CN107164534B - 用于检测cdkn2b基因变异的试剂盒及cdkn2b基因变异率的定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测方法，具体的，本发明通过采用通过在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测，来定量检测CDKN2B的变异率，与现有技术中常规定量PCR技术必须分为两步或更多步骤，才能获得该基因的变异率相比，本发明的技术方案，操作更简便，节省时间，花费更低，数据更加具有可比性。

Description

用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒及CDKN2B基因变异率的定 量检测方法
技术领域
本发明涉及基因变异率检测方法领域，更具体的，本发明涉及一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒及CDKN2B基因变异率的定量检测方法。
背景技术
CDKN2B(Cyclin-dependent kinase 4inhibitor B)是细胞周期激酶抑制因子，毗邻肿瘤抑制基因CDKN2A，是一个频发突变的区域，这些变异可以在很多肿瘤病例检测到。该基因编码细胞周期激酶抑制因子，与CDK4或CDK6形成复合物，抑制细胞周期激酶的活性，通过控制细胞周期G1的进程，功能蛋白是一种细胞生长调节作用。该基因的表达受到TGFbeta诱导，提示参与TGF beta的生长调控。
目前，CDKN2B基因的检测主要用于临床糖尿病人预测，并且由于很多基于CDK的抗肿瘤药物已经开始临床试验，该基因可以监测药物治疗中的疗效和预后，具有很高的临床应用价值，因此，CDKN2B的突变率检测是目前的研究热点之一。
现有技术中，采用常规定量PCR技术检测CDKN2B的突变率，必须分为两步或更多步骤，才能获得该基因的变异率，使用不方便，花费也高，限制了应用。本文发明的新方法，可以在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测，与现有方法比较，数据更加具有可比性，同时，节省时间和花费。
发明内容
本发明提供了一种高效、简便且特异性和灵敏度高的CDKN2B基因变异率的定量检测方法。
本发明第一方面，提供了一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒，所述试剂盒用于CDKN2B基因变异率的定量检测；其中，所述试剂盒包含一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针。
优选的，所述试剂盒中，一对靶基因特异性引物为突变区引物和保守区引物，所述两条不同荧光标记的探针分别为FAM标记的非突变探针，和vic标记的突变探针；更进一步的优选，所述①突变区引物和vic标记的突变探针的核苷酸序列分别为：
正向引物(Forward Primer)：CTTATGCAGTTCCTCACCAAAGTTT；
逆向引物(Reverse Primer)：GGATAGGAAGAGAACCGCAAGTT；
vic标记的突变探针(Probe)：VIC-AGGCAACAAATCCA-NONE；
所述②保守区引物和FAM标记的非突变探针为如下产品：
Assay ID Hs03922281_s1，
Catalog#4426961，
ABI PRODUCT USA。
本发明另一方面提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测检测方法，包括以下步骤：
(1)提取CDKN2B基因组DNA作为模板；
(2)向反应体系中加入PCR预混合液，权利要求1～3任一项所述的一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针和DNA模板进行定量PCR；
(3)检测步骤(3)突变区和非突变区的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数(CT值)；
(4)根据步骤(4)突变区和非突变区CT值计算变异系数，即变异系数(％)＝突变CT值/非突变CT值x100。
上述方法中，优选，步骤(1)DNA的提取采用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen产品)，按照说明书指引提取血液或组织DNA，鉴定DNA浓度和质量，-20℃存储备用；进一步的，优选，步骤(2)反应条件为：i)、50℃，2分钟；ii)、95℃，10分钟；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分钟；其中iii)和iv)进行45个循环；并且所述的PCR预混合液为2x Master mix。
在本发明的另一个更优选的实施方式中，提供了一种CDKN2B基因变异率的定量检测检测方法，包括以下步骤：
(1)提取CDKN2B基因组DNA：用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen产品)，按照说明书指引提取血液或组织DNA；
(2)定量PCR：
反应体系：
PCR预混合液选用2x Master mix(
Figure BDA0001343974480000031
Universal PCR Master Mix,ABI):20ul
引物(Primer)-M F(50nM):0.5ul
引物(Primer)-M R(50nM):0.5ul
探针(Probe)-MP(250nM):0.5ul
Hs03922281_s1:1.0ul
模板DNA(10-20ng/ml):10ul
去离子水:7.5ul
总反应体积＝40ul
反应条件：i)、50℃，2分钟；ii)、95℃，10分钟；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分钟；其中iii)和iv)进行45个循环。
(3)检测结果：变异系数(％)＝突变CT值/非突变CT值x100。
