CN116286743A - 一种中温核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中温核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用，本发明通过广泛而深入的研究，通过大量的筛选，首次意外地获得了对于KmAgo酶的活性具有显著改善的突变型的蛋白，是基于kurthia massiliensis的中温核酸酶Argonaute(KmAgo，SEQ ID NO.1所示的野生型序列)的突变蛋白或其活性片段、变异形式、衍生蛋白。与野生型相比，本发明突变蛋白的酶催化活性显著提高，最大可达至7倍；该突变蛋白保持非常好的热稳定性；在核酸检测技术，以及开发基因编辑工具技术中，都有应用潜力。

Description

一种中温核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域，涉及一种中温核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
Argonaute(Ago)蛋白作为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的重要组成部分，对小分子RNA的剪切与招募发挥着非常关键的作用，是继RNA干扰(RNAi)发现之后颇受关注的一个蛋白家族。目前发现，Argonaute蛋白广泛存在于真核和原核生物中，并且在真核和原核生物中的功能各有不同，在真核生物中Ago蛋白主要参与RNAi过程，在形成RISC复合体中起到重要的作用；而在原核生物中，Ago蛋白主要起到宿主防御功能，参与细菌对外源基因入侵的防御机制以及参与宿主的复制及损伤修复。
原核生物来源的Argonaute蛋白(简称pAgos)相比eAgos功能和结构更加多样化，但其生理功能长期以来难以捉摸。早期研究主要集中于高温生物来源的pAgos，除了MpAgo偏爱利用5’末端羟基化(5’OH)的RNA向导(gDNA)切割靶单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)和靶RNA之外，其余高温来源的pAgos都偏爱利用5’末端磷酸化(5’P)的gDNA切割靶ssDNA和/或靶RNA。高温生物来源的pAgos在中温条件下都只有低水平的gDNA引导的靶ssDNA和/或靶RNA切割活性，这限制了基于高温pAgos的应用开发。最近的研究开始集中于中温生物来源的pAgos，以期找到能够在中温条件下有效切割靶DNA和/或靶RNA的pAgos。马立新团队于2020年发现了来源自kurthia massiliensis的中温核酸酶Argonaute(KmAgo)蛋白，具有有效切割靶DNA/RNA的能力，但其野生型切割能力弱，活性差。
与现在常用的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a/13a类似，也有人建议将pAgos用作下一代基因组编辑工具。但KmAgo蛋白在中温环境下核酸内切酶活性水平较低，这极大限制了其在基因编辑和核酸检测等领域的应用。
因此，针对该蛋白迫切需要开发一种可以获得高催化活性的KmAgo突变体的方法。并且对KmAgo催化活力的改造也将进一步揭示出它在结构与功能上的联系。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种中温核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用，酶活性提高，热稳定性提升。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种中温核酸内切酶突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白，所述中温核酸内切酶来源于中温原核生物kurthia massiliensis，所述的突变蛋白KmAgo具有选自以下的一个或多个位点的核心氨基酸突变：
(1)W599S；
(2)H602E；
(3)E12L；
(4)E621I；
(5)Y130D；
(6)E614G；
(7)C68L；
(8)C480L；
(9)R291P；
(10)A654I；
(11)S715V；
(12)C201D；
(13)S162D；
(14)W445I；
(15)N541A，
其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO.1所示的序列。所述KmAgo突变蛋白除一个或多个所述氨基酸突变以外，其余序列与SEQ ID NO.1所示的序列相同或基本相同。
作为优选的技术方案之一，所述的突变蛋白KmAgo具有选自以下的一个或多个位点的核心氨基酸突变：
(1)W599S；
(2)H602E；
(3)E12L；
(4)E621I；
(5)Y130D；
(6)E614G；
(7)C68L；
(8)C480L；
(9)R291P；
(10)A654I；
其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO.1所示的序列。
作为优选的技术方案之一，所述中温为10～80℃，进一步优选为32～44℃，更进一步优选为37℃。
作为优选的技术方案之一，所述KmAgo突变蛋白的酶活力Q1，与野生型的酶活力Q0的比值：Q1/Q0为≥3，较佳地≥4，更佳地≥5，最佳地≥7。
作为优选的技术方案之一，所述突变蛋白KmAgo具有选自以下位点的核心氨基酸突变：
(1)W599S；
(2)H602E；
(3)E12L；
(4)E621I；
(5)Y130D；
