CN103757104B - 用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒及基因芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒以及相应的基因芯片。所述的试剂盒包括：检测人基因组的7个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述7个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787；还包括检测人基因组的4个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述4个SNP位点是rs2853668、rs31489、rs402710和rs4635969；还包括检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的巢氏PCR扩增引物。所述的基因芯片包括：检测人基因组的11个SNP位点的上下游引物和探针，所述11个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs2853668、rs31489、rs402710、rs4635969；以及检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的上下游引物和探针。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒以及相应的基因芯片，用于预测鼻咽癌发病风险、进行鼻咽癌高危人群筛查以提高鼻咽癌早诊率。
背景技术
鼻咽癌是鼻咽上皮来源的恶性肿瘤，多发于鼻咽顶部和咽隐窝，是一种多因素影响的复杂性疾病，其发生及发展与遗传因素、EBV病毒感染及环境因素密切相关。中国是世界鼻咽癌高发区，据世界卫生组织统计，2008年，中国新发病例占全球39.2%（33101人），因鼻咽癌死亡病例占全球40.5%（20899人）；并且，鼻咽癌好发于壮年，严重影响人民健康和经济发展。
近几年，巴德年院士提出的现代“3P”医学理念正不断得到推广。“3P”医学模式，即预测（Prediction）、预防（Prevention）和个体化诊疗（Personalization），强调利用个体基因组等信息，进行疾病的预测和防治，对于疾病的态度由“重治”转变为“重防”。同样，鼻咽癌的防治关键将是进行患病高危人群的筛查，提高早诊率。临床研究发现，鼻咽癌早期治疗效果远高于晚期。临床分期是影响治疗效果的重要因素，早期无局部淋巴结转移鼻咽癌的5年生存率（75.7%）远高于淋巴结转移鼻咽癌（58.2%）和晚期远处转移鼻咽癌（34.9%）。然而，目前仍然缺乏有效的用于高危人群筛查、早期诊断的方法策略，加上鼻咽癌的早期症状无特异性和原发部位较隐蔽，不易被发现，80%鼻咽癌患者就诊时已处于中晚期，治疗效果不理想，导致临床上鼻咽癌的5年生存率一直徘徊于60%左右。进行鼻咽癌高发区人群筛选，能够筛选患病高危人群，提高鼻咽癌早诊率，是提高治疗效果的关键。因而，开发鼻咽癌发病风险预测、用于鼻咽癌高危人群筛查的新型手段具有重要的意义。
目前临床上提高鼻咽癌早期诊断率主要是通过提高个人健康意识，结合鼻咽腔检查，并利用EB病毒抗体检测技术以评估EB病毒感染情况（详见专利：CN92114135“一种检测EB病毒抗体的显色试剂及其制造方法”；CN200710027841“检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及其制备方法”；CN201010255146“EB病毒IgA抗体检测试剂盒（胶体金法）及制备方法”；CN200710029366.1“检测EB病毒gp78抗体的CBA试剂盒及其制备方法”等）。但是这种策略难以应用于大规模人群的高危人群筛查以及鼻咽癌的早期预防预警，也未能够有效地提高早诊率。因此，对于鼻咽癌高危人群，根据个体携带鼻咽癌易感基因情况进行鼻咽癌发病风险预测以提高鼻咽癌早诊率显得非常重要。
遗传因素在不少肿瘤的发生中起到不容忽视的重要作用。在其它相关的恶性肿瘤研究当中，研究者能够利用个体携带易感基因的情况，对其发病风险进行预测。例如，分别携带BRCA1和BRCA2基因突变的女性，罹患乳腺癌的相对风险分别是正常群体的5－45倍和9－21倍；并且，Antoniou等人通过7个风险相关位点联合分析发现，在BRCA2突变携带者中，5%高危组到80岁时发生乳腺癌的可能性为80～96%，而低危组仅为42～50%，指出这些患病风险差异可以用于指导临床方案。然而，目前缺乏有效的鼻咽癌发病风险预测产品。虽然已有个别申请专利根据鼻咽癌相关基因来判定个体对鼻咽癌是否易感的方法，如PLUNC的C-2128T位点、C-1888T位点或由此两位点组成的单倍型（详见专利：CN200510008650.1“一种检测与鼻咽癌相关的易感基因PLUNC基因型的方法及PLUNC易感基因”），CYP2E1基因上Rsal1多态性，TNF-β基因上G252A位点多态性，GSTM1基因缺失与否(Present/Null)，GSTT1基因缺失与否(Present/Null)（详见专利：CN201210053659“鼻咽癌易感基因无创检测试剂盒”）等。然而，该方法仅针对极少数的指标检测，准确率较低；并且，该方法可靠性有待于大规模人群样本进行验证。另外，EB病毒已被国际癌症研究联盟（IARC）确定为Ⅰ类致癌物，而鼻咽癌与EB病毒有密切的关联。因此，综合考虑基因易感因素和EB病毒因素对鼻咽癌发病风险的预测十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒以及相应的基因芯片，可同时检测多个鼻咽癌易感基因的SNP位点，可以为个体罹患鼻咽癌风险程度、鼻咽癌高发区人群普查，筛查鼻咽癌发病高危人群以及进行相应预防措施提供参考。
本发明所述的一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒包括：检测人基因组的7个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述7个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787。
