なる観察（Ｗｏｅｓｅ。
５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａ ２４４ （６
）１９８１を参照のこと〕に由来する。この情報は初め
、系統発生学的分析のために使用されたが、しかしそれ
は最近、生物の同定のためのＤＮＡプローブに基づく方
法のために使されている。
）１９８１を参照のこと〕に由来する。この情報は初め
、系統発生学的分析のために使用されたが、しかしそれ
は最近、生物の同定のためのＤＮＡプローブに基づく方
法のために使されている。
生物の特徴を示すｒＲＮＡ配列が得られる方法は、初め
に、標記ＤＮＡが陽性シグナルを付与し、そして区別さ
れることが必要とされる生物が陰性シグナルを付与する
特異的なハイブリダイゼーション実験に依存し、又は両
方の種に共通である配列が排除され、そして対象の生物
にユニークである配列（匿名であることができる）が保
持されるハイブリダイゼーション実験を用いる方法が液
体中で行なわれた。ＤＮＡプローブのための標的配列の
最終の種類は、生物の特徴を示すある抗原又は生化学的
生成物をコードするゲノムの領域である。
に、標記ＤＮＡが陽性シグナルを付与し、そして区別さ
れることが必要とされる生物が陰性シグナルを付与する
特異的なハイブリダイゼーション実験に依存し、又は両
方の種に共通である配列が排除され、そして対象の生物
にユニークである配列（匿名であることができる）が保
持されるハイブリダイゼーション実験を用いる方法が液
体中で行なわれた。ＤＮＡプローブのための標的配列の
最終の種類は、生物の特徴を示すある抗原又は生化学的
生成物をコードするゲノムの領域である。
すべての場合、ＤＮＡプローブの好結果は、対象の生物
中の標的配列を検出するその能力に依存し、ところがそ
れは、対象の生物にひじょうに関係される又は研究中の
サンプルに存在しそうである他の一連の生物にハイブリ
ダイズしない。標的ＤＮＡへのプローブのハイブリダイ
ゼーションは、ＤＮＡ配列及び使用されるハイブリダイ
ゼーション条件に依存する。２種のひしように近い関係
の配列の間の区別を可能にするであろうＤＮＡプローブ
の条件の選択のための十分に確立した指針が存在する（
Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｃ１ｆｌｅ、 （１９８２）Ｃｏ
ｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎ） 。ＤＮＡブローフ゛の目的は、標的のＤＮＡ配
列が他の生物の配列との最大の差異を有する場合、及び
研究下の領域のＤＮＡ配列のわかりやすいデータバンク
が利用できる場合、最適化され得る。
中の標的配列を検出するその能力に依存し、ところがそ
れは、対象の生物にひじょうに関係される又は研究中の
サンプルに存在しそうである他の一連の生物にハイブリ
ダイズしない。標的ＤＮＡへのプローブのハイブリダイ
ゼーションは、ＤＮＡ配列及び使用されるハイブリダイ
ゼーション条件に依存する。２種のひしように近い関係
の配列の間の区別を可能にするであろうＤＮＡプローブ
の条件の選択のための十分に確立した指針が存在する（
Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｃ１ｆｌｅ、 （１９８２）Ｃｏ
ｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎ） 。ＤＮＡブローフ゛の目的は、標的のＤＮＡ配
列が他の生物の配列との最大の差異を有する場合、及び
研究下の領域のＤＮＡ配列のわかりやすいデータバンク
が利用できる場合、最適化され得る。
生物のゲノムのセグメントのＤＮＡ配列は、組換えＤＮ
Ａ方法を使用する人々により広く使用される種々の技法
を用いてＤＮＡセグメントを単離することによって得ら
れる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、、 ｕｅ。
Ａ方法を使用する人々により広く使用される種々の技法
を用いてＤＮＡセグメントを単離することによって得ら
れる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、、 ｕｅ。
Ｍを参照のこと］。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓ
ａｉｋｉ ｔｔｅ、 （１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３０１３５０〜１３５４）のような方法を用いての対象
の領域の増幅の方法が、最近記載されている。
ａｉｋｉ ｔｔｅ、 （１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３０１３５０〜１３５４）のような方法を用いての対象
の領域の増幅の方法が、最近記載されている。
そのＰＣＲ技法は、増幅されるべきＤＮＡセグメントを
端に有する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを必要
とする。ＤＮＡの熱変性、低温でのそのれらの相補的Ｄ
ＮＡ配列へのプライマーのアニーリング、続く４種のデ
オキシリボヌクレオチドの存在下でのＤＮＡポリマラー
ゼによるアニールされたプライマー（熱安定性である）
の拡張の反復循環は、さらに操作されるべき特異的ＤＮ
Ａ配列を十分な量産せしめる。
端に有する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを必要
とする。ＤＮＡの熱変性、低温でのそのれらの相補的Ｄ
ＮＡ配列へのプライマーのアニーリング、続く４種のデ
オキシリボヌクレオチドの存在下でのＤＮＡポリマラー
ゼによるアニールされたプライマー（熱安定性である）
の拡張の反復循環は、さらに操作されるべき特異的ＤＮ
Ａ配列を十分な量産せしめる。
ＰＣＲ方法の１つの使用において、Ｋ、、 呈ｇ。
（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ（１９８９） ５Ｌ １９〜２４）は、試験される種
々の生物に保存される傾向がある１６ＳｒＲＮＡ遺伝子
の領域に由来するプライマーを用いてＥ、２＋７を増幅
した。類似するアプローチカ＜Ｍｅｄｌｉｎ、 Ｌ、、
ｆｔｅ、 （Ｇｅｎｅ（１９８８）７１．１９１〜
４９９）により使用されており、ここで彼らは、系統発
生学的研究のために真核生物のｒＲＮＡコード領域を増
幅した。
ｓ（１９８９） ５Ｌ １９〜２４）は、試験される種
々の生物に保存される傾向がある１６ＳｒＲＮＡ遺伝子
の領域に由来するプライマーを用いてＥ、２＋７を増幅
した。類似するアプローチカ＜Ｍｅｄｌｉｎ、 Ｌ、、
ｆｔｅ、 （Ｇｅｎｅ（１９８８）７１．１９１〜
４９９）により使用されており、ここで彼らは、系統発
生学的研究のために真核生物のｒＲＮＡコード領域を増
幅した。
プローブのための標的配列の選択は現在、次のものを包
含する： （ａ）特異的プローブの供給を可能にするで
あろう十分な種間の相違又は変動の領域の同定及び（ｂ
）好ましくは高い数のコピーで生物に存在する標的。ｒ
ＲＮＡ遺伝子生成物（１６Ｓ及び２３Ｓ）は、これらの
両方の基準を満たし、そしてそれ自体、多くの研究のた
めの標的であり、そして事実、これらの領域に向けられ
るＤＮＡプローブキットがいくつかの生物のために商業
的に利用できる。異なった属からのｒＲＮＡ遺伝子間の
データの比較が行なわれ、そしてこれらは隣接するより
保存された領域を端に有する遺伝子内の可変領域のパタ
ーンを強調した。
含する： （ａ）特異的プローブの供給を可能にするで
あろう十分な種間の相違又は変動の領域の同定及び（ｂ
）好ましくは高い数のコピーで生物に存在する標的。ｒ
ＲＮＡ遺伝子生成物（１６Ｓ及び２３Ｓ）は、これらの
両方の基準を満たし、そしてそれ自体、多くの研究のた
めの標的であり、そして事実、これらの領域に向けられ
るＤＮＡプローブキットがいくつかの生物のために商業
的に利用できる。異なった属からのｒＲＮＡ遺伝子間の
データの比較が行なわれ、そしてこれらは隣接するより
保存された領域を端に有する遺伝子内の可変領域のパタ
ーンを強調した。
関連する種が比較される場合、その“可変”領域は時折
りひじょうに類似する〔例２）を参照のこと〕 （同一
ではない）ことが見出された。これは、正しいプローブ
配列及び適切なハイブリダイゼーション条件の選択又は
高い変動性が存在する微生物のゲノムの領域の同定を可
能にする生物のカタログからの配列データを得る方法の
必要性を強調する。
りひじょうに類似する〔例２）を参照のこと〕 （同一
ではない）ことが見出された。これは、正しいプローブ
配列及び適切なハイブリダイゼーション条件の選択又は
高い変動性が存在する微生物のゲノムの領域の同定を可
能にする生物のカタログからの配列データを得る方法の
必要性を強調する。
すばやく且つ有用なり様でプローブ及びハイブリダイゼ
ーション条件の選択のためのＤＮＡデータベースを提供
するために使用され得る、ＤＮＡ配列を得るための方法
を提供することが本発明の目的である。
ーション条件の選択のためのＤＮＡデータベースを提供
するために使用され得る、ＤＮＡ配列を得るための方法
を提供することが本発明の目的である。
生物間の高度の多様性を含む新しい標的領域を同定し、
そして臨床医、獣医、食品技術者及び環境問題研究者に
対象の多くの種類の生物に対する特異的ＤＮＡプローブ
を生成することがさらに本発明の目的である。
そして臨床医、獣医、食品技術者及び環境問題研究者に
対象の多くの種類の生物に対する特異的ＤＮＡプローブ
を生成することがさらに本発明の目的である。
従って、本発明は、同定されるべき生物に対して特異的
であり、そして非実験的方法で属と種との間を区別でき
るＤＮＡプローブを生成するための方法を提供し、そし
て該方法は、系統発生的に関連する多くの生物のゲノム
の可変領域、又は同定され、そしてそのゲノム中に前記
可変領域を有する前記生物を含む一定のサンプルに存在
すると思われる多くの生物のゲノムの可変領域を、一対
のオリゴヌクレオチ”ドプライマー０亥プライマーの少
なくとも１つは、既知であり又は前記生物に保持されて
いると思われるＤＮＡ配列に対応する）を用いて増幅し
、この増幅された領域の配列を決定し、前記他の増幅さ
れた領域との比較により、同定されるべき前記生物に対
して特異的なプローブを生成するために前記配列又はそ
の一部を選択し、そして選択されたプローブの正確なヌ
クレオチド配列に基づいて特異的シグナルを得るために
必要とされるハイブリダイゼーション条件を定義するこ
とを含んで成る。
であり、そして非実験的方法で属と種との間を区別でき
るＤＮＡプローブを生成するための方法を提供し、そし
て該方法は、系統発生的に関連する多くの生物のゲノム
の可変領域、又は同定され、そしてそのゲノム中に前記
可変領域を有する前記生物を含む一定のサンプルに存在
すると思われる多くの生物のゲノムの可変領域を、一対
のオリゴヌクレオチ”ドプライマー０亥プライマーの少
なくとも１つは、既知であり又は前記生物に保持されて
いると思われるＤＮＡ配列に対応する）を用いて増幅し
、この増幅された領域の配列を決定し、前記他の増幅さ
れた領域との比較により、同定されるべき前記生物に対
して特異的なプローブを生成するために前記配列又はそ
の一部を選択し、そして選択されたプローブの正確なヌ
クレオチド配列に基づいて特異的シグナルを得るために
必要とされるハイブリダイゼーション条件を定義するこ
とを含んで成る。
本発明の方法は、ひじょうに近い関連する生物間を区別
できるＤＮＡプローブの生成を可能にする。従って、本
発明の方法は、たった２種の塩基が与えられた遺伝子座
で異なる生物間をこの後記載されるようにして区別する
ことができる。
できるＤＮＡプローブの生成を可能にする。従って、本
発明の方法は、たった２種の塩基が与えられた遺伝子座
で異なる生物間をこの後記載されるようにして区別する
ことができる。
本発明の方法は、与えられた生物のゲノムの可変領域に