(6)E12L和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I；
(7)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；
(8)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和N541A和S715V和
E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；
(9)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I和C201D；
(10)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D；
(11)W599S和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I和A654I和S162D；
(12)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和N541A和S715V和E621I和
A654I和S162D和C201D和R291P；
其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO.1。
作为进一步优选的技术方案之一，所述突变蛋白KmAgo的氨基酸序列选自：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第599位的W突变为S(W599S)；
(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第602位的H突变为E(H602E)；
(3)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第12位的E突变为L(E12L)；
(4)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第621位的E突变为I(E621I)；
(5)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第130位的Y突变为D(Y130D)；
(6)(S4)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第12位的E突变为L(E12L)，并且第445位的W突变为I(W445I)，并且第614位的E突变为G(E614G)，并且第130位的Y突变为D(Y130D)，并且第715位的S突变为V(S715V)，并且第621位的
E突变为I(E621I)；
(7)(S12)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第599位的W突变为S(W599S)，并且第12位的E突变为L(E12L)，并且第445位的W突变为I(W445I)，并且第6
14位的E突变为G(E614G)，并且第130位的Y突变为D(Y130D)，并且第715
位的S突变为V(S715V)，并且第621位的E突变为I(E621I)，并且第602位的H突变为E(H602E)，并且第654位的A突变为I(A654I)，并且第162位的S突变为D(S162D)，并且第201位的C突变为D(C201D)，并且第291位的R突变为P
(R291P)；
(8)(S15)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第599位的W突变为S(W599S)，并且第12位的E突变为L(E12L)，并且第445位的W突变为I(W445I)，并且第6
14位的E突变为G(E614G)，并且第130位的Y突变为D(Y130D)，并且第715
位的S突变为V(S715V)，并且第621位的E突变为I(E621I)，并且第602位的H突变为E(H602E)，并且第654位的A突变为I(A654I)，并且第162位的S突变为D(S162D)，并且第201位的C突变为D(C201D)，并且第291位的R突变为P
(R291P)，并且第541位的N突变为A(N541A)；
(9)(S10)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第599位的W突变为S(W599S)，并且第12位的E突变为L(E12L)，并且第445位的W突变为I(W445I)，并且第6
14位的E突变为G(E614G)，并且第130位的Y突变为D(Y130D)，并且第715
位的S突变为V(S715V)，并且第621位的E突变为I(E621I)，并且第201位的C突变为D(C201D)；
(10)(S11)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第599位的W突变为S(W599S)，并且第12位的E突变为L(E12L)，并且第445位的W突变为I(W445I)，并且第6
14位的E突变为G(E614G)，并且第130位的Y突变为D(Y130D)，并且第715
位的S突变为V(S715V)，并且第621位的E突变为I(E621I)，并且第602位的H突变为E(H602E)，并且第654位的A突变为I(A654I)，并且第162位的S突变为D(S162D)，并且第201位的C突变为D(C201D)；
(11)(S8)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第599位的W突变为S(W599S)，并且第445位的W突变为I(W445I)，并且第614位的E突变为G(E614G)，并且第130位的Y突变为D(Y130D)，并且第715位的S突变为V(S715V)，并且第621位的E突变为I(E621I)，并且第654位的A突变为I(A654I)，并且第162位的S突变为D(S162D)；