本发明所提供的的CDKN2B基因变异率的定量检测方法的检测结果判定方法如下：
反应是由一套标记了不同荧光的探针和引物组成，在检索方案中，先由一对引物加不易发生变异区的荧光标记探针(例如，优选FAM标记的非突变探针，更优选为试验码(Assay ID)：Hs03922281_s1，登记号(Catalog#)：4426961，ABI产品(ABI PRODUCT USA))检测总CDKN2B表达水平，同时，另外一个不同荧光标记探针(例如优选vic标记的突变探针)位于变异区，如果发生变异，变异区探针不能结合扩增产物，计数降低，最后，通过变异区与稳定区计数差异和比值，计算出该基因的变异率。
变异率(％)＝(稳定区总基因计数-变异区基因计数)x 100/稳定区总基因计数。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供的试剂盒检测灵敏度高；本发明所提供的CDKN2B基因变异率的定量检测方法可以在一个反应体系内完成CDKN2B表达水平和突变率两个指标的检测，与现行方法比较，数据更加具有可比性，检测结果准确率更高，同时，节省时间和花费。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步，应当理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1CDKN2B基因变异率的定量检测方法
(1)提取CDKN2B基因组DNA：用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen产品)，按照说明书指引提取血液或组织DNA；
(2)定量PCR：
反应体系：
PCR预混合液选用2x Master mix(
Figure BDA0001343974480000041
Universal PCR Master Mix,ABI):20ul
引物(Primer)-M F(50nM):0.5ul
引物(Primer)-M R(50nM):0.5ul
探针(Probe)-MP(250nM):0.5ul
Hs03922281_s1:1.0ul
模板DNA(10-20ng/ml):10ul
去离子水:7.5ul
总反应体积＝40ul
反应条件为：i)、50℃，2分钟；ii)、95℃，10分钟；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分钟；其中iii)和iv)进行45个循环。
(3)检测结果：变异系数(％)＝突变CT值/非突变CT值x100。
当变异系数大于正常人对照3倍以上者为异常。
上述诊断结果可以用于具有消化道，泌尿系统恶性肿瘤的辅助性诊断。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于CDKN2B基因变异率的定量检测；其中，所述试剂盒包含一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针；
所述一对靶基因特异性引物为突变区引物和保守区引物，所述两条不同荧光标记的探针分别为FAM标记的非突变探针，和vic标记的突变探针；
其中，
①突变区引物和vic标记的突变探针的核苷酸序列分别为：
正向引物：CTTATGCAGTTCCTCACCAAAGTTT；
逆向引物：GGATAGGAAGAGAACCGCAAGTT；
vic标记的突变探针：VIC-AGGCAACAAATCCA-NONE；
②保守区引物和FAM标记的非突变探针为如下产品：
试验代码为 Hs03922281_s1，
登记号： 4426961，
ABI产品。
2.一种权利要求1所述的检测CDKN2B基因变异的试剂盒在制备CDKN2B基因变异率的定量检测产品中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取CDKN2B基因组DNA作为模板；
（2）向反应体系中加入PCR预混合液：权利要求1所述的一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针和DNA模板进行定量PCR；
（3）检测步骤（2）突变区和非突变区的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数，作为CT值；
（4）根据步骤（3）突变区和非突变区CT值计算变异系数，即变异系数（%）= 突变区CT值/非突变区CT值x 100。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，步骤（1）DNA的提取采用DNeasy血液和组织试剂盒，按照说明书指引提取血液或组织DNA，鉴定DNA浓度和质量，-20℃存储备用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）向反应条件为i）、50℃，2 分钟；ii）、95℃，10 分钟；iii）、95℃，15 秒；iv）、59℃ ， 1分钟；其中iii）和iv）进行 45个循环。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的PCR预混合液为2 x Master mix。
6.根据权利要求2所述的应用，包括以下步骤：
（1）提取CDKN2B基因组DNA，用DNeasy血液和组织试剂盒，按照说明书指引提取血液或组织DNA；
（2）定量PCR：
反应体系：
PCR预混合液选用2 x Master mix: 20ul
引物-M F 50nM: 0.5ul
引物-M R 50nM: 0.5ul
探针-MP 250nM: 0.5ul
Hs03922281_s1: 1.0ul
模板 DNA 10-20ng/ml: 10ul
水: 7.5ul
总反应体积=40ul
反应条件为：i）、50℃，2 分钟；ii）、95℃，10 分钟；iii）、95℃，15 秒；iv）、59℃ ， 1分钟；其中iii）和iv）进行 45个循环；
（3）检测结果：变异系数（%）= 突变CT值/非突变CT值x100。
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