対するＤＮＡプローブの生成において普遍的な適用を有
する。オリゴヌクレオチドプライマーは、前記可変領域
又はその一部に隣接する保存された領域又はその一部の
ＤＮＡ配列に対応する。
対するＤＮＡプローブの生成において普遍的な適用を有
する。オリゴヌクレオチドプライマーは、前記可変領域
又はその一部に隣接する保存された領域又はその一部の
ＤＮＡ配列に対応する。
本発明の方法は、サンプルに存在すると思われる多くの
生物についての領域のためのＤＮＡ配列データバンクを
すばやく確立し、そしてプローブの配列及びそれが他の
生物のものと異なる程度により決定されるハイブリダイ
ゼーション条件下で対象の生物を同定するであろうＤＮ
Ａプローブフラグメントを得ることによって、ゲノムの
未知領域の標的を定めるために使用され得る。本発明の
方法は、ＤＮＡプローブとして有用な配列を同定するた
めに存在する方法以上の有意な改良点を表わす。
生物についての領域のためのＤＮＡ配列データバンクを
すばやく確立し、そしてプローブの配列及びそれが他の
生物のものと異なる程度により決定されるハイブリダイ
ゼーション条件下で対象の生物を同定するであろうＤＮ
Ａプローブフラグメントを得ることによって、ゲノムの
未知領域の標的を定めるために使用され得る。本発明の
方法は、ＤＮＡプローブとして有用な配列を同定するた
めに存在する方法以上の有意な改良点を表わす。
ＤＮＡブロービングのための遺伝子座としての１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子は、いくらかの場合において不適切性であ
るので、ＤＮＡプローブのための情報を与える標的を供
給するそれらの能力のための他のゲノム領域を分析する
ために本発明の方法の普遍性を利用して来た。初めに、
最っとも少なく保存される傾向がある領域が調べられた
。この考慮は、遺伝子間スペーサー、すなわち機能的な
遺伝子間スペーサーであるゲノムのこれらの領域に、そ
れらの領域を保存するために最小の進化的な圧力が存在
すべきであるように注意を向ける。
ＲＮＡ遺伝子は、いくらかの場合において不適切性であ
るので、ＤＮＡプローブのための情報を与える標的を供
給するそれらの能力のための他のゲノム領域を分析する
ために本発明の方法の普遍性を利用して来た。初めに、
最っとも少なく保存される傾向がある領域が調べられた
。この考慮は、遺伝子間スペーサー、すなわち機能的な
遺伝子間スペーサーであるゲノムのこれらの領域に、そ
れらの領域を保存するために最小の進化的な圧力が存在
すべきであるように注意を向ける。
Ｅ、 ２ｉ（Ｂｒｏｓｉｕｓ ｆｅｅ、、 Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、 １４８１０７〜１２７（１９８１）
） 、ストレプトマイセス リビダンス（Ｓｔｒｅ ｔ
ｏｍ ｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ及びマイコバクテリウ
ムボビスＢ ＣＧ （Ｓｕｚｕｋｉｑ＆、 Ｊ、Ｂａｃ
ｔ、 １７０２８８６〜２８８９ （１９８８） ）及
びバシラスサズチリス（Ｇｒｅｅｎｆｌｅ、 Ｇｅｎｅ
３７．２６１〜２６６（１９８５） 〕についての１
６３及び２ａＳ ｒＲＮＡ間の遺伝手間領域に対する公
開されたデータが存在する。これらの配列の研究は、こ
れらの無関係な態量に高い変動性が存在することを示し
た。
．Ｂｉｏｌ、 １４８１０７〜１２７（１９８１）
） 、ストレプトマイセス リビダンス（Ｓｔｒｅ ｔ
ｏｍ ｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ及びマイコバクテリウ
ムボビスＢ ＣＧ （Ｓｕｚｕｋｉｑ＆、 Ｊ、Ｂａｃ
ｔ、 １７０２８８６〜２８８９ （１９８８） ）及
びバシラスサズチリス（Ｇｒｅｅｎｆｌｅ、 Ｇｅｎｅ
３７．２６１〜２６６（１９８５） 〕についての１
６３及び２ａＳ ｒＲＮＡ間の遺伝手間領域に対する公
開されたデータが存在する。これらの配列の研究は、こ
れらの無関係な態量に高い変動性が存在することを示し
た。
本発明の１つの観点において、可変領域は遺伝手間可変
領域であり、そしてそのプライマーは、前記遺伝手間領
域を端に有する保存された領域又はその一部に対応する
。従って、例として、プライマーの１つは１６５ ｒＲ
ＮＡｉＩ！伝子の保存された領域に対応し、そして他の
プライマーは２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の保存された領域
に対応することができる。
領域であり、そしてそのプライマーは、前記遺伝手間領
域を端に有する保存された領域又はその一部に対応する
。従って、例として、プライマーの１つは１６５ ｒＲ
ＮＡｉＩ！伝子の保存された領域に対応し、そして他の
プライマーは２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の保存された領域
に対応することができる。
他方、プライマーの１つは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の保
存された３′末端に対応し、そして他のプライマーは２
３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の保存された５′末端に対応する
ことができる。
存された３′末端に対応し、そして他のプライマーは２
３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の保存された５′末端に対応する
ことができる。
プライマーは、１６３及び２３Ｓ遺伝子のための利用で
きる配列データに由来することができる。そのようなプ
ライマーが本発明に従って、ＰＣＲ技法に用いて増幅さ
れる場合、いくらかの情況において、その増幅された（
遺伝子間）領域は、この後記載されるように大きさが異
なり、たとえば種間で異なる。
きる配列データに由来することができる。そのようなプ
ライマーが本発明に従って、ＰＣＲ技法に用いて増幅さ
れる場合、いくらかの情況において、その増幅された（
遺伝子間）領域は、この後記載されるように大きさが異
なり、たとえば種間で異なる。
そのような増幅された領域をＤＮＡ配列決定することに
よって、一連の微生物に対する追加の詳細な情報（ひじ
ょうに関連する生物間を区別することができるＤＮＡプ
ローブの調製を可能にする）が得られた。
よって、一連の微生物に対する追加の詳細な情報（ひじ
ょうに関連する生物間を区別することができるＤＮＡプ
ローブの調製を可能にする）が得られた。
１６Ｓ及び２３Ｓ遺伝子の間の遺伝手間領域は、例１に
使用される標的であるけれども、機能的な遺伝子の既知
配列により結合される他の遺伝手間領域もまた、本発明
のＤＮＡプローブのための標的として使用され得る。
使用される標的であるけれども、機能的な遺伝子の既知
配列により結合される他の遺伝手間領域もまた、本発明
のＤＮＡプローブのための標的として使用され得る。
本発明の方法においては、他の生物、たとえば旦−ユユ
からの既知配列の保存された領域が、個々の前記プライ
マーを生成するために使用され得る。最良の適合した配
列は、個々のプライマーを生成するために多くの生物か
らの既知配列に由来することができる。
からの既知配列の保存された領域が、個々の前記プライ
マーを生成するために使用され得る。最良の適合した配
列は、個々のプライマーを生成するために多くの生物か
らの既知配列に由来することができる。
増幅は、ＰＣＲ技法により好ましくは実施され得る。使
用されるポリマラーゼは好ましくは、熱安定性ポリマラ
ーゼ、たとえばテルマスアクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
□） （Ｔａｑ）の酵素である。
用されるポリマラーゼは好ましくは、熱安定性ポリマラ
ーゼ、たとえばテルマスアクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
□） （Ｔａｑ）の酵素である。
本発明のＤＮＡプローブのための標的配列として同定さ
れた生物のゲノムの領域は、好ましくはＰＣＲ増幅法以
外の方法を用いて単離され得る。
れた生物のゲノムの領域は、好ましくはＰＣＲ増幅法以
外の方法を用いて単離され得る。
増幅後、及び配列決定の前、その増幅されたヌクレオチ
ド配列は、適切なベクターに連結され、次に前記ベクタ
ーにより適切な宿主生物が形質転換される。それによっ
て、増幅された配列が、より容易に利用できるように供
給される。
ド配列は、適切なベクターに連結され、次に前記ベクタ
ーにより適切な宿主生物が形質転換される。それによっ
て、増幅された配列が、より容易に利用できるように供
給される。
他方、増幅の後、増幅された配列又はその一部は、ヌク
レオチドプローブとして使用するために化学的に合成さ
れ得る。いづれかの情況において、可変領域のＤＮＡ配
列は、ジデオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒ。
レオチドプローブとして使用するために化学的に合成さ
れ得る。いづれかの情況において、可変領域のＤＮＡ配
列は、ジデオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒ。
Ｆ、 ｑ （！：’ 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、 （１９７７） ７４．５４６３〜５４６
７ ）のような方法を用いて確立される。その得られる
配列は、生物のためのプローブの選択を導びくために使
用され、そして最とも適切な配列が選択される。
ｄ、Ｓｃｉ、 （１９７７） ７４．５４６３〜５４６
７ ）のような方法を用いて確立される。その得られる
配列は、生物のためのプローブの選択を導びくために使
用され、そして最とも適切な配列が選択される。
増幅のために使用されるＤＮＡはオートクレーブされた
サンプルからのものである。−これは、サンプルの容易
な保存及び実験室の研究者のための高い安全性を可能に
するように、特に有用である。
サンプルからのものである。−これは、サンプルの容易
な保存及び実験室の研究者のための高い安全性を可能に
するように、特に有用である。
標的生物は、適切には微生物である。たとえば、それら
の生物は、アエロモナス、バ之ｉ玉１，７゜ス又はスト
レプトコーカスの種から選択され得る。
の生物は、アエロモナス、バ之ｉ玉１，７゜ス又はスト
レプトコーカスの種から選択され得る。
これらの種間の特定の微生物種は、アエロモナスクロス
トリジウム ベルフリンゲンス （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｅｒｆｒｉｎ ｅｎＳ） クロストリジウム チロブチリカ （懇μ佳仝遠匹■肚Ｕ…竪）を包含する。
トリジウム ベルフリンゲンス （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｅｒｆｒｉｎ ｅｎＳ） クロストリジウム チロブチリカ （懇μ佳仝遠匹■肚Ｕ…竪）を包含する。
本発明はまた、前記方法により得られる特異的プローブ
もまた供給する。
もまた供給する。
本発明に従って標的を定められた可変領域は、１６Ｓ
ｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２又はＶ ６ ｊＪ（
域である。■２及び■６領域は、種間の最っとも相同差
異が時折り観察される２種の十分に特徴化された可変領
域である。本発明の方法に従ってｖ２及び■６領域を用
いて、２種の異なったプローブが、対象の生物のために
生成され得る。
ｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２又はＶ ６ ｊＪ（
域である。■２及び■６領域は、種間の最っとも相同差
異が時折り観察される２種の十分に特徴化された可変領
域である。本発明の方法に従ってｖ２及び■６領域を用