(12)(S20)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且第599位的W突变为S(W599S)，并且第12位的E突变为L(E12L)，并且第445位的W突变为I(W445I)，并且第6
14位的E突变为G(E614G)，并且第130位的Y突变为D(Y130D)，并且第715位的S突变为V(S715V)，并且第621位的E突变为I(E621I)，并且第654位的A突变为I(A654I)，并且第162位的S突变为D(S162D)，并且第201位的C突变为D(C201D)，并且第291位的R突变为P(R291P)，并且第541位的N突变为A
(N541A)。
作为更进一步优选的技术方案之一，所述突变蛋白KmAgo具有选自以下位点的核心氨基酸突变：
(S4)E12L和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I；
(S12)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；
(S15)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和N541A和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；
(S10)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I和C201D；
(S11)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D；
(S8)W599S和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I和A654I和S162D；
(S20)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和N541A和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；
其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO.1。
作为进一步优选的技术方案之一，所述的KmAgo突变蛋白的酶活力Q1，与野生型的酶活力Q0的比值：Q1/Q0比值为3.0～5.0，较佳的为4.1～5.0。
作为优选的技术方案之一，所述的活性片段、变异形式、衍生蛋白包括：
在SEQ ID NO.1所示序列上具有前述单位点突变所形成的氨基酸序列，进一步具有一个或几个(例如通常为1-30个，较佳地1-10个，更佳地1-6个，再佳地1-3个、最佳地1个)氨基酸残基的缺失、插入和/或取代后，仍然具有定向剪切单链DNA活性(cA1)，该活性显著高于SEQ ID NO.1所示野生型KmAgo酶的相应活性(cA0)，所述显著高于为(cA1-cA0)/cA0≥10％-800％中的任意数值，例如≥15％、≥20％、≥40％、≥50％、≥100％、≥200％、或≥600％或更高；
蛋白的修饰(通常不改变一级结构)，具体形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化；糖基化；具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列；被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白；
前述突变蛋白或其活性片段与其他蛋白或标记物形成的融合蛋白或偶联物；
含有一种或多种其他的突变，从而进一步提升KmAgo突变蛋白的酶切活性。
2、一种分离的多核苷酸，其编码前述突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白。
3、一种载体，其含有前述分离的多核苷酸。
作为优选的技术方案之一，所述载体为重组表达载体，是指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
作为优选的技术方案之一，所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码本发明实施例中的KmAgo突变蛋白的核苷酸序列相同或者是简并的变异体。
4、一种宿主细胞，其含有前述载体，或其核酸中含有前述分离的多核苷酸。
作为优选的技术方案之一，所述宿主细胞包括来源于以下微生物的细胞：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、摩纳酵母(Saccharo mycesmonacensis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxiamus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)，树干毕赤酵母(Pichia stipites)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)。
可通过本领域常规的重组转化方法本发明突变蛋白，并且所述突变蛋白可以在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高压匀浆、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。获得本发明所述宿主细胞可表达KmAgo蛋白突变蛋白。
