CN113832225A

CN113832225A - 一种用于smn1基因检测引物、试剂盒及其制备方法与应用

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Publication number: CN113832225A
Application number: CN202111250075.1A
Authority: CN
Inventors: 刘小芳; 李丙亮; 翟建新
Original assignee: Shanghai Koyee Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Koyee Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-26
Filing date: 2021-10-26
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-10-26
Also published as: CN113832225B

Abstract

本发明涉及一种用于SMN1基因检测的引物对，并基于此，采用不对称PCR技术，制备得到了一种SMN1基因检测的试剂盒，从而实现通过探针熔解曲线法定性或定量检测SMN1基因的突变情况。其中，在针对SMN1基因突变的定量检测时，通过引入内部参考品进行扩增分析和数据校正，同时对扩增程序的优化调整，从而实现对样本中SMN1基因的拷贝数进行定量检测，并确保检测特异性高、保证定量准确。本发明还提出一种SMN1基因检测方法，样本DNA只需一步即可完成检测，检测快速，且可以精确定量SMN1基因exon7拷贝数，试剂成本低，其适用仪器在临床占有率高，非常适宜在临床中广泛应用。

Description

一种用于SMN1基因检测引物、试剂盒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种用于SMN1基因检测引物、试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(SMA)，是一类由脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、肌萎缩的疾病。属常染色体隐性遗传病，临床并不少见。本病临床表现差异较大，根据患者起病年龄和临床病程，将SMA由重到轻分为4型。共同特点是脊髓前角细胞变性，临床表现为进行性、对称性，肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹与肌萎缩，智力发育及感觉均正常。其中具体表现如下：

1型：也称Werdnig-Hoffman病，即婴儿型，约占全部SMA病例的45％。患儿出生后6个月内起病，出现迅速发展的进行性、对称性四肢无力，最大运动能力不能达到独坐。肌无力以近端为著，由于显著肌张力低下，平躺时下肢呈“蛙腿”样姿势。患儿表情及眼球运动正常，舌肌束颤，口咽部肌群无力导致哭声低弱、吸吮无力、咽反射减弱，易发生误吸。由于肋间肌受累比膈肌更重，导致矛盾呼吸，胸廓呈现特征性“钟形”畸形。呼吸肌无力突出，多数患儿在2岁内死于呼吸衰竭。

2型：也称Dubowitz病，即中间型，约占30％～40％。患者多在生后6～18个月起病，进展较1型慢，最大运动能力可达到独坐，但独坐年龄可能落后于正常同龄儿，不能独站或独走。肌无力以近端为著，下肢重于上肢，面肌及眼外肌不受累，舌肌萎缩伴肌束颤，四肢腱反射消失，肢体远端可观察到肌束颤。随着病程进展，出现吞咽困难、咳嗽无力、呼吸功能不全、脊柱侧弯、关节挛缩等合并症。部分患儿在儿童期丧失独坐能力。尽管寿命缩短，但多数可以活到成年期。

3型：也称Kugelberg-Welander病，即青少年型，约占20％。患者多在出生18个月后起病，早期运动发育正常，可独走，部分独走时间延迟。随年龄增长出现以近端为主的肌无力，下肢重于上肢，最终部分丧失独走能力，逐渐依赖轮椅。随病情进展，可出现肢体肌束颤、足部畸形，部分患者因脊柱侧弯、呼吸功能不全等影响日常生活，预期寿命不缩短或轻度下降。

4型：晚发型，即成人型，早期运动发育正常，成人起病，出现肢体近端无力，进展缓慢，预期寿命不缩短。

由于SMN1(Survival Motor Neuron运动神经元生存)功能基因缺失或突变导致的SMA是一种常染色体隐性遗传疾病。95％的SMA患者是因为遗传了来自父母双方的7号外显子缺失的SMN1基因。表型正常的父母通常携带一个或两个正常SMN1基因。只携带一个正常的SMN1基因的人被称作携带者。少数情况下，2-3％的人群携带2个正常SMN1基因，但这两个基因位于同一染色单体，这种情况下也是携带者。

SMA属于携带率高、发病率高的致残致死的严重性疾病，早期症状不明显，一旦发病无有效治疗手段，给家庭带来沉重的心理和经济上的负担，有进行筛查的必要性。95％的SMA患者是因为遗传了来自父母双方的7号外显子缺失的SMN1基因，病因明确，可通过一次性基因检测检出，进而明确生育SMA患儿的遗传风险，或通过产前诊断降低人群中SMA患儿的出生率，是一种符合卫生经济学的筛查策略。2008年，美国医学遗传学会(ACMG)对SMA建议泛族裔筛查，即不分区域、种族，对所有孕龄人群无差别实施SMN1携带者基因筛查，对高风险胎儿实施产前诊断，从而减少SMA患儿的出生。2017年，美国妇产科学会(ACOG)要求所有备育或者已育女性进行SMA携带者筛查。

