CN107164534B - 用于检测cdkn2b基因变异的试剂盒及cdkn2b基因变异率的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测方法,具体的,本发明通过采用通过在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测,来定量检测CDKN2B的变异率,与现有技术中常规定量PCR技术必须分为两步或更多步骤,才能获得该基因的变异率相比,本发明的技术方案,操作更简便,节省时间,花费更低,数据更加具有可比性。
Description
技术领域
本发明涉及基因变异率检测方法领域,更具体的,本发明涉及一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒及CDKN2B基因变异率的定量检测方法。
背景技术
CDKN2B(Cyclin-dependent kinase 4inhibitor B)是细胞周期激酶抑制因子,毗邻肿瘤抑制基因CDKN2A,是一个频发突变的区域,这些变异可以在很多肿瘤病例检测到。该基因编码细胞周期激酶抑制因子,与CDK4或CDK6形成复合物,抑制细胞周期激酶的活性,通过控制细胞周期G1的进程,功能蛋白是一种细胞生长调节作用。该基因的表达受到TGFbeta诱导,提示参与TGF beta的生长调控。
目前,CDKN2B基因的检测主要用于临床糖尿病人预测,并且由于很多基于CDK的抗肿瘤药物已经开始临床试验,该基因可以监测药物治疗中的疗效和预后,具有很高的临床应用价值,因此,CDKN2B的突变率检测是目前的研究热点之一。
现有技术中,采用常规定量PCR技术检测CDKN2B的突变率,必须分为两步或更多步骤,才能获得该基因的变异率,使用不方便,花费也高,限制了应用。本文发明的新方法,可以在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测,与现有方法比较,数据更加具有可比性,同时,节省时间和花费。
发明内容
本发明提供了一种高效、简便且特异性和灵敏度高的CDKN2B基因变异率的定量检测方法。
本发明第一方面,提供了一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒,所述试剂盒用于CDKN2B基因变异率的定量检测;其中,所述试剂盒包含一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针。
优选的,所述试剂盒中,一对靶基因特异性引物为突变区引物和保守区引物,所述两条不同荧光标记的探针分别为FAM标记的非突变探针,和vic标记的突变探针;更进一步的优选,所述①突变区引物和vic标记的突变探针的核苷酸序列分别为:
正向引物(Forward Primer):CTTATGCAGTTCCTCACCAAAGTTT;
逆向引物(Reverse Primer):GGATAGGAAGAGAACCGCAAGTT;
vic标记的突变探针(Probe):VIC-AGGCAACAAATCCA-NONE;
所述②保守区引物和FAM标记的非突变探针为如下产品:
Assay ID Hs03922281_s1,
Catalog#4426961,
ABI PRODUCT USA。
本发明另一方面提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测检测方法,包括以下步骤:
(1)提取CDKN2B基因组DNA作为模板;
(2)向反应体系中加入PCR预混合液,权利要求1~3任一项所述的一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针和DNA模板进行定量PCR;
(3)检测步骤(3)突变区和非突变区的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数(CT值);
(4)根据步骤(4)突变区和非突变区CT值计算变异系数,即变异系数(%)=突变CT值/非突变CT值x100。
上述方法中,优选,步骤(1)DNA的提取采用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen产品),按照说明书指引提取血液或组织DNA,鉴定DNA浓度和质量,-20℃存储备用;进一步的,优选,步骤(2)反应条件为:i)、50℃,2分钟;ii)、95℃,10分钟;iii)、95℃,15秒;iv)、59℃,1分钟;其中iii)和iv)进行45个循环;并且所述的PCR预混合液为2x Master mix。
在本发明的另一个更优选的实施方式中,提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测检测方法,包括以下步骤:
(1)提取CDKN2B基因组DNA:用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen产品),按照说明书指引提取血液或组织DNA;
(2)定量PCR:
反应体系:
引物(Primer)-M F(50nM):0.5ul
引物(Primer)-M R(50nM):0.5ul
探针(Probe)-MP(250nM):0.5ul
Hs03922281_s1:1.0ul
模板DNA(10-20ng/ml):10ul
去离子水:7.5ul
总反应体积=40ul
反应条件:i)、50℃,2分钟;ii)、95℃,10分钟;iii)、95℃,15秒;iv)、59℃,1分钟;其中iii)和iv)进行45个循环。
(3)检测结果:变异系数(%)=突变CT值/非突变CT值x100。
本发明所提供的的CDKN2B基因变异率的定量检测方法的检测结果判定方法如下:
反应是由一套标记了不同荧光的探针和引物组成,在检索方案中,先由一对引物加不易发生变异区的荧光标记探针(例如,优选FAM标记的非突变探针,更优选为试验码(Assay ID):Hs03922281_s1,登记号(Catalog#):4426961,ABI产品(ABI PRODUCT USA))检测总CDKN2B表达水平,同时,另外一个不同荧光标记探针(例如优选vic标记的突变探针)位于变异区,如果发生变异,变异区探针不能结合扩增产物,计数降低,最后,通过变异区与稳定区计数差异和比值,计算出该基因的变异率。
变异率(%)=(稳定区总基因计数-变异区基因计数)x 100/稳定区总基因计数。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:本发明提供的试剂盒检测灵敏度高;本发明所提供的CDKN2B基因变异率的定量检测方法可以在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测,与现行方法比较,数据更加具有可比性,检测结果准确率更高,同时,节省时间和花费。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步,应当理解,以下实施例仅用于说明本发明,而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1CDKN2B基因变异率的定量检测方法
(1)提取CDKN2B基因组DNA:用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen产品),按照说明书指引提取血液或组织DNA;
(2)定量PCR:
反应体系:
引物(Primer)-M F(50nM):0.5ul
引物(Primer)-M R(50nM):0.5ul
探针(Probe)-MP(250nM):0.5ul
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总反应体积=40ul
反应条件为:i)、50℃,2分钟;ii)、95℃,10分钟;iii)、95℃,15秒;iv)、59℃,1分钟;其中iii)和iv)进行45个循环。
(3)检测结果:变异系数(%)=突变CT值/非突变CT值x100。
当变异系数大于正常人对照3倍以上者为异常。
上述诊断结果可以用于具有消化道,泌尿系统恶性肿瘤的辅助性诊断。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于CDKN2B基因变异率的定量检测;其中,所述试剂盒包含一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针;
所述一对靶基因特异性引物为突变区引物和保守区引物,所述两条不同荧光标记的探针分别为FAM标记的非突变探针,和vic标记的突变探针;
其中,
①突变区引物和vic标记的突变探针的核苷酸序列分别为:
正向引物:CTTATGCAGTTCCTCACCAAAGTTT;
逆向引物:GGATAGGAAGAGAACCGCAAGTT;
vic标记的突变探针:VIC-AGGCAACAAATCCA-NONE;
②保守区引物和FAM标记的非突变探针为如下产品:
试验代码为 Hs03922281_s1,
登记号: 4426961,
ABI产品。
2.一种权利要求1所述的检测CDKN2B基因变异的试剂盒在制备CDKN2B基因变异率的定量检测产品中的应用,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取CDKN2B基因组DNA作为模板;
(2)向反应体系中加入PCR预混合液:权利要求1所述的一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针和DNA模板进行定量PCR;
(3)检测步骤(2)突变区和非突变区的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数,作为CT值;
(4)根据步骤(3)突变区和非突变区CT值计算变异系数,即变异系数(%)= 突变区CT值/非突变区CT值x 100。
3.根据权利要求2所述的应用,其中,步骤(1)DNA的提取采用DNeasy血液和组织试剂盒,按照说明书指引提取血液或组织DNA,鉴定DNA浓度和质量,-20℃存储备用。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤(2)向反应条件为i)、50℃,2 分钟;ii)、95℃,10 分钟;iii)、95℃,15 秒;iv)、59℃ , 1分钟;其中iii)和iv)进行 45个循环。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的PCR预混合液为2 x Master mix。
6.根据权利要求2所述的应用,包括以下步骤:
(1)提取CDKN2B基因组DNA,用DNeasy血液和组织试剂盒,按照说明书指引提取血液或组织DNA;
(2)定量PCR:
反应体系:
PCR预混合液选用2 x Master mix: 20ul
引物-M F 50nM: 0.5ul
引物-M R 50nM: 0.5ul
探针-MP 250nM: 0.5ul
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模板 DNA 10-20ng/ml: 10ul
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总反应体积=40ul
反应条件为:i)、50℃,2 分钟;ii)、95℃,10 分钟;iii)、95℃,15 秒;iv)、59℃ , 1分钟;其中iii)和iv)进行 45个循环;
(3)检测结果:变异系数(%)= 突变CT值/非突变CT值x100。
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TA01 | Transfer of patent application right | ||
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