作为进一步优选的技术方案之一，在适合表达的条件下，培养宿主细胞，从而表达KmAgo突变蛋白；和
分离所述KmAgo突变蛋白。
获得的突变蛋白还可任选地进行纯化，从而获得更纯的突变蛋白产物。
作为更进一步优选的技术方案之一，所述的适合表达的条件包括本领域常规的技术，而纯化技术包括镍柱纯化，离子交换层析等。
5、前述一种中温核酸内切酶突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白的制备方法，培养前述宿主细胞，从而表达所述的突变蛋白或其活性片段、变异形式、衍生蛋白。
6、前述一种中温核酸内切酶突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白在核酸检测、基因编辑中的应用。
7、一种基于前述突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白的体外切割DNA的体系，包括：
(A)向导DNA(gDNA)，所述向导DNA(gDNA)靶向结合于预定的靶位点；和
(B)可编程核酸内切酶Argonaute(KmAgo)，其中，可编程核酸内切酶为前述的KmAgo突变蛋白或其活性片段、变异形式、衍生蛋白；和
(C)靶DNA(target DNA)，所述靶DNA具有与所述向导DNA大部分互补的核苷酸序列。
作为优选的技术方案之一，所述向导DNA的长度为21～45nt，进一步优选为15～21nt，更进一步优选为16～18nt。
作为优选的技术方案之一，所述向导DNA与所述靶核酸之间具有反向互补的片段。
作为优选的技术方案之一，所述靶DNA是携带报告分子的靶核酸，所述报告分子是分别携带荧光基团和淬灭基团的核酸分子。
作为进一步优选的技术方案之一，所述荧光基团包括：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X，或其组合，更进一步优选为FAM。
作为进一步优选的技术方案之一，所述猝灭基团包括：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合，更进一步优选为BHQ。
8、基于前述体系的一种体外切割DNA的方法，具体步骤如下：
S1.基于KmAgo和gDNA形成KmAgo-向导复合物；
S2.令KmAgo-向导复合物与靶DNA接触，所述KmAgo-向导复合物在特定位点切割靶DNA。
作为优选的技术方案之一，所述KmAgo及KmAgo-向导复合物的核酸酶活性需要存在至少一种选自Mn2+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Fe2+，Co2+，Zn2+和Ni2+或其中任意组合的二价金属离子。
作为进一步优选的技术方案之一，所述KmAgo及KmAgo-向导复合物的阳离子是Mn2+。
作为进一步优选的技术方案之一，二价金属离子的浓度为10μM～3mM，更进一步优选为10μM～200mM，更进一步优选为20μM。
本发明的有益效果在于：
本发明通过广泛而深入的研究，通过大量的筛选，首次意外地获得了对于KmAgo酶的活性具有显著改善的突变型的蛋白，是基于kurthia massiliensis的中温核酸酶Argonaute(KmAgo，SEQ ID NO.1所示的野生型序列)的突变蛋白或其活性片段、变异形式、衍生蛋白。所述KmAgo突变蛋白衍生蛋白除一个或多个所述氨基酸突变以外，其余序列与SEQ ID NO.1所示的序列相同或基本相同。
本发明借助机器学习进行改造靶点打分，辅以该酶的晶体结构或者同源建模的结构共进化分析来选择靶标位点，通过筛选获得酶催化活性提高的突变体。在本发明中，最终选择的突变热点共15个，包括位点W599、H602、E621、Y130、E12、E614、C68、C480、R291、A654、S715、C201、S162、W445和N541。进一步地，本发明人对这些候选位点进行筛选，使用荧光法纯酶的筛选。筛选结果表明，W599S、H602E、E621I、Y130D、E12L、E614G、C68L、C480L、R291P和A654I这10个单点突变体可以提高KmAgo的酶催化活性。进一步地，本发明人根据突变筛选出的酶催化活性提高的突变体活性数据，通过机器学习获得了活性进一步提高的多点组合突变体：S4、S12、S15、S10、S11、S8、S20。
本发明所述KmAgo突变蛋白在10至80℃，优选的中温条件指32至44℃的温度范围内具有核酸酶活性，更进一步优选在37℃下具有核酸酶活性。本发明所述KmAgo突变蛋白的酶催化活性较野生型显著提高，具有更好的高温热稳定性。
KmAgo突变蛋白显著提升了定向剪切单链DNA靶标的活性，活性提升可达300％至700％，从而为病原体检测、基因分型、病程监测等提供帮助。本发明的方法可对胞外的遗传物质进行位点特异性修饰，因此可以有效地应用在核酸检测和基因编辑等生物技术领域。这提高了该蛋白在核酸检测技术领域中的应用潜力，同时也为开发新的基因操作工具奠定了基础。
本发明的主要优点如下：
(1)本发明筛选得到的突变型，与野生型相比，酶催化活性显著提高，最大可达至7倍；
(2)本发明的突变体的热稳定性，没有因为突变而受到不良影响，保持非常好的热稳定性；
(3)本发明的突变体，在核酸检测技术，以及开发基因编辑工具技术中，都有应用潜力。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
图1为野生型KmAgo和突变体的SDS-PAGE电泳图，其中，A为野生型KmAgo电泳图，B为单点位突变体的电泳图，C为多点突变体的电泳图，M:Marker；泳道1：流穿；泳道2-9：纯化样品；
图2为野生型KmAgo和突变体的靶标剪切核酸胶图；