在SMA患者中最常见的突变是SMN1基因的纯合缺失，大部分携带者可检测到SMN1基因中一个等位基因的缺失，对SMN1基因外显子7、8进行检测，是SMA基因诊断和产前诊断的首选方法。

SMN1最常见的3种突变类型为：1)SMN1基因的缺失，2)SMN1基因转变成类似SMN2基因，前两种类型占全部变异的95％。3)SMN1点突变，目前发现约50余种点突变。

基因缺失的检测方法包括基于聚合酶链式反应的试验、变性高效液相色谱(DHPLC)、多重依赖性探针扩增法(MLPA)等。PCR-RFLP是最初，也是最常用于确定SMA致病基因的检测方法。PCR-RFLP的局限性在于，不能检出SMA携带者，也不能检出那些SMN1点突变型的SMA患者。MLPA使用双探针杂交连接技术检测SNP位点，当两条探针的连接点与模板完全匹配时，通过连接酶作用连接成一条单链，再通过探针上引入的引物序列进行扩增，而不扩增模板本身。若两条探针的连接点不能与模板完全匹配，则不发生连接反应，也不会被引物扩增。该方法可以用于SMN1和SMN2基因的定量。但MLPA方法为国外专利方法，产品价格昂贵，且需要多步反应，操作较为繁琐，耗时长(整个检测需要2天)。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提出一种用于SMN1基因检测的引物对。

包括如下技术方案：

一种用于SMN1基因检测的引物对，所述引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，或为与SEQ ID NO.6所示至少有相似度为80％以上的序列；下游引物序列如SEQ IDNO.7所示，或为与SEQ ID NO.7所示至少有相似度为80％以上的序列。

本发明的目的之一还在于提出上述引物对在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。

本发明的目的之一还在于提出一种SMN1基因检测的试剂盒。

包括如下技术方案：

一种SMN1基因检测的试剂盒，其包括上述引物对，所述上游引物和下游引物在检测反应体系中的用量摩尔比为2～5。

本发明的目的之一还在于提出上述试剂盒在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。

本发明的目的之一还在于提出一种非疾病诊断目的SMN1基因和/或SMN2基因定量检测方法。

包括如下技术方案：

获取待测生物样本核酸；

将上述生物样本核酸，采用上述试剂盒进行检测，获取样本检测的熔解曲线图；

提取上述熔解曲线分析图中导数峰对应的峰值，计算比值，从而确定SMN1基因和/或SMN2基因的拷贝数。

本发明的发明人基于对脊髓性肌萎缩症的深入研究，为了克服现有技术针对目前SMN1基因检测存在的不足，设计得到一种用于SMN1基因检测引物，

并基于此，采用不对称PCR技术，结合发明人精密设计的检测探针，制备得到了一种SMN1基因检测的试剂盒，从而实现通过探针熔解曲线法就能快速定性或准确定量检测SMN1基因的突变情况。其中，在针对SMN1基因突变的定量检测时，通过引入内部参考品进行扩增分析和数据校正，同时对扩增程序的优化调整，从而实现对样本中SMN1基因的拷贝数进行定量检测，并确保检测特异性高、保证定量准确。以便快速准确区分正常者、SMN1缺失基因携带者、SMA患者。

并且，基于本发明试剂盒提出的SMN1基因检测方法，与现有的MLPA及PCR-RFLP方法相比，本方法操作简便，样本DNA只需一步即可完成检测，检测快速，且可以精确定量SMN1基因exon7拷贝数，试剂成本低，其适用仪器在临床占有率高，非常适宜在临床中广泛应用。

附图说明

图1为SMA形成的基因突变分子机制图。

图2为正常人、携带者和患者携带的SMN1基因突变的情况分类图。

图3为SMN1基因检测流程图。

图4为实施例1中本发明SMN1基因定量检测的试剂盒在检测正常人基因组DNA样本时的熔解曲线图。

图5为实施例2中引物探针组合一检测正常人基因组DNA的检测结果图，其中，SMN1基因的二阶导数峰所对应的温度值为66℃，SMN2基因的二阶导数峰所对应的温度值为57℃。在42℃左右有明显的非特异峰。

