CN106191274A - 基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒 - Google Patents

基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，涉及致病基因检测试剂盒。包括：扩增SMN1和SMN2基因exon7的上游引物F1和下游引物R1；扩增内参CFTR基因exon4的上游引物F2和下游引物R2；用于检测的荧光探针。在单管PCR体系中即可定量检测SMA的主要致病基因SMN1基因exon7的拷贝数，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在2～3h即可完成，简便快速、耗时短；均相检测、闭管操作；检测通量高；检测特异性高、结果容易判读。能够快速方便的应用于SMA致病基因的大规模人群筛查，尤其适用于产前、婚前及孕前筛查以及患者的基因诊断。

Description

基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒
技术领域
本发明涉及致病基因检测试剂盒，具体是涉及一种基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy，SMA)是指一类由于脊髓前角细胞变性导致的进行性骨骼肌无力和萎缩的一组疾病，属于常染色体隐性遗传病，其发病率为1/6000～1/10000。临床表现为进行性、对称性的肌肉萎缩及肌无力。至今SMA无有效治疗方法，预后主要与疾病类型有关，I型患者出生后6个月发病，一般生存期在2岁以内；II型患者一般在出生后6～18个月内发病，生存期在5岁以内，而III型患者可存活至成人，其病情进展较慢，最终均死于呼吸肌麻痹或全身衰竭。
目前发现的与SMA有关的基因有神经元凋亡抑制蛋白基因(neuronal apoptosisinhibitory protein，NAIP)和运动神经元存活基因(survival motor neuron，SMN)，二者均位于5q13区。约98％以上的SMA患者发生SMN基因突变，5q13区存在2个SMN等位基因：SMN1和SMN2，只有SMN1基因的纯和缺失才会导致SMA。SMN1基因的缺失突变可引起脊髓前角运动神经元和脑干运动神经核变性，最终导致肌无力、肌萎缩。
人群中SMA致病基因的携带率为2％～2.5％。携带者本人不发病，但是可以传给下一代，其配偶若也是基因携带者，则生育患儿的几率为1/4。通过对SMN1基因的拷贝数进行定量检测，可筛查出95％以上的携带者。若孕妇为携带者，则需要对其丈夫进行该基因的检测，若夫妻双方均为携带者，则需在妊娠时进行产前诊断。所以，通过筛查SMA携带者并对其进行婚姻及生育指导，配合产前诊断，就可以在第一胎就防止患儿出生，这不仅降低了本病的发病率，而且防止了不良基因在群体中的播散。
现有技术中所采用的SMA基因诊断方法主要有聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术、等位基因特异性扩增、多重连接探针依赖性扩增技术(MLPA)等，但限制性片段长度多态性分析技术、等位基因特异性扩增这些技术仅能定性检测患者是否存在SMN1基因纯合缺失，不能区分SMN1致病基因携带者，而MLPA虽能够进行携带者筛查，其技术成本高、仪器要求高、操作复杂且耗时长，不适合大规模的临床筛查。
虽然诸如CN 105039318A、CN 103789440A、CN 104480206A等专利还提出了利用荧光PCR等技术检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变的方案，但这些技术方案普遍存在准确性低、可靠性差、成本高而不利于产前诊断和大规模人群筛查等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒。
本发明包括：
扩增SMN1和SMN2基因exon7的上游引物F1和下游引物R1，其中，F1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，R1的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
扩增内参CFTR基因exon4的上游引物F2和下游引物R2，其中，F2的碱基序列如SEQID NO：3所示，R2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；
用于检测的荧光探针。
所述用于检测的荧光探针包括：
用于检测SMN1基因exon7的荧光探针P1，其碱基序列如SEQ ID NO：5所示；
用于检测SMN1和SMN2基因exon7的荧光探针P2，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示；
用于检测CFTR基因exon4的荧光探针P3，其碱基序列如SEQ ID NO：7所示。
所述荧光探针5’端的荧光基团可包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar 705；
所述荧光探针3’端的淬灭基团可包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。
所述基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒的检测体系可包括：1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、2.5mM MgCl2、4pmol上游引物F1、4pmol下游引物R2、0.4pmol上游引物F2、0.4pmol下游引物R1、1pmol荧光探针P1、1pmol荧光探针P2、1pmol荧光探针P3。
所述1×PCR buffer中可包括：Tris-HCl pH8.5 10mM、KCl 50mM和50％(v/v)甘油。
检测体系的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：
(1)95℃10min；
(2)95℃15s→56℃15s→72℃20s，50个循环，在56℃退火阶段采集荧光信号；
(3)95℃1min→35℃3min→45℃～80℃，其中45℃～80℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集荧光信号。
本发明的有益效果是：
1、简便快速、耗时短：本发明在单管PCR体系中即可完成SMN1基因拷贝数的定量，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在2～3h即可完成，操作步骤少、耗时短；
2、均相检测、闭管操作：本发明为均相检测体系，PCR及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的可能性；
3、检测通量高：本发明基于荧光PCR熔解曲线分析技术，PCR之后只需运行一个简单的熔解曲线分析步骤(在荧光PCR仪上40min以内完成)即可完成，而PCR可以在普通仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，故可以大大提高检测通量，提高荧光PCR仪的利用率；