图3为野生型KmAgo和突变体的底物剪切效率与时间曲线图；
图4为野生型KmAgo和突变体的剪切活性比较图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1野生型KmAgo质粒载体的构建与合成及突变位点的选择
在NCBI数据库中搜索KmAgo野生型的核苷酸序列，送生工生物公司合成，经密码子优化后，选择pET28a(+)载体，选择NdeI和XhoI双酶切位点，将公司合成的质粒产物转化至大肠杆菌Ecoli-BL21(DE3)感受态中，涂布平板(含有50μg/ml卡那霉素)，37℃倒置过夜培养，第二天挑取单菌落送测序验证质粒序列是否正确，经比对正确后，提质粒。质粒提取步骤参照Axygen质粒小提试剂盒说明书。质粒浓度由Nano-300测定。
本发明所涉及的来源中温原核菌kurthia massiliensis的Argonaute蛋白(KmAgo)的野生型(WT)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过已有的非监督模型对KmAgo借助机器学习进行改造靶点打分，辅以该酶的晶体结构或者同源建模的结构共进化分析来选择靶标位点，选择二者都符合的氨基酸残基作为靶标位点(见表1)。
表1靶标位点及距离催化中心的距离
Figure BDA0004144317030000101
实施例2单位点突变体蛋白的表达与剪切活性测定
转化pET28a-KmAgo质粒至大肠杆菌BL21(DE3)，单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD600达到0.6-0.8时，添加终浓度0.5mM IPTG后移至18℃摇床过夜。4000rpm离心15-20min收集菌体，用Buffer A(20mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl，10mM咪唑)洗菌后，将菌体重悬于Buffer A，超声破碎。13,300rpm离心45min，收集上清。上清过滤后，进行Ni-NTA纯化。使用10mM、20mM和250mM咪唑各洗1个柱体积，收集含有高纯度目的蛋白的洗脱组分，超滤换液至Buffer B(20mMTris-HCl pH 7.5,500mM NaCl)。收集纯化的蛋白并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定纯度(图1)。将蛋白分成小份，经液氮速冻后，储存在-80℃。
设计16nt gDNA序列与30nt的靶DNA序列，送公司合成。gDNA与靶DNA的序列见表2。
表2.gDNA与靶DNA的序列
Figure BDA0004144317030000102
配置反应缓冲液(含15mM Tris-HCl pH 8.8、250mM NaCl)，在反应缓冲液中加入终浓度20μM的MnCl2、100nM KmAgo、1μM合成的gDNA和1μM互补单链DNA靶标核酸，在490nm的激发波长和550nm的发射波长下反应在37℃反应120min，测定终点时荧光值，每个实验做三个重复。如图3所示。
配置反应缓冲液(含15mM Tris-HCl pH 8.8、250mM NaCl)，在反应缓冲液中加入终浓度20μM的MnCl2、100nM KmAgo、1μM合成的gDNA和1μM互补单链DNA靶标核酸，37℃下孵育30min，取6-10μL样品，按1：1比例(体积比)加入上样缓冲液(含质量浓度95％(去离子)甲酰胺，0.5mmol/L EDTA，质量浓度0.025％溴酚蓝，质量浓度0.025％二甲苯蓝)，在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测，如图2所示。
结果
一些单点突变的突变蛋白其酶活力基本不变或略有下降，如S715V、C201D、S162D、W445I、N541A。
酶活力提升数据如表3所示，经过筛选得到10个酶活力提高的单点突变体W599S、H602E、E621I、Y130D、E12L、E614G、C68L、C480L、R291P和A654I。
表3.酶活力提升情况
Figure BDA0004144317030000111
优选的五个单点突变体如表4所示。
表4.优选的五个单点突变体
Figure BDA0004144317030000112
Figure BDA0004144317030000121
后续又通过基于机器学习的监督模型对有效位点进行多点位组合，获得了活性进一步提高的多位点组合突变体(S4)E12L和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I；(S12)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；(S15)W599和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和N541A和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；(S10)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I和C201D；(S11)W599和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D；(S8)W599S和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I和A654I和S162D和(S20)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和N541A和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D和R291P。