根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述检测rs1412829的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:3；所述检测rs1572072的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:6；所述检测rs28421666的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:9；所述检测rs2860580的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:12；所述检测rs2894207的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:15；所述检测rs6774494的PCR扩增引物的序列分别为SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:18；所述检测rs9510787的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:21。
根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述的试剂盒还包括检测人基因组的4个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述4个SNP位点是rs2853668、rs31489、rs402710和rs4635969。
根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述检测rs2853668的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:24；所述检测rs31489的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:27；所述检测rs402710的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:30；所述检测rs4635969的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:33。
根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述的试剂盒还包括检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A（GenBank登录号：NC-007605）的巢氏PCR扩增引物。
根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的巢氏PCR扩增引物的初级PCR引物的序列为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35，以及次级PCR引物的序列为SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
本发明所述的试剂盒以是以本发明人的基于国际范围内最大规模样本量的鼻咽癌人群和正常人对照人群及全基因组水平鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究为基础，结合其它的鼻咽癌相关易感基因，选择11个单核苷酸多态性位点（SNP）及EBV分型信息进行制备的，针对每个位点的引物序列都是经过特异性筛选的。采取受检者外周血、唾液或漱口水来源的基因组DNA，在本发明所述的试剂盒上进行基因分型检测，再利用多重PCR扩增、质谱检测（Sequenom）及桑格（Sanger）测序方法，检测单核苷酸位点，综合分析环境因素（腌制食品食用史、既往吸烟史、新鲜水果蔬菜食用量）、肿瘤家族史及鼻咽癌易感基因位点单核苷酸多态性（SNP）信息，利用遗传风险计分模型，推测受检者罹患鼻咽癌的风险程度，克服了现有的仅仅通过检测EB病毒感染情况、或者依靠极少数且尚待大规模验证的易感基因指标的等结果来进行鼻咽癌发病风险判断的不足。本发明所述的试剂盒能够在受检者任何一个年龄阶段进行检测，结合受检者环境暴露因素，提示受检者不同时期罹患鼻咽癌的风险程度，能够进行大规模人群普查、筛选鼻咽癌发病高危人群，实现鼻咽癌发病风险预测、预警，提高早诊率。
本发明所述的一种用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片包括：检测人基因组的11个SNP位点的上下游引物和探针，所述11个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs2853668、rs31489、rs402710、rs4635969；以及检测检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的上下游引物和探针。
根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片的进一步特征，所述检测rs1412829的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39，以及探针的序列为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；所述检测rs1572072的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43，以及探针的序列为SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45；所述检测rs28421666的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，以及探针的序列为SEQ ID NO:48和SEQID NO:49；所述检测rs2860580的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51，以及探针的序列为SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53；所述检测rs2894207的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55，以及探针的序列为SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57；所述检测rs6774494的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59，以及探针的序列为SEQ IDNO:60和SEQ ID NO:61；所述检测rs9510787的上下游引物的序列分别为SEQID NO:62和SEQ ID