图6为实施例2中引物探针组合二检测正常人基因组DNA的检测结果图，其中，SMN1基因的二阶导数峰所对应的温度值为61℃，SMN2基因的二阶导数峰所对应的温度值为57℃。

图7为实施例3中SMN1 exon7不同拷贝数样本的定量检测结果。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。

此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

本发明涉及缩略语和术语定义如下：

SMA：Spinal Muscular Atrophy，脊髓性肌萎缩症。

SMN1：survival motor neuron gene 1，运动神经元存活基因1。

MLPA：multiplex ligation-dependent probe amplification，多重连接探针扩增技术。

PCR-RFLP：polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

本发明的一些实施例提供了一种用于SMN1基因检测的引物对，所述引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，或为与SEQ ID NO.6所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列的序列；下游引物序列如SEQ ID NO.7所示，或为与SEQ ID NO.7所示至少有相似度为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列的序列。其中，上述两条引物位于SMN1基因的7号外显子突变点两侧。

本发明的一些实施例提供了上述引物对在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。

本发明的一些实施例提供了一种SMN1基因检测的试剂盒，其包括上述引物对，所述上游引物和下游引物在检测反应体系中的用量摩尔比为2～5。即该试剂盒通过采用不对称PCR，下游引物的浓度远小于上游引物，以形成大量的单链DNA产物。

在其中一些实施例中，上述试剂盒包括用于SMN1基因定量检测的探针，所述探针序列如SEQ ID NO.9所示。

在其中一些实施例中，上述探针为双标记探针，探针序列5'末端修饰荧光标记基团包括，但不限于FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750；3'末端修饰荧光淬灭基团包括，但不限于BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL。

在其中一些实施例中，上述探针优选为双标记探针，所述探针序列3'末端修饰荧光标记基团为ROX，5'末端修饰荧光淬灭基团为BHQ2。

在其中一些实施例中，上述试剂盒还包括用于内参质控的引物对和探针；进一步地，所述用于内参质控的引物对序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示，所述探针序列如SEQ ID NO.10所示。

在其中一些实施例中，上述试剂盒包括用于SMN1基因定性检测的探针，所述探针序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的一些实施例提供了上述试剂盒在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。

本发明的一些实施例提供了一种非疾病诊断目的SMN1基因和/或SMN2基因定量检测方法，其包括如下步骤：

获取待测生物样本核酸；

在其中一些实施例中，上述熔解曲线图中导数峰对应的峰值分别为SMN1-P56、SMN2-P61、IC-P65和IC-P70。

在其中一些实施例中，上述检测方法通过比值SMN1-P56/IC-P65确定SMN1基因的拷贝数，通过比值SMN2-P61/IC-P70确定SMN2基因的拷贝数。

实施例1试剂盒的组成

1、目标序列

根据SMN1基因exon7序列(如下表1-1中SEQ ID NO.1所示)，和SMN2基因exon7序列(如下表1-1中SEQ ID NO.8所示)，进行引物探针设计。

表1-1

2、定性检测试剂盒的组成

2.1引物探针序列

根据上述目的序列，采用设计软件Primer Express 3.0进行引物探针设计，如下表1-2所示：

表1-2

2.2检测体系

针对待测样本，按下表所示反应体系组成进行检测体系配制。

表1-3

组分	用量	供应商
			5×Buffer MMCA	6μL	近岸蛋白质科技有限公司
5U/μL Haemo Taq酶	0.4μL	近岸蛋白质科技有限公司
			100mM探针	0.5pmol	-
100mM上游引物	1.4pmol	-
			100mM下游引物	0.7pmol	-
DNA模板	10ng/反应	-
			水	补水至30μL	-
总体积	30μL	-

2.3反应程序

反应程序为：95℃，3min；10×(95℃，10s；65℃，5s；62℃(每个循环降低0.5℃)，20s；72℃，15s；)；40×(95℃，6s；65℃，5s；60℃，10s；72℃，15s；)；95℃，1min；45℃，30s；45℃-80℃连续收集荧光信号。

2.4结果判读

61℃有明显的峰，为正常或携带者；61℃无峰为SMA患者。

3、定量检测试剂盒的组成

3.1引物探针序列

根据上述目的序列，采用设计软件Primer Express 3.0进行引物探针设计，如下表1-4所示：

表1-4

3.2检测体系

表1-5

3.3反应程序

反应程序为：95℃，3min；10×(95℃，10s；65℃，5s；62℃(每个循环降低0.5℃)，20s；72℃，15s；)；28×(95℃，6s；65℃，5s；60℃，10s；72℃，15s；)；95℃，1min；45℃，30s；45℃-80℃连续收集荧光信号。