いて、２種の異なったプローブが、対象の生物のために
生成され得る。
本発明は、１６Ｓ ｒＲＮＡ及び２３Ｓ ｒＲＮＡをコ
ードする遺伝子に介在する遺伝手間可変領域から得られ
、そして下記ヌクレオチド配列又はそれへの相補的配列
に由来する種々のプローブを供給する：クロストリジウ
ム ジフィシルー ＡＧＡＧＡＡ ＣＣＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣＣＴ
ＣＣＴＴＴＣＴＡＡ ＧＧＡＧＡＡ ＴＡＧ Ａ ＡＡ
ＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＡＡＧＧＣＴＧＡ
ＡＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＡＣＣＡ
ＴＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＴＣＴＡＡＴ
ＡＡＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡ
ＣＣＡＡＡＴＣＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＴＧＣＣＴＡ
ＧＣＴＡＣＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＧＣＡＣＡＧ
ＴＧＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＧＣＴＡＡＡＧＧＴＡＴＡ
’ＴＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＴＣＡＡＴ
ＴＴＡＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＧＣＡＴ クロストリジウムパステウリアナムー Ａ Ｇ Ａ ＧＡ Ａ ＣＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡ
ＴＣＡ ＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡ Ａ ＧＧＡＧＴＡ
Ａ ＴＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＴＡＡＣＴＧＴＴＧＴＡＴ
ＡＣＡＴＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴ
ＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＧＡ Ｇ ＡＧＡ ＴＣＡＧＴＴ
ＣＴＣＴＴＡＡＧ ＡＴＧＴＡ ＣＴＴＴＧＡ Ａ Ａ
ＡＴＴＧＣＡＴＡＧＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＴ
ＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴ八＾ＴＡＴＧＡ
ＴＴＴＴＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡ
ＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＣへＡＡ ＡＣＴＣＴＡ Ａ Ａ
ＡＣＧＧＧＣＴＡ ＡＣＧＣＣＴＡ Ａ Ａ ＡＧ
ＡＧＴ Ａ Ａ ＣＡ ＡＧＧＴＣＡ ＡＧＣＴＡＣＡ
ＡＡＧＧＧＣＧＣＡＴ ｌ！１」ｆし乙矢互ご五二」じＣＬ乙五ＡＧＧＡＧＡＡ
ＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡ
ＡＧＧＡＡＴＡＣＡＴＣＴＴＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＡＧ
ＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴＡＴＣ
ＴＣＴＧＴＴＴ＾へＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＣＴＡＴＣＴ
ＣＴＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＧＣ
ＡＣＡＴＡＡ ＴＴＴ ＡＡＴＴＴＡＴＡＧＡ Ａ Ａ
ＣＡ ＡＣＡ ＡＧＣＣＡ Ａ ＡＴＴＧＧＣＡ Ａ
Ａ ＡＣＣＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡ
ＡＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＡＣＴＡＡＴＡＴＡＧＧＴＣ
ＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＧＣＡＴマイコバクテリ
ウムボビウムー ＡＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＧ ＡＴＣＡＣＣＴＣ
ＣＴＡ ＴＴＣＴＡ ＡＧ ＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡ＾Ａ
ＣＧＡＣＣＣＣＧ Ａ ＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧ
ＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＣＧＴＣＴＡＧ
ＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＡＡＣＡＧＡ
ＡＡＴＧＡＴＴＧＣＣＡＧＡＣ＾ＣＡＣＴＡ ＴＴＧＧ
ＧＣＣＣＴＧＡ ＧＡ ＣＡ Ａ ＣＡＣＴＣＧＧＴＣ
ＣＧＴＣＣＧＴＧＴＧＧ Ａ ＧＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣ
ＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡ
ＴＴＧＧＧ Ａ ＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＧＡＴＧＡＴ
ＣＴＡＧＧＴＧＡＧＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＧＧ
ＣＣＧＧＣＣＧＴＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＴ
ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧ
ＴＡＡＧＴＧＴＴＴＡＡＧＧＧＧＧＧＡＴマイコバクテ
リウムボビス− 八ＣＣＧＧＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＡＡＡＴＴ
ＴＡＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＡ
ＧＣＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＧＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴ
ＧＧＧＣＧＴＡＧＧＣＧＴＧＡＧＧＧＧＴＴＣＴＴＧＴ
ＣＴＧＴＡＧＴＧＧＧＣＧ ＡＧＡＣＧＧＧＧＴＧＣＡ
ＴＧＡ ＣＡ ＡＣＡＡＡＧＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣ
ＡＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＧＧＣＡＡＣＡＣ
ＴＣＧＧＡＣＴＴＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＴＣＣＣ
ＣＡ ＣＣＧＣＣＴＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧ
ＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡ Ａ ＣＴＧＧ Ａ ＴＡ Ｇ
ＴＧＧＴＴＧＣＧ Ａ ＧＣＡＴＣＡＡ ＴＧＧ ＡＴ
Ａ ＣＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＧ
ＴＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡ ＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＴＴ
ＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＧＴＣＴＡＡＡ
ＧＧＧＣＧＣＡＴマイコバクーリウムツベルキュロシス
ーＡ ＣＣＧＧ Ａ ＡＧＴＣＧＴＣＧＧＧ ＡＴＣＡ
ＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡ Ａ ＧＧＡ Ｇ ＣＡＣＣＡ
ＣＧ ＡＡＡＡＣＧＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＴ
ＣＡＧＧＣＧＴＧＡＧＧＧＧＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡ
ＧＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＧＣＡＴＧＡＣＡＡ
ＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＴＧＴＴ
ＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＡＡＣＡＣＴＣＧＧＡＣＴＴ
ＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＴＣＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴ
ＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣ
ＧＴＧＡＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＧＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧ
ＧＡＴＡＣＣＣＧＴＧＣＣＧＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣ
ＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＣＴＴＴＧＧＴ
ＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＧＴＣＴＡＡ
ＧＧＧＣＧＣＡ 上記特別に言及されたプローブは、本発明の方法に従っ
て生成され得る特異的プローブのいくつかの例である。
ードする遺伝子に介在する遺伝手間可変領域から得られ
、そして下記ヌクレオチド配列又はそれへの相補的配列
に由来する種々のプローブを供給する：クロストリジウ
ム ジフィシルー ＡＧＡＧＡＡ ＣＣＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣＣＴ
ＣＣＴＴＴＣＴＡＡ ＧＧＡＧＡＡ ＴＡＧ Ａ ＡＡ
ＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＡＡＧＧＣＴＧＡ
ＡＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＡＣＣＡ
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ＧＧＧＣＧＣＡ 上記特別に言及されたプローブは、本発明の方法に従っ
て生成され得る特異的プローブのいくつかの例である。
翻訳されていないＤＮＡプローブ（すなわち高いコピー
数）の第二必要条件を満足せしめるためには、転写され
た領域が分析のために選択された。
数）の第二必要条件を満足せしめるためには、転写され
た領域が分析のために選択された。