4、检测特异性高、结果容易判读：本发明是通过熔解峰的峰高比值来判定SMN1基因的拷贝数，结果易于判读，且不易出错，故检测特异性高。
附图说明
图1为实施例2中本发明对SMN1拷贝数≥2的样本在ROX通道检测结果；
图2为实施例2中本发明对SMN1拷贝数≥2的样本在FAM通道检测结果；
图3为实施例2中本发明对SMN1拷贝数为1的样本在ROX通道检测结果；
图4为实施例2中本发明对SMN1拷贝数为1的样本在FAM通道检测结果；
图5为实施例2中本发明对SMN1拷贝数≥2的样本在ROX通道检测结果；
图6为实施例2中本发明对SMN1拷贝数≥2的样本在FAM通道检测结果；
图7为实施例2中本发明对SMN1拷贝数为1的样本在ROX通道检测结果；
图8为实施例2中本发明对SMN1拷贝数为1的样本在FAM通道检测结果；
图9为实施例2中本发明对SMN1拷贝数为0的样本在ROX通道检测结果；
图10为实施例2中本发明对SMN1拷贝数为0的样本在FAM通道检测结果；
图11为实施例2中本发明对SMN1拷贝数≥2的样本在ROX通道检测结果；
图12为实施例2中本发明对SMN1拷贝数≥2的样本在FAM通道检测结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例结合附图，对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
一种基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其中包含PCR扩增引物和荧光探针，具体如下：
F1：5’-GAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTG-3’(SEQ ID NO：1)，
R1：5’-CACTTTCATAATGCTGGCAGA-3’(SEQ ID NO：2)，
P1：5’-ROX-AGCCTTTTTGATTTTGTCTGAAACCCTGTAAGGCT-BHQ2-3’(SEQ ID NO：5)，用于检测SMN1基因exon7；
P2：5’-FAM-AGCTTTATATGGATGTTAAAAAGC-BHQ1-3’(SEQ ID NO：6)，用于检测SMN1和SMN2基因exon7。
本发明的内参引物为拷贝数恒定的管家基因作为内对照基因，例如glyceraldehyde-3-phosphate(GAPDH)(磷酸甘油醛脱氢酶)、ALB基因、β-actin(β-肌动蛋白)、cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR)基因exon4等。优选的，内参基因为CFTR基因exon4，其引物探针序列分别为：
F2：5’-TCTCTTTATTGTGAGGACACTG-3’(SEQ ID NO：3)，
R2：5’-AAGTATTACCTTCTTATAAATCAAAC-3’(SEQ ID NO：4)，
P3：5’-FAM-CACATTGGAATGCAGATGAGAATGTG-BHQ1-3’(SEQ ID NO：7)，用于检测内参基因CFTR exon4；
针对目的基因的引物和探针可以重新设计或者标记不同的荧光染料，序列可以有单个碱基的差异，序列末端可以标记不同荧光基团和淬灭基团，例如，可优选FAM、ROX作为荧光标记基团，BHQ1和BHQ2作为淬灭基团。
本试剂盒中的检测体系包括：1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、2.5mM MgCl2、4pmol上游引物F1、4pmol下游引物R2、0.4pmol上游引物F2、0.4pmol下游引物R1、1pmol荧光探针P1、1pmol荧光探针P2、1pmol荧光探针P3。
所述1×PCR buffer中包括：Tris-HCl pH8.5 10mM、KCl 50mM和50％(v/v)甘油。
检测体系的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：
(1)95℃10min；
(2)95℃15s→56℃15s→72℃20s，50个循环，在56℃退火阶段采集荧光信号；
(3)95℃1min→35℃3min→45℃～80℃，其中45℃～80℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集荧光信号。
实施例2
应用实施例1的试剂盒进行检测分析，操作过程所使用的仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪：
(1)将脊髓性肌萎缩症待检DNA样本、正常对照DNA样本(control，SMN1、SMN2和CFTR基因均为2拷贝)和阴性对照(NTC)分别加入到实施例1的试剂盒的检测体系中，并按实施例1的试剂盒的荧光PCR熔解曲线检测程序进行检测，每个样本的检测体系的模板加入量均为5μL，10ng/μL；阴性对照为10mM Tris-EDTA缓冲液，pH 8.0，加入量为5μL。
(2)结果判读：步骤(1)中每种SMN1基因拷贝数的样本在ROX通道和FAM通道具有其特征熔解峰高比值，计算待检样本两个荧光通道的熔解峰高比值与正常对照样本两个荧光通道的熔解峰高比值的比值，计算公式如下：
比值1＝[峰高SMN2/峰高SMN1]待检样本/[峰高SMN2/峰高SMN1]对照样本
比值2＝[峰高SMN1+SMN2/峰高CFTR]待检样本/[峰高SMN1+SMN2/峰高CFTR]对照样本
峰高值以实验结果导入origin软件计算所得，其中ROX通道两个熔解峰的峰高为Tm值为60.5℃和64℃处的峰高，FAM通道两个熔解峰的峰高为Tm值为57.5℃和65℃处的峰高。
当计算的比值1为0.5～0.7之间时，定义为≥2拷贝；
当计算的比值1为0.8～1.5之间时，比值2为0.95～1.2之间时，定义为≥2拷贝；
当计算的比值1为0.8～1.5之间时，比值2为0.75～0.9之间时，定义为1拷贝；
当计算的比值1为1.7～2.5之间时，定义为1拷贝；
当ROX通道只有SMN2熔解峰无SMN1熔解峰时，定义为0拷贝；
当ROX通道只有SMN1熔解峰无SMN2熔解峰时，比值2为≥0.75时，定义为≥2拷贝；
当ROX通道只有SMN1熔解峰无SMN2熔解峰时，比值2为0.1～0.5之间时，定义为1拷贝。
如比值不在上述范围，需要重新检测。
如图1～12所示，本发明的试剂盒对每种SMN1基因拷贝数的样本在ROX通道和FAM通道具有其特征熔解峰高比值，而且各种基因型间不存在交叉检出的现象，因此在检测实际样本时可对照上述熔解峰高比值范围判读待测样本的SMN1基因拷贝数。
实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输、保存不当或试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降，出现检测不准确的结果。
本发明在单管PCR体系中即可定量检测SMA的主要致病基因SMN1基因exon7的拷贝数，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在2～3h即可完成，操作步骤少，耗时短，通量高，成本低，能够快速方便的应用于SMA致病基因的大规模人群筛查，尤其适用于产前、婚前及孕前筛查以及患者的基因诊断，重复性好、检测特异性高、结果易判读。

