CN113373212A - 基于mbmca基因诊断g6pd缺乏症的技术研发平台 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，步骤一、以位点c.95A>G为例，用Primerpremier5.0软件结合Oligo6.0软件设计扩增片段在109bp引物，采用不对称反应体系，包括0.2μL的DNA聚合酶，5μL的10×PCRBuffer，300μM的dNTP，上游引物20nM，下游引物1μM，探针浓度100nM，2μL的DNA，补水至25μL；步骤二、在Bio‑RadCFX96Touch荧光定量PCR按照如下条件进行扩增；步骤三、基于分子信标探针熔解曲线分析，设计双管四色荧光探针的G6PD缺陷基因检测试剂盒；步骤四、随机选取志愿者共80人，构建各种缺陷等位基因的CRS人群，其中男女各占一半,可通过本发明的使用对G6PD基因进行评估，从而减少G6PD缺乏症的临床症状危害。
Description
技术领域
本发明属于医疗技术领域，具体涉及基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症简称G6PD缺乏症，也称“蚕豆病”，是“经典”的X染色体连锁不完全显性遗传病，有着典型的地域性特征和遗传性特征。据统计，全国新生儿G6PD缺乏症的平均发病率为0.77％，我国内主要分布在南部：广西，广东，云南等地，其中广西是该病的高发区之一，因此疾病筛查是我国对该病预防的一个重要环节。
目前全世界已发现约150种G6PD基因缺陷等位基因，其分布具有明显的种族和地域异质性该病主要分布于南纬10°至北纬30°区域内的热带和亚热带地区。常发于泰国，越南，中国南部等地，该病覆盖地区广泛，我国是G6PD缺乏症的高发区之一，迄今为止在东南亚人群中发现的30余种G6PD缺陷等位基因，在我国人群中发现的缺陷等位基因就有24种。
目前市场上的G6PD基因缺陷症检测试剂盒只检测3种基因缺陷。本发明基于MBMCA技术，创设一个可对中国G6PD基因缺陷的8种基因缺陷全覆盖检测的检测试剂盒，弥补中国现市场上的G6PD检测试剂盒检测范围上的不足。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，可对中国G6PD基因缺陷的8种基因缺陷全覆盖检测的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，包括以下步骤：
步骤一、以位点c.95A>G为例，用Primerpremier5.0软件结合Oligo6.0软件设计扩增片段在109bp引物，采用不对称反应体系，包括0.2μL的DNA聚合酶，5μL的10×PCRBuffer，300μM的dNTP，上游引物20nM，下游引物1μM，探针浓度100nM，2μL的DNA，补水至25μL；
步骤二、在Bio-RadCFX96Touch荧光定量PCR按照如下条件进行扩增；
步骤三、基于分子信标探针熔解曲线分析，设计双管四色荧光探针的G6PD缺陷基因检测试剂盒；
步骤四、随机选取志愿者共80人，构建各种缺陷等位基因的CRS人群，其中男女各占一半；
步骤五、志愿者的检测，并得出数据；
步骤六、运用EpiData3.1软件双录入方式建立数据库，运用SPSS26.0软件对数据进行统计分析；
步骤七、数据结果的判定。
优选的，步骤五中，检测方法为所有志愿者要求在清晨空腹情况下，应用含有乙二胺四乙酸二钠(EDTA-K2)抗凝管采集外周肘正中静脉全血样本,置于离心机并以3000r/min离心5min,此时见管内形成血清和红细胞两部分(上部分为血清，下部分为血红细胞)，用移液器抽吸并去掉上层血清液，随后微量移液器吸取压积红细胞20μL，加入1mL去离子水(稀释51倍)，吹打充分混匀，常温下待红细胞完全溶解(约15-30min)，应用G6PD测定试剂盒(上海执诚生物科技有限公司提供)，严格按照试剂说明书操作，采用日立7600-series全自动生化分析仪进行G6PD酶活性测定。
优选的，志愿者的选取标准：
A.在某某市生活1年及以上；
B.在被调查医院建立有出生档案；
C.家族三代均在本地生活；
D.年龄均未满18周岁；
E.研究对象均自愿参与并签署知情同意书。
优选的，步骤六中，数据的分析采用百分比(％)描述，计量统计学资料采用均值±方差描述，影响因素采用Pearsonχ2检验和二项logistic回归分析法分析，均以α＝0.05为检验水准，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