NO:63，以及探针的序列为SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65；所述检测rs2853668的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:66和SEQ IDNO:67，以及探针的序列为SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69；所述检测rs31489的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71，以及探针的序列为SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73；所述检测rs402710的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75，以及探针的序列为SEQ ID NO:76和SEQID NO:77；所述检测rs4635969的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79，以及探针的序列为SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81；所述检测检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A（GenBank登录号：NC-007605）的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83，以及探针的序列为SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85。
本发明所述的基因芯片是以本发明人基于世界范围内最大规模样本量的鼻咽癌人群和正常对照人群，以及全基因组水平鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究为基础，结合新的独立人群研究发现的鼻咽癌相关易感基因，选择11个单核苷酸多态性位点（SNP）及EBV分型信息进行制备的，针对每个位点的引物和探针序列都是经过特异性筛选的结果。采取受检者外周血、唾液或漱口水来源的基因组DNA，在本发明所述的基因芯片上进行基因分型检测，检测这11个单核苷酸位点以及与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A（GenBank登录号：NC-007605）信息；综合受检者各位点的基因型信息，利用遗传风险计分模型，推测受检者罹患鼻咽癌的风险程度。
具体实施方式
（一）用于鼻咽癌发病风险预测的与鼻咽癌发病显著相关的SNP位点
本发明是基于鼻咽癌人群和正常人对照人群的大规模样本量的鼻咽癌全基因组关联分析，以及全基因组水平鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究（Agenome-wide association study of nasopharyngeal carcinoma identifies three newsusceptibility loci,Jin-Xin Bei et al,Nature Genetics,Volume42,Number7,600-603,July2010）为基础，同时，发明人利用荟萃分析（meta-analysis）的统计学方法对大规模的全基因组关联数据进行整合分析，获得1300个候选SNP位点，并在独立的广东人群队列（2735例鼻咽癌病人和3112例对照）和广西人群队列（790例鼻咽癌病人和1009例对照）中进行验证，结合HapMap、dbSNP等数据库挑选出SNP位点，并进行位点实验成功率评分，从中确定了与鼻咽癌发病显著相关的11个SNP位点。
在发明人所研究的队列中，进行了SNP位点关联分析，挑选的11个位点与鼻咽癌发病关联程度如下表：
表1：
表2：本发明所确定的与鼻咽癌发病显著相关的11个SNP位点的序列
其中，rs1412829位于基因CDKN2A/CDKN2B区域，rs1572072和rs9510787位于基因TNFRSF19区域，rs2860580、rs2894207和rs28421666位于基因HLA区域，rs6774494位于基因MDS1-EVI1区域，rs402710、rs31489位于CLPTM1L区域，rs4635969、rs2853668位于TERT-CLPTM1L区域。
依据EBV序列中的G155391A（GenBank登录号：NC-007605）位点对鼻咽癌高发地区的广东人群（167例鼻咽癌患者和980例正常对照）和鼻咽癌低发地区的山东人群（22例鼻咽癌患者和621例正常对照）所感染的EBV进行分型，发现突变型亚株在鼻咽癌患者中非常显著且导致蛋白一级结构改变，不同EBV亚型与鼻咽癌发病情况关联密切，结果如表3。
表3：
上述SNP位点与鼻咽癌发病风险的预测的关联性将通过以下试剂盒的制备和实验来进行进一步的说明。
（二）用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒
本实施例所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，是通过检测上述的11个SNP位点及EBV分型信息来进行鼻咽癌发病风险预测的试剂盒。
本发明所述的试剂盒包括：检测人基因组的11个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述11个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs9510787、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs31489、rs402710、rs4635969、rs2853668;检测EBV分型的巢氏PCR引物，EBV分型是依据RPMS1基因的多态性进行分型的，多态性位点为G155391A（GenBank登录号：NC-007605）。
一、试剂盒的制备：
1、设计和合成所述SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。
表4：待测SNP位点的PCR扩增引物（PCRP）及单碱基延伸引物（UEP）
所述检测EBV分型序列NC_007605.1155391G/A的巢氏PCR扩增引物初级PCR引物：SEQ ID NO:34GCT GGG TTGA TGC TGT AGA TG；
SEQ ID NO:35AGG GTC TGG ACG TGG AGT TTG；
