CN102242187A - 一种fmr1基因5’端非编码区cgg重复数目的pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对X染色体FMR1基因异常所导致的几种遗传疾病的实验室辅助诊断方法。该方法的建立旨在以分子生物学检测方法作为临床检查的辅助手段，提高临床诊断的正确率，并为相关遗传病的产前筛查提供一种新的检测手段。
Description
发明所属领域：
本发明涉及对X染色体FMR1基因异常所导致的几种遗传疾病的实验室辅助诊断方法。该方法的建立旨在以分子生物学检测方法作为临床检查的辅助手段，提高临床诊断的正确率，并为相关遗传病的产前筛查提供一种新的检测手段。
发明背景：
脆性X综合征，脆性X相关共济失调综合症和脆性X相关卵巢功能不足
脆性X综合征(fragile x syndrome，FXS)也被称作脆性X染色体综合征或Martin-Bell综合征，被首次报到于与20世纪60年代末，是一种X连锁不完全显性遗传病。患者从儿童期或少年期开始出现智力发育异常症状和一系列异常外貌体征。其主要症状为1.智力低下，计算能力差，无数字的基本概念。抽象思维及推理能力方面均有明显缺陷。2.语言障碍，表现为会话和言语表达能力的发育严重迟缓，学语年龄延迟、词汇量少、语言重复单调。3.行为障碍，表现为多动、注意力不集中。孤独症也较常见。4.特殊面容：包括头围增大、脸长、前额突出、虹膜颜色变淡、耳轮大、腭弓高、嘴大唇厚及下顷大而突出等。
FXS的病因为X性染色体异常，具体地说是位于X染色体上的FMR1基因5’端非编码区CGG重复序列的异常延长。已知正常人在此区段的CGG重复数目约为5-55个，临床病人则多于200个(称为‘全突变型’)。此区段CGG重复数目在55-200个之间则被称作‘前突 变’。男性只有一条X染色体，一旦发生异常则临床症状表现明显。女性有两条X染色体，当其中一条异常，另一条正常时可表现较轻的临床症状。两条都异常时则症状严重，但这种情况几率较低。因此，FXS的临床发病率在男性中较在女性中为高。在男性中大约为人群的1200到2500分之一。在女性中大约为人群的1650到5000分之一。FXS约占男性智力低下患者的4％到8％，是发病率仅次于唐氏综合征(Downsyndrome)的又一大类导致智力发育低下的遗传病.
近年研究发现，具有X染色体FMR1基因‘前突变’的个体在年轻时虽可不表现任何临床症状。但有部分‘前突变’携带者在老年期会发生类帕金森样的震颤麻痹和共济失调。其主要症状为：1.意向性震颤，即在注意力集中，伸手拿取物体或倒水时出现不可控的震颤。2.四肢肢端麻木。3.情绪不稳定，焦虑，易激惹，性格改变。4.短期记忆丧失，智力衰退。上述症状将进行性发展，最终在发病后5-20年危及生命。这些症状虽与帕金森氏症相似，但其发病机制与干预、治疗手段均有不同之处，故这部分病人应与帕金森氏症相区分而诊断为‘脆性X相关共济失调综合症’(Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome，FXTAS)。由于对本病缺乏认识及缺乏简便明确的实验室检查手段，这类病人目前在临床上几乎都被诊断为类帕金森氏症、阿尔茨海默氏病或老年痴呆而延误治疗。与FXS类似，FXTAS患者男性较女性为多且发病率随年龄增长而升高，在50岁以上男性FMR1基因‘前突变’携带者中FXTAS发病率为30％，70岁以上则达50％，80岁以上可达75％。据估算，在男性中约有1/500到1/800是‘前突变’携带者，可见FXTAS在老年中枢神经系统退化性疾病中占重要位置。
与男性不同，FMR1基因‘前突变’女性携带者则可能受到另一种疾病的困扰，脆性X相关卵巢功能不足(Fragile X-Associated PrimaryOvarian Insufficiency，FXPOI)。其主要症状为不孕和绝经期提前(早于40岁)。流行病学调查显示约20-28％的FMR1基因‘前突变’女性携带者会出现受孕困难。另有约23％的女性携带者会出现绝经期提前。据估算，女性中‘前突变’携带者可达1/130到1/250。可见FXPOI在原发性卵巢功能不足(Primary Ovarian Insufficiency，POI)患者中占有显著比重。鉴于POI可有多种发病机制，相应的治疗手段也各不相同。明确的病因学诊断将对治疗效果发生决定性的影响。