优选的，分析研究方法有标本采集、DNA提取、标签SNP位点挑选、
SNP分型、高分辨熔解曲线SNP分型、数据分析、G6PD酶学筛查和统计学分析。
优选的，运用了四色荧光探针法标记，具有可面向广大人群、数据结果可靠优点。
优选的，步骤七中，判定标准：正常成年人G6PD活性的参考范围(＞18岁)：＞1300U/L，青少年组(＜18岁)：＞1500U/L。
优选的，选取志愿者的方式为在某某市的辖区中随机抽取3个城区，再将城区内所有公立医院进行编号，随机抽取2家医院，共计4家医院。
优选的，红细胞完全溶解的时间为15-30min。
与现有技术相比，本发明提供了基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，具备以下有益效果：
1、可通过本发明的使用对G6PD基因进行评估，从而减少G6PD缺乏症的临床症状危害；
2、G6PD缺陷等位基因有着抵抗恶性疟原虫感染的具体防护作用，可通过G6PD的基因检测进一步研究抵抗恶性疟原虫的方法，具有极大的临床意义；
3、本发明运用了
DNA质谱分析系统平台并结合MBMCA技术，通过生物信息学分析，明晰不同种族的G6PD缺陷等位基因的基因流而研发的一款新型G6PD基因缺陷检测试剂盒，填补了目前医院对G6PD基因检测种类的空白，拓宽了基因检测面，为人们提供一份基于基因检测结果而定制的个性化健康管理方案预防指南，有效预防G6PD缺陷症，并有效降低由G6PD缺陷症引发的一系列疾病的发生概率；
4、本发明所研发的是能检测到8种基因突变类型的新型G6PD基因检测试剂盒，比现市场上常用的G6PD检测试剂盒多出5种基因缺陷检测，扩大了基因检测范围；
5、本发明可对具有G6PD缺乏症突变的直系亲属提供保障，直系亲属可进行检测；在医院的体检中，血检未能提供关于G6PD的具体相关检测，本发明可对G6PD基因缺乏产生具体临床结论；
6、本发明的G6PD缺乏症基因检测试剂盒具有可靠的理论支持，且具有独特的双管四色荧光探针技术，在当患者出现G6PD缺陷综合征临床症状时，医院不具备检测G6PD基因技术时，通过此G6PD缺乏症基因检测试剂盒可快速高效准确的做出G6PD基因检测的结果，并进行下一步的对症治疗，且在患者未出现临床症状之前，可让患者提前预知风险，制定方案减少G6PD缺陷综合征出现的几率。
该装置中未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现，本发明结构科学合理，使用安全方便，为人们提供了很大的帮助。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：
图1为本发明提出的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台技术方案：基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，包括以下步骤：
步骤一、以位点c.95A>G为例，用Primerpremier5.0软件结合Oligo6.0软件设计扩增片段在109bp引物，采用不对称反应体系，包括0.2μL的DNA聚合酶，5μL的10×PCRBuffer，300μM的dNTP，上游引物20nM，下游引物1μM，探针浓度100nM，2μL的DNA，补水至25μL；
步骤二、在Bio-RadCFX96Touch荧光定量PCR按照如下条件进行扩增；
步骤三、基于分子信标探针熔解曲线分析，设计双管四色荧光探针的G6PD缺陷基因检测试剂盒；
步骤四、随机选取志愿者共80人，构建各种缺陷等位基因的CRS人群，其中男女各占一半；
步骤五、志愿者的检测，并得出数据；
步骤六、运用EpiData3.1软件双录入方式建立数据库，运用SPSS26.0软件对数据进行统计分析；
步骤七、数据结果的判定。
本发明中，优选的，步骤五中，检测方法为所有志愿者要求在清晨空腹情况下，应用含有乙二胺四乙酸二钠(EDTA-K2)抗凝管采集外周肘正中静脉全血样本,置于离心机并以3000r/min离心5min,此时见管内形成血清和红细胞两部分(上部分为血清，下部分为血红细胞)，用移液器抽吸并去掉上层血清液，随后微量移液器吸取压积红细胞20μL，加入1mL去离子水(稀释51倍)，吹打充分混匀，常温下待红细胞完全溶解(约15-30min)，应用G6PD测定试剂盒(上海执诚生物科技有限公司提供)，严格按照试剂说明书操作，采用日立7600-series全自动生化分析仪进行G6PD酶活性测定。