次级PCR引物：SEQ ID NO:36AGA AGG CGT AGA GCA TGT CCA G；
SEQ ID NO:37GAG TAC GAC TGT GAG GTG GGC G。
2、试剂盒的构建
试剂盒的其他成分包括：Taq酶、dNTP混合液、稀释液、缓冲液等，详见下面的检测方法。
二、检测方法：
1、DNA提取
使用Qiagen DNA midi kit(100)试剂盒或类似产品，提取组织、细胞或血样中的DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用。
2、PCR扩增
PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。
（1）在一个新的1.5ml EP管中配制PCR master mix溶液。
（2）使用24通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入PCR master mix液。该384孔板即为PCR反应板。
（3）取出已经制备好的DNA样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μl，每个5μlPCR反应体系中包含模板DNA20-50ng，Hotstar Taq0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs。
（4）在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。将384孔PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR反应。
3、PCR产物碱性磷酸酶处理
（1）在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP（shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶）处理，以去除体系中游离的dNTPs。
（2）配制碱性磷酸酶处理反应液（SAP Mix）。
| SAP Mix | 对每个反应，μl |
| 水 | 1.53 |
| SAP缓冲液（10x） | 0.17 |
| SAP酶(1.7U/μl) | 0.3 |
| 总体积 | 2 |
（3）使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将SAP Mix加入384孔PCR反应板。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAP混合液2μl(SAP0.5U，buffer0.17μl)。
（4）将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
4、单碱基延伸
（1）在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。
（2）配制单碱基延伸反应液（EXTEND Mix）。
（3）使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTEND Mix液2μl.（其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl）。
（4）将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：
I.94℃，30秒
II.94℃，5秒
III.52℃，5秒
IV.80℃，5秒
V.回到III，4次或以上
VI.回到II，39次或以上
VII.72℃，3分钟
VII.4℃恒定
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
5、树脂纯化
（1）将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；
（2）加16μl水到延伸产物的对应孔内；
（3）将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；
（4）离心使树脂沉入孔底部。
6、芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
7、质谱检测
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF（matrix-assisted laserdesorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱）分析，检测结果使用TYPER4.0软件（sequenom）分型并输出结果。
8、巢氏PCR扩增并检测PCR产物序列
1）初级PCR过程
反应体系：
| 组分 | 体积（μl） |
| 5x Colorless buffer | 5 |
| MgCl2（25mM） | 2 |
| dNTP(10mM) | 0.5 |
| RPMS1初级PCR引物 | 0.5 |
| 人唾液DNA | 2 |
| Go Taq聚合酶 | 0.125 |
| ddH2O | 14.875 |
| 总计 | 25 |
配好反应体系后，上机，在VeritiTMThermal Cycler上进行PCR反应，条件如下：
2）次级PCR
反应体系：
| 组分 | 体积（μl） |
| 5x Green buffer | 10 |
| MgCl2（25mM） | 4 |
| dNTP(10mM) | 1 |
| RPMS1次级PCR引物 | 1 |
| 初级PCR反应产物 | 5 |
| Go Taq聚合酶 | 0.25 |
| ddH2O | 28.75 |
| 总计 | 50 |
配好反应体系后，上机，在VeritiTMThermal Cycler上进行PCR反应，条件如下：
3）电泳及测序
最终的PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察和挑选符合大小片段者的PCR产物进行测序，比对多核甘酸链序列，得到NC_007605.1155391G/A分型情况。
三、结果分析：
对于本发明所述的试剂盒的效果，本发明人通过灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、受试者工作特性（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲线、疾病风险再分类（Reclassification）等对基于遗传因素和环境因素构建的鼻咽癌预测模型的拟合效果进行分析。研究对象为具有完整问卷调查的1387例患者和1459例健康对照，分析结果如下。