FXS，FXTAS和FXPOI的诊断与FMR1基因5’端非编码区CGG重复数目的检测
目前，FXS的临床诊断主要依赖症状学鉴别。可提供诊断辅助的实验室检查方法为染色体核型检查。其方法为从患者外周血中分离培养血细胞，在缺乏叶酸，加入咖啡因的培养基中培养72小时后进行染色体显带。然后人工在显微镜下寻找，计数具‘脆性’X染色体(fra(X)染色体)的细胞。当fra(X)细胞占细胞总数的一定百分比时则判断为检测阳性。染色体核型分析需细胞培养过程，技术复杂、昂贵、耗时。检测结果受培养基成份、培养时间，和观察者主管因素的影响，即使在最佳条件下检测的正确率也达不到50％。染色体核型检查对FXTAS和FXPOI则无能为力。
分子生物学，特别是PCR技术的发展为脆性X相关疾病的实验室辅助检查带来了新的方法。PCR检测FMR1基因CGG重复数目的方法较精确可靠。但因目标序列几乎全由C、G碱基组成，常规PCR反应效 率低下，反应产物只能以Southern blot方法才能有效检测。Southern blot方法步骤较多，费时费力，对实验设备和人员培训要求较高。故该方法虽然长久以来已用于临床基础研究，但无法应用于临床实验室诊断。因此，发展一种简便可靠的FXS实验室诊断方法一直是中外科研人员努力的目标。现有文献表明，各方努力多集中于对PCR方法的改进，以提高检测灵敏度和可靠性。目前，虽在国外学术期刊和专利中可以找到相关文献声称可用改进PCR方法检测‘全突变型’FMR1基因的CGG重复数目。但在临床实践中，即使有些医疗机构开始了相关的尝试，结果也多不理想。至今，在国内外临床实验室中对‘全突变型’只能以PCR产物缺失这种阴性结果来推论样本中CGG重复数目多于200。这样模糊不清的方法远远无法满足临床需要。
对FXS的产前筛查
采用羊水细胞、绒毛及胎血均可进行染色体核型检查以对FXS进行产前筛查。但研究表明采用羊水细胞、绒毛方法检测的阳性率较低，而经皮取胎血风险较大。故目前尚没有一个满意的方法对FXS进行产前筛查。
发明内容：
本发明的目的是要提供一种可以PCR方法结合常规琼脂糖凝胶电泳检测人类FMR1基因5’端非编码区CGG重复数目的方法。其有效检测的CGG重复数目可从5至1000。本发明提供了实现上述目标的具体方法，包括：亚硝酸钠处理基因组DNA，PCR反应所需的引物序列，PCR反应混合物配方，PCR反应热循环程序，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测和片段长度定量。
本发明的第二个目的是通过这种方法为FXS，FXTAS和FXPOI的临床诊断提供一种实验室辅助方法。鉴于这些疾病与其它疾病，如唐氏综合症，帕金森氏症和原发性卵巢功能不足在临床症状上的相似性，对这些疾病的确诊需要在症状学基础上参考实验室检查所获得的客观结果才能做出最终判断。明确、可靠的实验室检测方法对获得正确的诊断结论至关重要。
本发明的第三个目的是为FXS的产前筛查提供一种敏感、可靠的方法。目前对FXS尚无十分有效的治疗手段，更无法根治。因此，产前筛查是优生优育，预防疾病的主要手段。鉴于目前所应用的染色体核型检查技术复杂、昂贵、耗时且结果稳定性差，对FXS的产前筛查尚无法普及。本发明提供了一种远比染色体核型检查技术简单可靠的技术手段，使FXS的产前筛查有望成为孕期常规检查。
本发明的第四个目的是为基础与临床科研，新药研发等工作提供一种新的研究手段。如上所述，PCR结合Southern blot的方法是目前在学术科研实验室中测定FMR1基因5’端非编码区CGG重复数目的标准方法。本发明所描述的方法更为简便易行，对提高工作效率，降低研发成本有显著意义。
本发明所涉及的测定FMR1基因5’端非编码区CGG重复数目的方法，主要包括以下步骤：
1.基因组DNA亚硝酸钠处理。
2.使用特异引物，以从1.获得的DNA为模板进行PCR反应
3.使用简并引物以从1.获得的DNA为模板进行PCR反应