本发明中，优选的，志愿者的选取标准：
A.在某某市生活1年及以上；
B.在被调查医院建立有出生档案；
C.家族三代均在本地生活；
D.年龄均未满18周岁；
E.研究对象均自愿参与并签署知情同意书。
本发明中，优选的，步骤六中，数据的分析采用百分比(％)描述，计量统计学资料采用均值±方差描述，影响因素采用Pearsonχ2检验和二项logistic回归分析法分析，均以α＝0.05为检验水准，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
本发明中，优选的，分析研究方法有标本采集、DNA提取、标签SNP位点挑选、
SNP分型、高分辨熔解曲线SNP分型、数据分析、G6PD酶学筛查和统计学分析。
本发明中，优选的，运用了四色荧光探针法标记，具有可面向广大人群、数据结果可靠优点。
本发明中，优选的，步骤七中，判定标准：正常成年人G6PD活性的参考范围(＞18岁)：＞1300U/L，青少年组(＜18岁)：＞1500U/L。
本发明中，优选的，选取志愿者的方式为在某某市的辖区中随机抽取3个城区，再将城区内所有公立医院进行编号，随机抽取2家医院，共计4家医院。
本发明中，优选的，红细胞完全溶解的时间为15-30min。
本发明G6PD缺乏症即“蚕豆病”，是“经典”的X染色体连锁不完全显性遗传病，是重要的出生缺陷疾病之一，为避免下一代出生出现G6PD缺陷症，本发明可应用于夫妻婚检。
实施例一
基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，包括以下步骤：
步骤一、以位点c.95A>G为例，用Primerpremier5.0软件结合Oligo6.0软件设计扩增片段在109bp引物，采用不对称反应体系，包括0.2μL的DNA聚合酶，5μL的10×PCRBuffer，300μM的dNTP，上游引物20nM，下游引物1μM，探针浓度100nM，2μL的DNA，补水至25μL；
步骤二、在Bio-RadCFX96Touch荧光定量PCR按照如下条件进行扩增；
步骤三、基于分子信标探针熔解曲线分析，设计双管四色荧光探针的G6PD缺陷基因检测试剂盒；
步骤四、随机选取志愿者共80人，构建各种缺陷等位基因的CRS人群，其中男女各占一半；
步骤五、志愿者的检测，并得出数据；
步骤六、运用EpiData3.1软件双录入方式建立数据库，运用SPSS26.0软件对数据进行统计分析；
步骤七、数据结果的判定。
本发明中，优选的，步骤五中，检测方法为所有志愿者要求在清晨空腹情况下，应用含有乙二胺四乙酸二钠(EDTA-K2)抗凝管采集外周肘正中静脉全血样本,置于离心机并以3000r/min离心5min,此时见管内形成血清和红细胞两部分(上部分为血清，下部分为血红细胞)，用移液器抽吸并去掉上层血清液，随后微量移液器吸取压积红细胞20μL，加入1mL去离子水(稀释51倍)，吹打充分混匀，常温下待红细胞完全溶解(约15-30min)，应用G6PD测定试剂盒(上海执诚生物科技有限公司提供)，严格按照试剂说明书操作，采用日立7600-series全自动生化分析仪进行G6PD酶活性测定。
本发明中，优选的，志愿者的选取标准：
A.在某某市生活1年及以上；
B.在被调查医院建立有出生档案；
C.家族三代均在本地生活；
D.年龄均未满18周岁；
E.研究对象均自愿参与并签署知情同意书。
本发明中，优选的，步骤六中，数据的分析采用百分比(％)描述，计量统计学资料采用均值±方差描述，影响因素采用Pearsonχ2检验和二项logistic回归分析法分析，均以α＝0.05为检验水准，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
本发明中，优选的，分析研究方法有标本采集、DNA提取、标签SNP位点挑选、
SNP分型、高分辨熔解曲线SNP分型、数据分析、G6PD酶学筛查和统计学分析。
检测方法所有志愿者当日清晨采取空腹静脉血3mL，EDTA-K2抗凝，2～8°冰箱保存，在3000r/min条件下，离心5min，去掉上清液，吸取压积红细胞20μL加入1mL去离子水(稀释51倍)，充分混匀待红细胞完全溶解后(约15-30min)应用全自动生化分析仪采用酶速率法测定。
1.1判定标准：正常成年人G6PD活性的参考范围(＞18岁)：＞1300U/L，青少年组(＜18岁)：＞1500U/L。