Claims (6)

1.基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于包括：
扩增SMN1和SMN2基因exon7的上游引物F1和下游引物R1，其中，F1的碱基序列如SEQ IDNO：1所示，R1的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
扩增内参CFTR基因exon4的上游引物F2和下游引物R2，其中，F2的碱基序列如SEQ IDNO：3所示，R2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；
用于检测的荧光探针。
2.如权利要求1所述基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于所述用于检测的荧光探针包括：
用于检测SMN1基因exon7的荧光探针P1，其碱基序列如SEQ ID NO：5所示；
用于检测SMN1和SMN2基因exon7的荧光探针P2，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示；
用于检测CFTR基因exon4的荧光探针P3，其碱基序列如SEQ ID NO：7所示。
3.如权利要求1所述基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针5’端的荧光基团包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar 705；
所述荧光探针3’端的淬灭基团包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。
4.如权利要求1所述基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于其检测体系包括：1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、2.5mM MgCl2、4pmol上游引物F1、4pmol下游引物R2、0.4pmol上游引物F2、0.4pmol下游引物R1、1pmol荧光探针P1、1pmol荧光探针P2、1pmol荧光探针P3。
5.如权利要求4所述基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于所述1×PCR buffer中包括：Tris-HCl pH8.5 10mM、KCl 50mM和体积百分数为50％的甘油。
6.如权利要求4所述基于熔解曲线分析的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于所述检测体系的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：
(1)95℃10min；
(2)95℃15s→56℃15s→72℃20s，50个循环，在56℃退火阶段采集荧光信号；
(3)95℃1min→35℃3min→45℃～80℃，其中45℃～80℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集荧光信号。
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