3.4结果判读

提取熔解曲线导数峰对应的4个峰对应的纵坐标值(SMN1-P56、SMN2-P61、IC-P65和IC-P70)，计算比值SMN1-P56/IC-P65和比值SMN2-P61/IC-P70。由于不同SMN1拷贝数的样本，比值SMN1-P56/IC-P65有显著差异；不同SMN2拷贝数的样本，比值SMN2-P61/IC-P70有显著差异。因此根据比值所在范围，可以确定SMN1和SMN2基因拷贝数。

IC的模式与SMN1/SMN2相似，存在两种序列，同时仅存在一个碱基的差异。IC扩增序列的拷贝数恒定，分别为2个拷贝。差异碱基在探针序列中，因此IC的溶解曲线峰对应了两个Tm值。由于IC序列的拷贝数保持恒定(各2个拷贝)，因此可以作为内部参考序列用来校准靶标的检测结果(如同一把量尺)。如果没有IC，靶标峰值与拷贝数的关系将无法确定。

同时IC也作为内部质控使用，若IC对应的两个峰任一个不存在，表示该样本的检测结果无效。

SMA基因拷贝数定量参考值由参考样本的检测结果确定。参考样本为SMN1和SMN2不同拷贝数的人类基因组DNA，其拷贝数的确定由MLPA试剂盒检测确定。参考值的范围与检测方法的系统偏差、样本差异等多个因素有关，根据不同参考样本多次重复检测结果的标准偏差，确定以下数值范围。

表1-6 SMA基因拷贝数定量参考值

SMN1-P56/IC-P6	SMN1拷贝数	SMN2-P61/IC-P70	SMN2拷贝数
				<0.5	0	<0.5	0
0.5～1.5	1	0.5～1.5	1
				1.5～3.2	2	1.5～3.3	2
>3.2	3+	>3.3	3+

实施例2试剂盒引物的优化

根据SMN1基因exon7序列(如上SEQ ID NO.1所示)，设计以下表2-1所示引物探针组用于检测SMN1及SMN2的第7外显子，对8份健康人外周血白细胞DNA样本进行检测，从而筛选检测结果较好的一组。

表2-1

反应体系分别见表2-2

表2-2 PCR体系配方

组分	用量	供应商
			5×Buffer MMCA	6μL	近岸蛋白质科技有限公司
5U/μL Haemo Taq酶	0.4μL	近岸蛋白质科技有限公司
			100mM探针	0.5pmol
100mM上游引物	0.7pmol
			100mM下游引物	1.4pmol
DNA模板	10ng/反应
			水	补水至30μL
总体积	30

引物探针组合一和组合二的检测结果分别见图4和图5。其中，图4为引物探针组合一检测正常人基因组DNA的检测结果图，经伯乐CFX96荧光PCR仪检测，SMN1基因的二阶导数峰所对应的温度值为66℃，SMN2基因的二阶导数峰所对应的温度值为57℃，但峰不明显，一致性差。而且在48℃左右及其他位置有随机出现的非特异峰。图5为实引物探针组合二检测正常人基因组DNA的检测结果图，经伯乐CFX96荧光PCR仪检测，SMN1基因的二阶导数峰所对应的温度值为61℃，SMN2基因的二阶导数峰所对应的温度值为57℃。结果显示，引物探针组合一的检测结果有明显的非特异性峰，影响结果判读；引物探针组合二的检测结果良好，两个峰分别对应SMN1和SMN2基因，无其他非特异性峰。

实验例3：SMN1/SMN2基因exon7定量检测

根据SMN1基因exon7序列(如SEQ ID NO.1所示)，和SMN2基因exon7序列(如SEQ IDNO.8所示)，设计以下引物探针检测SMN1及SMN2的第7外显子。探针的突变位点与SMN2序列一致。同时设计一套内参(IC)引物探针，用于SMN1和SMN2拷贝数定量及质控。其中，IC扩增序列在单条染色体上有2个拷贝(单细胞中共有4个拷贝)，但探针序列中存在一个碱基的差异，因此IC的溶解曲线峰对应了两个Tm值。若IC对应的两个峰任一个不存在，表示该样本的检测结果无效。具体序列如下表3-1所示：