1.2统计学处理用SPSS23.0统计学软件进行处理数据。计数资料以率(％)表示，采用2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
1.3DNA的提取步骤
(1)实验准备：将WB洗涤液W1加入无水乙醇,WB洗涤液W2加入19mL无水乙醇，充分颠倒混匀后直接使用。
(2)取1.5mL容积的洁净离心管，用移液器抽取500μLWB裂解液LB并加入离心管内。
(3)分别对离心管进行样本编号标记，待样本充分复融，分别对应样本号依次加入抗凝全血样本200μL，剧烈旋涡10～20秒(注：血液样本的适宜用量为50～200μL。若存在样本不足的情况，可适当减少样本的用量，最低至50μL；若需要更多的DNA，建议将样本用量增加至200μL。增加或减少血液用量时，无需改变步骤4～8中的溶液用量；且为能充分裂解细胞以释放DNA，样本与WB裂解液LB需彻底均匀，建议剧烈漩涡时间达20秒为宜)。
(4)短暂离心，采用移液器向上述每个样本中加入100μLWB沉淀液PB,剧烈涡旋10-20秒(建议剧烈涡旋20秒使蛋白充分沉淀)。
(5)将离心管放入离心机并以12000rpm离心5min后，从离心机上取下离心管，此时上清液可能会出现轻微颜色变化，但不会影响DNA的纯化效果。
(6)小心转移上清液至套进收集管的WB离心柱的凹缝下方，将收集管放入离心机并以12000rpm离心30秒。
(7)从离心机上谨慎取下WB收集管，弃去滤液。将WB离心柱重新套进WB收集管，用移液器抽取并加入500μLWB洗涤液W1至WB离心柱的凹缝下方，再次放入离心机并以12000rpm离心30秒(注：此时首先确认WB洗涤液W1已加入无水乙醇，若未添加无水乙醇，提取到的DNA产量将会严重降低)。
(8)再次小心取下WB收集管，丢弃滤液。WB离心柱重新套进WB收集管，加入500μLWB洗涤液W2至WB离心柱的凹缝下方，置于离心机并以12000rpm离心30秒(注：再次确认WB洗涤液W2已加入无水乙醇，若未添加无水乙醇，可能无法提取到DNA)。
(9)按照第8步的操作流程重复操作一次。
(10)从离心机上小心取下WB收集管，弃滤液。再次用WB离心柱重新套进WB收集管，再以12000rpm离心2分钟(注：此步骤的作用是达到干燥DNA的目的，遗漏或忽略此步骤将可能严重影响后续实验)。
(11)小心取出WB离心柱，套进1.5mL干净离心管中，用移液器抽取并加入200μLWB洗脱液EB(10MmTris-HC1,PH8.5)至膜中心，室温下放置1分钟，然后置于离心机以12000rpm离心1分钟(注：若较高的的PH值不利于后续实验，可用PH值不低于7.5的去离子水代替WB洗脱液EB；若DNA需要长期保存，建议使用PH8.0的TE洗脱。将WB洗脱液EB预热至60～70℃有利于提高DNA的回收率，若需要提高回收效率，可分两次洗脱)。
(12)从离心机上小心取出WB离心柱，1.5mL离心管底部即是DNA溶液。该DNA溶液可直接用于后续实验，或将该溶液进行分装短期保存于4℃冰箱内，若长期保存则置于-80℃超低温冰箱内待测。
1.4SNPscanTM多重SNP分型
1.4.1实验试剂
SNPscanTM分型试剂盒；琼脂糖；溴化乙啶；溴酚兰；HI-DI；GeneScanTM-500。
1.4.2纳入检测的突变位点
共纳入35种G6PD基因突变位点：c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.1024C>T、c.871G>A、c.1004C>A、c.406C>T、c.592C>T、c.1311C>T、c.1365-13T>C、c.703C>T、c.487G>A、392G>T、c.196T>A、c.1360C>T、c.519C>T、c.202G>A、c.442G>A、c.1339G>A、c.1381G>A、c.1225C>T、c.1159C>T、c.1414A>C、c.493A>G、c.371A>G、c.1160G>A、c.517T>C、c.563C>T、c.1340G>T、c.1387C>T、c.274C>T、c.691G>C、c.143T>C、c.473G>A及c.835A>G。
1.4.3待测样本预处理
(1)DNA样本的质量检查以及浓度估算
用微量移液器抽取1μL待检DNA样本，在配置的1％琼脂糖电泳对其进行质量检查以及浓度估计，因检测大部分样本DNA的浓度已达到30～50ng/μL,故DNA不再进行稀释。
(2)样本裂解