后使用上述酶活检测方法测定酶活数据，酶活力提升数据如表5所示。
表5.酶活力提升情况
Figure BDA0004144317030000122
图4为KmAgo单点位和多点位突变体蛋白活性提高柱状图。结果表明，突变体蛋白活性较野生型蛋白可最多提高至7倍。且可在体外应用于基因检测，具有良好的应用前景。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种中温核酸内切酶突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白，其特征在于，所述中温核酸内切酶来源于中温原核生物kurthia massiliensis，所述的突变蛋白KmAgo具有选自以下的一个或多个位点的核心氨基酸突变：
(1)W599S；
(2)H602E；
(3)E12L；
(4)E621I；
(5)Y130D；
(6)E614G；
(7)C68L；
(8)C480L；
(9)R291P；
(10)A654I；
(11)S715V；
(12)C201D；
(13)S162D；
(14)W445I；
(15)N541A；
其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的一种中温核酸内切酶突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白KmAgo具有选自以下的一个或多个位点的核心氨基酸突变：
(1)W599S；
(2)H602E；
(3)E12L；
(4)E621I；
(5)Y130D；
(6)E614G；
(7)C68L；
(8)C480L；
(9)R291P；
(10)A654I；
其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO.1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的一种中温核酸内切酶突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白，其特征在于，所述突变蛋白KmAgo具有选自以下位点的核心氨基酸突变：
(1)W599S；
(2)H602E；
(3)E12L；
(4)E621I；
(5)Y130D；
(6)E12L和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I；
(7)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；
(8)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和N541A和S715V和
E621I和A654I和S162D和C201D和R291P；
(9)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I和C201D；
(10)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和H602E和S715V和E621I和A654I和S162D和C201D；
(11)W599S和W445I和E614G和Y130D和S715V和E621I和A654I和S162D；
(12)W599S和E12L和W445I和E614G和Y130D和N541A和S715V和E621I和
A654I和S162D和C201D和R291P；
其中，所述突变位点的编号基于SEQ ID NO.1。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1～3中任一项所述突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白。
5.一种载体，其特征在于，其含有权利要求4所述分离的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求5所述载体，或其核酸中含有权利要求5所述分离的多核苷酸。
7.权利要求1～3中任一项所述一种中温核酸内切酶突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白的制备方法，其特征在于，培养权利要求6所述宿主细胞，从而表达所述的突变蛋白或其活性片段、变异形式、衍生蛋白。
8.权利要求1～3中任一项所述一种中温核酸内切酶突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白在核酸检测、基因编辑中的应用。
9.一种基于前述突变蛋白KmAgo或其活性片段、变异形式、衍生蛋白的体外切割DN A的体系，其特征在于，包括：
(A)向导DNA，所述向导DNA靶向结合于预定的靶位点；和
(B)可编程核酸内切酶Argonaute KmAgo，其中，可编程核酸内切酶为前述的KmAgo突变蛋白或其活性片段、变异形式、衍生蛋白；和
(C)靶DNA，所述靶DNA具有与所述向导DNA大部分互补的核苷酸序列。
10.基于权利要求9所述体系的一种体外切割DNA的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1.基于KmAgo和gDNA形成KmAgo-向导复合物；
S2.令KmAgo-向导复合物与靶DNA接触，所述KmAgo-向导复合物在特定位点切割靶DNA。
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