なぜならば、これらは、翻訳されるべきであるメツセン
ジャーＲＮＡの役割以外の機能的役割を満たすからであ
る。リポソーム遺伝子の遺伝手間領域の有用性のために
、他の遺伝手間領域が、ＤＮＡプローブのための適切な
標的として調べられた。
ジャーＲＮＡの役割以外の機能的役割を満たすからであ
る。リポソーム遺伝子の遺伝手間領域の有用性のために
、他の遺伝手間領域が、ＤＮＡプローブのための適切な
標的として調べられた。
関連する属及び種を区別できるプローブの定義を可能に
するために、本発明の完全にされた方法を用いて、ひじ
ょうに関連する生物のためのＤＮＡをすばやく定義した
（例２を参照のこと）。
するために、本発明の完全にされた方法を用いて、ひじ
ょうに関連する生物のためのＤＮＡをすばやく定義した
（例２を参照のこと）。
１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝手間領域が標的を定められる方
法の１つの例示において、２種の塩基によってのみ異な
る配列が区別されるプローブ／ハイブリダイゼーション
条件が定義される。
法の１つの例示において、２種の塩基によってのみ異な
る配列が区別されるプローブ／ハイブリダイゼーション
条件が定義される。
本発明の方法の一般的な有用性を示すために、Ｅ、コリ
からの利用できるＤＮＡ配列を用いて、広範囲のダラム
陽性、ダラム陰性、好気性及び嫌気性生物のためのプラ
イマーを供給した。
からの利用できるＤＮＡ配列を用いて、広範囲のダラム
陽性、ダラム陰性、好気性及び嫌気性生物のためのプラ
イマーを供給した。
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子の可変領域が種特
異的プローブの基本であるが、本発明のＰＣＲのための
プライマーとしての不変領域の使用は、配列又はハイブ
リダイゼーション分析が行なわれなかった種からの１６
ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のその部分のすばやい単
離を可能にする。増幅された領域の続＜ＤＮＡ配列決定
は、研究下の生物の可変部に対する情報を付与し、そし
てこれは定義された条件下での続く実験においてＤＮＡ
プローブとして使用され得る。
異的プローブの基本であるが、本発明のＰＣＲのための
プライマーとしての不変領域の使用は、配列又はハイブ
リダイゼーション分析が行なわれなかった種からの１６
ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のその部分のすばやい単
離を可能にする。増幅された領域の続＜ＤＮＡ配列決定
は、研究下の生物の可変部に対する情報を付与し、そし
てこれは定義された条件下での続く実験においてＤＮＡ
プローブとして使用され得る。
本発明は、１６ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２
可変領域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列又は
それへの相補的配列に由来する種々のプローブを供給す
る： アエロモナス ヒドロフィラー ＧＣＴＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＴＣＧＧＣＡＧＧ
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それへの相補的配列に由来する種々のプローブを供給す
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本発明はまた、１６Ｓ ｒＲＮ＾をコードする遺伝子の
Ｖ６可変領域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列
又はそれへの相補的配列に由来する種々のプローブを供
給する： アエロモナス互ヱ１ｚ±１ ＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧ
ＣＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＡ
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リアー Ａ Ｇ ＧＴＣＴＴＧ Ａ ＣＡ ＴＣＣＣＧＣＴＧＣ
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ＧＣＴＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＧ 文旦込上ユ１泣呈讐生児乙り乙竺Ｚ工 ＴＡＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣＴ
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Ｇ ＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＣＣＣＴ タレブシエラブネウモニアエー ＴＧＧＴ ＣＴＴＧ ＡＣＡ ＴＣＣＡ ＧＡＧＡ Ａ
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又はそれへの相補的配列に由来する種々のプローブを供
給する： アエロモナス互ヱ１ｚ±１ ＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧ
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ＣＴＧＴ。
上記に特別に言及されたプローブは、本発明の方法に従
って生成され得る特異的プローブのいくつかの追加の例
である。
って生成され得る特異的プローブのいくつかの追加の例
である。
この後、例２及び上記に提供されるデータは、１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子の遺伝手間領域における配列に基づかれた
。翻訳のための鋳型の役割以外のｍ能的な役割を有する
他のＲＮＡ分子もまた、高いコピー数で存在するＲＮＡ
に対する特異的プローブの生成のための標的部位として
有用である。そのような転写されているが、しかし場合
によっては、翻訳された遺伝子領域の例は、リボヌクレ
アーゼＰ成分ＲＮＡ（Ｍｌ）である。公開されたデータ
ＣＢｒｙａｎ、 Ｄ、Ｊａｍｅｓ ｆｌｅ、 （１９８
８）Ｃｅｌｌ ５２．１９〜２６）の研究は、このＲＮ
Ａ内に可変領域が存在することを示した。効果的なプラ
イマーが、これらの可変領域の増幅を可能にするであろ
う利用できるデータから調製され得ることが示された（
例３）。
ＲＮＡ遺伝子の遺伝手間領域における配列に基づかれた
。翻訳のための鋳型の役割以外のｍ能的な役割を有する
他のＲＮＡ分子もまた、高いコピー数で存在するＲＮＡ
に対する特異的プローブの生成のための標的部位として
有用である。そのような転写されているが、しかし場合
によっては、翻訳された遺伝子領域の例は、リボヌクレ
アーゼＰ成分ＲＮＡ（Ｍｌ）である。公開されたデータ
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Ａ内に可変領域が存在することを示した。効果的なプラ
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う利用できるデータから調製され得ることが示された（
例３）。
本発明の方法を用いて、増幅された領域のＤＮＡ配列の
パネルを導びくことかでき、そして本発明に従って特定
された方法を用いて、得られるＤＮＡ配列の比較に基づ
いてのＤＮＡプローブを開発することができる。
パネルを導びくことかでき、そして本発明に従って特定
された方法を用いて、得られるＤＮＡ配列の比較に基づ
いてのＤＮＡプローブを開発することができる。
本発明は、可変領域（遺伝子間又は遺伝子内である）の
分析を可能にし、そして選択されたＤＮＡに選択された
条件下で特異的にハイブリダイズするであろうＤＮＡプ
ローブの供給を可能にする。
分析を可能にし、そして選択されたＤＮＡに選択された
条件下で特異的にハイブリダイズするであろうＤＮＡプ
ローブの供給を可能にする。
非実験的な方法でのいづれか特定のプローブのための適
切なハイブリダイゼーション条件の選択は、本発明の方
法に固有である。ハイブリダイゼーション条件は、この
後、例でさらに記載されるようにひじょうに関連する種
の配列と選択される配列とを区別するために、安定した
ハイブリダイゼーションのためのそれ自体既知の方法で
決定され得るプローブの正確なヌクレオチド配列に基づ
いて選択される。いづれか与えられた情況における最適
なハイブリダイゼーションのために選択される生化学的
及び物理的なパラメーターは、ハイブリダイゼーション
に関与するＡＣＴ対：Ｇ：Ｃ対の比に基づかれ、そして
従って、ハイブリダイゼーション媒体の温度及び塩濃度
を主に変性する。
切なハイブリダイゼーション条件の選択は、本発明の方
法に固有である。ハイブリダイゼーション条件は、この
後、例でさらに記載されるようにひじょうに関連する種
の配列と選択される配列とを区別するために、安定した
ハイブリダイゼーションのためのそれ自体既知の方法で
決定され得るプローブの正確なヌクレオチド配列に基づ
いて選択される。いづれか与えられた情況における最適
なハイブリダイゼーションのために選択される生化学的
及び物理的なパラメーターは、ハイブリダイゼーション
に関与するＡＣＴ対：Ｇ：Ｃ対の比に基づかれ、そして
従って、ハイブリダイゼーション媒体の温度及び塩濃度
を主に変性する。
最適なハイブリダイゼーション条件の決定は、増幅され
た配列と利用できる又は新たに創造されたデータバンク
におけるひじょうに関連する配列との比較を包含する。
た配列と利用できる又は新たに創造されたデータバンク
におけるひじょうに関連する配列との比較を包含する。
従って、本発明の方法は、最適且つ調整されたハイブリ
ダイゼーション条件の決定による高められた感度及び生
物のゲノムのいづれかの領域に対して適切な種特異的プ
ローブの生成による特異性の両者を有する。
ダイゼーション条件の決定による高められた感度及び生
物のゲノムのいづれかの領域に対して適切な種特異的プ
ローブの生成による特異性の両者を有する。
本発明の方法は、生物の種々の種の検出のためのＤＮＡ
プローブ及び与えられた属の多くのメンバーを検出する
ことができるプローブの生成を提供する。本発明は、生
物における標的部位のより一般的な例示を提供し、そし
て従って、ＤＮＡプローブのための現在の標的及びＤＮ
Ａプローブ配列の論理的且つデータベース的選択並びに
それらが使用されるべきであるハイブリダイゼーション
の条件の改良点を示す。
プローブ及び与えられた属の多くのメンバーを検出する
ことができるプローブの生成を提供する。本発明は、生
物における標的部位のより一般的な例示を提供し、そし
て従って、ＤＮＡプローブのための現在の標的及びＤＮ
Ａプローブ配列の論理的且つデータベース的選択並びに
それらが使用されるべきであるハイブリダイゼーション
の条件の改良点を示す。
本発明の方法に従って得られるプローブは、標的配列に
相補的な配列を有するプローブと生物とを接触すること
によって、１６ＳｒＲＮＡを含む又は含むと思われる生
物の検出及び／又は決定のために使用され得る。
相補的な配列を有するプローブと生物とを接触すること
によって、１６ＳｒＲＮＡを含む又は含むと思われる生
物の検出及び／又は決定のために使用され得る。
上記プローブの適用は、多くの情況において有益なもの
であろう。たとえばマイコバクテリウムボビスのための
プローブは、家畜（又は他の種）におけるこの生物の存
在のために非主観的試験を提供するであろう。現在、ウ
シＴ、Ｂ、は、いくつかのヨーロッパの国々において及
びひじょうに多くの進行図において主な経済的重要な病
気である。
であろう。たとえばマイコバクテリウムボビスのための
プローブは、家畜（又は他の種）におけるこの生物の存