用微量移液器抽取4μL样本，分别加入2.5μL4xDNAlysisBuffer,抽取水并用水补足至10μL，盖膜进行震荡充分混匀，然后12000rpm离心2分钟，在PCR仪上98℃5分钟，立即冰置。
1.4.4连接反应过程
分别对冰置的降解DNA样本加入10μl上述连接反应预混合液,盖上盖膜，轻微震荡混匀后置于离心机以3000rpm离心0.5分钟，然后立即(越快越好)将离心后96孔板放置PCR仪上，去除盖膜，盖上96孔橡胶盖垫，盖好PCR仪热盖，接着按以下程序运行：
第一步：在98℃将体系预变性2分钟；第二步(5个循环)：每个循环由95℃变性1分钟到58℃退火3小时；第三步：由94℃变性2分钟到72℃保持。
反应产物尽量在运行到72℃温浴时，如果需要立即(越快越好)进行下一步实验，则取下冰置待用，否则，立即在-20℃冰箱下保存，在进行下一步实验时，先4℃解冻10分钟，然后冰置待用。
1.4.5多重荧光PCR反应过程
(1)针对每个位点设计3条探针引物序列：包括2条5’端鉴别探针和1条3’端探针，其5’端探针序列由一段通用引物序列、等位基因鉴别引物序列、位点5’侧特异性序列以及对应不同等位基因的3’末端碱基组成，3’端探针序列由位点3’侧特异性序列、位点鉴别连接序列、3’端通用引物序列或加接连接反应特异探针序列。两个等位基因特异性鉴别序列与通用引物连接生成；
(2)将高温处理后的短片段基因组DNA与探针混合物变性复性，各探针与对应模板进行配对；
(3)加入连接酶反应体系，配对在同一模板上的紧邻探针在连接酶作用下进行特异性连接，产生连接产物；PCR扩增反应体系扩增总体积为20μL，包括2×PCRMasterMix10μL、PrimerMixⅠorⅡ1μL，LigationProduct1μL,剩余部分添加灭菌的双蒸水补足至20μL；
(4)利用带荧光标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增，不同长度的扩增产物利用荧光毛细管电泳获得分离；
PCR扩增反应程序
第一步：95℃预变性2分钟；第二步(9个循环)：94℃变性20秒、62℃退火40秒、72℃延伸1.5分钟；第三步(25个循环)：94℃变性20秒、57℃退火40秒、72℃延伸1.5秒；68℃延伸60分钟、4℃保存。
(5)通过对荧光毛细管电泳数据文件中不同长度的连接产物峰谱的分析确定不同位点的基因型；
(6)多重位点分型的实现：通过改变位点鉴别序连接序列的长度来获取相应连接长度的连接产物，实现多个位点的检测；通过加接连接反应可进一步增加连接产物不同长度的范围从而实现更多位点的检测；通过改变探针中通用引物序列，随后采用不同荧光标记的通用PCR引物进行扩增从而进一步增加检测位点的数目。
(7)PCR产物鉴：将PCR产物稀释10倍后，取1μL与0.5μLLiz500SIZESTANDARD,8.5μlHi-Di混匀，95℃变性5分钟后上ABI3730XL测序仪。ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper4.1来分析。
1.5统计学处理
以α＝0.05为检验水准，双侧检验，所有数据采用SPSS23.0软件进行分析，对所检测的数据结果进行统计分析，认为P<0.05为差异有统计学意义。用Logistic回归分析位点基因型和等位基因在G6PD缺乏病例组和G6PD酶含量正常组的关系，以比值比(OR)和95％可信区间(CI)表示相对风险度，并经年龄和性别校正计算P值和风险值。位点间所构成的单倍型运用在线SHEsis软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis)进行分析。每组变量的正态性检验用“One-SampleKolmogorov-SmirnoyTest”方法，符合正态性分布的计量资料以均数±标准差表示,两组间的比较用独立样本t检验，反之用秩和检验，分类资料以百分数(％)表示，计数资料用2检验产物基因型。
实施例二
基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，包括以下步骤：
步骤一、以位点c.95A>G为例，用Primerpremier5.0软件结合Oligo6.0软件设计扩增片段在109bp引物，采用不对称反应体系，包括0.2μL的DNA聚合酶，5μL的10×PCRBuffer，300μM的dNTP，上游引物20nM，下游引物1μM，探针浓度100nM，2μL的DNA，补水至25μL；