表3-1

针对10例外周血白细胞样本，采用本发明试剂盒，并根据实施例1所述反应体系和检测方法，进行PCR检测，检测得到的熔解曲线见图3，结果显示，该方法可以准确区分SMN1exon7不同拷贝数的样本，实现SMN1 exon7的定量检测。在数据量化方面，提取溶解曲线导数峰对应的4个峰值(SMN1-P56、SMN2-P61、IC-P65和IC-P70)，计算比值SMN1-P56/IC-P65，根据比值所在范围可确定SMN1的拷贝数。比值SMN2-P61/IC-P70用于SMN2拷贝数的定量。具体如下表3-2所示。

表3-2 SMN1基因拷贝数定量及参考值

注：参考值由参考品检测结果和临床比对数据结果确定。

实验例4：与MLPA方法的临床试验比较

MLPA是目前临床上SMA基因检测的金标准。MLPA检测主要分4个步骤：1)探针杂交；2)连接反应；3)PCR扩增；4)毛细管电泳及荧光信号分析。

本实验例采用实验例1的方法和MLPA方法同时对52份人外周血白细胞样本(从上海市某医院获取)进行了检测，结果如下表4-1所示。其中在MPLA检测中的试剂采用SALSAMLPA probemix P060 SMA Carrier及配套试剂(荷兰MRC公司)。

表4-1

结合上表统计结果显示，采用本发明试剂盒对SMA检测的方法与MLPA方法的临床试验结果具有很高的一致性(100％)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海科亦生物科技有限公司

<120> 一种用于SMN1基因检测引物、试剂盒及其制备方法与应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 276

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tattttgttg aataaaataa gtaaaatgtc ttgtgaaaca aaatgctttt taacatccat 60

ataaagctat ctatatatag ctatctatgt ctatatagct atttttttta acttccttta 120

ttttccttac agggtttcag acaaaatcaa aaagaaggaa ggtgctcaca ttccttaaat 180

taaggagtaa gtctgccagc attatgaaag tgaatcttac ttttgtaaaa ctttatggtt 240

tgtggaaaac aaatgttttt gaacatttaa aaagtt 276

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttttccttac agggtttcag acaaaa 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

agctattttt tttaacttcc ttta 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aaggaatgtg agcaccttcc ttc 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tttgtctgaa accctgtaag gaaa 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aggtattttt tttaccttcc ttta 24

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

aatttaagga atgtgagcac cttccttct 29

<210> 8

<211> 276

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tattttgttg aataaaataa gtaaaatgtc ttgtgaaaca aaatgctttt taacatccat 60

ataaagctat ctatatatag ctatctatgt ctatatagct atttttttta acttccttta 120

ttttccttac agggttttag acaaaatcaa aaagaaggaa ggtgctcaca ttccttaaat 180

taaggagtaa gtctgccagc attatgaaag tgaatcttac ttttgtaaaa ctttatggtt 240

tgtggaaaac aaatgttttt gaacatttaa aaagtt 276

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tttgtctaaa accctgtaag gaaa 24

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ctctttttgc gtatttgatg tgtcttt 27

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

actttatttt tttaacttcc ttta 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aggaaggctg aagttttatg a 21

Claims

1.一种用于SMN1基因检测的引物对，其特征在于，所述引物对中上游引物序列如SEQID NO.6所示，或为与SEQ ID NO.6所示至少有相似度为80％以上的序列；下游引物序列如SEQ ID NO.7所示，或为与SEQ ID NO.7所示至少有相似度为80％以上的序列。

2.权利要求1所述引物对在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。

3.一种SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对，所述上游引物和下游引物在检测反应体系中的用量摩尔比为2～5。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于SMN1基因定量检测的探针，所述探针序列如SEQ ID NO.9所示。

5.根据权利要求3～4任一项所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于内参质控的引物对和探针；进一步地，所述用于内参质控的引物对序列如SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.12所示，所述探针序列如SEQ ID NO.10所示。

6.根据权利要求3～5任一项所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于SMN1基因定性检测的探针，所述探针序列如SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求3～6任一项所述试剂盒在脊髓性肌萎缩症检测中的应用。

8.一种非疾病诊断目的SMN1基因和/或SMN2基因定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取待测生物样本核酸；

将上述生物样本核酸，采用权利要求3～6任一项所述试剂盒进行检测，获取样本检测的熔解曲线图；

9.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于，所述熔解曲线图中导数峰对应的峰值分别为SMN1-P56、SMN2-P61、IC-P65和IC-P70。

10.根据权利要求8-9任一项所述检测方法，其特征在于，通过比值SMN1-P56/IC-P65确定SMN1基因的拷贝数，通过比值SMN2-P61/IC-P70确定SMN2基因的拷贝数。