在のために非主観的試験を提供するであろう。現在、ウ
シＴ、Ｂ、は、いくつかのヨーロッパの国々において及
びひじょうに多くの進行図において主な経済的重要な病
気である。
マイコバクテリウムツベルキュロシスのためのプローブ
の解説は、ヒトにおけるこのやっかいな生物の検出を可
能にしく現在、それは臨床的に陽性の患者の５０％に標
準の微生物学的方法により検出されない）、そしてこれ
は、完全に進行したＡＩＤＳを有する人の約２０％に存
在するので、重要なものになっている。
の解説は、ヒトにおけるこのやっかいな生物の検出を可
能にしく現在、それは臨床的に陽性の患者の５０％に標
準の微生物学的方法により検出されない）、そしてこれ
は、完全に進行したＡＩＤＳを有する人の約２０％に存
在するので、重要なものになっている。
アエロモナスサルモニシダのためのプローブは、フルン
ケル症を引き起こすこの病原体の環境及び魚における検
出を可能にし、そしてこの病原体はサケの養殖産業にお
いて主な経済的損失である。ひじょうに関連する生物ア
エロモナス ｈｐ旦ヱ土至（このためのプローブもまた
記載される）は、食品に存在する場合、下痢及び胃腸炎
を引き起こす。最後に、これらのプローブの有用性の追
加の例として、種々のクロストリシア属（たとえばクロ
スト１ジウムジフイシル）は、臨床的分析又は食品産業
において有用なものである。
ケル症を引き起こすこの病原体の環境及び魚における検
出を可能にし、そしてこの病原体はサケの養殖産業にお
いて主な経済的損失である。ひじょうに関連する生物ア
エロモナス ｈｐ旦ヱ土至（このためのプローブもまた
記載される）は、食品に存在する場合、下痢及び胃腸炎
を引き起こす。最後に、これらのプローブの有用性の追
加の例として、種々のクロストリシア属（たとえばクロ
スト１ジウムジフイシル）は、臨床的分析又は食品産業
において有用なものである。
本発明は、生物の混合物における特定の生物を検出する
ための方法をさらに提供し、該方法とは、前記特定の生
物の２種の選択されたヌクレオチド領域の配列（該配列
の少なくとも１つは、前記生物のヌクレオチド可変領域
からのものである）を、前記特定された方法に示された
一連の段階により決定し、そして前記生物の特異的ヌク
レオチド領域を選択的に増幅するための一対のプライマ
ーを生成するために前記配列決定された領域を用い、そ
してそれによって前記特定の生物を検出することを含ん
で成る。生物は、適切には、特別に前記で言及されたも
のの中のいづれかの１種である。
ための方法をさらに提供し、該方法とは、前記特定の生
物の２種の選択されたヌクレオチド領域の配列（該配列
の少なくとも１つは、前記生物のヌクレオチド可変領域
からのものである）を、前記特定された方法に示された
一連の段階により決定し、そして前記生物の特異的ヌク
レオチド領域を選択的に増幅するための一対のプライマ
ーを生成するために前記配列決定された領域を用い、そ
してそれによって前記特定の生物を検出することを含ん
で成る。生物は、適切には、特別に前記で言及されたも
のの中のいづれかの１種である。
上記方法は、好ましくは、生物の遺伝子の２種の選択さ
れた可変領域の配列を決定し、そして前記遺伝子の特異
的可変領域を選択的に増幅するための一対のプライマー
を生成するために前記配列決定された領域を用い、そし
てそれによって、前記特定の生物のための種特異的プロ
ーブを生成し、又は増幅生成物を検出することを含んで
成る。
れた可変領域の配列を決定し、そして前記遺伝子の特異
的可変領域を選択的に増幅するための一対のプライマー
を生成するために前記配列決定された領域を用い、そし
てそれによって、前記特定の生物のための種特異的プロ
ーブを生成し、又は増幅生成物を検出することを含んで
成る。
従って、たとえばｒＲＮＡ遺伝子の可変部分のほとんど
の可変領域からのＤＮＡ配列を得ることができる。これ
らの可変領域の２種の領域が得られる場合、それらは、
対象の特定の生物のためのひじょうに特異的なプライマ
ーとして作用することができる。好ましくは、このよう
にして生成されるプライマーは、前記のようなプローブ
と同等のものである。
の可変領域からのＤＮＡ配列を得ることができる。これ
らの可変領域の２種の領域が得られる場合、それらは、
対象の特定の生物のためのひじょうに特異的なプライマ
ーとして作用することができる。好ましくは、このよう
にして生成されるプライマーは、前記のようなプローブ
と同等のものである。
他方、上記のような１つの種特異的プライマー及び一定
の又は保存された領域プライマーの組合せは、対象の種
を特異的に増幅するために組合して使用され得る。
の又は保存された領域プライマーの組合せは、対象の種
を特異的に増幅するために組合して使用され得る。
上記方法での対象の種の選択的増幅は、種に対して特異
的なプローブの使用によりさらに確保され得る。たとえ
ば、次の特定の生物、アエロモナボビス及びサルモネラ
チピムリウムの場合、Ｖ２／Ｖ６のためのプローブは、
第３ａ又は３ｂ表に与えられる適切な可変領域のための
配列を比較することによって容易に同定され得る。
的なプローブの使用によりさらに確保され得る。たとえ
ば、次の特定の生物、アエロモナボビス及びサルモネラ
チピムリウムの場合、Ｖ２／Ｖ６のためのプローブは、
第３ａ又は３ｂ表に与えられる適切な可変領域のための
配列を比較することによって容易に同定され得る。
好ましくは、本発明の方法は、最少の装置及び前記より
も少ない操作を含む“ワン−チューブ（ｏｎｅ−ｔｕｂ
ｅ）”方法であり得る。従って、本発明は、ＤＮＡ調製
及び増幅が単一のチューブで行なわれる、前記特定され
たいづれかの方法を提供する。
も少ない操作を含む“ワン−チューブ（ｏｎｅ−ｔｕｂ
ｅ）”方法であり得る。従って、本発明は、ＤＮＡ調製
及び増幅が単一のチューブで行なわれる、前記特定され
たいづれかの方法を提供する。
本発明の方法は、動物、植物及び微生物に適用され得る
。好ましくは、本発明で調製されたプローブは、種々の
用途のためのバイオセンサーとして使用され得る。
。好ましくは、本発明で調製されたプローブは、種々の
用途のためのバイオセンサーとして使用され得る。
本発明は、次の例によりさらに例示されるであろつ。
炎上
新鮮な培養物５０Ｉｌ！（１０５〜１０個の細菌）を、
ベンチトップ遠心分離器により１分間、１０，０ＯＯｒ
、ｐ、ｍ。
ベンチトップ遠心分離器により１分間、１０，０ＯＯｒ
、ｐ、ｍ。
で遠心分離することによってベレット化し、そして上清
液を捨てた。細菌培養物は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏ
ｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ＣｏＣｏ１１ｅ Ｇａｌｗａｙ。
液を捨てた。細菌培養物は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏ
ｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ＣｏＣｏ１１ｅ Ｇａｌｗａｙ。
Ｉｒｅｌａｎｄ、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＣｏＣｏ１
１ｅ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、 Ｇａｌｗａｙ。
１ｅ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、 Ｇａｌｗａｙ。
Ｉｒｅｌａｎｄ及びνｅｔｅｒｉｎａｒｙ ＣｏＣｏ１
１ｅ、 ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂ
ｌｉｎ、 Ｉｒｅｌａｎｄの種々の実験室から得られた
。次に、ペレットを、水２５ｕ！中に再懸濁した。サン
プルを、７５０ ＩＪＩの［１ｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に
おいて９５゛Ｃで１０分間加熱し、すばやく遠心分離し
、管のふたから凝集物を除き、そして次に、５５°Ｃで
１５分間、プロティナーゼＫ （５０ｉ／ｄの濃度で）
の存在下でインキュベートした。次に、プロティナーゼ
Ｋを９５°Ｃで１５分間、変性せしめた。凝集物を再び
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆふたからすばやい遠心分離により除
き、そしてＤＮアーゼフリーＲＮアーゼＡ （Ｓｉｇｍ
ａ）を添加し、最終濃度をＬｏｇ／ｒｎ１にし、そして
３７゛ｃで１５分間インキュベートし、ＲＮＡを変性せ
しめた。これらのインキュベーション及び反応は、Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ−Ｔｈｅｒｍｏ−サ
イクラ−を用いて行なわれた。
１ｅ、 ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂ
ｌｉｎ、 Ｉｒｅｌａｎｄの種々の実験室から得られた
。次に、ペレットを、水２５ｕ！中に再懸濁した。サン
プルを、７５０ ＩＪＩの［１ｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に
おいて９５゛Ｃで１０分間加熱し、すばやく遠心分離し
、管のふたから凝集物を除き、そして次に、５５°Ｃで
１５分間、プロティナーゼＫ （５０ｉ／ｄの濃度で）
の存在下でインキュベートした。次に、プロティナーゼ
Ｋを９５°Ｃで１５分間、変性せしめた。凝集物を再び
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆふたからすばやい遠心分離により除
き、そしてＤＮアーゼフリーＲＮアーゼＡ （Ｓｉｇｍ
ａ）を添加し、最終濃度をＬｏｇ／ｒｎ１にし、そして
３７゛ｃで１５分間インキュベートし、ＲＮＡを変性せ
しめた。これらのインキュベーション及び反応は、Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ−Ｔｈｅｒｍｏ−サ
イクラ−を用いて行なわれた。
ＲＮＡ消化の後、２ＸＰＣＲ反応緩衝液（カクテル）
（１００ｍｍのＭＣＩ、２０ｍのＴｒｉｓ、、ｐＨ８，
３，３ｍｍのＭｇＣＥ ｚ）、０．２％のゼラチン、４
００ＩｎｎのｄＮＴＰ、適切な濃度のプライマー（２０
マーのためにそれぞれ２５００９モル）及び２．５単位
のＴａｑポリマラーゼを添加し、モして５０ｕｌの最終
体積で３０回のＰＣＲ循環を行なった。典型的には、Ｐ
ＣＲ循環は、９４°Ｃで１分間のＤＮＡ加熱変性、３７
°Ｃ〜５５’Ｃで２分間のプライマーのアニーリング及
び７２°Ｃで１〜３分間の拡張反応期間から成る。サン
プルを室温に徐々に冷却し、そして反応物の１／１０（
５Ｊｌりを、４％Ｎｕ−５ｉｅｖｅ（Ｎｏ−５ｉｅｖｅ
は商標である）アガロース最少ゲル上でのゲル電気泳動
により分析し、増幅の結果を測定した（第１．３及び５
図を参照のこと）。
（１００ｍｍのＭＣＩ、２０ｍのＴｒｉｓ、、ｐＨ８，
３，３ｍｍのＭｇＣＥ ｚ）、０．２％のゼラチン、４
００ＩｎｎのｄＮＴＰ、適切な濃度のプライマー（２０
マーのためにそれぞれ２５００９モル）及び２．５単位
のＴａｑポリマラーゼを添加し、モして５０ｕｌの最終
体積で３０回のＰＣＲ循環を行なった。典型的には、Ｐ
ＣＲ循環は、９４°Ｃで１分間のＤＮＡ加熱変性、３７
°Ｃ〜５５’Ｃで２分間のプライマーのアニーリング及
び７２°Ｃで１〜３分間の拡張反応期間から成る。サン
プルを室温に徐々に冷却し、そして反応物の１／１０（
５Ｊｌりを、４％Ｎｕ−５ｉｅｖｅ（Ｎｏ−５ｉｅｖｅ
は商標である）アガロース最少ゲル上でのゲル電気泳動
により分析し、増幅の結果を測定した（第１．３及び５
図を参照のこと）。
プロテイナーゼＫ、界面活性剤、フェノール抽出及びエ
タノール沈殿の組合せを用いる他の方法がまた、ＤＮＡ
の調製のために都合良く使用され得る。
タノール沈殿の組合せを用いる他の方法がまた、ＤＮＡ