鼻咽癌与7个单核苷酸多态性的关联分析：如表5所示，logistic回归的关联分析表明，7个SNP均与鼻咽癌的发病风险相关，其中位于HLA区域的三个SNP位点rs2860580、rs2894207、rs28421666与鼻咽癌关联的OR较高，平均每个等位基因的OR值（95%CI）分别为1.85（1.63-2.09）、1.72(1.46-2.02)、1.54(1.30-1.83)，且趋势线检验P值均小于0.001。
表5：鼻咽癌发病风险和7个SNP的关联分析
风险等位基因/保护性等位基因
每个SNP的比值比在调整年龄、性别、教育程度、方言、居住类型后用logistic回归分析进行评估
发病风险预测模型：如表6所示，三种模型拟合性都很好，其中综合流行病学因素和遗传风险因素的模型拟合度最好，AUC值为0.73。
表6：AUC（曲线下面积）评估基于不同因素的发病风险预测模型
a.流行病学模型结合环境暴露因素（包括咸鱼食用量、新鲜水蔬食用量、吸烟史）和肿瘤家族史；遗传风险模型包括7个SNP分型结果；综合模型整合了受试者的流行病学因素和遗传学因素。
b.依据Hosmer Lemeshow拟合优度检验计算χ2值和P值，χ2值<20(P>0.01)被认为是校正好的的模型。
c.模型中的AUC值以非参数方法比对，P值是以综合模型为基准计算的。
对流行病学模型和综合模型数据再分类：如表7所示，计算得到综合判别改善IDI(integrated discrimination index)为0.05，P<0.001；净再分类改善NRI（netreclassification improvement）为16%，P<0.001，说明模型中增加包含7个SNP位点的遗传因素能更好的预测鼻咽癌发病风险。
表7：流行病学模型和综合模型的数据再分类
特异性和灵敏性：基于本发明所述的7个SNP位点的遗传因素模型的灵敏度为58.18%，比鼻咽癌家族史这一涵盖有部分遗传因素在内的预测模型灵敏度（17.16%）要高41.02个百分点，而包含了流行病学和基于7个SNP位点的遗传因素在内的综合预测模型灵敏度和特异度分别达到了较高的值。
表8：预测鼻咽癌发病风险各因素的灵敏度和特异性
| 模型 | 灵敏度 | 特异度 |
| 基于鼻咽癌家族史模型 | 17.16% | 94.45% |
| 基于环境因素的模型 | 60.71% | 67.17% |
| 流行病学（鼻咽癌家族史和环境因素）模型 | 63.37% | 67.99% |
| 遗传因素模型 | 58.18% | 61.69% |
| 综合模型（流行病学因素和环境因素） | 63.73% | 72.58% |
综上所述，基于本发明所述的试剂盒可应用于鼻咽癌发病风险预测，将所得到鼻咽癌发病的遗传危险系数代入本发明提及的综合考虑模型，即基于咸鱼食用量、新鲜水果蔬菜食用量、吸烟史等环境暴露因素、肿瘤家族史因素及遗传因素的鼻咽癌发病风险预测的综合模型，能够预测个体罹患鼻咽癌的风险。
（三）用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片
本实施例所述的用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片，是通过检测上述的11个SNP位点来进行鼻咽癌发病风险预测的基因芯片。
所述的基因芯片包括：检测人基因组的11个SNP位点的Taqman上下游引物和探针，所述11个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、、rs9510787、rs2853668、rs31489、rs402710、rs4635969；以及检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A（GenBank登录号：NC-007605）的Taqman上下游引物和探针。
本基因芯片除了包含已经报道的7个SNP位点，引入了新的SNP位点，而且特别引入了EBV分型的依据(NC_007605.1155391G/A)。基于此所制备的基因芯片将更有效地用于鼻咽癌发病风险预测。
一、芯片探针设计
1、根据人基因组11个SNP位点和EBV分型序列信息设计taqman上下游引物及探针
（1）对于rs1412829
G1F：CAGGTGTGAAATCTGAGCTGACTAA SEQ ID NO:38
G1R：CACATATCATGCTTTGGGAAACTCT SEQ ID NO:39
Probe1-G1：FAM-TGCCATTCCTCAcGCT-MGB SEQ ID NO:40
Probe2-G1：VIC-CCATTCCTCAtGCTT-MGB SEQ ID NO:41
（2）对于rs1572072
G2F：AGAGGAAAGAGGCACCTTACCC SEQ ID NO:42
G2R：AAGCCGAGAACAGTTAAATTGCA SEQ ID NO:43
Probe1-G2：FAM-CATCCTTCTGTCCTACTT-MGB SEQ ID NO:44
Probe2-G2：VIC-CTTAAGCATCCTTCTTTC-MGB SEQ ID NO:45
（3）对于rs28421666
G2F：AAAAGACTACAAAGACTAATATTACAATTCTGTAAATGTATCTSEQ ID NO:46
G3R：TTCTATCATCTAATTCTAGTCTTCTGAGTGTCAT SEQ ID NO:47
Probe1-G3：FAM-CTTCCTGTTTTCATAAAT-MGB SEQ ID NO:48
Probe2-G3：VIC-TCCTTCCTGTTTTTATAAAT-MGB SEQ ID NO:49
（4）对于rs2860580
G4F:TTCTACACCCAGAGTCACAAACTGTTA SEQ ID NO:50
G4R:TCTCATGAGATCTGATGGTTTTATAAGG SEQ ID NO:51
Probe1-G4:FAM-CCGTCCTTCTTCAcGT-MGB SEQ ID NO:52
Probe2-G4:VIC-CGTCCTTCTTCAtGTG-MGB SEQ ID NO:53
（5）对于rs2894207
G5F：CCTCAGTGTATCAAAGACCTAAATGTGA SEQ ID NO:54
G5R：ACCTAATCCAAAGTCATGAAGATTTATGCTT SEQ ID NO:55
Probe1-G5：FAM-AAGAGTTCTCTAATATTAAGTC-MGB SEQ ID NO:56
Probe2-G5：VIC-AAGAGTTCTCTAATGTTAAGTC-MGB SEQ ID NO:57
（6）对于rs6774494