步骤二、在Bio-RadCFX96Touch荧光定量PCR按照如下条件进行扩增；
步骤三、基于分子信标探针熔解曲线分析，设计双管四色荧光探针的G6PD缺陷基因检测试剂盒；
步骤四、随机选取志愿者共80人，构建各种缺陷等位基因的CRS人群，其中男女各占一半；
步骤五、志愿者的检测，并得出数据；
步骤六、运用EpiData3.1软件双录入方式建立数据库，运用SPSS26.0软件对数据进行统计分析；
步骤七、数据结果的判定。
本发明中，优选的，步骤五中，检测方法为所有志愿者要求在清晨空腹情况下，应用含有乙二胺四乙酸二钠(EDTA-K2)抗凝管采集外周肘正中静脉全血样本,置于离心机并以3000r/min离心5min,此时见管内形成血清和红细胞两部分(上部分为血清，下部分为血红细胞)，用移液器抽吸并去掉上层血清液，随后微量移液器吸取压积红细胞20μL，加入1mL去离子水(稀释51倍)，吹打充分混匀，常温下待红细胞完全溶解(约15-30min)，应用G6PD测定试剂盒(上海执诚生物科技有限公司提供)，严格按照试剂说明书操作，采用日立7600-series全自动生化分析仪进行G6PD酶活性测定。
本发明中，优选的，志愿者的选取标准：
A.在某某市生活1年及以上；
B.在被调查医院建立有出生档案；
C.家族三代均在本地生活；
D.年龄均未满18周岁；
E.研究对象均自愿参与并签署知情同意书。
本发明中，优选的，步骤六中，数据的分析采用百分比(％)描述，计量统计学资料采用均值±方差描述，影响因素采用Pearsonχ2检验和二项logistic回归分析法分析，均以α＝0.05为检验水准，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
本发明中，优选的，分析研究方法有标本采集、DNA提取、标签SNP位点挑选、
SNP分型、高分辨熔解曲线SNP分型、数据分析、G6PD酶学筛查和统计学分析。
本发明中，优选的，运用了四色荧光探针法标记，具有可面向广大人群、数据结果可靠优点。
本发明中，优选的，步骤七中，判定标准：正常成年人G6PD活性的参考范围(＞18岁)：＞1300U/L，青少年组(＜18岁)：＞1500U/L。
本发明中，优选的，选取志愿者的方式为在某某市的辖区中随机抽取3个城区，再将城区内所有公立医院进行编号，随机抽取2家医院，共计4家医院，红细胞完全溶解的时间为15-30min。
材料：采用天根生化科技(北京)有限公司生产的干血斑基因组DNA提取试剂盒(DP334)和血液基因组DNA提取试剂盒，使用Sequenom公司GenotypingTools及MassARRAYAssayDesign4.0软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物(Ist-PCRPrimer，2nd-PCRPrimer)以单碱基延伸反应引物(UEP_SEQ)，并交与广州英俊生物技术有限公司合成，以及各类常见的检测试剂盒的生产材料；
设备需求：医用低温箱-30℃，医用低温冰箱-80℃，立式冷藏柜4℃，半自动分液仪，热封膜仪，移液器，涡旋振荡器，恒温混匀仪，PCR仪。
保障本发明对G6PD基因缺陷检测的灵敏度，准确度，保证本发明合格率大于99％，并在本发明出厂前对本发明品质进行检验。定期对本发明进行抽样检验。
1.6G6PD酶学筛查
采用广州米基公司生产的G6PD荧光斑点法试剂盒筛查G6PD酶活性，严格按照试剂说明书进行操作及判读。步骤如下：(1)取3mm2干血斑一片置于96孔板中，设定阴/阳对照；(2)加入120μL/孔荧光反应试剂，用恒温振荡器(ThermoFisherShakerHT)(条件：37℃恒温，振幅900rpm)处理30min，去除纸片后再振荡1min，用芬兰雷勃Ascent荧光读数仪读取荧光数值；同时将5μL反应液滴于滤纸上，立即吹干后置紫外光下观察荧光强度。
1.7构建G6PD缺乏症基因检测试剂盒
8种G6PD缺陷等位基因，包括c.95A>G、c.392G>T、c.871G>A、c.1024C>T、c.1311C>T、c.1360C>T、c.1376G>T和c.1388G>A，其实已经覆盖了我国人群的99.4％(1956/1968)G6PD缺乏症突变。因此，我们拟基于分子信标探针熔解曲线分析(MolecularBeanMeltingCurveanalysis,MBMCA)技术，设计出一个双管四色荧光探针(FAM/HEX/ROX/Cy5)的G6PD缺陷基因检测试剂盒。