の調製のために都合良く使用され得る。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３′末端及び２３Ｓ ｒＲＮ
Ａ遺伝子の５′末端から生じる２０−マーのオリゴヌク
レオチドプライマーを、Ａｐｐｌｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ又はＢｅｃｋｍａ（これらは商標である）製の
オリゴヌクレオチド合成器上で合成した。このようにし
て合成されたプライマーは、利用できる１６３及び２３
Ｓ ｒＲＮＡ配列のＣ１ｕｓｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
（ｆ（ｉｇｇｉｎｓｆｆＪ、、 Ｇｅｎｅ＋ ７３２３
７〜２４４．１９８８）により定義されるように前記領
域における保存された配列に対応する。
Ａ遺伝子の５′末端から生じる２０−マーのオリゴヌク
レオチドプライマーを、Ａｐｐｌｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ又はＢｅｃｋｍａ（これらは商標である）製の
オリゴヌクレオチド合成器上で合成した。このようにし
て合成されたプライマーは、利用できる１６３及び２３
Ｓ ｒＲＮＡ配列のＣ１ｕｓｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
（ｆ（ｉｇｇｉｎｓｆｆＪ、、 Ｇｅｎｅ＋ ７３２３
７〜２４４．１９８８）により定義されるように前記領
域における保存された配列に対応する。
１６Ｓ ｒＲＮＡの３′プライマ一配列は、下記の通り
である： ２３Ｓ ｒＲＮＡの５′プライマーの配列は、下記の通
りであり： ５′ ３′Ｃ
Ｔ／Ｇ Ａ／Ｇ Ｃ／Ｔ ＴＧＣＣＡＡ Ｇ／ＣＧＣＡ
ＴＩＩｍＣＡＣ：にこで、“／°゛は、その位置での塩
基の分解性選択を示す。
である： ２３Ｓ ｒＲＮＡの５′プライマーの配列は、下記の通
りであり： ５′ ３′Ｃ
Ｔ／Ｇ Ａ／Ｇ Ｃ／Ｔ ＴＧＣＣＡＡ Ｇ／ＣＧＣＡ
ＴＩＩｍＣＡＣ：にこで、“／°゛は、その位置での塩
基の分解性選択を示す。
ブロック解除の後、オリゴヌクレオチドの精製を、分離
用ポリアクリルアミドゲルからの溶離により行ない、モ
してＮＡＰ １０カラム上でのクロマトグラフィー処理
により精製した。
用ポリアクリルアミドゲルからの溶離により行ない、モ
してＮＡＰ １０カラム上でのクロマトグラフィー処理
により精製した。
上記プライマーによるＰＣＲ増幅を、次の微生物につい
て上記で概略された条件を用いて行なった： ジウムブチリカム、クロストリジウムジフィシル、クロ
ストリジウムパステウリアナム、クロは、２００〜６５
０塩基対の範囲であった。５種のクロストリジウム種に
ついてのデータが、第１図に示され、ここでレーン１〜
６は、次のことを表わす：レーン１：クロストリジウム
ペルフリン゛ンスの増幅された１６Ｓ ２３Ｓ ｒＲ
ＮＡＲＮＡ遺伝垣 間領域２：クロストリジウムジフィシルの増幅された１
６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡＲＮＡ遺伝子−領域レーン３ス
トリジウムパステウリアナムの増幅された１６Ｓ ２
３Ｓ ｒＲＮＡＲＮＡ遺伝垣 間領域４：クロストリジウムブチリカムの増幅された１
６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡＲＮＡ遺伝垣間領域レーン５ス
トリジウムチロブチリカムの増幅された１６Ｓ−２３Ｓ
ｒＲＮＡＲＮＡ遺伝子−領域レーン６ ｐＢＲＨａｅ
Ｉ［サイズマーカーＰＣＲ増幅ＤＮＡを、Ｓｍａ １部
位中へのブランド末端連結によりベクターＭ１３ｍｐｌ
Ｉ中にサブクローンした。その挿入されたＤＮＡを、Ｓ
ａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結方法により配列決定した。
て上記で概略された条件を用いて行なった： ジウムブチリカム、クロストリジウムジフィシル、クロ
ストリジウムパステウリアナム、クロは、２００〜６５
０塩基対の範囲であった。５種のクロストリジウム種に
ついてのデータが、第１図に示され、ここでレーン１〜
６は、次のことを表わす：レーン１：クロストリジウム
ペルフリン゛ンスの増幅された１６Ｓ ２３Ｓ ｒＲ
ＮＡＲＮＡ遺伝垣 間領域２：クロストリジウムジフィシルの増幅された１
６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡＲＮＡ遺伝子−領域レーン３ス
トリジウムパステウリアナムの増幅された１６Ｓ ２
３Ｓ ｒＲＮＡＲＮＡ遺伝垣 間領域４：クロストリジウムブチリカムの増幅された１
６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡＲＮＡ遺伝垣間領域レーン５ス
トリジウムチロブチリカムの増幅された１６Ｓ−２３Ｓ
ｒＲＮＡＲＮＡ遺伝子−領域レーン６ ｐＢＲＨａｅ
Ｉ［サイズマーカーＰＣＲ増幅ＤＮＡを、Ｓｍａ １部
位中へのブランド末端連結によりベクターＭ１３ｍｐｌ
Ｉ中にサブクローンした。その挿入されたＤＮＡを、Ｓ
ａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結方法により配列決定した。
これらの操作は、増幅すｈｆ、−Ｄ Ｎ Ａ （ＰＣＲ
反応の約２０ｍ）５０ｎｇを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＨの
Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，１ｍＭのＥＤＴＡ）１０００倍体
積に対して２時間、滴下透析することによって行なわれ
た。ＤＮＡをＨｅｔｏ−Ｖａｃ （Ｈｅｔｏ−Ｖａｃは
商標である）乾燥機中で乾燥せしめ、そして次にＳｍａ
Ｉ消化されたＭ１３ ＭｐＨ（１０ｎｇ）及びＴ４リ
ガーゼ１単位を含む連結緩衝液１０ＪＩＩ中に再懸濁し
た。連結は、１０″Ｃで少なくとも５時間行なわれた。
反応の約２０ｍ）５０ｎｇを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＨの
Ｔｒｉｓ、 ｐＨ８，１ｍＭのＥＤＴＡ）１０００倍体
積に対して２時間、滴下透析することによって行なわれ
た。ＤＮＡをＨｅｔｏ−Ｖａｃ （Ｈｅｔｏ−Ｖａｃは
商標である）乾燥機中で乾燥せしめ、そして次にＳｍａ
Ｉ消化されたＭ１３ ＭｐＨ（１０ｎｇ）及びＴ４リ
ガーゼ１単位を含む連結緩衝液１０ＪＩＩ中に再懸濁し
た。連結は、１０″Ｃで少なくとも５時間行なわれた。
そのＤＮＡ混合物を用いて、Ｅ、コリＪＭ２０１を形質
転換せしめた。−本ｆ！ｉ Ｄ Ｎ Ａを、Ｔ７ポリマ
ラーゼを用いてジデオキシ配列決定のための組換え体か
ら調製した。得られたＤＮＡ配列は、上記に示される。
転換せしめた。−本ｆ！ｉ Ｄ Ｎ Ａを、Ｔ７ポリマ
ラーゼを用いてジデオキシ配列決定のための組換え体か
ら調製した。得られたＤＮＡ配列は、上記に示される。
マイコバクテリウム種の配列のクラスター整合が、第１
表に示される。それらの間の可変領域は、低密度の保存
された塩基（Ｍ印）により示されている。プローブ生成
のための多くの可能性が、この分析から生じる。下線部
の２０ｂの１つのフラグメント（９ｂの差異を包含する
）を選択しく第１アビウムは、ウシＴ、Ｂ、のための現
在の試験において家畜の非病原性感染の指示体として使
用される）と区別され得ることを示した。この配列がｒ
３２ＰＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）により放射性ラベルされ、そしてＮｙ
ｔｒａｎ （Ｎｙｔｒａｎは商標である）膜（Ｓｃｈｌ
ｅｉｓｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｎｅｌｌ）にスロットプロ
ットされたマイコバクテリウムボビス及びマイコバクテ
リウムアビウムの増幅された遺伝手間領域にプローブと
して使用される場合、マイコバクテリウムボビスが検出
され、ところがマイコバクテリウムアビウムは検出され
なかった（第２図）。第２図において、＋１ Ａ １１
は、マイコバクテリウムボビスに対応し、モしてＢ″“
は、マイコバクテリウムアビウムに対応する。ハイブリ
ダイゼーションのための条件は、６ Ｘ５ＳＰＥ 、
Ｏ，ｉ％Ｓ、Ｄ、Ｓ、における５５°Ｃでの２時間であ
り、そして洗浄は５ Ｘ５ＳＣ、０，１％Ｓ、Ｄ、Ｓ。
表に示される。それらの間の可変領域は、低密度の保存
された塩基（Ｍ印）により示されている。プローブ生成
のための多くの可能性が、この分析から生じる。下線部
の２０ｂの１つのフラグメント（９ｂの差異を包含する
）を選択しく第１アビウムは、ウシＴ、Ｂ、のための現
在の試験において家畜の非病原性感染の指示体として使
用される）と区別され得ることを示した。この配列がｒ
３２ＰＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）により放射性ラベルされ、そしてＮｙ
ｔｒａｎ （Ｎｙｔｒａｎは商標である）膜（Ｓｃｈｌ
ｅｉｓｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｎｅｌｌ）にスロットプロ
ットされたマイコバクテリウムボビス及びマイコバクテ
リウムアビウムの増幅された遺伝手間領域にプローブと
して使用される場合、マイコバクテリウムボビスが検出
され、ところがマイコバクテリウムアビウムは検出され
なかった（第２図）。第２図において、＋１ Ａ １１
は、マイコバクテリウムボビスに対応し、モしてＢ″“
は、マイコバクテリウムアビウムに対応する。ハイブリ
ダイゼーションのための条件は、６ Ｘ５ＳＰＥ 、
Ｏ，ｉ％Ｓ、Ｄ、Ｓ、における５５°Ｃでの２時間であ
り、そして洗浄は５ Ｘ５ＳＣ、０，１％Ｓ、Ｄ、Ｓ。
中において室温で２度および５ Ｘ５ＳＣ、０，１％Ｓ
、Ｄ、Ｓ、中におおいて５５°Ｃで２分間、１度、行な
われた。類似する方法で得られたクロストリジウム種の
ためのＤＮＡ配列は、第２表に示される。再び、ＤＮＡ
プローブのための可能性は、クラスター分析から明らか
である。クロストリジウムの３種の種について第２表に
示される配列の分析は、同一の一連の配列（星印により
示される）が生じる領域を示し、これは、必要なら、ク
ロストリジウムのための属特異的プローブの基礎として
作用することができる。
、Ｄ、Ｓ、中におおいて５５°Ｃで２分間、１度、行な
われた。類似する方法で得られたクロストリジウム種の
ためのＤＮＡ配列は、第２表に示される。再び、ＤＮＡ
プローブのための可能性は、クラスター分析から明らか
である。クロストリジウムの３種の種について第２表に
示される配列の分析は、同一の一連の配列（星印により
示される）が生じる領域を示し、これは、必要なら、ク
ロストリジウムのための属特異的プローブの基礎として
作用することができる。
盟主
増幅を、例１に示される方法に従って行なった。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ２ （Ｒ１／Ｒ２）及び■
６（Ｕ １ ／Ｕ ２ ）可変領域を個々の端に有する
２０マーのオリゴヌクレオチドプライマーを、利用でき
るデータから選択した（Ｄａａ＋ｓ星＆、 Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅ
ｎｔ １６ｒ８７−ｒ１７３（１９８８））。
６（Ｕ １ ／Ｕ ２ ）可変領域を個々の端に有する
２０マーのオリゴヌクレオチドプライマーを、利用でき
るデータから選択した（Ｄａａ＋ｓ星＆、 Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅ
ｎｔ １６ｒ８７−ｒ１７３（１９８８））。
このようにして台底されたプライマーは、次の配列を有
した： それぞれ■２及びＶ６のためのプライマーとしてＲ１／
Ｒ２及びＵｌ／Ｕ２によるＰＣＲ増幅を、次の微生物の
ために上記で概略された条件を用いて行なった： びスタフィロコー力スアウレウス。これらの種のＲ１／