G6F：ATGACACATTATGCAAGCCAGG SEQ ID NO:58
G6R：AGCGATAAAGATGCAGGACCAT SEQ ID NO:59
Probe1-G6：FAM-CAATATGTCACcAAGCC-MGB SEQ ID NO:60
Probe2-G6：VIC-CAATATGTCACtAAGCC-MGB SEQ ID NO:61
（7）对于rs9510787
G7F：TGACCTGCAACTCTTAGGAATTGT SEQ ID NO:62
G7R：TTCCACCACTCACTTTTTTCTACTAAAT SEQ ID NO:63
Probe1-G7：FAM-TCTTAGAAGACAGCAAG-MGB SEQ ID NO:64
Probe2-G7：VIC-TTAGAAGACAGCGAGCAG-MGB SEQ ID NO:65
（8）对于rs2853668
G8F:TGTGCAGGAAATGGCCATG SEQ ID NO:66
G8R:CTGAAAGCAGCCTCATCTCTCC SEQ ID NO:67
Probe1-G8：FAM-CCATGACAAaACTCAGTAC-MGB SEQ ID NO:68
Probe2-G8：VIC-CATGACAAcACTCAGTAC-MGB SEQ ID NO:69
（9）对于rs31489
G9F：ATGGGGCTGTAGTATGGACGTC SEQ ID NO:70
G9R：GAGGTCACTTGAGCTCAGGAGG SEQ ID NO:71
Probe1-G9：FAM-CTTTAAAAGTaTCTTTTTTGAG-MGB SEQ ID NO:72
Probe2-G9：VIC-CTTTAAAAGTcTCTTTTTTGA-MGB SEQ ID NO:73
（10）对于rs402710
G10F：AAAGCCGTCATTCCGTTCAG SEQ ID NO:74
G10R：CGTGGTGTTTCTGGTCTACCTGTA SEQ ID NO:75
Probe1-G10：FAM-CATACGCAGCTGCA-MGB SEQ ID NO:76
Probe2-G10：VIC-ATACGCAGCCGCAC-MGB SEQ ID NO:77
（11）对于rs4635969
G11F：TTGCTGAAAACCAGCAACAAA SEQ ID NO:78
G11R：CATATTTTAGGCCAGGCTTGGT SEQ ID NO:79
Probe1-G11：FAM-CCAAGAAACAAcGAAA-MGB SEQ ID NO:80
Probe2-G11：VIC-CCAAGAAACAAtGAAA-MGB SEQ ID NO:81
（12）对于G155391A（GenBank登录号：NC-007605）
G12F:CTCCTCCCCTGTCGACCAG SEQ ID NO:82
G12R:CGAGCTCGAGTACGACTGTGAG SEQ ID NO:83
Probe1-G12：FAM-TCCTCCCCCAgACAC-MGB SEQ ID NO:84
Probe2-G12：VIC-TCCTCCCCCAaACAC-MGB SEQ ID NO:85
2、反应试剂的准备
-20度保存试剂：SNP Genotyping Assay Mix(80X*)、AmpliTaq Gold DNA聚合酶、2×Assay Loading Reagent、Assay Loading Reagent。
4度保存试剂：TaqMan Universal PCR Master Mix、Genomic DNA、GT SampleLoading Reagent。
常温保存试剂：无DNA、DNA酶、RNA酶的去离子水；引物；TE（10mMTris HCl,0.1mM EDTA,pH8.0）。
准备10X Assays试剂
依据下表配置50μl10XAssays储存液（可供10次使用）
3、准备样品预混液和样品。
1)在1.5ml离心管中预混表格中的4种样品预混成分，每份样品需要3.48μL预混液。
依据下表配制样品预混液和最终的样品混合液：
2)取2.52μL基因组DNA与3.48μL预混液混合，得到6μL样品混合液。
二、检验方法
采用Fludigm公司的BioMarkTM高通量基因分析系统，它是集成流体通路（Integrated Fluidic Circuit，IFC）技术、实时定量PCR技术及强大的基因分析软件相结合的技术平台。利用集成电路制作工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增，简化了生物样品和试剂的分液操作，提高分析通量和灵敏度，以更少的试剂用量、更低成本达到了更高检出率。在通量、灵敏度、灵活度上均有明显优势。
1.GT192.24芯片的初始化
1)将300μl控制液注入MX收集器
2)去除芯片底部的蓝色保护膜
3)将芯片转入MX收集器，运行Prime(124x)程序
注意事项：打开芯片包装后需要在24小时内使用；请勿将控制液滴入样品孔或试剂孔；初始化完成后，应在60分钟内完成上样操作。
2.芯片进样
1）运行Prime(124x)程序后，将已初始化芯片从MX控制器中取出，加入4μL试剂组（Assay）和5μL样品（Sample）至芯片片中的相应管道。
2）将芯片放回MX控制器中，运行Mix(124x)程序完成进样。
3）用胶带移除芯片表面的灰尘或纤维杂质，制备开始芯片实验。
注意事项：
1）进样之前，分别混匀并离心试剂组和样品组，否则导致数据质量下降。
2）不用的样品通道，加入3.48μL样品预混液和2.52μL水；不用的试剂通道，加入2.5μL试剂上样组分,0.25μL ROX,和2.25μL水。
3）移液时，推压活塞不超出第一个停止位，否则会引起气泡。
4）加入样品后须在4小时之内开始芯片实验
3数据收集（选择试验中涉及的所有探针类型，否则机器将不收集该组数据）
1）双击桌面上的样品收集软件图标，启动软件。
2）点击Start a New Run，确认照相机温度降至-5.0℃，且指示灯为绿色状态。
3）将芯片放入读片机中。
4）点击Load。
5）核定芯片类型和编号。
6）选择正确的项目设置，点击Next。
7）选择新的芯片运行文件（New），浏览确定数据存放位置。点击Next。
8）选择应用类型（Genotyping），外参荧光（ROX），探针类型（FAM-MGB,VIC-MGB），点击Next。
9）点击Browse寻找合适的热循环方案GT192x24Standard v1.pcl。
10）确认选择了自动曝光模式（Auto Exposure）。
11）点击Next。
12）核实芯片运行信息的正确性。
13）点击Start Run开始实验。
三、结果分析
验证样品的结果与原先所作的基因分型结果是否一致，进行统计分析验证基因分型的准确率。