实验结果
| 性别 | 检测人数(人) | G6PD缺乏人数(人) | 发生率(％) |
| 男性 | 40 | 5 | 12.5 |
| 女性 | 40 | 3 | 7.5 |
| 合计 | 80 | 8 | 10 |
表1G6PD缺乏症检出率与性别的关系
在80个志愿者中，检出G6PD缺乏的共8例，总发生率10％。其中男女发生率分别为12.5％和7.5％，男女生的整体发生率为10％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、以位点c.95A>G为例，用Primerpremier5.0软件结合Oligo6.0软件设计扩增片段在109bp引物，采用不对称反应体系，包括0.2μL的DNA聚合酶，5μL的10×PCRBuffer，300μM的dNTP，上游引物20nM，下游引物1μM，探针浓度100nM，2μL的DNA，补水至25μL；
步骤二、在Bio-RadCFX96Touch荧光定量PCR按照如下条件进行扩增；
步骤三、基于分子信标探针熔解曲线分析，设计双管四色荧光探针的G6PD缺陷基因检测试剂盒；
步骤四、随机选取志愿者共80人，构建各种缺陷等位基因的CRS人群，其中男女各占一半；
步骤五、志愿者的检测，并得出数据；
步骤六、运用EpiData3.1软件双录入方式建立数据库，运用SPSS26.0软件对数据进行统计分析；
步骤七、数据结果的判定。
2.根据权利要求1所述的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于：步骤五中，检测方法为所有志愿者要求在清晨空腹情况下，应用含有乙二胺四乙酸二钠(EDTA-K2)抗凝管采集外周肘正中静脉全血样本,置于离心机并以3000r/min离心5min,此时见管内形成血清和红细胞两部分(上部分为血清，下部分为血红细胞)，用移液器抽吸并去掉上层血清液，随后微量移液器吸取压积红细胞20μL，加入1mL去离子水(稀释51倍)，吹打充分混匀，常温下待红细胞完全溶解(约15-30min)，应用G6PD测定试剂盒，采用日立7600-series全自动生化分析仪进行G6PD酶活性测定。
3.根据权利要求1所述的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于，志愿者的选取标准：
A.在某某市生活1年及以上；
B.在被调查医院建立有出生档案；
C.家族三代均在本地生活；
D.年龄均未满18周岁；
E.研究对象均自愿参与并签署知情同意书。
4.根据权利要求1所述的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于：步骤六中，数据的分析采用百分比(％)描述，计量统计学资料采用均值±方差描述，影响因素采用Pearsonχ2检验和二项logistic回归分析法分析，均以α＝0.05为检验水准，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
5.根据权利要求1所述的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于：分析研究方法有标本采集、DNA提取、标签SNP位点挑选、
SNP分型、高分辨熔解曲线SNP分型、数据分析、G6PD酶学筛查和统计学分析。
6.根据权利要求1所述的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于：运用了四色荧光探针法标记，具有可面向广大人群、数据结果可靠优点。
7.根据权利要求1所述的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于：步骤七中，判定标准：正常成年人G6PD活性的参考范围(＞18岁)：＞1300U/L，青少年组(＜18岁)：＞1500U/L。
8.根据权利要求1所述的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于：选取志愿者的方式为在某某市的辖区中随机抽取3个城区，再将城区内所有公立医院进行编号，随机抽取2家医院，共计4家医院。
9.根据权利要求2所述的基于MBMCA基因诊断G6PD缺乏症的技术研发平台，其特征在于：红细胞完全溶解的时间为15-30min。
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