Ｒ２増幅は、分析されるすべての場合において約１２０
個の塩基対フラグメントを生ぜしめた。Ｕｌ／Ｕ２プラ
イマー増幅は、約１００個の塩基対フラグメントを生ぜ
しめた。第３図は、Ｒ１／Ｒ２プライマー■２増幅及び
Ｕｌ／Ｕ２プライマー■６増幅のために得られた結果を
示し、ここでレーン１−１６は次のことを表わす：レー
ン１ ： ｐＢＲＨａｅｎ［サイズマーカーレーン２
：ｌ≦（旦」辷Ｌ２１サルモニシダの■２増幅 レーン３：アエロモナスｔ／Ｌｚ％＝之’の■６増幅 レーン４：クロストリジウムジフィシルの■２レーン５ レーン６ レーン７ レーン８ 増幅 ：クロストリジウム ジフィシルのＶ６増幅 ：クレブシエラ ブネウモニアエのｖ２増幅 ：クレブシエラプネウモニアエのＶ６ 増幅 ：マイコバクーｉウムボビスのＶ２増 幅 Ｖ２増幅 レーン１１ ： ７’７！、 −）’％ ７．フルオ
レスセンスの■６増幅 レーン１４：ヌ フィロコーカスアウレウスの■２増
幅 レーン１５：スタフィロコー力スアウレウスの■６増幅 レーン１６： ρＢＲＨａｅｍサイズマーカー増幅さ
れたバンドは、不変領域のプライマーがダラム陽性、ダ
ラム陰性、好気性及び嫌気性生物のために効果的である
ことを示す。
した： それぞれ■２及びＶ６のためのプライマーとしてＲ１／
Ｒ２及びＵｌ／Ｕ２によるＰＣＲ増幅を、次の微生物の
ために上記で概略された条件を用いて行なった： びスタフィロコー力スアウレウス。これらの種のＲ１／
Ｒ２増幅は、分析されるすべての場合において約１２０
個の塩基対フラグメントを生ぜしめた。Ｕｌ／Ｕ２プラ
イマー増幅は、約１００個の塩基対フラグメントを生ぜ
しめた。第３図は、Ｒ１／Ｒ２プライマー■２増幅及び
Ｕｌ／Ｕ２プライマー■６増幅のために得られた結果を
示し、ここでレーン１−１６は次のことを表わす：レー
ン１ ： ｐＢＲＨａｅｎ［サイズマーカーレーン２
：ｌ≦（旦」辷Ｌ２１サルモニシダの■２増幅 レーン３：アエロモナスｔ／Ｌｚ％＝之’の■６増幅 レーン４：クロストリジウムジフィシルの■２レーン５ レーン６ レーン７ レーン８ 増幅 ：クロストリジウム ジフィシルのＶ６増幅 ：クレブシエラ ブネウモニアエのｖ２増幅 ：クレブシエラプネウモニアエのＶ６ 増幅 ：マイコバクーｉウムボビスのＶ２増 幅 Ｖ２増幅 レーン１１ ： ７’７！、 −）’％ ７．フルオ
レスセンスの■６増幅 レーン１４：ヌ フィロコーカスアウレウスの■２増
幅 レーン１５：スタフィロコー力スアウレウスの■６増幅 レーン１６： ρＢＲＨａｅｍサイズマーカー増幅さ
れたバンドは、不変領域のプライマーがダラム陽性、ダ
ラム陰性、好気性及び嫌気性生物のために効果的である
ことを示す。
ＤＮＡ配列を、例１で記載されるようにして得た。■２
及びＶ ６９Ｍ域の両者のために得られたＤＮＡ配列の
いくつかの例が、第３ａ及び３ｂ図に示される。ｐ、Ｉ
ＴＪ以外の生物についての配列を、本発明に記載される
方法を用いて得た。普遍的なプライマーに対応する領域
をボックスで囲む。
及びＶ ６９Ｍ域の両者のために得られたＤＮＡ配列の
いくつかの例が、第３ａ及び３ｂ図に示される。ｐ、Ｉ
ＴＪ以外の生物についての配列を、本発明に記載される
方法を用いて得た。普遍的なプライマーに対応する領域
をボックスで囲む。
それらの間の可変領域は、低密度の保存された塩基（星
印）により示される。この分析の基礎に基づいて選択さ
れたアエロモナスサルモニシダに対して特異的なりＮＡ
プローブを、点線により示す（第３ｂ表）。このＶ６ブ
ローブ配列は、これらの培養物がＶ６を端に有する不変
領域のためのプライマーを用いて増幅される場合、好結
果を伴って、アエロモナスサルモニシダとＥ、：ｌｌＪ
、サルモネラ チピムリウム、クロストリジウムジフィ
シル、アエロモナス ヒドロフイラ、ヱ玉を区別した（
第４図を参照のこと）。使用されるハイブリダイゼーシ
ョン条件（ハイブリダイゼーションは、６ Ｘ５ＳＰＥ
、 ０．１％ＳＯＳ中において５７°Ｃで２時間行な
われ、そしてＺＸＳＳＣ中において６０°Ｃで３０分間
の強い洗浄を伴う）は、プローブによるＡ、サルモニシ
ダとＡ、ヒドロフイラとの間の区別を可能にした（ここ
でたった２個の塩基対の相違が存在する）ことが注目さ
れるであろう。
印）により示される。この分析の基礎に基づいて選択さ
れたアエロモナスサルモニシダに対して特異的なりＮＡ
プローブを、点線により示す（第３ｂ表）。このＶ６ブ
ローブ配列は、これらの培養物がＶ６を端に有する不変
領域のためのプライマーを用いて増幅される場合、好結
果を伴って、アエロモナスサルモニシダとＥ、：ｌｌＪ
、サルモネラ チピムリウム、クロストリジウムジフィ
シル、アエロモナス ヒドロフイラ、ヱ玉を区別した（
第４図を参照のこと）。使用されるハイブリダイゼーシ
ョン条件（ハイブリダイゼーションは、６ Ｘ５ＳＰＥ
、 ０．１％ＳＯＳ中において５７°Ｃで２時間行な
われ、そしてＺＸＳＳＣ中において６０°Ｃで３０分間
の強い洗浄を伴う）は、プローブによるＡ、サルモニシ
ダとＡ、ヒドロフイラとの間の区別を可能にした（ここ
でたった２個の塩基対の相違が存在する）ことが注目さ
れるであろう。
第４図において、レーン１〜７は次のものを表わす：
レーンｌ：ヱ１ｊビ１Ｌ工！Ｊ己匹と乞ｔレーア２ ：
７４１：ｌ−Ｅ Ｘ ！＝ ）’ｔｌｌ１７．ｒ
−レーン３：アエロモナスメジア レーン４：ヱ１ｊビＬＬ五カビアエ レーン５：エスシリシア２ル −ン６：サルモネラチピムリウム レーン７１旦工上ｌ乏立憲ジフイシル。
７４１：ｌ−Ｅ Ｘ ！＝ ）’ｔｌｌ１７．ｒ
−レーン３：アエロモナスメジア レーン４：ヱ１ｊビＬＬ五カビアエ レーン５：エスシリシア２ル −ン６：サルモネラチピムリウム レーン７１旦工上ｌ乏立憲ジフイシル。
班主
例１及び２に記載される方法を用いて、リボヌクレアー
ゼＰの遺伝手内可変領域を端に有するＤＮＡプライマー
〔公開されたデータ（Ｂｒｙａｎ、 Ｄ。
ゼＰの遺伝手内可変領域を端に有するＤＮＡプライマー
〔公開されたデータ（Ｂｒｙａｎ、 Ｄ。
Ｊａｍｅｓ ｆ＆ （！’ 、 （１９８８）皿星）の
分析から保護されるようにして選択された〕を、台底し
た。そのプライマーの配列は、次の通りである： １７−マーのオリゴヌクレオチド 及び １９−マーのオリゴヌクレオチド これらを用いて、１≦（旦ｊＥｔ２２ サルモニシダ、 カンスにおけるその対応する遺伝子内領域を増幅した。
分析から保護されるようにして選択された〕を、台底し
た。そのプライマーの配列は、次の通りである： １７−マーのオリゴヌクレオチド 及び １９−マーのオリゴヌクレオチド これらを用いて、１≦（旦ｊＥｔ２２ サルモニシダ、 カンスにおけるその対応する遺伝子内領域を増幅した。
その結果（第５図に示される）は、ダラム陽性、ダラム
陰性、好気性及び嫌気性生物がこれらのプライマーを用
いて増幅され得ることを示す。
陰性、好気性及び嫌気性生物がこれらのプライマーを用
いて増幅され得ることを示す。
第５図において、レーンｂ−ｈは次のものを表わす：
レーンｄ：立立±ヱメルセスカンス
レーンｈ：１ｋｂのラダーサイズのマーカー。
矢印は、リボヌクレアーゼＰ増幅ＤＮＡを示す。
第１図は、例１で調製されたクロストリジウム種のため
の増幅された１６３−２３３遺伝子間領域のアガロース
ゲルの写真であって、図面に代わる写真であり、 第２図は、マイコバク−■ラムボビス及びマイコバクテ
リウムアビウムＤＮＡへのマイコバクテリウムボビスの
１６３−２３３遺伝子間領域のためのＤＮＡプローブの
ハイブリダイゼーションのオートラジオグラム写真であ
って、図面に代わる写真であり、 第３図は、例２で調製されたような一連の生物の増幅さ
れた１６ＳｒＲＮ／ｐＪ域のアガロースゲルの写真であ
って、図面に代わる写真であり、第４図は、一連の生物
へのヱＸ＋工ｉ土：Ａ＋）ｂ±三之ｌの１５ｓ ｒＲＮ
Ａ遺伝子内領域のためのＤＮＡプローブのハイブリダイ
ゼーションのオートラジオグラム写真であって、図面に
代わる写真であり、そして 第５図は、例３で調製されたような一連の生物からの増
幅されたりボヌクレアーゼＰ領域のアガロースゲルの写
真であって、図面に代わる写真である。
の増幅された１６３−２３３遺伝子間領域のアガロース
ゲルの写真であって、図面に代わる写真であり、 第２図は、マイコバク−■ラムボビス及びマイコバクテ
リウムアビウムＤＮＡへのマイコバクテリウムボビスの
１６３−２３３遺伝子間領域のためのＤＮＡプローブの
ハイブリダイゼーションのオートラジオグラム写真であ
って、図面に代わる写真であり、 第３図は、例２で調製されたような一連の生物の増幅さ
れた１６ＳｒＲＮ／ｐＪ域のアガロースゲルの写真であ
って、図面に代わる写真であり、第４図は、一連の生物
へのヱＸ＋工ｉ土：Ａ＋）ｂ±三之ｌの１５ｓ ｒＲＮ
Ａ遺伝子内領域のためのＤＮＡプローブのハイブリダイ
ゼーションのオートラジオグラム写真であって、図面に
代わる写真であり、そして 第５図は、例３で調製されたような一連の生物からの増
幅されたりボヌクレアーゼＰ領域のアガロースゲルの写
真であって、図面に代わる写真である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、同定されるべき生物に対して特異的であり、そして
非実験的方法で属と種との間を区別できるＤＮＡプロー
ブを生成するための方法であって、系統発生的に関連す
る多くの生物のゲノムの可変領域、又は同定され、そし
てそのゲノム中に前記可変領域を有する前記生物を含む
一定のサンプルに存在すると思われる多くの生物のゲノ
ムの可変領域を、一対のオリゴヌクレオチドプライマー
（該プライマーの少なくとも１つは、既知であり又は前
記生物に保持されていると思われるＤＮＡ配列に対応す
る）を用いて増幅し、この増幅された領域の配列を決定
し、前記他の増幅された領域との比較により、同定され
るべき前記生物に対して特異的なプローブを生成するた
めに前記配列又はその一部を選択し、そして選択された
プローブの正確なヌクレオチド配列に基づいて特異的シ
グナルを得るために必要とされるハイブリダイゼーショ
ン条件を定義することを含んで成る方法。 ２、前記可変領域が種々の遺伝間領域であり、そして前
記プライマーが保存された領域又は前記遺伝子間領域を
端に有するその一部に対応する請求項１記載の方法。 ３、前記プライマーの１つが１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の保
存された領域に対応し、そして前記他のプライマーが２
３ＳｒＲＮＡ遺伝子の保存された領域に対応する請求項
２記載の方法。 ４、前記プライマー配列が、リボヌクレアーゼＰ成分Ｒ
ＮＡに由来する請求項１記載の方法。 ５、前記可変領域が１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子
のＶ２又はＶ６領域である請求項１記載の方法。 ６、前記増幅される可変領域が、同定されるべき生物を
含むオートクレーブされたサンプルに由来する請求項１
〜５のいづれか１項記載の方法。 ７、前記微生物を、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム
（Ｃｌｏｓｔｒｉ−ｄｉｕｍ）、エンテロコーカス（Ｅ
ｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エスシリシア（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）
、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
、プスードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ）、スタフィロコーカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ）又はストレプトコーカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ）の種から選択する請求項１〜６のいづれか