1、基于11个SNP位点和EBV分型信息构建的鼻咽癌发病风险预测模型计算AUC值。结果如表12所示，仅仅根据前期研究（A genome-wide association studyof nasopharyngeal carcinoma identifies three new susceptibility loci,Jin-Xin Bei et al,Nature Genetics,Volume42,Number7,600-603,July2010）报道的7个SNP位点构建的预测模型在267例样品（161例鼻咽癌病人和106例正常对照）中计算AUC值为0.671，增加TERT-CLPTM1L区域的rs402710构建的预测模型值为0.677，增加TERT-CLPTM1L区域的4个SNP位点AUC值为0.684，而依据本发明涵盖的11个SNP位点及EBV分型信息对疾病发生预测效果最佳，AUC值可达0.737。表9：
a.7snps:rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787
b.8snps:rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs402710
c.11snps:rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs31489、rs402710、rs4635969、rs2853668
d.11snps和EBV分型信息:rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs31489、rs402710、rs4635969、rs2853668、NC_007605.1155391
特异性和灵敏性：基于本发明所述的11个SNP位点和EBV的遗传因素模型的灵敏度为87.41%,特异度为53.00%，比单单7SNPs、EBV分型或者11SNPs灵敏度均高约10个百分点，涵盖11SNPs的预测模型与7SNPs的预测模型相比，在灵敏度相同的情况下，包含了基于11个SNP位点的遗传因素在内的预测模型特异度较高，因此，包含了11个SNP位点的遗传因素和EBV分型在内的综合预测模型灵敏度和特异度分别达到了较高的值。
表10：预测鼻咽癌发病风险的灵敏度和特异性
| 模型 | 灵敏度 | 特异度 |
| 7snpsa | 77.78% | 50.00% |
| EBV分型信息b | 77.04% | 51.00% |
| 11snpsc | 77.78% | 52.00% |
| 11snps和EBV分型信息d | 87.41% | 53.00% |
a.7snps:rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787
b.EBV分型信息:NC_007605.1155391
c.11snps:rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs31489、rs402710、rs4635969、rs2853668
d.11snps和EBV分型信息:rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs31489、rs402710、rs4635969、rs2853668、NC_007605.1 155391
2.这里所述的鼻咽癌风险预测模型是基于广东地区男女两性在各年龄组中，鼻咽癌发病率、人群死亡率、全基因组关联分析所得相关SNP位点鼻咽癌相对危险度（OR值）及人群中SNP对应位点的基因型频率，同时结合EBV RMPS1基因位点信息等相关参数，基于R语言而开发的一款鼻咽癌遗传风险计算软件（nasopharyngeal carcinoma Risk Calculator）。通过输入11个位点基因分型及EBV分型数据，选择该个体对应的性别、年龄，程序可返回该个体的鼻咽癌终生发病风险值（life time risk value）。下表为列举的其中4种基因分型情况。本发明所述的11个SNP位点、EBV分型不同分型情况下不同年龄组的个体终生发病风险值（life time risk）分布如下表：
表11：
综上所述，本发明所述的芯片具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，通过芯片检测得到11个SNP位点及EBV分型信息，输入本发明提及的鼻咽癌遗传风险计算软件，结合性别及性别，即可得到个体终生发病风险值，因此基于本发明所述的芯片可应用于鼻咽癌发病风险预测，能够预测个体罹患鼻咽癌的风险，并通过给予高危人群相应咨询及建议如生活习惯的改善、EBV抗体滴度定期的检查等来降低鼻咽癌发病风险。
Claims (6)
1.一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
检测人基因组的11个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述11个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs2853668、rs31489、rs402710和rs4635969。
2.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于：
所述检测rs1412829的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 3；
所述检测rs1572072的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 6；
所述检测rs28421666的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 9；
所述检测rs2860580的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 12；
所述检测rs2894207的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 15；
所述检测rs6774494的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 18；
所述检测rs9510787的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 21；