4.将从2.，3.获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。将电泳中显 示的条带与平行电泳的DNA分子量标准进行比对。进而推算出样本中FMR1基因5’端非编码区CGG的重复数目。
常规PCR用于检测FMR1基因5’端非编码区CGG重复数目的难点在于此区段G、C含量过高，在PCR反应中模板双链DNA解链困难，导致反应效率低下，而必须借助敏感但复杂的Southern blot来检测稀少的PCR产物。本发明中首先以亚硝酸盐对模板DNA进行处理。借助该化学物质与胞嘧啶(C)之间发生的脱氨基反应，将胞嘧啶转化为尿嘧啶(U)。U在DNA双链中以两个氢键互与其互补碱基T配对，而处理前的C、G配对之间为三个氢键。这样，处理后的DNA其双链解链所需自由能较处理前显著降低。以经过处理的DNA作为模板进行PCR反应，在退火阶段DNA双链解链几率将显著增高，PCR反应的效率也相应显著增高。
根据本发明方法的一个优选实施方案，特征在于使用亚硝酸钠与DNA中的胞嘧啶发生脱氨基反应。亚硝酸钠在反应中的浓度为500mM。亚硝酸钠对单链DNA中尿嘧啶脱的氨基作用比对双链DNA强约3倍。故在亚硝酸钠处理前，应在先70度下对DNA进行氢氧化钠预处理，使双链DNA解链为单链DNA。同时70度下氢氧化钠处理也对胞嘧啶发生脱氨基形成尿嘧啶有一定作用。
根据本发明方法的一个优选实施方案，特征在于在PCR反应混合物中加入甜菜碱。其在反应中的浓度为2M。甜菜碱能减少长链DNA二级结构的形成，提高PCR反应的效率
根据本发明的一个优选实施方案，特征在于在PCR反应使用(CCT) 4和(CCG)4简并引物。当CGG重复数目多于500时，前述亚硝酸 钠处理与甜菜碱的使用仍不能保证产生足量的PCR产物供琼脂糖凝胶电泳检测。此时(CCT)4和(CCG)4简并引物可在PCR反应中非特异地与FMR1基因5’端非编码区CGG重复序列结合，与上游配对引物相配合可生成一系列大小不等的PCR产物，这些PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中将呈现为一条抹带。抹带的出现以PCR阳性反应产物的形式提示过长CGG重复序列的存在。避免了既往检测中以PCR阴性结果推测CGG重复序列数目的不确定性。
具体实施方式
以下借助实例进一步举例描述本发明。本领域技术人员可以理解到，这些实施例并不以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
实例1.基因组DNA亚硝酸钠处理的方法
所需的试剂及缓冲液：
a)基因组DNA 5微克。
b)1M NaOH溶液
c)3M醋酸钠溶液(pH5.3)
d)无水乙醇
e)亚硝酸钠缓冲液，其成份为亚硝酸钠500mM，醋酸钠26mM，醋酸52mM，氯化钠150mM
实验方法：
人基因组DNA中加入等体积1MNaOH。置于70℃水浴中1小时后立即置于冰上。然后加入等摩尔数HCL使反应体系中和。加入1/10体积3M醋酸钠(pH5.5)稳定pH后，再加入两倍体积无水乙醇。于台式 离心机12,000转离心沉淀DNA。将DNA沉淀溶解于500ul新鲜配制的亚硝酸钠缓冲液。置50℃水浴中16小时后加入两倍体积无水乙醇。于台式离心机12,000转离心沉淀DNA。将处理后的DNA溶解于50ul10mM Tris缓冲液中备用。
实例2.PCR反应
按北京康为世纪LAmp DNA Polymerase MasterMix说明书配制PCR反应体系，其中包括：2X LAmp DNA Polymerase MasterMix，从实例1中获得的基因组DNA 100ng，MgCl2 1.5mM，上游引物(序列1)：TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA和下游引物(序列2)：AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC各1uM。甜菜碱2M。PCR反应热循环程序为：98℃ 5min；98℃10s-64℃30s-68℃2min 35个循环；68℃ 4min。