１項記載の方法。 ８、請求項１〜７のいづれか１項記載の方法により得ら
れるプローブ。 ９、１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡをコードする遺
伝子に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして下
記ヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するクロストリジウムジ
フィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）
のためのＤＮＡプローブ。 １０、１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡをコードする
遺伝子に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして
下記ヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するクロストリジウムパ
ステウリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐａｓｔｅｕ
ｒｉａｎｕｍ）のためのＤＮＡプローブ。 １１、１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡをコードする
遺伝子に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして
下記ヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するクロストリジウムペ
ルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉ
ｎｇｅｎｓ）のためのＤＮＡプローブ。 １２、１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡをコードする
遺伝子に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして
下記ヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するマイコバクテリウム
アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ）の
ためのＤＮＡプローブ。 １３、１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡをコードする
遺伝子に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして
下記ヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するマイコバクテリウム
ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）のた
めのＤＮＡプローブ。 １４、１６ＳｒＲＨＡ及び２３ＳｒＲＮＡをコードする
遺伝子に介在する遺伝子間可変領域から得られ、そして
下記ヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するマイコバクテリウム
ツベルキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のためのＤＮＡプローブ。 １５、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するアエロモナスヒドロ
フィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）の
ためのＤＮＡプローブ。 １６、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２可変領
域から得られ、そして下記２種のヌクレオチド配列の１
つ： 【遺伝子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するアエロモナスサルモ
ニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）
のためのＤＮＡプローブ。 １７、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するクロストリジウムペ
ルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉ
ｎｇｅｎｓ）のためのＤＮＡプローブ。 １８、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するクレブシエラプネウ
モニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
）のためのＤＮＡプローブ。 １９、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するマイコバクテリウム
ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）のた
めのＤＮＡプローブ。 ２０、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するスタフィロコーカス
アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕ
ｓ）のためのＤＮＡプローブ。 ２１、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ２可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するサルモネラチピムリ
ウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｕｒｉｕｍ）の
ためのＤＮＡプローブ。 ２２、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ６可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するアエロモナスヒドロ
フイラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）の
ためのＤＮＡプローブ。 ２３、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ６可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するアエロモナスサルモ
ニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）
のためのＤＮＡプローブ。 ２４、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ６可変領
域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝子
配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するクロストリジウムペ
ルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉ
ｎｇｅｎｓ）のためのＤＮＡプローブ。 ２５、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ６可変
領域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝
子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するマイコバクテリウム
ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）
のためのＤＮＡプローブ。 ２６、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ６可変
領域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝
子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するスタフィロコーカス
アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ）のためのＤＮＡプローブ。 ２７、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子のＶ６可変
領域から得られ、そして下記ヌクレオチド配列：【遺伝
子配列があります。】 又はそれへの相補的配列に由来するサルモネラチピムリ
ウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
）のためのＤＮＡプローブ。 ２８、標的ヌクレオチド配列を含む又は含むと思われる
生物の検出及び／又は決定のための方法であって、前記
生物と、請求項１〜２７のいづれか１項記載の前記標的
配列に相補的なプローブとを接触せしめることを含んで
成る方法。 ２９、生物の混合物における特定の生物を検出するため
の方法であって、前記特定の生物の２種の選択されたヌ
クレオチド領域の配列（該配列の少なくとも１つは、前
記生物のヌクレオチド可変領域からのものである）を、
請求項１〜７のいづれか１項記載の一連の段階により決
定し、そして前記生物の特異的領域を選択的に増幅する
ための一対のプライマーを生成するために前記配列決定
された領域を用い、そしてそれによって前記特定の生物
を検出することを含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IE1287/89 | 1989-04-20 | ||
| IE128789A IE81145B1 (en) | 1989-04-20 | 1989-04-20 | Generation of specific probes for target nucleotide sequences |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03130099A true JPH03130099A (ja) | 1991-06-03 |
| JP3097059B2 JP3097059B2 (ja) | 2000-10-10 |
Family
ID=11024937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02101858A Expired - Lifetime JP3097059B2 (ja) | 1989-04-20 | 1990-04-19 | 標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5574145A (ja) |
| EP (1) | EP0395292B1 (ja) |
| JP (1) | JP3097059B2 (ja) |
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| AU (1) | AU630932B2 (ja) |
| DE (1) | DE69030131T2 (ja) |
| DK (1) | DK0395292T3 (ja) |
| ES (1) | ES2100161T3 (ja) |
| GR (1) | GR3023600T3 (ja) |
| IE (1) | IE81145B1 (ja) |
| ZA (1) | ZA902924B (ja) |
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