CN102234680A - 一种体外测定生物钟节律的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种在细胞上快速测定生物钟节律的方法，其特征在于利用rPer1细胞系，以荧光素酶的活性作为测量指标，用50％的马血清处理来使细胞同步化，然后利用Lumicycle实时记录荧光的强度，从而确定细胞的节律周期。该方法在生物钟的基础及应用研究以及生物钟调节药物的筛选上具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物的开发以及时钟生物学的基础和应用研究。具体地说，本发明建立了一种新的体外快速测定生物钟节律的方法，能广泛用于生物钟的基础和应用研究及药物筛选。
背景技术
生物节律(circadian rhythm)是以大约24小时为周期的内在生理节律，它调节我们的许多代谢、生理活动和行为。很多证据表明，生物节律的失调和紊乱会对人的健康产生很大的负面效应，包括时差反应、倒夜班引起的疲劳综合症、睡眠失调等。此外，很多严重威胁人类健康的疾病，比如心脑血管疾病和肿瘤也都与生物节律的紊乱有关。然而，随着现代文明的普及，越来越多的人背离了日出而作，日落而息的生活方式，从而生物节律的失调也越来越普遍。因此，迫切需要开发能够改善生物节律的药物。目前生物节律的测定主要通过小鼠的跑轮实验，周期长，成本高，不适应大规模药物筛选的要求。因此建立一种新的快速测定生物节律的方法很有意义。
发明内容
发明目的
本发明希望利用现代细胞生物学技术，建立一套可以体外快速测定细胞生物节律的方法，既能用于生物钟的基础研究，又可以为将来大规模筛选生物钟调节药物打下基础。
发明概述
本发明建立了一种在细胞上快速测定生物节律的方法，其特征在于利用rPer1细胞系，待细胞长满5天后，以50％的马血清处理两小时来达到细胞节律的同步化，然后加入荧光素酶底物Luciferin，置Lumicycle仪器中实时测定荧光的强度，从而确定细胞的生物节律。
附图说明
图1为利用利用该方法测定细胞生物节律的代表性结果。
具体实施方式
1.生物节律体外测定方法的建立
1)筛选用细胞系的选择：我们选择了表达rPer1细胞作为筛选用细胞系，该细胞系源自Rat-1细胞，且其中整合了荧光素酶基因，荧光素酶基因的表达受核心生物钟基因Per1控制。
2)细胞同步化方法：在35mm培养皿中接种约3x105rPer1细胞，于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养基为D2902(Gibco)添加5％胎牛血清(GIBCO)，50单位/mL青霉素，50单位/mL链霉素，10mM HEPES，以及0.35g/L碳酸氢钠，3.5g/L葡萄糖。待细胞完全长满后，继续培养5天，以达到细胞周期的同步化。然后，细胞用50％马血清刺激2个小时，达到细胞节律的同步化。
3)细胞生物节律的测定：
细胞同步化后，加入2.0mL新鲜的D2902培养基，并补加Luciferin至终浓度为30ug/ml。接着去掉培养皿盖，用封口膜密封，将培养皿转移到Lumicycle仪器(Actimetrics)中，连续5天进行生物节律的测量。其中一次代表性的测量结果见图1。
Claims (1)
1.一种新的体外测定生物钟节律的方法，其特征在于利用Per1基因的启动子控制荧光素酶基因在Rat-1细胞系中节律性的表达，待细胞长满5天后，以50％的马血清处理两小时来达到细胞节律的同步化，然后加入荧光素酶底物Luciferin，置Lumicycle仪器中实时测定荧光的强度，从而确定生物节律。
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Non-Patent Citations (2)
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