实例3.(CCT)4和(CCG)4简并引物PCR反应
按北京康为世纪LAmp DNA Polymerase MasterMix说明书配制PCR反应体系，其中包括：2X LAmp DNA Polymerase MasterMix，从实例1中获得的基因组DNA 100ng，MgCl2 1.5mM，上游引物TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA(序列1)，(CCT)4引物CCTCCTCCTCCT(序列3)和(CCG)4引物CCGCCGCCGCCG(序列4)各1uM。甜菜碱2M。PCR反应热循环程序为：98℃ 5min；98℃10s-64℃30s-68℃2min 35个循环；68℃ 4min。
实例4.琼脂糖凝胶电泳检测
按常规方法制备1.5％琼脂糖凝胶。将5ul上述实例2.和3.中获得的PCR产物于凝胶中进行电泳。电压5V/cm。以50bp ladder为分子两 标准，比对PCR、产物的大小，估算CGG重复数目。
上述实例1至4的实验结果显示。当CGG重复数目在55个以下时，在溴乙锭染色的琼脂糖凝胶上，100％样本在与相应分子量标准对应处均可见清晰单一条带。当DNA样本中CGG重复数目在55-200时，有95％的样本可获得单一条带。最佳情况下，可从CGG重复数目达1000的样本中获得清晰单一条带。但是，当CGG重复数目在200-1000时，约有20％的DNA样本无法产生单一条带。此时，100％的DNA样本均可产生抹带。这样，虽无法精确确定CGG重复数目，但抹带的产生这一PCR阳性结果明确提示‘全突变’的存在。这些实验结果表明，本发明中所使用的方法能够对各类人群FMR1基因5’端非编码区CGG重复数目进行有效检测，从而达到辅助临床诊断的目的。
核酸序列表
| 序列编号 | 序列名称 | 序列 |
| 序列1 | 上游引物 | 5’-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA-3’ |
| 序列2 | 下游引物 | 5’-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC-3’ |
| 序列3 | (CCT)4引物 | 5’-CCTCCTCCTCCT-3’ |
| 序列4 | (CCG)4引物 | 5’-CCGCCGCCGCCG-3’ |
Claims (9)
1.一种可以PCR方法结合常规琼脂糖凝胶电泳检测人类FMR1基因5’端非编码区CGG重复数目的方法。其有效检测的CGG重复数目可从5至1000。包括实现上述目标的具体方法：热强碱及亚硝酸盐处理基因组DNA，PCR反应所需的引物序列，PCR反应混合物配方，PCR反应热循环程序，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测和片段长度定量。
2.根据权利要求1的方法，其中作为提供碱性条件的试剂包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾等无机物和有机物。
3.根据权利要求1的方法，其中用于处理基因组DNA的试剂包括但不限于可以引起DNA分子中碱基脱氨基作用的亚硫酸氢盐、亚硝酸盐等无机物和有机物。
4.按权利要求1的方法对处理后的基因组DNA的提取与纯化的方法，包括但不限于DNA的乙醇沉淀、异丙醇沉淀、聚乙二醇沉淀及用吸附柱的沉淀方法等。
5.按权利要求1的方法在PCR反应中所用的引物序列。
6.按权利要求1的方法在临床与科研中对人的FMR1基因5’非编码区中CGG重复序列的数量的检测，包括但不限于正常人、脆性X染色体综合症前突变和脆性X染色体综合症患者的检测。
7.按权利要求1的方法应用于产前诊断。
8.按权利要求1的方法应用于目的在于鉴别与FMR1基因前突变相关的疾病的检测。
9.按权利要求1的方法应用于所有高GC含量的DNA、RNA的PCR检测。
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