所述检测rs2853668的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 23，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 24；
所述检测rs31489的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 27；
所述检测rs402710的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 29，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 30；
所述检测rs4635969的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 31和SEQ ID NO: 32，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 33。
3.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于：还包括检测GenBank 登录号为NC-007605的与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的巢式PCR扩增引物。
4.根据权利要求3所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于：所述检测GenBank 登录号为NC-007605的与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的巢式PCR扩增引物的初级PCR引物的序列为SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35，以及次级PCR引物的序列为SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37。
5.一种用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括：
检测人基因组的11个SNP位点的扩增引物和探针，所述11个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs2853668、rs31489、rs402710、rs4635969；以及
检测GenBank 登录号为NC-007605的与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的扩增引物和探针。
6.根据权利要求5所述的用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片，其特征在于：
所述检测rs1412829的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，以及探针的序列为SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41；
所述检测rs1572072的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，以及探针的序列为SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO: 45；
所述检测rs28421666的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47，以及探针的序列为SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
所述检测rs2860580的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51，以及探针的序列为SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53；
所述检测rs2894207的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55，以及探针的序列为SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57；
所述检测rs6774494的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 58和SEQ ID NO: 59，以及探针的序列为SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 61；
所述检测rs9510787的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 62和SEQ ID NO: 63，以及探针的序列为SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 65；
所述检测rs2853668的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 66和SEQ ID NO: 67，以及探针的序列为SEQ ID NO: 68和SEQ ID NO: 69；
所述检测rs31489的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 70和SEQ ID NO: 71，以及探针的序列为SEQ ID NO: 72和SEQ ID NO: 73；
所述检测rs402710的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 74和SEQ ID NO: 75，以及探针的序列为SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 77；
所述检测rs4635969的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 78和SEQ ID NO: 79，以及探针的序列为SEQ ID NO: 80和SEQ ID NO: 81；
所述检测GenBank 登录号为NC-007605的与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 82和SEQ ID NO: 83，以及探针的序列为SEQ ID NO: 84和SEQ ID NO: 85。
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